CZ125097A3 - Vakcina a antitoxin pro léčbu a prevenci onemocnění C. difficile - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká terapie pomocí klostridiálního antitoxinu a vakciny pro lidi a jiné živočichy. Týká se rovněž antitoxinů, které neutralizují patologické účinky klostridiálních toxinů, a vakcin, které zamezují morbiditě a mortalitě spojené s klostridiálními onemocněními.

Dosavadní stav techniky

Rod Clostridium zahrnuje gram-pozitivní anaerobní sporogenní bacily. Přirozeným habitatem těchto organismů je prostředí a intestinální trakt člověka a jiných živočichů. Klostridia jsou opravdu ubikvitní; nacházejí se běžně v půdě, prachu, odpadu, mořských sedimentech, hynoucí vegetaci a blátě [viz například P.H.A. Sneath a d., „Clostridium“, Bergey’s Manual® of Systematic Bacteriology, sv. 2, str. 1141-2000, Williams & Wilkins (1986)]. Navzdory identifikaci přibližně 100 druhů Clostridium byl pouze malý počet označen za etiologického činitele medicinálního a veterinárního významu. Tyto druhy jsou však spojeny s velmi vážnými onemocněními, mezi něž patří botulismus, tetanus, anaerobní celulitis, plynová sněť, bakteremie, pseudomembránová kolitis a klostridiální gastroenteritis. Některé lékařsky a veterinárně významné druhy a choroby, s nimiž jsou spojeny, jsou uvedeny v tabulce 1. Protože vpodstatě všechny tyto druhy byly izolovány z fekálních vzorků zdánlivě zdravých osob, mohou být některé tyto izoláty pouze přechodnými, nikoli trvalými obyvateli střevní flóry.

• · · ·

Tabulka 1. Druhy Clóstridium mající význam pro humánní nebo veterinární medicínu*

druh	onemocnění
C. aminovalericum	bakteriurie (těhotné ženy)
C. argentinense	infekce ran, bakteremie, botulismus, infekce plodové vody
C. baratii	infekce válečných ran, peritonitis, infekční procesy oka, ucha a prostaty
C. beijerinckikii	infekce ran
C. bifermentans	infekce ran, abscesy, plynová sněť, bakteremie
C. botulinum	otravy jídlem, botulismus (ran, jídla, dětský)
C. butyricum	infekce močového traktu, dolních cest dýchacích, pohrudniční a břišní dutiny, infekce ran, abscesy, bakteremie
C. cadaverís	abscesy, infekce ran
C. carnis	infekce měkkých tkání, bakteremie
C. chauvoei	toxemie
C. clostridioforme	infekce břicha, čípku, šourku, pohrudnice a jiné, septicemie, peritonitis, apendicitis
C. cochlearum	izolováno z lidských chorobných procesů, ale role v onemocnění neznáma
C. difficile	průjem související s bakteriostatiky, pseudomembránová enterokolitis, bakteremie, hnisavé infekce
C. fallax	infekce měkkých tkání
C. ghnoii	infekce měkkých tkání
C. glycolicum	infekce ran, abscesy, peritonitis
C. hastiforme	infekce válečných ran, bakteremie, abscesy
C. histolyticum	infekce válečných ran, plynová sněť, izolát z gingiválního plaku
C. indolis	infekce gastrointestinálního traktu
C. innocuum	infekce gastrointestinálního traktu, empyem

.· • · · · • · • · 4

C. irregulare	penilní leze
C. leptům	izolováno z lidských chorobných procesů, ale role v onemocnění neznáma
C. limosum	bakteremie, peritonitis, pulmonální infekce
C. malenominatum	různé infekční procesy
C. novyi	infekce ran, plynová sněť, toxemie, zánět hlavové tkáně (u ovcí), krvavá moč (u hovězího dobytka)
C. oroticum	infekce močových cest, rektální abscesy
C. paraputrificum	bakteremie, peritonitis, infekce ran, apendicitis
C. perfringens	plynová sněť, anaerobní celulitis, intraabdominální abscesy, infekce měkkých tkání, otravy jídlem, nekrotizující pneumonie, empyem, meningitis, bakteremie, infekce dělohy, enteritis necrotans, jehněčí červenka, ovčí enterotoxemie
C. putrefaciens	bakteriurie (těhotné ženy s bakteremií)
C. putrificum	abscesy, infekce ran, bakteremie
C. ramosum	infekce břišní dutiny, genitálního traktu, plic a žlučových cest, bakteremie
C. sartagoforme	izolováno z lidských chorobných procesů, ale role v onemocnění neznáma
C. septicum	plynová sněť, bakteremie, hnisavé infekce, nekrotizující enterokolitis, motolice
C. sordellii	plynová sněť, infekce ran, penilní léze, bakteremie. abscesy, abdominální a vaginální infekce
C. sphenoides	apendicitis, bakteremie, infekce kostí a měkkých tkání, intraperitoneální infekce, infekce válečných ran, viscerální plynová sněť, renální abscesy
C. sporogenes	plynová sněť, bakteremie, endokarditis, infekce centrálního nervového systému a pleuropulmonální infekce, penilní léze, infekce válečných ran, jiné hnisavé infekce

..

• ·

C. subterminale	bakteremie, empyem, infekce žlučových cest, měkkých tkání a kostí
C. symbiosum	jaterní abscesy, bakteremie, infekce v důsledku střevní flóry
C. tertium	plynová sněť, apendicitis, mozkové abscesy, infekce intestinálního traktu a měkkých tkání, infekce válečných ran, periodontitis, bakteremie
C. tetani	tetanus, infekce dásní a zubů, korneální ulcerace, infekce bradavky a středního ucha, intraperitoneální infekce, novorozenecký tetanus, poporodní infekce dělohy, infekce měkkých tkání, zvláště související s traumatem (včetně odřenin a tržných ran, infekce související s použitím kontaminovaných jehel
C. thermosaccharolyticum	izolováno z lidských chorobných procesů, ale role v onemocnění neznáma

* Kompilováno z P.G. Engelkirk a d., „Classification“. Principles and Practice of Clinical Anaerobic Bacteriology, str. 22 až 23, Star Publishing Co., Belmont, CA (1992); J. Stephen a R.A. Petrowski, „Toxins Which Traverse Membranes and Deregulate Celíš“, in: Bacterial Toxins, 2. vyd., str. 66 až 67, American Society for Microbiology (1986); R. Berkow a A.J. Fletcher (ed.), „Bacterial Diseases“, Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 16. vyd., str. 116-126, Merck Research Laboratories, Rahway, N.J. (1992); a O.H. Sigmund a C.M. Fraser (ed.), „Clostridial Infections“, Merck Veterinary Manual, 5. vyd., str. 396 až 409, Merck & Co., Rahway, N.J. (1979).

Ve většině případů souvisí patogenita těchto organismů s uvolňováním silných exotoxinů nebo vysoce destruktivních enzymů. Některé druhy rodu Clostrídium skutečně produkují toxiny a jiné enzymy velkého lékařského a veterinárního významu [C.L. Hatheway, Clin. Microbiol. Rev. 3:66-98 (1990)].

Patrně pro jejich význam pro humánní a veterinární medicínu byl prováděn rozsáhlý výzkum těchto toxinů, zejména toxinů C. botulinum a C. difficile.

C. botulinum

Několik kmenů Clostridium botulinum produkuje toxiny, mající význam pro humánní a veterinární zdravotnictví [C.L. Hatheway, Clin. Microbiol. Rev. 3:66-98 (1990)]. Účinky těchto toxinů sahají od diaroických onemocnění, která mohou způsobit destrukci tlustého střeva, k paralytickým účinkům, které mohou vyvolat smrt. nebezpečí vývinu klostridiálních onemocnění hrozí zejména novorozencům a lidem a živočichům ve špatném zdravotním stavu (například trpícím chorobami souvisejícími s vysokým věkem nebo imunodeficiencí).

Clostridium botulinum produkuje nejjedovatější známý biologický toxin. Letální lidská dávka činí pouze 10'⁹ mg/kg tělesné hmotnosti toxinů v krevním řečišti. Botulinový toxin blokuje nervový přenos do svalů a vede k ochablosti a paralýze. Dostane-li se toxin do dýchacích cest a dýchacích svalů, vede k selhání dýchání, které může vyvolat smrt [S. Arnon, J. Infect. Dis. 154:201-206 (1986)].

Spory C. botulinum jsou přenášeny prachem a nalézají se na rostlinách, sklízených z půdy, na čerstvém ovoci a na zemědělských produktech jako je med. Za podmínek organismu příznivých spory klíčí na vegetativní buňky, které produkují toxin [S. Arnon, Ann. Rev. Med. 31-541 (1980)].

Onemocnění botulismem je možno rozdělit na čtyři typy podle způsobu vniknutí toxinů do krevního řečiště. Botulismus přenášený potravou vzniká po požití nesprávně uchovávaného a nepřiměřeně tepelně upravovaného jídla, které obsahuje botulinový toxin. Vletech 1976 a 1984 bylo ve Spojených státech 355 případů botulismu přenášeného potravou [K.L. MacDonald a d., Am. J. Epidemiol. 124:794 (1986)]. Úmrtnost v důsledku botulinového toxinů je 12 % a ve zvláště rizikových skupinách může být vyšší [C.O. Tacket a d., Am. J. Med. 76:794 (1984)]. Botulismus v důsledku rány vzniká tak, že C. botulinum pronikne do poraněné tkáně a produkuje toxin, který je absorbován do krevního řečiště. Od r. 1950 bylo zaznamenáno 30 případů botulismu v důsledku rány [M.N. Swartz, „Anaerobic Spore-Forming Bacilli:

..

• · ·· · ·· · · ··· · · · · ···· • ···· · · · · ··· • ·· · · · · · · ···« · ······· ···

The Clostridia“, str. 633 až 646, in: B.D. Davis a d. (ed.) Microbiology, 4. vyd., J.B. Lippincott Co. (1990)]. Inhalační botulismus vznikne, je-li toxin vdechnut. Inhalační botulismus byl zaznamenán jako důsledek náhodné expozice v laboratoři [E. Holzer, Med. Kliň. 41:1735 (1962)] a mohl by být vyvolán při použití toxinu jako činidla v biologických zbraních [D.R. Franz a d., in: Botulinum and Tetanus Neurotoxins, ed. B.R. DasGupta, Plenům Press, New York (1993), str. 473-476]. Infekční dětský botulismus vzniká při kolonizaci intestinálního traktu dítěte C. botulinum s produkcí toxinu a jeho absorpcí do krevního řečiště. Je pravděpodobné, že k vniknutí bakterie dojde, jsou-li vdechnuty spory, které následně klíčí [S. Arnon, J. Infect. Dis. 154:201 (1986)]. Od prvního rozpoznání v r. 1976 bylo zaznamenáno 500 případů [M.N. Swartz, viz výše].

Dětský botulismus napadá děti ve věku tří týdnů až jedenácti měsíců (více než 90 % případů představují děti mladší šesti měsíců) [S. Arnon, J. Infect. Dis. 154:201 (1986)]. Má se za to, že děti jsou náchylné z velké části v důsledku absence plného komplementu střevní mikroflóry dospělých. Benigní mikroflóra, přítomná ve střevech dospělého, poskytuje kyselé prostředí, které není příznivé pro kolonizaci C. botulinum. Děti začínají život se sterilními střevy, která jsou postupně kolonizována mikroflórou. V důsledku přítomnosti omezené mikroflóry v raném dětství není střevní prostředí kyselé a umožňuje tak klíčení a růst spor a produkci toxinů. V tomto ohledu se stávají náchylnějšími k botulismu také někteří dospělí, kteří prodělali léčbu antibiotiky, která mění střevní mikroflóru.

Dalším faktorem, přispívajícím k náchylnosti dětí k infekčnímu botulismu, je nezralost imunitního systému dítěte. Zralý imunitní systém je sensibilizován na bakteriální antigeny a produkuje ochranné protilátky. Vylučovaný IgA, produkovaný ve střevech dospělých, má schopnost aglutinovat vegetativní buňky C. botulinum [S. Arnon, J. Infect. Dis. 154:201 (1986)]. Sekreční IgA může působit také tak, že brání střevním bakteriím a jejich produktům, aby křížily buňky střeva [S. Arnon, Epidemiol. Rev. 3:45 (1981)]. Dětský imunitní systém k tomu není primárně imunizován.

Klinické příznaky dětského botulismu sahají od lehké paralýzy přes mírnou a silnou paralýzu vyžadující hospitalizaci k prudké paralýza, vedoucí k náhlé smrti [S.

Arnon, Epidemiol. Rev. 3:45 (1981)].

·» * » ··· ··«· · · · « • ···· · · · · ··· • · · · · · · · · ···· · • · · · ··· · · · • · 4 · ·· · · · · « 4 ·

Hlavní terapie silného dětského botulismu spočívá v pomocné ventilaci s použitím mechanického respirátoru a v současné eliminaci toxinů a bakterií s použitím projímadel, klyzmat a výplachu žaludku. V Kalifornii došlo za jediný rok k 68 hospitalizacím případů dětského botulismu s celkovými náklady na léčbu přes 4 miliony dolarů [T.L. Frankovich a S. Arnon, West. J. Med. 154:103 (1991)].

Každý z různých kmenů Clostridium botulinum produkuje antigenně odlišný toxin, označený písmenem A až G. Toxin sérotypu A se účastnil v 26 % případů botulismu přenášeného potravou; typy Β, E a F se rovněž účastnily menšího procenta případů botulismu přenášeného potravou [H. Sugiyama, Microbiol. Rev. 44:419 (1980)]. Botulismus v důsledku rány byl zaznamenán pouze u toxinů A nebo Β [H. Sugiyama, viz výše]. Téměř všechny případy dětského botulismu byly způsobeny bakteriemi produkujícími buď toxin typu A nebo B. (Výjimkou byl v Novém Mexiku jeden případ, způsobený Clostridium botulinum produkujícím toxin typu F, a jiný případ, způsobený Clostridium botulinum, produkujícím hybrid typu B a typu F.) [S. Arnon, Epidemiol. Rev. 3:45)]. Toxin typu C napadá vodní drůbež, dobytek, koně a norky. Toxin typu D napadá dobytek a toxin typu E napadá lidi a ptáky.

Komerčně dostupný od Connaught Industries Ltd. je trivalentní antitoxin, odvozený z koňské plasmy, jako terapie pro toxiny typu A, B a E. Tento antitoxin má však několik nevýhod. Za prvé je nutno intravenózně a/nebo intramuskulárně injekčně aplikovat velmi vysoké dávky. Za druhé má tento antitoxin vážné vedlejší účinky, jako je akutní anafylaxe, která může vyvolat smrt, a sérová nemoc. Konečně je účinnost antitoxinu nejistá a léčba nákladná [C.O. Tacket a d., Am. J. Med., 76:794 (1984)].

Heptavalentní koňský botulinový antitoxin, který používá pouze část F(ab’)2 molekuly protilátky, byl testován Armádou Spojených států [M. Balady, USAMRDC Newsletter, str. 6 (1991)]. Jeho tvorba byla vyvolána proti nečistým toxoidům v těchto velkých zvířatech a nejedná se o preparát s vysokým titrem.

Z imunizovaných lidských subjektů byl získán pentavalentní lidský antitoxin pro použití k léčbě dětského botulismu. Zásoba tohoto antitoxinu je omezená a nelze očekávat, že bude splňovat požadavky všech jedinců napadených botulismem. Při • · « · ► · · • · · ·

I · · «

odběru lidského séra je navíc nutno vyřadit HIV a další potenciálně vážné lidské patogeny [P.J. Schwartz a S.S. Arnon, Western J. Med. 156:197 (1992)].

Dětský botulismus byl označen za příčinu úmrtí v některých případech syndromu náhlé smrti dítěte (SIDS). Jako SIDS se oficiálně označuje smrt dítěte, která je náhlá a nečekaná a která zůstává nevysvětlena navzdory kompletnímu posmrtnému vyšetření. Na vazbu SIDS k dětskému botulismu se přišlo, když bylo zjištěno, že vzorky stolice nebo krve, odebrané z takto zemřelých dětí při autopsii, ve 3 až 4 % analyzovaných případů obsahují organismy a/nebo toxin C. botulinum [D.R. Peterson a d., Rev. Infect. Dis. 1:630 (1979)]. Naproti tomu ze 160 zdravých dětí mělo pouze 1 (0,6 %) ve stolici organismy C. botulinum a žádný botulinový toxin (S. Arnon a d., Lancet, str. 1273 až 1276, 17.6.1978).

V rozvinutých zemích je SIDS příčinou číslo jedna úmrtí dětí ve věku mezi 1 měsícem a 1 rokem (S. Arnon a d., Lancet, str. 1273 až 1277, 17.6.1978). Během prvního roku umírá na SIDS více dětí než na jakoukoli jinou jednotlivou příčinu smrti v prvních 14 letech života. Ve Spojených státech je ročně 8000 až 10000 obětí SIDS (Id).

Je tedy potřebná účinná terapie proti dětskému botulismu bez nebezpečných vedlejších účinků, dostupná ve velké zásobě za přiměřenou cenu, která může být aplikována bezpečně a bezbolestně, aby bylo možno provádět profylaktickou aplikaci dětem.

Byla prováděna imunizace subjektů za účele, vyvolat imunitu proti botulinovým toxinům. pro humánní použití je komerčně dostupná vakcina C. botulinum, obsahující chemicky inaktivovaný (tj. ošetřený formaldehydem) toxin typu A, B, C, D a E. Tento vakcinový preparát však má několik nevýhod. Za prvé je účinnost této vakcíny proměnlivá (konkrétně se po podání primární série vyvine ochranné množství protilátek proti typu B pouze u 78 % příjemců). Za druhé je imunizace bolestivá (aplikace vyžaduje hluboké subkutánní očkování) s častými nepříznivými reakcemi (mírné až silné místní reakce se vyskytují po první injekci u přibližně 6 % příjemců; toto číslo vzrůstá na přibližně 11 % jedinců, kteří dostávají posilovači injekci) [informační brožura o pentavaientním (ABCDE) botulinovém toxoidu, Centers for • · » · · » · · « ·

I · · I k · · « » · · · • · · · I • · 4 • · « ·

Disease Control], Za třetí je příprava vakciny nebezpečná, protože laboratorní pracovníci musejí pracovat s aktivním toxinem.

Jsou tedy potřebné bezpečné a účinné vakcinové preparáty pro podávání jedincům v nebezpečí expozice toxiny C. botulinum.

C. difficile

V nedávné době bylo prokázáno, že C. difficile, což je organismus, který svůj název získal díky potížím, s nimiž se setkává jeho izolace, je etiologickým činitelem při průjmových onemocněních (Sneath a d., str. 1165). C. difficile je přítomno bez nepříznivých účinků v gastrointestinálním traktu přibližně 3 % zdravých dospělých a 10 až 30 % novorozenců (Swartz, str. 644); podle jiných odhadů je C. difficile součástí normální gastrointestinální flóry 2 až 10 % lidí [G.F. Brooks a d. (ed.), „Infections Caused by Anaerobic Bacteria“, Jawetz, Melnick & Adelberg’s Medical Microbiology, 19. vyd., str. 257 až 262, Appleton & Lange, San Mateo, CA (1991)]. Protože jsou tyto organismy relativně resistentní vůči nejběžněji používaným bakteriostatikům, je-li pacient léčen antibiotiky, dojde k potlačení ostatních členů normální gastrointestinální flóry a C. difficile bují a produkuje cytopatické toxiny a enterotoxiny. Bylo nalezeno ve 25 % případů mírných průjmů v důsledku léčby antibiotiky, zejména cefalosporiny, klindamycinem a ampicilinem [M.N. Swartz, str. 644],

Významné je, že C. difficile je obvykle spojeno s nemocničními infekcemi. Tento organismus je často přítomen v prostředí nemocnic a ošetřovatelských zařízení a může být přítomen na rukou a oděvech nemocničního personálu, který pečuje o vysílené pacienty s oslabeným imunitním systémem. Protože mnozí z těchto pacientů jsou léčeni bakteriostatiky nebo jinými chemoterapeutiky, představuje takovýto přenos C. difficile významný rizikový faktor onemocnění (Engelkirk a d., str. 64 až 67).

C. difficile je spojeno s různými průjmovými onemocněními od samotného průjmu po výrazný průjem a nekrózu gastrointestinální sliznice s nahromaděním zánětlivých buněk a fibrinu, které tvoří v napadené oblasti pseudomembránu (Brooks • ·

a d.). Bylo zjištěno ve více než 95 % případů pseudomembránové enterokolitidy (Swartz a d., str. 644). Toto příležitostně smrtelné onemocnění je charakterizováno průjmem, vícečetnými plaky v tlustém střevě a toxickým megakolonem (Swartz, str. 644). I když se pro diagnózu někdy používá kultivace stolice, je optimální provádět diagnózu detekcí tepelně labilních toxinů, přítomných ve fekálních filtrátech pacientů s enterokolitidou způsobenou C. difficile (Swartz, str. 644 až 645, a Brooks, str. 260). Toxiny C. difficile jsou cytotoxické pro tkáňové a buněčné kultury a při intracekální injekci křečkům vyvolávají enterokolitidu (Swartz, str. 644).

Enterotoxicita C. difficile je primárně výsledkem působení dvou toxinů, označených A a B, které mají oba molekulovou hmotnost přibližně 300000. Oba jsou silnými cytotoxiny, přičemž toxin A má přímou enterocytotoxickou účinnost [Lyerly a d., Infect. Immun. 60:4633 (1992)]. Na rozdíl od toxinů A C. perfringens, což je organismus vzácně související s bakteriostatiky vyvolaným průjmem, není toxin C. difficile složkou sporového pláště a není produkován během sporulace (Swartz, str. 644). Toxin A C. difficile způsobuje krvácení, hromadění tekutina poškození sliznic v králičích střevních kličkách a zdá se, že zvyšuje příjem toxinů B střevní sliznici. Toxin B nezpůsobuje hromadění tekutin ve střevech, ale je pro buňky tkáňové kultury tisíckrát toxičtější než toxin A a způsobuje poškození membrán. Přestože oba toxiny vyvolávají podobné buněčné efekty, jako je desagregace aktinu, existují rozdíly v buněčné specifitě.

Při onemocnění jsou významné oba toxiny [Boriello a d., Rev. Infect. Dis. 12 (dodatek 2):S185; Lyerly a d., Infect. Immun. 47:349 (1985); a Rolfe, Infect. Immun. 59:1223 (1990)]. Má se za to, že nejprve působí toxin A vazbou na štětičkové hraniční receptory, čímž zničí vnější vrstvu slizníce, a pak umožní přístup toxinů B k takto odkryté tkáni. Tyto stupně patogenese by naznačovaly, že k profylaktické terapii CDAD by postačovala produkce neutralizujících protilátek proti toxinů A. Pro účinné terapeutikum proti pozdnímu stadiu onemocnění tlustého střeva však mohou být nezbytnou další složkou protilátky proti toxinů B. Bylo skutečně zaznamenáno, že živočichové vyžadují pro úplnou ochranu proti onemocnění protilátky proti toxinů A i B [Kim a Rolfe, Abstr. Ann. Meet. Am. Soc. Microbiol., 69:62 (1987)].

• · « · • · · · · · · • · · · · · · • · · · · · • · · · ««

Bylo zaznamenáno, že C. difficile produkuje také jiné toxiny, jako je enterotoxin jiný než toxiny A a B [Banno a d., Rev. Infect. Dis. 6(Suppl. 1:S11-S20 (1984)], nízkomolekulární toxin [Rihn a d., Biochem. Biophys. Res. Comm. 124:690695 (1984)], faktor měnící motilitu [Justus a d., Gastroenterol., 83:836-843 (1982)] a snad další toxiny. Bez ohledu na to je primárním problémem gastrointestinální onemocněni C. difficile.

Je význačné, že v důsledku resistence vůči nejběžněji používaným bakteriostatikům je C. difficile spojeno s antimikrobiální terapií s použitím prakticky všech bakteriostatik (avšak nejčastěji ampicilinu, klindamycinu a cefalosporinů). Je spojeno rovněž s onemocněním pacientů podstupujících chemoterapii sloučeninami, jako je methotrexát, 5-fluorouracil, cyklofosfamid a doxorubicin [S.M. Finegold a d., Clinical Guide to Anaerobic Infections, str. 88 až 89, Star Publishing Co., Beimont, CA (1992)]

Léčba onemocnění C. difficile je vzhledem k vysoké resistenci organismu problematická. Jako účinné byly zaznamenány orální metronidazol, bacitracin a vankomycin (Finegold a d., str. 89). Existují však problémy, související s léčbou pomocí těchto sloučenin. Vankomycin je velmi drahý, někteří pacienti nejsou schopni přijímat orální léčbu a poměr relapsů je vysoký (20 až 25 %), i když se nemusejí vyskytovat po několik týdnů (Id).

K prevenci nebo léčbě onemocnění C. difficile by vedla neutralizace účinků těchto toxinů v gastrointestinálním traktu. Je tedy potřebná účinná terapie proti toxinu C. difficile bez nebezpečných vedlejších účinků, dostupná ve velkém množství za přiměřenou cenu, a bezpečně aplikovatelná, aby mohla být účinně prováděna profylaktické aplikace pacientům s nebezpečím vývinu pseudomembránové enterokolitidy.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 znázorňuje reaktivitu anti-C. botulinum lgY pomocí Western blotu.

• · · · · · • · · · · • · · · · · · • · · · · · · • · · · · · • · · · · ·

Obr. 2 znázorňuje titr protilátky IgY proti toxoidu typu A C. botulinum ve vejcích, měřeno pomocí ELISA.

Obr. 3 znázorňuje výsledky testů neutralizace toxinu A C. difficile.

Obr. 4 znázorňuje výsledky testů neutralizace toxinu B C. difficile.

Obr. 5 znázorňuje výsledky testů neutralizace toxinu B C. difficile.

Obr. 6 představuje restrikční mapu genu toxinu A C. difficile se znázorněním sekvencí primerů 1 až 4 (SEQ ID NO:1-4).

Obr. 7 představuje Western blot reaktivního proteinu toxinu A C. difficile.

Obr. 8 znázorňuje expresní konstrukty toxinu A C. difficile.

Obr. 9 znázorňuje expresní konstrukty toxinu A C. difficile.

Obr. 10 znázorňuje čištění rekombinačního toxinu A C. difficile.

Obr. 11 znázorňuje výsledky testů neutralizace toxinu A C. difficile s protilátkami reagujícími na rekombinační toxin A.

Obr. 12 znázorňuje výsledky pro neutralizační destičku toxinu A C. difficile.

Obr. 13 znázorňuje výsledky pro neutralizační destičku toxinu A C. difficile.

Obr. 14 znázorňuje výsledky testů neutralizace rekombinačního toxinu A C. difficile.

Obr. 15 znázorňuje expresní konstrukty toxinu A C. difficile.

Obr. 16 znázorňuje chromatogram s vynesenou absorbancí při 280 nm proti retenčnímu času pro preparát pMA1870-680 IgY PEG.

Obr. 17 znázorňuje dva expresní konstrukty rekombinačního toxinu B C. difficile.

Obr. 18 znázorňuje expresní konstrukty toxinu B C. difficile.

Obr. 19 znázorňuje expresní konstrukty toxinu B C. difficile.

Obr. 20 znázorňuje expresní konstrukty toxinu B C. difficile.

Obr. 21 představuje gel SDS-PAGE znázorňující čištění fúzního proteinu rekombinačního toxinu B C. difficile.

·· ··

·· ·· • · fl

Obr. 22 představuje gel SDS-PAGE znázorňující čištění dvou proteinů rekombinačního toxinu B C. difficile, značených histidinem.

Obr. 23 znázorňuje expresní konstrukty toxinu B C. difficile.

Obr. 24 představuje Western blot reaktivního proteinu toxinu B C. difficile.

Obr. 25 znázorňuje expresní konstrukty toxinu typu A C. botulinum: jsou znázorněny i konstrukty použité k získání sekvencí C. botulinum a C. difficile.

Obr. 26 představuje gel SDS-PAGE, barvený Coomassie blue, znázorňující čištění fúzních proteinů rekombinačního toxinu typu A C. botulinum.

Obr. 27 znázorňuje expresní konstrukty toxinu typu A C. botulinum; jsou znázorněny i konstrukty použité k získání sekvencí C. botulinum.

Obr. 28 představuje gel SDS-PAGE, barvený Coomassie blue, znázorňující čištění proteinu pHisBot s použitím pryskyřice Ni-NTA.

Obr. 29 představuje gel SDS-PAGE, barvený Coomassie blue, znázorňující expresi proteinu pHisBot v hostitelských buňkách BL21(DE3) a BL21(DE3)pl_ysS.

Obr. 30 představuje gel SDS-PAGE, barvený Coomassie blue, znázorňující čištění proteinu pHisBot s použitím šaržovitého absorpčního postupu.

Obr. 31 znázorňuje expresní konstrukty toxinu A C. difficile.

Obr. 32 představuje gel SDS-PAGE, barvený Coomassie blue, a Western blot, znázorňující expresi pUC1960-2680 v hostitelských buňkách E. coli.

Obr. 33 představuje gel SDS-PAGE, barvený Coomassie blue, a Western blot, znázorňující expresi několika fúzních proteinů rekombinačního toxinu A C. difficile v hostitelských buňkách E. coli.

Obr. 34 představuje gel SDS-PAGE, barvený Coomassie blue, znázorňující čištění fúzních proteinů rekombinačních toxinů A a B C. difficile.

Obr. 35 znázorňuje výsledky studie profylaktického ošetření u křečků.

Obr. 36 znázorňuje výsledky studie terapeutického ošetření u křečků.

Obr. 37 znázorňuje výsledky studie terapeutického ošetření u křečků.

Obr. 38 znázorňuje výsledky studie terapeutického ošetření u křečků.

Obr. 39 znázorňuje výsledky podávání vankomycinu křečkům se stanovenou infekcí C. difficile.

Obr. 40 znázorňuje výsledky analýzy ELISA IgY izolovaného ze slepic, imunizovaných proteinem pMA1870-2680 rekombinačního toxinu A C. difficile a čtyřmi různými vehikuly.

Obr. 41 znázorňuje výsledky analýzy ELISA IgY izolovaného ze slepic, imunizovaných proteinem pPA1870-2680(N/C) rekombinačního toxinu A C. difficile a čtyřmi různými vehikuly.

Obr. 42 znázorňuje rozpouštěcí profily pro IgY, povlečený pomocí Aquateric.

Obr. 43 znázorňuje rozpouštěcí profily pro IgY, povlečený pomocí Eudragit®.

Obr. 44 znázorňuje výsledky analýzy ELISA IgY izolovaného z křečků, vakcinovaných proteiny rekombinačního toxinu A C. difficile.

Obr. 45 znázorňuje výsledky analýzy ELISA IgY izolovaného z křečků, vakcinovaných proteiny rekombinačních toxinů A a B C. difficile', je znázorněna reaktivita na rekombinační toxin A C. difficile.

Obr. 46 znázorňuje výsledky analýzy ELISA IgY izolovaného z křečků, vakcinovaných proteiny rekombinačních toxinů A a B C. difficile; je znázorněna reaktivita na rekombinační toxin B C. difficile.

Obr. 47 znázorňuje výsledky studie terapeutického ošetření u křečků.

Obr. 48 znázorňuje výsledky studie terapeutického ošetření u diaroických křečků.

Obr. 49 znázorňuje výsledky studie terapeutického ošetření u křečků.

Obr. 50 představuje Western blot, znázorňující hladiny toxinu A C. difficile v supernatantu kultury, průtoku kolonou a eluátu z afinitní čistící kolony.

Obr. 51 představuje Western blot, znázorňující hladiny toxinu A C. difficile v supernatantu kultury, průtoku kolonou a eluátu z afinitní čistící kolony.

·· ·· ·· · ···· ··· · · · · ···· • · ··· · · · · · ·· • ·· ··· · · · ···· · ······· ··· ·· ·· ·· ··· ·· ··

Obr. 52 představuje nativní gel PAGE, barvený Coomassie blue, znázorňující hladiny toxinu B C. difficile v supernatantu kapalné kultury.

Obr. 53 představuje nativní gel PAGE, barvený Coomassie blue, a Western blot, znázorňující hladiny toxinu B C. difficile v kulturách z dialýzních sáčků.

Obr. 54 představuje nativní gel PAGE, barvený Coomassie blue, a Western blot, znázorňující hladiny toxinu B C. difficile v komerčním preparátu toxinu B, průtoku kolonou a eluátu z afinitní čistící kolony.

Obr. 55 znázorňuje rozpouštěcí profily tablet IgY, povlečených enterosolventním filmem citlivým vůči pH.

Obr. 56 znázorňuje stabilitu reaktivity toxinu A C. difficile na IgY po procesu tabletování a povlékání enterosolventním povlakem.

Obr. 57 znázorňuje mortalitu křečků, profylakticky ošetřených IgY a infikovaných toxinem A C. difficile.

Obr. 58 znázorňuje mortalitu křečků, terapeuticky ošetřených IgY po infekci toxinem A C. difficile.

Definice

Pro snadnější porozumění vynálezu jsou dále definovány některé termíny.

Výraz „neutralizace“ se používá ve vztahu k antitoxinům, zejména antitoxinům obsahujícím protilátky, které mají schopnost bránit patologickému působení toxinu, proti němuž je antitoxin zaměřen.

Výraz „nadprodukce“ se používá ve vztahu k produkci klostridiálních toxinových polypeptidů v hostitelské buňce a naznačuje, že hostitelská buňka produkuje více klostridiálního toxinu v důsledku zavedení sekvencí nukleových kyselin, kódujících tento klostridiální toxinový polypeptid než by se od této hostitelské buňky očekávalo bez zavedení uvedených sekvencí nukleových kyselin. Pro snadné čištění toxinových polypeptidů, produkovaných v hostitelské buňce, je výhodné, aby hostitelská buňka uvedený toxinový polypeptid exprimovala nebo nadprodukovala v množství větším než 1 mg/l kultury hostitelských buněk.

• · · ···· » · · * • · ··· · · · · · ·· • ·· · · · · · · ···· · ······· · · · ·· ·· ·· ··· ·· ··

Výraz „fúzní protein“ se zde vztahuje na chimerní protein, obsahující daný protein (například toxin A nebo B C. difficile nebo jejich fragmenty) napojený na exogenní proteinový fragment (fúzní partner, který je tvořen netoxinovým proteinem). Fúzní partner může zvyšovat rozpustnost proteinu C. difficile, exprimovaného v hostitelské buňce a/nebo může dodávat afinitní značku k umožnění čištění rekombinačního fúzního proteinu ze supernatantu hostitelských buněk nebo kultury, je-li to žádoucí, může být fúzní protein z daného proteinu (tj. toxinového proteinu nebo jeho fragmentů) před imunizací odstraněn různými známými enzymatickými nebo chemickými metodami.

Výraz „netoxinový protein“ nebo „netoxinová proteinová sekvence“ se vztahuje na část fúzního proteinu nebo proteinové sekvence, která není odvozena od bakteriálního toxinového proteinu.

Výraz „daný protein“ se vztahuje na protein, jehož exprese ve fúzním proteinu je žádoucí, ve fúzním proteinu je daný protein napojen nebo fúzován s jiným proteinem nebo doménou proteinu, tj. fúzním partnerem, za účelem zvýšení stability daného proteinu a/nebo snadnosti čištění fúzního proteinu.

Výraz „maltózu vázající protein“ se vztahuje na maltózu vázající protein E. coli. K danému proteinu může být přidána část maltózu vázajícího proteinu za účelem vytvoření fúzního proteinu; část maltózu vázajícího proteinu může pouze zvyšovat rozpustnost vzniklého fúzního proteinu, je-li exprimován v bakteriálním hostiteli. Naproti tomu může část maltózu vázajícího proteinu umožňovat afinitní čištění fúzního proteinu na amylózové pryskyřici.

Výraz „polyhistidinový úsek“, používaný ve vztahu kfúznímu proteinu, se vztahuje na přítomnost dvou až deseti histidinových zbytků bud na aminoterminálním konci nebo na karboxyterminálním konci nebo na obou koncích daného proteinu nebo fúzního partnera. Výhodný je polyhistidinový úsek ze šesti až deseti zbytků. Polyhistidinový úsek je definován také funkčně jako počet za sebou následujících histidinových zbytků, přidaných k danému proteinu, který umožňuje afinitní čištění vzniklého fúzního proteinu na nikl-chelátové koloně.

Výraz „thioredoxinový protein“, používaný ve vztahu kfúznímu proteinu, se vztahuje na thioredoxinový protein E. coli. Je nutno upozornit, že se však vynálezu ·· ·♦ » · · k · · ··

neomezuje zdrojem thioredoxinového proteinu; i když je thioredoxinový protein E. coli zvlášť výhodný, je možno thioredoxinový protein získat z různých zdrojů. K danému proteinu může být přidána část thioredoxinového proteinu za účelem vytvoření fúzního proteinu; část thioredoxinového proteinu může zvyšovat rozpustnost vzniklého fúzního proteinu, je-li exprimován v bakteriální buňce.

Výraz „čištěný“ nebo „čistit“ se vztahuje na odstraňování nečistot ze vzorku. Například antitoxiny se čistí odstraněním kontaminujících neimunoglobulinových proteinů; čistí se rovněž odstraněním imunogiobulinu, který neváže toxin. Odstranění neimunoglobulinových proteinů a/nebo odstranění imunoglobulinů, které neváží toxin, vede ke zvýšení procenta imunoglobulinů reaktivních s toxinem ve vzorku. Čištění antitoxinu může být prováděno různými metodami, zahrnujícími extrakci a srážením ptačího antitoxinu z vajec pomocí polyethylenglykolu. Čištění antiklostridiálního antitoxinu může být rovněž prováděno afinitní chromatografii na pryskyřici, zahrnující část klostridiálního toxinového proteinu. V jiném příkladu jsou exprimovány polypeptidy rekombinačního toxinů v buňkách bakteriálního hostitele a toxinové polypeptidy jsou čištěny odstraněním proteinů hostitelských buněk; procento polypeptidů rekombinačního toxinů ve vzorku se tak zvýší. Dále se polypeptidy rekombinačního toxinů čistí odstraněním složek hostitelské buňky, jako je lipopolysacharid (například endotoxin).

Výraz „rekombinačni molekula DNA“ se vztahuje na molekulu DNA, která je tvořena segmenty DNA, spojenými navzájem metodami molekulární biologie.

Výraz „rekombinačni protein“ nebo „rekombinačni polypeptid“ se vztahuje na molekulu proteinu, která je exprimována z rekombinačni molekuly DNA.

Výraz „nativní protein“ se vztahuje na protein, který je izolován z přírodního zdroje oproti produkci proteinu rekombinačními metodami.

Výraz „část“ ve vztahu k proteinu (například „část daného proteinu“) se vztahuje na fragmenty tohoto proteinu. Fragmenty mohou mít velikost v rozmezí od čtyř aminokyselinových zbytků do celkové sekvence aminokyselin minus jedna aminokyselina.

·· ·· ·· · «· ·· • · · ···· ···· • ·♦*· · · · · ··· • ·· · · · · · · · « · · · >····«· · · · ·· ·» ·» «»· ·· «·

Výraz „rozpustný“ ve vztahu k proteinu, produkovanému rekombinační technologií DNA v hostitelské buňce označuje protein, který existuje v roztoku v cytoplasmě hostitelské buňky; jestliže protein obsahuje signální sekvenci, je rozpustný protein exportován do periplasmatického prostoru v bakteriálních hostitelích a vylučován do kultivačního média v eukaryotických buňkách schopných sekrece nebo bakteriálním hostitelem majícím příslušné geny (tj. gen kil). Naproti tomu nerozpustný protein je takový, který existuje v denaturované formě uvnitř cytoplasmatických granul (nazývaných inkluzní tělíska) v hostitelské buňce. Vysoká úroveň exprese (tj. větší než 10 až 20 mg rekombinačního proteinu/litr bakteriální kultury) rekombinačních proteinů často vede ktomu, že se exprimovaný protein nachází v inkluzních tělískách v buňkách bakteriálního hostitele. Rozpustný protein je protein, který se nenachází v inkluzním tělísku uvnitř hostitelské buňky nebo se nachází jak v cytoplasmě, tak v inkluzních tělískách a v tomto případě může protein přítomen v cytoplasmě ve vysokém nebo nízkém množství.

Existuje rozdíl mezi rozpustným proteinem (tj. proteinem, který je při expresi v hostitelské buňce produkován v rozpustné formě) a „solubiiizovaným“ proteinem. Nerozpustný rekombinační protein, nacházející se uvnitř inkluzního tělíska, může být solubilizován (tj. převeden do rozpustné formy) tak, že se na čištěná inkluzní tělíska působí denaturanty, jako je guanidinhydrochlorid, močovina nebo dodecylsulfát sodný (SDS). Tyto denaturanty je pak nutno ze solubilizovaného proteinového preparátu odstranit, aby byla umožněna renaturace získaného proteinu. Ne všechny proteiny po solubilizaci v denaturantu a odstranění denaturantu renaturují do aktivní konformace. Mnohé proteiny se po odstranění denaturantu vysrážejí. K solubilizaci inkluzních tělísek může být použit SDS, který udržuje proteiny v roztoku v nízké koncentraci. Diaiýzou se však ne vždy odstraní veškerý SDS (SDS může tvořit micely, které nevydialyzují); protein v inkluzních tělískách, solubilizovaný pomocí SDS, je tedy rozpustný, ale ne renaturovaný.

Existuje rozdíl mezi proteiny, které jsou rozpustné (tj. rozpuštěné) v roztoku neobsahujícím významná množství iontových detergentů (například SDS) nebo denaturantů (například močoviny, guanidinhydrochloridu), a proteiny, které existují jako suspenze molekul nerozpustného proteinu dispergovaných v roztoku. Rozpustný

··	··	0· »	··	49
♦ ·	•	9	•	• ·	• ·	4	•
• ·	···	•	•	•	4 4	44
• ·	• ·	« ·	•	•	4 444	4	•
• ·	• ·	•	•	•	4	•	•

protein se z roztoku jej obsahujícího neodstraní odstředěním s použitím podmínek dostatečných k odstranění bakterií přítomných v kapalném prostředí (tj. odstřeďováním při 5000 g po dobu 4 až 5 min). Za účelem zjištění, zda jsou dva proteiny, protein A a protein B, jsou rozpustné v roztoku, se například tyto dva proteiny umístí do roztoku vybraného ze skupiny zahrnující PBS-NaCI (PBS s obsahem 0,5 M NaCl), PBS-NaCI s obsahem 0,2 % Tweenu 20, PBS, PBS s obsahem 0,2 % Tweenu 20, PBS-C (PBS s obsahem 2 mM CaCI₂), PBS-C s obsahem buď 0,1 nebo 0,5 % Tweenu 20, PBS-C s obsahem buď 0,1 nebo 0,5 % NP-40, PBS-C s obsahem buď 0,1 nebo 0,5 % Tritonu X-100, PBS-C s obsahem 0,1 % deoxycholátu sodného. Směs obsahující proteiny A a B se pak odstřeďuje 5 min při 5000 g. Supernatant a peleta vzniklá odstřeďováním se pak testují na přítomnost proteinu A a B. Jestliže se protein A nachází v supernatantu a ne v peletě [kromě malých množství (tj. méně než 10 %) v důsledku zachycení], považuje se protein za rozpustný v testovaném roztoku. Jestliže se větší část proteinu B nachází v peletě (tj. více než 90 %), pak se protein B považuje za existující v suspenzi v testovaném roztoku.

Výraz „terapeutické množství“ se vztahuje na množství antitoxinu, nutné k neutralizaci patologických účinků jednoho nebo více klostridiálních toxinů v subjektu.

Výraz „terapeutická směs“, používaný ve vztahu ke směsi antitoxinů, se vztahuje na množství antitoxinu, nutné k neutralizaci patologických účinků jednoho nebo více klostridiálních toxinů v subjektu.

Výraz „terapeutická vakcina“, používaný ve vztahu k vakcině zahrnující jeden nebo více rekombinačních fúzních proteinů klostridiálního toxinů, znamená, že vakcina obsahuje imunologicky účinné množství fúzních proteinů (tj. imunogenů).

Výraz „imunogenně účinné množství“ se vztahuje k množství imunogenu, nutnému k vyvolání produkce ochranného množství protilátek v hostiteli (tj. subjektu) po vakcinaci.

Výraz „pyrogen“ se vztahuje na látku vyvolávající horečku. Pyrogeny mohou být vůči hostiteli endogenní (například prostaglandiny) nebo to mohou být exogenní sloučeniny (například bakteriální endo- a exotoxiny, nebakteriální sloučeniny, jako

jsou antigeny a určité steroidní sloučeniny atd.). přítomnost pyrogenu ve farmaceutickém roztoku může být detekována pomocí testu králičí horečky podle lékopisu USA (United States Pharmacopeia, sv. XXII (1990), United States Pharmacopeial Convention, Rockville, MD, str. 151).

Výraz „endotoxin“ se vztahuje na vysokomolekulární komplexy, asociované s vnější membránou gram-negativní bakterie. Nečištěný endotoxin obsahuje lipidy, proteiny a uhlohydráty. Vysoce čištěný endotoxin neobsahuje protein a označuje se jako lipopolysacharid (LPS). Protože při výrobě farmaceutických sloučenin (například proteinů produkovaných v E. coli pomocí technologie rekombinace DNA) má význam nečištěný endotoxin, vztahuje se zde výraz endotoxin na nečištěný endotoxin. Bakteriální endotoxin je známý pyrogen.

Výraz „prostý endotoxinu“, používaný ve vztahu k přípravku podávanému hostiteli parenterálně (s výjimkou intrathekální aplikace), znamená, že podávaná dávka obsahuje méně než 5 EU/kg tělesné hmotnosti [FDA Guidelines for Parenterál Drugs (prosinec 1987)]. Za předpokladu hmotnosti dospělého člověka 70 kg musí dávka obsahovat méně než 350 EU, aby vyhověla citovanému předpisu FDA. Hladiny endotoxinu se zde měří pomocí testu LAL (Limulus Amebocyte Lysáte Pyrochrome™, Associates of Cápe Cod, lne. Woods Hole, MA). Pro měření hladiny endotoxinu v přípravcích rekombinačních proteinů se v testu LAL podle pokynů výrobce pro chromogenní konečný bod bez diazokopulace použije 0,5 ml roztoku zahrnujícího 0,5 mg čištěného rekombinačního proteinu v 50 mM NaPO₄, pH 7,0, 0,3 M NaCl a 10 % glycerolu. Přípravky obsahující méně nebo rovno 450 endotoxinových jednotek (EU)/mg čištěného rekombinačního proteinu se zde označují jako „v podstatě prosté endotoxinu“. Podávání bakteriálních toxinů nebo toxoidů dospělým lidem za účelem vakcinace zahrnuje dávky asi 10 až 500 μg proteinu/dávku. Podávání 10 až 500 μg čištěného rekombinačního proteinu 70kg člověku, kdy tento čištěný rekombinační protein obsahuje 450 EU/mg proteinu, proto vede k zavedení pouze 4,5 až 225 EU (tj. 1,3 až 64,5 % maximálního přípustného zatížení endotoxinem na parenterální dávku).

Test LAL je uznáván úřadem U.S. FDA jako způsob detekce bakteriálních endotoxinů (21 C.F.R. §§ 660.100-105). Studie ukázaly, že test LAL je pro detekci

endotoxinu ekvivalentní nebo lepší než test králičího pyrogenu podle USP, a proto může být test LAL použit jako náhrada studií pyrogenity u živočichů [F.C. Perason, Pyrogens: endotoxins. LAL testing and depyrogenation. Marcel Dekker, New York (1985), str. 150 až 155]. Biologický úřad FDA akceptuje test LAL místo testu králičího pyrogenu podle USP, pokud se použitý test LAL ukáže jako stejně nebo více citlivý než králičí test [Fed. Reg., 38, 26130 (1980)].

Výraz „monovalentní“, používaný ve vztahu ke klostridiální vakcině, se vztahuje na vakcinu, která je schopna v hostiteli provokovat v hostitelském živočichovi (tj. subjektu) imunitní odpověď, zaměřenou proti jedinému typu klostridiálního toxinu. Například jestliže imunizace hostitele vakcinou toxinu typu A C. difficile indukuje v imunizovaném hostiteli protilátky, které chrání proti expozici toxinu typu A, ale ne proti expozici toxinu typu B, pak se vakcina typu A označuje jako monovalentní. Naproti tomu „multivaientní“ vakcina provokuje v hostitelském živočichovi imunitní odpověď zaměřenou proti několika (tj. více než jednomu) klostridiálním toxinům. Například jestliže imunizace hostitele vakcinou zahrnující toxiny typu A a B C. difficile indukuje produkci protilátek, které hostitele chrání před expozicí oběma typům toxinu A a B, označuje se vakcina jako multivaientní (konkrétně tato hypotetická vakcina je bivalentní).

Výrazy „agregát“ a „agregace“ se zde vztahují na tvoření shluků, nakupení nebo hmot materiálů. Není úmyslem omezovat tento výraz na určitý konkrétní typ shlukování. Naopak je úmyslem používat tento výraz v co nejširším smyslu, zahrnujícím všechny situace, v nichž se mnohonásobné prvky dostanou do těsného kontaktu. Tyto výrazy tedy zahrnují aglutinaci všech typů (neomezujícími příklady jsou aglutinace latexu, hemaglutinace nebo jakýkoli jiný pochod, při němž je ke vzniku aglutinace použita imunologická reakce). Tento výraz se vztahuje rovněž na neimunologické pochody a zahrnuje rovněž nespecifické vztahy mezi mnohočetnými komponentami: nutné je pouze, aby jednotlivé komponenty byly k sobě shluknuty.

Výraz „subjekt“, používaný ve vztahu k podávání přípravků zahrnujících antitoxiny nebo vakcin, se vztahuje na živočišného příjemce, jemuž jsou uvedené antitoxiny nebo vakciny podávány. Subjektem může být kterýkoli živočich, včetně savců a konkrétně lidí, u něhož je žádoucí tyto přípravky podávat. Subjekt může být před podáváním těchto přípravků vystaven jednomu nebo více toxinům C. difficile (v tom případě se jedná o terapeutické podávání subjektu). Alternativně subjekt nemusí být před podáváním těchto přípravků předem vystaven toxinům C. difficile (v tom případě se jedná o profylaktické podávání subjektu).

Výraz „vzorek“ je v popisu a v nárocích používán v nejširším smyslu. Jednak zahrnuje specimen nebo kulturu (například mikrobiologické kultury). Na druhé straně zahrnuje jak biologické, tak ekologické vzorky.

Biologické vzorky mohou být živočišné, včetně lidských, tekuté, pevné (například stolice) nebo tkáňové, stejně jako kapalné a pevné potravinářské a krmivářské produkty a složky, jako jsou mlékárenské výrobky, zelenina, maso a masné vedlejší výrobky a odpad. Biologické vzorky mohou být získány od všech druhů domácích stejně jako divokých zvířat, jejichž neomezujícími příklady mohou být takoví živočichové, jako jsou kopytnatci, medvědi, ryby, lagamorfa, hlodavci atd.

Ekologické vzorky zahrnují materiál životního prostředí, jako je povrchová hmota, půda, voda a průmyslové vzorky, stejně jako vzorky získané z přístrojů, zařízení, instalací, nástrojů, jednorázových a vícerázových pomůcek při zpracování potravin a mléka. Tyto příklady nejsou zamýšleny jako omezující typ vzorku použitelný podle vynálezu.

Výraz „kultura“ se zde používá ve vztahu k růstu organismů, zahrnujících například bakterie, in vivo nebo in vitro. Tento výraz je zamýšlen jako zahrnující všechny formy mikrobiálních kultur. Je zamýšlen jako zahrnující propagaci mikroorganismů nebo jiných živých buněk v médiu a v prostředí, které vede k jejich růstu. Tyto kultury mohou být pěstovány v jakémkoli formátu, zahrnujícím například agarové destičky, fermentační prostředí a polopevná prostředí, a v jakémkoli prostředí vhodném pro pěstovaný organismus (tj. aerobním, anaerobním, mikroaerofilním atd.)

Výraz „supernatantů se zde používá ve vztahu k jakémukoli kapalnému nebo tekutému roztoku. Tato kapalina nebo tekutina může nebo nemusí obsahovat pevné částice, jako jsou proteiny (například protilátky nebo molekuly toxinů). Tento výraz zahrnuje jakoukoli kapalinu ležící nad vysráženým nerozpustným materiálem, stejně jako kapaliny, jako jsou kapalná kultivační média, odebraná z mikrobiální nebo buněčné kultury. Zahrnuje rovněž kapalnou část vzorku, který byl odstřelován za účelem odstranění nerozpustných částic, které nejsou schopny během odstřeďování zůstat v roztoku, od částic, které jsou schopny během odstřelování zůstat v roztoku. Není však úmyslem omezovat význam tohoto výrazu na situaci, v níž je používáno odstřeďování.

Výraz „ochranné množství“, používané ve vztahu k hladině protilátek, indukovaných imunizací hostitele imunogenem, který zahrnuje bakteriální toxin, znamená hladinu oběhu protilátek, dostatečnou k ochraně hostitele před expozicí letální dávkou toxinu.

Výrazy „protein“ a „polypeptid“ se zde vztahují na sloučeniny zahrnující aminokyseliny, spojené peptidickými vazbami, a jsou vzájemně zaměnitelné.

Výraz „toxin“, používaný ve vztahu k toxinům produkovaným členy (tj. druhy a kmeny) rodu Clostridium, se vztahuje na proteiny, které jsou toxické pro tkáň (tkáně). Například toxiny produkované C. difficile jsou toxické pro intestinální tkáně; toxiny produkované C. botulinum jsou toxické pro nervovou tkáň.

Výrazy „enkapsulace“ nebo „zapouzdřování“ se vztahují na povlékání pevné (například lyofilizované) formy antitoxinu. Povlak může zahrnovat jakýkoli enterosolventní povlak nebo kapsli. Výrazy „enterosolventní povlak“ nebo „enterosolventní film“ se používají vzájemně zaměnitelně a označují látku nebo sloučeninu, která je odolná vůči kyselému pH (tj. kyselinovzdorná sloučenina), jaké se nachází v žaludku. Enterosolventní povlak, nanesený na pevnou látku, inhibuje rozpouštění této pevné látky v žaludku.

Pro enkapsulaci pevných přípravků existují standardní metody. Tyto metody zahrnují mikroenkapsulaci pevného přípravku, při níž se na pevný přípravek nanáší enterosolventní povlak. Povlečený materiál může být subjektu podáván orálně tak, že se mikroenkapsulované částice suspendují ve známých farmaceutických suspenzních roztocích.

Má-li být pomocí enterosolventního povlaku enkapsulován pevný antitoxin, může být enterosolventní povlak aplikován s použitím jednostupňového procesu povlékání, při němž se na pevný antitoxin přímo nanáší enterosolventní film;

povlečený antitoxin se označuje jako překrytý enterosolventním filmem. Alternativně je možno použít dvoustupňového procesu nanášení, při němž se nejprve pevným antitoxinem povleče nonpareil (například částice cukru o velikosti asi 40 až 60 mesh) a pak se tento nonpareil povlečený antitoxinem povleče enterosolventním filmem. Žádoucí enterosolventní povlaky pro aplikaci antitoxinů zahrnují polymethakryláty, jako je Eudragit® L30D (Rohm Tech, lne.).

Pevný antitoxin může být pro orální podávání formulován vložením požadovaného množství antitoxinu do kapsle; přednostně má kapsle takové charakteristiky, že je odolná proti rozpouštění v žaludku a schopná rozpuštění ve střevech. Jsou dostupné četné vhodné známé formulace kapslí; navíc jsou k dispozici standardní metody plnění kapslí zahrnující použití inertních plnících materiálů k získání dostatečného objemu náplně kapsle s terapeutickou kompozicí v pevné formě. Kromě použití mikroenkapsulovaného antitoxinu a antitoxinu obsaženého v kapsli může být pevný antitoxin podáván orálně ve formě tablet nebo pilulek. Pro dosažení dostatečného objemu pro lisování tablety nebo pilulky může být pevný antitoxin kombinován s inertními materiály. Po vytvoření může být tableta nebo pilulka povlékána enterosolventním filmem, bránícím rozpouštění v žaludku a podporujícím rozpouštění ve střevech.

Výraz „orální podávání“ nebo „orální aplikace“ se vztahuje na dodávání přípravku, jako je přípravek zahrnující antitoxin, ústy.

Výraz „parenterální podávání“ nebo „parenterální aplikace“ se vztahuje na dodávání přípravku, jako je přípravek zahrnující antitoxin nebo vakcinu, jinou cestou než přes gastrointestinální trakt (například orálně) nebo plíce. Parenterální aplikace může probíhat zejména intravenózní, subkutánní, intramuskulární nebo intramedulární (tj. intrathekální) injekcí.

Výraz „příznaky“ a „příznaky intoxikace“, používaný ve vztahu k subjektu vystavenému nebo v nebezpečí vystavení toxinům C. difficile, se vztahuje na přítomnost kteréhokoli z těchto jevů: průjem, enterokolitis, pseudomembránová kolitis, krvácení, ulcerace a/nebo zánět střevní slizníce, cecitis (tj. zánět slepého střeva).

• ·

Výraz „přestává vykazovat příznaky“ se vztahuje na situaci, v níž subjekt přestal vykazovat znaky a/nebo příznaky spojené s onemocněním a/nebo infekcí C. difficile.

Výraz „podstatná eliminace“ příznaků intoxikace onemocněním C. difficile znamená, že u subjektu, vystaveného intoxikaci a trpícího příznaky intoxikace jsou příznaky zmírněny, oslabeny nebo eliminovány. Například jestliže intoxikovaný subjekt vykazuje silný průjem (tj. objemný, vodnatý průjem), tvoří podstatnou eliminaci tohoto příznaku návrat k alespoň volně formované stolici.

Výraz „po uplynutí doby léčby“, používaný v souvislosti ze způsobem ošetřování subjektu vystaveného toxinu C. difficile, znamená období po přerušení podávání terapeutické sloučeniny (například antitoxinu) subjektu po dobu alespoň 7 dní, výhodně alespoň 14 dní. Terapeutická sloučenina, která vede k podstatné eliminaci příznaků intoxikace po uplynutí doby léčby, brání opětnému objevení (jsou-li příznaky eliminovány) nebo zvětšení intenzity (jsou-li příznaky zmírněny) těchto příznaků po dobu alespoň 7 dní po vysazení aplikace terapeutické sloučeniny. Jinými slovy není u většiny [tj. u statisticky významného počtu (například 75 %)] subjektů po dobu alespoň 7 dní po přerušení terapie pozorován relaps (tj. znovuobjevení nebo zvýšení intenzity).

Na rozdíl od antitoxinů podle vynálezu současné terapeutické sloučeniny pro nepopiratelné infekce C. difficile [tj. antibiotika, jako je vankomycin nebo metronidazol nebo koncentrát bovinního IgG z krav imunizovaných toxoidy A a B C. difficile [Lyerly a d. (1991) Infect. Immun. 59:2215] ve významném počtu ošetřených subjektů nebrání relapsu. Relapsuje (tj. znovu se objevují příznaky intoxikace) například asi 25 % lidí a až 100 % křečků trpících onemocněním spojeným s C. difficile, ošetřovaným vankomycinem nebo metronidazolem.

Křečci, jimž byl podáván koncentrát bovinního IgG (BIC) z krav imunizovaných toxoidy A a B před infekcí C. difficile (tj. profylaktické ošetření) vždy relapsují (tj. průjmy se vracejí) a hynou, jakmile je BIC stažen [Lyerly a d. (1991), viz výše], Jsou-li pomocí BIC ošetřováni křečci se zjištěnou infekcí C. difficile, není pozorován žádný terapeutický efekt (tj. podávání BIC neeliminuje průjem nebo nebrání úhynu) [Lyerly a d. (1991), viz výše].

Naproti tomu antitoxiny podle vynálezu, jsou-li používány k ošetřování zjištěné infekce C. difficile (terapeutický režim), podstatně eliminují příznaky intoxikace včetně průjmu a brání úmrtí. Většina živočichů ošetřovaných proteiny anti-toxinu C. difficile nerelapsuje a zůstává zdravých po přerušení antitoxinové terapie po dobu alespoň 14 dnů [zvířata zůstávají zdravá po dlouhou dobu (například asi 5 měsíců)].

Podstata vynálezu

Vynález se týká výroby polypeptidů odvozených od toxinů. V jednom provedení spadá do vynálezu fúzní protein zahrnující polyhistidinový úsek a část toxinu. Vynález není omezen na typ nebo charakter toxinu. Například jsou jako fúzní proteiny zahrnující polyhistidinový úsek exprimovány části toxinů produkovaných členy rodu Clostridium.

Ve výhodném provedení zahrnují toxinové polypeptidy neurotoxin Clostridium botuiinum. Vynález zahrnuje použití polypeptidů odvozených od toxinu C. botulinum jako imunogenů pro výrobu vakcin a antitoxinů. Vakciny a antitoxiny C. botulinum nalézají použití u lidí a jiných živočichů. V jednom provedení spadá do vynálezu fúzní protein zahrnující netoxinovou proteinovou sekvenci a část toxinu typu A Clostridium botulinum. Ve výhodném provedení zahrnují sekvence toxinu typu A C. botulinum část sekvence SEQ ID NO:28. V dalším výhodném provedení zahrnují sekvence toxinu typu A C. botulinum část sekvence SEQ ID NO:23. Vynález není omezen na charakter fúzního proteinu. Fúzní protein může například zahrnovat sekvenci toxinu typu A Clostridium botulinum, uvedenou jako SEQ ID NO:23, spolu s polyhistidinovým úsekem.

Do vynálezu spadá rovněž hostitelská buňka obsahující rekombinační expresní vektor, kde vektor kóduje fúzní protein zahrnující netoxinovou proteinovou sekvenci a část sekvence toxinu typu A Clostridium botulinum SEQ ID NO:28. V tomto provedení je hostitelská buňka schopna exprimovat kódovaný protein toxinu typu A Clostridium botulinum jako rozpustný protein v úrovni větší nebo rovné 0,25 až 10 % celkového buněčného proteinu a výhodně v úrovni větší nebo rovné 0,75 % celkového buněčného proteinu. Vynález není omezen na charakter fúzního proteinu exprimovaného rekombinačním vektorem v hostitelské buňce. Fúzní protein může například zahrnovat sekvenci toxinů typu A Clostridium botulinum, uvedenou jako SEQ ID NO:23, spolu s polyhistidinovým úsekem.

Do vynálezu rovněž spadá hostitelská buňka obsahující rekombinačni expresní vektor, kde vektor kóduje protein odvozený od sekvence toxinů typu A Clostridium botulinum SEQ ID NO:28. V tomto provedení je hostitelská buňka schopna exprimovat kódovaný protein toxinů typu A Clostridium botulinum v úrovni větší nebo rovné 10 až 40 % celkového buněčného proteinu a výhodně v úrovni větší nebo rovné 20 % celkového buněčného proteinu. Vynález není omezen charakterem fúzního proteinu, exprimovaného rekombinačním vektorem v hostitelské buňce. Fúzní protein může například zahrnovat sekvenci toxinů typu A Clostridium botulinum, uvedenou jako SEQ ID NO:23, spolu s polyhistidinovým úsekem.

V jednom provedení do vynálezu spadá způsob vytváření neutralizujících toxinů, zaměřených proti toxinů typu A Clostridium botulinum, zahrnující (v jakémkoli pořadí) čištěný rozpustný fúzní protein, zahrnující netoxinovou proteinovou sekvenci a část sekvence toxinů typu A Clostridium botulinum SEQ ID NO:28, stejně jako imunizaci hostitele čištěným fúzním proteinem za účelem vytvoření protilátek schopných neutralizovat nativní toxin typu A Clostridium botulinum. Fúzní protein může například zahrnovat část sekvence toxinů typu A Clostridium botulinum, uvedené jako SEQ ID NO:23, a polyhistidinový úsek. Způsob může dále zahrnovat další stupeň odebírání protilátek z hostitele. Odebrané protilátky dále mohou být čištěny. Vynález zahrnuje protilátku jako takovou, vytvořenou výše uvedenými metodami.

Do vynálezu dále spadá způsob čištění rekombinačního fúzního proteinu, odvozeného z toxinů typu A Clostridium botulinum. V tomto provedení rekombinačni fúzní protein zahrnuje polyhistidinový úsek, zahrnující (v jakémkoli pořadí) roztok zahrnující fúzní protein zahrnující polyhistidinový úsek a část sekvence toxinů typu A Clostridium botulinum SEQ ID NO:28, a chromatografickou pryskyřici zahrnující dvojmocný kation kovalentně navázaný na pevný nosič. V tomto provedení se tento roztok přidává k chromatografické pryskyřici za účelem navázání fúzního proteinu

I ·· ·· ·· · ·· ·· ··· ··»· ·«·· • ···· · · · · ··· • ·· ··· · · · ···· · ······· ··· ·· ·· · · ··· · · ♦· k chromatografické pryskyřici. Toto provedení může dále zahrnovat stupeň promývání chromatografické pryskyřice obsahující uvedený navázaný fúzní protein za účelem odstranění nefúzního proteinu z chromatografické pryskyřice a vymývání navázaného fúzního proteinu z promyté chromatografické pryskyřice.

Ve výhodném provedení chromatografická pryskyřice zahrnuje niklové ionty, imobilizované na pevném nosiči. Příklady komerčně dostupných kolon s niklovými ionty zahrnují pryskyřici His*Bind® (Novagen) a agarózovou pryskyřici Ni-NTA (Qiagen). Protože agarózová pryskyřice Ni-NTA má velmi vysokou afinitu pro vazbu proteinů obsahujících polyhistidinový úsek, je velmi výhodná jako chromatografická pryskyřice.

Vynález není omezen charakterem roztoku zahrnujícího fúzní protein zahrnující polyhistidinový úsek a část sekvence toxinů typu A Clostridium botulinum SEQ ID NO:28. V jednom provedení zahrnuje tento roztok rozpustný extrakt, odvozený z buněčné pelety zahrnující hostitelské buňky obsahující rekombinační fúzní protein. V dalším provedení je rozpustný extrakt vytvořen z buněčné pelety suspendováním ve vazebném pufru a rozrušením suspenze za účelem rozrušení membrán hostitelské buňky za vzniku směsi zahrnující rozpustné proteiny a nerozpustné buněčné zbytky. V dalším provedení způsob čištění rekombinačního fúzního proteinu odvozeného od toxinů typu A Clostridium botulinum, kde rekombinační fúzní protein zahrnuje polyhistidinový úsek, dále zahrnuje stupeň odstraňování nerozpustných buněčných zbytků z porušené suspenze buněk za vzniku čirého rozpustného lyzátu. V ještě dalším provedení způsob čištění rekombinačního fúzního proteinu používá přídavek neiontového detergentu k získanému čirému lyzátu. Výhodným neiontovým detergentem je Nonidet P-40. V ještě dalším výhodném provedení způsob čištění rekombinačního fúzního proteinu zahrnuje další stupeň inkubace čirého rozpustného lyzátu, obsahujícího uvedený neiontový detergent, chromatografickou pryskyřicí po dobu více než 1 h při 4 °C za účelem navázání fúzního proteinu na chromatografickou pryskyřici. Zvlášť výhodné jsou inkubační stupně v délce asi 3 h.

Vynález se týká klostridiální antitoxinové terapie pro lidi a jiné živočichy. Antitoxiny, které neutralizují patologické účinky klostridiálních toxinů, se vytvářejí «· ·· ·· · ·· ·· • · · · · · · ···· • ···· · · · · · · · • ·· ··· · · · ···· · ······· ··· ·· t· ·· ··· ·· ·· imunizací ptačích hostitelů rekombinačními fragmenty toxinu. V jednom provedení do vynálezu spadá fúzní protein zahrnující netoxinovou proteinovou sekvenci a část sekvence toxinu B Clostridium difficile SEQ ID NO: 10. Vynález není omezen charakterem fúzního proteinu. Fúzní protein může například zahrnovat část sekvence toxinu B Clostridium difficile, uvedené jako SEQ ID NO:20, a maltózu vázající protein (nebo jeho část). Na druhé straně může fúzní protein zahrnovat sekvenci toxinu B Clostridium difficile, uvedenou jako SEQ ID NO:21, spolu s polyhistidinovým úsekem.

V jednom provedení zahrnuje vynález způsob tvorby neutralizujícího antitoxinu zaměřeného proti toxinu B Clostridium difficile, zahrnující a) v jakémkoli pořadí získání i) čištěného fúzního proteinu, zahrnujícího netoxinovou proteinovou sekvenci a část toxinu B Clostridium difficile SEQ ID NO:10, a ii) ptačího hostitele a b) imunizaci tohoto hostitele uvedeným čištěným fúzním proteinem za účelem vytvoření antitoxinu schopného neutralizovat nativní toxin B Clostridium difficile. Opět pouze jako příklad je možno uvést, že fúzní protein může zahrnovat část sekvence toxinu B Clostridium difficile, uvedené jako SEQ ID NO: 20, a maltózu vázající protein /nebo jeho část). Na druhé straně může fúzní protein zahrnovat sekvenci toxinu B Clostridium difficile, uvedenou jako SEQ ID NO:21, spolu s polyhistidinovým úsekem. Způsob může dále zahrnovat stupeň c) získání uvedeného antitoxinu z uvedeného hostitele a dále d) čištění tohoto antitoxinu. Do vynálezu spadá protilátka, získaná výše uvedenými způsoby, jako taková.

Vynález dále zahrnuje způsob léčby zahrnující a) získání i) subjektu a ii) alespoň jednoho neutralizujícího antitoxinu zaměřeného proti fúznímu proteinu, zahrnujícímu netoxinovou proteinovou sekvenci a část sekvence toxinu B Clostridium difficile SEQ ID NO: 10, a b) podávání uvedeného antitoxinu uvedenému subjektu.

V jednom provedení zahrnuje vynález podávání orální cestou. Vynález dále zahrnuje skutečnost, že ošetřovaný subjekt může nebo nemusí být vystaven Clostridium difficile a jeho toxinům. To znamená, že v jednom případě může expozice toxinu B Clostridium difficile proběhnout před podáním antitoxinu. V jiném případě subjekt nebyl před podáním antitoxinu vystaven toxinu typu B Clostridium difficile.

Do vynálezu rovněž spadají fúzní proteiny obsahující fragmenty toxinu A.

V jednom provedení spadá do vynálezu fúzní protein zahrnující netoxinovou ·· ·· ·· · ·· ·♦ • · · ···· ···· • · ··· · · · · · ·· • ·· « · · · · · ···· · ······· ··· ·· ·· ·· ··· ·· ·· proteinovou sekvenci a část sekvence toxinu typu A Clostridium difficile, sestávající z SEQ ID NO:7. V dalším provedení spadá do vynálezu fúzní protein zahrnující netoxinovou proteinovou sekvenci a část sekvence toxinu A Clostridium difficile, zahrnující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:8. Ve výše popsaných provedeních může být netoxinová část fúzního proteinu vybrána z různých typů sekvencí netoxinových proteinů. Ve výhodném provedení je netoxinovou sekvencí sekvence maltózu vázajícího proteinu (nebo její část).

Do vynálezu spadá způsob generování neutralizujícího antitoxinu zaměřeného proti toxinu A Clostridium difficile, zahrnující a) získání v jakémkoli pořadí: i) čištěného fúzního proteinu zahrnujícího netoxinovou proteinovou sekvenci (například sekvenci maltózu vázajícího proteinu nebo její část) a část sekvence toxinu A Clostridium difficile (například sekvenci toxinu A, jak je uvedena v SEQ ID NO:7), a ii) ptačího hostitele, a b) imunizaci uvedeného hostitele uvedeným čištěným fúzním proteinem za účelem vytvoření antitoxinu schopného neutralizovat toxin A Clostridium difficile. Způsob může dále zahrnovat stupeň c) získání uvedeného antitoxinu z uvedeného hostitele a d) čištění uvedeného antitoxinu.

Do vynálezu rovněž spadá použití fragmentů toxinů ve vakcinách a diagnostických testech. Fragmenty mohou být používány odděleně jako čištěné rozpustné antigeny nebo alternativně ve směsích nebo „koktejlech“.

Vynález poskytuje přípravky zahrnující ptačí neutralizující antitoxin zaměřený proti části toxinu A C. difficile a části toxinu B C. difficile. Tyto antitoxiny nalézají použití u lidí a jiných živočichů, vystavených nebo v nebezpečí expozice C. difficile. V jednom provedení je složka ptačího neutralizujícího antitoxinu zaměřeného proti části toxinu A C. difficile zaměřena proti prvnímu fúznímu proteinu, zahrnujícímu část toxinu A C. difficile, a druhému fúznímu proteinu, zahrnujícímu část toxinu B C. difficile. V dalším provedení zahrnuje první i druhý fúzní protein alespoň jednu netoxinovou proteinovou sekvenci. V ještě dalším provedení je antitoxin zaměřen proti části toxinu A C. difficile, zahrnující část SEQ ID NO:6. V jiném provedení je antitoxin zaměřen proti části toxinu A C. difficile, kde část SEQ ID NO:6 zahrnuje sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO:7, 8 a 29. V ještě dalším provedení zahrnuje první i druhý fúzní protein alespoň jednu netoxinovou proteinovou ·· ·· · ·· ·· ··· ···· ···· • · ··· · · · · · ·· ······· · · ··· · · ·«····· ··· • · ·· ·· ··· 99 9· sekvenci. Vynález není omezen charakterem netoxinové proteinové sekvence. V jednom provedení netoxinová proteinová sekvence zahrnuje maltózu vázající protein. V jiném provedení zahrnuje netoxinová proteinová sekvence thioredoxinový protein. V ještě dalším provedení je antitoxin zaměřen proti části toxinu B C. difficile, zahrnující část SEQ ID NO:10. V jiném provedení je antitoxin zaměřen proti části toxinu B C. difficile, kde část SEQ ID NO:10 zahrnuje sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO:11, 12, 20, 21 a 30. V ještě dalším provedení přípravky zahrnující ptačí antitoxiny dále zahrnují enterosolventní povlak.

Do vynálezu rovněž spadá způsob léčby zahrnující a) získání: i) subjektu, ii) prvního ptačího neutralizujícího antitoxinu zaměřeného proti části sekvence toxinu A Clostridium difficile SEQ ID NO:6 a iii) druhého ptačího neutralizujícího antitoxinu zaměřeného proti části sekvence toxinu B Clostridium difficile SEQ ID NO:10, b) smísení prvního a druhého antitoxinu za vytvoření terapeutické směsi a c) podávání této terapeutické směsi subjektu po dobu léčby. Do vynálezu dále spadá způsob léčby, který dále zahrnuje před stupněm c) stupeň zpracování terapeutické směsi za účelem zlepšení její enterické stability. Ve výhodném provedení tato léčba zahrnuje enkapsulaci antitoxinů v terapeutické směsi. Ve zvláště výhodném provedení stupeň enkapsulace zahrnuje povlékání antitoxinů enterosolventním filmem.

Do vynálezu dále spadá způsob léčby, kde subjekt byl před podáváním antitoxinu exponován alespoň jednomu toxinu Clostridium difficile. V jednom provedení trpí exponovaný subjekt příznaky intoxikace a podávání antitoxinu vede k podstatné eliminaci příznaků po přerušení léčby. V jiném provedení zahrnují příznaky intoxikace průjem.

Do vynálezu rovněž spadá způsob léčby, kdy subjekt nebyl před podáváním antitoxinu vystaven toxinu Clostridium difficile.

V jednom provedení se při způsobu léčby nejprve získá první ptačí antitoxin zaměřený proti části toxinu A Clostridium difficile, zahrnující proteinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO:7, 8 a 29. V jiném provedení se získá druhý ptačí antitoxin, zaměřený proti části toxinu B Clostridium difficile, zahrnující proteinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO:11, 12, 20, 21 a 30.

• · ·· ·· · · · · · • · · ···· ···· ··«·· · · · * · ·· • ·· ··· · · · ···· · ···· · · · ··· • · ·· ·· · · · ·· ··

Způsob léčby není omezen způsobem podávání antitoxinu. V jednom provedení způsob léčby zahrnuje podávání antitoxinů orální cestou. V jiném provedení způsob léčby zahrnuje podávání antitoxinů parenterální cestou.

Do vynálezu dále spadá způsob vakcinace subjektu za účelem vytvoření neutralizujícího antitoxinu zaměřeného proti toxinů C. difficile, zahrnující a) získání v jakémkoli pořadí: i) subjektu, ii) prvního čištěného rozpustného a vpodstatě endotoxinů prostého proteinu zahrnujícího sekvenci toxinů A Clostridium difficile SEQ ID NO:6 a iii) druhého čištěného rozpustného a v podstatě endotoxinů prostého proteinu zahrnujícího část sekvence toxinů B Clostridium difficile SEQ ID NO:10, b) smísení prvního a druhého proteinu za vytvoření terapeutické vakciny a d) vakcinaci subjektu terapeutickou vakcinou za účelem vytvoření neutralizujícího antitoxinu.

V jednom provedení je tímto subjektem pták. V jiném provedení je subjektem savec.

V ještě dalším provedení je subjektem člověk. V dalším provedení první i druhý protein dále zahrnuje alespoň jednu netoxinovou proteinovou sekvenci. Vynález není omezen charakterem netoxinové proteinové sekvence. V jednom provedení netoxinová proteinová sekvence zahrnuje poiyhistidinový úsek. V jiném provedení zahrnuje netoxinová proteinová sekvence maltžu vázající protein. V ještě dalším provedení zahrnuje netoxinová proteinová sekvence thioredoxinový protein.

V jednom provedení se při způsobu vakcinace používá první čištěný a v podstatě endotoxinů prostý protein zahrnující SEQ ID NO:29. V jiném provedení se při způsobu vakcinace používá druhý čištěný a v podstatě endotoxinů prostý protein zahrnující SEQ ID NQ:30.

Vynález dále poskytuje fúzní protein, zahrnující alespoň jednu netoxinovou proteinovou sekvenci a část sekvence toxinů A Clostridium difficile, tvořenou SEQ ID NO:29. V jednom provedení netoxinová proteinová sekvence zahrnuje thioredoxinový protein. V jiném provedení netoxinová proteinová sekvence dále zahrnuje poiyhistidinový úsek.

Vynález poskytuje způsob detekce antigenů Clostridium difficile ve vzorku, při němž se v jakémkoli pořadí získá vzorek s podezřením na obsah antigenů Clostridium difficile, pevné nosné konjugáty, zahrnující protilátky reaktivní s antigeny Clostridium difficile, navázanými na pevný nosič, vzorek a pevné nosné konjugáty se • » • · smísí za podmínek, za nichž jsou konjugáty schopny vázat antigeny Clostridium difficile, a detekuje se vazba. V jednom provedení reagují ptačí protilátky s toxinem A Clostridium difficile. Ve zvláště výhodném provedení ptačí protilátky reagují s toxinem B Clostridium difficile. V jiném výhodném provedení reagují ptačí protilátky s intervalem B-3 toxinu Β. V dalším výhodném provedení ptačí protilátky reagují s toxinem A í toxinem B. Do vynálezu rovněž spadá, jestliže použitý pevný nosič zahrnuje polystyrénové částice. V jednom výhodném provedení vede stupeň míšení ke vzniku viditelných agregátů. Ve výhodném provedení je vzorkem lidská stolice.

V alternativním provedení zahrnuje vynález způsob léčby zahrnující získání subjektu vystaveného Clostridium difficile, vykazujícího příznaky zahrnující průjem, a protilátky reagující s Clostridium difficile, kde protilátka je přítomna v terapeutickém množství, které je aplikovatelné, a podávání protilátky subjektu za takových podmínek, že subjekt přestane vykazovat příznaky a je možno ukončit léčbu. Ve zvlášť výhodném provedení vykazuje subjekt dlouhodobé přežití po skončení léčby. V jednom výhodném provedení jsou protilátkami reagujícími s antigeny Clostridium difficile ptačí protilátky. Předpokládá se, že protilátky budou reaktivní vůči různým jednotkám nebo antigenům, zahrnujícím, avšak neomezujícím se na toxin A Clostridium difficile, interval A-6 toxinu A, toxin B Clostridium difficile,, interval B-3 toxinu B a kombinaci toxinu A a toxinu B.

Vynález dále poskytuje způsob čištění toxinů Clostridium difficile z kultury, zahrnující v jakémkoli pořadí získání kultury zahrnující organismy Clostridium difficile a supernatantu zahrnujícího toxiny v roztoku, protilátek reaktivních s toxiny Clostridium difficile imobilizovaných na pevném nosiči, odebrání supernatantu z kultury zahrnující toxiny, přidání supernatantu k imobilizované protilátce za takových podmínek, že protilátky jsou schopny vazby na toxiny, eluování toxinů z imobilizovaných protilátek a detekci veškerých eluovaných toxinů. V jednom výhodném provedení jsou protilátkami reaktivními s antigeny Clostridium difficile ptačí protilátky. Předpokládá se, že při tomto způsobu budou používány různé protilátky včetně protilátek reaktivních vůči různým antigenům nebo jednotkám, zahrnující, avšak neomezující se na toxin A Clostridium difficile, interval A-6 toxinu A, toxin B Clostridium difficile, interval B-3 toxinu B a kombinaci toxinu A a toxinu B.

• · ♦ · ·« • · · · · • · · · · · · • · · · · · · • · · « · · ·· · · « ·

Vynález poskytuje přípravky zahrnující ptačí antitoxin zaměřený proti proteinu klostridiálního toxinu. Ve výhodném provedení jsou tyto přípravky v pevné dávkové formě. Výraz „pevná dávková forma“ zahrnuje dávkové formy zahrnující tablety, pilulky, kapsle (zahrnující například tzv. gel-cap ve významu, v jakém je používán ve farmaceutickém průmyslu) a všechny jejich variace s prodlouženým uvolňováním (například regulované uvolňování, trvalé uvolňování, časované uvolňování, prodloužený účinek apod.). Výraz „pevná dávková forma“ může navíc dále zahrnovat suspenze (tj. pevné částice zahrnující ptačí antitoxin suspendovaný v kapalném vehikulu; pevné částice mohou dále zahrnovat enterosolventní povlak), které mohou být aplikovány orálně.

V jednom provedení zahrnuje pevná dávková forma ptačího antitoxinu enterosolventní povlak. Ve zvlášť výhodném provedení se enterosolventní povlak rozpouští při pH asi 7,0. Výrazy „při pH asi 7,0“ a „pH asi 7,0“ se používají vzájemně zaměnitelně a vztahují se na rozmezí pH 6,5 až 7,5. Zvlášť výhodné enterosolventní povlaky jsou takové, které zůstávají v podstatě netknuté během průchodu enterosolventní tablety (pilulky, kapsle atd.) žaludkem (pH asi 0 až 2,0) a tenkým střevem (pH asi 5,0 až 6,5), ale rozpouštějí se, dosáhnou-li tlustého střeva (pH asi 7,0). Příklady vhodných enterosolventních povlaků jsou kopolymery kyseliny methakrylové [například Eudragit L nebo S (Rohm Tech, lne., Malden, MA)] acetátftalát celulózy (CAP) [například Aquateric (FMC Corp., Philadelphia, PA), který se rozpouští při pH 6,5], acetátsukcinát hydroxypropylmethylcelulózy (HPMCAS) [například Aquoat Grade 3 (Shin-Etsu Chemical Corp., Japonsko), který se rozpouští při pH 7,0] a polyvinylacetátftalát (PVAP) [například Sureteric (Colorcaon, lne., West Point, PA)]. Výraz „v podstatě netknutý“ v souvislosti s enterosolventně povlečenou tabletou (pilulkou, kapslí atd.) znamená, že při pH pod asi 7,0 je uvolňováno méně než 10 % proteinu (tj. ptačího antitoxinu).

V jednom provedení zahrnuje ptačí antitoxin, přítomný v pevné dávkové formě, tabletu. Výraz „tableta“ se vztahuje na pevnou dávkovou formu obsahující léčebné látky (například ptačí antitoxin) s vhodnými ředidly, vehikuly, plnivy atd. nebo bez nich. Tableta může mít různý tvar, velikost a hmotnost a může být tříděna podle

způsobu výroby (například tvarovaná tableta, lisovaná tableta atd.). Výraz tableta zahrnuje pilulky.

V dalším provedení obsahují přípravky zahrnující ptačí antitoxiny v pevné dávkové formě polyethylenglykol (PEG). Pevné dávkové formy (například tablety) zahrnující přípravky s lyofilizovanou ptačí protilátkou (tj. antitoxinem) obsahující PEG mohou obsahovat 0 až 60 % (z celkové hmotnosti tablet), přednostně 20 až 40 % PEG. Tablety mohou obsahovat rovněž vodu (stejně jako plniva, pojivá, nastavovadla, barviva atd.) Obsah vody se může měnit; přítomnost vody v tabletě je důsledkem absorpce vody z atmosféry během manipulace s lyofilizovanými přípravky ptačích protilátek před tvorbou tablet nebo během ní. Je-li žádoucí, je možno při tvorbě tablet vodu k pevným přípravkům protilátek úmyslně přidávat.

Vynález dále poskytuje způsob vytváření pevné dávkové formy ptačího antitoxinů zaměřeného proti klostridiálnímu toxinovému proteinu, zahrnující: a) získání přípravku zahrnujícího ptačí antitoxin zaměřený proti klostridiálnímu toxinovému proteinu v suché formě a b) tvarování tohoto suchého ptačího antitoxinů do tablety. Způsob tvarování suchého antitoxinů do tablety zahrnuje jakýkoli postup schopný uvést pevný antitoxinový přípravek do formy tablety, včetně lisování nebo tvarování antitoxinů. Metody vytváření tablet ze suchého materiálu jsou známy. Ve výhodném provedení se tvarování suchého antitoxinů do tablet provádí lisováním suchého antitoxinů pomocí tabletovacího lisu.

V dalším provedení způsob vytváření pevné dávkové formy zahrnující ptačí antitoxin dále zahrnuje stupeň nanášení enterosolventního povlaku na tabletu. V dalším výhodném provedení způsob vytváření pevné dávkové formy zahrnující ptačí antitoxin používá kompozici, obsahující suchý antitoxin, která obsahuje polyethylenglykol.

Vynález předpokládá vakcinaci lidí a jiných živočichů polypeptidy odvozenými od neurotoxinu C. botulinum, které jsou v podstatě prosté endotoxinu. Tyto botulinové peptidy jsou použitelné rovněž pro produkci antitoxinů. Anti-botulinální antitoxin je vhodný pro ošetřování pacientů, u nichž se projevují nebo hrozí příznaky v důsledku působení toxinů C. botulinum. Organismy, toxiny a jednotlivé stupně podle vynálezu jsou podrobně popsány dále.

I. Druhy Clostridium, klostridiální onemocnění a související toxiny

Výhodné provedení způsobu podle vynálezu je zaměřeno na získání protilátek proti druhům Clostridium, jejich toxinům, enzymům nebo jiným metabolickým produktům, komponentám buněčných stěn nebo syntetickým nebo rekombinačním verzím všech těchto sloučenin. Předpokládá se, že tyto protilátky budou vznikat imunizací lidí nebo jiných živočichů. Vynález není zamýšlen jako omezený na kterýkoli konkrétní toxin nebo kterýkoli druh organismu. V jednom provedení se jako imunogeny předpokládají toxiny všech druhů Clostridium. Příklady těchto toxinů jsou neuraminidasový toxin C. butyricum, toxiny HT a LT C. sordellii, toxiny A, B, C, D, E, F a G C. botulinum a četné toxiny C. perfringens. V jednom výhodném provedení se jako imunogeny předpokládají toxiny A a B C. difficile. V tabulce 2 jsou uvedeny druhy Clostridium, jejich toxiny a některé antigeny související s onemocněním.

Tabulka 2. Klostridiální toxiny

organismus	toxiny a antigeny související s chorobou
C. botulinum	A, B, Cn C2, D, E, F, G
C. butyricum	neuraminidasa
C. difficile	A, B, enterotoxin (ani A ani B), faktor měnící motilitu, nízkomolekulární toxin, jiné
C. perfringens	α, β, ε, x, γ, δ, ν, θ, κ, λ, μ, υ
C. sordelli/ C. bifermentans	HT, LT, α, β, γ
C. novyi	α, β, γ, δ, ε, ζ, ν, θ
C. septicum	«, β, γ, δ
C. histolyticum	α, β, γ, δ, ε plus další enzymy
C. chauvoei	α, β, γ, δ

Nepředpokládá se, že by protilátky, produkované proti jednomu toxinu, byly používány pouze proti tomuto toxinu. Předpokládá se, že protilátky zaměřené proti jednomu toxinu (například enterotoxinu typu A C. perfringens) mohou být používány jako účinný terapeutický prostředek proti jednomu nebo více toxinům produkovaným jinými členy rodu Clostrídium nebo jinými organismy produkujícími toxiny (například Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Acinetobacter calcoaceticus, Pseudomonas aeruginosa, další druhy Pseudomonas atd.) Dále se předpokládá, že protilátky zaměřené proti části toxinu, která se váže na savčí membrány (například enterotoxin A C. perfringens), mohou být použity i proti jiným organismům. Předpokládá se, že tyto oblasti vážící se na membrány, se budou vyrábět synteticky a používat jako imunogeny.

II. Získávání protilátek u ne-savců

Výhodné provedení způsobu podle vynálezu pro získávání protilátek zahrnuje imunizaci. Předpokládá se však rovněž, že je možno získávat protilátky od ne-savců bez imunizace. V případě, kdy se nepředpokládá imunizace, je možno podle vynálezu používat ne-savce s předem existujícími protilátkami proti toxinům a rovněž ne-savce, kteří mají protilátky proti celým organismům, na základě reakcí s podávaným antigenem. Jako příklad posledně uvedené možnosti je možno provádět imunizaci syntetickými peptidy nebo rekombinačními proteiny sdílejícími se složkami celého organismu epitopy.

Ve výhodném provedení předpokládá způsob podle vynálezu imunizaci nesavců bakteriálním toxinem nebo toxiny. Vynález není zamýšlen jako omezený na kterýkoli konkrétní toxin. V jednom provedení se jako imunogeny předpokládají toxiny ze všech klostridiálních bakteriálních zdrojů (viz tabulka 2). Příklady těchto toxinů jsou neuraminidasový toxin C. butyricum, toxiny A, B, C, D, E, F a G C. botulinum, toxiny α, β, ε a i C. perfringens a toxiny HT a LT C. sordellii. Ve výhodném provedení se jako imunogeny předpokládají toxiny A a B C. difficile.

Zvlášť výhodné provedení zahrnuje použití bakteriálního toxinového proteinu nebo fragmentů toxinových proteinů produkovaných molekulárně biologickými prostředky (tj. rekombinační toxinové proteiny). Ve výhodném provedení imunogen · · · · · · · · · · « · · · · · · · · · · · • · · · · « · · 9 ···· · ······· ··· ·· ·· ·· ··· 99 99 zahrnuje interval 6 toxinů A C. difficile produkovaný technologií rekombinace DNA. V dalším výhodném provedení imunogen zahrnuje interval 3 toxinů B C. difficile produkovaný technologií rekombinace DNA. Rekombinačni proteiny toxinů C. difficile mohou být používány jako imunogeny odděleně nebo v kombinaci za účelem produkce protilátek specifických bucf pro toxin A C. difficile, toxin B C. difficile nebo toxiny A i B C. difficile. Konkrétně mohou být proteiny toxinů A a B C. difficile navzájem smíseny a používány jako jediný imunogen. Alternativně mohou být proteiny toxinů A C. difficile používány odděleně jako imunogen u prvního subjektu. Podobně mohou být proteiny toxinů B C. difficile používány odděleně jako imunogen u druhého subjektu. Antitoxiny, produkované oddělenou imunizací dvou oddělených subjektů proteiny toxinů A C. difficile nebo proteiny toxinů B C. difficile, mohou být spojeny a vytvořit antitoxin zaměřený proti toxinů A i B C. difficile.

Rekombinačni proteiny toxinů C. difficile podle vynálezu umožňují produkci protilátek, které jsou specifické pro jediný toxin C. difficile (tj. monospecifické protilátky). To je v kontrastu s biochemickým čištěním toxinů A C. difficile z přírodních zdrojů, které vždy vede k izolaci preparátu toxinů A, kontaminovaného imunologicky významným množstvím toxinů B; podobně biochemickým čištěním toxinů B C. difficile z přírodních zdrojů se izoluje preparát toxinů B, kontaminovaný imunologicky významným množstvím toxinů A. Protože jsou tyto preparáty nerekombinačního toxinů A a/nebo B křížově kontaminovány buď toxinem B nebo A, doje při imunizaci živočicha k produkci polyklonálních protilátek, reaktivních vůči toxinů A i B.

Jak je uvedeno dále v oddílu VI, přesná detekce přítomnosti toxinů A a/nebo B ve vzorku vyžaduje dostupnost čistých preparátů toxinů A a B a dostupnost monospecifických protilátek. Použití rekombinačních toxinových proteinů C. difficile tak umožňuje produkci preparátu polyklonálních protilátek, který může být použit pro přesnou detekci jednotlivých toxinů C. difficile i organismů C. difficile.

Používá-li se imunizace, je přednostní ne-savec z třídy Aves. Předpokládají se všichni ptáci (například kachny, pštrosi, emu, krůty atd.). Výhodným ptákem je kuře. Důležité je, že kuřecí protilátka nefixuje savčí kompicment. [Viz H.N. Benson a d., J. Immunol. 87:616(1961).] Kuřecí protilátka tedy normálně nevyvolává reakci závislou na komplementu. [A.A. Benedict a K. Yamaga, „Immunoglobulins and Antibody

Production in Avian Species“, v Comparative Immunology (J.J. Marchaloni, ed.), str. 335-375, Blackwell, Oxford (1966).] Výhodné antitoxiny podle vynálezu tedy nevykazují vedlejší účinky spojené s komplementem, pozorované u dosud známých antitoxinů.

Používají-li se ptáci, předpokládá se, že protilátka se bude získávat buď z ptačího séra nebo z vejce. Výhodné provedení zahrnuje získávání protilátky z vejce. Nosné slepice transportují imunoglobulin žloutku („IgY“) v koncentracích rovných nebo převyšujících jeho koncentrace v séru. [Viz R. Patterson a d., J. Immunol. 89:272 (1962) a S.B. Caroll a B.D. Stollar, J. Biol. Chem. 258:24 (1983).] Kromě toho velký objem produkovaného žloutku značně převyšuje objem séra, které je možno v kterémkoli daném časovém úseku z ptáka získat. Konečně je protilátka z vajec čistší a homogennější: obsahuje mnohem méně neimunoglobulinových proteinů (v porovnání se sérem) a do žloutku je transportována pouze jedna třída imunoglobulinu.

Vezme-li se v úvahu imunizace toxiny, je možno uvažovat modifikaci za účelem snížení toxicity. V tomto ohledu nelze vynález pokládat za omezený imunizací modifikovaným toxinem. Jako imunogen se předpokládá rovněž nemodifikovaný („nativní“) toxin.

Rovněž se nepředpokládá, že by vynález byl omezen typem modifikace - je-li modifikace použita. Vynález zahrnuje všechny typy modifikace toxinů včetně chemického a tepelného zpracování toxinů. Přednostní modifikací je však zpracování formaldehydem.

Nepředpokládá se, že by vynález byl omezen na konkrétní způsob imunizace; vynález zahrnuje všechny způsoby imunizace, zahrnující subkutánní, intramuskulární, intraperitoneální a intravenózní nebo intravaskulární injekce, stejně jako perorální aplikaci imunogenu.

Vynález dále zahrnuje imunizaci s adjuvans nebo bez něj. (Adjuvans je definováno jako látka, o níž je známo, že zvyšuje imunitní odpověď na jiné antigeny, je-li podávána s jinými antigeny). Je-li použito adjuvans, nepředpokládá se, že by vynález byl omezen na jakýkoli konkrétní typ adjuvans - nebo může být totéž adjuvans, jakmile již bylo použito, používáno po celou dobu. Přestože vynález • ·· · · · · · · · · · * · ······· ··« »· β· «· «·· ·· «· zahrnuje všechny typy adjuvans, ať používané odděleně nebo v kombinacích, přednost se dává použití kompletního Freundova adjuvans následovaného poněkud později nekompletním Freundovým adjuvans. Výhodné je dále použití adjuvans Gerbu. Vynález dále zahrnuje použití drůbežího adjuvans RI ΒI a adjuvans Quil A.

Používá-li se imunizace, zahrnuje vynález různá schémata imunizace. V jednom provedení se kuřeti podává v den 0 a následně v určitých intervalech toxin nebo toxiny. Nepředpokládá se, že by vynález byl omezen na konkrétní intervaly nebo dávky, podobně se nepředpokládá, že by vynález byl omezen na konkrétní schéma získávání protilátky. Výhodná doba získávání je někdy po dni 100.

Jestliže se používají ptáci a protilátka se získává z vajec, mohou být vejce před zpracováním na protilátku skladována. Je výhodné, skladují-li se vejce po dobu méně než 1 rok při 4 °C.

Předpokládá se, že kuřecí protilátka, produkovaná tímto způsobem, může být extrahována pomocí pufru a použita analyticky. I když je nečištěný, může tento preparát sloužit jako reference účinnosti protilátky před další manipulací (například imunologickým čištěním).

II. Zvýšení účinnosti protilátek

Používá-li se čištění, předpokládá vynález čištění za účelem zvýšení účinnosti ne-savčích i savčích antitoxinů. Konkrétně vynález předpokládá zvýšení procenta imunoglobulinu reaktivního s toxinem. Přednostně se čištění ptačí protilátky provádí dělením s polyethylenglykolem (PEG).

Vynález předpokládá, že ptačí protilátka se bude nejprve čistit pomocí jednoduchých nenáročných postupů. V jednom provedení se kuřecí protilátka z vajec čistí extrakcí a srážením s PEG, Čištění pomocí PEG využívá rozdílnou rozpustnost lipidů (kterých je ve vaječném žloutku hojně) a proteinů ve vysokých koncentracích PEG 8000. [Polson a d., Immunol. Comm. 9:495 (1980)]. Tato metoda je rychlá, jednoduchá a relativně levná a poskytuje imunoglobulinovou frakci, která je významně čistší, pokud jde o kontaminaci neimunoglobulinových proteinů, než srovnatelné amoniumsulfátové frakce savčího séra a koňských protilátek, Většina • · • · 4 • · • ·

PEG se zvysráženého kuřecího imunoglobulinu odstraní působením ethanolu. Protilátka čištěná pomocí PEG je skutečně dostatečně čistá, takže vynález předpokládá použití PEG-čištěných antitoxinu při pasivní imunizaci intoxikovaných lidí a zvířat.

Vynález dále předpokládá zvyšování účinnosti kompozic obsahujících antitoxin enterosolventním povlečením pevné formy antitoxinu za účelem zlepšení přežití antitoxinů v gastrointestinálním traktu (tj. enterické stability), jak je dále diskutováno v oddílu IV(C).

IV. Ošetření

Vynález předpokládá antitoxinovou terapii pro lidi a další živočichy intoxikované bakteriálními toxiny. Další výhodnou metodou ošetření je parenterální aplikace antitoxinu.

A. Terapeutické přípravky a kombinace

Vynález předpokládá použití terapeutických kompozic antitoxinů. Antitoxinové kompozice mohou zahrnovat antitoxin v pevné nebo kapalné formě.

Nepředpokládá se, že by vynález byl omezen na konkrétní charakter terapeutického přípravku. Tyto přípravky mohou být k dispozici například spolu s fyziologicky tolerovatelnými kapalnými, gelovými nebo pevnými nosiči, ředidly, adjuvans a vehikuly. Dále mohou být antitoxiny používány společně s jinými terapeutickými prostředky včetně antibiotik.

Jak výše uvedeno, mohou být tyto terapeutické přípravky podávány savcům pro veterinární použití, například domácím zvířatům, a pro klinické použití u lidí způsobem podobným jako u jiných terapeutických prostředků. Obecně se dávka nutná pro terapeutickou účinnost liší podle typu použití a způsobu podáváni, stejně jako podle konkrétních požadavků jednotlivých hostitelů.

Z hlediska způsobu podávání mohou být antitoxiny používány pro orální, intravenózní, intraperitoneální, intramuskulární nebo intrathekální aplikaci. Formulace • ···· · · · ♦ · · · • ·· ·«« · · * ···· · • · · · · · · · » · pro tyto aplikace mohou zahrnovat účinné množství antitoxinu ve sterilní vodě nebo fyziologickém salinickém roztoku.

Na druhé straně mohou tyto formulace obsahovat běžně používané přísady, jako jsou pojivá, plniva, nosiče, konzervační prostředky, stabilizační prostředky, emulgátory, pufry a vehikula, jako jsou například ve farmaceutické čistotě mannitol, laktóza, škrob, stearát hořečnatý, natriumsacharin, celulóza, uhličitan hořečnatý spod. Tyto kompozice typicky obsahují 1 až 95 %, přednostně 2 až 70 % účinné složky.

Kompozice se přednostně připravují pro orální aplikaci, buď jako kapalné roztoky nebo suspenze; mohou být také připravovány pevné formy, zahrnující pevné formy vhodné pro rozpouštění nebo suspendování v kapalině před podáváním. Pevné formy antitoxinů mohou dále zahrnovat enterosolventní povlak. Kompozice se přednostně připravují jako injekční, buď jako kapalné roztoky nebo suspenze; mohou být rovněž připravovány pevné formy vhodné pro rozpouštění nebo suspendování v kapalině před podáváním.

Antitoxiny podle vynálezu se často mísí s ředidly nebo vehikuly, které jsou fyziologicky tolerovatelné a kompatibilní. Vhodná ředidla a vehikula jsou například voda, salinický roztok, živné formulace (například Ensure®, Enfamil® atd.), dextróza, glycerol apod. a jejich kombinace, kromě toho, je-li to žádoucí, mohou kompozice obsahovat menší množství pomocných látek, jako jsou smáčecí a emulgační prostředky, stabilizační nebo pufrující prostředky.

B. Dávkování antitoxinu

Je známo, že je nutno nalézt kompromis při podávání běžně dostupného antitoxinu, který je obvykle produkován ve velkém množství velkými zvířaty, jako jsou koně; je nutno podávat dostatečné množství antitoxinu, aby byl neutralizován toxin, ale ne tolik, aby se zvýšilo riziko nežádoucích vedlejších účinků. Tyto vedlejší účinky jsou vyvolávány: i) citlivostí pacienta na cizí (například koňské) bílkoviny, ii) anafylaktickými nebo imunogenními vlastnostmi neimunoglobulinových proteinů, iii) fixací komplementu u savčích protilátek a/nebo iv) celkovou zátěží podané cizí • · bílkoviny. Tuto rovnováhu je velmi obtížné dodržet, jestliže je možno stupeň intoxikace (a tudíž potřebnou úroveň antitoxinové terapie), jak výše uvedeno, odhadnout pouze přibližně.

Vynález předpokládá podstatné snížení vedlejších účinků, takže se této rovnováhy dosahuje snadněji. Ošetření podle vynálezu předpokládá snížení vedlejších účinků použitím PEG-čištěného antitoxinu z ptáků.

V jednom provedení ošetření podle vynálezu předpokládá použití PEGčištěného antitoxinu z ptáků. Použití protilátky odvozené ze žloutku a čištěné PEG jako antitoxinu umožňuje podávání 1) ptačí protilátky nefixující (savčí) komplement, 2) méně heterogenní směsi neimunoglobulinových proteinů a 3) méně celkového proteinu k dosažení ekvivalentní hmotnosti aktivní protilátky přítomné v běžně dostupných antitoxinech. Ne-savčí zdroj antitoxinu umožňuje použití pro pacienty, kteří jsou citliví na koňské nebo jiné savčí sérum.

Jak platí v případech botulismu, stupeň expozice jedince toxinu C. difficile a prognóza se často obtížně odhadují a závisí na velkém počtu faktorů (například množství inokula, toxigenitě a sérotypu daného kmene C. difficile atd.). Pro stanovení dávek při podávání antitoxinu je tedy obvykle důležitější klinická manifestace pacienta než kvantitativní diagnostický test Pro mnoho onemocnění spojených s toxinem (například botulismus, tetanus, záškrt atd.) totiž neexistuje rychlý kvantitativní test pro detekci přítomností toxinu v organismu. Tato onemocnění spojená s toxiny představují spíše naléhavé lékařské případy, které ospravedlňují okamžité ošetření. Potvrzení etiologického činitele nesmí zpozdit zahájení terapie, protože stav zasaženého pacienta se může rychle zhoršovat. Navíc k počátečnímu ošetření antitoxinem mohou být indikovány následné dávky, jak onemocnění postupuje. Dávkování a časování těchto následných dávek je závislé na znacích a příznacích nemoci u každého jednotlivého pacienta.

Předpokládá se, že má-li být antitoxin podáván parenterálně, zahrnuje podávání antitoxinu zasaženému jedinci počáteční injekci přibližně 10 ml dávky imunoglobulinu (s méně než přibližně 1 g celkových proteinů). V jednom výhodném provedení se předpokládá, že alespoň 50 % počáteční injekce tvoří imunoglobulin. Předpokládá se rovněž, že se pro léčbu používá čistší imunoglobulin, kdy přibližně 90

% počáteční injekce tvoří imunoglobulin. Používá-li se čistší imunoglobulin (například čištěný IgY), předpokládá se, že celkové proteiny tvoří méně než přibližně 100 mg. Předpokládají se rovněž dodatečné dávky v závislosti na znacích a příznacích souvisejících s postupem choroby spojené s C. difficile.

Předpokládá se, že jestliže má být antitoxin podáván orálně, zahrnuje podávání antitoxinů zasaženému jedinci léčebný běh (tj. počáteční a následné dávky) zahrnující podávání terapeutického přípravku zahrnujícího asi 50 g, přednostně asi 4 až 5 g antitoxinů.

C. Podávání antitoxinů

I když není úmyslem omezovat cestu podávání, předpokládá vynález způsob antitoxinové léčby bakteriální intoxikace, při němž je podávání antitoxinů parenterální nebo orální.

V jednom provedení se antitoxin parenterálně podává subjektu ve vodném roztoku. Nepředpokládá se, že by parenterální podávání bylo omezeno na konkrétní cestu. Naopak se uvažuje s použitím všech cest parenterálního podávání. V jednom provedení se parenterální podávání provádí intravenózní injekcí.

V jednom provedení se antitoxin podává v pevné formě (například tablety, kapsle). V alternativním provedení se antitoxin podává ve vodném roztoku. Používá-li se vodný roztok, má tento roztok dostatečnou iontovou sílu pro solubilizaci bílkovinné protilátky a současně je schopný požití při orální aplikaci. Aplikační roztok může být rovněž pufrován (například karbonátový pufr o pH 9,5), což může neutralizovat žaludeční kyseliny a stabilizovat protilátky, jsou-li protilátky podávány orálně. V jednom provedení je aplikačním roztokem vodný roztok. V jiném provedení je aplikačním roztokem umělá výživa. Přednostně je aplikačním roztokem kojenecká výživa. Další provedení předpokládá podávání lyofilizované protilátky enkapsulované nebo mikroenkapsulované ve sloučeninách odolných vůči kyselinám.

Způsoby nanášení enterosolventních povlaků na farmaceutické sloučeniny jsou v oboru známy [jsou známy společnosti specializující se na povlékání farmaceutických sloučenin, například The Coating Plače (Verona, Wl) a AAI (Wilmington, NC)]. Enterosolventní povlaky, které jsou odolné vůči žaludečním kyselinám a jejichž uvolňování (tj. rozpouštění povlaku k uvolnění farmaceutické sloučeniny) je závislé na pH, jsou komerčně dostupné [například polymethakryláty Eudragit® L a Eudragit® S (Rohm GmbH)]. Eudragit® Sje rozpustný ve střevní tekutině od pH 7,0; tento povlak může být používán k mikroenkapsulaci lyofilizovaných antitoxinových protilátek a částice se pro orální aplikaci suspendují v roztoku o hodnotě pH nad nebo pod 7,0. Mikročástice zůstávají intaktní a nerozpuštěné, dokud nedosáhnou střev, kde pH vyvolá jejich rozpuštění a uvolnění antitoxinu.

Vynález je zaměřen na zlepšení enterické stability terapeutického antitoxinu [Enterická stabilita je definována jako stabilita antitoxinu během průchodu gastrointestinálním traktem; enterická stabilita se zlepší zvýšením množství orálně aplikovaného antitoxinu, který je dodán na požadované místo (tj. střeva) ve funkční nebo aktivní formě]. O protilátkách, a zejména ptačích, je známo, že jsou významně denaturovány, jsou-li vystaveny kyselým roztokům (například žaludeční tekutině). Denaturace protilátky vede ke ztrátě funkčnosti (tj. ztrátě schopnosti vázat se na specifický cíl). Kromě denaturace protilátek v důsledku nízkého pH, které se vyskytuje v částech gastrointestinálního traktu, může docházet k proteolytické degradaci antitoxinu v důsledku štěpení enzymy. Vynález zlepšuje enterickou stabilitu terapeutických antitoxinů jejich povlékáním enterosolventním povlakem. Enterosolventní povlak zabraňuje kysele vyvolané denaturaci antitoxinu a brání expozici antitoxinu enzymům přítomným v horních částech gastrointestinálního traktu.

Podle vynálezu se ukazuje, že použití enterosolventních povlaků, odolných vůči kyselinám, brání uvolnění mikroenkapsulovaného antitoxinu (například enterosolventně povlečeného antitoxinu) do simulované žaludeční tekutiny a současně umožňuje uvolňování antitoxinu v simulované střevní tekutině. Enterické přežití terapeutických antitoxinů může být zlepšeno také použitím vehikul (více nebo méně inertních látek přidávaných k terapeutické sloučenina jako ředidlo nebo pro dodání tvaru nebo konzistence, je-li sloučenina ve formě tablet). Vehikula, jako jsou karbonátové pufry o pH asi 9,5 nebo výživné formulace (například Ensure®, • ···· · · · · · · · » ·· · 9 9 9 9 9 999 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

Enfamil® atd.) mohou nepřímo snižovat denaturaci antitoxinu v žaludku zvyšováním pH žaludku nebo poskytováním dalšího proteinu konkurujícího při degradaci žaludečními enzymy. Naproti tomu použití enterosolventních povlaků na antitoxinové kompozici přímo brání denaturaci nebo štěpení antitoxinu v žaludku tím, že brání uvolňování antitoxinu z enterosolventně povlečené částice, dokud částice nedosáhne střevní tekutiny, která má zásadité pH. Použití enterosolventních povlaků je zvlášť výhodným prostředkem zlepšení stability terapeutických antitoxinů podle vynálezu v kyselém prostředí.

Vynález zahrnuje způsob léčení, který může být aplikován při léčbě akutní intoxikace. V jednom provedení se podává antítoxin orálně bucf v aplikačním roztoku nebo ve formě tablet v terapeutické dávce subjektu intoxikovanému bakteriálním toxinem, který sloužil jako imunogen pro antitoxin.

Vynález rovněž zahrnuje způsob léčení, který může být aplikován profylakticky, V jednom provedení se antitoxin podává orálně v aplikačním roztoku v terapeutické dávce subjektu za účelem zabránění intoxikace subjektu bakteriálním toxinem, který sloužil jako imunogen pro produkci antitoxinu. V jiném provedení se antitoxin podává orálně v pevné formě, jako jsou tablety, nebo jako mikroenkapsulované částice. Mikroenkapsulace lyofilizované protilátky pomocí sloučenin, jako je Eudragit® (Rohm Tech, lne.) nebo polyethylenglykol, které se rozpouštějí v širokém rozmezí jednotek pH, umožňuje orální aplikaci pevného antitoxinu v kapalné formě (tj. v suspenzi) příjemcům neschopným tolerovat podávání tablet (například dětem nebo pacientům na umělé výživě). Ve výhodném provedení je lyofilizovaná protilátka povlečena Eudragitem® L30D (Rohm Tech, lne.). V jednom výhodném provedení je subjektem dítě. V jiném provedení se protilátka, produkovaná proti celému bakteriálnímu organismu, podává orálně subjektu v aplikačním roztoku v terapeutické dávce.

V. Vakciny proti druhům klostridií

Vynález zahrnuje vytvoření mono- a multivalentních vakcin pro ochranu živočicha (zejména lidí) proti několika druhům klostridií. Zvlášť zajímavé jsou vakciny,

které stimulují produkci humorální imunitní odpovědi na C. difficile, C. tetani a C. botulinum u člověka. Antigeny tvořící vakcinový preparát mohou být nativní nebo rekombinačně získané toxinové proteiny z výše uvedených druhů klostridií. Jestliže se jako imunogeny používají toxinové proteiny, jsou obvykle modifikovány za účelem snížení toxicity. Tato modifikace může být chemická nebo genetická (tj. technologie rekombinace DNA). Obecně je preferována genetická detoxifikace (tj. exprese netoxických fragmentů v hostitelské buňce), protože exprese netoxických fragmentů v hostitelské buňce vylučuje přítomnost intaktního aktivního toxinu ve finálním preparátu. Požaduje-li se však chemická modifikace, představuje výhodnou modifikaci toxinu ošetření formaídehydem.

Podle vynálezu se jako antigeny v mono- a multivalentních vakcinových preparátech používají rekombinační toxinové proteiny C. difficile. Pro přípravu těchto mono- a multivalentních vakcin mohou být jako antigeny používány rozpustné rekombinační proteiny toxinu A a B C. difficile, v podstatě prosté endotoxinů, mohou být používány samotné nebo ve spojení buď s rekombinačními nebo nativními toxiny nebo toxoidy z C. botulinum, C. difficile a C. tetani. Předpokládá se, že v důsledku strukturní podobnosti proteinů toxinů C. botulinum a C. tetani je možno použít vakcinu zahrnující toxinové proteiny C. difficile a botulinum (nativní nebo rekombinační nebo jejich směs) ke stimulaci imunitní odpovědi vůči C. botulinum, C. tetani a C. difficile.

Nepříznivým důsledkům vystavení toxinům C. difficile je možno zamezit imunizací ohrožených subjektů přípravky, které dodávají imunitu jako je chemicky nebo geneticky detoxifikovaný toxin.

Vakciny, které dodávají imunitu vůči jednomu nebo více typům toxinů A a B, by byly použitelné jako prostředky ochrany živočichů včetně lidí před škodlivými účinky toxinů C. difficile. Subjekt může být imunizován kompozicemi, zahrnujícími jeden nebo více toxinových proteinů C. difficile, za účelem vyvolání neutralizujících protilátek u subjektu. Subjekt může být imunizován prvním imunogenem zahrnujícím proteiny toxinu B C. difficile za účelem produkce neutralizujících protilátek zaměřených proti toxinům A a B C. difficile. Alternativně může být subjekt imunizován jediným imunogenem zahrnujících proteiny toxinu A a B C. difficile.

Obecně není chemická detoxifikace bakteriálních toxinů pomocí prostředků, jako je formaldehyd, glutaraldehyd nebo peroxid vodíku, optimální pro vytváření vakcin nebo antitoxinů. Je nutno dosáhnout jemné rovnováhy mezi přílišnou a příliš malou chemickou modifikací. Je-li ošetření nedostatečné, může vakcina ztratit účinnost díky destrukci nativních imunogenních determinant Dalším velkým omezením použití botulinálních toxoidů pro tvorbu antitoxinů nebo vakcin jsou vysoké výrobní náklady. Zvýše uvedených důvodů je žádoucí vývoj způsobů výroby netoxických, avšak imunogenních toxinových proteinů C. diffícile.

Rekombinační toxinové proteiny C. diffícile se produkují v hostitelských buňkách, jako je E. coli, bud v rozpustné nebo nerozpustné formě. Nerozpustné rekombinační proteiny se nacházejí v inkluzních tělískách. Protein inkluzního tělíska musí být před čištěním a/nebo podáním hostiteli solubilizován. Drsné zacházeni s proteinem inkluzního tělíska, nutné k této solubilizaci, může snížit imunogenitu čištěného proteinu. V ideálním případě jsou rekombinační proteiny, použitelné jako vakciny, exprimovány jako rozpustné proteiny ve vysoké hladině (tj. vyšší nebo rovné asi 0,75 % celkových buněčných proteinů) v E. coli nebo jiných hostitelských buňkách. To usnadňuje produkci a izolaci dostatečných množství imunogenu ve vysoce čištěné formě (tj. v podstatě prosté kontaminace endotoxinem nebo jiným pyrogenem). Schopnost exprimovat rekombinační proteiny jako rozpustné proteiny v E. coli je výhodná díky nízkým nákladům na růst v porovnání s hmyzími nebo savčími tkáňovými kulturami.

Tento vynález poskytuje rozpustné toxinové proteiny C. diffícile, produkované v ekonomických hostitelských buňkách (například E. coli). Dále poskytuje způsoby izolace čištěných rozpustných toxinových proteinů C. diffícile, které jsou vhodné pro imunizaci lidí a jiných živočichů. Tyto rozpustné čištěné preparáty toxinových proteinů C. diffícile poskytují základ pro zlepšené vakcinové přípravky a usnadňují produkci antitoxinu.

Jestliže se jako vakciny používají rekombinační klostridiální toxinové proteiny, produkované v gram-negativních bakteriích (například E. coli), pak se před podáním hostitelskému živočichovi čistí pro odstranění endotoxinu. Za účelem vakcinace hostitele se podává imunogenně účinné množství čištěného rekombinačního

··

9 • ··· klostridiálního toxinového proteinu, v podstatě prosté endotoxinu v kterémkoli z různých fyziologicky přijatelných známých nosičů. Jestliže se podává pro účely vakcinace, může být čištěný rekombinační klostridiální toxinový protein, v podstatě prostý endotoxinu, používán samostatně nebo ve spojení se známými adjuvans, zahrnujícími kamenec draselný, fosforečnan hlinitý, hydroxid hlinitý, Gerbuho adjuvans (GMDP; C.C. Biotech Corp.), adjuvans RIBI (MPL; RIBI Immunochemical Research, lne.), QS21 (Cambridge Biotech). Adjuvans na bázi kamence a hliníku jsou zvlášť preferována, mají-li být vakcíny podávány lidem. Imunizace může probíhat nasální, orální, intramuskulární, intraperitoneální nebo subkutánní cestou.

Vynález zahrnuje použití rozpustných preparátů fúzních proteinů, v podstatě prostých endotoxinu, zahrnujících části toxinů A a B C. difficile, jako vakcíny. V jednom provedení vakcina zahrnuje část toxinu C. difficile a polyhistidinový úsek (nazývaný také jako histidinová značka). Ve zvlášť výhodném provedení je fúzní protein, zahrnující část toxinového proteinu C. difficile a polyhistidinový úsek, exprimován s použitím série pET expresních vektorů (Novagen). Expresní systém pET používá vektor obsahující promotor T7, který kóduje fúzní protein, a hostitelskou buňku, která může být indukována k expresi T7 DNA polymerasy (tj. hostitelský kmen DE3). produkce fúzních toxinových proteinů C. difficile, obsahujících histidinový úsek, není omezena na použití konkrétního expresního vektoru a hostitelského kmene. Pro expresi proteinových sekvencí C. difficile jako fúzního proteinu obsahujícího histidinový úsek může být použito několik komerčně dostupných expresních vektorů a hostitelských kmenů (například série pQE (pQE-8, 12, 16, 17, 18, 30, 31, 32, 40, 41, 42, 50, 51, 52, 60 a 70) expresních vektorů (Qiagen), které se používají s hostitelskými kmeny M15[pRE/4] (Qiagen) a SG13009[pREP4] (Qiagen, může být použita k expresi fúzních proteinů obsahujících šest histidinových zbytků na aminoterminálním konci fúzního proteinu.

VI. Detekce toxinu

Vynález zahrnuje detekci bakteriálního toxinu ve vzorku. Výraz „vzorek“ je v popisu a v nárocích používán v nejširším smyslu. Na jedné straně zahrnuje

specimen nebo kulturu. Na druhé straně zahrnuje jak biologické, tak environmentální vzorky.

Biologické vzorky mohou tvořit živočišné, včetně lidských, tekutiny, pevné látky (například stolice) nebo tkáň; kapalné a pevné potravinářské produkty a složky, jako jsou mlékárenské produkty, zelenina, maso a masné produkty a odpad. Environmentální vzorky zahrnují environmentální materiály, jako je povrchová voda, půda, voda a průmyslové vzorky, stejně jako vzorky získané z pomůcek, nástrojů a zařízení pro zpracování potravin a mléka pro jednorázové i opakované použití. Tyti příklady však v žádném případě neomezují typy vzorků, použitelné podle vynálezu.

Jak je uvedeno výše v oddíle IV, onemocnění spojená s toxiny představují naléhavé lékařské případy, které odůvodňují okamžité ošetření, protože existující metodologie neposkytují rychlé kvantitativní testy na přítomnost toxinů nebo organismů C. difficile, zahajuje se léčba subjektů, u nichž je podezření na onemocnění spojené s C. difficile, před stanovením množství nebo povahy přítomného toxinu nebo organismu. Pokud by byl k dispozici rychlý test na toxiny a organismy C. difficile, bylo by možno stanovit dávkování terapeutických sloučenin tak, aby poskytovaly intoxikovanému subjektu maximální přínos. Specifické protilátky proti toxinu A a B C. difficile podle vynálezu umožňují rychlé a kvantitativní testy na toxiny nebo organismy C. difficile.

Vynález zahrnuje detekci bakteriálního toxinu metodou kompetitivní imunoanalýzy, která používá rekombinační proteiny toxinu A a B, protilátky vytvořené proti rekombinačním proteinům bakteriálních toxinů. Fixní množství rekombinačních toxinových proteinů je imobilizováno na pevném nosiči (například mikrotitrační destičce), načež se přidá biologický vzorek s podezřením na obsah bakteriálního toxinu. Biologický vzorek se nejprve smísí s afinitně čištěnými nebo PEG frakcionovanými protilátkami zaměřenými proti rekombinačnímu toxinovému proteinu. Pak se přidá reportérové látka, která je schopna detekovat přítomnost protilátky navázané na imobilizovaný toxinový protein. Reportérové látka může zahrnovat protilátkou s vazebnou specifitou pro antitoxin napojený na molekulu, která se používá k identifikaci přítomnosti reportérové látky. Je-li ve vzorku přítomen toxin, bude tento toxin soutěžit s imobilizovaným toxinovým proteinem o vazbu na anti51 ·· ·· «· • · · · · • · ··· · · • · · · · · · • · · · · · ·· ·· ·· • ·· ·· ·· · · · · • · · ·· • · «·· · · • · · · ··· ·· ·· rekombinační protilátku, a tím snižovat signál získaný po přídavku reportérové látky. Jako kontrola se používá vzorek, ke kterému není přimíšena protilátka. Ten poskytuje nejvyšší (tj. referenční) signál.

Vynález rovněž zahrnuje detekci bakteriálního toxinu metodou „sendvičové“ imunoanalýzy, která používá protilátky zaměřené proti rekombinačním bakteriálním toxinovým proteinům. Afinitně čištěné protilátky zaměřené proti rekombinačním bakteriálním toxinovým proteinům jsou imobilizovány k pevnému nosiči (například mikrotitračním destičkám). Pak se přidávají biologické vzorky s podezřením na obsah bakteriálních toxinů s následným promytím k odstranění v podstatě veškerého nenavázaného antitoxinu. Biologický vzorek se pak vystaví působení reportérové látky, která se váže na antitoxin, a pak se promyje od vpodstatě veškeré nenavázané reportérové látky, reporterová látka může zahrnovat protilátku s vazebnou specifitou pro antitoxin napojený na molekulu, která se používá k identifikaci přítomnosti reportérové látky. Identifikace reportérové látky v biologické tkáni indikuje přítomnost bakteriálního toxinu.

Předpokládá se rovněž detekce bakteriálního toxinu přeléváním kapalin (například polévek a jiné tekuté stravy a krmiv včetně výživných doplňků pro lidi a jiné živočichy) přes imobilizovanou protilátku, která je zaměřena proti bakteriálnímu toxinu. Předpokládá se, že imobilizovaná protilátka bude přítomna v tomto nosiči nebo na něm, přičemž jde o patrony, kolony, kuličky nebo jiné pevné nosné médium. V jednom provedení se po expozici kapaliny imobilizovanou protilátkou promytím v podstatě odstraní nenavázaný toxin. Expozice kapaliny se pak vystaví reportérové látce, která detekuje přítomnost navázaného toxinu. Ve výhodném provedení je reportérovou látkou enzym, fluorescenční barvivo nebo radioaktivní sloučenina napojená na protilátku, která je zaměřena proti toxinu (tj. „sendvičová“ imunoanalýza). Předpokládá se rovněž, že detekční systém bude podle potřeby vyvíjen (například přídavkem enzymového substrátu do enzymových systémů, pozorování pomocí fluorescenčního záření u fluorescenčních barvivových systémů a kvantifikace radioaktivity v radioaktivních systémech).

• · • « • · ι « * « ·>

Příklady provedeni vynálezu

K osvětlení některých výhodných provedení a aspektů vynálezu slouží následující příklady, které jej však žádným způsobem neomezují.

V následujícím popisu se používají tyto zkratky: °C (stupeň Celsia), min'¹ (otáčky za minutu), BBS-Tween (borátem pufrovaný salinický roztok obsahující Tween), BSA (hovězí sérový albumin), ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), CFA (kompletní Freundovo adjuvaňs), IFA (nekompletní Freundovo adjuvaňs), IgG (imunoglobulin G), IgY (imunoglobulin Y), IM (intramuskulární), IP (intraperitoneální), IV (intravenózní nebo intravaskulární), SC (subkutánní), H₂O (voda), HCI (kyselina chlorovodíková), LD₁₀₀ (letální dávka pro 100 % pokusných zvířat), aa (aminokyselina), HPLC (vysokoúčinná kapalinová chromatografie, kD (kilodalton), g (gram), pg (mikrogram), mg (miligram), ng (nanogram), μΙ (mikrolitr), ml (mililitr), mm (milimetr), nm (nanometr), pm (mikrometr), M )molární), mM (milimolární), MW (molekulová hmotnost), s (sekunda), min (minuta), h (hodina), MgCI₂ (chlorid hořečnatý), NaCl (chlorid sodný), Na₂CO₃ (uhličitan sodný), OD₂₈₀ (optická hustota při 280 nm), OD₆₀₀ (optická hustota při 600 nm), PAGE (elektroforéza na polyakrylamidovém gelu), PBS [fosfátem pufrovaný salinický roztok (150 mM NaCl, 10 mM natriumfosfátového pufru, pH 7,2)], PEG (polyethylenglykol), PMSF (fenylmethylsulfonylfluorid), SDS (dodecylsulfát sodný), Tris (tris(hydroxymethyl)aminomethan), Ensure® (Ensure®, Ross Laboratories, Columbus OH), Enfamil® (Enfamil®, Mead Johnson), w/v (hmotnost na objem), v/v (objem na objem), Accurate Chemical (Accurate Chemical & Scientific Corp., Westbury, NY), Amicon (Amicon, lne., Beverly, MA), Amresco (Amresco, lne., Solon, OH), ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD), BBL (Baltimore Biologics Laboratory (divize Becton Dickinson), Cockeysville, MD), Becton Dickinson (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ), BioRad (BioRad, Richmond, CA), Biotech (C-C Biotech Corp., Poway, CA), Charles River (Charles River Laboratories, Wiimington, MA), Cocalico (Cocalico Biologicals lne., Reamstown, PA), CytRx (CytRx Corp., Norcross, GA), Falcon (například Baxter Healthcare Corp., McGaw Park, IL, a Becton Dickinson), FDA (Federal Food and Drug Administration), Fisher Biotech ·· ·· · ··· · ·· · • · ··· · · * · · ·· • · · · · · · · · ··· · · • · · · «·· ··· ·· ·· ·· ··· ·· ·· (Fisher Biotech, Springfield, NJ), GIBCO (Grand Island Biologie Company/BRL, Grand Island, NY), Gibco-BRL (Life Technologies, lne, Gaithersburg, MD), Harlan Sprague Dawley (Harlan Sprague Dawley, lne., Madison, Wl), Mallinckrodt (divize Baxter Healthcare Corp., McGaw Park, IL), Millipore (Millipore Corp., Marlborough, MA), New England Biolabs (New England Biolabs, lne. Beverly, MA), Novagen (N Novagen, lne., Madison, Wl), Pharmacia (Pharmacia, lne., Piscataway, NJ), Qiagen (Qiagen, Chatsworth, CA), RIBI (RIBI Immunochemical Research, lne., Hamilton, MT), Sasco (Sasco, Omaha, NE), Showdex (Showa Denko America, lne., New York, NY), Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), Sterogene (Sterogene, lne., Arcadia, CA), Tech Lab (Tech Lab, lne., Blacksburg, VA) a Vaxcell (Vaxcell, lne., přidružená společnost CytRx Corp., Norcross, GA).

Je-li v popisu uváděn rekombinační protein, je na něj stručně poukazováno pomocí aminokyselin v sekvenci toxinu přítomných v rekombinačním proteinu, zaokrouhlených na nejbližší desítku. Například rekombinační protein pMB1850-2360 obsahuje aminokyseliny 1852 až 2362 proteinu toxinu B C. difficile. V popisu jsou uvedeny konstrukční detaily pro všechny rekombinační proteiny, aby odborník přesně věděl, které aminokyseliny jsou v daném rekombinačním proteinu přítomny.

Příklad 1

Produkce vysokého titru protilátek ke Clostridium difficile u slepice

Ukázalo se, že protilátky proti určitým patogenním organismům jsou účinné při léčbě onemocnění, vyvolaných těmito organismy. Nebylo zjištěno, zda je možno produkovat protilátky proti Clostridium difficile, které by byly účinné při léčbě infekce vyvolané tímto organismem. C. difficile tedy bylo testováno jako imunogen pro produkci slepičích protilátek.

Pro stanovení optimálního průběhu produkce vysokého titru vaječných protilátek proti celým organismům C. difficile byly vyzkoušeny různé imunizační kmeny a různé imunizační koncentrace. Příklad zahrnoval (a) přípravu bakteriálního

imunogenu, (b) imunizaci, (c) čištění antibakteriálních kuřecích protilátek a (d) detekci antibakteriálních protilátek v čištěných preparátech IgY.

a) Příprava bakteriálního imunogenu

Kmeny C. difficile 43594 (sérotyp A) a 43596 (sérotyp C) byly původně získány z ATCC. Tyto dva kmeny byly vybrány proto, že představují dva z nejběžněji se vyskytujících sérotypů izolovaných z pacientů s pseudomembránovou koiitidou, související s antibiotiky. [Delmee a d., J. Clin. Microbiol., 28(10):221 (1990).] Tyto kmeny byly navíc dříve charakterizovány s ohledem na virulenci na modelu infekce C. difficile na syrském křečkovi. [Delmee a d., J. Med. Microbiol., 33:85 (1990).]

Bakteriální kmeny byly odděleně kultivovány po dobu 48 h na agaru se srdcovým a mozkovým nálevem při 37 °C v zařízení Gas Pack Jar (BBL, Cockeysviile, MD), vybaveném anaerobním obalem Gas Pack Plus (BL). byla použita 48h kultivace, protože produkuje lepší růst a organismy jsou více křížově reaktivní s ohledem na výskyt povrchových antigenů. Čím vyšší je stupeň křížové reaktivity našich preparátů IgY, tím lepší je pravděpodobnost širokého rozmezí účinnosti proti různým kmenům a sérotypům. [Torna a d., J. Clin. Microbiol., 26(3):426 (1988).]

Vzniklé organismy byly setřeny z povrchu agaru pomocí sterilního tamponu s dacronovým koncem a suspendovány v roztoku obsahujícím 0,4 % formaldehydu v PBS, pH 7,2. Tato koncentrace formaldehydu byla popsána jako produkující dobré výsledky pro účely přípravy suspenzí imunogenú celého organismu pro tvorbu polyklonálního anti-C. difficile séra u králíků. [Delmee a d., J. Clin. Microbiol., 21:323 (1985), Davies a d., Microbial Path., 9:141 (1990).] Tímto způsobem byly připraveny dvě oddělené bakteriální suspenze, pro každý kmen jedna. Obě suspenze pak byly inkubovány 1 h při 42 °C. Po této době zpracování formaldehydem byly suspenze odstřeďovány 20 min při 4200 x g a vzniklé pelety byly dvakrát promyty normálním salinickým roztokem. Promyté pelety, které obsahovaly celé organismy ošetřené formalinem, byly resuspendovány v čerstvém normálním salinickém roztoku tak, aby visuáiní turbidita každé suspenze odpovídala McFarlandovu standardu č. 7. [M.A.C. Edelstein, „Processing Clinical Specimens for Anaerobic Bacteria: Isolation and Identification Procedures“, in: S.M. Finegold a d. (ed.), Bailey and Scotťs Diagnostic

Microbiology, str. 477-507, C.V. Mosby Co. (1990). Příprava McFarlandových nefelometrických standardů a odpovídající přibližný počet organismů pro každou zkumavku je detailně popsán na str. 172-173 tohoto svazku. Každá z obou suspenzí s hodnotou 7 pak byla rozdělena na dva objemy. Jeden objem každé suspenze byl volumetricky adjustován přídavkem salinického roztoku, aby odpovídal visuální turbiditě McFarlandova standardu č. 1 [Tamtéž.] Suspenze s hodnotou 1 obsahovaly přibližně 3.10® organismů/ml a suspenze s hodnotou 7 přibližně 2.10⁹ organismů/ml. [Tamtéž.] Čtyři vzniklé suspenze s upravenou koncentrací organismů C. difficile, ošetřených formalinem, byly považovány za „suspenze bakteriálních imunogenů“. Tyto suspenze byly použity bezprostředně po přípravě pro počáteční imunizaci. [Viz oddíl (b).]

Postup ošetření formalinem nevedl k získání 100 % neživotných bakterií v suspenzích imunogenů. Za účelem zvýšení úrovně usmrcení byla zvýšena jak koncentrace formalinu, tak délka působení, jak je uvedeno dále v tabulce 3. (Přestože životnost se silnějším působením formalinu poklesla, nebylo dosaženo 100% neživotnosti suspenzí bakteriálních imunogenů.) V následných imunogenových preparátech byly proto formalinové roztoky připravovány v normálním salinickém roztoku místo v PBS. V den 49, tj. den páté imunizace, byly přebytečné objemy čtyř dříve uvedených suspenzí bakteriálních imunogenů zmrazený na -70 °C a uchovány pro použití při všech následujících imunizacích.

b) Imunizace

Pro počáteční imunizaci byl objem 1,0 ml každé z výše uvedených suspenzí bakteriálního imunogenu zvlášť emulgován v 1,2 objemu CFA (GIBCO). Každou ze čtyř emulgovaných suspenzí imunogenu byly imunizovány dvě slepice (ještě nenesoucí) bílého leghornského plemene o stáří čtyř měsíců, (není nutno používat ještě nenesoucí slepice; je možno použití i aktivní nosnice.) Každá slepice obdržela celkový objem přibližně 1,0 ml jedné emulgované suspenze imunogenu ve čtyřech injekcích (dvou subkutánních a dvou intramuskulárních) o objemu přibližně 250 μΙ. Tímto způsobem byly zahájeny celkem čtyři různé imunizační kombinace s použitím dvou slepic na kombinaci za účelem zhodnocení jak účinku imunizační koncentrace • · • · • · · ·

9 99 99

999 «9 ·9 na produkci protilátek vaječného žloutku (IgY), tak mezikmenovou křížovou reaktivitu IgY produkovaného proti heterologním kmenům. Tyto čtyři imunizace jsou shrnuty v tabulce 3.

Tabulka 3. Imunizační skupiny

označení skupiny	imunizační kmen	přibližná imunizační dávka
CD 43594, #1	kmen C. difficile 43594	1,5.108 organismů/slepici
CD 43594, #7	» II	1,0.108 organismů/slepici
CD 43594, #1	kmen C. difficile 43596	1,5.109 organismů/slepici
CD 43594, #7	n a	1,0.109 organismů/slepici

Časový okamžik první série imunizací byl označen jako „den nula“. Všechny následné imunizace byly prováděny výše popsaným způsobem s tou výjimkou, že suspenze bakteriálního imunogenu byly emulgovány pomocí IFA (GIBCO) místo CFA a při imunizaci v pozdějším časovém okamžiku byly místo čerstvě připravených suspenzí používány zmrazené uchovávané suspenze. Imunizační schéma je uvedeno v tabulce 4.

Tabulka 4. Imunizační schéma

den imunizace	ošetření formalinem	použitý imunogenový preparát
0	1%, 1 h	čerstvě připravený
14	1 %, přes noc	>1 II
21	1%, přes noc	II II
35	1%, 48 h	II II
49	1%, 72 h	II II
70	» »	zmrazený
85	υ n	II II
105	» υ	II II

c) Čištění anti-bakteriálních kuřecích protilátek

Z každé imunizační skupiny byla mezi dny 80 a 84 po počáteční imunizaci odebrána skupina čtyř vajec a kuřecí imunoglobulin (IgY) byl extrahován modifikovaným postupem podle A. Polsona a d., Immunol. Comm., 9:495 (1980). K oddělení žloutků od bílků byl použit mírný proud destilované vody ze střičky a žloutky byly rozrušeny prokapáním nálevkou do kalibrovaného válce. Pro každou skupinu byly spojeny čtyři žloutky. Tyto spojené a rozrušené žloutky byly pro zlepšení výtěžku protilátek smíseny se 4 objemy extrakčního pufru (extrakční pufr pro vejce tvoří 0,01 M fosforečnan sodný, 0,1 M NaCl, pH 7,5, a obsahuje 0,005 % thimerosalu) a byl přidán PEG 8000 (Amresco) do koncentrace 3,5 %. Když se veškerý PEG rozpustil, byly vzniklé sraženiny proteinů peletovány odstředěním při 13000 x g po dobu 10 min. Supernatanty byly dekantovány a přefiltrovány přes fáčovinu pro odstranění vrstvy lipidů a k supernatantům byl přidán PEG do konečné koncentrace 12 % (bylo předpokládáno, že supernatanty obsahují 3,5 % PEG): Po druhém odstředění byly supernatanty odstraněny a pelety byly naposledy odstředěny k vypuzení zbylého PEG. Tyto surové pelety IgY pak byly rozpuštěny v původním objemu žloutku extrakčního pufru a skladovány při 4 °C. Jak další kontrola byl výše popsaným způsobem připraven roztok preimunního IgY s použitím vajec od neimunizovaných slepic.

d) Detekce antibakteriálních protilátek v čištěných preparátech IgY

Za účelem zhodnocení relativních hladin aktivity C. difficile ve výše popsaných preparátech IgY byla použita modifikovaná verze postupu ELISA pro celé organismy podle N.V Padhye a d., J. Clin. Microbiol. 29:99-103 (1990). Zmrazené organismy obou výše uvedených kmenů C. difficile byly ponechány roztát a zředěny s použitím PBS, pH 7,2 na koncentraci přibližně 1.10⁷ organismů/ml. Tímto způsobem byly připraveny dvě nanášecí suspenze, pro každý imunizační kmen jedna. Do jamek 96jamkových mikrotitračních destiček (Falcon, pro-Bind Assay Plates) byly umístěny objemy 100 μΙ nanášecích suspenzí. Tímto způsobem bylo na každou destičku umístěno celkem přibližně 1.10⁶ organismů jednoho nebo druhého kmene. Destičky ··· · · · · ···· • · ··· · · · · ··· « · · · · * · ···· · ·«····· * · ♦ ·· it ·· · · · · · * * pak byly inkubovány přes noc při 4 °C. Příštího rána byly nanášecí suspenze dekantovány a všechny jamky byly třikrát promyty pomocí PBS. Za účelem blokování nespecifických vazebných míst bylo pak do každé jamky přidáno 100 μί 0,5% BSA (Sigma) v PBS a destičky byly inkubovány 2 h při teplotě místnosti. Blokovací roztok byl dekantován a výše popsané objemy 100 μΙ preparátů IgY byly podrobeny počátečnímu ředění 1:500 roztokem 0,1 % BSA v PBS a pak postupně ředěny ve stupních 1:5. Do jamek byl umístěna tato ředění: 1:500, 1:2500, 1:62500,1:312500 a 1:1562500. Destičky byly opět inkubovány 2 h při teplotě místnosti. Po této inkubaci byly roztoky obsahující IgY dekantovány a jamky byly promyty třikrát pomocí BBSTween (0,1 M kyselina boritá, 0,025 M boritan sodný, 1,0 M NaCl, 0,1 % Tween-20), pak dvakrát pomocí PBS-Tween (0,1 % Tween-20) a nakonec dvakrát pouze PBS. Do každé jamky bylo přidáno 100 μΙ ředění 1:750 konjugátu králičí anti-kuřecí IgG (celá molekula)-alkalická fosfatasa (Sigma) (ředěno v 0,1 % BSA v PBS). Destičky byly opět inkubovány 2 h při teplotě místnosti. Roztoky konjugátu byly dekantovány a destičky byly promyty výše popsaným způsobem, přičemž konečné promývání bylo prováděno pomocí 50 mM Na₂CO₃, pH 9,5, místo PBS. Destičky byly vyvíjeny přídavkem 100 μί roztoku obsahujícího 1 mg/ml p-nitrofenylfosfátu (Sigma), rozpuštěného v 50 mM Na₂CO₃, 10 mM MgCI₂, pH 9,5, do každé jamky a inkubací destiček při teplotě místnosti v temnu po dobu 45 min. Byla měřena absorbance každé jamky při 410 nm pomocí přístroje Dynatech MR 700. Tímto způsobem byl každý zvýše popsaných čtyř preparátů IgY testován na reaktivitu proti oběma imunizujícícm kmenům C. difficile: byla stanovena kmenově specifická i křížová aktivita.

Tabulka 5. Výsledky ELISA celého organismu anti-C. difficile

preparát lgY	ředění preparátu lgY	jamky s nánosem 43594	jamky s nánosem 43596
	1:500	1,746	1,801
	1:2500	1,092	1,670
CD 43594, #1	1:12500	0,202	0,812
	1:62500	0,136	0,179
	1:312500	0,012	0,080
	1:1562500	0,002	0,020
	1:500	1,780	1,771
	1:2500	1,025	1,078
CD 43594, #7	1:12500	0,188	0,382
	1:62500	0,052	0,132
	1:312500	0,022	0,043
	1:1562500	0,005	0,024
	1:500	1,526	1,790
	1:2500	0,832	1,477
CD 43596, #1	1:12500	0,247	0,452
	1:62500	0,050	0,242
	1:312500	0,010	0,067
	1:1562500	0,000	0,036
	1:500	1,702	1,505
	1:2500	0,706	0,866
CD 43596, #7	1:12500	0,250	0,282
	1:62500	0,039	0,078
	1:312500	0,002	0,017
	1:1562500	0,000	0,010
	1:500	0,142	0,309
	1:2500	0,032	0,077
preimunní lgY	1:12500	0,006	0,024
	1:62500	0,002	0,012

	1:312500	0,004	0,010
	1:1562500	0,002	0,014

Tabulka 5 ukazuje výsledky ELISA celého organismu. Všechny čtyři preparáty IgY vykazovaly významnou úroveň aktivity do zředění 1:62500 nebo většího proti oběma kmenům imunizujícího organismu. Protilátky, vytvořené proti jednomu kmeni, tedy byly vysoce křížově reaktivní s druhým kmenem a naopak. Imunizační koncentrace organismů neměla významný vliv na produkci IgY, specifickou pro organismus, protože obě koncentrace produkovaly přibližně ekvivalentní odpověď. Spodní imunizační koncentrace přibližně 1,5.10® organismů/slepici je tedy zobou testovaných koncentrací výhodnější. Preimunní IgY se zdál mít relativně nízkou hladinu reaktivity s C. difficile do ředění 1:500, pravděpodobně v důsledku předchozí expozice zvířat environmentálním klostridiím.

Počáteční test ELISA celého organismu byl proveden s použitím preparátů IgY, vyrobených z jednotlivých vajec CD 43594, #1 a CD 43596, #1, sebraných kolem dne 50 (data neznázorněná). Zjistilo se, že specifické titry jsou 5 až 10křát nižší než hodnoty uvedené v tabulce 5. Tyto výsledky demonstrují, že je možno začít imunizovat slepice před dobou, v níž začínají klást vejce, a získat s vysokým titrem specifický IgY z prvních snesených vajec. Jinak řečeno, před zahájením imunizačního schématu není nutno čekat, až budou slepice snášet vejce.

Příklad 2

Léčení infekce C. difficile protilátkou proti C. difficile

Za účelem zjištění, zda jsou imunní protilátky IgY, vytvořené proti celým organismům C. difficile, schopny inhibovat infekci křečků, vyvolanou C. difficile, byli použiti křečci, infikovaní těmito bakteriemi. [Lyerly a d., Infect. Immun. 59:2215-2218 (1991).] Tento příklad zahrnoval: (a) stanovení letální dávky organismů C. difficile a (b) ošetření infikovaných zvířat imunní protilátkou nebo kontrolní protilátkou v živném roztoku.

a) Stanovení letální dávky organismů C. difficile

Stanovení letální dávky organismů C. difficile bylo prováděno podle modelu popsaného D.M. Lyerlym a d., Infect. Immun. 59:2215-2218 (1991). Kmen C. difficile ATCC 43596 (sérotyp C, ATCC) byl nanesen na agar BHI a kultivován anaerobně (systém BBL Gas Pak 100) 42 h při 37 °C. Organismy byly z povrchu agaru setřeny pomocí sterilního tamponu s dacronovým hrotem a suspendovány ve sterilním 0,9% roztoku NaCl do hustoty 10⁸ organismů/ml.

Pro stanovení letální dávky C. difficile v přítomnosti kontrolní protilátky a umělé výživy byla získána neimunní vejce od neimunizovaných slepic a byl vyroben 12% PEG preparát jako v příkladu 1 (c). Tento preparát byl rozpuštěn ve čtvrtině původního objemu žloutku Ensure® s vanilkovým aroma.

Počínaje dnem 1 byl skupinám samic zlatých syrských křečků (Harlan Sprague Dawley) ve stáří 8 až 9 týdnů o hmotnosti přibližně 100 g orálně podáván 1 ml preimunní formulace Ensure® v čase 0, 2 h, 6 h a 10 h. V čase 1 h bylo zvířatům orálně podáno 3,0 mg klindamycinu HCI (Sigma) v 1 ml vody. Toto léčivo predisponuje křečky pro infekci C. difficile změnou normální střevní flóry. V den 2 bylo zvířatům podáno 1 ml preimunní formulace IgY/Ensure® v době 0, 2 h, 6 h a 10 h. V čase 1 h v den 2 byly různé skupiny zvířat orálně inokulovány salinickým roztokem (kontrola) nebo 10², 10⁴, 10⁶ nebo 10⁸ organismů C. difficile v 1 ml salinického roztoku. Od dnů 3 až 12 byl zvířatům podáván 1 ml preimunní formulace IgY/Ensure® třikrát denně a byl pozorován nástup průjmu a úhyn. Každé zvíře bylo umístěno v individuální kleci a dostávalo potravu a vodu ad libitum.

Podávání 10⁶ až 10⁸ organismů vedlo k úhynu po 3 až 4 dnech, zatímco dávky 10² až 10⁴ organismů způsobily smrt po 5 dnech. Cekální výtěry, odebrané zvířatům, indikovaly přítomnost C. difficile. Za předpokladu účinnosti dávky 10² byl tento počet organismů zvolen pro následující experiment za účelem zjištění, zda by mohla hyperimunní anti-C. difficile protilátka blokovat infekci.

• ·

b) Ošetření infikovaných zvířat imunní protilátkou nebo kontrolní protilátkou v umělé výživě

Byl opakován experiment (a) s použitím tří skupin po sedmi křečcích. Skupina A nedostala klindamycin ani C. difficile a představovala kontrolu přežití. Skupina B dostala klindamycin, 10² organismů C. difficile a preimunní IgY podle stejného schématu jako zvířata výše podle (a). Skupina C dostala klindamycin, 10² organismů C. difficile a hyperimunní anti-C. difficile IgY podle stejného schématu jako skupina B. Anti-C. difficile IgY byl připraven jako v příkladu 1 stou výjimkou, že 12% PEG preparát byl rozpuštěn v Ensure®, odpovídajícím jedné čtvrtině objemu původního žloutku.

U všech zvířat byl pozorován nástup průjmu a dalších příznaků onemocnění a úhyn. Každé zvíře bylo umístěno v individuální kleci a dostávalo potravu a vodu ad libitum. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 6.

Tabulka 6. Účinek orální aplikace hyperimunní protilátky IgY na infekci C. difficile

skupina zvířat	doba do průjmu3	doba do úhynu3
A pouze preimunní IgY	žádný průjem	žádný úhyn
B klindamycin, C. difficile, preimunní IgY	30 h	49 h
C klindamycin, C. difficile, imunní IgY	33 h	56 h

Křečci v kontrolní skupině A si nevyvinuli průjem a zůstali po dobu experimentu zdraví. Křečci ve skupinách B a C vyvinuli diaroické onemocnění. AntiC. difficile IgY nechránil zvířata proti průjmu nebo uhynutí; všechna zvířata podlehla ve stejných časových intervalech jako zvířata ošetřená preimunním IgY. Zatímco tedy imunizace celými organismy může zřejmě zlepšit subletální příznaky u konkrétních bakterií (viz patent US 5,080.895, H. Tokoro), nezdá se tento přístup být produktivní při ochraně proti letálním účinkům C. difficile.

• · ·· • · · · · 4

Příklad 3

Produkce antitoxinů typu A C. botulinum u slepic

Za účelem zjištění, zda je možno vytvořit protilátky proti toxinu produkovanému klostridiálními patogeny, které by byly účinné při léčbě klostridiálních onemocnění, byl produkován antitoxin k toxinu typu A C. botulinum. Tento příklad zahrnuje: (a) modifikaci toxinu, (b) imunizaci, (c) získání antitoxinů, (d) hodnocení antigenity a (e) zjišťování titru antitoxinů.

a) Modifikace toxinu

Toxoid typu A C. botulinum byl získán od B.R. DasGupta. Z něho byl vyčištěn aktivní neurotoxin typu A (MW přibližně 150 kD) do čistoty vyšší než 99 %podle publikovaných metod. [B.R. DasGupta & V. Athyamoorthy, Toxicon. 22:415 (1984).] Neurotoxin byl detoxifikován formaldehydem podle publikovaných metod. [B.R. Singh & B.R. DasGupta, Toxicon. 27:403 (1989).]

b) Imunizace

Toxoid C. botulinum pro imunizaci byl rozpuštěn v PBS (1 mg/ml) a byl emulgován přibližně stejným objemem CFA (GIBCO) při počáteční imunizaci nebo IFA při posilovači imunizaci. V den nula byl dvěma bílým leghornkám, získaným od místních chovatelů, na různých místech (intramuskulárně a subkutánně) aplikován 1 ml inaktivovaného toxoidu emulgovaného v 1 ml CFA. Následné posilovači imunizace byly prováděny podle tohoto schématu (dny injekce a množství toxoidu): dny 14 a 21 - 0,5 mg, den 171 - 0,75 mg, dny 394, 401, 409 - 0,25 mg. Jedna slepice dostala navíc posilovači dávku 0,150 mg v den 544.

• ·

c) Získání antitoxinu

Celkový imunoglobulin ze žloutku (IgY) byl extrahován způsobem popsaným v příkladu 1(c) a peleta IgY byla rozpuštěna v PBS s thimerosalem o původním objemu žloutku.

d) Hodnocení antigenity

Vejce byla sbírána ode dne 409 do dne 423 a bylo zjišťováno, zda je toxoid dostatečně imunogenní, aby vyvolal tvorbu protilátek, vejce od obou slepic byla spojena do jedné skupiny a protilátka byla získána standardním protokolem PEG. [Příklad 1(c).j Antigenita botulinálního toxinu byla hodnocena na Westernových biotech. Na SDS-polyakrylamidovém redukčním gelu byly odděleny detoxikovaný neurotoxin typu A 150 kD a nemodifikovaný toxický botulinální komplex typu A 300 kD (toxin používaný pro intragastrickou aplikaci v experimentech neutralizace zvířecích střev; viz příklad 6). Metoda Westernová biotu byla prováděna podle Towbina. [H. Towbin a d., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76:4350 (1979).] Vzorky po 10 μg komplexu a toxoidu C. botulinum byly rozpuštěny v SED redukujícím pufru (1 % SDS, 0,5 % 2-merkaptoethanolu, 50 mM Tris, pH 6,8, 10 % glycerolu, 0,025 % w/v bromfenolové modři, 10 % β-merkaptoethanolu), zahřívány 10 min na 95 °C a děleny na 5% SDS-polyakrylamidovém gelu o tloušťce 1 mm. [K. Weber a M. Osborn, „Proteins and Sodium Dodecyl Sulfáte: Molecular Weight Determination on Polyacrylamide Gels and Related Procedures“, in: The Proteins, 3. vyd. (H. Neurath & R.L. Hill, ed.) str. 179-223 (Academie Press, NY, 1975).] Část gelu byla odříznuta a proteiny byly odbarveny pomocí Coomassiovy modři. Proteiny ve zbytku gelu byly s použitím elektroblotingového systému Milliblot-SDE (Millipore) podle pokynů výrobce přeneseny na nitrocelulózu. Nitrocelulózy byla dočasně obarvena pomocí 10% Ponceau S (S.B. Carroll a A. Laughon, „Production and Purification of Polycional Antibodies to the Foreign Segment of β-galactosidase Fusion Proteins“, in: DNA Cloning: A Practical Approach, sv. III (ed. D. Glover), str. 89-111, IRL Press, Oxford (1987)] za účelem visualizace pruhů, pak odbarvena mírným proudem destilované vody, vedeným přes blot po dobu několika minut. Nitrocelulóza byla přes

noc ponořena do PBS s obsahem 3 % BSA o teplotě 4 °C za účelem blokování zbylých míst vazby proteinu.

Blot byl rozřezán na proužky a každý proužek byl inkubován s příslušnou primární protilátkou. Ptačí anti-C. botulinum protilátky [popsané v (c)] a preimunní kuřecí protilátka (jako kontrola) byly po dobu 2 h při teplotě místnosti ředěny 1:125 v PBS s obsahem 1 mg/ml BSA. Bloty byly promyty postupně vždy dvěma velkými objemy PBS, BBS-Tween a PBS (každé promývání 10 min). Konjugát sekundární protilátky kozí anti-kuřecí IgG-alkalická fosfatasa (Fisher Biotech) byl zředěn 1:500 v PBS s obsahem 1 mg/ml BSA a inkubován s blotem 2 h při teplotě místnosti. Bloty byly promyty vždy dvěma velkými objemy PBS a BBS-Tween a pak jedním objemem PBS a 0,1 M Tris-HCl, pH 9,5. Bloty byly vyvíjeny v čerstvě připraveném pufru jako substrátu s alkalickou fosfatasou (100 pg/ml tetrazoliumnitromodři (Sigma), 50 pg/ml 5-brom-4-chlor-3-indolylfosfátu (Sigma), 5 mM MgCI₂ v 50 mM Na₂CO₃, pH 9,5).

Westernový bloty jsou znázorněny na obr. 1. Anti-C. botulinum IgY reagoval na redukčním gelu s toxoidem za vzniku širokého imunoreaktivního pásu při asi 145 až 150 kD. Tento toxoid je díky síťování formalinem odolný vůči disulfidickému štěpení redukčními činidly. Imunní IgY reagovat s aktivním toxinovým komplexem, těžkým řetězcem 97 kD a lehkým řetězcem 53 kD C. botulinum typu A. Preimunní IgY byl ve Westernově blotu nereaktivní s komplexem C. botulinum nebo toxoidem.

e) Titr antitoxinu

Titr protilátky IgY k toxoidu C. botulinum typu A z vajec sebraných mezi dnem 409 a 423 byl zjišťován pomocí ELISA tímto způsobem: 96jamkové destičky Falcon Pro-bind byly přes noc při 4 °C opatřeny nánosem 100 μΙ/jamku toxoidu [B.R. Singh & B.R. DasGupta, Toxicon 27:403 (1989)] v koncentraci 2,5 pg/ml v PBS, pH 7,5, s obsahem 0,005 % thimerosalu. Následující den byly jamky po dobu 1 h při 37 °C blokovány PBS s obsahem 1 % BSA. IgY z imunních nebo preimunních vajec byl zředěn v pBS s obsahem 1 % BSA a 0,05 % Tween 20 a destičky byly inkubovány 1 h při 37 °C. Destičky byly promyty třikrát pomocí PBS s obsahem 0,05 % Tween 20 a třikrát samotným PBS. Kozí anti-kuřecí IgG, konjugovaný s alkalickou fosfatasou • · · ··· · · · ···· · ······· · · · ·· ·· ·· ··· ·· ·· (Fisher Biotech) byl zředěn 1:750 v PBS s obsahem 1 % BSA a 0,05 % Tween 20, přidán k destičkám a inkubován 1 h při 37 °C. Destičky byly promyty stejným způsobem jako předtím a byl přidán p-nitrofenylfosfát (Sigma) v koncentraci 1 mg/ml v 0,05 M Na₂CO₃, pH 9,5,10 mM MgCI₂.

Výsledky jsou znázorněny na obr. 2. Kuřata imunizovaná toxoidem vytvořila vysoké titry protilátky vůči imunogenu. Důležité je, že vejce od obou imunizovaných slepic měly významné titry anti-imunogenových protilátek ve srovnání s preimunními kontrolními vejci. Anti-C. botulinum IgY měl významnou aktivitu do ředění 1:93750 nebo většího.

Příklad 4

Příprava imunoglobulinu z ptačího vaječného žloutku v orálně aplikovatelné formě

Pro orální aplikaci ptačích protilátek IgY experimentálním myším bylo nutno stanovit účinný systém podávání IgY. Problém spočíval vtom, že pokud by byl surový IgY rozpuštěn v PBS, salinický roztok v PBS by vyvolával dehydrataci myší, což by mohlo být za dobu studie nebezpečné, proto byly testovány alternativní metody orální aplikace IgY. Příklad zahrnoval: (a) izolaci imunního IgY, (b) solubilizaci IgY ve vodě nebo PBS včetně následné dialýzy roztoku IgY-PBS vodou za účelem eliminace nebo snížení obsahu solí (soli a fosfátu) v pufru a (c) (porovnání množství a aktivity získaného IgY na základě absorbance při 280 nm a PAGE a enzymové imunoanalýzy (ELISA).

a) Izolace imunního IgY

Za účelem zjištění nejúčinnějšího systému podávání IgY jsme použili IgY, který byl vytvořen proti jedu Crotalus durissus terrificus. Od slepic imunizovaných jedem C. durissus terrificus byla sebrána tři vejce a ze žloutků byl extrahován IgY s použitím modifikovaného Polsonova postupu podle Thalley a Carroll [Bio/Technology, 8:934938 (1990)], popsaného v příkladu 1(c).

Vaječné žloutky byly odděleny od bliků, spojeny a smíseny se čtyřmi objemy PBS. Byl přidán práškový PEG do koncentrace 3,5 %. Směs byla odstřeďována 10 min při 10000 min'¹ za účelem peletizace vysráženého proteinu a supernatant byl přefiltrován přes fáčovinu k odstranění vrstvy lipidů. Ksupernatantu byl přidán práškový PEG pro úpravu konečné koncentrace PEG na 12 % (za předpokladu koncentrace PEG v supernatantu 3,5 %). Směs 12 % PEG/lgY byla rozdělena na dva stejné objemy a odstředěna za účelem peletizace IgY.

b) Solubilizace IgY ve vodě nebo PBS

Jedna peleta byla resuspendována v PBS o objemu 1/2 původního objemu žloutku a druhá peleta byla resuspendována ve vodě o objemu 1/2 původního objemu žloutku. Pelety pak byly odstředěny k odstranění částic nebo nerozpustného podílu. IgY v roztoku PBS se rozpouštěl snadno, avšak frakce resuspendovaná ve vodě zůstala zakalená.

Pro splnění předpokládaných požadavků na sterilitu orálně podávaných protilátek je nutno roztok protilátky podrobit sterilní filtraci (jako alternativa k tepelné sterilizaci, která by protilátky zničila). Preparát IgY resuspendovaný ve vodě byl příliš zakalený, než aby prošel membránovým filtrem 0,2 nebo 0,45 pm, a proto bylo 10 ml frakce resuspendované v PBS dialyzováno přes noc při teplotě místnosti proti 250 ml vody. Následujícího rána byla dialýzní komůrka vyprázdněna a naplněna 250 ml čerstvé H₂O pro druhou dialýzu. Poté byl stanoven výtěžek rozpustné protilátky při OD₂₈₀, který je porovnán v tabulce 7.

Tabulka 7. Závislost výtěžku IgY na rozpouštědlech

frakce	absorbance ředění 1:10 při 280 nm	výtěžek %
rozpuštěná v PBS	1,149	100
rozpuštěná v H2O	0,706	61
rozpuštěná v PBS/dialyzovaná s H2O	0,885	77

·· ·· ·· · ·· ·· • · · · · ·· ···· • ···· · · · · ··· • ·· «·· · · · ···· · ······· · · · ·· ·· *· ··· ·· ··

Resuspendováním pelet v PBS s následnou diaiýzou proti vodě se získalo více protilátek než přímo resuspendováním pelet ve vodě (77 % proti 61 %). Ekvivalentní objemy preparátů IgY byly porovnávány pomocí PAGE a tyto výsledky jsou ve shodě s hodnotami absorbance (neuvedeny).

c) Aktivita IgY připraveného s různými rozpouštědly

Byla provedena ELISA za účelem porovnání aktivity IgY extrahovaného každým zvýše uvedených postupů. Na každou jamku 96jamkové mikrotitrační destičky byl nanesen jed C. durissus terrificus (C.d.t.) v koncentraci 2,5 pg/ml v PBS. Zbývající proteinová vazebná místa byla blokována pomocí PBS s obsahem 5 mg/ml BSA. Byla přidána duplicitně ředění primární protilátky (v PBS s obsahem 1 mg/ml BSA). Po 2 h inkubace při teplotě místnosti byla nenavázaná protilátka odstraněna promytím jamek pomocí PBS, BBS-Tween a PBS. Druhově specifická sekundární protilátka (konjugát kozího anti-kuřecího imunoglobulinu s alkalickou fosfatasou (Sigma)) byla zředěna 1:750 v PBS s obsahem 1 mg/ml BSA a přidána do každé jamky mikrotitrační destičky. Po 2 h inkubace při teplotě místnosti byla promytím stejným způsobem odstraněna nenavázaná sekundární protilátka a do každé jamky byla jako substrát přidána čerstvě připravená alkalická fosfatasa (Sigma) v koncentraci 1 mg/ml v 50 mM Na₂CO₃, 10 mM MgCI₂, pH 9,5. Vývoj zbarvení byl měřen pomocí přístroje Dynatech MR 700 s použitím filtru 412 nm. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 8.

Tabulka 8. Vazebná aktivita antigenu u IgY připraveného s různými rozpouštědly

ředění	preimunní	rozp. v PBS	rozp. v H2O	PBS/H2O
1:500	0,005	1,748	1,577	1,742
1:2500	0,004	0,644	0,349	0,606
1:12500	0,001	0,144	0,054	0,090
1:62500	0,001	0,025	0,007	0,016

·· ·· • · · • ·· β·· · · • · · ·· ·· ·· ·· ·♦ • 99 · · · • · ··· · · • · · · · · · • · « · · ·

1:312500

0,010

0,000

0,000

0,002

Výsledky vazebného testu odpovídají hodnotám výtěžku v tabulce 7, přičemž lgY rozpuštěný v PBS vykazoval mírně vyšší aktivitu než protilátka rozpuštěná v PBS a dialyzovaná proti H₂O. Protilátka rozpuštěná ve vodě měla značně nižší vazebnou aktivitu než druhý preparát.

Příklad 5

Přežití aktivity protilátky po průchodu gastrointestinálním traktem

Za účelem zjištění proveditelnosti orální aplikace protilátky bylo zajímavé zjistit, zda orálně podaný lgY přežije průchod gastrointestinálním traktem. Příklad zahrnoval: (a) orální podání specifické imunní protilátky smísené s výživnou směsí a (b) test aktivity protilátky extrahované ze stolice.

a) Orální aplikace protilátky

V tomto příkladu byly jako preparáty lgY použity protilátky proti jedu, rozpuštěné v PBS a dialyzované proti vodě, získané v příkladu 4, smísené se stejným objemem Enfamil®. V tomto experimentu byly použity dvě myši, z nichž každá dostávala jinou dietu:

1) voda a potrava jako obvykle,

2) imunní preparát lgY dialyzovaný proti vodě a smísený 1:1 s Enfamil®. (Odpovídající směs byla myším podávána jako jejich jediný zdroj potravy a vody).

b) Aktivita protilátky po požití

Poté, co obě myši požili příslušnou tekutinu, bylo jako první věc ráno do každé trubky doplněno 10 ml příslušné tekutiny. V polovině dopoledne zůstalo v každé trubce asi 4 až 5 ml kapaliny. V tomto okamžiku byly od každé myši odebrány vzorky ·

stolice, zváženy a rozpuštěny v přibližně 500 μΙ PBS na 100 mg vzorku stolice. V 1,5ml mikrofugálních zkumavkách bylo rozpuštěno 160 mg kontrolní stolice (bez protilátky) v 800 μί PBS a 99 mg experimentální stolice (specifická protilátka) v 500 μΙ PBS. Vzorky byly zahřívány 10 min na 37 °C a důkladně promíchávány. Experimentální stolice byla také drcena úzkou špachtlí. Každý vzorek byl 5 min odstřeďován v mikrofuze a byly odebírány supernatanty, u nichž byl předpoklad obsahu extraktů protilátek. V případě, že byly třeba extrakty do budoucna, byly pelety uchovávány při 2 až 8 °C. Protože supernatanty byly zabarvené, byly pro počáteční ředění při enzymové imunoanalýze (ELISA) pětinásobně zředěny PBS s obsahem 1 mg/ml BSA. Po tomto počátečním zředění pak byly primární extrakty ředěny po řadě pětinásobně. Objem primárního extraktu, přidávaného do každé jamky, byl 190 μί. Analýza ELISA byla provedena přesně, jak uvedeno v příkladu 4.

Tabulka 9. Aktivita specifické protilátky po průchodu gastrointestinálním traktem

ředění	preimunní IgY	kontrolní fekální extrakt	experimentální fekální extrakt
1:5	<0	0,000	0,032
1:25	0,016	<0	0,016
1:125	<0	<0	0,009
1:625	<0	0,003	0,001
1:3125	<0	<0	0,000

Ve fekálním extraktu myši, jíž byla podávána specifická protilátka ve formulaci Enfamil®, byla přítomna určitá aktivní protilátka, ale ve velmi nízkém množství, protože byly vzorky testovány při počátečním zředění 1:5, mohla by být pozorovaná vazba při méně zředěných vzorcích vyšší. Proto byla myším podávána dále buď obvyklá strava a voda nebo specifický IgY ve formulaci Enfamil®, aby mohl být pokus opakován. Další destička ELISA byla opatřena přes noc nánosem 5 pg/ml jedu C.d.t. v PBS.

k ·· • · « • · ·

Následujícího rána byla destička ELISA blokována 5 mg/ml BSA a fekální vzorky byly extrahovány stejně jako v předchozím případě, avšak místo, aby byly zahřívány na 37 °C, byly k omezení proteolýzy uchovávány na ledu. Vzorky byly testovány zpočátku neředěné a pak ředěné po řadě pětinásobně. Jinak byl test prováděn stejně jako v předchozím případě.

Tabulka 10. Přežití protilátky po průchodu gastrointestinálním traktem

ředění	preimunní IgY	kontrolní extrakt	experimentální extrakt
neředěná	0,003	<0	0,379
1:5	<0	<0	0,071
1:25	0,000	<0	0,027
1:125	0,003	<0	0,017
1:625	0,000	<0	0,008
1:3125	0,002	<0	0,002

Pokus potvrdil předchozí výsledky s výrazně vyšší aktivitou protilátky. Kontrolní fekální extrakt nevykázal žádnou aktivitu anti-C.d.í., ani neředěný, zatímco fekální extrakt z myši, živené anti-C.d.ř. IgY/Enfamil®, vykázal značnou anti-C.d.ř. aktivitu. Tento (a předchozí) pokus jasně demonstruje, že aktivní protilátka IgY přežívá průchod myším zažívacím traktem, což je zjištění s příznivými implikacemi pro úspěch orální aplikace IgY jako terapeutických nebo profylaktických prostředků.

Příklad 6

Neutralizace neurotoxinu C. botulinum typu A ptačí antitoxinovou protilátkou in vivo

Tento příklad demonstroval schopnost PEG-čištěného antitoxinu, získaného způsobem uvedeným v příkladu 3, neutralizovat letální účinek neurotoxinu typu A C. botulinum u myší. Za účelem stanovení orální letální dávky (LD₁₀₀) toxinu A byly

skupinám myší BALB/c podávány různé dávky toxinů na jednotku tělesné hmotnosti (průměrná tělesná hmotnost 24 g). pro orální aplikaci byl použit komplex toxinů A, který obsahuje neurotoxin asociovaný s jinými netoxinovými proteiny. Tento komplex je výrazně toxičtější než čištěný neurotoxin, je-li podáván orální cestou. [I. Ohishi a d., Infect. Immun., 16:106 (1977).] Komplex toxinů typu A C. botulinum, získaný od Erica Johnsona (University of Wisconsin, Madison) měl při parenterální aplikaci 250 pg/ml v 50 mM citrátu sodném, pH 5,5, specifická toxicita 3.10⁷ myší LDgo/mg. U myší, živených obvyklou vodou a potravou, bylo obvykle fatálních 40 až 50 ng/g tělesné hmotnosti během 48 h. Jestliže myši dostávaly ad libitum dietu pouze Enfamilu®, byla koncentrace potřebná k vyvolání letality přibližně 2,5krát vyšší (125 ng/g tělesné hmotnosti). U myší živených Enfamilem® s obsahem preimunního IgY (resuspendovaného v Enfamilu® v objemu původního žloutku) byly fatální koncentrace botulinálního toxinů přibližně 200 ng/g tělesné hmotnosti.

Byla rovněž stanovena orální LD₁₀₀ toxinů C. botulinum pro myši, které dostávaly známé množství preimunní lgY-Ensure®, podávané orálně injekčními stříkačkami. Pomocí stříkačky o velikosti 22 bylo každé myši podáno 1 h před a 1/2 h a 5 h po podání botulinálního toxinů vždy 250 μΙ směsi preimunní lgY-Ensure® (preimunní IgY rozpuštěn ve 1/4 původního objemu žloutku), koncentrace toxinů podávaného orálně byly v rozmezí přibližně 12 až 312 ng/g tělesné hmotnosti (0,3 až 7,5 pg na myš). U všech myší byla letální koncentrace botulinálního toxinového komplexu přibližně 40 ng/g tělesné hmotnosti (1 pg na myš) za méně než 36 h.

Dvěma skupinám po 10 myších BALB/c byla orálně podána jednorázová dávka vždy 1 pg botulinálního toxinového komplexu ve 100 pl 50mM citrátu sodného, pH 5,5. Myši dostaly 1 h před a 1/2 h, 4 h a 8 h po podání botulinálního toxinů vždy 250 pl směsi buď preimunního nebo imunního IgY v Ensure® (1/4 původního objemu žloutku). Ještě další dva dny dostávaly myši tři ošetření denně. Myši byly pozorovány po dobu 96 h. Přežití a mortalita je uvedena v tabulce 11.

·· · · ·· · ·· · · ·· ···· ····

Tabulka 11. Neutralizace botulinálního toxinu in vivo

dávka toxinu ng/g	typ protilátky	počet živých myší	počet mrtvých myší
41,6	neimunní	0	10
41,6	anti-botulinální toxin	10	0

Všechny myši, ošeřené směsí preimunní IgY-Ensure®, uhynuly do 46 h po podání toxinu. průměrná doba úhynu myši byla 32 h po podání toxinu. Ošetření směsí preimunní IgY-Ensure® bylo po 24 h přerušeno v důsledku nadměrné paralýzy úst myší v této skupině. Naproti tomu všech deset myší, ošetřovaných směsí imunní anti-botulinální IgY-Ensure®, přežilo déle než 96 h. Pouze 4 myši v této skupině vykazovaly příznaky otravy botulismem (dvě myši asi 2 dny a dvě myši 4 dny po podání toxinu). Tyto myši nakonec uhynuly po 5 a 6 dnech. Šest myší v této imunní skupině nevykazovalo žádné nepříznivé účinky toxinu a zůstalo dlouhodobě živých a zdravých. Ptačí anti-botulinální protilátka tedy prokázala u experimentálních myší velmi dobrou ochranu proti letálním účinkům.

Příklad 7

Produkce ptačího antitoxinu proti toxinu A Clostridium difficile

Toxin A je účinný cytotoxin, vylučovaný patogenními kmeny C. difficile, který hraje přímou roli při poškození gastrolntestinálních tkání. Ve vážnějších případech intoxikace C. difficile se může vyvinout pseudomembránová kolitis, která může být fatální. Tomu by se dalo zabránit neutralizací účinků tohoto toxinu v gastrointestinálním traktu. Jako první krok byly produkovány protilátky proti části toxinu. Příklad zahrnoval: (a) konjugaci syntetického peptidů toxinu A s hovězím sérovým albuminem, (b) imunizaci slepic konjugátem peptid-BSA a (c) detekci antitoxinových peptidických protilátek pomocí ELISA.

a) Konjugace syntetického peptidu toxinů A s hovězím sérovým albuminem

Syntetický peptid CQTIDGKKYYFN-NH₂ byl připraven komerčně (Multiple Peptide Systems, San Diego, CA) a vysokotlakou kapalinovou chromatografii byla zjištěna čistota > 80 %. Jedenáct aminokyselin za cysteinovým zbytkem představuje konsensuální sekvenci opakované sekvence aminokyselin nacházející se v toxinů A. [Wren a d., Infect Immun., 59:3151-3155 (1991).] Cystein byl připojen pro usnadnění konjugace s nosným proteinem.

Za účelem přípravy nosiče pro konjugaci byl BSA (Sigma) rozpuštěn v 0,01 M NaPO4, pH 7,0 na konečnou koncentraci 20 mg/ml a n-maleinimidobenzoyl-Nhydroxysukcinimidester (MBS; Pierce) byl rozpuštěn v Ν,Ν-dimethylformamidu na koncentraci 5 mg/ml. 0,51 ml roztoku MBS bylo přidáno k 3,25 ml roztoku BSA a inkubováno 30 min při teplotě místnosti se zamícháním každých 5 min. BSA, aktivovaný MBS, pak byl čištěn chromatografii na sloupci Bio-Gel P-10 (Bio-Rad; objem lože 40 ml), ekvilibrovaném pufrem 50 mM NaPO₄, pH 7,0. Píkové frakce byly spojeny (6,0 ml).

Lyofilizovaný peptid toxinů A (20 mg) byl přidán ke směsi aktivovaného BSA, míchán do rozpouštění peptidu a inkubován 3 h při teplotě místnosti. Během 20 min se reakční směs zakalila a vytvořila se sraženina. Po 3 h byla reakční směs odstředěna 10 min při 10000 x g a supernatant byl analyzován na obsah proteinu. Při 280 nm nebylo možno detekovat významné množství proteinu. Sraženina konjugátu byla promyta třikrát PBS a skladována při 4 °C. Byla provedena druhá konjugace s 15 mg aktivovaného BSA a 5 mg peptidu a konjugáty byly spojeny a suspendovány v koncentraci peptidu 10 mg/ml v 10 mM NaPO₄, pH 7,2.

b) Imunizace slepic peptidovým konjugátem

U dvou slepic byla provedena počáteční imunizace v den nula injekcí 1 mg peptidového konjugátu, který byl emulgován v CFA (GIBCO), do dvou subkutánních a dvou intramuskulárních míst. V den 14 a v den 21 dostaly slepice posilovači injekci 1 mg peptidového konjugátu emulgovaného v IFA (GIBCO).

« · · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · · • · · · » ·· ·· ·· · • · · « • · · · • · · · · 4 • · « • Η · · ·

c) Detekce antitoxinových peptidických protilátek pomocí ELISA

Ze dvou vajec, získaných před imunizací (preimunní) a dvou vajec, získaných 31 a 32 dní po počáteční imunizaci, byl pomocí frakcionace PEG, popsané v příkladu 1, vyčištěn IgY.

Na jamky 96jamkové mikrotitrační destičky (Falcon Pro-Bind Assay Plate) bylo přes noc při 4 °C naneseno 100 pg/ml roztoku syntetického peptidů toxinu A v PBS, pH 7,2, připraveného rozpuštěním 1 mg peptidů v 1,0 ml H₂O a zředěním PBS. Preimunní a imunní preparáty IgY byly po řadě pětinásobně ředěny v pufru obsahujícím 1 % PEG 8000 a 0,1 % Tween-20 (v/v) v PBS, pH 7,2. Jamky byly blokovány po dobu 2 h při teplotě místnosti pomocí 150 μΙ roztoku obsahujícího 5 % (v/v) netučného sušeného mléka Carnation® a 1 % PEG 8000 v PBS, pH 7,2. Po 2 h inkubace při teplotě místnosti byly jamky promyty, byl přidán konjugát sekundární králičí anti-kuřecí IgG-alkaiická fosfatasa (1:750), jamky byly znovu promyty a vyvíjení barvy bylo provedeno jako v příkladu 1. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 12.

Tabulka 12. Reaktivita IgY s toxinovým peptidem

	absorbance při 410 nm
ředění preparátu PEG	preimunní	imunní anti-peptid
1:100	0,013	0,253
1:500	0,004	0,039
1:2500	0,004	0,005

Je zřejmé, že imunní protilátky obsahují titry proti tomuto opakujícímu se epitopu toxinu A.

Příklad 8

Produkce ptačích antitoxinů proti nativním toxinům A a B Clostridium difficile

Za účelem zjištění, zda jsou ptačí protilátky účinné při neutralizaci toxinů C. difficile, byly imunizovány slepice s použitím nativních toxinů A a B C. difficile. Získané protilátky z vaječného žloutku pak byly extrahovány a hodnocena jejich schopnost neutralizovat toxiny A a B in vitro. Příklad zahrnoval (a) přípravu toxinových imunogenú, (b) imunizaci, (c) čištění antitoxinů a (d) test aktivity neutralizace toxinů.

a) Příprava toxinových imunogenú

Jako imunogeny byly použity jak nativní toxiny A a B C. difficile, tak toxoidy C. difficile, připravené zpracováním nativních toxinů formaldehydem. Toxoidy A a B C. difficile, byly připraveny postupem, který byl modifikován podle publikovaných metod (Ehrich a d., Infect. Immun. 28:1041 (1980). Oddělené roztoky (v PBS) nativních toxinů A a B C. difficile (Tech Lab) byly upraveny na koncentraci 0,20 mg/ml a byl přidán formaldehyd do konečné koncentrace 0,4 %. Roztoky toxin/formaldehyd pak byly inkubovány 40 h při 37 °C. Ze vzniklých roztoků toxoidu pak byl odstraněn volný formaldehyd dialýzou proti PBS při 4 °C. Ve dříve publikovaných zprávách nebyla prováděna dialýza. V odpovídajících toxoidových preparátech tedy musel být přítomen volný formaldehyd. Roztoky toxoidů byly zkoncentrovány pomocí koncentrační jednotky Centriprep (Amicon) na konečnou koncentraci toxoidu 4,0 mg/ml. Zbývající dva preparáty byly označeny jako toxoid A a toxoid B.

Nativní toxiny C. difficile byly připraveny zkoncentrováním zásobních roztoků toxinu A a toxinu B (Tech Lab., lne.) pomocí koncentrační jednotky Centriprep (Amicon na konečnou koncentraci 4,0 mg/ml.

• · ·

b) Imunizace

S použitím výše popsaných imunogenu toxoidu A a toxoidu B byly provedeny první dvě imunizace. Byly použity celkem 3 různé imunizační kombinace. V první imunizační skupině bylo 0,2 ml toxoidu A emulgováno ve stejném objemu adjuvans Titer Max (CytRx). Toto adjuvans bylo použito pro zachování množství použitého imunogenu a pro zjednodušení postupu imunizace. Tato imunizační skupina byla označena „CTA“. Ve druhé imunizační skupině bylo 0,1 ml toxoidu B emulgováno ve stejném objemu adjuvans Titer Max. Tato skupina byla označena „CTB“. Ve třetí imunizační skupině bylo 0,2 ml toxoidu A smíseno nejprve s 0,2 ml toxoidu B a vzniklá směs byla emulgována v 0,4 ml Titer Max. Tato skupina byla označena „CTAB“. Tímto způsobem byly připraveny tři různé emulze imunogenú, každá s obsahem konečné koncentrace 2,0 mg/ml toxoidu A (CTA), resp. toxoidu B (CTB) nebo směsi 0,2 mg/ml toxoidu A a 2,0 mg/ml toxoidu B (CTAB).

V den 0 byly imunizovány bílé leghornky, získané od místního chovatele, tímto způsobem: Skupina CTA: Byly imunizovány čtyři slepice, přičemž každá dostala 200 pg toxoidu A ve dvou intramuskulárních (I.M.) injekcích emulze 50 μΙ emulze CTA do oblasti hrudníku. Skupina CTB: Jedna slepice byla imunizována 200 pg toxoidu B ve dvou I.M. injekcích 50 μΙ emulze CTB do oblasti hrudníku. Skupina CTAB: Byly imunizovány čtyři slepice, přičemž každá dostala směs obsahující 200 pg toxoidu A a 200 pg toxoidu B ve dvou I.M. injekcích 100 pl emulze CTAB do oblasti hrudníku. Druhá imunizace byla provedena po uplynutí 5 týdnů v den 35 přesně stejně jako výše popsaná první imunizace.

Za účelem zjištění, zda slepice, které byly předtím imunizovány toxoidy C. difficile, mohou tolerovat následnou posilovači imunizaci pomocí nativních toxinů, byla jedna slepice ze skupiny CTAB imunizovány potřetí, tentokrát pomocí směsi nativního toxinů A a nativního toxinů B, popsaného výše v oddílu (a) (tyto toxiny nebyly ošetřeny formaldehydem a byly použity v aktivní formě). Účelem bylo zvýšit množství (titr) a afinitu specifické antitoxinové protilátky produkované slepicí, oproti hodnotě získané imunizací pouze toxoidy. V den 62 bylo připraveno 0,1 ml směsi toxinů, obsahující 200 pg nativního toxinů A a 200 pg nativního toxinů B. Tato směs toxinů pak byla emulgována v 0,1 ml adjuvans Titer Max. Vzniklou emulzí imunogenu

pak imunizována jedna slepice CTAB ve dvou I.M. injekcích po 100 μΙ do oblasti hrudníku. Tato slepice byla označena páskou na křídle a pozorována za účelem zjištění případných nepříznivých účinků po dobu přibližně 1 týdne, po kterou se jevila v dobrém zdravotním stavu.

Protože výše uvedená slepice CTAB tolerovala posilovači imunizaci nativními toxiny A a B bez nepříznivých účinků, bylo rozhodnuto podat posilovači dávku nativního toxinu také zbylým slepicím. V den 70 byly provedeny posilovači imunizace tímto způsobem: Skupina CTA: 0,2 ml roztoku 4 mg/ml nativního toxinu A bylo emulgováno ve stejném objemu adjuvans Titer Max. Každá ze 4 slepic pak byla imunizována 200 gg nativního toxinu A způsobem popsaným výše pro imunizaci toxoidem A. Skupina CTB: 50 μΙ roztoku 4 mg/ml nativního toxinu B bylo emulgováno ve stejném objemu adjuvans Titer Max. Slepice byla imunizována 20 μg nativního toxinu B způsobem pospaným výše pro imunizaci toxoidem B. Skupina CTAB: 0,15 ml roztoku 4 mg/ml nativního toxinu A bylo smíseno nejprve s 0,15 ml roztoku 4 mg/ml nativního toxinu B. Vzniklá směs toxinů pak byla emulgována v 0,3 ml adjuvans Titer Max. Pak byly 3 zbylé slepice (slepice s páskou na křídle nebyla tentokrát imunizována) imunizovány 200 μg nativního toxinu A a 200 μg nativního toxinu B způsobem popsaným výše pro imunizaci toxoidem A + toxoidem B (CTAB). V den 85 dostaly všechny slepice druhou posilovači dávku nativních toxinů přesně stejným způsobem.

Všechny slepice tolerovaly posilovači imunizaci nativními toxiny bez nepříznivých účinků. Protože dříve publikovaná literatura popisuje použití toxoidu ošetřených formaldehydem, jedná se zřejmě o první případ, kdy byly prováděny imunizace s použitím nativních toxinů C. difficile.

c) Čištění antitoxinů

Od slepic ve skupině CTB po 10 až 12 dnech po druhé imunizaci toxoidem (den 35 imunizace popsané výše v oddílu (b)) a od slepic ve skupinách CTA a CTAB po 20 až 21 dnech po druhé imunizaci toxoidem byla sbírána vejce. Pro získání preimunní (negativní) kontroly byla sbírána vejce také od neimunizovaných slepic ze ···· · · · · · •> ·· · · ··· ·· ·· stejného hejna. Ze čtyř skupin vajec byl způsobem popsaným v příkladu 1(c) extrahován ze žloutku imunoglobulin (IgY) a konečné pelety IgY byly solubilizovány v PBS v původním objemu žloutku bez thimerosalu. Thimerosal byl vyloučen, protože by byl toxický vůči buňkám CHO, používaným v tesech neutralizace toxinu, popsaných dále v sekci (d).

d) Test aktivity neutralizace toxinu

Aktivita roztoků IgY, připravený v oddílu (c), při neutralizaci toxinů byla stanovena testem, který byl modifikován podle publikovaných metod. [Ehrich a d., Infect. Immun. 28:1041-1043 (1992), a McGee a d., Microb. Path. 12:333-341 (1992).] Jako další kontrola byla aktivita při neutralizaci toxinů zjišťována také u afinitně čištěného kozího anti-toxinu A C. difficile (Tech Lab) a afinitně čištěného kozího anti-toxinu B C. difficile (Tech Lab).

Roztoky IgY a kozí protilátky byly sériově ředěny médiem F 12 (GIBCO), které bylo doplněno 2 % FCS (GIBCO) (tento roztok je ve zbytku tohoto příkladu označován jako „médium“). Vzniklé roztoky protilátek pak byly smíseny se standardizovanou koncentrací buď nativního toxinu A C. difficile (Tech Lab) nebo nativního toxinu B C. difficile (Tech Lab) v dále uvedených koncentracích. Po 60 min inkubace při 37 °C bylo do jamek 96jamkových mikrotitračních destiček (Falcon Microtest lil), které obsahovaly 2,5.10⁴ ovariálních buněk čínského křečka - CHO - na jamku (buňky CHO byly naneseny na destičky předchozí den, aby dobře přilnuly) přidán objem 100 μΙ směsi toxin-protilátka. Dále uvedená konečná koncentrace toxinu nebo uvedené ředění protilátky se vztahuje na konečnou testovanou koncentraci každé látky přítomné v příslušné jamce mikrotitrační destičky. Byly připraveny referenční toxinové jamky, které obsahovaly buňky CHO a toxin A nebo toxin B ve stejné koncentraci, jaká byla použita u směsí toxin plus protilátka (tyto jamky neobsahovaly protilátku). Byly rovněž připraveny zvláštní kontrolní jamky, které obsahovaly pouze buňky CHO a médium. Zkušební destičky pak byly inkubovány 18 až 24 h v inkubátoru se zvlhčenou atmosférou s 5 % CO₂ při 37 °C. Následujícího dne byly zbylé ulpívající (životaschopné) buňky v jamkách podrobeny barvení po dobu 10 min pomocí 0,2% krystalové violeti (Mallinckrodt) rozpuštěné ve 2 % ·· ·· ·· · ·· ·♦ ··· · · ·· · · · · • · ··· ·· · · · ·♦ « · · · · · · · · ··· · · ···· ··· · · · ethanolu. přebytek zbarvení byl odstraněn oplachem vodou a barvené buňky byly solubilizovány přídavkem 100 μΙ 1% SDS (rozpuštěného ve vodě) do každé jamky. Pak byl měřena absorbance každé jamky při 570 nm a bylo vypočteno procento cytotoxicity každého zkušebního vzorku nebo směsi podle vzorce absorbance vzorku % cytotoxicity buněk CHO = [1 - (-)] x 100 absorbance kontroly

Na rozdíl od dříve publikovaných údajů, kde se výsledky kvantifikují visuálně počítáním zaoblených buněk na základě mikroskopie, byly v tomto příkladu ke kvantifikaci testu toxinů C. difficile použity spektrofotometrické metody. Pro stanovení aktivity CTA, CTAB a preimunních preparátů IgY, stejně jako afinitně čištěného kontrolního kozího antitoxinu A, při neutralizaci toxinu A byla jednotlivá ředění těchto protilátek podrobena reakci s 0,1 pg/ml nativního toxinu A (tj. přibližně 50 % cytotoxické dávky toxinu A v tomto testu). Výsledky jsou znázorněny na obr. 3.

K úplné neutralizaci došlo v případě IgY CTA (antitoxin A) ve zředění 1:80 nebo nižším a významná neutralizace se projevovala do zředění 1:320. IgY CTAB (antitoxin A + toxin B) vykazoval úplnou neutralizaci při ředění 1:320 až 1:160 a nižším a významnou neutralizaci to ředění 1:1280. Komerčně dostupný afinitně čištěný kozí antitoxin A neneutralizoval toxin A úplně při žádném z testovaných zředění, ale vykazoval významnou neutralizaci do zředění 1:1280. Preimunní IgY nevykazoval aktivitu při neutralizaci toxinu A v žádné testované koncentraci. Výsledky demonstrují, že IgY, čištěný z vajec, snášených slepicemi, imunizovanými samotným toxinem A nebo současně toxinem A a toxinem B, je účinným antitoxinem proti toxinu A.

Aktivita CTAB a preimunních preparátů IgY a rovněž afinitně čištěného kontrolního kozího antitoxinu B při neutralizaci toxinu B byla stanovována reakcí různých zředění těchto protilátek s nativním toxinem B v koncentraci 0,1 ng/ml (přibližně 50 % cytotoxické dávky toxinu B v testovaném systému). Výsledky jsou znázorněny na obr. 4.

K úplné neutralizaci toxinu B došlo u IgY CTAB (antitoxin A + toxin B) při zředění 1:40 a nižším a významná neutralizace se projevovala do zředění 1:320.

·· ·· · · · ·· ·· ··· « · · · · · · · ····· ·· · ···· • ·· · · · · · · ···· · ······· ··· ·· ·· ·· ··· ·· ··

Afinitně čištěný kozí antitoxin B vykazoval úplnou neutralizaci při zředění 1:640 a nižším a významná neutralizace se projevovala do ředění 1:2560. Preimunní IgY nevykazoval neutralizační aktivitu vůči toxinu B při žádné testované koncentraci. Tyto výsledky demonstrují, že IgY, čištěný z vajec, snášených slepicemi imunizovanými současně toxinem A a toxinem B, je účinným antitoxinem proti toxinu B.

V další studii byla zjišťována aktivita CTB, CTAB a preimunních preparátů IgY při neutralizaci toxinu B reakcí různých ředění těchto protilátek s nativním toxinem B v koncentraci 0,1 pg/ml (přibližně 100 % cytotoxické dávky toxinu B v tomto testovacím systému). Výsledky jsou uvedeny na obr. 5.

K významné neutralizaci toxinu B došlo v případě IgY CTAB (antitoxin B) ve zředění 1:80 a nižším, zatímco v případě IgY CTAB (antitoxin A + toxin B) byla zjištěna významná neutralizační aktivita při zředění 1:40 a nižším. Preimunní IgY nevykazoval neutralizační aktivitu vůči toxinu B v žádné testované koncentraci. Tyto výsledky demonstrují, že IgY, čištěný z vajec, snášených slepicemi imunizovanými samotným toxinem B nebo současně toxinem A a toxinem B, je účinným antitoxinem vůči toxinu B.

Příklad 9

Ochrana zlatých syrských křečků in vivo před onemocněním C. difficile pomocí ptačích antitoxinů proti toxinů, A a B C. difficile

Nejintensivněji používaným zvířecím modelem pro studium onemocnění C. difficile je křeček. [Lyerly a d., Infect. Immun. 47:349-352 (1992).] Existuje několik jiných zvířecích modelů pro průjem vyvolaný antibiotiky, ale žádný z nich nesimuluje lidskou formu onemocnění tak blízce jako křeček. [R. Fekety, „Animal Models of Antibiotic-lnduced Collitis“, in: O. Zak a M. Sande (ed.), Experimental Models in Antimicrobial Chemotherapy, sv. 2, str. 61-72 (1986).] V tomto modelu se zvířata nejprve predisponují pro onemocnění orálním podáním antibiotika, jako je klindamycin, které mění populaci normálně se vyskytující gastrointestinální flóry (Fekety, str. 61-72). Po orální imunizaci zvířat životaschopnými organismy C. difficile • · se u křečků vyvine zánět slepého střeva a na střevní sliznici je patrné krvácení, ulcerace a zánět. [Lyerly a d., Infect. Immun. 47:349-352 (1985).] Zvířata se stanou letargickými, mají silný průjem a vysoké procento jich na onemocnění umírá. [Lyerly a d., Infect. Immun. 47:349-352 (1985).] Tento model se proto ideálně hodí pro vývoj terapeutických prostředků, navrhovaných pro léčbu nebo profylaxi onemocnění C. difficile.

Schopnost antitoxinů C. difficile, popsaných výše v příkladu 1, chránit křečky před onemocněním C. difficile, byla zjišťována pomocí zlatého syrského křečka jako modelu infekce C. difficile. Příklad zahrnoval (a) přípravu ptačích antitoxinů C. difficile, (b) ochranu křečků před onemocněním C. difficile léčbou pomocí ptačích antitoxinů a (c) dlouhodobé přežití ošetřených křečků.

a) Příprava ptačího antitoxinů C. difficile

Od slepic ze skupin CTA a CTAB, popsaných v příkladu 1(b), byla sebrána vejce. Vejce použitá jako preimunní (negativní) kontrola byla zakoupena v místním supermarketu. Z těchto tří skupin vajec byl extrahován imunoglobulin IgY způsobem popsaným v příkladu 1 (c) a konečné pelety IgY byly solubilizovány ve výživném prostředku Ensure® v objemu jedné čtvrtiny původního objemu žloutku.

b) Ochrana křečků in vivo proti onemocnění C. difficile ošetřením ptačím antitoxinem

Byla zjišťována schopnost ptačích antitoxinů C. difficile, připravených v oddíle (a), chránit křečky před onemocněním C. difficile, s použitím zvířecího modelu, modifikovaného podle publikovaných postupů. [Fekety, str. 61-72, Borriello a d., J. Med. Microbiol. 24:53-64 (1987), Kim a d., Infect. Immun. 55:2984-2992 (1987)), Borriello a d., J. Med. Microbiol. 25:191-196 (1988), Delmee a Avesani, J. Med. Microbiol. 33:85-90 (1990), a Lyerly a d., Infect. Immun. 59:2215-2218 (1991).] pro tuto studii byly použity tři různé experimentální skupiny, každá tvořená 7 samicemi zlatých čínských křečků (Charles River) o stáří přibližně 10 týdnů a hmotnosti přibližně 100 g. Tyto skupiny byly označeny „CTA“, „CTAB“ a „preimunní“. Tato • · ·· ·· · · · ·· ··· · · · · · · · • ···· · · · · ··· • ·· ··· · · · ···· ······· · · ·· ·· ·· ··· ·· ·· označení odpovídala antitoxinovým preparátům, jimiž byla zvířata v každé skupině ošetřována. Každé zvíře bylo umístěno v samostatné kleci a po celou délku studie dostávalo potravu a vodu ad libitum. V den 1 bylo každému zvířeti orálně podáno 1,0 ml jednoho ze tří antitoxinových preparátů (připravených výše v oddíle (a)) v těchto časových bodech: 0 h, 4 h a 8 h. V den 2 bylo opakováno ošetření jako v den 1.

V den 3 v časovém bodě 0 byl každému zvířeti opět podán výše popsaným způsobem antitoxin. po 1 h bylo každému zvířeti orálně podáno 3,0 mg klindamycinHCI (Sigma) v 1 ml vody. Toto ošetření predisponuje zvířata k infekci C. difficile. Jako kontrola možné endogenní kolonizace C. difficile byly stejným způsobem dále podány 3,0 mg klindamycin-HCI ještě jednomu zvířeti ze stejné dodávky (neošetřenému). Toto kontrolní zvíře s klindamycinem bylo po zbytek studie ponecháno bez ošetření (a bez infekce). V časových bodech 4 h a 8 h byl zvířatům výše uvedeným způsobem podán antitoxin. V den 4 v časovém bodě 0 h byl každému zvířeti opět výše uvedeným způsobem podán antitoxin. V 1 h bylo každé zvíře orálně imunizováno 1 ml inokula C. difficile, které obsahovalo přibližně 100 organismů kmene 43596 C. difficile ve sterilním salinickém roztoku. Kmen C. difficile 43956, což je kmen sérotypu C, byl zvolen proto, že je zástupcem jednoho z nejčastějších sérotypu, izolovaných z pacientů s pseudomembránovou kolitis, vyvolanou antibiotiky. [Delmee a d., J. Clin. Microbiol., 28:2210-2214 (1985).] Navíc se tento kmen již dříve projevil jako virulentní na křeččím modelu infekce. [Delmee a Avesani, J. Med. Microbiol. 33:85-90 (1990).].

V časových bodem 4 h a 8 h byl zvířatům výše uvedeným způsobem podán toxin. Ve dny 5 až 13 byl zvířatům 3x denně podáván antitoxin, jek ve výše popsáno pro den 1, a byl pozorován nástup průjmu a úhyn. Ráno dne 14 byly shrnuty konečné výsledky studie. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 13.

Tabulka 13. Výsledky ošetření

skupina	počet přeživších zvířat	počet uhynulých zvířat
preimunní	1	6
CTA (pouze antitoxin A)	5	2
CTAB (antitoxin A + antitoxin B)	7	0

·· ·· • · · · • · ··· · • · · · · · • · · · · ·· ··

U zástupců zvířat, uhynulých ve skupinách preimunního preparátu a CTA, byla provedena nekropsie. Z apendixů těchto zvířat byly kultivovány životaschopné organismy C. difficile a makroskopická patologie gastrointestinálního traktu těchto zvířat byla konzistentní s očekáváním pro onemocnění C. difficile (zanícený, zvětšený, hemoragický apendix, vyplněný vodnatým diaroickým materiálem). Kontrolní zvířata s klindamycinem zůstala během celé doby studie zdravá, což ukazuje, že křečci, použití pro studii, nebyli před zahájením studie kolonizováni endogenními organismy C. difficile. Po konečném ošetření antitoxinem v den 13 bylo usmrceno a porobeno pitvě i vždy jedno přeživší zvíře ze skupiny CTA a CTAB. U žádného nebyla zaznamenána patologie.

Ošetření křečků orálně podaným antitoxinem proti toxinů A a toxinů B (skupina CTAB) úspěšně chránilo 7 ze 7 (100 %) zvířat před onemocněním C. difficile. Ošetření křečků orálně podaným antitoxinem proti toxinů A (skupina CTA) chránilo 5 ze 7 (71 %) těchto zvířat před onemocněním C. difficile. Ošetření pomocí preimunního IgY před onemocněním C. difficile nechránilo, protože přežilo pouze 1 ze 7 (14 %) těchto zvířat, tyto výsledky demonstrují, že ptačí antitoxin proti toxinů A a ptačí antitoxin proti toxinů A + toxinů B účinně chrání křečky před onemocněním C. difficile. Z těchto výsledků rovněž vyplývá, že i když neutralizace toxinů A samotného poskytuje určitý stupeň ochrany proti onemocnění C. difficile, je pro dosažení maximální ochrany nutná současně aktivita antitoxinu A a antitoxinu B.

c) Dlouhodobé přežití ošetřených křečků

V literatuře bylo popsáno, že křečci, ošetřovaní orálně podávaným koncentrátem hovězího IgG, jsou chráněni před onemocněním C. difficile, pokud ošetřování trvá, ale jakmile se přeruší, vyvine se u nich průjem a zvířata během 72 h uhynou. [Lyerly a d., Infect. Immun. 59(6):2215-2218 (1991).]

Za účelem zjištění, zda léčba onemocnění C. difficile pomocí ptačích antitoxinů podporuje dlouhodobé přežití po přerušení léčby, byla pozorována 4 přežívající zvířata ve skupině CTA a 6 přežívajících zvířat ve skupině CTAB po dobu 11 dní (264 • · · ·

h) po přerušení léčby antitoxinem, popsané výše v oddílu (b). Všichni křečci zůstali po celou tuto dobu zdraví. Tento výsledek demonstruje, že léčba ptačím antitoxinem nejen chrání před nástupem onemocnění C. difficile, (tj. je profylakticky účinná), ale podporuje i dlouhodobé přežití po skončení léčby, a tak poskytuje trvalé vyléčení.

Příklad 10

Léčba nepopiratelné infekce C. difficile u zlatých syrských křečků ptačími antitoxiny proti toxinům A a B C. difficile

Schopnost ptačích antitoxinů C. difficile, popsaných výše v příkladu 8, léčit stanovenou infekci C. difficile byla hodnocena pomocí modelu zlatého syrského křečka. Příklad zahrnoval (a) přípravu ptačích antitoxinů C. difficile, (b) léčbu křečků s nepopiratelnou infekcí C. difficile in vivo a (c) histologické hodnocení cekální tkáně.

a) Příprava ptačích antitoxinů C. difficile

Byla odebrána vejce od slepic skupiny CTAB, popsané výše v příkladu 8 (b), které byly imunizovány toxoidy C. difficile a nativními toxiny A a B. Vejce zakoupená v místním supermarketu byla použita jako preimunní (negativní) kontrola. Z obou skupiny vajec byl extrahován imunoglobulin IgY způsobem popsaným v příkladu 1 (c) a konečné pelety IgY byly solubilizovány ve výživném prostředku Ensure® v objemu čtvrtiny původního objemu žloutku.

b) Léčba křečků s nepopiratelnou infekcí C. difficile in vivo

Ptačí antitoxiny C. difficile, připravené výše v oddílu (a), byly hodnoceny na schopnost léčit stanovenou infekci C. difficile u křečků s použitím zvířecího modelu, který byl modifikován podle postupu, který byl popsán pro studii ochrany křečků výše v příkladu 8(b).

·· ·· · · 9 ·· ·· · 9 9 9 99 9 9 9 9 • 9 9 99 9 · · · · · · • ·· ··· · · · ···· 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 99 999 99 99

Pro tuto studii byly použity čtyři experimentální skupiny, každá tvořená 7 samicemi zlatých syrských křečků (Charles River) o stáří přibližně 10 týdnů a hmotnosti přibližně 100 g. Každé zvíře bylo ustájeno samostatně a po celou dobu studie dostávalo potravu a vodu ad libitum.

V den 1 studie byla provedena predispozice zvířat ve všech čtyřech skupinách infekcí C. difficile orálním podáním 3,0 mg klindamycin-HCI (Sigma) v 1 ml vody.

V den 2 bylo každé zvíře ve všech čtyřech skupinách orálně imunizováno 1 ml inokula C. difficile, které obsahovalo přibližně 100 organismů kmene 43596 C. difficile ve sterilním salinickém roztoku. Kmen 43596 C. difficile byl zvolen proto, že je zástupcem jednoho z nejčastěji se vyskytujících sérotypů izolovaných z pacientů s pseudomembránovou koiitidou, spojenou s antibiotiky. [Delmee a d., J. Clin. Microbiol. 28:2210-2214 (1990).] Protože byl tento kmen použit ve všech předchozích příkladech, byl zde použit také z důvodu experimentální kontinuity.

V den 3 studie (24 h po infekci) byla zahájena léčba ve dvou ze čtyř skupin zvířat. Každé zvíře v jedné skupině dostalo orálně 1,0 ml preparátu IgY CTAB (připraveného výše v oddíle (a)) v časových bodech 0 h, 4 h a 8 h. Zvířata v této skupině byla označena „CTAB-24“. Zvířatům ve druhé skupině bylo orálně podáno 1,0 ml preimunního preparátu IgY (připraveného rovněž výše v oddíle (a)) ve stejných časových bodech jako v případě skupiny CTAB. Tato zvířata byla označena jako „Pre-24“. Ve zbylých dvou skupinách zvířat se v den 3 nic neprovádělo.

V den 4, 48 h po infekci, bylo ve skupinách CTAB-24 a Pre-24 opakováno stejné ošetření jako v den 3, které bylo také zahájeno ve stejných časových bodech ve zbylých dvou skupinách. Poslední dvě skupiny zvířat byly označeny „CTAB-48“ a „Pre-48“.

V den 5 až 9 byl zvířatům ve všech čtyřech skupinách podán 3x denně antitoxin nebo preimunní IgY, jak je popsáno výše pro den 4. Všechny čtyři skupiny jsou shrnuty v tabulce 14.

·· ·· ·· · ·· ·· · ·· ···· · · · · • · ··· · · · · · ·» • ·· · · · · · · ··· · · • · · « · · · · · ·

Tabulka 14. Experimentální skupiny

označení	experimentální ošetření
CTAB-24	infekce, léčba w/antitoxin IgY zahájení 24 h po infekci
Pre-24	infekce, léčba w/preimunní IgY zahájení 24 h po infekci
CTAB-48	infekce, léčba w/antitoxin IgY zahájení 48 h po infekci
Pre-48	infekce, léčba w/preimunní IgY zahájení 48 h po infekci

U všech zvířat byl pozorován nástup průjmů a úhyn do uzavření studie ráno 10. dne. Výsledky studie jsou znázorněny v tabulce 15.

Tabulka 15. Experimentální výsledky - den 10

skupina	počet přeživších zvířat	počet uhynulých zvířat
CTAB-24	6	1
Pre-24	0	7
CTAB-48	4	3
Pre-48	2	5

Přežilo 86 % zvířat, která začala dostávat léčbu IgY antitoxinu 24 h po infekci (CTAB-24), resp. 57 % zvířat, léčených IgY antitoxinu počínaje 48 h po infekci (CTAB-48). Naproti tomu nepřežilo žádné zvíře, které dostávalo preimunní IgY počínaje 24 h po infekci (Pre-24), a do závěru studie přežilo pouze 29 % zvířat, která začala dostávat léčbu preimunním IgY 48 po infekci (Pre-48). Tyto studie demonstrují, že ptačí antitoxiny, vytvořené proti toxinům A a B C. difficile, jsou schopny úspěšně léčit nepopiratelnou infekci C. difficile in vivo.

c) Histologické hodnocení cekální tkáně

Pro další hodnocení schopnosti preparátů IgY, testovaných v této studii na schopnost léčit nepopiratelnou infekci C. difficile bylo provedeno histologické . . . *· · ·· ·· • · · ···· ···· • ···· · · · · · ·.

• · · ··· · · · ···· · ······· ··· ·· ·· ·· ··· ·· · · hodnocení vzorků cekální tkáně, získaných od reprezentativních zvířat ze studie popsané výše v oddílu (b).

Bezprostředně po smrti byly za zvířat, která uhynula ve skupinách Pre-24 a Pre-48, odebrány vzorky cekální tkáně. Po dokončení studie byl usmrcen zástupce přeživších zvířat a byly odebrány vzorky cekální tkáně ze skupin CTAB-24 a CTAB48. Bylo rovněž usmrceno jedno neošetřené zvíře ze stejné dodávky, jaká byla použita ve studii, a vzorek cekální tkáně byl odebrán jako normální kontrola. Všechny tkáňové vzorky byly fixovány přes noc při 4 °C v 10% pufrovaném formalinu. Fixované tkáně byly uloženy do parafinu, nařezány a umístěny na podložní sklíčka. Řezy tkání pak byly barveny pomocí hematoxylinu a eosinu (skvrna H a E) a zkoumány světelnou mikroskopií.

Při zkoumání nevykazovaly tkáně získané ze zvířat CTAB-24 a CTAB-48 žádné patologické známky a byly nerozeznatelné od normální kontroly. Toto zjištění poskytuje další důkaz schopnosti ptačích antitoxinů, vytvořených proti toxinům A a B C. difficile, účinně léčit nepopiratelnou infekci C. difficile a zabraňovat patologickým následkům, ke kterým vlivem C. difficile normálně dochází.

Naproti tomu bylo u zvířat ze skupin Pre-24 a Pre-48, která uhynula na onemocnění C. difficile, pozorováno charakteristické podstatné poškození a destrukce sliznic. Normální architektura tkáně byla u těchto dvou preparátů obliterována a většina tkáně sliznic odpadla a vyskytovaly se četné velké hemorrhagické oblasti obsahující masivní počty erytrocytú.

Příklad 11

Klonování a exprese fragmentů toxinu A C. difficile

Byl klonován a sekvenován gen toxinu A a bylo zjištěno, že kóduje protein o předpokládané MW 308 kD. [Dove a d., Infect. Immun., 58:480-488 (1990).] Vzhledem k nákladnosti a obtížnosti izolace nativního proteinu toxinu A by bylo výhodné používat jednoduché a nenákladné prokaryotické expresní systémy pro produkci a čištění vysokých hladin rekombinačního proteinu toxinu A pro účely

imunizace. Ideálně by byl izolovaný rekombinační protein rozpustný, aby si uchoval nativní antigenitu, protože solubilizované proteiny inkluzních tělísek se často neskládají do nativních konformací. K usnadnění čištění by měl být rekombinační protein exprimován v hladinách vyšších než 1 mg/l kultury E. coli.

Za účelem stanovení, zda je možno v E. coli produkovat vysoké hladiny rekombinačního protein toxinu A, byly fragmenty genu toxinu A klonovány do různých prokaryotických expresních vektorů a zjišťována jejich schopnost exprimovat rekombinační protein toxinu A v E. coli. Byly použity tři prokaryotické expresní systémy. Tyto systémy byly zvoleny proto, že způsobovaly expresi bud fúzního (pMALc a pGEX2T) nebo nativního (pET23a-c) proteinu v E. coli do vysokých hladin a umožňovaly afinitní čištění exprimovaného proteinu na koloně obsahující ligandy. Fúzní proteiny exprimované z vektorů pGEX vážou glutathionové agarózové perličky a jsou eluovány redukovaným glutathionem. Fúzní proteiny pMAL vážou amylózovou pryskyřici a jsou eluovány maltózou. Buď na N-terminálním (pET16b) nebo na Cterminálním (pET23a-c) konci fúzních proteinů pET je přítomna polyhistidinová značka. Tato sekvence specificky váže chelátové kolony Ni₂' a je eluována imidazolovými solemi. Podrobný popis těchto vektorů je k dispozici (Williams a d. (1994), DNA Cloning: Expression Systems, v tisku) a zde není podrobně rozebírán. Příklad zahrnoval (a) klonování genu toxinu A, (b) expresi velkých fragmentů toxinu A v různých prokaryotických expresních systémech, (c) identifikaci menších fragmentů genu toxinu A, které účinně exprimují v E. coli, (d) čištění rekombinačního proteinu toxinu A afinitní chromatografii a (e) demonstraci funkční aktivity rekombinačního fragmentu genu toxinu A.

a) Klonování genu toxinu A

Restrikční mapa genu toxinu A je znázorněna na obr. 6. Kódovaný protein obsahuje karboxyterminální vazebnou oblast ligandu, obsahující násobné repetice vazebné oblasti uhlohydrátů. [von Eichel-Streiber a Sauerborn, Gene 96:107-113 (1990).] Gen toxinu A byl klonován ve třech kusech s použitím buď polymerasové reakce (PCR) kamplifikaci specifických oblastí (oblasti 1 a 2 na obr. 6) nebo • · • · • · » 4 » « • · screeningem konstruované genomové knihovny pro specifický fragment genu toxinu A (oblast 3 na obr. 6). Sekvence použitých primerů PCR:

P1: 5’ GGAAATT TAGCTGCAGCATCTGAC 3’ (SEQ ID NO:1)

P2: 5’ TCTAGCAAATTCGCTTGT GTTGAA 3’ (SEQ ID NO:2)

P3: 5’ CTCGCATATAGCATTAGACC 3’ (SEQ ID NO:3) a

P4: 5’ CTATCTAGGCCTAAAGTAT 3’ (SEQ ID NO:4).

Tyto oblasti byly klonovány do prokaryotických expresních vektorů, které exprimují v E. coli ve vysokých hladinách buď fúzní (pMALc a pGEX2T) nebo nativní (pET23ac) protein a umožňují afinitní čištění exprimovaného proteinu na koloně obsahující ligandy.

Kmen 10463 Clóstridium difficile VPI byl získán z ATCC (ATCC č. 43255) a kultivován za anaerobních podmínek v mozkovém a srdcovém nálevu (BBL). Vysokomolekulární DNA. C. difficile byla získána v podstatě způsobem popsaným vWren a Tabaqchali (1987), J. Clin. Microbiol., 25:2402, avšak k rozrušení bakterií byla použita proteinasa K a dodecylsulfát sodný (SDS) a k odstranění uhlohydrátů z vyčeřeného lyzátu bylo použito srážení pomocí cetyltrimethylamoniumbromidu [jak uvádí Ausubel a d., Current Protocols in Molecular Biology (1989)]. Integrita a výtěžek genomové DNA byl hodnocen porovnáním se sériovým ředěním nedělené DNA lambda po elektroforéze na agarózovém gelu.

Fragmenty 1 a 2 byly klonovány pomocí PCR s použitím korekční termostabilní DNA polymerasy (nativní polymerasa pfu’, Stratagene). Vysoká věrnost této polymerasy snižuje mutační problémy spojené s amplifikaci pomocí polymeras náchylných k chybám (například polymerasy Taq). Amplifikace PCR byla prováděna s použitím uvedených primerů PCR (obr. 6) v reakčních směsích po 50 μΙ, obsahujících 10 mM Tris-HCI (8,3), 50 mM KCI, 1,5 mM MgCI₂, vždy 200 μΜ dNTP, vždy 0,2 μΜ primerů a 50 ng genomové DNA C. difficile. Reakční směsi byly překryty 100 μΙ minerálního oleje, zahřívány 4 min na 94 °C a po přidání 0,5 μΙ nativní polymerasy pfu (Stratagene) podrobeny 30 cyklům 1 min při 94 °C, 1 min při 50 °C a 4 min při 72 °C, po nichž následovalo 10 min při 72 °C. Duplicitní reakční směsi byly spojeny, extrahovány chloroformem a vysráženy ethanolem. Po promytí v 70% ethanolu byly pelety resuspendovány v 50 μΙ pufru TE [10 mM Tris-HCI, 1 mM EDTA, pH 8,0], Alikvoty po 10 μΙ byly restrikčně štěpeny pomocí buď EcoR\/Hinc\\ (fragment 1) nebo EcóR\(Pst\ (fragment 2) a příslušné restrikční fragmenty byly gelově čištěny s použitím soupravy Prep-A-Gene (BioRad) a ligovány buď s vektorem pGEX2T (Pharmacia), restringovaným EcoR\/Sma\ (fragment 1) nebo s vektorem EcoRVPstl pMAlc (New England Biolabs) (fragment 2). Předpokládá se, že oba klony produkují v rámci fúze buď s proteinem glutathion-S-transferasou (vektor pGEX) nebo s maltózu vázajícím proteinem (vektor pMAL). Rekombinační klony byly izolovány a potvrzeny restrikčním štěpením pomocí standardních rekombinačních metod molekulární biologie [Sambrook a d., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989)] a označeny pGA30-660, resp. pMA660-1100 (označení klonů viz obr. 6).

Fragment 3 byl klonován z genomové knihovny zvolených velikostí genomové DNA C. difficile, štěpené pomocí Pst\, s použitím standardních metod molekulární biologie (Sambrook a d.). Vzhledem k tomu, že v genomové DNA C. difficile je vnitřní místo Psřl fragmentu 3 chráněno před štěpením [Pice a d., Curr. Microbiol., 16:55-60 (1987)], byl gelově vyčištěn fragment o velikosti 4,7 kb z genomové DNA C. difficile, restringované Pst\, a ligován s DNA pUC9, restringovanou Pst\ a ošetřenou fosfatasou. Získaná genomová knihovna byla podrobena screeningu oligonukleotidovým primerem specifickým pro fragment 3 a bylo izolováno více nezávislých klonů. Přítomnost fragmentu 3 v několika těchto klonech byla potvrzena restrikčním štěpením a klon s uvedenou orientací (obr. 6) byl restringován pomocí BamHl/HindU], uvolněný fragment byl přečištěn gelovou elektroforézou a ligován s podobně restringovanou DNA expresního vektoru pET23c (Novagen). Rekombinační klony byly izolovány a potvrzeny restrikčním štěpením. U tohoto konstruktu se předpokládá, že vytváří jak předpokládanou fúzi v rámci s vedoucí sekvencí proteinu pET, tak s předpokládanou C-terminální polyhistidinovou afinitní značkou, a je označen pPA1100-2680 (označení klonů viz obr. 6).

b) Exprese velkých fragmentů toxinu A v £ coli

Byla vyvolána exprese proteinů ze tří expresních konstruktů, vyrobených podle odstavce (a), a byla provedena analýza Western blot s afinitně čištěným kozím polyklonálním antisérem, zaměřeným proti toxoidu toxinu A (Tech Lab). Postupy použité pro indukci proteinu, SDS-PAGE a analýzu Western blot jsou podrobně popsány v Williams a d. (1994). Stručně řečeno, bylo 5 ml 2X YT (16 g tryptonu, 10 g kvasničného extraktu, 5 g NaCl na litr, pH 7,5) + 100 pg/ml ampicilinu přidáno ke kulturám bakterií (BL21 pro plasmidy pMAl a pGEX a BL21(DE3)LysS pro plasmidy pET), obsahující příslušný rekombinační klon, ve kterých byla indukovány exprese rekombinačního proteinu přídavkem IPGT k 1 mM. Kultury byly kultivovány při 37 °C a indukovány po dosažení hustoty buněk 0,5 OD₆₀₀. Indukovaný protein byl ponechán akumulovat se dvě hodiny po indukci. Vzorky proteinu byly připraveny peletizací 1 ml alikvotů bakterií odstředěním (1 min v mikrofuze) a resuspendováním peletovaných bakterií ve 150 μΙ vzorkového pufru 2x SDS-PAGE [Williams a d. (1994)]. Vzorky byly zahřívány 5 min na 95 °C a ochlazené alikvoty po 5 nebo 10 μΙ byly naneseny na 7,5% SDS-PAGE gely. Byly naneseny rovněž vysokomolekulární markéry BioRad, aby bylo možno odhadovat molekulovou hmotnost identifikovaných fúzních proteinů. Po elektroforéze byl protein detekován bud obecně barvením gelů pomocí Coomassieovy modři nebo specificky Westernovým blotem na nitrocelulózu pro detekci specifického imunoreaktivního proteinu. Westernový bloty (prováděné, jak uvedeno v příkladu 3), které detekují protein reaktivní s toxinem A v buněčných lyzátech indukovaného proteinu z těchto tří expresních konstruktů, jsou znázorněny na obr. 7. Na tomto obrázku obsahují pruhy 1 až 3 buněčné lyzáty připravené z kmenů E. coli, obsahujících pPA1100-2860 v buňkách BL21(DE3)lysE; pruhy 4 až 6 obsahují buněčné lyzáty připravené z kmenů E. coli obsahujících pPA1100-2860 v buňkách BL21(DE3)lysS; pruhy 7 až 9 obsahují buněčné lyzáty připravené z kmenů E. coli obsahujících pMA660-1100. Pruhy byly sondovány s afinitně čištěnou kozí polyklonální protilátkou proti antitoxinu A (Tech Lab). Kontrolní lyzáty z neindukovaných buněk (pruhy 1, 7 a 10) obsahují velmi málo imunoreaktivního materiálu v porovnání s indukovanými vzorky ve zbylých pruzích. Pás s největší molekulovou hmotností, pozorovaný pro každý klon, je konzistentní s předpovídanou plnou délkou fůzního proteinu.

Každý konstrukt řídí expresi vysokomolekulárního (HMW) proteinu, který je reaktivní s protilátkou toxinu A. Velikost největších imunoreaktivních pásů z každého vzorku je konzistentní s odhady MW intaktních fúzních proteinů. Z toho vyplývá, že tyto tři fúzní proteiny jsou v rámci a žádný z klonů neobsahuje klonující artefakty,

které porušují integritu kódovaného fúzního proteinu. Western blot však demonstruje, že fúzní protein ze dvou větších konstruktů (pGA30-660 a pPA1100-2860) je vysoce degradován. Hladina exprese proteinů toxinu A z těchto dvou konstruktů je také nízká, protože pásy indukovaného proteinu nejsou při barvení Coomassie viditelné (neznázorněno). Bylo konstruováno několik dalších expresních konstruktů, které fúzují velké podoblasti genu toxinu A buď s expresním vektorem pMALc nebo pET23a-c, a testováno na indukci proteinů§. Tyto konstrukty byly vyrobeny smísením gelové čištěných restrikčních fragmentů, odvozených od expresních konstruktů znázorněných na obr. 6, s příslušně štěpenými expresními vektory, ligací a selekcí rekombinačních klonů, v nichž restrikční fragmenty toxinu A ligovaly spolu a do expresního vektoru, jak se předpokládá pro fúze v rámci. Exprimovaný interval toxinu A v těchto konstruktech je znázorněn na obr. 8, stejně jako interní restrikční místa, použitá k výrobě těchto konstruktů.

Zde používaný výraz „interval“ se vztahuje na jakoukoli část (tj. kterýkoli segment toxinu, který je menší než celá molekula toxinu) klostridiálního toxinu. Ve výhodném provedení se „interval“ vztahuje na části toxinů C. difficile, jako je toxin A nebo toxin B. Předpokládá se rovněž, že tyto intervaly odpovídají epitopům s imunologickým významem, jako jsou antigeny nebo imunogeny, proti nimž se uskutečňuje odpověď neutralizující protilátky. Tento vynález se v žádném případě neomezuje na konkrétní intervaly nebo sekvence, popisované v těchto příkladech. Předpokládá se rovněž, že pro přípravky a způsoby podle vynálezu se budou používat podčásti intervalů (například epitop obsažený v jednom intervalu nebo přemosťující více intervalů).

Ve všech případech byl Westernovou analýzou každého z těchto konstruktů s kozí protilátkou antitoxinu A (Tech Lab) detekován vysokomolekulární fúzní protein o předpokládané velikosti (neznázorněn). To potvrzuje, že čtecí rámec každého z těchto klonů není předčasně ukončen a dochází k fúzi ve správném rámci s fúzním partnerem. Westernová analýza však odhalila, že ve všech případech je indukovaný protein vysoce degradován a jak vyplývá z absence identifikovatelných pásů indukovaného proteinu při barvení pomocí Coomassieovy modři, je exprimován pouze v nízké hladině. Z těchto výsledků vyplývá, že exprese vysoké hladiny • ·

rekombinačního proteinu intaktního toxinu A není možná, jsou-li pomocí těchto expresních vektorů exprimovány v E. coli velké oblasti genu toxinu A.

c) Vysoká hladina exprese malých fúzních proteinů toxinu A v E. coli

Zkušenost ukazuje, že obtíže při expresi se většinou vyskytují v případě exprese velkých (větších než 100 kD) fragmentů v E. coli. Byl konstruován určitý počet expresních konstruktů obsahujících menší fragmenty genu toxinu A za účelem zjištění, zda je možno ve vysoké hladině exprimovat malé oblasti genu bez rozsáhlé degradace proteinu. Souhrn těchto expresních konstruktů je znázorněn na obr. 9. Všechny byly konstruovány fúzemi v rámci vyhovujících restrikčních fragmentů toxinu A buď s vektorem pMALc nebo pET23a-c. Proteinové preparáty z indukovaných kultur každého z těchto konstruktů byly analyzovány jak barvením Coomassieovou modří, tak Westernovou analýzou jako v odstavci (b). Ve všech případech byla pozorována vyšší hladina intaktního fúzního proteinu o plné délce než s většími rekombinanty z odstavce (b).

d) Čištění rekombinačního proteinu toxinu A

Ve větším měřítku (500 ml) byly kultivovány kultury každého rekombinantu z odstavce (c), indukovány a byla izolována rozpustná a nerozpustná proteinová frakce. Z rozpustných proteinových extraktů byl afinitní chromatografii popsaným způsobem [Williams a d. (1994)] izolován rekombinační fúzní protein. Stručně řečeno byly extrakty obsahující značené fúze pET naneseny na niklchelátový sloupec a eluovány pomocí imidazolových solí podle údajů distributora (Novagen). Byly připraveny extrakty obsahující rozpustný fúzní protein pMAL a chromatografovány v chromatografickém pufru (10 mM NaPO₄, 0,5 M NaCl, 10 mM β-merkaptoethanol, pH 7,2) na sloupci amylózové pryskyřice (New England Biolabs) s elucí chromatografickým pufrem obsahujícím 10 mM maltózy [Williams a d. (1994)]. Bylo-li zjištěno, že exprimovaný protein je převážně nerozpustný, byly extrakty nerozpustného proteinu připraveny způsobem popsaným výše v příkladu 17. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 17. Obr. 10 ukazuje čištění vzorků rekombinačního

proteinu toxinů A. Pruhy 1 a 2 na tomto obrázku obsahují MBP fúzní protein čištěný afinitním čištěním rozpustného proteinu.

Tabulka 16. Čištění rekombinačního proteinu toxinů A

klon(a)	rozpustnost proteinu	výtěžek afinitně čištěného rozpustného proteinu(b)	% intaktního rozpustného fúzního proteinu(c)	výtěžek intaktního nerozpustného fúzního proteinu
PMA30-270	rozpustný	4 mg/500 ml	10%	NA
PMA30-300	rozpustný	4 mg/500 ml	5 až 10%	NA
pMA300-600	nerozpustný	—	NA	10 mg/500 ml
pMA660-1100	rozpustný	4,5 mg/500 ml	50%	NA
pMA1100-1610	rozpustný	18 mg/500ml	10%	NA
PMA1610-1870	obojí	22 mg/500ml	90%	20 mg/500 ml
pMA1450-1870	nerozpustný	—	NA	0,2 mg/500 ml
pPA1100-1450	rozpustný	0,1 mg/500 ml	90%	NA
pPA1100-1870	rozpustný	0,02 mg/500 ml	90%	NA
pMA1870-2680	obojí	12 mg/500 ml	80%	NA
pPA1870-2680	nerozpustný	—	NA	10 mg/500 ml

(a) pP = vektor pET23, pM = vektor pMALc, A = toxin A (b) vztaženo na 1,5 OD₂₈₀ = 1 mg/ml (extinkční koeficient MBP) (c) odhadnuto z barvení gelů SDS-PAGE pomocí Coomassie

Pruhy 3 a 4 obsahují fúzní protein MBP čištěný solubilizací nerozpustných inkluzních tělísek. Vzorky čištěného fúzního proteinu jsou pMA1870-2680 (pruh 1), pMA660-1100 (pruh 2), pMA300-600 (pruh 3) a pMA1450-1870 (pruh 4).

Špatných výtěžků afinitně čištěného proteinu bylo dosaženo, když byly pro expresi použity vektory pET, značené polyhistidinovým úsekem (pPA110-1450, pPA1100-1870). Významných výtěžků proteinu však bylo dosaženo z expresních konstruktů pMAL, zahrnujících celý gen toxinů A, přičemž výtěžky plné délky rozpustného fúzního proteinu činily od odhadovaných 200 až 400 pg/500 ml kultury (pMA30-300) do více než 20 mg/500 ml kultury (pMA1610-1870). Pouze jeden » · ·· • · · · · • · · ·· ·· interval byl exprimován ve vysokých hladinách jako striktně nerozpustný protein (pMA300-600). I když tedy nebyl pozorovány vysoká úroveň exprese při použití velkých expresních konstruktů z genu toxinu A, bylo možno dosáhnout použitelných hladin rekombinačního proteinu zahrnujícího gen celého toxinu A izolací indukovaného proteinu ze řady menších expresních konstruktů pMAL, které zahrnují gen celého toxinu A. Jedná se o první demonstraci proveditelnosti exprese rekombinačního proteinu toxinu A v E coli ve vysoké hladině.

e) Test hemaglutinace s použitím rekombinačních proteinů toxinu A

Karboxyterminální konec, tvořený opakujícími se jednotkami, obsahuje hemaglutinační aktivitu vazebné domény toxinu A C. difficile. Za účelem stanovení, zda si exprimované rekombinanty toxinu A podržují funkční aktivitu, byly provedeny testy hemaglutinace. Dva rekombinační proteiny toxinu A, jeden obsahující vazebnou doménu buď jako rozpustný afinitně čištěný protein (pMA1870-2680) nebo SDS solubilizovaný protein inkluzních tělísek (pPA1870-2680), a rozpustný protein z jedné oblasti mimo tuto doménu (pMA1100-1610) byly testovány popsaným postupem. [H.C. Krivan a d., Infect. Immun. 53:573 (1986).] Citrátované králičí červené krvinky (RRBC) (Cocaiico) byly několikrát promyty Tris pufrem (0,1 M Tris a 50 mM NaCl) s odstředěním při 450 g po dobu 10 min při 4 °C. Z balených buněk byla vytvořena 1% suspenze RRBC a resuspendována v Tris pufru. V Tris pufru byla vytvořena ředění rekombinačních proteinů a nativního toxinu A (Tech Labs) a ve dvou exemplářích přidána do 96jamkové mikrotitrační desky s kulatým dnem v konečném objemu 100 μΙ. Do každé jamky bylo přidáno 50 μΙ 1% suspenze RRBC, promícháno jemným poklepem a byla provedena inkubace po dobu 3 až 4 h při 4 °C. K významné hemaglutinaci došlo pouze u rekombinačních proteinů obsahujících vazebnou doménu (pMA1870-2680) a nativní toxin A. Rekombinační protein vně vazebné oblasti (pMA1100-1610) hemaglutinační aktivitu nevykazoval. S použitím ekvivalentních koncentrací proteinu byl hemaglutinační titr pro toxin A 1:256, zatímco titr pro rozpustné a nerozpustné rekombinační proteiny vazebné oblasti byl 1:256 a asi 1:5000. Testované rekombinační protein si zřetelně ponechávaly funkční aktivitu a byly schopny vázat RRBC.

Příklad 12

Funkční aktivita IgY reaktivního vůči rekombinantům toxinu A

Exprese rekombinačního proteinu toxinu A jako několikanásobných fragmentů v E. coli prokázala možnost tvorby antigenu toxinu A s použitím metodiky rekombinace (příklad 11). Izolace těchto rekombinačních proteinů umožňuje stanovit imunoreaktivitu každé jednotlivé podoblasti proteinu toxinu A (tj. v souboru protilátek zaměřených proti proteinu nativního toxinu A). Tak jsou identifikovány oblasti (pokud existují), v nichž je vyvolána malá nebo žádná protilátková odezva, použije-li se jako imunogen úplný protein. Protilátky zaměřené proti specifickým fragmentům proteinu toxinu A lze čistit afinitní chromatografii proti rekombinačnímu proteinu toxinu A a testovat na schopnost neutralizace. Tak je možno identifikovat veškeré podoblasti toxinu A, které jsou nezbytné pro produkci neutralizujících protilátek, porovnáním s hladinami imunitní odpovědi zaměřené proti těmto intervalům při použití nativního toxinu jako imunogenu je možno předpovídat, zdaje možno použitím rekombinačního proteinu zaměřeného proti jednotlivé oblasti místo proti úplnému proteinu produkovat potenciálně vyšší titry neutralizujících protilátek. Konečně protože není známo, zda protilátky reaktivní vůči rekombinačním proteinům toxinu A, produkovaným v příkladu 11, neutralizují toxin A stejně účinně jako protilátky vytvořené proti nativnímu toxinu A (příklady 9 a 10), byla testována ochranná schopnost souboru protilátek, afinitně čištěných proti rekombinačním fragmentům toxinu A, hodnocena z hlediska schopnosti neutralizovat toxin A.

Tento příklad zahrnoval (a) epitopové mapování proteinu toxinu A za účelem zjištění titru specifických protilátek zaměřených proti jednotlivým podoblastem proteinu toxinu A, je-li jako imunogen použit protein nativního toxinu A, (b) afinitní čištění IgY reaktivního vůči rekombinačním proteinům, pokrývajícím gen toxinu A, (c) testy neutralizace toxinu A s afinitně čištěným IgY reaktivním vůči rekombinačnímu proteinu toxinu A za účelem identifikace podoblastí proteinu toxinu A, které vyvolávají produkci neutralizujících protilátek, a stanovení, zda je možno směsí protilátek reaktivních vůči rekombinačnímu proteinu toxinu A vyvolat kompletní neutralizaci toxinu A.

a) Epitopové mapování genu toxinu A

Afinitní čištění rekombinačního proteinu toxinu A, specifického pro definované intervaly proteinu toxinu A, umožňuje epitopové mapování souborů protilátek, zaměřených proti nativnímu toxinu A. To dosud nebylo možné, protože dřívější exprese rekombinantů toxinu A byla hodnocena pouze Westernovou analýzou bez znalosti hladiny exprese proteinu [například von Eichel-Streiber a d., J. Gen. Microbiol. 135:55-64 (1989)]. Vysoká nebo nízká reaktivita rekombinačního proteinu toxinu A na Westernových biotech může tedy odrážet rozdíly v expresi proteinu, ale nikoli rozdíly v imunoreaktivitě. Kvantifikováním čištěného rekombinačního proteinu, vytvořeného v příkladu 11, tak byl vyřešen přesně problém imunoreaktivity jednotlivých oblastí proteinu toxinu A.

Pro účely tohoto příkladu byl protein toxinu A rozdělen na šest intervalů (1 až 6), číslovaných od aminoterminálního konce (interval 1) ke karboxyterminálnímu konci (interval 6).

Rekombinační proteiny, odpovídající těmto intervalům, byly z expresních klonů (označení klonů viz příklad 11(d)) pMA30-300 (interval 1), pMA300-660 (interval 2), pMA660-1100 (interval 3), pPA1100-1450 (interval 4), pMA1450-1870 (interval 5) a pMA1870-2680 (interval 6). Těchto 6 klonů bylo zvoleno, protože pokrývají celý protein od aminokyseliny s číslem 30 do aminokyseliny s číslem 2680, a dělí tak protein na 6 malých intervalů. V jednom intervalu (interval 6) je také specificky obsažena karbohydrátová vazebná repetice, což umožňuje hodnocení imunitní odpovědi specificky zaměřené vůči této oblasti. Westernový bloty gelů 7,5 % SDSPAGE s nánosem a elektroforézou s definovaným množstvím každého rekombinačního proteinu, byly sondovány buď s polyklonální protilátkou kozího antitoxinu A (Tech Lab) nebo s polyklonální protilátkou kuřecího antitoxinu A [IgY pCTA, příklad 8 (c)j. Bloty byly připraveny a vyvíjeny dříve popsaným postupem s alkalickou fosfatasou [Williams a d. (1994) viz výše]. Bylo zjištěno, že alespoň 90 % veškeré reaktivity jak v souborech kozích, tak kuřecích protilátek bylo zaměřeno proti vazebné doméně ligandu (interval 6). Zbylá imunoreaktivita byla zaměřena proti všem pěti zbývajícím intervalům a byla v souborech obou protilátek podobná s tím • · • · rozdílem, že kuřecí protilátka vykazovala mnohem nižší reaktivitu proti intervalu 2 než kozí protilátka.

Tím je jasně demonstrována skutečnost, že použije-li se jako imunogen u koz nebo kuřat nativní toxin A, je převážná část imunitní odpovědi zaměřena v proteinu proti vazebné oblasti ligandu a zbylá odpověď je rozdělena po celých zbylých 2/3 proteinu.

b) Afinitní čištění IgY reaktivního vůči rekombinačnímu proteinu toxinů A

Byly připraveny afinitní kolony, obsahující rekombinačni protein toxinů A ze 6 intervalů, definovaných v odstavci (a), a použity k (i) afinitnímu čištění protilátek reaktivních vůči každému jednotlivému intervalu z preparátu IgY CTA [příklad 8(c)j a (ii) zbavení preparátu IgY CTA intervalově specifických protilátek. Afinitní kolony byly připraveny navázáním 1 ml pryskyřice Actigel (Sterogene), promyté PBS, na oblastně specifický protein s použitím 1/10 konečného objemu kondenzačního roztoku Aid (1 M kyanborohydrid sodný). Celkové množství oblastně specifického proteinu, přidané ke každé reakční směsi, bylo 2,7 mg (interval 1), 3 mg (intervaly 2 a 3), 0,1 mg (interval 4), 0,2 mg (interval 5) a 4 mg (interval 6). Proteiny pro intervaly 1,3 a 6 tvořil afinitně čištěný fúzní protein pMAL vafinitním pufru (viz přiklad 11). Interval 4 byl afinitně čištěný fúzní protein obsahující polyhistidinový úsek v PBS, intervaly 2 a 5 byly z preparátů inkluzních tělísek nerozpustného fúzního proteinu pMAL, intenzivně dialyzovaných v PBS. Alikvoty supernatantů z kondenzačních reakcí před a po kondenzaci byly hodnoceny pomocí barvení Coomassie na gelech 7,5 % SDSPAGE. Na základě intenzit proteinových pásů byla ve všech případech odhadnuta vyšší účinnost kondenzace než 50 %. Pryskyřice byly nality do 5ml kolon BioRad, intenzivně promyty PBS a skladovány při 4 °C.

Pro každou jednotlivou oblast byly dále uvedeným způsobem alikvoty preparátu polyklonální protilátky IgY CTA zbaveny protilátky. Vzorek 20 ml preparátu IgY CTA [příklad 8(c)j byl intenzivně dialyzován proti 3 dávkám PBS (1 litr na každou dialýzu), kvantifikován pomocí absorbance při OD₂₈₀ a skladován při 4 °C. Z dialyzovaného preparátu IgY bylo odebráno šest alikvotů po 1 ml a zbavováno protilátky jednotlivě pro každý ze šesti intervalů. Každý 1ml alikvot procházel

100

příslušnou afinitní kolonu a dvakrát byl na kolonu nanesen eluát. Eluát byl shromážděn a spojen s promytím 1 ml PBS. Navázaná protilátka byla z kolony eluována promytím 5násobkem objemu kolony 4 M guanidin-HCI (v 10 mM Tris-HCI, pH 8,0). Kolona byla reekvilibrována v PBS a opět byl nanesen zásobní roztok zbavený protilátky. Eluát byl shromážděn, spojen s promytím 1 ml PBS, kvantifikován absorbancí při OD₂₈₀ a skladován při 4 °C. Tímto způsobem bylo dvěma cykly afinitního čištění pro každý ze šesti intervalů toxinu A jednotlivě zbaveno protilátky 6 alikvotů preparátu IgY CTA. Specifita každého získaného zásobního roztoku byla testována Westernovým přenosem. Vzorky proteinů, odpovídající všem 6 podoblastem toxinu A, byly naneseny na duplicitní gely 7,5 % SDS-PAGE. Po elektroforéze byl proveden blotting gelů a přenos proteinů byl potvrzen barvením pomocí Ponceau S [postup popisuje Williams a d. (1994), viz výše]. Po 1 h blokování blotů při 20 °C v PBS + 0,1 % Tween 20 (PBST) s obsahem 5 % mléka (jako blokujícím pufru) bylo přidáno buď 4 ml dialyzovaného preparátu IgY CTA ve zředění 1/500 v blokujícím pufru nebo ekvivalentní množství šesti zásobních roztoků, zbavených protilátek (s použitím OD₂₈₀ pro standardizaci koncentrace protilátky) a bloty byly další 1 h inkubovány při teplotě místnosti. Bloty byly promyty a vyvíjeny alkalickou fosfatasou (s použitím konjugátu králičí anti-kuřecí alkalické fosfatasy jako sekundární protilátky, jak dříve popsáno [Williams a d. (1994), viz výše]. Ve všech případech byl reaktivity protilátky zbaven pouze cílový interval a bylo specificky odstraněno alespoň 90 % reaktivity cílových intervalů.

Soubory oblastně specifických protilátek byly izolovány afinitní chromatografii dále popsaným způsobem. Na každou afinitní kolonu bylo postupně naneseno 10 ml dialyzovaného preparátu IgY CTA tak, že k izolaci oblastně specifických protilátek, specifických pro každou ze šesti podoblastí, byl použit jediný alikvot 10 ml. Kolony byly postupně promyty 10 objemy PBS, 6 objemy BBS-Tween, 10 objemy TBS a eluovány 4 ml elučního media Actisep (Sterogene). Eluát byl intenzivně dialyzován proti několika dávkám PBS a získaná afinitně čištěná protilátka byla skladována při 4 °C. Během dialýzy vzrostl v každém případě objem eluátu na více než 10ml v důsledku vysoké viskozity elučního media Actisep. Alikvoty každého vzorku byly pomocí mikrokoncentračního zařízení Centricon 30 (Amicon) 20x zkoncentrovány a skladovány při 4 °C. Specifita každého oblastně specifických protilátek byla testována

101

oproti dialyzovanému preparátu IgY CTA Westernovou analýzou přesně stejným postupem jako výše s tou výjimkou, že místo preparátů IgY CTA, zbavených protilátky, byly použity vzorky po 4 ml blokujícího pufru, obsahujícího 100 μΙ oblastně specifické protilátky (nezkoncentrované). Každý preparát afinitně čištěné protilátky byl specifický pro definovaný interval stou výjimkou, že vzorky čištěné proti intervalům 1 až 5 reagovaly i s intervalem 6. To může být důsledkem nespecifické vazby na protein intervalu 6, protože tento protein obsahuje repetitivní vazebnou doménu ligandu, o níž bylo uvedeno, že váže protilátky nespecificky. [Lyerly a d., Curr. Microbiol. 19:303-306 (1989).]

Reaktivita každého preparátu afinitně čištěné protilátky vůči odpovídajícím proteinům byla přibližně stejná jako reaktivita standardního dialyzovaného preparátu IgY CTA ve zředění 1/500. Jestliže zásobní roztoky specifické protilátky měly ředění 1/40, ukazuje to, že nezkoncentrované zásobní roztoky afinitně čištěné protilátky obsahují 1/10 až 1/20 koncentrace specifických protilátek oproti výchozímu preparátu IgY CTA.

c) Test neutralizace toxinu A s použitím protilátek reaktivních vůči rekombinačnímu proteinu toxinu A

K hodnocení schopnosti ochuzených nebo obohacených vzorků, připravených podle odstavce (b), neutralizovat cytotoxicitu toxinu A byl použit test neutralizace toxinu CHO [příklad 8(d)]. Obecná schopnost afinitně čištěných protilátek neutralizovat toxin A byla hodnocena tak, že byly navzájem smíseny alikvoty všech 6 koncentrovaných zásobních roztoků afinitně čištěných vzorků, vytvořených podle odstavce (b) a byla testována schopnost neutralizovat toxin A v koncentraci 0,1 gg/ml. Výsledky, znázorněné na obr. 11, prokazují téměř kompletní neutralizaci toxinu A pomocí afinitně čištěné (AP) směsi. Některé epitopy uvnitř rekombinačních proteinů, použitých pro afinitní čištění, se pravděpodobně ztratily při denaturaci proteinů před afinitním čištěním [působením guanidin-HCI podle odstavce (b)]. Neutralizační schopnost protilátek zaměřených proti rekombinačnímu proteinu je tedy při použití těchto afinitně čištěných souborů protilátek pravděpodobně podhodnocena. Tento experiment prokazuje, že protilátky reaktivní s rekombinačním

I

102

toxinem A mohou neutralizovat cytotoxicitu, z čehož by vyplývalo, že je možno získat neutralizující protilátky s použitím proteinu toxinu A jako imunogenu.

Na základě zjištění, že rekombinační expresní klony genu toxinu A dělí protein na 6 podoblastí, je možno hodnotit neutralizační schopnost protilátek zaměřených proti každé jednotlivé oblasti. Nejprve byla zjišťována neutralizační schopnost protilátek zaměřených proti vazebné doméně ligandů toxinu A.

V experimentu neutralizace toxinu, znázorněném na obr. 11, byly z dialyzovaného preparátu PEG odstraněny protilátky specifické pro interval 6 (interval 6 obsahuje vazebnou doménu ligandů) a byl hodnocen účinek na neutralizaci toxinu. Preparát byl zbaven protilátek buď použitím preparátu IgY CTA pro interval 6, zbaveného protilátek, připraveného podle odstavce (b) (na obr. 11 „-6 aff. depleted“), nebo přidáním proteinu intervalu 6 k preparátu IgY CTA (odhadováno jako 10násobný molární přebytek vůči anti-interval 6 imunoglobulinu přítomnému v tomto preparátu), aby došlo ke kompetitivní soutěži o protein intervalu 6 (na obr. 11 „-6 prot depleted“). V obou případech snižuje odstranění specifických protilátek pro interval 6 neutralizační účinnost oproti výchozímu preparátu IgY CTA. Tím je demonstrováno, že protilátky zaměřené proti intervalu 6 přispívají k neutralizaci toxinu. Protože interval 6 odpovídá vazebné doméně ligandů v proteinu, demonstrují tyto výsledky, že protilátky zaměřené proti této oblasti v preparátu PEG přispívají k neutralizaci toxinu A v tomto testu. Je však signifikantní, že po odstranění těchto protilátek si preparát PEG ponechává významnou schopnost neutralizovat toxin A (obr. 11). Tato neutralizace je pravděpodobně důsledkem působení protilátek specifických k ostatním oblastem proteinu toxinu A, protože v ochuzeném vzorku, připraveném podle odstavce (b), bylo odstraněno alespoň 90 % protilátek, reaktivních s vazebnou oblastí ligandů. Tento závěr podporuje porovnání neutralizace toxinu afinitně čištěnou (AP) směsí oproti afinitně čištěné protilátce intervalu 6 samotné. Přestože byla pozorována určitá neutralizační schopnost u samotných AP protilátek intervalu 6, byla tato neutralizace významně nižší než v případě směsi všech AP zásobních roztoků protilátek (neznázorněno).

Vzhledem k tomu, že směs všech šesti afinitně čištěných vzorků neutralizovala cytotoxicitu toxinu A téměř úplně (obr. 11), byl stanoven relativní význam protilátek

103

zaměřených proti intervalům 1 až 5 toxinů A ve směsi. Bylo to prováděno dvěma způsoby. Nejprve byly připraveny vzorky obsahující afinitně čištěné protilátky, reprezentující 5 ze 6 intervalů tak, že každý vzorek byl zbaven jedné oblasti. Obr. 12 znázorňuje neutralizační křivku vzorků, porovnávající neutralizační schopnost afinitně čištěných směsí protilátek bez protilátek specifických pro interval 4 (-4) nebo 5 (-5) vzhledem ke směsi všech 6 zásobních roztoků afinitně čištěných protilátek (pozitivní kontrola). Zatímco odstranění protilátek specifických pro interval 5 (nebo intervaly 1 až 3, neznázorněno) nemělo na neutralizaci toxinů žádný vliv, ztráta protilátek specifických pro interval 4 neutralizaci toxinů významně snížila (obr. 12).

Podobné výsledky byly pozorovány ve druhém experimentu, ve kterém byly k protilátkám specifickým pro interval 6 přidány afinitně čištěné protilátky, zaměřené proti jediné oblasti, a byly zkoumány účinky na neutralizaci toxinů. Pouze protilátky specifické pro interval 4 zvyšovaly výrazně neutralizaci, byly-li přidány k protilátkám specifickým pro interval 6 (obr. 13). Tyto výsledky demonstrují, že protilátky zaměřené proti intervalu 4 (odpovídající klonu pPA1100-1450 na obr. 9) jsou v tomto testu významné pro neutralizaci cytotoxicity. Epitopové mapování ukázalo, že vzniká pouze nízká hladina protilátek reaktivních s touto oblastí, použije-li se jako imunogen nativní toxin A [příklad 12(a)]. To vyvolává hypotézu, že imunizace rekombinačním proteinem, specifickým pro tento interval, vyvolá vyšší titr neutralizujících protilátek. Souhrnně lze říci, že tato analýza pomocí neutralizace CHO identifikovala v proteinu toxinů A dvě kritické oblasti, proti nimž jsou produkovány neutralizující protilátky.

Příklad 13

Produkce a hodnocení ptačího antitoxinu proti rekombinačnímu polypeptidu toxinů A C. diffícile

V příkladu 12 jsme demonstrovali neutralizaci cytotoxicity, zprostředkované toxinem A, afinitně čištěnými protilátkami, reaktivními s rekombinačním proteinem toxinů A. Za účelem-zjištění, zda mohou být protilátky, získané imunizací fragmentem rekombinačního polypeptidu toxinů C. diffícile, účinné při léčbě klostridiálních

104 ·· ·· • · · • · ··· • · · « • · · « ·· ·· • · ·· • · · · • · ·· • ··· · · • · · ·· ·· onemocnění, byly vytvořeny protilátky k rekombinačnímu proteinu toxinu A, reprezentujícímu vazebnou doménu. Jako imunogeny byly použity dva rekombinační polypeptidy vazebné domény toxinu A, exprimující vazebnou oblast buď ve vektoru pMALc (pMA1870-1680) nebo pET 23(pPA1870-2680). Protein pMAL byl afinitně čištěn jako rozpustný produkt [příklad 12(d)] a protein pET byl izolován jako nerozpustná inkluzní tělíska [příklad 12(d)] a solubilizován na imunologicky aktivní protein patentově chráněnou metodou (patentová přihláška USA č. 08/129027). Tento příklad zahrnuje (a) imunizaci, (b) shromažďování antitoxinu, (c) stanovení titru antitoxinové protilátky, (d) neutralizaci hemaglutinační aktivity toxinu A in vitro protilátkou proti rekombinačnímu toxinu A a (e) test neutralizační aktivity toxinu A in vitro.

a) Imunizace

K imunizaci slepic byl odděleně použit rozpustný preparát a preparát inkluzních tělísek. Oba čištěné polypeptidy toxinu A byly zředěny PBS a emulgovány přibližně stejným objeme CFA pro počáteční imunizaci a IFA pro posilovači imunizaci. V den nula bylo pro každý rekombinační preparát injekčně aplikováno dvěma bílým leghornským nosnicím (získaným od místního chovatele) na více místech (intramuskulárně a subkutánně) 1 ml adjuvantní směsi, obsahující přibližně 0,5 až 1,5 mg rekombinačního toxinu A. Posilovači imunizace 1,0 mg byla provedena v den 14 a v den 28.

b) Shromažďování antitoxinu

Ze žloutku byl standardním postupem PEG Qako v příkladu 1) extrahován celkový imunní IgY a konečná peleta IgY byla rozpuštěna ve sterilním PBS o původním objemu žloutku. Tento materiál se označuje „imunní rekombinační IgY“ nebo „imunní IgY“.

c) Titr antitoxinové protilátky

Za účelem zjištění, zda je rekombinační protein toxinu A dostatečně imunogenní pro získání protilátek ve slepicích, byl pomocí ELISA stanoven titr protilátek rekombinačního polypeptidu toxinu A. V den 32 byla sebrána vejce od obou slepic, žloutky byly spojeny a popsanou metodou PEG byla izolována protilátka. Pro rozpustný rekombinační protein obsahující fúzi maltózu vázajícího proteinu v pMal (pMA1870-2680) byl stanoven titr imunní rekombinační protilátky IgY. 96jamkové destičky Falcon Pro-bind byly přes noc pokryty při 4 °C 100 μΙ/jamku rekombinantu toxinu A v koncentraci 2,5 pg/μΙ v PBS s obsahem 0,05 % thimerosalu. Pro porovnání reaktivity s fúzním partnerem byla jiná destička pokryta maltózu vázajícím proteinem (MBP) ve stejné koncentraci. Příští den byly jamky 1 h při 37 °C blokovány pomocí PBS s obsahem 1 % bovinního sérového albuminu (BSA). IgY, izolovaný z imunních nebo preimunních vajec, byl zředěn ředidlem protilátek (PBS s obsahem 1 % BSA a 0,05 % Tween-20) a přidán k blokovaným jamkám a inkubován 1 h při 37 °C. Destičky byly promyty třikrát PBS s obsahem 0,05 % Tween-20, pak třikrát PBS. Na destičku byl přidán králičí anti-kuřecí IgG, konjugovaný s alkalickou fosfatasou (Sigma), zředěný ředidlem protilátek 1:1000. Destičky byly promyty stejně jako výše a byl přidán substrát [p-nitrofenylfosfát (Sigma)] v koncentraci 1 mg/ml v 0,05M Na₂CO₃, pH 9,5 a 10mM MgCI₂. Destičky byly kvantitativně hodnoceny na zařízení Dynatech MR 300 Micro EPA při 410 nm asi 10 min po přidání substrátu.

Z výsledků tohoto testu ELISA vyplývá, že v kuřatech, imunizovaných rekombinačním polypeptidem toxinu A, byly produkovány vysoké titry protilátek, tento rekombinant se zdá vysoce imunogenní, protože byl schopen produkovat vysoké titry protilátek relativně rychle s málo imunizacemi. Titr imunního IgY zaměřeného specificky proti toxinové části rekombinantu byl vyšší než titr imunního IgY kjeho fúznímu partnerovi, maltózu vázajícímu proteinu, a významně vyšší než u preimunního IgY. Titr ELISA (reciproční k nejvyššímu zředění IgY poskytujícímu signál) v preimunním IgY k MBP nebo rekombinantu byl méně než 1:30, zatímco titr IgY kMBP, resp. rekombinantu toxinu A byl 1:18750, resp. více než 1:93750. Významné je, že titry protilátek proti rekombinantu, vzniklých ve slepicích proti rekombinačnímu peptidu, jsou mnohem vyšší než v případě protilátek proti této

106.

• · • · • · · · · • · · • · · • · · · oblasti, vzniklých imunizací nativním toxinem A. Titr protilátky k rekombinantu oblasti 1870-2680 v preparátu protilátek CTA je alespoň pětkrát nižší v porovnání s protilátkami vytvořenými rekombinantem (1:18750 versus více než 1:93750). Zdá se tedy, že lepší imunitní odpověcT než v případě nativního toxinu A lze proti specifickému rekombinantu získat, použije-li se jako imunogen tento rekombinant.

Toto zjištění je významné, protože ukazuje, že k získání antitoxinových preparátů není nutno používat molekuly nativního toxinu, protože části rekombinantu stimulují produkci protilátek. Tak je možno odstranit problémy spojené s toxicitou nativního toxinu, což usnadňuje produkci antitoxinu ve velkém měřítku.

d) Neutralizace hemaglutinační aktivity toxinu A in vitro pomocí protilátky proti rekombinačnímu toxinu A

Toxin A má kromě cytotoxických a enterotoxických vlastností hemaglutinační aktivitu. Konkrétně toxin A sráží králičí erythrocyty vazbou na trisacharid (gal 1-3B14GlcNAc) na povrchu buněk. [H. Krivan a d., Infect. Immun. 53:573-581 (1986).] Zkoumali jsme, zda může protilátka proti rekombinačnímu toxinu A (imunní IgY, protilátky získané imunizací nerozpustným produktem exprimovaným v pET) neutralizovat hemaglutinační aktivitu toxinu A in vitro. Postup testu hemaglutinace se řídil popisem v H.C. Krivan a d. Před provedením testu hemaglutinace byl imunní nebo pre-imunní IgY, frakcionovaný polyethylenglykolem, preabsorbován citrátovanými králičími erythrocyty, protože jsme zjistili, že i IgY samotný může srážet červené krvinky. Citrátované králičí červené krvinky (RRBC) (Cocalico) byly dvakrát promyty odstředěním při 450 g s isotonickým pufrem (0,1 M Tris-HCl, 0,05 M NaCl, pH 7,2. Protilátky v IgY, reaktivní s RRBC, byly odstraněny tak, že byla připravena 10% suspenze RRBC (přídavkem balených buněk k imunnímu nebo preimunnímu IgY) a směs byla inkubována 1 h při 37 °C. RRBC pak byly odstraněny odstředěním. Neutralizace hemaglutinační aktivity toxinu A protilátkou byla testována na 96jamkových mikrotitračních destičkách s kulatým dnem. 25 μΙ toxinu A (36 μg/ml) (Tech Lab) v isotonickém pufru bylo smíseno se stejným objemem různých ředění imunního nebo preimunního IgY v isotonickém pufru a inkubováno 15 min při teplotě místnosti. Pak bylo přidáno 50 μΙ 1 % suspenze RRBC v isotonickém pufru a směs

107

byla inkubována 3 h při 4 °C. Byly rovněž zahrnuty jamky s pozitivními kontrolami, obsahující konečnou koncentraci 9 pg/ml toxinu A po zředění bez lgY. Hemaglutinační aktivita byla hodnocena visuálně, přičemž difusní matrice RRBC, pokrývající dno jamky, představovala pozitivní hemaglutinační reakci a tuhý knoflík RRBC na dně představoval negativní reakci. Imunní IgY proti rekombinantu neutralizoval hemaglutinační aktivitu toxinu A s neutralizačním titrem 1:8. Preimunní lgY však nebyl schopen hemaglutinační schopnost toxinu A neutralizovat.

e) Test neutralizace toxinu A in vitro

Schopnost lgY proti rekombinačnímu toxinu (imunních protilátek lgY, získaných imunizací pomocí pMA1870-2680, rozpustného rekombinačního proteinu s vazebnou doménou exprimovaného v pMAL, označených na obr. 14 Anti-tox. A-2 a uváděných jako rekombinační oblast 6) a preimunního lgY, připraveného podle příkladu 8(c), neutralizovat cytotoxickou aktivitu toxinu A byla hodnocena in vitro s použitím testu cytotoxicity buněk CHO a toxinu A (Tech Lab) v koncentraci 0,1 pg/ml způsobem pospaným v příkladu 8(c). Jako další kontrola byly použity preparáty IgY proti nativnímu toxinu A (CTA) a preimunního lgY, pospané v příkladu 8(c). Výsledky jsou znázorněny na obr. 14.

IgY proti rekombinačnímu toxinu vykázal pouze částečnou neutralizaci cytotoxické aktivity toxinu A, zatímco preimunní IgY významno neutralizační aktivitu nevykázal.

Příklad 14

Neutralizace toxinu A C. difficile in vivo

Byla hodnocena schopnost ptačích protilátek (IgY), získaných imunizací vazební doménou rekombinačního toxinu A, neutralizovat enterotoxinovou aktivitu toxinu A C. difficile in vivo s použitím zlatých syrských křečků, příklad zahrnoval: (a) přípravu ptačího IgY proti rekombinačnímu toxinu A pro orální aplikaci, (b) ochranu

108..

křečků in vivo proti enterotoxicitě toxinu A C. difficile ošetřením toxinu A ptačím IgY proti rekombinačnímu toxinu A a (c) histologické hodnocení slepého střeva křečků.

a) Příprava ptačího IgY proti rekombinačnímu toxinu A pro orální aplikaci

Od slepic, které byly imunizovány fragmentem pMA1870-2680 rekombinačního toxinu A C. difficile (popsaným v příkladu 13), byla získána vejce. Druhá skupina vajec, zakoupených v místním supermarketu, byla použita jako preimunní (negativní) kontrola. Zobou skupin vajec byl způsobem popsaným v příkladu 8(c) extrahován ze žloutku IgY a konečné pelety IgY byly solubilizovány ve čtvrtině původního objemu žloutku s použitím 0,1 M karbonátového pufru (směs NaHCO₃ a Na₂CO₃), pH 9,5. Základní karbonátový pufr byl použit pro ochranu toxinu A před působením kyselého prostředí žaludku.

b) Ochrana křečků proti enterotoxicitě toxinu A C. difficile in vivo ošetřením toxinu A ptačím IgY proti rekombinačnímu toxinu A

Za účelem hodnocení schopnosti ptačího IgY proti rekombinačnímu toxinu A, připraveného podle odstavce (a), neutralizovat in vivo enterotoxinovou aktivitu toxinu A byl vyvinut model neutralizace toxinu in vivo s použitím zlatých syrských křečků. Tento model byl založen na publikovaných hodnotách minimálního množství toxinu A, nutného k vyvolání průjmu (0,08 mg toxinu A/kg tělesné hmotnosti) a úhynu (0,16 mg toxinu A/kg tělesné hmotnosti) při orálním podání křečkům (Lyerly a d., Infect. Immun. 47:349-352 (1985)).

Pro tuto studii byly použity čtyři oddělené experimentální skupiny, každá tvořená 7 samicemi zlatého syrského křečka (Charles River) o přibližném stáří tří a půl týdne a o hmotnosti přibližně 50 g. Zvířata byla ustájena ve skupinách po 3 a 4 a po celou délku studie měla přístup k potravě a vodě ad libitum.

Pro každé zvíře byla připravena směs obsahující buď 10 gg toxinu A (0,2 mg/kg) nebo 30 μg toxinu A (0,6 mg/kg) (toxin A C. difficile byl získán od Tech Lab) a 1 ml buď IgY proti rekombinačnímu toxinu A nebo preimunního IgY (z odstavce (a)). Tyto směsi byly inkubovány 60 min při 37 °C a pak podány zvířatům orální cestou.

109 • · · · · · • · · • · · · · • ·· · · · · · · ···· ·

Zvířata pak byla po dobu 24 h po podání směsi toxin A + IgY sledována, zda dojde k nástupu průjmu nebo úhynu. Výsledky získané na konci této doby jsou uvedeny v tabulce 17.

Tabulka 17. Výsledky studie po 24 h

	výsledek studie po 24 h
experimentální skupina	zdravé1	průjem2	úhyn3
10 μg toxinů A + antitoxin proti intervalu 6	7	0	0
30 gg toxinů A + antitoxin proti intervalu 6	7	0	0
10 μg toxinů A + preimunní sérum	0	5	2
30 gg toxinů A + preimunní	0	5	2

zvířata zůstala po celých 24 h trvání studie zdravá ² u zvířat se vyvinul průjem, avšak nedošlo k úhynu ³ u zvířat se vyvinul průjem a následně uhynula

Předběžné ošetření toxinem A v obou testovaných dávkách s použitím IgY proti rekombinačnímu toxinů A zamezilo u křečků zjevným příznakům onemocnění. Předběžné ošetření toxinem A C. difficile s použitím IgY proti rekombinačnímu toxinů A tedy neutralizovalo enterotoxinovou aktivitu toxinů A in vivo. Naproti tomu všechna zvířata ve dvou skupinách, které dostávaly toxin A a byly předběžně ošetřeny pomocí preimunního IgY, si vyvinula příznaky onemocnění, které sahaly od průjmu po úhyn. Průjem, který se vyvinul u 5 zvířat, která neuhynula v každé ze dvou preimunních skupin, do konce studie spontánně zmizel.

c) Histologické hodnocení slepých střev křečků

Pro další zhodnocení schopnosti IgY proti rekombinačnímu toxinů chránit křečky proti enterotoxinové aktivitě toxinů A bylo provedeno histologické hodnocení slepých střev křečků ze studie v odstavci (b).

Za účelem přípravy histologických vzorků byly usmrceny tři skupiny zvířat, první skupinu tvořilo po jednom reprezentativním zvířeti z každé ze 4 skupin

110 • · · ·

přeživších křečků v závěru studie popsané v odstavci (b). Tato zvířata představovala ve studii časový bod 24 h.

Druhou skupinu tvořila dvě zvířata, která nebyl součástí výše popsané studie, ale byla oddělena ošetřena stejnými směsmi toxin A + preimunní IgY jako zvířata v odstavci (b). U obou těchto křečků se vyvinul průjem a byla usmrcena 8 h po podání směsi toxin A + preimunní IgY. V době usmrcení vykazovala obě zvířata příznaky průjmu. Tato zvířata představovala ve studii akutní fázi.

Konečná skupina byla tvořena jedním neošetřeným křečkem ze stejné dodávky jako zvířata použitá pro předchozí skupiny. Toto zvíře sloužilo jako normální kontrola.

Z těchto 7 zvířat byly odebrány vzorky cekální tkáně a fixovány přes noc při 4 °C s použitím 10% pufrovaného formalinu. Fixované tkáně byly uloženy do parafinu, rozřezány a přeneseny na skleněná mikroskopická podložní sklíčka. Poté byly řezy tkání barveny pomocí hematoxylinu a eosinu (barvení H a E) a zkoumány světelnou mikroskopií.

Tkáně získané ze dvou zvířat představujících časový bod 24 h, která dostala směs obsahující buď 10 pg nebo 30 pg toxinů A a IgY proti rekombinačnímu toxinů A, byly nerozeznatelné od normální kontroly jak z hlediska hrubé patologie, tak na mikroskopické úrovni. Toto zjištění poskytuje další důkaz schopnosti IgY proti rekombinačnímu toxinů A účinně neutralizovat enterotoxinovou aktivitu toxinů A C. difficile in vivo, a tak bránit akutním nebo trvalým patologickým změnám, vyvolaným toxinem A.

Naproti tomu tkáně ze dvou zvířat, představujících časový bod 24 h, která dostala směs toxin A + preimunní IgY, vykazovaly významné patologické změny. V obou těchto skupinách byla pozorována menší organizace než u normální kontrolní tkáně. Cytoplasma epiteliálních buněk měla vakuolovitý vzhled a mezi epitelem a spodními vrstvami buněk byly přítomny mezery. Lamina propria z velké části chyběla. Střevní klky a krypty byly výrazně zmenšeny a zdály se přerostlé planární vrstvou epiteliálních buněk a fibroblastů. Proto i když se jevilo, že se tato zvířata zotavila z akutních příznaků intoxikace toxinem A, došlo k trvalým patologickým změnám cekální sliznice.

111

Tkáně získané ze dvou zvířat, reprezentujících akutní fázi, která dostala směs toxinu A a preimunního IgY, vykazovaly nejvýznamnější patologické změny. Na úrovni hrubé patologie bylo pozorováno, že obě zvířata mají vážně zvětšené slepé střevo, vyplněné vodnatým diaroickým materiálem. Na mikroskopické úrovni byla u zvířete, kterému byla podána směs obsahující 10 pg toxinu A a preimunní IgY, zjištěna vrstva sliznice, která měla potrhaný poškozený vzhled a dezorganizovanou zhutněnou kvalitu. Krypty ve velkém rozsahu chyběly a objevily se četné trhliny v epitelu. Došlo rovněž ke vnikání erythrocytů do prostorů mezi epiteliální vrstvou a spodní tkání. Zvíře, kterému byla podána směs obsahující 30 pg toxinu A a preimunní IgY, vykázalo nejvážnější patologické změny. Cekální tkáň tohoto zvířete měla vzhled velmi podobný jako u zvířat, která uhynula v důsledku C. difficile. Byla zaznamenána rozsáhlá destrukce sliznice a epiteliální vrstva byla odpadlá. Značně převládaly hemorrhagické oblasti, obsahující velký počet erythrocytů. U tohoto vzorku zcela chyběl vzhled normální architektury tkáně. Z hlediska výskytu patologických případů tento křeččí in vivo model intoxikace toxinem A velmi úzce koreluje s patologickými důsledky onemocnění C. difficile u křečků. Výsledky uvedené v tomto příkladu demonstrují, že zatímco IgY proti rekombinačnímu toxinu A (interval 6) je schopen pouze částečné neutralizace cytotoxické aktivity toxinu A C. difficile, neutralizuje táž protilátka účinně 100 % enterotoxinové aktivity toxinu in vivo. I když není úmyslem přihlašovatele omezovat vynález na tento mechanismus, může to být důsledkem skutečnosti, že cytotoxicita a enterotoxicita toxinu A C. difficile představují dvě samostatné a oddělené biologické funkce.

Příklad 15

Neutralizace toxinu A C. difficile protilátkami proti rekombinačním polypeptidům toxinu A

V příkladu 14 byla demonstrována schopnost ptačích protilátek, zaměřených proti rekombinačnímu fragmentu 1870-2680 toxinu A C. difficile (exprimovanému v pMA1870-2680, viz příklad 13) neutralizovat enterotoxickou aktivitu toxinu A. Dále

112 • Λ

byla zkoumána schopnost ptačích protilátek (IgY), zaměřených proti jiným rekombinačním epitopům toxinů A, neutralizovat nativní toxin A in vivo. Tento příklad zahrnoval (a) přípravu IgY proti rekombinačním polypeptidům toxinů A, (b) ochranu křečků in vivo proti toxinů A ošetřením IgY proti rekombinačnímu toxinů A a (c) kvantifikaci specifické koncentrace protilátek v preparátech CTA a IgY intervalu 6.

Nukleotidová sekvence kódující oblasti úplného proteinu toxinů A je uvedena pod SEQ ID NO:5. Aminokyselinová sekvence úplného proteinu toxinů A je uvedena pod SEQ ID NO:6. Aminokyselinová sekvence, tvořená zbytky 1870 až 2680 toxinů A, je uvedena pod SEQ ID NO:7. Aminokyselinová sekvence, tvořená zbytky 1870 až 1960 toxinů A, je uvedena pod SEQ ID NO:8. Aminokyselinová sekvence, tvořená zbytky 1873 až 2684 toxinů A, je uvedena pod SEQ ID NO:29.

a) Příprava IgY proti rekombinačním polypeptidům toxinů A

Od leghornských slepic, které byly imunizovány rekombinačními polypeptidovými fragmenty toxinů C. diffícile, zahrnujícími úplný protein toxinů A, byla získána vejce. Jako imunogeny byly použity tyto polypeptidové fragmenty: 1) pMA 1870-2680 (interval 6), 2) pPA 1100-1450 (interval 4) a 3) směsi fragmentů tvořených pMA 30-300 (interval 1), pMA 300-660 (interval 2), pMA 660-1100 (interval 3) a pMA 1450-1870 (interval 5). Tato směs imunogenů se označuje jako interval 1235. Umístění jednotlivých intervalů v molekule toxinů A je znázorněno na obr. 15A. Na obr. 15A jsou použity tyto zkratky: pP označuje vektor pET23 (New England Biolabs), pM označuje vektor pMAL™-c (New England Biolabs), A označuje toxin A, čísla se vztahují na interval aminokyselin, exprimovaný v klonu. (Například označení pMA30300 ukazuje, že rekombinační klon kóduje aminokyseliny 30 až 300 toxinů A a použitý vektor byl pMAL™-c.)

Rekombinační proteiny byly vytvořeny způsobem popsaným v příkladu 11. IgY byly extrahovány a solubilizovány pro orální aplikaci v 0,1 M karbonátovém pufru o pH 9,5 postupem popsaným v příkladu 14(a). Reaktivita IgY proti jednotlivým rekombinačním intervalům byla hodnocen a pomocí ELISA způsobem popsaným v příkladu 13(c).

113..

• · • · · · · · · ···· • ···· · · · · ··· • · · « · · · · · · · · · · • · · · · · · · · ·

b) Ochrana křečků in vivo proti toxinu A ošetřením protilátkami proti rekombinačnímu toxinu A

Schopnost protilátek, vytvořených proti rekombinačním polypeptidům toxinu A, poskytovat in vivo ochranu proti enterotoxické aktivitě toxinu A, byla prověřována v modelovém systému křečka. Tento test byl prováděn způsobem popsaným v příkladu 14(b). Stručně řečeno bylo pro každou samici zlatého syrského křečka (Charles River) o hmotnosti 40 až 50 g smíseno 1 ml PEG preparátu IgY 4X (tj. resuspendovaného v 1/4 původního objemu žloutku) proti intervalu 6, intervalu 4 nebo intervalu 1235 s 30 gg (LD₁₀₀ orální dávky) toxinu A C. difficile (Tech Lab). Jako negativní kontrola sloužil preimunní IgY smísený s toxinem A. Jako pozitivní kontrola sloužily protilátky získané proti toxoidu A C. difficile (příklad 8), smísené s toxinem A (CTA). Směs byla inkubována 1 h při 37 °C a pak orálně aplikována lehce etherizovaným křečkům pomocí 18g krmiči jehly. Pak byl u zvířat po dobu přibližně 24 h pozorován nástup průjmu a úhyn. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 18.

Tabulka 18. Výsledky studie po 24 h

experimentální skupina	zdravé1	průjem2	úhyn3
preimunní	0	0	7
CTA	5	0	0
interval 6	6	1	0
interval 4	0	1	6
interval 1235	0	0	7

zvířata nevykazovala známky onemocnění u zvířat se vyvinul průjem, avšak nedošlo k úhynu u zvířat se vyvinul průjem a uhynula

Předběžné ošetření pomocí IgY proti intervalu 6 bránilo průjmu u šesti ze sedmi a úplně zabránilo úhynu u všech sedmi křečků. Naopak provedlo-li se s preimunním IgY, IgY proti intervalu 4 a intervalu 1235, nemělo u křečků žádný vliv na nástup průjmu a úhyn.

114 • · · · · «· • · · ·· · · · • ·· · · · · · • · · · · · · • · · · · · ···

c) Kvantifikace koncentrace specifické protilátky v PEG preparátech CTA a IgY intervalu 6

Za účelem stanovení čistoty PEG preparátů IgY byl alikvot PEG preparátu IgY pMA1870-2680 (interval 6) chromatografován pomocí HPLC a kalibrované kolony KW-803 (Shodex). Vzniklý profil absorbance při 280 nm je znázorněn na obr. 16. Jediný velký vrchol odpovídá odhadované molekulové hmotnosti IgY. Integrace plochy pod tímto vrcholem ukázala, že v tomto vrcholu je přítomno více než 95 % proteinu, eluovaného z kolony. Tento výsledek demonstruje, že většina materiálu, absorbujícího při 280 nm, v PEG preparátu odpovídá IgY. Je tedy možno absorbanci při 280 nm použít ke stanovení celkové koncentrace protilátky v PEG preparátech.

Pro stanovení koncentrace protilátek specifických pro interval 6 (vyjádřeno jako procentický podíl z celkové protilátky) v PEG preparátech CTA a pMA1870-2680 (interval 6) bylo afinitně čištěno definované množství těchto protilátkových preparátů na afinitní koloně pPA1870-2680(H) (schematicky znázorněno na obr. 15B) a byly kvantifikovány specifické protilátky. Na obr. 15B jsou použity tyto zkratky: pP označuje vektor pET23 (New England Biolabs), pM označuje vektor pMAL™-c (New England Biolabs), pG označuje vektor pGEX (Pharmacia), pB označuje vektor PinPoint™ Xa (Promega), A označuje toxin A, čísla se vztahují na interval aminokyselin, exprimovaný v klonu. Plné elipsy představují MBP, šrafované elipsy přestavují glutathion S-transferasu, šrafované kroužky představují biotinovou značku a HHH představuje polyhistidinovou značku.

Afinitní kolona, obsahující repetici rekombinačního proteinu toxinu A, byla získána takto: Na 4 ml pryskyřice Actigel (Sterogene), promyté PBS, bylo v 15 ml zkumavce (Falcon), obsahující 1/10 konečného objemu kondenzačního roztoku Aid (1M kyanborohydrid sodný) navázáno 5 až 10 mg proteinu inkluzních tělísek pPA1870-2680 [připraveného postupem podle příkladu 17 a dialyzovaného do PBS]. Alikvoty supernatantu z kondenzačních reakcí před a po kondenzaci, byly hodnoceny barvením gelů 7,5 % SDS-PAGE pomocí Coomassieovy modři. Na základě intenzit proteinových pásů bylo na pryskyřici navázáno více než 6 mg rekombinačního proteinu. Pryskyřice byla nanesena na 10ml kolonu (BioRad), intenzivně promyta

115 • · · •

PBS, preeluována 4M guanídin-HCI (v 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,005 % thimerosalu) a reekvilibrována PBS. Kolona byla skladována při 4 °C.

Na výše uvedené afinitní koloně byly následujícím způsobem čištěny alikvoty preparátů (PEG prep) pMA1870-2680 (interval 6) nebo polyklonální protilátky IgY CTA. Kolona byla připojena na UV monitor (ISCO) a propláchnuta PBS. Pro čištění IgY pMA1870-2680 byl použit 2X PEG prep (sterilně filtrovaný na filtru 0,45 μ; přibližně 500 mg celkového IgY). Kolona byla propláchnuta PBS do znovunastolení základní hodnoty (průtok kolony byl uschován), promyta BBS Tween pro vymytí nespecificky vázaných protilátek a reekvilibrována pomocí PBS. Navázaná protilátka byla z kolony vymyta pomocí 4 M guanidin-HCI (v 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,005 % thimerosalu). Celý eluční pík byl shromážděn v 15 ml zkumavce (Falcon). Kolona byla reekvilibrována a eluát byl rechromatografován výše popsaným způsobem. Preparát protilátky byl kvantifikován pomocí absorbance UV (k vynulování spektrofotometru byl použit eluční pufr). Celková čištěná protilátka činila přibližně 9 mg, resp. 1 mg z prvního a druhého průchodu chromatografii. Nízký výtěžek z druhého průchodu ukázal, že prvním průchodem chromatografii byly odstraněny nejvíce specifické protilátky. Odhadovaný procentický podíl protilátek specifických pro interval 6 v PEG prep pMA1870-2680 je přibližně 2 %.

Procentický podíl protilátek specifických pro interval 6 v PEG prep CTA byl stanoven (pomocí stejné kolony a metody) jako přibližně 0,5 % celkového IgY.

4X Peg prep obsahuje přibližně 20 mg/ml IgY. V odstavci (b) tedy přibližně 400 pg specifické protilátky v PEG prep intervalu 6 in vivo neutralizovalo 30 pg toxinu A.

Příklad 16

Ošetření onemocnění C. difficile u křečků in vivo protilátkami proti rekombinačnímu intervalu 6

Byla zkoumána schopnost protilátek, zaměřených proti rekombinačnímu intervalu 6 toxinu A, chránit křečky in vivo proti onemocnění C. difficile. Tento příklad

116 zahrnoval: (a) profylaktické ošetření onemocnění C. difficile a (b) terapeutické ošetření onemocnění C. difficile.

a) Profylaktické ošetření onemocnění C. difficile

Tento experiment byl prováděn způsobem podle příkladu 9(b). Tři skupiny po 7 samicích syrského křečka o hmotnosti 100 g (Charles River) byly profylakticky ošetřeny buď preimunními IgY, IgY proti nativním toxinům A a B [CTAB; viz příklad 8(a) a (b)] nebo IgY proti intervalu 6. IgY byly připraveny jako 4X PEG preparáty způsobem popsaným v příkladu 9(a).

Zvířatům bylo po dobu 12 dní třikrát denně zhruba ve 4h intervalech aplikováno po 1 ml preparátu protilátky zředěného v Ensure®. S použitím odhadů specifické koncentrace protilátek podle příkladu 15(c) obsahovala každá dávka preparátu protilátek intervalu 6 přibližně 400 pg specifické protilátky. V den 2 byl každý křeček predisponován k infekci C. difficile orálním podáním 3,0 mg klindamycin-HCI (Sigma) v 1 ml vody. V den 3 byli křečci orálně imunizováni 1 ml inokula kmene ATCC 43596 C. difficile ve sterilním salinickém roztoku, obsahujícím přibližně 100 organismů. Pak byla zvířata pozorována z hlediska nástupu průjmu a následného úhynu během doby ošetření. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 19.

Tabulka 19. Letalita po 12 dnech ošetření

skupina	počet živých zvířat	počet mrtvých zvířat
preimunní	0	7
CTAB	6	1
interval 6	7	0

Ošetření křečků orálně podaným IgY proti intervalu 6 úspěšně ochránilo sedm ze sedmi (100 %) zvířat před onemocněním C. difficile. Jeden z křečků v této skupině vykazoval průjem, který pak v průběhu ošetření vymizel. Jak je již uvedeno v příkladu 9, vysokou ochrannou schopnost mají protilátky k nativnímu toxinu A a Β. V tomto

117 ·· • · příkladu přežilo ve skupině ošetřované CTAB šest ze sedmi zvířat. Všichni křečci, ošetřovaní preimunním sérem, byli postiženi průjmem a uhynuli. Zvířata, která přežila ve skupině CTAB a skupině intervalu 6, zůstala po dobu 12 dní po skončení ošetření zdravá. Konkrétně šest ze sedmi křečků, ošetřovaných protilátkami proti intervalu 6, přežilo alespoň 2 týdny po skončení ošetření, z čehož vyplývá, že tyto protilátky poskytují dlouhodobé vyléčení. Tyto výsledky představují první důkaz toho, že protilátky vytvořené proti rekombinační oblasti toxinů A mohou při pasivním podání zvířatům zabránit CDAD. Tyto výsledky rovněž naznačují, že při profylaktickém podání mohou k ochraně zvířat proti onemocnění C. difficile postačovat pouze protilátky vytvořené proti intervalu 6.

Jiní autoři již získali protilátky proti toxinů A aktivní imunizací křečků proti rekombinačnímu polypeptidů umístěnému v oblasti intervalu 6 [Lyerly, D.M. a d. (1990), Curr. Microbiol. 21:29]. Na obr. 17 je schematicky znázorněno umístění Lyerlyho rekombinačního proteinu v intervalu 6 (při klonování do vektoru pUC) v porovnání s kompletním konstruktem intervalu 6 (pMA1870-2680), použitým podle vynálezu k vytvoření neutralizujících protilátek, zaměřených proti toxinů A. Na obr. 17 představuje plná elipsa MBP, který je v pMA1870-2680 fúzován s intervalem 6 toxinů A.

Protilátky podle Lyerlyho a d. (uvnitř intervalu 6) byly schopny chránit křečky před infekcí C. difficile pouze částečně, pokud jde o přežití (přežila čtyři z osmi zvířat), a navíc u žádného zvířete nezabránily průjmu. Mimoto zvířata, ošetřovaná protilátkami z vnitřku intervalu 6 [Lyerly a d. (1990)], po skončení ošetření uhynula.

V kontrastu s tím demonstruje výše popsaný experiment, že pasivní podávání protilátek proti intervalu 6 zabránilo u šesti ze sedmi zvířat průjmu a úplně zabránilo úhynu v důsledku CDAD. Pasivní aplikace protilátek proti intervalu 6 navíc poskytuje, jak výše uvedeno, dlouhodobé vyléčení (tj. ošetření je možno bez nebezpečí stáhnout).

118 · • ·· ··· · · · ··· · · • · · · ··· · · · ·· ·· ·* ··· ·· ··

b) Terapeutické ošetření onemocnění C. difficile·. Ošetření nepopiratelné infekce C. difficile in vivo u křečku protilátkami rekombinačního intervalu 6

Byla zkoumána schopnost protilátek proti rekombinačnímu intervalu 6 toxinů A působit při terapeutickém ošetření onemocnění C. difficile. Tento experiment byl prováděn v podstatě stejně jako v příkladu 10(b). Tři skupiny po sedmi až osmi samicích zlatého syrského křečka (o hmotnosti 100 g; Charles River), byly ošetřeny buď preimunním IgY, IgY proti nativnímu toxinů A a toxinů B (CTAB) a IgY proti intervalu 6. Protilátky byly připraveny postupem popsaným výše pro preparáty 4X PEG.

Křečci byli nejprve predisponováni pro infekci C. difficile dávkou 3 mg klindamycin-HCI (Sigma), podanou orálně v 1 ml vody. Přibližně po 24 h byla zvířata orálně exponována 1 ml kmene C. difficile ATCC 43596 ve sterilním salinickém roztoku, obsahujícím přibližně 200 organismů. Jeden den po infekci byla k ověření nepopiratelnosti infekce zjišťována přítomnost toxinů A a B ve stolici křečků pomocí komerční imunoanalytické soupravy (Cytoclone A+B EPA, Cambridge Biotech). Testování byli čtyři náhodně vybraní členové každé skupiny. Jako negativní kontrola byla testována stolice neinfikovaného křečka. Všechna infikovaná zvířata měla pozitivní výsledek testu podle pokynů výrobce na přítomnost toxinů. Poté bylo přibližně 24 h po infekci zahájeno léčení.

Zvířatům byl podáván denně ve zhruba 4h intervalech 1 ml preparátu protilátky, zředěné v Ensure® (Ross Labs). Množství specifických protilátek, podané v jedné dávce (stanoveno afinitním čištěním), bylo odhadnuto jako asi 400 pg IgY proti intervalu 6 (pro zvířata ve skupině intervalu 6) a pro preparát CTAB 100 pg antitoxinu A (specifického pro interval 6) a 70 pg anti-toxinu B (specifického pro interval 3; viz příklad 19). Zvířata byla podrobena léčení po dobu 9 dní a pak další 4 dny pozorována na výskyt průjmu a úhynu. Výsledky a počet zvířat, která přežila a která uhynula 4 dny po infekci, jsou uvedeny v tabulce 20.

119 ·· • · · · · ·· » · · · • · ··· · · · · · · • ·· ··· · · · ··· · « ······· · · · ·· ·· ·· ··· · · ··

Tabulka 20. Terapeutické ošetření in vivo protilátkami proti intervalu 6

skupina	počet živých zvířat	počet mrtvých zvířat
preimunní	4	3
CTAB	8	0
interval 6	8	0

Protilátky zaměřené současně proti intervalu 6 a CTAB úspěšně zabránily úhynu v důsledku C. difficile, jestliže byly terapeuticky podány 24 h po infekci. Tento výsledek je významný, protože mnozí výzkumníci zahajují terapeutické ošetření křečků dosavadními léčivy (například vankomycinem, fenelfamyciny, tiacumiciny atd.) 8 h po infekci [Swanson a d., (1991), Antimicrobial Agents and Chemotherapy 35:1108 a (1989) J. Antibiotics 42:49],

Z křečků ošetřených preimunním IgY uhynulo 42 % v důsledku CDAD. Zatímco protilátky proti intervalu 6 zabránily u ošetřených křečků úhynu, neodstranily všechny příznaky CDAD, protože 3 zvířata vykazovala mírný průjem. 14 dní po infekci mělo průjem navíc jedno zvíře ošetřené CTAB a jedno zvíře ošetřené preimunním preparátem. Tyto výsledky ukazují, že protilátky proti intervalu 6 poskytují účinný prostředek terapie CDAD.

Příklad 17

Indukce protilátek neutralizujících toxin A vyžaduje rozpustný protein intervalu 6

Jak je uvedeno v příkladech 11(d) a 15, exprese rekombinačních proteinů v E. coli může vést k produkci buď rozpustného nebo nerozpustného proteinu. Je-li produkován nerozpustný protein, je rekombinační protein před imunizací zvířat solubiiizován. Za účelem stanovení, zda je možno použít k vytvoření neutralizujících protilátek k toxinu A rozpustného nebo nerozpustného rekombinačního proteinu, byl proveden následující experiment. Tento příklad zahrnoval a) expresi repetic toxinu A a subfragmentú těchto repetic v E. coli pomocí různých expresních vektorů, b)

120 ·· ·♦ • » * • · ··· • · · · • · · · • ·» ·· ·· · · · · • · · ·· • · ···· · • · · ·

identifikaci rekombinačních repetic toxinu A a podoblastí, na něž se vážou neutralizující protilátky a c) stanovení neutralizační schopnosti protilátek získaných proti rozpustnému a nerozpustnému repetičnímu imunogenu toxinu A.

a) Exprese repetic toxinu A a subfragmentů těchto repetic v E. coli pomocí různých expresních vektorů

Imunogenem intervalu 6, použitým v příkladech 15 a 16, byl protein pMA18702680, v němž jsou repetice toxinu A exprimovány jako rozpustný fúzní protein s MBP (popsán v příkladu 11). Je zajímavé, že exprese této oblasti (od místa Spěl na konec repetic, viz obr. 15B) ve třech jiných expresních konstruktech, jak nativním proteinu (pPA1870-2680), proteinu značeném poly-His [pPA1870-2680(H)j, nebo proteinu značeném biotinem (pBA1870-2680) vedla po indukci bakteriálního hostitele ke zcela nerozpustnému proteinu (viz obr. 15B). Pro expresi pBA1870-2680 byl použit hostitelský kmen BL21 (Novagen) a pro expresi pPA1870-2680 a pPA1870-2680(H) hostitelský kmen BL21(DE3) (Novagen). Tyto nerozpustné proteiny se ve velkém množství akumulovaly v inkluzních tělískách. Exprese rekombinačních plasmidů v hostitelských kmenech E. coli, kultivovaných v médiu 2X YR, byla prováděna popsaným způsobem [viz výše Williams a d. (1994)].

Jak je shrnuto na obr. 15B, vedla exprese fragmentů repetic toxinu A (buď jako N-terminálních fragmentů Spel-EcoRI nebo C-terminálních fragmentů EcoRI) s použitím expresních systémů pGEX (pGA1870-2190), PinPoint™-Xa (pBA18702190 a pBA2250-2680) a pET (pPA1870-2190) rovněž k vysokému výtěžku nerozpustného proteinu. Expresní systémy pGEX a pET jsou popsány v příkladu 11. Expresní systém PinPoint™-Xa řídí expresi fúzních proteinů v E. coli. Fúzní proteiny z vektorů PinPoint™-Xa obsahují na aminoterminálním konci biotinovou značku a mohou být afinitně čištěny avidinovou pryskyřicí SoftLink™ Soft Release (Promega) za podmínek mírné denaturace (5 mM biotinu).

Rozpustnost exprimovaných proteinů z expresních konstruktů pPG1870-2190 a pPA1870-2190 byla stanovena po indukci exprese rekombinačního proteinu za podmínek, o nichž se uvádí, že podporují rozpustnost proteinu [Tyto podmínky zahrnují růst hostitele při snížené teplotě (30 °C) a použití vysoké (1 mM IPTG) nebo

121 • · · ·

nízké (0,1 mM IPTG) koncentrace induktoru [Williams a d. (1994)]. Veškerý exprimovaný rekombinační protein toxinu A byl za těchto podmínek nerozpustný. Exprese těchto fragmentů repetic toxinu A v expresních vektorech pET a pGEX vede k produkci nerozpustného rekombinačního proteinu, i když se hostitelské buňky kultivují za snížené teploty a s použitím nižších koncentrací induktoru. Přestože se expresí těchto fragmentů ve vektorech pMal získal afinitně čistitelný rozpustný fúzní protein, byl tento protein buď převážně nerozpustný (pMA1870-2190) nebo nestabilní (pMA2250-2650). Pokusy o solubilizaci exprimovaného proteinu z expresního konstruktu pMA1870-2190 s použitím snížené teploty nebo nižší koncentrace induktoru flak výše uvedeno) nevedly ke zlepšení rozpustnosti fúzního proteinu.

Souhrnně tyto výsledky demonstrují, že exprese repetiční oblasti toxinu A v E coli vede k produkci nerozpustného rekombinačního proteinu, ať je exprimován jako velký (aa 1870-2680) nebo malý (aa 1870-2190 nebo aa 2250-2680) fragment v různých expresních vektorech (nativní nebo pET značení poly-His, pGEX nebo PinPoint™-Xa) za podmínek růstu, o nichž je známo, že podporují rozpustnost proteinu. Výjimku z tohoto pravidla tvořily fúze s MBP, které podporovaly rozpustnost proteinu buď částečně (pMA1870-2190) nebo úplně (pMA1870-2680).

b) Identifikace rekombinačních repetic toxinu A a podoblastí, na něž se vážou neutralizující protilátky

Repetiční oblasti toxinu A, na něž se vážou neutralizující protilátky, byly identifikovány pomocí rekombinačních proteinů repetičních oblastí toxinu A, exprimovaných jako rozpustné nebo nerozpustné proteiny, za účelem odstranění ochranných protilátek z polyklonálního souboru protilátek proti nativnímu toxinu C. difficile. Pro hodnocení schopnosti proteinů vázat neutralizující protilátky byl vyvinut test in vivo.

Postup testu je následující. Rekombinační proteiny se nejprve předběžně smísí s protilátkami proti nativnímu toxinu A (protilátky CTA;, vytvořené v příkladu 8) a nechají reagovat. Pak se přidá toxin A C. difficile v koncentraci pro křečky letální a směs se podává křečkům IP injekčně. Jestliže rekombinační protein obsahuje

122

neutralizující epitopy, ztratí protilátky CTA schopnost vázat toxin A, což vede k průjmu a/nebo úhynu křečků.

Test byl prováděn takto: Letální dávka toxinu A, podávaná orálně devíti zlatým syrským křečkům (Sasco) o hmotnosti 40 až 50 g byla stanovena jako 10 až 30 pg. Preparát protilátek CTA, čištěný PEG, byl naředěn v0,1M karbonátovém pufru, pH 9,5, na koncentraci 0,5X (tj. protilátky byly zředěny na dvojnásobek původního objemu žloutku). Ředění se provádělo v karbonátovém pufru pro ochranu před degradací kyselinami v žaludku. Koncentrace 0,5X byla použita proto, že byla identifikována jako nejnižší účinná koncentrace proti toxinu A. Koncentrace protilátek specifických pro interval 6 v 0,5X preparátu CTA byla odhadnuta na 10 až 15 pg/ml (odhadováno metodou popsanou v přikladu 15).

Schopnost vázat se na neutralizující protilátky proti toxinu A C. difficile (CTA) byla porovnávána u preparátu inkluzních tělísek [nerozpustný protein intervalu 6: pPA1870-2680(H)] a rozpustného proteinu intervalu 6 [pMA1870-2680; viz obr. 15]. Konkrétně bylo 1 až 2 mg rekombinačního proteinu rozmícháno s 5 ml preparátu protilátky 0,5X CTA (podle odhadu obsahujícího 60 až 70 pg protilátky specifické pro interval 6). Po 1 h inkubace při 37 °C byl přidán CTA (Tech Lab) v konečné koncentraci 30 pg/ml a znovu inkubován 1 h při 37 °C. 1 ml této směsi, obsahující 30 pg toxinu A (a 10 až 15 pg protilátky specifické pro interval 6), bylo orálně podáno zlatým syrským křečkům (Sasco) o hmotnosti 40 až 50 g. Rekombinační proteiny, které vedou ke ztrátě neutralizační schopnosti protilátky CTA, by naznačovaly, že tyto proteiny obsahují neutralizující epitopy. Jako negativní, resp. pozitivní kontrola sloužila preimunní protilátka, resp. CTA (obě 0,5X) bez přídavku rekombinačního proteinu.

Byly testovány dva další preparáty inkluzních tělísek, oba exprimované jako nerozpustné produkty ve vektoru pET: jeden obsahoval odlišný insert (fragment toxinu B), jiný než interval 6, nazvaný pPB1850-2070 (viz obr. 18), který slouží jako kontrola pro nerozpustný interval 6, a druhý představoval zkrácenou verzi oblasti intervalu 6, nazvanou pPA1870-2190 (viz obr. 15B). Výsledky tohoto experimentu jsou uvedeny v tabulce 21.

123 • · • · • · • · • * ·

Tabulka 21. Výsledky studie vazby neutralizujících protilátek rozpustným proteinem intervalu 6 po 24 h

experimentální skupina1	zdravé2	průjem3	úhyn4
preimunní Ab	0	3	2
CTAAb	4	1	0
CTA Ab + int 6 (rozpustná)	1	2	2
CTA Ab + int 6 (nerozpustná)	5	0	0
CTA Ab + pPB 1850-2070	5	0	0
CTA Ab + pPA1870-2190	5	0	0

každé skupině byl přidán toxin A C. difficile (CTA) ² zvířata nevykazovala známky onemocnění ³ u zvířat se vyvinul průjem, avšak nedošlo k úhynu ⁴ u zvířat se vyvinul průjem a uhynula

Preimunní protilátka byla neúčinná proti toxinu A, zatímco protilátky anti-CTA v 0,5x zředěné koncentraci téměř úplně chránily křečky proti enterotoxickým účinkům CTA. Přídavek rekombinačních proteinů pPB1850-2070 nebo pPA01870-2190 k protilátce anti-CTA neměl na její ochrannou schopnost žádný vliv, což ukazuje, že se tyto rekombinační proteiny nevážou na neutralizující protilátky. Na druhé straně byl rekombinační protein intervalu 6 schopen se vázat na neutralizující protilátky antiCTA a neutralizoval ochranný účinek protilátek anti-CTA in vivo. Čtyři z pěti zvířat ve skupině ošetřené protilátkami anti-CTA, smíšenými s rozpustným proteinem intervalu 6, vykazovalo toxicitu spojenou s toxinem (průjem a úhyn). Výsledky navíc ukázaly, že protein intervalu 6 musí být exprimován jako rozpustný protein, aby byl schopen se vázat na neutralizující protilátky anti-CTA, protože přídavek nerozpustného proteinu intervalu 6 neměl ne neutralizační schopnost preparátu protilátek anti-CTA žádný vliv.

124 • · • *

c) Stanovení neutralizační schopnosti protilátek vytvořených proti repetičními imunogenu rozpustného a nerozpustného toxinu A

Za účelem stanovení, zda jsou vyvolávány protilátky proti solubilizovaným inkluzním tělískům, byl nerozpustný repetiční protein toxinu A solubilizován a byla vyvolána tvorba specifických protilátek v kuřatech. Nerozpustný protein pPA18702680 byl solubilizován metodou, pospanou Wiiliamsem, viz výše (1994). Stručně řečeno byly indukované kultury (500 ml) peletizovány odstředěním při 4 °C po dobu 10 min při 3000 g: Pelety buněk byly opatrně resuspendovány v 10 ml sonifikačního pufru inkluzních tělísek (25 mM HEPES, pH 7,7, 100 mM KCI, 12,5 mM MgCI₂, 20 % glycerolu, 0,1 % (v/v) Nonidet P-40, 1 mM DTT). Suspenze byla přenesena do 30 ml neskleněné odstředivkové zkumavky. Bylo přidáno 500 μΙ lysozymu 10 mg/ml a zkumavky byly inkubovány na ledu po dobu 30 min. Suspenze pak byla alespoň na 1 h mrazena při -70 °C. Poté byla suspenze rychle roztavena ve vodní lázni o teplotě místnosti a pak umístěna na led. Pak byla suspenze sonifikována s použitím alespoň 15 s impulsů mikrosondy (Branson Sonicator, model č. 450), přerušovaných chlazením na ledu.

Sonifikovaná suspenze byla přenesena do 35 ml Oakridgeovy zkumavky a odstřeďována 10 min při 4 °C při 6000 g za účelem peletizace inkluzních tělísek. Peleta byla dvakrát promyta napipetováním nebo promícháním v čerstvém ledově chladném pufru RIPA [0,1 % SDS, 1 % Triton X-100, 1 % deoxycholátu sodného vTBS (25 mM Tris-CI, pH 7,5, 150 mM NaCl)]. Inkluzní tělíska byla vysušena a pomocí malé kovové špachtle přenesena do 15 ml zkumavky (Falcon). Byl přidán 1 ml 10% SDS a peleta byla solubilizována opatrným pipetováním a vypouštěním roztoku pomocí 1 ml mikropipety. Solubilizace byla usnadněna zahříváním vzorku podle potřeby na 95 °C.

Jakmile byla inkluzní tělíska v roztoku, byly vzorky zředěny 9 objemy PBS. Roztoky proteinů byly dialyzovány přes noc při teplotě místnosti proti lOObnásobnému objemu PBS s obsahem 0,05 % SDS. Dialýzní pufr pak byl vyměněn za PBS s obsahem 0,01 % SDS a vzorky byly dialyzovány při teplotě místnosti několik hodin až přes noc. Do použití byly vzorky skladovány při 4 °C. Před

125

dalším použitím byly vzorky ohřátý na teplotu místnosti, aby případný vysrážený SDS přešel do roztoku.

Preparát inkluzních tělísek byl použit pro imunizaci slepic. Protein byl dialyzován do PBS a emulgován přibližně stejným objemem CFA při první imunizaci nebo IFA při následné posilovači imunizaci. V den nula bylo pro každý rekombinační preparát dvěma bílým leghornským nosnicím injekčně vpraveno na více místech (IM a SC) 1 ml směsi rekombinační protein-adjuvans s obsahem přibližně 0,5 až 1,5 mg rekombinačního proteinu. V den 14 a 28 byly podány posilovači injekce 1,0 mg. V den 32 byla sebrána vejce a pomocí PEG izolována protilátka, jak je popsáno v příkladu 14(a). Byly přítomny vysoké titry protilátek specifických pro toxin A (stanoveno pomocí ELISA způsobem popsaným v příkladu 13). Titry byly stanoveny pro obě protilátky proti rekombinačním polypeptidům pPA1870-2680 a pMA18702680 a bylo zjištěno, že jsou srovnatelné při > 1:62500.

Protilátky proti rozpustnému proteinu intervalu 6 (pMA1870-2680) a nerozpustnému proteinu intervalu 6 [(inkluzní tělísko), pPA1870-2680] byly testovány na neutralizační aktivitu proti toxinu A s použitím testu in vivo popsaného v příkladu 15(b). Preimunní protilátky, resp. protilátky proti toxinu A (CTA) sloužily jako negativní, resp. pozitivní kontrola. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 22.

Tabulka 22. Výsledky studie neutralizace toxinu A protilátkami proti rozpustnému proteinu intervalu 6 po 24 h

experimentální skupina	zdravé1	průjem2	úhyn3
preimunní	1	0	4
CTA	5	0	0
interval 6 (rozpustná)4	5	0	0
interval 6 (nerozpustná)	0	2	3

zvířata nevykazovala známky onemocnění u zvířat se vyvinul průjem, avšak nedošlo k úhynu u zvířat se vyvinul průjem a uhynula 400 pg/ml

126 ' Protilátky vytvořené proti nativnímu toxinu A chránily, zatímco preimunní protilátky měly malý vliv. Jak bylo zjištěno s použitím testu CHO in vitro [popsaného v příkladu 8(d)], kde protilátky vytvořené proti rozpustnému proteinu intervalu 6 mohly j částečně neutralizovat účinky toxinu A, zde byly schopny neutralizovat toxin A in vivo kompletně. Naproti tomu protilátky vytvořené proti nerozpustnému proteinu intervalu j 6 nebyly schopny neutralizovat účinek toxinu A in vivo, jak je patrné výše (tabulka 22) ani in vitro, jak ukazuje test CHO [popsaný v příkladu 8(d)].

Tyto výsledky demonstrují, že rozpustný repetiční imunogen toxinu A je nutný pro vyvolání produkce neutralizujících protilátek u kuřat a že vytvoření tohoto rozpustného imunogenu se dosáhne pouze se specifickým expresním vektorem (pMal), obsahujícím oblast toxinu A zahrnující aa 1870-2680. To znamená, že protein, který je následně solubilizován, nevede k antigenu toxinu A, který by vyvolal vznik neutralizující protilátky.

Příklad 18

Klonování a exprese genu toxinu B C. difficile

Gen toxinu B byl klonován a sekvenován: aminokyselinová sekvence, odhadnutá ze sekvence klonovaného nukleotidu naznačuje pro toxin B molekulovou hmotnost 269,7 kD [Barroso a d., Nucl. Acids Res. 18:4004 (1990)]. Nukleotidové sekvence kódující oblasti celého genu toxinu B je uvedena jako SEQ ID NO:9. Aminokyselinová sekvence celého proteinu toxinu B je uvedena jako SEQ ID NO: 10. Aminokyselinová sekvence tvořená zbytky aminokyselin 1850 až 2360 toxinu B je uvedena jako SEQ ID NO:11. Aminokyselinová sekvence tvořená zbytky aminokyselin 1750 až 2360 toxinu B je uvedena jako SEQ ID NO:12. Aminokyselinová sekvence tvořená zbytky aminokyselin 1754 až 2362 toxinu B je uvedena jako SEQ ID NO:30.

Vzhledem k nákladnosti a obtížnosti izolace nativního proteinu toxinu B by bylo výhodné použít jednoduchých a levných prokaryotických expresních systémů pro produkci vysokých hladin rekombinačního proteinu toxinu B pro účely imunizace.

127

Ideální by bylo, kdyby izolovaný rekombinační protein byl rozpustný, aby se uchovala nativní antigenicita, protože solubilizované proteiny inkluzních tělísek se často neskládají do nativních konformací. Jak je patrné z příkladu 17, byly neutralizující protilátky proti rekombinačnímu toxinu A získány skutečně pouze tehdy, byly-li jako imunogen použity rozpustné rekombinační polypeptidy toxinu A. Aby se usnadnilo čištění, měl by být protein exprimován v kultuře E. coli v hladině vyšší než 1 mg/l.

Pro zjištění, zda je možno v E. coli produkovat vysoké hladiny rekombinačního proteinu toxinu B, byly fragmenty genu toxinu B klonovány do různých prokaryotických expresních vektorů a byla hodnocena jejich schopnost exprimovat v E. coli rekombinační protein toxinu B. Tento příklad zahrnoval (a) klonování genu toxinu B a (b) expresi genu toxinu Β v E coli.

a) Klonování genu toxinu B

Gen toxinu B byl klonován s použitím PCR amplifikace z genomové DNA C. difficile. Nejprve byl gen klonován ve dvou překrývajících se fragmentech pomocí dvojic primerů P5/P6 a P7/8. Poloha těchto primerů v genu toxinu B je schematicky znázorněna na obr. 18. Sekvence těchto primerů jsou:

P5: 5’ TAGAAAAAATGGCAAATGT 3’ (SEQ ID NO:11)

P6: 5’ TTTCATCTTGTA GAGTCAAAG 3’ (SEQ ID NO:12)

P7: 5’ GATGCCACAAGATGATTTAGTG 3’ (SEQ ID NO:13) a

P8: 5’ CTAATTGAGCTGTATCAGGATC 3’ (SEQ ID NO: 14).

Obr. 18 znázorňuje dále umístění těchto primerů v genu toxinu Β: P9, který je tvořen sekvencí 5’ CGGAATTCCTAGAAAAAATGGCAA ATG 3’ (SEQ ID NO:15), P10, který je tvořen sekvencí 5’ GCTCTAGAATGA CCATAAGCTAGCCA 3’ (SEQ ID NO:16), P11, který je tvořen sekvencí 5’ CGGAATTCGAGTTGGTAGAAAGGTGGA 3’ (SEQ ID NO:17), P13, který je tvořen sekvencí 5’

CGGAATTCGGTTATTATCTTAAGGATG 3’ (SEQ ID NO:18), a P14, který je tvořen sekvencí 5’ CGGAATTCTTGATAACTGGAT TTGTGAC 3’ (SEQ ID NO: 19). Aminokyselinová sekvence, tvořená zbytky aminokyselin 1852 až 2362 toxinu B, je uvedena jako SEQ ID NQ:20. Aminokyselinová sekvence, tvořená zbytky

128 ·«

aminokyselin 1755 až 2362 toxinu B, je uvedena jako SEQ ID NO:21. Aminokyselinová sekvence, tvořená zbytky aminokyselin 1754 až 2362 toxinu B, je uvedena jako SEQ ID NO:30.

Kmen VPI Clóstridium difficile 10463 byl získán z American Type Culture Collection (ATCC 43255) a kultivován za anaerobních podmínek v mozkosrdcovém nálevu (Becton Dickinson). Vysokomolekulární DNA C. difficile byla izolována vpodstatě popsaným způsobem [Wren a Tabaqchali (1987), J. Clin. Microbiol., 25:2402], avšak s výjimkou, že 1) k rozrušení bakterií bylo použito 100 pg/ml proteinasy Kv 0,5% SDS a 2) k odstranění uhlohydrátů z vyčeřeného lyzátu bylo použito srážení cetyltrimethylamoniumbromidem (CTAB) [jak je popsáno v Ausubel a d., ed. Current Protocols in Molecular Biology, sv. 2 (1989) Current Protocols], Stručně řečeno byl po rozrušení bakterií proteinasou Ka SDS roztok upraven na přibližně 0,7 M NaCl přídavkem 1/7 objemu 5M NaCl. Byla přidána 1/10 objemu roztoku CTAB/NaCI (10 % CTAB v 0,7 M NaCl) a po důkladném promíchání byl roztok inkubován 10 min při 65 °C. Byl přidán stejný objem směsi chloroform/isoamylalkohol (24:1) a fáze byly důkladně promíchány. Organická a vodná fáze byla oddělena odstřeďováním v mikrofuze po dobu 5 min. Vodný supernatant byl odebrán a extrahován směsí fenol/chloroform/isoamylalkohol (25:24:1). Odstřeďováním v mikrofuze po dobu 5 min byly odděleny fáze. Supernatant byl přenesen do čerstvé zkumavky a pomocí isopropanolu byla vysrážena DNA. Sraženina DNA byla peletizována krátkým odstředěním v mikrofuze. K odstranění zbytkového CTAB byla peleta DNA promyta 70% ethanolem. Pak byla peleta DNA vysušena a opět rozpuštěna v pufru TE (10 mM Tris-HCI pH 8,0, 1 mM EDTA). Integrita a výtěžek genomové DNA byly hodnoceny srovnáním na základě postupného ředění nezkrácené DNA lambda po elektroforéze na agarózovém gelu.

Fragmenty toxinu B byly klonovány pomocí PCR s použitím korekční termostabilní DNA polymerasy [nativní Pfu polymerasa (Stratagene)]. Vysoká věrnost této polymerasy omezuje mutační problémy, související s amplifikaci polymerasami náchylnými k chybám (například polymerasou Taq). PCR amplifikace byla provedena s použitím dvojic primerů P5 (SEQ ID NO:12) plus P6 (SEQ ID NO:12) a P7 (SEQ ID NO:13) plus P8 (SEQ ID NO:14) v reakčních směsích po 50 μί, obsahujících 10 mM

129 • « • · • ·

Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCI₂, 200 μΜ každého dNTP, 0,2 μΜ každého primerů a 50 ng genomové DNA C. difficile. Reakční směsi byly překryty 100 μΙ minerálního oleje, zahřívány 4 min na 94 °C, bylo přidáno 0,5 μΙ nativní polymerasy Pfu (Stratagene), načež byly podrobeny cyklům 30krát 1 min při 94 °C, 1 min při 50 °C, při 72 °C (2 min pro každý kb amplifikované sekvence) a 10 min při 72 °C. Zdvojené reakční směsi byly spojeny, extrahovány chloroformem a vysráženy ethanolem. Po promytí 70% ethanolem byly pelety resuspendovány v 50 μΙ pufru TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA).

Produkt amplifikace P5/P6 byl dále popsaným způsobem klonován do pUC19. Alikvoty DNA po 10 μΙ byly gelově čištěny pomocí soupravy Prep-a-Gene (BioRad) a ligovány do vektoru pUC19, restrikčně ošetřeného pomocí Smál. Rekombinační klony byly izolovány a potvrzeny restrikčním štěpením standardními metodami molekulární biologie (Sambrook a d., 1989). Byly identifikovány inserty dvou nezávislých izolátů, v nichž byl insert toxinů B orientován tak, že místa vektorů BamH\ a Sací byla orientována 5’, resp. 3’ (pUCB10-1530). Fragment BamHl/Sac\, obsahující insert, byl klonován do podobně štěpené DNA vektoru pET23a-c- a v malém měřítku kultur identifikovaných klonů (5 ml) byla vyvolána exprese proteinu.

Totální extrakty proteinu byly izolovány, rozlišeny na gelech SDS-PAGE a protein toxinů B byl identifikován Westernovou analýzou pomocí afinitně čištěné kozí protilátky proti toxinů B (Tech Lab). Postupy indukce proteinu, SDS-PAGE a Westernové blotové analýzy byly prováděny, jak popisuje Williams a d. (1994), viz výše. Stručně řečeno byly 5 ml kultury bakterií, pěstovaných v 2XYT s obsahem 100 μς/ιτιΙ ampicilinu, obsahující příslušný rekombinační klon, indukovány k expresi rekombinačního proteinu přídavkem IPTG do 1 mM. Byli použiti hostitelé E. coli BL21(DE3) nebo BL21(DE3)LysS (Novagen) pro plasmidy pET.

Kultury byly indukovány přídavkem IPTG do konečné koncentrace 1,0 mM, když hustota buněk dosáhla 0,5 OD₆₀₀ a 2 h po indukci byl indukovaný protein ponechán nahromadit se. Vzorky proteinu byly připraveny peletizací alikvotů bakterií po 1 ml odstředěním (1 min v mikrofuze) a resuspendováním peletizovaných bakterií ve 150 μΙ vzorkového pufru 2x SDS-PAGE (0,125 mM Tris-HCl pH 6,8, 2 mM EDTA, 6 % SDS, 20 % glycerolu, 0,025 % bromfenolové modři; před použitím se přidá β130 • · • · · merkaptoethanol do 5 %). Vzorky se zahřejí na 95 °C po dobu 5 min, pak se ochladí a na gely 7,5 % SDS-PAGE se nanese 5 nebo 10 μΙ. Byly naneseny rovněž vysokomolekulární proteinové markéry (BioRad), aby bylo možno odhadovat molekulovou hmotnost identifikovaných fúzních protein. Po elektroforéze byl protein detekován buď obecně barvením gelů pomocí Coomassieovy modři nebo specificky přenosem na nitrocelulózu pro westernovou detekci specifického imunoreaktivního proteinu. Molekulová hmotnost indukovaného proteinu reaktivního s toxinem B umožnila stanovit integritu čtecího rámce toxinu B.

Rekombinant pET23b (pPB10-1530) exprimoval konzistentně s odhadovanými hodnotami vysokomolekulární protein reaktivní s toxinem B. To potvrzuje, že během PCR amplifikace nedošlo k terminačním chybám v rámci. Byl konstruován expresní klon pET23b, obsahující interval 10-1750aa genu toxinu B, fúzí fragmentu EcoRVSpel amplifikačního produktu P7/P8 do intervalu P5-EcoRV amplifikačního produktu P5/P6 (viz obr. 18) v pPB10-1530. Integrita tohoto klonu byla potvrzena restrikčním mapováním a westernovou detekcí exprimovaného rekombinačního proteinu toxinu B. Hladiny indukovaného proteinu jak zpPB10-1530, tak pPB10-1750 byly příliš nízké, než aby usnadnily čištění použitelných množství rekombinačního proteinu toxinu B. Zbývající interval 1750-2360 aa byl klonován přímo do expresního vektoru pMAL nebo pET z amplifikačního produktu P7/P8 způsobem popsaným dále.

b) Exprese genu toxinu B

i) Přehled metod exprese

Fragmenty genu toxinu B byly exprimovány v E. coli jako buď nativní nebo fúzní proteiny. Nativní proteiny byly exprimovány v expresních vektorech buď pET23a-c nebo pET16b (Novagen). Vektory pET23 obsahují ve všech čtecích rámcích extensivní polylinkerovou sekvenci (vektory a-c), následovanou Cterminálním polyhistidinovým úsekem. Vektor pET16b obsahuje N-terminální polyhistidinovou sekvenci 5’ bezprostředně za malým polylinkerem. Polyhistidinová sekvence se váže na Ni-chelátové kolony a umožňuje afinitní čištění značených cílových proteinů [Williams a d. (1994), viz výše]. Tyto afinitní značky jsou malé (10

131 • · • ·

aa pro pET16b, 6 aa pro pET23) a umožňují expresi a afinitní čištění nativních proteinů s pouze omezeným množstvím cizích sekvencí.

Byl konstruován N-terminálně histidinem značený derivát pET16b, obsahují extensivní klonovací kazetu, k usnadnění klonování N-terminálně polyhistidinem značených expresních konstruktů toxinů B. Bylo to provedeno náhradou promotorové oblasti vektorů pET23a a b promotorovou oblastí expresního vektoru pET16b. Každý vektor byl restrikčně štěpen pomocí BglW a Ndel a reakční směsi byly rozděleny na 1,2% agarózovém gelu. Promotorové oblast pET16b (obsažená v 200 bp fragmentu Bglll-Ndel) a vektory pET23a nebo b bez promotoru byly z gelu vyříznuty, smíseny a čištěny pomocí Prep-A-gene (BioRad). Eluovaná DNA byla ligována a transformanty byly podrobeny screeningu na náhradu promotorů štěpením čištěné plasmidové DNA pomocí Ncol (promotor pET16b toto místo obsahuje, promotor pET23 ne). Tyto klony (označené pETHisa nebo b) obsahují promotor pET16b (tvořený promotorem pT7lac, místem vazby ribosomů a polyhistidinovou (10 aa) sekvencí), fúzovaný v místě Ndel s extensivním polylinkerem pET23.

Všechny fúzní proteiny MBP byly konstruovány a exprimovány ve vektorech pMAL™-c nebo pMAL™-p2 (New England Biolabs), v nichž je příslušný protein exprimován jako C-terminální fúze s MBP. Všechny plasmidy pET byly exprimovány buď v expresním hostiteli BL21(DE3) nebo BL21(DE3)LysS, zatímco plasmidy pMAL byly exprimovány s hostiteli BL21.

Ve větším měřítku (500 ml až 1 I) byly kultury každého rekombinantu kultivovány v médiu 2X YT, indukovány a frakce rozpustného proteinu byly izolovány popsaným způsobem [Williams a d. (1994), viz výše]. Extrakty rozpustného proteinu byly afinitně chromatografovány popsaným způsobem [Williams a d. (1994), viz výše] za účelem izolace rekombinačního fúzního proteinu. Stručně řečeno byly extrakty obsahující značené fúze pET chromatografovány na sloupci niklového chelátu a eluovány pomocí imidazolových solí nebo s použitím nízkého pH (pH 4,0) podle návodu distributora (Novagen nebo Qiagen). Byly připraveny extrakty obsahující rozpustný fúzní protein pMAL a chromatografovány v pufru PBS na sloupci amylózové pryskyřice (New England Biolabs) a eluovány pomocí PBS s obsahem 10 mM maltózy popsaným způsobem [Williams a d. (1994), viz výšej.

132 ii) Přehled exprese toxinu B

V obou velkých expresních konstruktech, popsaných v odstavci (a), byla detekována pouze nízká hladina (tj. méně než 1 mg/l intaktního či nedegradovaného rekombinačního proteinu) rekombinačního proteinu. Poté bylo konstruováno větší množství expresních konstruktů, obsahujících menší fragmenty genu toxinu B, za účelem zjištění, zda je možno exprimovat malé oblasti genu ve vysoké hladině. Všechny byly konstruovány fúzemi vyhovujících restrikčních fragmentů toxinu B v rámci do expresních vektorů pMAL-c, pET23a-c, pET16b nebo pETHisa-b nebo inženýrskou manipulací restrikčních míst ve specifických polohách s použitím amplifikace PCR [za stejných podmínek jako v odstavci (a)j. Ve všech případech byly klony ověřeny restrikčním mapováním, a je-li to uvedeno, sekvenováním DNA.

Byly analyzovány proteinové preparáty z indukovaných kultur každého z těchto konstruktů pomocí SDS-PAGE za účelem zjištění stability proteinu (barvení Coomassieovou modří) a imunoreaktivity proti specifickému antiséru proti toxinu B (Westernová analýza). U menších konstruktů byly v porovnání s většími rekombinanty pozorovány vyšší hladiny intaktních (tj. nedegradovaných) fúzních proteinů plné délky a byla konstruována řada expresních konstruktů, přemosťujících celý gen toxinu B (obr. 18,19 a 20 a tabulka 23).

Byly identifikovány konstrukty, které exprimovaly významnou hladinu rekombinačního proteinu toxinu B (více než 1 mg/l intaktního rekombinačního proteinu) v E. coli, a řada těchto klonů, která přemosťuje gen toxinu B, je znázorněna na obr. 19 a shrnuta v tabulce 23. Tyto klony byly použity k izolaci čistého rekombinačního proteinu toxinu B z celého genu toxinu B. Významné výtěžky proteinu byly získány z expresních konstruktů pMAL, přemosťujících celý gen toxinu B, a výtěžky rozpustného fúzního proteinu o plné délce se pohybovaly od odhadovaných 1 mg/l kultury (pMB1100-1530) do více než 20 mg/l kultury (pMB1750-2360).

Příklady čištění MBP a rekombinantú toxinu B, značených polyhistidinem, jsou znázorněny na obr. 21 a 22. Obr. 21 znázorňuje gel 7,5 % SDS-PAGE, barvený

Coomassie Blue, na němž byla prováděna elektroforéza různých vzorků proteinů,

133

extrahovaných z bakterií obsahujících pMB1850-2360. Vzorky byly nanášeny tímto způsobem: pruh 1: protein extrahovaný z neindukované kultury, pruh 2: protein z indukované kultury, pruh 3: totální protein z indukované kultury po sonifikaci, pruh 4: rozpustný protein a pruh 5: eluovaný afinitně čištěný protein. Obr. 22 znázorňuje čištění rekombinačních proteinů exprimovaných v bakteriích, obsahujících buď pPB1850-2360 (pruhy 1 až 3) nebo pPB1750-2360 (pruhy 4 až 6). Vzorky byly nanášeny tímto způsobem: neindukovaný totální protein (pruhy 1 a 4), indukovaný totální protein (pruhy 2 a 5) a eluovaný afinitně čištěný protein (pruhy 3 a 6). Proteinové markéry molekulové hmotnosti v širokém rozmezí (BioRad) jsou znázorněny v pruhu 7.

I když tedy nebylo dosaženo vysoké hladiny exprese s použitím velkých expresních konstruktů z genu toxinu B, bylo dosaženo použitelných hladin rekombinačního proteinu po izolaci indukovaného proteinu z řady menších expresních konstruktů pMAL, přemosťujících celý gen toxinu B.

Tyto výsledky představují první důkaz schůdnosti exprese rekombinačního proteinu toxinu B v E.coli ve vysoké hladině. Exprese malých oblastí předpokládané vazebné domény ligandů (repetiční oblast) toxinu B jako nativního proteinu také vedla k získání nerozpustného proteinu, zatímco velké konstrukty nebo fúze s MBP byly rozpustné (obr. 19), což demonstruje, že pro produkci rozpustného fúzního proteinu z tohoto intervalu jsou nutné specifické metody.

iii) Konstrukce klonů a podrobnosti exprese

Část genu toxinu B, obsahující repetiční oblast toxinu B [aminokyselinové zbytky 1852-2362 toxinu B (SEQ ID NO:20)j byla izolována PCR amplifikačí tohoto intervalu genu toxinu B z genomové DNA C. difficile. Sekvence a poloha obou PCR primerů [P7 SEQ ID NO:13) a P8 (SEQ ID NO:14)], použitých k amplífikaci této oblasti, v genu toxinu B jsou znázorněny na obr. 18.

DNA z PCR amplífikace byla čištěna výše popsaným způsobem extrakcí chloroformem a srážením ethanolem. Byla provedena restrikce pomocí Spěl a štěpená DNA byla rozdělena elektroforézou na agarózovém gelu. Restrikčním

134

štěpením pomocí Spěl byl produkt amplifikace 3,6 kb rozštěpen na dubletový pás 1,8 kb. Tento dubletový pás byl z gelu vyříznut a smísen s vhodně vyříznutým gelově čištěným vektorem pMALc nebo pET 23b. Tyto vektory byly připraveny štěpením pomocí Hind\\\, vyplněním volných konců Klenowovým enzymem a štěpením pomocí Xba\ (pMALc) nebo Nhe\ (pET23b). Gelově čištěné fragmenty DNA byly čištěny pomocí soupravy Prep-A-Gene (BioRad) a DNA byla ligována, transformována a předpokládané rekombinační klony byly analyzovány restrikčním mapováním.

Klony pET a pMal, obsahující repetiční insert toxinu B (interval aa 1750-2360 toxinu B) byly ověřeny restrikčním mapováním s použitím enzymů, které štěpily specifická místa v oblasti toxinu Β. V obou případech se odhaduje, že fúze místa Spěl toxinu B buď s kompatibilním místem Xba\ (pMal) nebo s nekompatibilním místem Nhe\ (pET) vytváří fúzi in frame. To bylo potvrzeno v případě klonu pMB1750-2360 sekvenováním DNA na spojení klonu a 5’ konce insertu toxinu B pomocí primeru specifického pro MBP (New England Biolabs). V případě konstruktu pET by fúzí zarovnaného 3’ konce toxinu B s vyplněným místem /7/nďlll měla v tomto vektoru vzniknout in frame fúze s C-terminální polyhistidinovou sekvencí. Vybraný klon pPB1750-2360 ztratil, jak bylo předpovězeno, místo /7/nďlll na napojení tohoto klonu; tím byla odstraněna možnost adice dalšího adenosinového zbytku na 3’ konec produktu PCR v důsledku terminálně transferasové aktivity polymerasy Pfu, poněvadž fúzí tohoto adenosinového zbytku s vyplněným místem /7/nďlll by došlo k regeneraci restrikčního místa (což bylo pozorováno u několika klonů).

Byly pěstovány 1 I kultury každého expresního konstruktu a fúzní protein byl čištěn afinitní chromatografii buď na sloupci amylózové pryskyřice (konstrukty pMAL, pryskyřice dodána z New England Biolabs) nebo sloupci Ni-chelátu (konstrukty pET; pryskyřice dodána z Qiagen nebo Novagen) popsaným způsobem [Williams a d. (1994), viz výše]. Integrita a čistota fúzních proteinů byla zjišťována barvením proteinů na gelech SDS-PAGE pomocí Coomassie a rovněž analýzou westernovým přenosem buď s afinitně čištěným kozím polyklonálním antisérem (Tech Lab) nebo kuřecím polyklonálním preparátem PEG, vytvořeným proti proteinu toxinu B (CTB), popsaným výše v příkladu 8. V obou případech se afinitním čištěním dosáhlo výtěžků nad 20 mg proteinu na litr kultury, z něhož podle odhadu více než 90 % bylo tvořeno

135

rekombinačním proteinem plné délky. Je nutno uvést, že protein s polyhistidinovou afinitní značkou byl uvolněn z pryskyřice Qiagen Ni-NTA při nízké koncentraci imidazolu (60 mM), což vyžadovalo stupeň promývání 40 mM místo 60 mM imidazolem během čištění.

Periplasmaticky vylučovaná verze pMB1750-2360 byla konstruována tak, že promotor a MBP kódující oblast tohoto konstruktu byly nahrazeny úseky z příbuzného vektoru (pMAL™-p2; New England Biolabs), v němž je na N-konci MBP přítomna signální sekvence, takže je exprimován fúzní protein. Bylo to provedeno substitucí fragmentu promotoru BglW-EcoRV z pMAL-p2 do pMB1750-2360. Výtěžky vylučovaného, afinitně čištěného proteinu (získávaného z extraktů pomocí osmotických šoků, popisovaných v Riggs, Current Protocols in Molecular Biology, sv. 2, ed. Ausubel a d., (1989), Current Protocols, str. 166.6.1.16.6.14] z tohoto vektoru činily 6,5 mg/l kultury, z čehož podle odhadu 50 % tvořil fúzní protein plné délky.

Interval byl exprimován rovněž ve dvou nepřekrývajících se fragmentech. pMB1750-1970 Byl konstruován tak, že do pMB1750-2360 byl zaveden posun restrikcí pomocí HindlW, vyplněním převislých konců a opětnou ligací plasmidu. Rekombinační klony byl selektovány podle ztráty místa Hind\\\ a dále analýzou restrikční mapy. Exprese rekombinačního proteinu z tohoto vektoru činila více než 20 mg/l nebo protein o čistotě více než 90 %.

Komplementární oblast byla exprimována v PMB1970-2360. Tento konstrukt byl vytvořen odstraněním intervalu 1750-1970 z pMB1750,2360. To bylo provedeno restrikcí tohoto plasmidu pomocí EcoRI (v polylinkeru pMalc 5’ k insertu) a III, vyplněním převislých konců a opětnou ligací plasmidu. Vzniklý plasmid pMB19702360 byl získán jak intracelulárně, tak s použitím vylučovaných verzí vektoru pMB1750-2360.

Ve verzi pMB1970-2360 nedocházelo k sekreci fúzního proteinu, pravděpodobně v důsledku konformačního omezení, které brání exportu fúzního proteinu. Intracelulárně exprimovaný vektor však produkoval více než 40 mg/l fúzního proteinu plné délky o čistotě více než 90 %.

Konstrukty pro přesnou expresi repetic toxinu B buď v pMalc (pMB1850-2360) nebo pET16b (pPB1850-2360) byly konstruovány následujícím způsobem. Interval

136 ·· ·· ·· · ·· ·· ··· ···· ···· • · ··· · · · · · ·· • · · · · · · » · ···· · • · · · · » « ··· ·· «· ·· ··· ·· ··

DNA, zahrnující repetice toxinu B, byl amplifikován pomocí PCR výše popsaným způsobem s použitím primerů P14 (SEQ ID NO:19) a P8(SEQ ID NO:14). Primer P14 dodává místo EcoRI jako bezprostředně lemující start repetic toxinu B.

Amplifikovaný fragment byl klonován do T-vektoru pT7 Blue (Novagen) a rekombinační klony,, do nichž byly v jakékoli orientaci vloženy jednotlivé kopie PCR fragmentu, byly selektovány a potvrzeny restrikčním mapováním. Insert byl vyříznut ze dvou příslušně orientovaných nezávisle izolovaných plasmidů pT71850-2360 s EcoRI (5’ konec repetic) a Pstl (v lemujícím polylinkeru vektoru) a klonován do vektoru pMalc, štěpeného EcoRI/Psřl. Vzniklý konstrukt (pMB1850-2360) byl potvrzen restrikční analýzou a poskytl po afinitní chromatografií 20 mg/l rozpustného fúzního proteinu [více než z 90 % intaktního, tj. nedegradovaného]. Restrikcí tohoto plasmidů pomocí Hindlll a opětnou ligací vektoru došlo k odstranění intervalu 19702360. Vzniklý konstrukt (pMB1850-1970) exprimoval více než 70 mg/l 90% fúzního proteinu o plné délce.

Konstrukt pPB1850-2360 byl získán klonováním fragmentu EcoRI (vyplněn Klenowem)-SamHI z vektoru pT71850-2360 (opačná orientace než byla použita při konstrukci pMB1850-2360) do vektoru pET16b, štěpeného Ndel (vyplněn)/BamHI. Výtěžky afinitně čištěného rozpustného fúzního proteinu činily 15 mg/l nebo fúzní protein plné délky o čistotě více než 90 %.

Bylo dále konstruováno několik menších expresních konstruktů z intervalu 1750-2070 ve vektorech pET, značených His, ale exprese těchto plasmidů v hostiteli BL21 (DE3) vedla k produkci vysokých hladin většinou nerozpustného proteinu (viz tabulku 23 a obr. 19). Tyto konstrukty byly získány následujícím způsobem.

pPB1850-1970 byl konstruován klonováním fragmentu Bglll-Hindlll pPB18502360 do vektoru pET23b, štěpeného pomocí Bglll/Hindlll. pPB1850-2070 byl konstruován klonováním fragmentu Bglll-Pvull pPB1850-2360 do vektoru pET23b, štěpeného pomocí Bglll/Hincll. pPB1850-1970(c) byl konstruován odstraněním vnitřního fragmentu Hindlll vektoru pPB1750-2360, v němž bylo místo vektoru Hindlll regenerováno během klonování (pravděpodobně adicí zbytku A na amplifikovaný produkt PCR terminálně transferasovou aktivitou polymerasy Piu). Konstrukt pPB1750-1970)n) byl získán vložením insertu, obsahujícího fragment Ndel-Hindlll

137 • · · • · ··· • · · · · • · · · ·· «· ·· • · • · • · • · ·· ·· ·· · · · • · ·· • · 1 44 49 pPB1750-2360, do identicky štěpeného vektoru pETHisb. Všechny konstrukty byly potvrzeny restrikčním štěpením.

Ve vektoru pMalc byl konstruován expresní konstrukt, který řídí expresi intervalu 10-470 aa toxinů B, tímto způsobem: fragment Nhe\ (místo 5’ vůči insertu ve vektoru pET23)-Afíll (vyplněný) genu toxinů B z pPB10-1530 byl klonován do vektoru pMalc Xba\ (kompatibilní s Nhe\)IHind\\\ (vyplněný). Integrita konstruktu (pMB10-470) byla ověřena restrikčním mapováním a sekvenováním DNA spoje 5’ klonu s použitím DNA primerů specifického pro MBP (New England Biolabs). Všechen exprimovaný protein však byl degradován na molekulovou hmotnost monomerního MBP.

Druhý konstrukt, přemosťující tento interval (aa 10-470), byl konstruován klonováním produktu amplifikace PCR z reakční směsi obsahující primery P9 (SEQ ID NO:15) a P10 (SEQ ID NO:16) (obr. 18) do vektoru pETHisa. Bylo to provedeno klonováním produktu PCT jako tupého fragmentu EcoRI do vektoru DNA, restringovaného pomocí EcoRI-/7/ncll; rekombinační klony byly ověřeny restrikčním mapováním. I když tento konstrukt (pPB10-520) umožňoval expresi a čištění (s použitím N-terminální polyhistidinové afinitní značky) intaktního fúzního proteinu, byly výtěžky odhadnuty na méně než 500 pg/l kultury.

Vyššího výtěžku rekombinačního proteinu z tohoto intervalu (aa 10-520) bylo dosaženo expresí intervalu ve dvou překrývajících se klonech. Interval 10-33 aa byl klonován jak ve vektoru pETHisa, tak pMalc s použitím fragmentu DNA BamHl-Af/lll (vyplněný) zpPB10-520. Tento fragment byl klonován do vektoru pMalc, restringovaného BamHl-H/ndlII (vyplněný) nebo pETHisa, restringovaného SamHlHincW. Rekombinační klony byly ověřeny restrikčním mapováním. Byla získána vysoká hladina jak nerozpustného (pET), tak rozpustného (pMal) fúzního proteinu. Celkové výtěžky fúzního proteinu z konstruktu pMB10-330 (obr. 18) byly 20 mg/l kultury, z čehož podle odhadu 10 % tvořili fúzní protein plné délky. I když byly výtěžky tohoto intervalu vyšší a při expresi z konstruktu pET byl produkován více než 90% rekombinační protein plné délky, byla použita fúze pMal, protože exprimovaný protein byl rozpustný, a tudíž měl větší pravděpodobnost nativní konformace.

Klon pMB260-520 byl konstruován klonováním amplifikované DNA, štěpené

EcoRI-Xbal, z PCR reakční směsi, obsahující DNA primery P11 (SEQ ID NO:17 a

138

P10 (SEQ ID N0:16) (obr. 18) do podobně restringovaného vektoru pMalc. Výtěžek afinitně čištěného proteinu byl 10 mg/l, z čehož podle odhadu přibližně 50 % bylo tvořeno rekombinačním proteinem plné délky.

Interval aa 510-1110 byl exprimován dále popsaným způsobem. Tento celý interval byl exprimován jako fůze pMal klonováním fragmentu Nhel-Hindlll pUCBIO1530 do vektoru pMalc, štěpeného Xbal-Hindlll. Integrita konstruktu (pMB510-1110) byla ověřena restrikčním mapováním a sekvenováním DNA spoje 5’ klonu pomocí primeru DNA, specifického pro MBP. Výtěžek afinitně čištěného proteinu byl 25 mg/l kultury, z čehož podle odhadu 5 % bylo tvořeno fúzním proteinem plné délky (1 mg/l).

Ve snaze dosáhnout vyšších výtěžků byla tato oblast exprimována ve dvou fragmentech (aa 510-820 a 820-1110) ve vektoru pMalc. Klon pMB510-820 byl konstruován vložením fragmentu DNA Sací (v polylinkeru pMal 5’ vůči insertu)-/7pal zpMB510-1110 do vektoru pMalc, restringovaného Sacl/Sřul. Vektor pMB820-1110 byl konstruován vložením fragmentu Hpal-Hindll\ pUCB10-1530 do vektoru pMalc, štěpeného SamHI (vyplněný)/Hindlll. Integrita těchto konstruktů byla ověřena restrikčním mapováním a sekvenováním DNA spoje 5’ klonu pomocí primeru DNA specifického pro MBP.

Rekombinační protein, exprimóvaný z vektoru pMB510-820, byl vysoce nestabilní. Z konstruktu pMB820-1105 však byly získány vysoké hladiny (20 mg/l) více než 90% fúzního proteinu plné délky. Kombinace částečně degradovaného proteinu pMB510-1110 (obohaceného na interval 510-820) s proteinem pMB8201110 poskytuje použitelná množství rekombinačního antigenu z tohoto intervalu.

Interval aa 1100-1750 byl exprimován dále popsaným způsobem, celý interval byl exprimován ve vektoru pMalc z konstruktu, v němž byl fragment Accl(vyplněný)Spel pPB10-1750 vložen do pMalc, restringovaného pomocí Sítvl(Xbal (Xbal je kompatibilní se Spěl; místa Stul a vyplněné Accl mají zarovnané konce). Integrita tohoto konstruktu (pMB1100-1750) byla ověřena restrikčním mapováním a sekvenováním DNA spoje klonu s použitím primeru DNA specifického pro MBP. I když bylo z buněk obsahujících tento konstrukt izolováno 15 mg/l afinitně čištěného proteinu, byl protein z více než 99 % degradován na velikost monomeru MBP.

139 • · · > ·· · · · · · ··· ···· ···· • · · · · e · · · ··· • ·· ··· · · · ···· · ···· ··· ··· • · ·· ·· · · · · · · ·

Menší derivát pMB1100-1750 byl konstruován restrikcí pMB1100-1750 pomocí AfIW a Sa/I (v pMalc polylinker 3’ vůči insertu), vyplněním převislých konců a opětnou ligací plasmidu. Vzniklý klon (ověřený restrikčním štěpením a sekvenováním DNA), který měl vypuštěný interval aa 1530-1750, byl označen pMB1100-1530. pMB11001530 exprimoval rekombinační protein ve výtěžku větším než 40 mg/l, z čehož podle odhadu 5 % tvořil fúzní protein o plné délce.

Pro expresi zbývajícího intervalu byly vytvořeny tři konstrukty. Nejprve byl fragment BspHI(vyplněný)-Spel zpPB10-1750 klonován do vektoru pMalc, štěpeného pomocí EcoRI(vyplněný)/Xbal. Integrita tohoto konstruktu (pMB15701750) byla ověřena restrikčním mapováním a sekvenováním DNA spoje klonu 5’ pomocí primeru DNA, specifického pro MBP. Exprese rekombinačního proteinu z tohoto plasmidu byla velmi nízká, přibližně 3 mg afinitně čištěného proteinu na litr, a protein byl z větší části degradován na velikost monomeru MBP. Tato oblast pak byla exprimována z fragmentu DNA, amplifikovaného pomocí PCR. Na genomovou DNA C. difficile byla výše popsaným způsobem aplikována PCR reakce s použitím primeru P13 [SEQ ID NO:18; P13 byl konstruován za účelem zavedení místa EcoRI 5’ vůči sekvencím amplifikovaného toxinu B] a P8 (SEQ ID NO:14). Amplifikovaný fragment byl štěpen pomocí EcoRI a Spěl a klonován do vektoru pMalc, štěpeného pomocí EcoR\/Xba\. Vzniklý klon (pMB1530-1750) byl ověřen analýzou restrikční mapy a rekombinační protein byl exprimován a čištěn. Výtěžek byl vyšší než 20 mg proteinu na litr kultury a podle odhadu byl z 25 % tvořen fúzním proteinem plné délky; tato hodnota byla významně vyšší než u původního klonu pMB1570-1750. Insert pMB1530-1750 (ve fragmentu EcoRI-Sa/l) byl přenesen do vektoru pETHisa (štěpen pomocí EcoRI/Xhol, konce Xhol a Sa/I jsou kompatibilní). Z rozpustných lyzátů buněk, indukovaných k expresi fúzního proteinu z tohoto konstruktu, nebyl na sloupcích Ni-chelátu vyčištěn žádný detekovatelný fúzní protein.

Tabulka 23. Přehled expresních konstruktů toxinu B^a

klon	afinitní značka	výtěžek (mg/l)	% plné délky
PPB10-1750	žádná	nízký (odhadnuto z hybridizace	?

140

		Westernová blotu)
PPB10-1530	žádná	nízký (dtto)	?
pMB10-470	MBP	15 mg/l	0%
pPB 10-520	poly-his	0,5 mg/l	20%
pPB 10-330	poly-his	> 20 mg/l (nerozpustný)	90%
pMB10-330	MBP	20 mg/l	10%
pMB260-520	MBP	10 mg/l	50%
pMB510-1110	MBP	25 mg/l	5%
pMB510-820	MBP	degradován (hybridizací Westernová blotu)
pMB820-1110	MBP	20 mg/l	90 %
pMB1100-1750	MBP	15 mg/l	0%
pMB1100-1530	MBP	40 mg/l	5%
pMB1570-1750	MBP	3 mg/l	<5%
pPB1530-1750	poly-his	nedetekován čištěný protein	?
pMB1530-1750	MBP	20 mg/l	25%
pMB1750-2360	MBP	> 20 mg/l	>90%
pMBpl 750-2360	MBP	6,5 mg/l (sekrece)	50%
pPB1750-2360	poly-his	> 20 mg/l	> 90 %
pMB1750-1970	MBP	> 20 mg/l	> 90 %
pMB1970-2360	MBP	40 mg/l	> 90 %
pMBpl 970-2360	MBP	(bez sekrece)	NA
pMB1850-2360	MBP	20 mg/l	> 90 %
pPB1850-2360	poly-his	15 mg/l	> 90 %
pMB1850-1970	MBP	70 mg/l	> 90 %
pPB1850-1970	poly-his	>10 mg/l (nerozpustný)	> 90 %
pPB 1850-2070	poly-his	> 10 mg/l (nerozpustný)	> 90 %
pPB1750-1970(c)	poly-his	> 10 mg/l (nerozpustný)	> 90 %
pPB1750-1970(n)	poly-his	> 10 mg/l (nerozpustný)	> 90 %

141

Klony uváděné kursivou se v současné době používají k čištění rekombinačního proteinu z každého zvoleného intervalu.

Příklad 19

Identifikace, čištění a indukce neutralizujících protilátek proti rekombinačnímu proteinu toxinu B C. difficile

Pro zjištění, zda mohou fragmenty rekombinačního polypeptidu toxinu B vytvářet neutralizující protilátky, se zvířata typicky nejprve imunizují rekombinačnimi proteiny a vytvoří se protilátky proti rekombinačním proteinům. Tyto protilátky proti rekombinačním proteinům se pak testují in vivo nebo in vitro na neutralizační schopnost. V závislosti na imunogenním charakteru rekombinačního polypeptidu může tvorba vysokého titru protilátek proti tomuto proteinu trval několik měsíců. Pro urychlení tohoto procesu a identifikaci, který rekombinační protein nebo proteiny mohou být nejlepšími kandidáty na tvorbu neutralizujících protilátek, byly provedeny testovací studie. Konkrétně byly rekombinační polypeptidy toxinu B podrobeny prescreeningu, při němž bylo zjišťováno, zda mají schopnost vázat ochranné protilátky z preparátu protilátek CTB, a tudíž tyto protilátky zbavovat jejich neutralizační schopnosti, rekombinační polypeptidy, které vázaly CTB, pak byly použity pro vytvoření neutralizujících protilátek. Tento příklad zahrnoval: a) identifikaci rekombinačních podoblastí v toxinu B, na něž se vážou neutralizující protilátky, b) identifikaci protilátek, specifických pro podoblasti toxinu B, které neutralizují toxin B in vivo, a c) tvorbu a hodnocení protilátek, reagujících s rekombinačnimi polypeptidy toxinu B.

a) Identifikace rekombinačních podoblastí v toxinu B, na něž se vážou neutralizující protilátky

Podoblasti v toxinu B, na něž se vážou neutralizující protilátky, byly identifikovány s použitím rekombinačních proteinů toxinu B k odstranění ochranných protilátek z polyklonální skupiny protilátek proti nativnímu toxinu B C. difficile. Byl

142

proveden pokus in vivo za účelem hodnocení preparátů z hlediska schopnosti vázat neutralizující protilátky. Rekombinační proteiny byly předem smíseny s protilátkami zaměřenými proti nativnímu toxinu B (protilátky CTB; viz příklad 8) a ponechány reagovat 1 h při 37 °C. Poté byl přidán toxin B C. difficile (CTB; Tech Lab) v koncentraci letální pro křečky a inkubován další 1 h při 37 °C. Po inkubaci byla tato směs intraperitoneálně (IP) injekčně aplikována křečkům. Jestliže rekombinační polypeptid obsahuje neutralizující epitopy, ztratí protilátky CTB svou schopnost chránit křečky proti úhynu v důsledku CTB. Existuje-li částečná nebo úplná ochrana směsí protilátka CTB - rekombinant, pak rekombinant obsahuje pouze slabé ne neneutralizující epitopy toxinu B. Tento pokus byl prováděn následujícím způsobem:

Protilátky proti CTB byly vytvořeny v leghornských nosnicích, jak je popsáno v příkladu 8. Letální dávka (LD₁₀₀) toxinu B C. difficile, je-li podána IP samicím zlatých syrských křečků (Charles River) o hmotnosti 40 g, byla stanovena jako 2,5 až 5 pg. Při výše uvedené IP dávce byly protilátky, vytvořené proti CTB a čištěném srážením PEG, schopny křečky kompletně ochránit. Bylo rovněž stanoveno minimální množství protilátky CTB, potřebné k dosažení dobré ochrany proti 5 pg CTB, aplikované injekčně IP křečkům (1x PEG). Pomocí těchto experimentů byly definovány parametry potřebné k testování, zda daný rekombinační protein může odstraňovat ochranné CTB protilátky.

Klonované oblasti, testované na neutralizační schopnost, pokrývají celý gen toxinu B a byly označeny jako intervaly (INT) 1 až 5 (viz obr. 19). Byla testována přibližně ekvivalentní koncentrace pro každý rekombinační polypeptid. Byly použity tyto rekombinační polypeptidy: 1) směs intervalů 1 a 2 (INT-1,2), 2) směs intervalů 4 a 5 (INT-4,5) a 3) interval 3 (INT-3). Rekombinační proteiny (každý v množství asi 1 mg celkového proteinu) byly nejprve preinkubovány 1 h při 37 °C s konečnou koncentrací protilátky CTB 1X [tj. peleta rozpuštěná v původním objemu žloutku, jak je popsáno v příkladu 1 (c)] v konečném objemu 5 ml. Pak bylo přidáno 25 pg CTB (v koncentraci 5 pg/ml), postačující k usmrcení 5 křečků, a směs pak byla inkubována 1 h při 37 °C. Každé z pěti samic křečků (Charles River) o hmotnosti 40 g v každé pokusné skupině bylo pak podáno IP 1 ml směsi s použitím tuberkulinové

143 injekční stříkačky s jehlou velikosti 27. Výsledky tohoto experimentu jsou uvedeny v tabulce 24.

Tabulka 24. Vazba neutralizujících protilátek proteinem intervalu 3

skupina1	počet živých zvířat	počet mrtvých zvířat
protilátky CTB	3	2
protilátky CTB + INT1,2	3	2
protilátky CTB + INT4.5	3	2
protilátky CTB + INT 3	0	5

Každé skupině byl podán toxin B C. difficile (CTB)

Jak je znázorněno v tabulce 24, přídavek rekombinačních proteinů zlNT-1,2 nebo INT-4,5 neměl žádný vliv na ochrannou schopnost preparátu protilátek CTB oproti preparátu CTB samotnému. Naproti tomu rekombinační polypeptid INT-3 byl schopen odstranit veškerou neutralizační schopnost protilátek CTB neutralizovat toxin B, což demonstruje úhyn všech křečků v této skupině.

Výše uvedený experiment byl opakován s použitím dvou menších exprimovaných fragmentů (pMB1750-1970 a pMB1970-2360, viz obr. 19), zahrnujících doménu INT-3, za účelem zjištění, zda by tato doména mohla být rozdělena na menší neutralizující epitopy. Navíc byl na neutralizační aktivitu testován polypeptid INT-3 plné délky, exprimovaný jako protein značený niklem (pPB17502360), a porovnán sfúzí MBP, exprimovaného v původním INT-3 (pMB1750-2360). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 25.

Tabulka 25. Odstranění neutralizujících protilátek proteiny obsahujícími repetice

skupina1	počet živých zvířat	počet mrtvých zvířat
protilátky CTB	5	0
protilátky CTB + pPB1750-2360	0	5
protilátky CTB + pMB1750-2360	0	5
protilátky CTB + pMB1970-2360	3	2

144

protilátky CTB + pMB1750-1970 ¹ Každé skupině byl podán toxin B C. difficile (CTB)

Výsledky, shrnuté v tabulce 25, naznačují, že menší polypeptidické fragmenty v doméně INT-3, pMB1750-1970 a pMB1970-2360, částečně ztrácejí schopnost odstraňovat neutralizující protilátky ze skupiny protilátek CTB. Tyto výsledky demonstrují, že k úplnému odstranění neutralizujících protilátek ze skupiny protilátek CTB je nutný polypeptid INT-3 plné délky. Tento experiment dále ukazuje, že neutralizační epitop INT-3 může být exprimován v alternativních vektorových systémech a výsledky jsou nezávislé na použitém vektoru nebo doprovázejícím fúzním partneru.

Následně byly na schopnost odstraňovat neutralizující protilátky ve skupině protilátek CTB výše popsaným způsobem testovány další proteiny, specifické pro interval 3. Proteiny specifické pro interval 3, použité v těchto studiích, jsou shrnuty na obr- 23. Na obr. 23 jsou použity tyto zkratky: pP označuje vektor pET23, pM označuje vektor pMALc, B označuje toxin B, čísla označují interval aminokyselin, exprimovaný v klonu. Plné černé oválky představují MBP a HHH označuje polyhistidinovou značku.

Vázat se a úplně odstraňovat neutralizující protilátky ze skupiny protilátek CTB mohou pouze rekombinačni proteiny zahrnující celou repetiční doménu toxinů B (pMB1750-2360, pPB1750-2360 a pPB1850-2360). Rekombinačni proteiny, obsahující pouze část repetiční domény toxinů B, nebyly schopny úplně odstraňovat neutralizující protilátky ze skupiny protilátek CTB (pMB1750-1970 a pMB1970-2360 mohly odstraňovat neutralizující protilátky částečně, zatímco pMB 1850-1970 a pPB1850-2070 neodstraňovaly ze skupiny protilátek CTB žádné neutralizující protilátky).

Výše uvedené výsledky demonstrují, že pouze kompletní vazebná doména ligandu (repetiční oblast) genu toxinů B může vázat a úplně odstraňovat neutralizující protilátky ze skupiny protilátek CTB. Tyto výsledky ukazují, že protilátky zaměřené proti celé repetiční oblasti toxinů B jsou nezbytné pro neutralizaci toxinů in vivo (viz obr. 23; pouze rekombinačni proteiny, exprimované vektory pMB1750-2360,

145

pPB 1750-2360 a pPB 1850-2360, jsou schopny kompletně odstraňovat neutralizující protilátky ze skupiny protilátek CTB).

Tyto výsledky reprezentují první náznak, že pro vytvoření protilátek schopných neutralizovat toxin B je nezbytná celá repetiční oblast toxinu B a pro vytváření maximálních titrů neutralizujících protilátek nemusejí postačovat podoblasti.

b) Identifikace protilátek specifických pro podoblast toxinu B, které neutralizují toxin B in vivo

Za účelem zjištění, zda protilátky, zaměřené proti repetiční oblasti toxinu B, postačují pro neutralizaci, byly afinitně čištěny oblastně specifické protilátky v preparátu CTB a testovány na neutralizaci in vivo. Afinitní kolony, obsahující rekombinační proteiny repetic toxinu B, byly získány dále popsaným způsobem. Byla připravena zvláštní afinitní kolona s použitím každého z těchto rekombinačních proteinů repetic toxinu B: pPB1750-2360, pPB1850-2360, pMB1750-1970 a pMB1970-2360.

Pro každou připravovanou afinitní kolonu bylo přes noc při teplotě místnosti kondenzováno 4 ml pryskyřice Actigel (Sterogene), promyté PBS, s 5 až 10 mg afinitně čištěného rekombinačního proteinu (nejprve intenzivně dialyzovaného do PBS) v 15ml zkumavkách (Falcon), obsahujících 1/10 konečného objemu kondenzačního roztoku Aid (1 M kyanoborohydrid sodný). Alikvoty supernatantů z kondenzačních reakcí před kondenzací a po ní byly hodnoceny barvením gelů 7,5 % SDS-PAGE pomocí Coomassie. Na základě intenzit proteinových pásů byla odhadnuta účinnost kondenzace ve všech případech větší než 30 %. Pryskyřice byly nality do 10ml kolon (BioRad), promyty intenzivně PBS, preeluovány 4M guanidinHCI (v 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) a reekvilibrovány v PBS. Kolony byly uchovávány při 4 °C.

Alikvoty preparátu polyklonální protilátky CTB IgY (prep PEG) byly dále popsaným způsobem afinitně čištěny na každé ze čtyř kolon. Kolony byly napojeny na UV monitor (ISCO), promyty PBS a byly naneseny alikvoty 2X prep PEG po 40 ml (filtračně sterilizované pomocí filtru 0,45 pm). Kolony byly promývány PBS do

146 znovuustavení základní hodnoty. Pak byly kolony promyty pomocí BBStween pro vymytí nespecificky se vážících protilátek a reekvilibrovány pomocí PBS. Navázaná protilátka byla z kolony eluovány v 4M guanidin-HCI (v 10 mM Tris-HCI, pH 8,0). Eluovaná protilátka byla okamžitě intenzivně dialyzována proti alespoň dvěma dávkám PBS a byla získána afinitně čištěná protilátka, která byla uchovávána při 4 °C. Preparáty protilátek byly kvantifikovány absorbancí UV. Eluční objemy byly v rozmezí 4 až 8 ml. Všechny afinitně čištěné zásobní roztoky obsahovaly podobné celkové koncentrace protilátky v rozmezí 0,25 až 0,35 % z celkového proteinu, naneseného na kolony.

Schopnost afinitně čištěných preparátů protilátek neutralizovat in vivo toxin B byla stanovena pomocí testu, popsaného v odstavci a). Před testováním byla afinitně čištěná protilátka zředěna 1:1 v PBS. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 26.

Tabulka 26. Neutralizace toxinu B afinitně čištěnými protilátkami

skupina3	počet živých zvířatb	počet mrtvých zvířatb
preimunní1	0	5
CTB1; 400 pg	5	0
CTB (AP na pPB1750-2360)2; 875 pg	5	0
CTB (AP na pMB1750-1970)2; 875 pg	5	0
CTB (AP na pMB1970-2360)2; 500 pg	5	0

K protilátce se přidá toxin B C. difficile (CTB) (Tech Lab; v koncentraci 5 pg/ml, celkově 25 pg) v koncentraci letální pro křečky a inkubuje se 1 h při 37 °C. Po inkubaci se tato směs intraperitoneálně (IP) aplikuje křečkům. Každá skupina dostávala toxin, předem smísený s protilátkou, vytvořenou proti uvedenému proteinu, tj. buď ¹ 4X prep PEG protilátky nebo ² afinitně čištěnou (AP) protilátku (z prep PEG CTB v označených sloupcích). Je uvedeno množství konkrétní protilátky v každém preparátu; množství se pro afinitně čištěné preparáty stanovuje přímo a pro 4X CTB se odhaduje způsobem popsaným v příkladu 15.

147 ^b Počty v každé skupině představují počty živých nebo mrtvých křečků po 2 h po

IP podání směsi toxin/protilátka.

Ve všech případech byla pozorována podobná úroveň neutralizace toxinu, takže letalita byla ve všech skupinách oproti preimunní kontrolní skupině zpožděna. Tento výsledek demonstruje, že pro neutralizaci toxinu B in vivo postačují protilátky reagující s repetiční oblastí genu toxinu B. Křečci ve všech skupinách nakonec uhynou, ale tento úhyn je pomocí protilátek prep PEG CTB maximálně odložen. Neutralizace afinitně čištěnými (AP) protilátkami tedy není tak úplná, jak bylo pozorováno u prep CTB před afinitní chromatografii. Tento výsledek může být důsledkem ztráty aktivity během denaturace guanidinem (během eluce protilátek z afinitní kolony) nebo přítomnosti protilátek specifických pro jiné oblasti genu toxinu B, které mohou přispívat k neutralizaci toxinu (přítomny v prep PEG CTB).

Zjištění, že protilátky, afinitně čištěné proti nepřekrývajícím se proteinům pMB1750-1970 a pMB1970-2360, neutralizují toxin B, naznačilo možnost, že buď 1) jsou k neutralizaci toxinu B postačující protilátky specifické pro repetiční podoblasti nebo 2) mohou proteiny specifické pro podoblasti, vázat většinu nebo všechny protilátky, specifické pro repetice, přítomné ve skupině polyklonálních CTB. To by bylo pravděpodobně důsledkem konformačních podobností mezi repeticemi, protože homologie primárních aminokyselinových sekvencí mezi různými repeticemi je v rozmezí pouze 25 až 75 % [Eichel-Streiber a d., (1992), Molec. Gen. Genetics 233:260]. Tyto možnosti byly testovány afinitní chromatografii.

Preparát CTB PEG byl postupně 2x čištěn na sloupci pMB1750-1970; po druhé chromatografii byl pozorován pouze malý eluční pík, což ukazuje, že většina reaktivních protilátek byla odstraněna. Tento preparát CTB, zbavený tohoto intervalu, byla pak chromatografován na sloupci pPB 1850-2360; na sloupec se nenavázala žádná protilátka. Pak byla pomocí ELISA postupem podle příkladu 13(c) stanovena reaktivita preparátů CTB a CTB (čištěný na pMB1750-1970) vůči proteinům pPB1750-2360, pPB1850-2360, pMB1750-1970 a pMB1970-2360. Stručně řečeno byly 96jamkové mikrotitrační destičky (Falcon, Pro-Bind Assay Plates) povlečeny rekombinačním proteinem přídavkem 100 μΙ proteinu v koncentraci 1 až 2 pg/ml v PBS s obsahem 0,005 % thimerosalu do každé jamky a inkubací při 4 °C přes noc.

148

Příští ráno byla nanesená suspenze dekantována a jamky byly třikrát promyty PBS. Za účelem blokování nespecifických vazebných míst pak bylo do každé jamky přidáno 100 μ11,0% BSA (Sigma) v BPS (blokující roztok) a destičky byly inkubovány 1 h při 37 °C. Blokující roztok byl dekantován a do první jamky ředící série byly přidány dvojené vzorky 150 μΙ zředěné protilátky. Počáteční ředění testovacího séra bylo 1/200 pro prep. CTB (koncentrace čištěného CTB byla standardizována podle OD₂₈₀) v blokujícím roztoku obsahujícím 0,5 % Tween 20, načež bylo do tohoto roztoku provedeno 5násobné ředění, a sice postupným přenášením alikvotů po 30 μΙ do 120 μΙ pufru, promícháním a opakováním ředění do čerstvé jamky. Po konečném zředění bylo z každé jamky odebráno 30 μΙ, takže všechny jamky obsahovaly konečný objem 120 μΙ. Bylo provedeno celkem 5 takovýchto ředění (celkem 4 jamky). Destičky byly inkubovány 1 h při 37 °C. Po této inkubaci byly sériově ředěné vzorky dekantovány a jamky byly třikrát promyty s použitím PBS s obsahem 0,5 % Tween 20 (PBST) a pak dvakrát po 5 min promyty s použitím BBS-Tween a nakonec třikrát s použitím PBST. Do každé jamky bylo přidáno 100 μΙ sekundární protilátky ve zředění 1/1000 [králičí anti-kuřecí IgG alkalická fosfatasa (Sigma) zředěná v blokujícím roztoku s obsahem 0,5 % Tween 20] a destička byla inkubována 1 h při 37 °C. Roztoky konjugátu byly dekantovány a destičky byly promyty 6krát v PBST, pak jednou v 50 mM Na₂CO₃, 10 mM MgCI₂, pH 9,5. Destičky byly vyvíjeny přídavkem 100 μΙ roztoku obsahujícího 1 mg/ml p-nitrofenylfosfátu (Sigma), rozpuštěného v 50 mM Na₂CO₃, 10 mM MgCI₂, pH 9,5, do každé jamky. Pak byly destičky inkubovány v temnu při teplotě místnosti po dobu 5 až 45 min. Byla měřena absorbance každé jamky při 410 nm pomocí přístroje Dynatech MR 700.

Jak vyplývá z výsledků afinitní chromatografie, čištěním preparátů CTB na sloupci pMB1750-1970 byla odstraněna veškerá reaktivita vůči proteinu pMB19702360. Reciproční čištění preparátu CTB, který byl čištěn na sloupci pMB1970-2360 nevedlo k navázání protilátky při chromatografování na sloupci pMB1750-1970. Z těchto výsledků vyplývá, že všechny opakující se reaktivní protilátky ve skupině polyklonálních CTB rozpoznávají zachovanou strukturu, která je přítomna v nepřekrývajících se repeticích. I když je možné, že tato zachovaná struktura představuje vzácné zachované lineární epitopy, zdá se pravděpodobnější, že

149

neutralizující protilátky rozpoznávají specifickou konformaci proteinu. Tento závěr vyplývá také z výsledků analýzy reaktivity CTB těchto rekombinačních proteinů pomocí hybridizace Westernových blotú.

Westernové bloty gelů 7,5% SDS-PAGE s naneseným definovaným množstvím každého rekombinačního proteinu, podrobeným elektroforéze, byly sondovány s preparáty polyklonální protilátky CTB. Bloty byly připraveny a vyvíjeny s alkalickou fosfatasou, jak je popsáno v příkladu 3. Výsledky jsou uvedeny na obr.

24.

Obr. 24 zobrazuje porovnání imunoreaktivity protilátky IgY, vytvořené proti buď nativnímu nebo rekombinačnímu antigenu toxinu B. Bylo naneseno duplicitně stejné množství proteinů pMB1750-1970 (pruh 1), pMB1970-2360 (pruh 2), pPB1850-2360 (pruh 3) a sériové ředění proteinu pPB1750-2360 (pruhy 4 až 6, obsahující ředění 1x, 1/10x a 1/11x) a vyvíjeno na gelu 7,5% SDS-PAGE. Každá polovina blotu byla hybridizována s protilátkami IgY, preparovanými PEG, z kuřat imunizovaných buď nativním CTB nebo proteinem pPB1750-2360. Je nutno upozornit, že protein pMB1750-1970 plné délky byl identifikován pouze protilátkami reaktivním vůči rekombinačnímu proteinu (šipky).

Přestože preparát CTB reaguje s proteiny pPB1750-2360, pPB1850-2360 a pMB1970-2360, nebyla pozorována reaktivita vůči proteinu pMB1750-1970 (obr. 24). Vzhledem ktomu, že všechny protilátky reaktivní s repeticemi mohou být tímto proteinem navázány během afinitní chromatografie, naznačuje tento výsledek, že tento protein se nemůže na Westernových blotech správně skládat. Protože je takto eliminována veškerá reaktivita s protilátkami, je nepravděpodobné, že protilátky reaktivní s repeticemi v preparátu CTB rozpoznávají lineární epitopy. To může naznačovat, že pro vyvolání ochranných protilátek bude nutno, aby se rekombinační protein toxinu B správně skládal.

150

c) Tvorba a hodnocení protilátek reaktivních s rekombinačnimi polypeptidy toxinu B

i) Tvorba protilátek reaktivních s rekombinačnimi proteiny toxinu B

Protilátky proti rekombinačním proteinům byly vytvořeny v leghornských nosnicích, jak je popsáno v příkladu 13. Tvorba protilátek byla vyvolána [s použitím Freundova adjuvans (Gibco), není-li uvedeno jinak] proti těmto rekombinačním proteinům: 1) směs proteinů intervalu 1+2 (viz obr. 18), 2) směs proteinů intervalu 4 a 5 (vit obr. 18), 3) protein pMB1970-2360, 4) protein pPB1750-2360, 5) pMB17502360, 6) pMB1750-2360 [adjuvans Titermax (Vaxcell)], 7) pMB1750-2360 [Gerbu adjuvans (Biotech)], 8) protein pMBpl750-2360, 9) pPB1850-2360 a 10) pMB18502360.

Kuřatům byly podány alespoň 3 posilovači dávky rekombinačního proteinu, dokud nebyla reaktivita ELISA [postupem popsaným v odstavci (b), avšak s výjimkou, že destičky byly pokryty proteinem pPB1750-2360] polyklonálních preparátů PEG alespoň rovná reaktivitě PEG preparátu polyklonální protilátky CTB. Pro PEG preparáty ze všech výše uvedených imunogenů byly stanoveny titry ELISA a bylo zjištěno, že jsou porovnatelné a leží v rozmezí od 1:12500 do 1:62500. Ve všech případech bylo dosaženo vysokých titrů s výjimkou 6) pMB1750-2360, kdy nebyly pozorovány silné titry s použitím adjuvans Titermax, a tento preparát nebyl dále testován.

ii) Hodnocení protilátek reaktivních s rekombinačnimi proteiny Westernovou hybridizací

Westernový bloty gelů 7,5% SDS-PAGE s nánosem definovaného množství rekombinačního proteinu, podrobeného elektroforéze (proteiny pMB1750-1970, pPB1850-2360 a pMB1970-2360 a sériové ředění pPB1750-2360 pro umožnění kvantifikace reaktivity), byly sondovány s preparáty polyklonálních protilátek CTB, pPB1750-2360, pMB1750-2360 a pMB1970-2360 (z kuřat imunizovaných s použitím Freundova adjuvans). Bloty byly připraveny a vyvíjeny alkalickou fosfatasou, jak je popsáno v odstavci b).

151 • · • ·

Jak je znázorněno na obr. 24, preparáty CTB a pMB1970-2360 silně reagovaly s proteiny pPB1750-2360, pPB1850-2360 a pMB1970-2360, zatímco preparáty pPB1750-2360 a pMB1970-2360 (Gerbu) reagovaly silně se všemi čtyřmi proteiny. Reaktivita Westernových blotů preparátů pPB1750-2360 a pMB1970-2360 (Gerbu) byla ekvivalentní preparátu CTB, zatímco reaktivita preparátu pMB1970-2360 byla méně než 10 % reaktivity preparátu CTB. Navzdory ekvivalentním reaktivitám ELISA byla u PEG preparátů z dvou nezávislých skupin imunizovaných proteinem pMB1750-2360 a jedné skupiny imunizované preparátem pMB1750-2360 s použitím Freundova adjuvans pozorována pouze slabá reaktivita (přibližně 1 %) vůči rekombinačním proteinům.

Ke zjištění, zda tento rozdíl imunoreaktivity podle analýzy Westernovým blotem odráží různé titry protilátek, bylo použito afinitní čištění. Na afinitní koloně pPB1750-2360 z odstavce b) bylo popsaným způsobem chromatografováno 50 ml Ex preparátů PEG z kuřat imunizovaných bud proteinem pMB1750-2360 nebo pMB1970-2360. Výtěžek afinitně čištěné protilátky (% celkového proteinu v preparátu( byl ekvivalentní výtěžku získanému z PEG preparátu CTB v odstavci b). Rozdíly westernové reaktivity tedy odrážejí kvalitativní rozdíl skupin protilátek spíše než kvantitativní rozdíly. Z těchto výsledků vyplývá, že určité rekombinační proteiny jsou při vytváření vysoce afinitních protilátek účinnější (testováno hybridizací Westernových blotů).

iii) Neutralizace toxinů B in vivo s použitím protilátek reaktivních s rekombinačním proteinem

K hodnocení schopnosti neutralizace protilátek, vytvořených proti rekombinačním proteinům toxinů B, byl použit křeččí model in vivo [popsaný v příkladech 9 a 14(b)]. Výsledky tří pokusů jsou uvedeny dále v tabulkách 27 až 29.

Byla kompilována schopnost každého imunogenu neutralizovat toxin B in vivo a hodnoty jsou uvedeny v tabulce 30. jak vyplývá ze studií premixu rekombinační protein-CTB (tabulka 24), ochrannou schopnost mají pouze protilátky k intervalu 3 (1750-2366) a nikoli k jiným oblastem toxinů B (tj. intervalům 1 až 5). Neočekávané je zjištění, že protilátky vytvořené proti oblasti INT-3, exprimované ve vektoru pMAL

152

(pMB1750-2360 a pMB1750-2360) s pomocí Freundova adjuvans, nemají neutralizační schopnost. Toto zjištění je reprodukovatelné, protože nebyla pozorována neutralizace během dvou nezávislých imunizací pMB1750-2360 a jedné imunizace pMpB1750-2360. Skutečnost, že pětinásobné množství afinitně čištěných specifických protilátek pro repetice toxinu B z preparátů pMB1750-2360 PEG nemůže toxin B neutralizovat, zatímco jednonásobné množství afinitně čištěných protilátek anti-CTB jej neutralizovat může (tabulka 28), dokazuje, že rozdílná schopnost protilátek CTB neutralizovat toxin B je důsledkem spíše kvalitativních než kvantitativních rozdílů mezi těmito preparáty protilátek. Neutralizující protilátky se vytvořily pouze pokud byla tato oblast exprimována v alternativním vektoru (pPB1750-2360) nebo s použitím alternativního adjuvans pro protein pMB1750-2360. Významné je, že protilátky vytvořené s použitím Freundova adjuvans kpPB18502360, který obsahuje fragment, který je pouze o 100 aminokyselin menší než rekombinační pPB1750-2360, nejsou schopny neutralizovat toxin B in vivo (tabulka 27); je nutno rovněž upozornit, že pro pPB1850-2360 a pPB1750-2360 byl použit týž vektor.

Tabulka 27. Neutralizace toxinu B in vivo

skupina3	počet živých zvířatb	počet mrtvých zvířatb
preimunní	0	5
CTB	5	0
INT 1+2	0	5
INT 4+5	0	5
pMB1750-2360	0	5
pMB1970-2360	0	5
pPB 1750-2360	5	0

K protilátce se přidá toxin B C. difficile (CTB) (Tech Lab; v koncentraci 5 pg/ml, celkově 25 pg) v koncentraci letální pro křečky a inkubuje se 1 h při 37 °C. Po inkubaci se tato směs intraperitoneálně (IP) aplikuje křečkům. Každá skupina

153 • » ··>

·· ·· ··· ···· ···· • · · · · · · · · · · · • ·· ··· · · · · · · · · ···· · · · ··· ·· ·· I·· ·· ·· dostávala toxin, předem smísený s protilátkou, vytvořenou proti uvedenému proteinu, jako 4X prep PEG protilátky.

Počty v každé skupině představují počty živých nebo mrtvých křečků po 2 h po IP podání směsi toxin/protilátka.

Tabulka 28. Neutralizace toxinu B afinitně čištěnými protilátkami

skupina3	počet živých zvířatb	počet mrtvých zvířat0
preimunní(l)	0	5
CTB(1)	5	0
pPB1750-2360(1)	5	0
1,5 mg anti-pMB1750-2360 (2)	1	4
1,5 mg anti-pMB1970-2360(2)	0	5
300 pg anti-CTB (2)	5	0

K protilátce se přidá toxin B C. difficile (CTB) (Tech Lab; v koncentraci 5 pg/ml, celkově 25 pg) v koncentraci letální pro křečky a inkubuje se 1 h při 37 °C. Po inkubaci se 1 ml této směsi intraperitoneálně (IP) aplikuje křečkům. Každá skupina dostávala toxin, předem smísený s protilátkou, vytvořenou proti uvedenému proteinu, tj. buď (1) 4X prep PEG protilátky nebo (2) afinitně čištěnou protilátku (na pryskyřici pPB1750-2360), buď 1,5 mg/skupinu (antipMB1750-2360 a anti-pMB1970-2360; použita neředěná afinitně čištěná protilátka) nebo 350 pg/skupinu (anti-CTB, specifická pro repetici; použita protilátka anti-CTB ředěná 1/5).

Počty v každé skupině představuje počty mrtvých nebo živých křečků 2 h po IP podání směsi toxin/protilátka.

Tabulka 29. Tvorba neutralizujících protilátek s použitím Gerbuho adjuvans

skupina3	počet živých zvířatb	počet mrtvých zvířatb
preimunní	0	5
CTB	5	0

154 ·· ·· • » • · • · • * · • · ··· • · · · · • · · · ·« ·· ·· • ·· ·· ·· · · · · • · · ·· • · «··· · • ♦ · · ··» ·· ··

pMB1970-2360	0	5
pMB1850-2360	0	5
pPB1850-2360	0	5
pMB1750-2360 (Gerbu adj.)	5	0

K protilátce se přidá toxin B C. difficile (CTB) (Tech Lab) v koncentraci letální pro křečky a inkubuje se 1 h při 37 °C. Po inkubaci se tato směs intraperitoneálně (IP) aplikuje křečkům. Každá skupina dostávala toxin, předem smísený s protilátkou, vytvořenou proti uvedenému proteinu jako 4X prep PEG protilátky.

Počty v každé skupině představují počty živých nebo mrtvých křečků po 2 h po IP podání směsi toxin/protílátka.

Tabulka 30. Neutralizace toxinu B in vivo

imunogen	adjuvans	testovaný preparát3	antigen použitý pro AP	neutralizace in vivob
preimunní	NA1	PEG	NA	ne
CTB (nativní)	Titermax	PEG	NA	ano
CTB (nativní)	Titermax	AP	pPB1750-2360	ano
CTB (nativní)	Titermax	AP	pPB1850-2360	ano
CTB (nativní)	Titermax	AP	pPB1750-1970	ano
CTB (nativní)	Titermax	AP	pPB 1970-2360	ano
pMB1750-2360	Freund	PEG	NA	ne
pMB1750-2360	Freund	AP	pPB1750-2360	ne
pMB1750-2360	Gerbu	PEG	NA	ano
pMB1970-2360	Freund	PEG	NA	ne
pMB1970-2360	Freund	AP	pPB1750-2360	ne
pPB1750-2360	Freund	PEG	NA	ano
pPB1850-2360	Freund	PEG	NA	ne
pMB1850-2360	Freund	PEG	NA	ne

155

INT 1+2	Freund	PEG	NA	ne
INT 4+5	Freund	PEG	NA	ne

³ Buď preparát PEG (PEG) nebo afinitně čištěné protilátky (AP).

^b „Ano“ označuje úplnou neutralizaci (0/5 mrtvých), a „ne“ označuje žádnou neutralizaci (5/5 mrtvých) toxinu B po 2 h po podání směsi.

¹ „NA“ znamená „nepoužito“.

Skupina protilátek pPB1750-2360 poskytuje výraznou ochranu in vivo, ekvivalentní jako v případě afinitně čištěných protilátek CTB. Koreluje to s pozorovanou vysokou afinitou této skupiny protilátek (oproti skupině pMB17502360 nebo pMB1970-2360) podle výsledků Western blot analýzy (obr. 24). Tyto výsledky představují první důkaz toho, že protilátky neutralizující in vivo mohou být indukovány pomocí rekombinačního proteinu toxinu B jako imunogenu.

L V ‘.J i 5 ! ί !

DOl auiuvan použitím Gerbuho adjuvaňs a proteinu nMSI 750-2360 vzniká neutralizující odpověď, dokazuje, že pro indukci neutralizujících protilátek je nutná konformace nebo prezentace tohoto proteinu. Tyto výsledky jsou konzistentní se zjištěním, že se zdá, že neutralizující protiiátky, produkované s použitím CTB jako imunogenu rozpoznávají konformační epitopy [viz výše odstavec (b)j. Jedná se o první důkaz toho, že konformace nebo prezentace rekombinačního toxinu B je nezbytná pro vznik vysokých titrů neutralizujících protilátek.

Příklad 20

Stanovení kvantitativních a kvalitativních rozdílů mezi preparáty pMB1750-2360, pMB1750-2360 (Gerbu) a polyklonálntch protilátek pPB1750 IgY

V příkladu 19 bylo demonstrováno, že tvorbu neutralizujících protilátek toxinu B je možno vyvolat pomocí specifických rekombinačních proteinů toxinu B (pPB1750156

2360) nebo specifických adjuvans. Protilátky vytvořené proti pMB1750-2360 byly schopny neutralizovat enterotoxický účinek toxinu B, jestliže byl k imunizaci slepic použit rekombinační protein ve spojení s Gerbuho adjuvans, ale nikoli při použití Freundova adjuvans. Pro zjištění důvodu těchto omezení ohledně antigenu a adjuvans byly afinitní chromatografií izolovány protilátky, specifické pro toxin B, přítomné v neutralizujících a neneutralizujících preparátech PEG, a testovány na kvalitativní nebo kvantitativní rozdíly. Příklad zahrnoval: a) čištění specifických protilátek anti-toxin B z PEG preparátů pMB1750-2360 a pPB1750-2360 a b) neutralizaci toxinu B s použitím afinitně čištěné protilátky in vivo.

a) Čištění specifických protilátek z PEG preparátů pMB1750-2360 a pPB17502360

Za účelem čištění a stanovení koncentrace specifických protilátek (vyjadřované jako procento celkové protilátky) v PEG preparátech pPB1750-2360 (Freund a Gerbu) a pPB1750-2330 bylo definovaná množství těchto preparátů chromatografováno na afinitní koloně obsahující celou repetiční oblast toxinu B (pPB i 750-2360). Pak bylo kvantifikováno množství afinitně čištěné protilátky.

Afinitní kolona, obsahující rekombinační repetiční protein toxinu B, pPB17502360, byla získána tímto způsobem: 4 ml pryskyřice Actigel (Sterogene), promyté pomocí PBS, byly v 15m! zkumavce (Falcon), obsahující 1/10 konečnélio objemu kondenzačního roztoku Aid (1M kyanoborohydridu sodného) kondenzovány s 5 mg afinitně čištěného proteinu pPB1750-2360 (dialyzovaného do PBS; podle odhadu jej tvoří více než 95 % plné délky fúzního proteinu). Alikvoty supernatantu z kondenzačních reakcí před a po kondenzaci byly hodnoceny barvením gelů SDSPAGE 7,5% pomocí Coomassie. Podle intenzit proteinových pásů bylo na pryskyřici navázáno více než 95 % (přibližně 5 mg) rekombinačního proteinu. Pryskyřice s navázaným proteinem byla nalita na 10 ml sloupce (BioRad), promyta intenzivně PBS, preeluována 4M guanidin-HCI (v 10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 0,005 % thimerosal), reekvilibrována v PBS a uchovávána při 4 °C.

Alikvoty preparátů pMB1750-2360, pMB1750-2360 (Gerbu) nebo polyklonální protilátky IgY pPB1750-2360 (preparáty PEG) byly na výše uvedené koloně afinitně

157 • ··· čištěny tímto způsobem: Kolona byla připojena k monitoru UV (ISCO) a promyta PBS. Byly použity 40ml alikvoty preparátů 2x PEG (před chromatografíi sterilně filtrovaných s použitím filtru 0,45 pm a kvantifikovaných pomocí OD₂₈₀). Kolona byla promývána PBS do znovuobnovení základní hodnoty (průtok byl uschován), promyta BBS-Tween pro vymytí nespecificky se vážících protilátek a reekvilibrována PBS. Navázaná protilátka byla z kolony eluovány v 4M guanidin-HCI (v 10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 0,005 % thimerosal) a celý eluční pík byl shromážděn v 15ml zkumavce (Falcon). Kolona byla reekvilibrována, a eluát z kolony byl rechromatografován výše uvedeným postupem. Preparáty protilátek byly kvantifikovány pomocí UV absorbance (k vynulování spektrofotometru byl použit eluční pufr). Po eluci prvního průchodu chromatografíi byly získány přibližně 10násobně vyšší koncentrace celkové čištěné protilátky vzhledem ke druhému průchodu. Nízký výtěžek z druhého průchodu chromatografíi ukazoval, že během prvního průchodu byla odstraněna většina specifických protilátek.

Pro preparáty pMB1750-2360, pMB 1750-2350 (Gerou) nebo poíyldonámí protilátky IgY pPB1750-2360 byly dialýzou eiuátů z kolony po prvním průchodu připraveny skupiny afinitně čištěnýsh protilátek. Eiuáty byl jímány na ledu a ihned diaiyzovány po dobu 2 h při 4 °C proti 100násobnému objemu PBS. Vzorky byly pak dialyzovány při 4 °C proti 3 dávkám 65riásobného objemu PBS. Dialýza byla prováděna s jednou dávkou PBS minimálně 8 h. Dialyzované vzorky byly shromážděny, odstředěny pro odstranění nerozpustných zbytků, kvantifikovány pomocí OD₂₃₀ a uchovávány při 4 °C.

Procentický podíl protilátek, specifických pro repetici toxinů B, přítomných v každém preparátu, byl stanoven pomocí kvantifikace výtěžků protilátek z prvního průchodu kolonou (množství specifické protilátky získané po prvním průchodu/ceikový nanesený protein). Výtěžek afinitně čištěné protilátky, specifické pro repetici (vyjádřený jako procentický podíl celkového proteinu v preparátu) v 1) PEG preparátu pMB 1750-2360 byl přibližně 0,5 %, 2) preparátu pMB 1750-2360 (Gerbu) byl přibližně 2,3 % a 3) preparátu pPB1750-2360 byl přibližně 0,4 %. Čištění preparátu polyklonálních protilátek IgY CTB na stejné koloně prokázalo, že koncentrace protilátek specifických pro repetici toxinů B v preparátu CTB je 0,35 %.

158

	·»· ··	......-· · .....- «	... e>--
•	•	•	•	• ·	• · ·
•	• · · '	•	•		» · · ·
•	» ·	• ·	•		• · · · ·
•	• ·	•	•		• ·

Tyto výsledky ukazují, že 1) použití Gerbuho adjuvans zvýšilo titr specifické protilátky, produkované proti proteinu pMB1750-2360, pětinásobně oproti imunizaci s použitím Freundova adjuvans a 2) rozdíly pozorované v neutralizační schopnosti in vivo u PEG preparátů pMB1750-2360 (neneutralizující) a pPB1750-2360 (neutralizující) a CTB (neutralizující) v příkladu 19, nejsou důsledkem rozdílů titru specifických protilátek v těchto třech preparátech, protože titr protilátky specifické pro repetici byl pro všechny tři preparáty podobný; rozdílná schopnost těchto tří preparátů neutralizovat toxin B tedy musí odrážet kvalitativní rozdíly indukovaných protilátek, specifických pro repetici toxinů B. Pro potvrzení, že existují kvalitativní rozdíly mezi protilátkami vytvořenými ve slepicích, imunizovaných různými rekombinačními proteiny a/nebo s různými adjuvans bylo křečkům podáno stejné množství afinitně čištěných protilátek proti repetici toxinů B (aa1870-2360 toxinů B) z různých preparátů s použitím dále popsaného křeččího modelu in vivo.

—V

K hodnocení neutralizační schopnosti afinitně čištěných protilátek, vytvořených proti rekombinačnímu toxinů B, čištěných podle odstavce (a), byl použit křečci model in vivo. Stejně tak byl na neutralizaci in vivo testován 4X IgY PEG preparát z druhé nezávislé imunizace s použitím antigenu pPB1750-2360 s Freundovým adjuvans. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 31.

Tabulka 31. Neutralizace toxinů B in vivo s použitím afinitně čištěných protilátek

skupina3	počet živých zvířatb	počet mrtvých zvířaf
preimunní1	0	5
CTB (300 pg)2	5	0
CTB (100 pg)2	1	4
pMB1750-2360 (G) (5 mg)2	5	0
pMB1970-2360 (G)(1,5 mg)2	5	0
pMB 1970-2360 (G) (300 pg)2	5	0
pMB1970-2360 (F) (1,5 mg)2	0	5

v<*

159 • · · · · • · · · • · « · • · ·

pPB 1970-2360 (F) (1,5 mg)2	5	0
pPB1970-2360 (F) (300 pg)2	1	4
CTB (100 pg)3	2	3
pPB1970-2360 (F) (500 pg)1	5	0

K protilátce (je uvedeno množství konkrétní protilátky) se přidá toxin B C.

difficile (CTB) (Tech Lab) v koncentraci ietální pro křečky (25 pg) a inkubuje se h při 37 °C. Po inkubaci se tato směs IP aplikuje křečkům (1/5 celkové směsi na křečka). Každá skupina dostávala toxin, předem smísený s protilátkou, vytvořenou proti uvedenému proteinu (G = Gerbuho adjuvans, F = Freundovo adjuvans). ¹ 4X prep PEG IgY protilátky, ² afinitně čištěná protilátka na pryskyřici pPB1850-2360,³ 1X IgY PEG preparát.

^b Počty v každé skupině představují počty živých nebo mrtvých křečků po 2 h po

IP podání směsi toxin/protilátka.

Výsledky uvedené v tabulce 31 demonstrují, že

1) Jak je uvedeno v příkladu 19 a zde reprodukováno, 1,5 mg afinitně čištěné protilátky ze slepic, imunizovaných pMBI 750-2360 s použitím Freundova adjuvans toxin B in vivo neneutralizuje. 300 pg afinitně čištěné protilátky z podobně imunizovaných slepic s použitím Gerbuho adjuvans však vykázalo kompletní neutralizaci toxinu B in vivo. Z toho vyplývá, že Gerbuho adjuvans kromě toho, že zvyšuje titr protilátek reaktivních s antigenem pMB1750-2360 vzhledem k Freundovu adjuvans (demonstrováno v odstavci (a)), také zvyšuje výtěžek neutralizujících protilátek proti tomuto antigenu, a to více než 5násobně.

2) Kompletní neutralizace toxinu B in vivo byla pozorována s 1,5 mg afinitně čištěné protilátky ze slepic imunizovaných antigenem pPB1750-2360, ale nikoli s antigenem pMB1750-2360, bylo-li použito Freundovo adjuvans. Z toho vyplývá, že při použití standardizovaných koncentrací specifických protilátek k repetici toxinu B jsou indukovány neutralizující protilátky, použije-li se jako antigen s Freundovým adjuvans pPB1750-2360 a nikoli pMB1750-2360.

3) Kompletní neutralizace in vivo byla pozorována s použitím 300 pg protilátky pMB 1750-2360 (Gerbu), ale nikoli 300 pg protilátky pPB1750-2360 (Freund).

w · »· • · • · ·· • » 4 • · 4

160

Protilátka pMB1750-2360 (Gerbu) má tedy vyšší titr neutralizujících protilátek než protilátka pPB1750-2360 (Freund).

4) Kompletní neutralizace toxinu B byla pozorována při použití 300 pg) protilátky CTB [afinitně čištěné (AP)], ale nikoli 100 pg protilátky CTB (AP nebo PEG prep). Z toho vyplývá, že k neutralizaci 25 pg toxinu in vivo v tomto pokusu je třeba více než 100 pg protilátky specifické pro repetici toxinu B a že afinitně čištěné protilátky specifické pro repetiční interval toxinu B neutralizují toxin B stejně účinně jako PEG prep IgY získaný proti celému proteinu CTB (prokázáno v tomto pokusu).

5) Jak bylo pozorováno pro počáteční PEG preparát pPB1750-2360 (IgY) (příklad 19), úplná neutralizace byla pozorovány v případě PEG preparátu IgY izolovaného z druhé nezávislé skupiny slepic imunizovaných pPB1750-2360 (Freund). To ukazuje, že neutralizující protilátky jsou reprodukovatelně produkovány, jestliže jsou slepice imunizovány proteinem pPB1750-2360 s použitím Freundova adjuvans.

Diagnostická enzymová imunoanalýza na toxiny A a B C. difficile

Byla zkoumána schopnost rekombinačních toxinových proteinů a protilátek vytvořených proti těmto rekombinačním proteinům (popsaných ve výše uvedených příkladech) tvořit základ diagnostických analýz pro detekci klostridiálního toxinu ve vzorku. Pro kvantitativní detekci toxinu A a toxinu B C. difficile z biologického vzorku byly testovány dva formáty imunoanalýzy. První formát zahrnoval kompetitivní test, při němž bylo pevné množství rekombinačního toxinu A nebo B imobilizováno na pevném nosiči (například jamkách mikrotitrační destičky), načež byl přidán biologický vzorek s obsahem toxinu, smísený s afinitně čištěnými nebo PEG frakcionovanými protilátkami proti rekombinačnímu toxinu A nebo B. Je-li ve vzorku přítomen toxin, soutěží tento toxin s imobilizovaným rekombinačním toxinovým proteinem o vazbu na protilátku proti rekombinačnímu proteinu, čímž snižuje signál, získaný po přídavku

161 reporterového činidla. Reportérové činidlo detekuje přítomnost protilátky navázané na imobilizovaný toxinový protein.

Ve druhém formátu byla vyvinuta sendvičová imunoanalýza s použitím afinitně čištěných protilátek k rekombinačnímu toxinu A a B. Tyto afinitně čištěné protilátky k rekombinačnímu toxinu A a B byly použity k pokrytí mikrotitračních jamek místo rekombinačních polypeptidů (které byly použity v kompetitivním formátu testu). Do jamek pak byly přidány biologické vzorky obsahující toxin A nebo B a poté reportérové činidlo pro detekci přítomnosti navázaného toxinu v jamce.

a) Kompetitivní imunoanalýza pro detekci toxinu C. difficile

Rekombinační toxin A nebo B byl navázán na pevný nosič tak, že 96jamkové mikrotitrační destičky byly pokryty proteinem v koncentraci 1 gg/ml v PBS. Destičky byly inkubovány přes noc při 2 až 8 °C. Následující ráno byly povlékací roztoky odstraněny a zbyiá vazebná místa na jamkách byla blokována zaplněním každé jamky roztokem PBS obsahujícím 0,5 % BSA a 0,05 % Tween-20. Nativní toxin A nebo B C. difficile (Tech Lab) byl zředěn na 4 pg/mi extrakty stolice zdravých syrských křečků (Sasco). Extrakty stolice byly získány vložením fekálních pelet do 15ml odstředivkové zkumavky; bylo přidáno 2 ml PBS na peletu a zkumavka byla provířena pro vytvoření rovnoměrné suspenze. Pak byla zkumavka odstřeďována 5 min při teplotě místnosti rychlostí 2000 min'¹. Byl odebrán supernatant; ten obsahuje extrakt stolice. 50 μΙ extraktu křečci stolice bylo napipetováno do každé jamky mikrotitračních destiček, kde sloužilo jako ředidlo pro sériové ředění vzorků toxinu 4 pg/ml. Do první řady jamek mikrotitrační destičky bylo napipetováno 100 μΙ vzorků toxinu o koncentraci 4 pg/ml, načež byly odebrány alikvoty po 50 μΙ a na destičce směrem dolů sériově ředěny ve dvou exemplářích. Do příslušných jamek byl přidán stejný objem afinitně čištěných protilátek proti rekombinačnímu toxinu [pro detekci toxinu A bylo použito 1 ng/jamku protilátky anti-pMA1870-2680; pro detekci toxinu B bylo použito 0,5 ng/jamku anti-pMB1750-2360(Gerbu)j a destičky byly inkubovány za mírného míchání 2 h při teplotě místnosti. Jamky sloužící jako negativní kontrola obsahovaly protilátku, ale neobsahovaly nativní toxin, který by soutěžil o vazbu.

162

Nenavázaný toxin a protilátka byly odstraněny promytím destiček 3 až 5krát pomocí PBS obsahujícího 0,05 % Tween-20. Po promývacím stupni bylo do každé jamky přidáno 100 μΙ králičí anti-kuřecí protilátky IgG konjugované s alkalickou fosfatasou (Sigma) a destičky byly inkubovány 2 h při teplotě místnosti. Pak byly destičky pro odstranění nenavázané sekundární protilátky promyty stejným způsobem jako předtím. Do každé jamky byl přidán čerstvě připravený substrát alkalické fosfatasy (1 mg/ml p-nitrofeny!fosfátu (Sigma) v 50 mM Na₂CO₃, pH 9,5, 10 mM MgCI₂). Jakmile se vyvinulo dostatečné zbarvení, byly destičky odečteny na čtečce Dynatech MR700 s použitím filtru 410 nm.

Výsledky jsou shrnuty v tabulkách 32 a 33. V případě výsledků uvedených v tabulce 32 byly destičky pokryty rekombinačním proteinem toxinu A (pMA18702680). Je uvedeno množství nativního toxinu A (přítomného jako přídavek k solubilizované křeččí stolici) přidaného do dané jamky (0 až 200 ng). Protilátka vytvořená proti rekombinačnímu proteinu toxinu A, pMAl870-2680, byla afinitně čištěna na afinitní koloně obsahující pPA1870-2680 (popsané v příkladu 20). Jak js znázorněno v tabulce 32, může být rekombinační protein toxinu A a afinitně čištěný toxin použit pro základ kompetitivní imunoanalýzy pro detekci toxinu A v biologických vzorcích.

Podobné výsledky byly získány s použitím rekombinačního toxinu B, pPB1750-2360 a protilátek vytvořených proti pMB1750-2360(Gerbu). V případě výsledků uvedených v tabulce 33 byly jamky pokryty rekombinačním proteinem toxinu B (pPB1750-2360). Je uvedeno množství nativního toxinu B (přítomného jako přídavek k solubilizované křeččí stolici), přidaného k dané jamce (0 až 20 ng). Protilátka vytvořená proti rekombinačnímu proteinu toxinu B, pMB1750-2360(Gerbu), byla afinitně čištěna na afinitní koloně obsahující pPB1850-2360 (popsané v příkladu 20). Jak je znázorněno v tabulce 33, může být rekombinační protein toxinu B a afinitně čištěný antitoxin použit jako základ kompetitivní imunoanalýzy pro detekci toxinu B v biologických vzorcích.

V tomto kompetitivním testu je redukce považována za významnou ve všech bodech nad pozadím; tento test může být proto použit k detekci vzorků obsahujících méně než 12,5 ng toxinu A/jamku a pouze 50 až 100 ng toxinu B/jamku.

163

Tabulka 32. Kompetitivní inhibice anti-C. difficile toxinu A nativním toxinem A

ng toxinu A/jamku	odečtená hodnota OD410
200	0,176
100	0,253
50	0,240
25	0,259
12,5	0,309
6,25	0,367
3,125	0,417
0	0,590

Tabulka 33. Kompetitivní inhibice anti-C. difficile toxinu B nativním toxinem B

ng toxinu B/jamku	odečtená hodnota OD410
200	0,392
100	0,566
50	0,607
25	0,778
12,5	0,970
6,25	0,902
3,125	1,040
0	1,055

Tyto kompetitivní testy inhibice prokazují, že nativní toxiny C. difficile a rekombinační proteiny toxinu C. difficile mohou soutěžit o vazbu na protilátky, vytvořené proti rekombinačním toxinům C. difficile, což dokazuje, že tyto protilátky proti rekombinačnímu toxinu poskytují účinná diagnostická činidla.

ητ

164

b) Sendvičová imunoanalýza pro detekci toxinu C. difficile

Afinitně čištěné protilátky proti rekombinačnímu toxinu A nebo toxinu B byly imobilizovány na 96jamkových mikrotitračních destičkách tímto způsobem: Jamky byly pasivně pokryty přes noc při 4 °C afinitně čištěnými protilátkami vytvořenými proti buď pMA1870-2680 (toxin A) nebo pMB1750-2360(Gerbu) (toxin B). Protilátky byly afinitně čištěny způsobem popsaným v příkladu 20. Protilátky byly použity v koncentraci 1 pg/ml a do každé mikrotitrační jamky bylo přidáno 100 μΙ. Jamky pak byly blokovány 200 μΙ 0,5% BSA v PBS po dobu 2 h při teplotě místnosti, načež byl blokovací roztok dekantován. Vzorky stolice od zdravých syrských křečků byly resuspendovány v PBS, pH 7,4 (k resuspendování pelet bylo použito 2 ml PBS/peletu stolice a vzorek byl odstřeďován výše popsaným způsobem). Do suspenze stolice pak byl v koncentraci 4 pg/ml přidán nativní toxin A nebo B C.

difficile (Tech Lab). Suspenze stolice s obsahem toxinu (buď toxinu A nebo toxinu B) pak byly ve dvou exemplářích sériově ředěny suspenzí stolice bez toxinu a do pokrytých obsahující mikrotitračních jamek bylo ve dvou suspenzi stolice bez toxinu sloužily je exemplářích přidáno 50 μί. Jamky :o negativní kontrola.

Destičky byly inkubovány 2 h při teplotě místnosti a pak byly promyty třikrát PBS. Do každé jamky bylo přidáno 100 μΙ buď kozího anti-nativního toxinu A nebo kozího anti-nativního toxinu B (Tech Lab), zředěného 1:1000 v PBS s obsahem 1 % BSA a 0,05 % Tween 20. Destičky byly inkubovány další 2 h při teplotě místnosti. Pak byly destičky promyty stejně jako předtím a bylo přidáno 100 μ! králičího antikozího IgG konjugovaného s alkalickou fosfatasou (Cappel, Durham, N.C.) ve zředění 1:1000. Destičky byly inkubovány další 2 h při teplotě místnosti. Pak byly destičky promyty stejně jako předtím a pak vyvíjeny přídavkem 100 μΙ/jamku roztoku substrátu s obsahem 1 mg/m! p-nitrofenylfosfátu (Sigma) v 50 mM Na₂CO₃, pH 9,5, 10 mM MgCI₂. Pomocí čtečky (Dynatech) byla měřena absorbance každé jamky při 410 nm. Výsledky testu jsou uvedeny v tabulkách 34 a 35.

165

Tabulka 34. Detekce toxinu A C. difficile ve stolici s použitím afinitně čištěných protilátek proti toxinu A

ng toxinu A/jamku	odečtená hodnota OD410
200	0,9
100	0,8
50	0,73
25	0,71
12,5	0,59
6,25	0,421
0	0

Tabulka 35. Detekce toxinu B C. difficile ve stolici s použitím afinitně čištěných protilátek proti toxinu B

ng toxinu B/jamku	odečtená hodnota OD410
200	1,2
100	0,973
50	0,887
25	0,846
12,5	0,651
6,25	0,431
0	0,004

Výsledky uvedené v tabulkách 34 a 35 ukazují, že protilátky vytvořené proti rekombinačním fragmentům toxinu A a toxinu B mohou být použity k detekci přítomnosti toxinu C. difficile ve vzorcích stolice. Tyto protilátky tvoří základ pro citlivou sendvičovou imunoanalýzu, která je schopna detekovat až pouze 6,25 ng toxinu A nebo B v 50 μΙ vzorku stolice. Jak je patrné z tabulek 34 a 35, je pozadí pro tuto sendvičovou imunoanalýzu extrémně nízké;, proto je citlivost tohoto testu mnohem nižší než 6,25 ng toxinu/jamku. Je pravděpodobné, že by tímto testem bylo možno detekovat hladiny toxinu 0,5 až 1,0 pg/jamku.

166

Výsledky uvedené v tabulkách 32 až 35 prokazují zřejmou použitelnost rekombinačních činidel v detekčních systémech pro toxin C. difficile.

Příklad 22

Konstrukce a exprese fúzních proteinů fragmentu C C. botulinum

Byl klonován a sekvenován neurotoxinový gen typu A C. botulinum [Thompson a d., Eur. J. Biochem. 189:73(1990)]. Nukleotidová sekvence tohoto toxinového genu je k dispozici v bankách sekvenčních dat EMBL/GenBank pod přírůstkovým číslem X52066; nukleotidová sekvence kódující oblasti je uvedena jako SEQ ID NO:27. Aminokyselinová sekvence neurotoxinu typu A C. botulinum je uvedena jako SEQ ID NO:28. Neurotoxinový gen typu A je syntetizován jako jednoduchý polypeptidový řetězec, který je zpracován za vzniku dimeru, složeného z lehkého a těžkého řetězce, které jsou spojeny disulfidickými vazbami. Karboxyterminální část těžkého řetězce 50 kD se označuje jako fragment C nebo doména H_c.

Předchozí pokusy jiných pracovníků exprimovat polypeptidy zahrnující fragment C toxinu typu A C. botulinum jako nativní polypeptid (například nikoli jako fúzní protein) v E. coli byly neúspěšné [H.F. LaPenotiere a d., in Botulinum and Tetanus Neurotoxins, ed. DasGupta, Plenům Press, New York (1993), str. 463-466). Bylo popsáno, že exprese fragmentu C jako fúze s MBP E. coli vede k produkci nerozpustného proteinu (H.F. LaPenotiere a d., viz výše).

Za účelem produkce rozpustných rekombinačních proteinů fragmentu C v E. coli byly konstruovány fúzní proteiny obsahující syntetický gen fragmentu C, odvozený od toxinu typu A C. botulinum, a buď část proteinu toxinu C. botulinum nebo MBP. Tento příklad zahrnoval: a) konstrukci plasmidů kódujících fúzní proteiny fragmentu C a b) expresi fúzních proteinů fragmentu C. botulinum v E. coli.

i

167

a) Konstrukce plasmidů kódujících fúzní proteiny fragmentu C

V příkladu 11 bylo demonstrováno, že je možno účinně exprimovat a čistit v E. coli repetiční doménu toxinu A C. difficile buď jako nativní (exprese ve vektoru pET 23a v klonu pPA1870-2680) nebo fúzní (exprese ve vektoru pMALc jako fúze s MBP E. coli v klonu pMA1870-2680) protein. Byly konstruovány fúzní proteiny obsahující fúzi mezi MBP, částmi repetiční domény toxinu A C. difficile (ukázalo se, že je exprimována jako rozpustný fúzní protein) a fragmentem C toxinu typu A C. botulinum. Byl také konstruován fúzní protein obsahující fragment C toxinu typu A C. botulinum a MBP.

Obr. 25 poskytuje schematické znázornění botuiinálních fúzních proteinů spolu s donorovými konstrukty obsahujícím sekvence toxinu A C. difficile nebo sekvence fragmentu C C. botulinum, které byly použity k vytvoření botuiinálních fúzních proteinů. Plné čtverečky na obr. 25 představují sekvence genu toxinu A C. difficiie, prázdné čtverečky představují sekvence fragmentu C C. botulinum a plné černé oválky představují MBP E. coli. Je-li název restrikčnihe enzymu uveden v závorce, znamená to, že restrikční místo bylo během konstrukce zničeno. Hvězdička u názvu restrikčnihe enzymu znamená, že toto restrikční místo bylo na klonovacim spoji obnoveno.

Na obr, 25 je znázorněna restrikční mapa konstruktů pMA1870-2680 a pPA1100-2680 (popsaných v příkladu 11), které obsahují sekvence odvozené od repetiční domény toxinu A C. difficile', tyto konstrukty byly použity jako zdroj sekvencí genu toxinu A C. difficile pro konstrukci plasmidů kódujících fúze mezi genem fragmentu C C. botulinum a genem toxinu A C. difficile. Expresní konstrukt pMA18702680 exprimuje vysokou hladinu rozpustného intaktního fúzního proteinu (20 mg/l kultury), který může být afinitně čištěn na amylózové koloně (čištění popsáno v příkladu 11d).

Jako zdroj sekvencí genu fragmentu C C. botulinum pro botulinální fúzní proteiny byl použit konstrukt pAlterBot (obr. 25). pAlterBot byl získán od J. Middlebrooka a R. Lemley na ministerstvu obrany USA. pAterBot obsahuje syntetický fragment C C. botulinum, vložený do vektoru pALTER-1® (Promega). Tento syntetický gen fragmentu C kóduje stejné aminokyseliny jako přirozeně se vyskytující

168 • ť ·· gen fragmentu C. Sekvence přirozeně se vyskytujícího fragmentu C jsou jako většina klostridiálních genů extrémně bohaté na A/T (Thompson a d., viz výše). Tento vysoký obsah A/T způsobuje obtíže při expresi v E. coli a kvasinkách v důsledku změněné frekvence použití kodonů, resp. náhodných polyadenylačních míst. pro zlepšení exprese proteinů fragmentu C v E. coli byla vytvořena syntetická verze genu, v níž jsou neoblíbené kodony nahrazeny preferovanými kodony.

Nukleotidové sekvence sekvencí genu fragmentu C C. botulinum, obsažených v pAlterBot, je uvedena jako SEQ ID NO:22. Prvních šest nukleotidů (ATGGCT) kóduje methioninový, resp. alaninový zbytek. Tyto dvě aminokyseliny vznikly vložením sekvencí fragmentu C. botulinum do vektoru pALTER® a poskytují iniciační methioninový zbytek. Aminokyselinová sekvence fragmentu C C. botulinum, kódovaného sekvencemi obsaženými v pAlterBot, je uvedena jako SEQ ID NO:23. První dvě aminokyseliny (Met Ala) jsou kódovány sekvencemi odvozenými do vektoru. Počínaje třetím aminokyseiinovým zbytkem (Arg) je aminokyselinová sekvence identická jako v genu toxinu typu A C. botulinum.

Konstrukty pMA1870-2680, pPA1100-2680 a pAlterBot byly použity jako progenitorové plasmidy pro vytvoření expresních konstruktů, v nichž byly s použitím expresního vektoru pMAL-c (New England Biolabs) exprimovány fragmenty repetiční domény toxinu A C. difficile jako genetické fúze s genem fragmentu C C. botuíinum. Expresní vektor pMAL-c vytváří fúzní proteiny, které obsahují na aminoterminálním konci MBP. Byl konstruován konstrukt, pMBot, v němž by! gen fragmentu C C. botulinum exprimován jako fúze pouze s MBP (obr. 25). Exprese fúzního proteinu byla indukována z kmenů E. coli, obsahujících výše uvedené plasmidy, a indukovaný protein byl afinitně čištěn na sloupci amyiózové pryskyřice.

i) Konstrukce pBlueBot

Pro usnadnění klonování genu fragmentu C C. botulinum do určitého počtu požadovaných konstruktů byly sekvence botulinálního genu odebrány z pAlterBot a vloženy do plasmidu pBluescript (Stratagene) za vzniku pBluBot (obr. 25). pBlueBot byl konstruován tímto způsobem: Bakterie obsahující plasmid pAlterBot byly pěstovány v médiu obsahujícím tetracyklin a plasmidová DNA byla izolována pomocí

169

soupravy QIAprep-spin Plasmid Kit (Qiagen). 1 pg DNA pAlterBot byl štěpen Nco\ a vzniklý ustupující lepivý konec 3’ byl ztupen s použitím Klenowova fragmentu DNA polymerasy I (dále jen Klenowův fragment). DNA pAlterBot pak byla štěpena pomocí k uvolnění sekvencí botulinálního genu (insert Bot) jako tupý (s vyplněným místem Λ/col) fragment H/'ndlll. DNA vektoru pBluescript byla připravena štěpením

200 ng DNA pBluescript pomocí Smál a /-/mdlil. Produkty štěpení obou plasmidu byly rozděleny na agarózovém gelu. Příslušné fragmenty byly odděleny z gelu, smíseny a čištěny s použitím soupravy Prep-a-Gene kit (BioRad). Eluovaná DNA pak byla ligována pomocí T4 DNA ligasy a použita k transformaci kompetentních buněk DH5a (Gibco-BRL). Hostitelské buňky byl učiněny kompetentními pro transformaci s použitím postupu s chloridem vápenatým podle Sambrooka a d., viz výše, při 1,821,83. Rekombinační klony byly izolovány a potvrzeny restrikčním štěpením s použitím standardních technik rekombinační molekulární biologie (Sambrook a d., viz výše). Vzniklý klon pBlueBot obsahuje několik vhodných jednotlivých restrikčních míst obklopujících insert Bot (tj. sekvence fragmentu C C. botulínum, odvozené od pAlterBot), jak je znázorněno na obr. 25.

ii) Konstrukce fúzních proteinů C. difficile/C. botulinum/MQP

Konstrukty, kódující fúze mezi genem toxínu A C. difficile a genem fragmentu C C. boíuiinum a MBP, byly získány stejnými metodami rekombinace DNA, jaké jsou popsány výše; tyto proteiny obsahovaly různá množství repetiční domény toxínu A C. difficile.

Klon MABot obsahuje insert 2,4 kb, odvozený od genu toxínu A C. difficile, fúzovaného s insertem Bot (tj. sekvence fragmentu C C. botulínum, odvozené od pAlterBot). pMABot (obr. 25) byl konstruován smísením gelově čištěné DNA z pBlueBot štěpeného Not\/Hind\\\ (fragment Bot 1,2 kb), pPA1100-2680 štěpeného SpeVNotl (fragment repetice toxinů A C. difficile 2,4 kb) a vektoru pMAL-c štěpeného XbalíHindW. Rekombinační klony byly izolovány, potvrzeny restrikčním štěpením a čištěny s použitím soupravy QIAprep-spin Plasmid Kit (Qiagen). Tento klon exprimúje repetice toxinů A a sekvence botulinálního fragmentu C jako in-frame fúzi s MBP.

170

Konstrukt pMCABot obsahuje insert 1,0 kb, odvozený od genu toxinu A C. difficile, fúzovaného s insertem Bot (tj. sekvence fragmentu C C. botulinum, odvozené od pAlterBot). pMCABot byl konstruován štěpením klonu pMABot pomocí EcoRi k odstranění konce 5’ repetice toxinu A C. difficile (viz obr. 25; vektor pMAL-c obsahuje místo EcoRi 5’ vůči insertu C. difficile v klonu pMABot). Restrikční místa byla vyplněna a po gelovém čištění navzájem opět ligována. Vzniklý klon (pMCABot, obr. 25) vytvořil in-frame fúzi mezi MBP a zbývající 3’ částí repetiční domény toxinu A C. difficile fúzovanou s genem Bot.

Klon pMNABot obsahuje fragment Spe\ÍEcoR\ (vyplněný) 1 kb z repetiční domény toxinu A C. difficile (odvozený z klonu pPA1100-2680) a gen fragmentu C C. botulinum 1,2 kb jako fragment Nco\ (vyplněný)//7//7ďlll (odvozený z pAlterBot). Tyto dva fragmenty byly vloženy do vektoru pMAL-c štěpeného pomocí Xba\IHind\\\. Oba vkládané fragmenty byly vytvořeny štěpením příslušného plasmidu pomocí EcoRi (pPA1100-2680) nebo Nco\ (pAlterBot) s následným ošetřením Kienowovým fragmentem. Po ošetření Kienowovým fragmentem byly plasmidy štěpeny druhým enzymem (bud Spěl nebo HinďiW). Všechny th fragmenty byly gelově čištěny, smíseny a před ligací čištěny pomocí Prep-a-Gene. Po ligaci a transformaci byly předpokládané rekombinace analyzovány restrikční analýzou; bylo zjištěno, že na fúzním spoji bylo regenerováno místo EcoRi, jak bylo předpovězeno pro fúzi mezi vyplněným místem EcoRi a Nco\.

Byl konstruován konstrukt kódující fúzní protein mezi genem boíulinálního fragmentu C a genem MBP (tj. v této fúzi chybějí veškeré sekvence genu toxinu A C. difficile) a označen pMBot. Konstrukt pMBot byl získán odstraněním sekvencí toxinu A C. difficile z konstruktu pMABot a fúzí sekvencí genu fragmentu C s MBP. Bylo to provedeno štěpením DNA pMABot pomoci Stu\ (umístěno v polylinkeru pMALc 5’ vůči místu Xbal) a Xbal (umístěno na fúzním spoji toxA-Bot 3’ vůči místu Nofí), vyplněním místa Xbal pomocí Klenowova fragmentu, gelovým čištěním požadovaného restrikčního fragmentu a ligací tupých konců za vzniku kruhového plasmidu. Po ligaci a transformaci byly předpokládané rekombinanty analyzovány restrikčním mapováním insertu Bot (tj. sekvencí fragmentu C C. botulinum).

b) Exprese fúzních proteinů fragmentu C C. botulinum v E. coli

Ve větším měřítku (1 litr) byly vypěstovány kultury vektoru pMAL-c a každého rekombinačního konstruktu, popsaného výše v odstavci a), indukovány a izolovány frakce rozpustného proteinu způsobem popsaným v příkladu 18. Pro izolaci rekombinačního fúzního proteinu byly extrakty rozpustného proteinu chromatografovány na amylózových afinitních kolonách. Čištěné rekombinační fúzní proteiny byl analyzovány nanesením na gely SDS-PAGE s následným barvením Coomassie a popsanou analýzou Western blot [Williams a d. (1994), viz výše]. Stručně řečeno byly připraveny extrakty a chromatografovány v kolonovém pufru (10 mM NaPO₄, 0,5 M NaCl, 10 mM β-merkaptoethanolu, pH 7,2) proti sloupci amylózové pryskyřice (New England Bioiabs) a eluovány kolonovým pufrem s obsahem 10 mM maltózy, jak popsáno [Williams a d. (1994), viz výše]. Gel SDS-PAGE, obsahující čištěné vzorky proteinu, barvené Coomassieovou modří, je znázorněn na obr. 26.

Na obr. 26 byly naneseny tyto vzorky: Pruhy 1 až 6 obsahují protein čištěný zE. c/í obsahující plasmidy pMAL-c, resp. pPAÍ870-2680, resp. pMABot, resp. pMNABot, resp. pMCABot, resp. pMBot. Pruh 7 obsahuje markéry molekulové hmotnosti v širokém rozmezí (BioRad).

Vzorky proteinů byly připraveny pro eiektroforézu smísením 5 μί eluovaného proteinu s 5 μί 2x SDS-PAGE vzorkového pufru (0,125 mM Tris-HCI, pH 6,8, 2 mM EDTA, 6 % SDS, 20 % glycerol, 0,025 % bromfenolové modři; před použitím se přidá β-merkaptoethanol do 5 %). Vzorky byly zahřívány 5 min na 95 °C, pak ochlazeny a naneseny na gel SDS-PAGE s 7,5 % agarózy. Byly rovněž naneseny markéry molekulové hmotnosti pro široké rozmezí pro umožnění odhadu molekulové hmotnosti identifikovaných fúzních proteinů. Po elektroforéze byl protein detekován obecně barvením gelu pomocí Coomassieovy modři.

Ve všech případech činil výtěžek více než 20 mg fúzního proteinu na litr kultury (viz tabulku 36) a s výjimkou proteinu pMCABot mělo vysoké procento (tj. více než 20 až 50 % celkového eluovaného proteinu) eluovaného fúzního proteinu molekulovou hmotnost odhadovanou pro fúzní protein plné délky (obr. 26). Bylo odhadnuto (vizuální kontrolou), že jako fúzní protein plné délky bylo exprimováno méně než 10 % fúzního proteinu pMCABot.

>» '«-ηττ'¹ • · «

172 ·· ··

Tabulka 36. Výtěžek afinitně čištěných fúzních proteinů fragment C C. botulinum/MBP

konstrukt	výtěžek (mg/l kultury)	procento celkového rozpustného proteinu
pMABot	24	5,0
pMCABot	34	5,0
pMNABot	40	5,5
pMBot	22	5,0
pMA1870-2680	40	4,8

Výsledky prokazují, že s použitím expresního systému pMAL-c je v E. coli dosažitelná vysoká hladina exprese intakiních fúzních proteinů fragment C C. botulínum/toxin A C. difficile. Tyto výsledky jsou v rozporu s výsledky uváděnými H.F. LaPenotierern a d. (1993), viz výše. Navíc tyto výsledky ukazují, že pro získání rozpustného fúzního proteinu s použitím systému pMAL-c v E. coli není nutno fúzovat gen botulinálního fragmentu C s genem toxinu A C. difficile.

Za účelem zjištění, zda jsou výše uvedené botulinální fúzní proteiny rozpoznávány protilátkami proti toxinu A C. botulinum, byly provedeny Westernový bloty. Byly analyzovány vzorky obsahující afinitně čištěné proteiny z E. coli obsahující plasmidy pMABot, pMCABot, pMNABot, pMBot, pMA1870-2680 nebo pMALc. Na gely SDS-PAGE (7,5 % akrylamidu) byly naneseny vzorky proteinů, čištěných z každého expresního konstruktu. Po elektroforéze byly gely blotovány a přenos proteinů byl potvrzen barvením pomocí Ponceau S (jak je popsáno v příkladu 12b).

Po přenosu proteinů byly bloty blokovány inkubací po dobu 1 h při 20 °C v blokovacím pufru [PBST (PBS s obsahem 0,1 % Tween 20 a 5 % sušeného mléka)]. Pak byly bloty inkubovány v 10 ml roztoku obsahujícího primární protilátku; tento roztok obsahoval PEG prep IgY proti toxinu A C. botulinum (popsán v příkladu 3) ve zředění 1/500 v blokovacím pufru. Bloty byly inkubovány 1 h při teplotě místnosti v přítomnosti primární protilátky. Pak byly bloty promývány a vyvíjeny

9 9 9

9 99

999 β 9

9 9

173 • · · · · 9

9 999 9 9

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

99 99 >

99 99 s použitím konjugátu králičí anti-kuřecí alkalické fosfatasy (Boehriňger Mannheim) jako sekundární protilátky tímto způsobem: Králičí anti-kuřecí protilátka byla zředěna blokovacím pufrem na 1 pg/ml (10 ml konečného objemu na blot) a bloty byly inkubovány 1 h při teplotě místnosti v přítomnosti sekundární protilátky. Pak byly bloty postupně promývány PBST, BBS-Tween a 50 mM Na₂CO₃, pH 9,5. Bloty byly pak vyvíjeny v čerstvě připraveném substrátovém pufru alkalické fosfatasy (100 pg/ml tetrazoliové nitromodři, 50 pg/ml 5-bromchlorindolylfosfátu, 5 mM MgCI₂ v 50 mM Na₂CO₃, pH 9,5). Vyvíjení bylo zastaveno přelitím blotů destilovanou vodou a pak byly bloty vysušeny vzduchem.

Touto Westernovou analýzou byly detekovány proteiny reaktivní vůči toxinu C. botulinum ve vzorcích proteinů pMABot, pMCABot, pMNABot a pMBot (odpovídajících předpokládaným proteinům plné délky, identifikovaným na obr. 26 barvením Coomassie, jak uvedeno výše), ale nikoli ve vzorcích proteinů pMA11002680 nebo pMALc.

Z těchto výsledků vyplývá, že relevantní fúzní proteiny, čištěné na amylózové pryskyřici, popsané v odstavci a), obsahovaly podle předpokladu imunoreaktivní protein fragmentu C C.botulinum.

Příklad 23

Získávání neutralizujících protilátek nasální aplikací proteinu pMBot

Byla hodnocena schopnost rekombinačních botulinálních proteinů, produkovaných v příkladu 22, stimulovat systémovou imunitní odpověď proti epitopům botulinálního toxinu. tento příklad zahrnoval: a) hodnocení indukce sérových titrů IgG, produkovaných nasální nebo orální aplikací fúzních proteinů toxinu A C. difficile obsahujících botulinální toxin a b) neutralizaci neurotoxinu typu A C. botulinum protilátkami proti rekombinačnímu fragmentu C C. botulinum in vivo.

174

a) Hodnocení indukce sérových titrů IgG produkovaných nasální nebo orální aplikací fúzních proteinů toxinů A C. difficile, obsahujících botulinální toxin

Šest skupin po pěti samicích krys CF (Charles River) o stáří 6 týdnů bylo nasálně nebo orálně imunizováno jednou ze tří následujících kombinací s použitím proteinu připraveného v příkladu 22: (1) 250 pg proteinu pMBot na krysu (nasálně a orálně), (2) 250 pg proteinu pMABot na krysu (nasálně a orálně), (3) 125 pg pMBot ve směsi s 125 pg pMA1870-2680 na krysu (nasálně a orálně). Druhá sada pěti skupiny po 3 samicích krys CF byla nasálně nebo orálně imunizována jednou z těchto kombinací: (4) 250 pg proteinu pMNABot na krysu (nasálně a orálně) nebo (5) 250 pg proteinu pMAL-c na krysu (nasálně a orálně).

Fúzní proteiny byly pro imunizaci připraveny takto: Proteiny (v kolonovém pufru s obsahem 10 mM maltózy) byly zředěny 0,1 M karbonátovým pufrem, pH 9,5 a podány orálně nebo nasálně v objemu 200 pl. Krysy byly před podáním mírně zklidněny etherem. Orální aplikace byla provedena s použitím dávkovači jehly velikosti 20. Nasální aplikace byla provedena s použitím mikropipetovacího zařízení P-200 (Gilson). Po 14 dnech po primární imunizaci byla krysám aplikována výše popsanými metodami posilovači dávka a po dalších 7 dnech jim byla odebrána krev. Krysy z každé skupiny byly mírně etherizovány a krev jim byla odebrána z ocasu. Krev byla ponechána se vysrážet po dobu 1 h při 37 °C a bylo shromážděno sérum.

Sérum od jednotlivých krys bylo analyzováno pomocí ELISA za účelem zjištění sérového titru IgG proti toxinů typu A C. botulinum. Použitý postup ELISA byl modifikací postupu popsaného v příkladu 13c. Stručně řečeno byly 96jamkové mikrotitrační destičky (Falcon, Pro-Bind Assay Plates) povlečeny toxoidem typu A C. botulinum (připraveným podle postupu v příkladu 3a) tak, že do každé jamky byl vložen objem 100 μ! toxoidu typu A C. botulinum o koncentraci 2,5 pg/m! v PBS s obsahem 0,005 % thimerosalu a byla provedena inkubace přes noc při 4 °C. Příští ráno byla povlékací suspenze dekantována a všechny jamky byly promyty třikrát pomocí PBS.

Za účelem blokování nespecifických vazebných míst pak bylo do každé jamky přidáno 100 μΙ blokovacího roztoku [0,5 % BSA v PBS] a jamky byly 1 h inkubovány při 37 °C. Blokovací roztok byl dekantován a do první jamky ředicí série byly přidány

175 • · zdvojené vzorky 150 μΙ zředěného krysího séra. Počáteční zkušební ředění séra bylo 1:30 v blokovacím roztoku s obsahem 0,5 % Tween 20 s následným 5násobným ředěním do tohoto roztoku. To bylo provedeno sériovým přenosem alikvotů po 30 μΙ do 120 μΙ blokovacího roztoku s obsahem 0,5 % Tween 20, rozmícháním a opakováním ředění do čerstvé jamky. Po konečném ředění bylo z jamky odebráno 30 μΙ, takže všechny tyto jamky obsahovaly konečný objem 120 μΙ. Byla provedena celkem 3 takováto ředění (celkem 4 jamky). Destičky byly 1 h inkubovány při 37 °C. Po této inkubaci byly sériově ředěné vzorky dekantovány a jamky byly promyty šestkrát pomocí PBS s obsahem 0,5 % Tween 20 (PBST). Do každé jamky bylo přidáno 100 μΙ králičího anti-krysího IgG-alkalické fosfatasy (Sigma) ve zředění (1/1000) v blokovacím pufru s obsahem 0,5 % Tween 20 a destička byla 1 h inkubována při 37 °C. Roztoky konjugátu byly dekantovány a destičky byly promyty výše popsaným způsobem, přičemž bylo PBST při konečném promytí nahrazeno 50 mM Na₂CO₃, pH 9,5. Destičky byly vyvíjeny přídavkem 100 μΙ roztoku obsahujícího 1 mg/ml p-nitrofenylíosfátu (Sigma), rozpuštěného v 50 mM Na₂CO₃, 10 mM MgCI₂, pH 9,5 do každé jamky a inkubací destiček po dobu 5 až 45 min v temnu při teplotě místnosti. Pomocí čtečky Dynatech MR 700 byla měřena absorbance každé jamky při 410 nm. Výsledky jsou shrnuty v tabulkách 37 a 38 a představují průměrné reaktivity séra u jednotlivých myší.

Tabulka 37. Stanovení sérových titrů IgG proti toxinu typu A C. botulinum po imunizaci fúzními proteiny obsahujícími fragment C C. botulinum

cesta imunizace	nasální	orální
imunogen	preimunní	pMBot	pMBot & pMA1870- 2680	pMABot	pMBot	pMBot & pMA1870- 2680	pMABot
ředění
1:30	0,080	1,040	1,030	0,060	0,190	0,080	0,120
1:150	0,017	0,580	0,540	0,022	0,070	0,020	0,027
1:750	0,009	0,280	0,260	0,010	0,020	0,010	0,014

6

1:3750	0,007	0,084	0,090	0,009	0,009	0,010	0,007
testované krysy		5	5	5	5	2	2

čísla představují průměrné hodnoty získané ze dvou destiček ELISA, standardizovaných s použitím preimunní kontroly.

Tabulka 38. Stanovení sérových titrů IgG proti toxinu typu A C. botulinum po imunizaci fúzními proteiny obsahujícími fragment C C. botulinum

cesta imunizace	nasální	orální
imunogen	preimunní	pMBot	PMABot	pMNABot	pMNABot
ředění
1:30	0,040	0,557	0,010	0,015	0,010
1:150	0,009	0,383	0,001	0,003	0,002
1:750	0,001	0,140	0,000	0,000	0,000
1:3750	0,000	0,040	0,000	0,000	0,000
testované krysy		1	1	3	3

Výše uvedené výsledky ELISA demonstrují, že reaktivita vůči botulinálním fúzním proteinům byla nejsilnější při nasální cestě aplikace; pokud byly botulinální fúzní proteiny podávány orálně, byly stimulovány pouze slabé odpovědi. Největší odpověď sérového IgG vyvolal nasálně podaný pMbot a pMBot ve směsi s pMA18702680. Z těchto výsledků vyplývá, že k vyvoláni této odpovědi je nezbytný pouze protein pMBot, protože přídavek proteinu pMA1870-2680 protilátkovou odpověď nezvyšoval (tabulka 37). Umístěním fragmentu toxinu A C. difficile mezi MBP a protein fragmentu C C.botulinum došlo k dramatickému snížení titru anti-bot igG (viz výsledky s použitím proteinů pMABot, pMCABot a pMNABot).

Tato studie demonstruje, že protein pMBot při nasálním podání indukuje silnou odpověď sérového IgG zaměřenou proti toxinu typu A C. botulinum.

·· « ·

177

b) Neutralizace neurotoxinu typu A C. botulinum protilátkami proti rekombinačnímu fragmentu C C. botulinum

Schopnost protilátek proti toxinů typu A C. botulinum, získaných nasální aplikací rekombinačních botulinálních fúzních proteinů krysám (příklad 22), neutralizovat toxin typu A C. botulinum byla testována na myším neutralizačním modelu. Tento myší model je uznávanou metodou detekce botulinálních toxinů v tělních tekutinách a hodnocení proti-botulinálních protilátek [E.J. Schantz a D.A. Kautter, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 61:96 (1990) a přihláška Investigational New Drug (BB-IND-3703), podaná generálním lékařem ministerstva obrany Federálnímu úřadu pro potraviny a léčiva]. Protilátky proti toxinů typu A C. botulinum byly připraveny tímto způsobem:

Krysy ze skupiny, které byl nasálně podán protein pMBot, dostaly druhou posilovači dávku 250 pg proteinu pMBot na krysu a po 7 dnech bylo odebráno sérum. Sérum z jedné krysy z této skupiny a z preimunní krysy bylo testováno na neutralizující aktivitu proti toxinů typu A C. botulinum na dále popsaném myším neutralizačním modelu.

intraperitoneální (ÍP) metodou Schantze a Kauttera [J. Assoc. Off. Anal. Chem. 61:96 (1978)] byla s použitím 18 až 22 myších samic ICR stanovena hodnota LD₅₀ roztoku čištěného komplexu toxinů typu A C. botulinum, získaného od Dr. Erica Johnsona (University of Wisconsin Madison) a bylo zjištěno, že činí 3500 LD₅₀/mi. Stanovení LD₅₀ bylo provedeno následovně: Byl připraven standard toxinů typu A rozpuštěním čištěného komplexu toxinů typu A v 25 mM pufru na bázi fosforečnanu sodného, pH 6,8, na zásobní roztok toxinů o 3,15.10⁷ LD₅₀/mg. Byla stanovena hodnota OD₂₇₈ roztoku a koncentrace upravena na 10 až 20 pg/ml. Roztok toxinů pak byl zředěn gel-fosfátem (30 mM fosfátu, pH 6,4, 0,2 % želatiny) 1:100. Další ředění roztoku toxinů byla prováděna, jak je uvedeno v tabulce 39. Pomocí 0,5 ml každého uvedeného ředění byly injekčně ošetřeny vždy dvě myši a pozorovány na výskyt příznaků botulismu po dobu 72 h.

-» »·

I · · « » · · · • · · * 1 • · I • —

178

Tabulka 39. Stanovení LD^ čištěného komplexu toxinu typu A C. botulinum

ředění	počet úhynů po 72 h
1:320	2/2
1:640	2/2
1:1280	2/2
1:2560	0/2 (onemocnění po 72 h)
1:5120	0/2 (žádné příznaky)

Z výsledků uvedených v tabulce 39 byl titr toxinu odhadnut mezi 2560 LD₅₀/ml a 5120 LD₅₀/ml (čili asi 3840 LD₅₀/ml). Tato hodnota byla pro účely výpočtu zaokrouhlena na 3500 LD₅₀/ml.

Poté bylo stanoveno množství neutralizujících protilátek, přítomných v séru krys, imunizovaných nasálně proteinem pMBot. Následujícím způsobem bylo testováno sérum ze dvou krys s výše uvedenou posilovači dávkou proteinu pMBot a preimunní sérum z jedné krysy. Toxinový standard byl zředěn 1:100 gel-fosfátem na konečnou koncentraci 350 LD₅₀/ml. 1 μΙ zředěného toxinového standardu byl smísen s 25 μΙ séra z každé ze tří krys a 0,2 ml gel-fosfátu. Směsi byly inkubovány 30 min při teplotě místnosti s občasným zamícháním. 0,5 ml směsí bylo IP injekčně aplikováno každé ze dvou myší. Myši byly 72 h pozorovány na známky botulismu. Myši, které dostaly sérum z krys imunizovaných proteinem pMBot, tuto dávku neutralizovaly. Myši, které dostaly sérum preimunních krys, uhynuly za méně než 24 h.

Poté bylo kvantifikováno množství neutralizujících protilátek proti toxinu, přítomných v séru krys imunizovaných proteinem pMBot. Titrace sérových protilátek byly provedeny smísením 0,1 ml každého ředění protilátky (viz tabulka 40) s 0,1 ml ředění 1:10 zásobního roztoku toxinu (3,5.104 LD₅₀/ml) s 0,1 ml gel-fosfátu a injekcí 0,5 ml IP do 2 myší na jedno ředění. Myši pak byly 3 dny (72 h) pozorovány na známky botulismu. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 39.

Jak je znázorněno v tabulce 40, sérum pMBot neutralizovalo komplex toxinu typu A C. botulinum, bylo-Ii použito v ředění 1:320 nebo menším. Pro sérum pMBot byla získána střední hodnota neutralizace 168 lU/ml (jedna IU je definována jako

Y19

10000 myší LDgo). Tato hodnota se převádí na titr cirkulujícího séra asi 3,7 lU/mg sérového proteinu. Tento neutralizační titr je srovnatelný s komerčně dostupným (Connaught Laboratories, Ltd.) baleným koncentrovaným koňským antisérem proti C. botulinum. 10ml ampule Connaughtova antiséra obsahuje asi 200 mg/ml proteinu; každý mililitr může neutralizovat 750 IU toxinu typu A C. botulinum. Po podání jedné ampule člověku bude titr Connaughtova preparátu v cirkulujícím séru za předpokladu průměrného objemu séra 3 I přibližně 25 lU/ml). Titr anti-C. botulinum, pozorovaný v cirkulujícím séru u krys nasálně imunizovaných proteinem pMBot (168 lU/ml), je tedy 6,7krát vyšší než titr cirkulující protilátky proti C. botulinum, potřebný pro ochranu v případě člověka.

Tabulka 40. Kvantifikace neutralizujících protilátek v séru pMBot

	pMBot3
ředění	krysa 1	krysa 2
1:20	2/2	2/2
1:40	2/2	2/2
1:80	2/2	2/2
1:160	2/2	2/2
1:320	2/2b	2/2b
1:640	0/2	0/2
1:1280	0/2	0/2
1:2560	0/2	0/2

čísla představují počty myší, přeživších po 72 h, které dostaly sérum odebrané krysám, imunizovaným proteinem pMBot.

^b tyto myši po 72 h přežily, ale onemocněly

Tyto výsledky demonstrují, že při použití rekombinačního fúzního proteinu fragmentu C C. botulinum, produkovaného v E. coli, jako imunogenu jsou indukovány protilátky schopné neutralizovat toxin typu A C. botulinum.

180

Příklad 24

Produkce rozpustného proteinu fragmentu C C. botulinum, v podstatě prostého kontaminace endotoxinem

V příkladu 23 bylo demonstrováno, že neutralizující protilátky se vytvoří imunizací proteinem pMBot, exprimovaným vE. coli. Tyto výsledky prokázaly, že fúzní protein pMBot je dobrým kandidátem na vakcinu. Imunogeny vhodné pro použití jako vakciny však kromě schopnosti indukce neutralizujících protilátek musejí být apyrogenní. Byly vyvíjeny expresní klony a podmínky, které by usnadňovaly produkci proteinu fragmentu C C. botulinum pro použití jako vakcina.

Tento příklad zahrnoval: (a) stanovení obsahu pyrogenů v proteinu pMBot, (b) vytvoření proteinu fragmentu C C. botulinum, prostého MBP, (c) expresi proteinu fragmentu C C. botulinum s použitím různých expresních vektorů a (d) čištění rozpustného proteinu fragmentu C C. botulinum pro odstranění významné kontaminace endotoxiny.

a) Stanoveni obsahu pyrogenů v proteinu pMBot

Pro použití rekombinačního antigenu jako vakciny u člověka a jiných živočichů musí antigenový preparát prokázat apyrogenitu. Nejvýznamnějším pyrogenem, přítomným v preparátech rekombinačních proteinů produkovaných v gramnegativních bakteriích, jako je E. coli, je endotoxin [F.C. Pearson, Pyrogens: endotoxins, LAL testing and depyrogenation (1985), Marcel Dekker, New York, str. 23-56]. Pro hodnocení použitelnosti proteinu pMBot jako kandidáta na vakcinu byl stanoven obsah endotoxinů ve fúzních proteinech MBP.

Obsah endotoxinů ve vzorcích rekombinačních proteinů byl zjišťován pomocí Limulova testu (LAL kit: Associates of Cápe Cod) podle pokynů výrobce. Bylo zjištěno, že vzorky afinitně čištěného proteinu pMal-c a pMA1870-2680 obsahují vysoké hladiny endotoxinu [> 50000 EU/mg proteinu: EU (endotoxinová jednotka)]. Z toho vyplývá, že fúze obsahující MBP nebo repetice toxinu A s botulinálním fragmentem C budou rovněž obsahovat vysoké hladiny endotoxinu. Proto byl učiněn • · · ·

181 • · · následující pokus o odstranění endotoxinů z afinitně čištěných proteinových preparátů pMal-c a pMBot

Pro zjištění, zda je možno endotoxin snadno odstranit, byly vzorky proteinu pMal-c a pMBot depyrogenizovány polymyxinem. Bylo použito toto množství proteinu: 29 mi při OD₂₈₀/ml pro Ma!-c a 19 mi při 1,44 OD₂₈₀/ml pro pMBot. Vzorky proteinů byly intenzivně dialyzovány proti PBS a smíseny v 50ml zkumavce (Falcon) s 0,5 ml PBS-ekvilibrovaného polymyxinu B (AffiPrep Polymyxin, BioRad). Vzorky byly rozmíchávány v otáčejících se zkumavkách přes noc při 4 °C. Polymyxin byl peletizován odstředěním po dobu 30 min maximální rychlostí (přibližně 2000 g) ve stolní odstředivce a supernatant byl odstraněn. Získaný protein (v supernatantu) byl kvantifikován pomocí OD₂₈₀ a endotoxinová aktivita byla testována pomocí LAL. V obou případech byla získána pouze přibližně 1/3 vstupního proteinu a polymyxinem ošetřený protein si uchoval významnou kontaminaci endotoxinem (přibližně 7000 EU/mg pMBot).

Depyrogenizační experiment byl opakován s použitím nezávisle čištěného preparátu proteinu pMal-c a byly získány podobné výsledky. Z těchto studií byl učiněn závěr, že významné množství endotoxinů se odstraní spolu s čištěním od fúzních proteinů MBP pomocí amylózové pryskyřice. Tento endotoxin navíc nelze snadno odstranit působením polymyxinu.

Z těchto výsledků vyplývá, že přítomnost sekvencí MBP ve fúzním proteinu komplikuje odstranění endotoxinů z preparátů proteinu pMBot

b) Vytvoření proteinu fragmentu C C. botulinum, prostého MBP

V odstavci (a) byio demonstrováno, že fúzní protein pMBot nelze snadno vyčistit od kontaminujícího endotoxinů. Dále byla zkoumána možnost produkovat apyrogenní (například endotoxinů prostý) preparát rozpustného proteinu botulinálního fragmentu C, prostého navázaného MBP. Byl sestaven expresní konstrukt pMBot pro usnadnění čištění botulinálního fragmentu C od navázaného MBP štěpením fúzního proteinu s použitím zkonstruovaného místa štěpení faktorem

182

Xa, přítomného mezi MBP a botulinálním fragmentem C. Štěpení faktorem Xa bylo provedeno následovně.

Faktor Xa (New England Biolabs) byl přidán k proteinu pMBot (s použitím poměru 0,1 až 1,0 % faktoru Xa/protein pMBot) v různém složení pufru [například PBS-NaCl (PBS s obsahem 0,5 M NaCl), PBS-NaCl s obsahem 0,2 % Tween 20, PBS, PBS s obsahem 0,2 % Tween 20, PBS-C (PBS s obsahem 2 mM CaCI₂), PBSC s obsahem buď 0,1 nebo 0,5 % Tween 20, PBS-C s obsahem buď 0,1 nebo 0,5 % NP-40, PBS-C s obsahem buď 0,1 nebo 0,5 % Tritonu X-100, PBS-C s obsahem 0,1 % deoxycholátu sodného, PBS-C s obsahem 0,1 % SDS]. Štěpné směsi s faktorem Xa byly inkubovány 12 až 72 h při teplotě místnosti.

Rozsah odštěpení byl hodnocen Westernovým blotem nebo Coomassie barvením proteinů po elektroforéze na denaturujících gelech SDS-PAGE, popsané v příkladu 22. Štěpené reakční směsi (a kontrolní vzorky neštěpeného proteinu pMBot) byly před nanesením na gel 2 min odstřeďovány v mikrofuze pro odstranění nerozpustných proteinů. Vzorky ošetřené faktorem Xa byiy porovnávány s neštěpenými neodstřeďovanými vzorky pMBot na tomtéž gelu. Výsledky této analýzy jsou shrnuty dále.

1. Odstředěním bylo možno odstranit většinu (asi 90 %) proteinu pMBot, i když byly použity neštěpené kontrolní vzorky. Z toho vyplývá, že fúzní protein pMBot nebyl plně rozpustný (tj. existuje spíše jako suspenze než jako roztok). [Tento výsledek byl konzistentní s pozorováním, že většina afinitně čištěného proteinu pMBot se po dlouhodobém skladování (> 2 týdny) při 4 °C vysráží. Navíc po sonifikaci a vyčeření indukovaných E. coli zůstává většina (tj. 75 %) indukovaného proteinu pMBot v peletě. Resuspendováním těchto nerozpustných pelet v PBS s následnou sonifikaci dojde k částečné solubiiizaci nerozpustného protein u pMBot v peletách.]

2) Ta část proteinu pMBot, která je plně v roztoku (asi 10 % proteinu pMBot), je kompletně rozštěpena faktorem Xa, ale odštěpený (uvolněný) botulinální fragment C je relativně nerozpustný, takže plně v roztoku zůstává pouze odštěpený MBP.

3) Žádné zvýše uvedených reakčních podmínek nevedly ke zvýšení rozpustnosti bez současného snížení účinnosti štěpení. Podmínky, za kterých by byl odštěpený botulinální fragment C účinně solubilizován, nebyly identifikovány.

4) Použití 0,1 % SDS v pufru použitém pro odštěpení faktoru Xa zvýšilo rozpustnost proteinu pMBot (veškerý protein pMBot byl rozpustný). Přítomnost SDS však zabránila veškerému štěpení fúzního proteinu faktorem Xa.

5) Analýza peletizovaného proteinu ze štěpných reakcí ukázala, že během inkubace se sráží jak pMBot plné délky (tj. neštěpený), tak odštěpený protein botulinálního fragmentu C.

Tyto výsledky demonstrují, že čištění rozpustného proteinu botulinálního fragmentu C po štěpení fúzního proteinu pMBot je komplikováno nerozpustností jednak proteinu pMBot a jednak odštěpeného proteinu botulinálního fragmentu C.

d) Exprese fragmentu C C. botulinum s použitím různých expresních vektorů

Za účelem zjištění, zda dojde ke zvýšení rozpustnosti botulinálního fragmentu C expresí proteinu fragmentu C jako nativního proteinu, proteinu N-termináině značeného His nebo jako fúze s glutathion-S-transferasou (GST) byiy konstruovány alternativní expresní plasmidy. Tyto expresní konstrukty byly vytvořeny s použitím postupů uvedených v příkladu 22. Dále popsané vektory jsou schematicky znázorněny na obr. 27.

Na obr. 27 jsou použity tyto zkratky: pP označuje vektor pET23, pHIS označuje vektor pETHisa, pBlue označuje vektor pBluescript, pM označuje vektor pMAL-c a pG označuje vektor pGEX3T (popsaný v příkladu 11). Plné černé čáry označují sekvence genu fragmentu C C. botulinum, plné černé oválky představují MBP, šrafované oválky představují GST, „HHHHH“ představuje polyhistidinovou značku. Je-li název restrikčního enzymu na obr. 27 v závorce, znamená to, že restrikční místo bylo během konstrukce zničeno. Hvězdička u názvu restrikčního enzymu označuje, že toto restrikční místo bylo na klonovacim spoji obnoveno.

i) Konstrukce pPBot

Za účelem exprese fragmentu C C. botulinum jako nativního (tj. nefúzovaného) proteinu byl následujícím způsobem konstruován plasmid pPBot (znázorněno

schematicky na obr. 27). Sekvence fragmentu C, přítomné v pAlterBot (příklad 22) byly uvolněny štěpením pAlterBot pomocí Ncol a HindlII. Insert fragmentu C Ncol/Hindlll byl ligován s vektorem pETHisa (popsaným v příkladu 18b), který byl štěpen pomocí Ncol a HindlII. Tato ligace vytváří expresní konstrukt, v němž je Ncolkódovaný methionin botulináiního fragmentu C iniciačním kodonem a řídí expresi nativního botulináiního fragmentu C. Produkt ligace byl použit k transformaci kompetentních buněk BL21(DE3)pLysS (Novagen). Rekombinačni klony pak byly identifikovány restrikčním mapováním.

ii) Konstrukce pHisBot

Za účelem exprese fragmentu C C. botulinum, obsahujícího na aminoterminálním konci rekombinačního proteinu polyhistidinovou značku, byl následujícím způsobem konstruován plasmid pHisBot (schematicky znázorněn na obr. 27). Insert botulináiního fragmentu C Ncol/Hindlll z pAlterBot bylo ligován do vektoru pETHisa, který byl štěpen pomocí Nhel a HindlII. Místa Ncol (na insertu fragmentu C) a Nhel (na vektoru pETHisa) byla před ligaci vyplněna Klenowovým fragmentem; tato místa byla ligována tupými konci (místo Ndel bylo podle předpokladu regenerováno na kionovém spoji). Produkty ligace byly použity k transformaci kompetentních buněk BL21(DE3)pLysS a rekombinačni klony byly identifikovány restrikčním mapováním.

Výsledný klon pHisBot exprimuje protein botulináiního fragmentu C s Nterminálním prodloužením histidinovou značkou o sekvenci MetGlyHisHisHisHisHisHisHisHisHisHisSerSerGIyHisileGluGlyArgHisMetAla (SEQ ID NO:24); aminokyseliny kódované genem botulináiního fragmentu C jsou podtrženy a vektorem kódované aminokyseliny jsou uvedeny normálním písmem. Nukleotidové sekvence přítomná ve vektoru pETHisa, který kóduje fúzní protein pHisBot, je uvedena jako SEQ !D NO:25. Aminokyselinová sekvence proteinu pHisBot je uvedena jako SEQ ID NO:26.

iii) Konstrukce pGBot

185

Protein botulinálního fragmentu C byl exprimován jako fúze s proteinem glutathion-S-transferasou pomocí konstrukce plasmidu pGBot (schematicky znázorněno na obr. 27). Tento expresní konstrukt byl vytvořen klonováním insertu fragmentu C NotVSaft, přítomného v pBlueBot (příklad 22) do vektoru pGEX3T, který by! štěpen Sma! a Xho\. Místo Not\ (přítomné na botulinálním fragmentu) bylo před ligací ztupeno Klenowovým fragmentem. Produkty ligace byly použity k transformaci kompetentních buněk BL21.

Pro potvrzení integrity výše uvedených expresních konstruktů byl každý konstrukt testován restrikčním štěpením.

Postupem podle příkladu 22 byly ve velkém měřítku (1 I) kultury pPBot [hostitel BL21(DE3)pLysS], pHisBot [hostitel BL21(DE3)pLysSj a pGBot (hostitel BL21) pěstovány v médiu 2X YT a indukovány po dobu 3 h (s použitím IPTG do 0,8 až 1,0 mM). Z 1ml alikvotů každé kultury byly připraveny preparáty celkového, rozpustného a nerozpustného proteinu [Williams a d. (1994), viz výše] a analyzovány pomocí SDS-PAGE. Coomassie barvením nebyl ve vzorcích pPBot nebo pHisBot detekovatelný žádný zřejmý indukovaný pás, zatímco ve vzorku pGBot byl detekován prominentní pás o předpokládané molekulové hmotnosti. Byly připraveny rozpustné lyzáty kultur pGBot (resuspendováno v PBS) a pHisBot [resuspendováno ve vazebném pufru Novagen 1X (5 mM imidazolu, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCi, pH 7,9)] a použity následujícím způsobem k afinitnímu čištění rozpustného afinitně značeného proteinu.

Lyzát pGBot byl afinitně čištěn na glutathion-agarózové pryskyřici (Pharmacia) přesně postupem podle Smitha a Corcorana [Current Protocois in Molecular Biology, Supplement 28 (1994), str. 16.7.1-16.7.7]. Protein pHisBot byl čištěn na pryskyřici His-Bind (Novagen) s použitím soupravy His-bind (Novagen) přesně podle pokynů výrobce.

Vzorky z čištění jak proteinů pGBot, tak pHisBot (zahrnující neindukovaný, indukovaný, celkový, rozpustný a afinitně čištěný eluovaný protein) byly děleny na gelech SDS-PAGE. Po elektroforéze byly proteiny analyzovány Coomassieovým barvením nebo detekcí Western blot s použitím kuřecí protilátky proti toxoidu typu A C. botulinum (jak uvedeno v příkladu 22).

186

Tyto studie ukázaly, že za použitých podmínek byl protein pGBot téměř úplně nerozpustný, zatímco protein pHisBot byl rozpustný. Afinitní čištění proteinu pHisBot na tento první pokus bylo neúspěšné, jak pokud jde o výtěžek (většina imunoreaktivního botulinálního proteinu se nevázala na pryskyřici His-bind), tak pokud jde o čistotu (bylo odhadnuto, že botulinální protein zahrnuje přibližně 20 % celkového eluovaného proteinu).

d) Čištění rozpustného proteinu fragmentu C C. botulinum, v podstatě prostého endotoxinové kontaminace

Výše popsané studie ukázaly, že protein pHisBot byl exprimován v E. coli jako rozpustný protein. Afinitní čištění tohoto proteinu na pryskyřici His-bind však bylo velmi neúčinné. Pro zlepšení afinitního čištění rozpustného proteinu pHisBot (jak pokud jde o výtěžek, tak o čistotu) byla použita alternativní polyhistidin vážící afinitní pryskyřice (pryskyřice Ni-NTA; Qiagen). uvádí se, že pryskyřice Ni-NTA má oproti pryskyřici His-bind vyšší vazebnou afinitu (K_d = 1.10’¹³ při pH 8,0; uživatelská příručka Qiagen).

Výše popsaným způsobem byl připraven rozpustný lyzát (v 1X vazebném pufru Novagen) z 1 I indukované kultury 2X YT. Stručně řečeno byla kultura pHisBot [hostitel BI21(DE3)pLysS] pěstována při 37 °C do OD₆₀₀ 0,7 v 1 I média 2X YT s obsahem 100 pg/ml ampicilinu, 34 pg/ml chloramfenikolu a 0,2 % glukózy. Exprese proteinů byla indukována přídavkem IPTG do 1 mM. Po 3 h po přídavku ÍPTG byly buňky po dobu 15 min chlazeny v lázni vody a ledu a pak odstřeďovány po dobu 10 min při 5000 min¹ a 4 °C v odstředivce JA10 (Beckman). Pelety byly resuspendovány v celkovém objemu 40 ml vazebného pufru 1X Novagen (5 mM imidazolu, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCI, pH 7,9), přeneseny do dvou 35ml zkumavek Oakridge a zmrazovány po dobu alespoň 1 h na -70 °C. Zkumavky byly roztaveny a buňky lyžovány sonifikací (impulsy 4 X 20 s pomocí přístroje Branson Sonifier 450 s nastavením výkonu 6 až 7) na ledu. Suspenze byla vyčeřena odstřeďováním po dobu 20 min při 9000 min¹ (10000 g) v odstředivce JA-17 (Beckman).

187

Rozpustný lyzát byl upraven na 0,1 % NP40 a pak byl po dávkách absorbován do 7 ml suspenze 1:1 pryskyřice Ni-NTA ve vazebném pufru mícháním po dobu 1 h při 4 °G. Suspenze byla nalita do kolony o vnitřním průměru 1 nebo 2,5 cm (BioRad). Kolona pak byla promyta postupně 15 ml 1x vazebného pufru Novagen s obsahem 0,1 % NP40, 15 ml 1X vazebného pufru Novagen, 15 ml promývacího pufru (60 mM imidazolu, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,9) a 15 ml promývacího pufru NaHPO₄ (50 mM NaHPO₄, pH 7,0, 0,3 M NaCl, 10 % glycerolu). Navázaný protein byl eluován protonací pryskyřice s použitím elučního pufru (50 mM NaHPO₄, pH 4,0, 0,3 M NaCl, 10 % glycerol). Eluovaný protein byl skladován při 4 °C.

Vzorky celkového, rozpustného a eluovaného proteinu byly děleny pomocí SDS-PAGE. Vzorky proteinu byly připraveny pro elektroforézu, jak je uvedeno v příkladu 22b. Pro visualizaci rozdělených proteinů byly zdvojené gely barveny pomocí Coomassieovy modři a protein reaktivní s toxinem typu A C. botulinum byl detekován analýzou Western blot, popsanou v příkladu 22b. Reprezentativní gel, barvený Coomassieovou modří, je znázorněn na obr. 28. Na obr. 28 byly na 12,5 % akrylamidový gel naneseny tyto vzorky: Pruhy 1 až 4 obsahují celkový protein, resp. rozpustný protein, resp. rozpustný protein přítomný v průtoku kolony Ni-NTA, resp. afinitně čištěný protein pHisBot (tj. protein uvolněný z pryskyřice Ni-NTA protonací). Pruh 5 obsahuje vysokomolekulární proteinové markéry (BioRad).

Čištění proteinu pHisBot vedlo k výtěžku 7 mg afinitně čištěného proteinu z 1 I výchozí kultury buněk BL21(DE3)pLysS, obsahujících plasmid pHisBot. Výtěžek čištěného proteinu pHisBot představoval přibližně 0,4 % celkového rozpustného proteinu v indukované kultuře. Analýzou čištěného proteinu pHisBot pomocí SDSPAGE bylo zjištěno, že alespoň 90 až 95 % proteinu bylo přítomno jako jediný pás (obr. 28) o předpokládané molekulové hmotnosti (50 kD). Tento pás proteinu 50 kD byl imunoreaktivní s protilátkami proti toxinu typu A C. botulinum. Bylo zjištěno, že extinkční koeficient proteinového preparátu je 1,4 (s použitím testu Pierce BCA) nebo 1,45 (s použitím Lowryho testu) OD₂₈₀ na 1 mg/ml roztoku.

Vzorky pH neutralizovaného eluovaného proteinu pHisBot byly děleny na koloně KB 803 HPLC (Shodex). Přestože jsou touto kolonou zadržovány Hisznačené proteiny (snad v důsledku inherentní schopnosti vazby kovů na proteiny),

188 ···· ··· ··· ·« ·· *·· ·· ·· byla relativní mobilita proteinu pHisBot konzistentní s hodnotou očekávanou pro neagregovaný protein v roztoku. Bylo zjištěno, že za výše uvedených podmínek růstu a solubilizace je většina indukovaného proteinu pHisBot rozpustná (tj. na základě srovnání hladin proteinu pHisBot pozorovaných ve vzorcích celkového a rozpustného proteinu, připravených z buněk BL21(DE3)pLysS, obsahujících plasmid pHisBot, bylo zjištěno, že více než 90 % proteinu pHisBot je rozpustných). SDS-PAGE analýza vzorků získaných po odstředění, prodlouženém skladování při -20 °C a alespoň 2 cyklech zmrazování a rozmrazování nedetekovala úbytek proteinu (v důsledku srážení), což ukazuje, že protein pHisBot je rozpustný v eiučním pufru (tj. 50 mM NaHPO₄, pH 4,0, 0,3 M NaCl, 10 % glycerol).

Stanovení endotoxinové kontaminace afinitně čištěného preparátu pHisBot (po neutralizaci pH) pomocí testu LAL (Associates of Cápe Cod) nedetekovalo významnou kontaminaci endotoxinem. Test byl prováděn s použitím koncové chromogenní metody (bez diazokopulace) podle návodu výrobce. Touto metodou je možno detekovat koncentrace endotoxinu větší nebo rovné 0,03 EU/ml (EU označuje endotoxinové jednotky). Test LAL byl prováděn s použitím 0,5 ml roztoku zahrnujícího 0,5 mg proteinu pHisBot v 50 mM NaHPO₄, pH 7,0, 0,3 M NaCl, 10 % glycerolu; v 0,5 ml vzorku bylo detekováno 30 až 60 EU. Afinitně čištěný preparát pHisBot tedy obsahuje 60 až 120 EU/mg proteinu. Předpisy FDA pro podávání parenterálních léčiv vyžadují, aby přípravek podávaný lidem obsahoval méně než 5 EU/kg tělesné hmotnosti (průměrná lidská tělesná hmotnost je 70 kg; v parenterální dávce je proto možno podat až 349 jednotek EU). Protože ve vakcinovém preparátu se podává pouze velmi malé množství proteinu (obecně v rozmezí 10 až 500 pg proteinu), je při aplikaci afinitně čištěného pHisBot s obsahem 60 až 120 EU/mg proteinu dodáno pouze malé procento povolené endotoxinové zátěže. Například podáním 10 až 500 pg čištěného pHisBot člověku o hmotnosti 70 kg, kdy proteinový preparát obsahuje 60 EU/mg proteinu, se zavede pouze 0,6 až 30 EU [tj. 0,2 až 8,6 % maximální povolené endotoxinové zátěže na parenterální dávku (méně než 5 EU/kg tělesné hmotnosti)].

Výše uvedené výsledky demonstrují, že endotoxin (LPS) se při výše uvedeném schématu čištění nečistí spolu s proteinem pHisBot. přípravky

189 • · · · · ·· · · · · • ···· · · · · · ·· • · · ··· · * · · · · · · • · · « · · · ··· ·· ·· ·· ··· ·· ·· rekombinačně produkovaného proteinu pHisBot s nízkou hladinou endotoxinu (méně než nebo rovno 2 EU/mg rekombinačního proteinu) lze získávat promýváním kolony Ni-NTA promývacím pufrem do návratu OD₂₈₀ na základní úroveň (tj. dokud z kolony nepřestane vycházet UV absorbující materiál).

Výše uvedené výsledky demonstrují způsob produkce a čištění rozpustného proteinu botulinálního fragmentu C, v podstatě prostého endotoxinu.

Příklad 25

Optimalizace exprese a čištění proteinu pHisBot

Výsledky uvedené v příkladu 24d demonstrovaly, že protein pHisBot je vynikajícím kandidátem pro použití jako vakcina, protože je možno jej získávat v E. coli jako rozpustný protein a protože čištěním je možno odstranit pyrogenní aktivitu. Za účelem optimalizace exprese a čištění proteinu pHisBot byly testovány různé podmínky růstu a čištění.

a) Růstové parametry ii) Hostitelské kmeny

Byl vyšetřován vliv použitých hostitelských kmenů na produkci rozpustného proteinu pHisBot. Čištění pHisBot ve velkém měřítku [popsané výše v příkladu 24d] bylo provedeno s použitím hostitele BL21(DE3) (Novagen) místo BL21(DE3)pLysS. Vypuštění plasmidu pLysS v hostiteli BL21(DE3) vedlo k vyšší úrovni exprese v důsledku dereprese promotoru T7-lac tohoto plasmidu. Výtěžek afinitně čištěného rozpustného rekombinačního proteinu však byl velmi nízký (přibližně 600 μg/l kultury), probíhalo-li čištění za stejných podmínek jako v příkladu 24d. Tento výsledek byl důsledkem skutečnosti, že exprese v hostiteli BL21(DE3) vedla k velmi vysoké úrovni exprese proteinu pHisBot jako nerozpustných infuzních tělísek, jak ukazuje SDS-PAGE analýza proteinu připraveného z indukovaných kultur BL21(DE3) (obr. 29, pruhy 1 až 7, popsané dále). Tyto výsledky demonstrují, že protein pHisBot není

190 • · • · · ···· · · · · • · ··· ·· · · · ·· • · · · · · · · * ··· · · ······« ··· ·· ·· ·· ··* *· ·· vůči buňkám E. coli inherentně toxický a s použitím vhodné kombinace promotor/hostitel muže být exprimován do vysoké hladiny.

Obr. 29 znázorňuje gel SDS-PAGE barvený Coomassieovou modří (12,5 % akrylamidu), na nějž byly naneseny extrakty připravené z buněk BL21(DE3) obsahujících plasmid pHisBot. V případě každého pruhu byl nanesen vzorek 2,5 μΙ vzorkového pufru 2X SDS. Vzorky byly zpracovány postupem popsaným v příkladu 22b. Na gel byly nanášeny následující vzorky: Pruhy 1 až 7 obsahují protein izolovaný z hostitele BL21(DE3). pruhy 8 až 14 obsahují proteiny izolované z hostitele BL21(DE3)pLysS. Celkový protein byl nanesen v pruzích 1, 2, 4, 6, 8, 10 a

12. Rozpustný protein byl nanesen v pruzích 3, 5, 7, 9, 11 a 13. pruh 1 obsahuje protein z neindukovaných hostitelských buněk. Pruhy 2 až 13 obsahují protein z hostitelských buněk indukovaných po dobu 3 h. IPTG byl přidáván do konečné koncentrace 0,1 mM (pruhy 6 až 7), 0,3 mM (pruhy 4 až 5) nebo 1,0 mM (pruhy 2, 3, 8 až 13). Kultury byl pěstovány v médiu LB (pruhy 8 až 9), médiu 2X YT (pruhy 1011) nebo v médiu Terrific (pruhy 1 až 7, 12 až 13). Protein pHisBot, pozorovaný v pruzích 3, 5, a 7, je nerozpustný protein, který přetekl z pruhů 2, resp. 4, resp. 6. V pruhu 14 byly naneseny vysokomolekulární markéry (BioRad).

Byly testovány různé podmínky exprese za účelem zjištění, zda je možno použít hostitele BL21(DE3) pro expresi rozpustného proteinu pHisBot ve vhodně vysoké hladině (tj. asi 10 mg/ml). Měnila se teplota (kultivace při 37 nebo 30 °C), kultivační médium (2X YT, LB nebo Terrific) a hladina induktoru (0,1, 0,3 nebo 1,0 mM IPTG). Byly testovány všechny kombinace těchto proměnných a pak byla hodnocena hladina indukce a rozpustnost analýzou SDS-PAGE celkových a rozpustných extraktů [připravených z 1 ml vzorků postupem podle Williamse a d. (1994), viz výše].

Všechny kultury byly pěstovány v 15ml zkumavkách (Falcon č. 2057). Všechna kultivační média byla přes noc předehřátá na příslušnou teplotu a doplněna 100 pg/ml ampicilinu a 0,2 % glukózy. Médium Terrific obsahuje 12 g/l baktotryptonu, 24 g/l bakto-kvasničného extraktu a 100 ml/l roztoku zahrnujícího 0,17 M KH₂PO₄, 0,72 M K₂HPO₄. Kultury byly pěstovány v inkubátoru na otočném disku (pro zajištění aerace) do OD₆₀₀ přibližně 0,4 a indukovány přídavkem IPTG. Ve všech

191 ·· ·· • 9 9 • · ··· • · · • · · • 4 ··

99 • · · · • · · · • · · 9 · · • · · • 99 99 případech byla pozorovány vysoká úroveň exprese nerozpustného proteinu pHisBot bez ohledu na teplotu, médium nebo koncentraci induktoru.

Pak byly vyšetřovány účinky různých koncentrací IPTG na kultury 2X YT, pěstované při 23 °C. IPTG byl přidán do konečné koncentrace buď 1 mM, 0,1 mM, 0,05 mM nebo 0,01 mM. Při této teplotě byly při buď 1 nebo 0,1 mM IPTG indukovány podobné hladiny proteinu pHisBot; tyto hladiny exprese byly nižší než při vyšších teplotách. Hladina indukovaného proteinu byla při 0,05 mM IPTG snížena a při 0,01 mM IPTG chyběla (oproti indukcím 1,0 a 0,1 mM IPTG při 23 °C). Nebyly však pozorovány žádné podmínky, za nichž by byl protein pHisBot v tomto hostiteli rozpustný. I když jsou tedy hladiny exprese v hostiteli BL21(DE3) vyšší (v porovnání s hostitelem BL21(DE3)pLysS), podmínky, které usnadňují produkci rozpustného proteinu v tomto hostiteli, nelze identifikovat.

Tyto výsledky demonstrují, že produkce rozpustného proteinu pHisBot bylo dosaženo s použitím hostitele BL21(DE3)pLysS ve spojení s promotorem T7-lac.

ii) Účinek měnící se teploty, média a koncentrace IPTG a délky indukce

Byl vyšetřován účinek pěstování hostitelských buněk v různých médiích na expresi rekombinačního botulinálního proteinu z expresního konstruktu pHisBot [v hostiteli BL21(DE3)pl_ysS]. Buňky BL21(DE3)pLysS obsahující plasmid pHisBot byly pěstovány při 37 °C v médiu LB, 2X YT nebo Terrific. Buňky byly indukovány s použitím 1 mM IPTG během indukční doby 3 h. Bylo zjištěno, že exprese pHisBot je nejvyšší, byly-li buňky pěstovány v médiu 2X YT (viz obr. 29, pruhy 8 až 13).

Poté byly buňky pěstovány při 30 °C v médiu 2X YT a koncentrace IPTG byla měněna od 1,0, 0,3 nebo 1 mM a doba indukce byla buď 3 nebo 5 h. Exprese proteinu pHisBot byla podobná při všech 3 použitých koncentracích induktoru a hladiny indukovaného proteinu byly vyšší po 5h indukci v porovnání s 3h indukcí.

S použitím podmínek, zjištěných jako optimální pro expresi proteinu pHisBot byla kultura pěstována ve velkém měřítku za účelem poskytnutí dostatku materiálu pro čištění proteinu pHisBot ve velkém měřítku. Tři kultury po 1 I byly pěstovány v médiu 2X YT s obsahem 10 pg/ml ampicilinu, 34 pg/ml chloramfenikolu a 0,2 %

192 v » > « • · ·· ·· • · · » · · · · glukózy. Kultury byly pěstovány při 30 °C a pak indukovány po dobu 5 h s 1,0 mM IPTG. Kultury byly odebrány a postupem podle příkladu 18 byl připraven rozpustný lyzát. Čištění ve velkém měřítku bylo prováděno postupem podle příkladu 24d s tou výjimkou, že rozpustný lyzát byl šaržovitě absorbován po dobu 3 h místo 1 h. Konečný výtěžek byl 13 mg proteinu pHisBot/Iitr kultury. Protein pHisBot představoval 0,75 % celkového rozpustného proteinu.

Uvedené výsledky demonstrují růstové podmínky, za kterých je produkován rozpustný protein pHisBot (tj. použití hostitele BL21(DE3)pLysS, médium 2X YT, 30 °C, 1,0 mM IPTG po dobu 5 h).

b) Optimalizace parametrů čištění

Pro optimalizaci podmínek čištění byly výše popsaným postupem pěstovány velké kultury (3x 1 I) při 30 °C a indukovány po dobu 5 h pomocí 1 mM IPTG. Kultury byly spojeny, rozděleny do odstředivkových lahví, ochlazeny a peletovány jako v příkladu 24d. Před použitím byla peleta buněk zmrazená na -70 °C. Každá peleta představovala 1/3 I výchozí kultury a pro každý dále popsaný optimalizační experiment byly používány jednotlivé lahve. Tím byiy standardizovány přijaté bakterie pro každý experiment, takže bylo možno porovnávat výtěžky afinitně čištěného proteinu pHisBot mezi různými optimalizačními experimenty.

i) Vazebná specificita (protonace pH)

Byl připraven lyzát kultury pHisBot v PBS (pH 8,0) a s použitím chromatografického systému Econo (BioRad) nanesen na 3 ml kolonu Ni-NTA, ekvilibrovanou v PBS (pH 8,0), s průtokem 0,2 ml/min (3 až 4 objemy kolony/h). Kolona byla promývána PBS (pH 8,0) do dosažení základní hodnoty absorbance (OD₂₈₀). Pak byl průtok zvýšen na 2 ml/min a kolona byla ekviiibrovány v PBS (pH 7,0). Pro vymytí navázaného proteinu pHisBot z kolony byl aplikován gradient pH (pH 7,0 až 4,0 v PBS). Frakce byly shromážděny a alikvoty byl děleny na gelech SDSPAGE. Gely PAGE byly podrobeny Westernovu blottingu a protein pHisBot byl

193

I I « ·

detekován s použitím kuřecí protilátky proti toxoidu typu A C. botulinum, jak je popsáno v příkladu 22.

Z analýzy Westernových blotů bylo stanoveno, že protein pHisBot se začíná vymývat z kolony Ni-NTA při pH 6,0. To je konzistentní s předpovídanou eluci proteinového monomeru, značeného His, při pH 5,9.

Tyto výsledky demonstrují, že pH, při kterém je protein pHisBot protonován (uvolňován) z pryskyřice Ni-NTA v pufru PBS, je 6,0.

ii) Vazebná specificita (kompetice s imidazolem)

Za účelem definování podmínek čištění, za kterých je možno odstranit nativní proteiny E. coli z kolony Ni-NTA, byl proveden následující experiment. Byl připraven lyzát kultury pHisBot v 50 mM NaHPO₄, 0,5 M NaCl, 8 mM imidazolu (pH 7,0). Tento lyzát byl s použitím chromatografického systému Econo (BioRad) aplikován na sloupec 3 ml Ni-NTA, ekvilibrovaný v 50 mM NaHPO₄, 0,5 M NaCl (pH 7,0). Byl použit průtok 0,2 ml/min (3 až 4 objemy kolony/h). Kolona byla promývána 50 mM NaHPO₄, 0,5 M NaCl (pH 7,0), dokud se absorbance vymývaného roztoku nevrátila na základní hodnotu. Pak byl průtok zvýšen na 2 ml/min.

Kolona byla eluována s použitím stupňovitého gradientu imidazolu [v 50 mM NaHPO₄, 0,5 M NaCl (pH 7,0)]. Eluční stupně představovaly 20 mM, 40 mM, 60 mM, 100 mM, 200 mM, 1,0 M imidazolu s následným promytím 0,1 mM EDTA (pro oddělení niklu z kolony a odstranění veškerého zbylého proteinu). V každém stupni se v promývání pokračovalo, dokud se OD₂₈₀ nevrátilo na základní hodnotu. Frakce byly děleny na gelech SDS-PAGE, podrobeny Westernovu blottingu a protein pHisBot byl detekován s použitím kuřecí protilátky proti toxoidu typu A C. botulinum, jak je popsáno v příkladu 22. Pro detekci eluovaného proteinu v každé frakci byly zdvojené gely barveny Coomassieovou modří.

Výsledky analýzy PAGE ukázaly, že promytím 20 mM imidazolem byla odstraněna většina nespecificky navázaného bakteriálního proteinu a zbylý protein byl odstraněn promytím 40 a 60 mM imidazolu. protein pHisBot se začal vymývat při 100 mM imidazolu a byl kvantitativně eluován v 200 mM imidazolu.

194 ··

I « • * • · • ·

Tyto výsledky přesně definovaly okénko pro vymývání imidazolem, ve kterém dochází k optimálnímu odstranění proteinů E. coli z kolony se současným specifickým zadržením proteinu pHisBot v tomto pufru. Poskytly tak podmínky, za kterých je možno odstranit z proteinu pHisBot kontaminující hostitelské proteiny.

ii) Čistící pufry a optimalizované čistící protokoly

Během vývoje optimalizovaného protokolu pro šaržovité čištění rozpustného proteinu pHisBot byly testovány různé parametry čištění. Výsledky těchto analýz jsou shrnuty dále.

Šaržovité čištění bylo prováděno (jak je popsáno v příkladu 24d) s použitím několika pufrů za účelem stanovení, je-li možno pro vazbu proteinu pHisBot na kolonu Ni-NTA použití alternativní pufry. Bylo zjištěno, že kvantitativní vazby proteinu pHisBot na pryskyřici Ni-NTA se dosáhne buď v pufru Tris-HCl (pH 7,9) nebo NaHPO₄ (pH 8,0). Vazba proteinu pHisBot v pufru NaHPO4 nebyla inhibována při použití 5 mM, 8 mM nebo 60 mM imidazolu. Kvantitativní eiuce navázaného proteinu pHisBot bylo dosaženo v pufrech obsahujících 50 mM NaHPO₄, 0,3 m NaCl (pH 3,5 až 4,0), s nebo bez 10 % glycerolu. Kvantifikací rozpustného afinitně čištěného proteinu pHisBot před a po zmrazení a rozmražení (po několika týdnech skladování afinitně čištěného eluátu při -20 °C) však bylo zjištěno, že s použitím pufru s obsahem glycerolu bylo regenerováno 94 % proteinu, ale při použití pufru bez glycerolu pouze 68 % proteinu. Z toho vyplývá, že glycerol zvyšoval rozpustnost proteinu pHisBot v tomto pufru o nízkém pH, byl-li eluovaný protein uchováván za teplot zmrazování (například -20 °C). Neutralizace pH přídavkem pufru NaH₂PO₄ nevedla ke zjevnému srážení proteinu.

Bylo zjištěno, že ke kvantitativnímu navázání proteinu pHisBot s použitím šaržovitého formátu došlo po 3 h (obr. 30), ale nikoli po 1 h vazby při 4 °C (pryskyřice byla během navazováni míchána). Obr. 30 znázorňuje gel SDS-PAGE, barvený Coomassieovou modří (7,5 % akrylamidu), obsahující vzorky proteinů izolovaných během čištění proteinu pHisBot z lyzátu připraveného z hostitele BL21(DE3)pLysS. Na každý pruh bylo naneseno 5 μΙ vzorku proteinu smíšeného s 5 μΙ 2X vzorkového pufru a zpracováno jako v příkladu 22b. Pruh 1 obsahuje markéry vysoké molekulové

195 ·· ·· • · · · • · · · · · hmotnosti (BioRad). Pruhy 2 a 3 obsahují protein eluovaný z pryskyřice Ni-NTA. pruh 4 obsahuje rozpustný protein po 3 h šaržovité inkubace s pryskyřicí Ni-NTA. Pruhy 5 a 6 obsahují rozpustný, resp. celkový protein. Obr. 30 demonstruje, že protein pHisBot je kompletně rozpustný [srovnej pruhy 5 a 6, které ukazují podobné množství proteinu pHisBot 50 kD; kdyby bylo podstatné množství (větší než 20 %) proteinu pHisBot částečně nerozpustné v buňce hostitele, bylo by v pruhu 6 (celkový protein) pozorováno oproti pruhu 5 (rozpustný protein) více proteinu pHisBot)]. Obr. 30 demonstruje dále, že protein pHisBot ze z lyzátu kompletně odstraněn po šaržovité absorpci pryskyřicí Ni-NTA po dobu 3 h (srovnej pruhy 4 a 5).

Z uváděné vysoké afinitní interakce pryskyřice Ni-NTA s proteiny značenými His (K_d = 1.10'¹³ při pH 8,0) vyplývá, že by mělo být možné manipulovat s komplexy proteinu navázaného na pryskyřici bez významného uvolnění navázaného proteinu. Skutečně bylo zjištěno, že po navázání rekombinačního protein u na pryskyřici NiNTA je komplex pryskyřice-pHisBot vysoce stabilní a zůstává navázaný po opakovaných 2 min cyklech odstředování pryskyřice při 1600 g. Bylo-li toto odstředování prováděno v 50 ml zkumavce (Falcon), vznikla pevná peleta pryskyřice. Tím bylo umožněno odstranění spotřebovaného rozpustného lyzátu slitím supernatantu s následným resuspendováním pelety v promývacím pufru. Další promývání je možno provádět odstředováním. Možnost provádět další promývání umožňuje vyvinout protokoly pro šaržovitou absorpci velkých objemů lyzátu s odstraněním použitého lyzátu prostým odstředěním po navázání rekombinačního proteinu na pryskyřici.

Byl vyvinut následující zjednodušený integrovaný protokol čištění. Byl získán rozpustný lyzát resuspendováním pelety indukovaných buněk ve vazebném pufru [50 mM NaHPO₄, 0,5 M NaCl, 60 mM imidazolu (pH 8,0)], sonifikaci 4 x 20 s a odstředováním po dobu 20 min při 10000 g. Byl přidán NP-40 do 0,1 % a pryskyřice Ni-NTA (ekvilibrovaná ve vazebném pufru). Na litr výchozí kultury bylo použito 8 ml suspenze 1:1 (pryskyřice:vazebný pufr). Směs byla míchána 3 h při 4 °C. Suspenze byla nalita do kolony o vnitřním průměru 1 cm (BioRad), promyta vazebným pufrem s obsahem 0,1 % NP40, pak vazebným pufrem do ustavení základní hodnoty (tyto stupně je možno alternativně provádět odstředěním pryskyřice, resuspendováním ve

196

« · · · • · · • · · · · • · · • · · • · · · vazebném pufru s obsahem NP a následným odstředěním a resuspendováním ve vazebném pufru). Imidazol byl odstraněn promytím pryskyřice 50 mM NaHPO₄, 0,3 M NaCl (pH 7,0). Protein navázaný na pryskyřici byl eluován s použitím stejného pufru (50 mM NaHPO₄, 0,3 M NaCl) se sníženým pH (pH 3,5 až 4,0).

Podle tohoto protokolu bylo provedeno pilotní čištění a bylo získáno 18 mg/l afinitně čištěného pHisBot. Protein pHisBot měl čistotu vyšší než 90 %, hodnoceno Coomassie barvením gelu SDS-PAGE. To představuje nejvyšší pozorovaný výtěžek afinitně čištěného proteinu pHisBot a tento protokol eliminuje potřebu zvláštních vazebných a promývacích pufrů s obsahem imidazolu. Kromě zjednodušeného a účinného protokolu afinitního čištění rekombinačního proteinu pHisBot výše uvedené výsledky poskytují různé podmínky čištění, za nichž je možno izolovat protein pHisBot.

Příklad 26

Protein pHisBot je účinný imunogen

V příkladu 23 bylo demonstrováno, že po nasální imunizaci proteinem pMBot jsou v myším séru vytvářeny neutralizující protilátky. Bylo však zjištěno, že protein pMBot se čistí spolu s významným množstvím endotoxinu, který nelze snadno odstranit. Protein pHisBot může být naproti tomu izolován jako prostý významné kontaminace endotoxinem, což jej činí nejlepším kandidátem pro výrobu vakciny. Pro další hodnocení vhodnosti pHisBot jako vakciny byla následujícím způsobem stanovena imunogenita proteinu pHisBot a provedeno porovnání relativní imunogenity proteinů pMBot a pHisBot u myší.

Dvě skupiny po osmi myších BALBc byly imunizovány buď proteinem pMBot nebo proteinem pHisBot s použitím Gerbuho adjuvans (CC Biotech). Protein pMBot (v PBS s obsahem 10 mM maltózy) nebo protein pHisBot (v 50 mM NaHPO₄, 0,3 M NaCl, 10 % glycerolu, pH 4,0) byl smísen s Gerbuho adjuvans a použit k imunizaci myší. Každá myš dostala v den 0 IP injekci 100 μΙ směsi antigen/adjuvans (50 pg antigenu plus 1 μg adjuvans). Posilovači dávky byly podávány výše popsaným

197 • · • · 9

9 9

9 9 9 9

9 9

9 99 • · • · · · • » a • · ι způsobem s tou výjimkou, že v den 14 a 28 byly podávány IM cestou. V den 77 byla myším odebrána krev a byly stanoveny titry proti toxoidu typu A C. botulinum s použitím séra odebraného od jednotlivých myší v každé skupině (jak je popsáno v příkladu 23). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 41.

Tabulka 41. Titry sérového IgG proti toxoidu typu A C. botulinum u jednotlivých myší imunizovaných proteinem pMBot nebo pHisBot

	preimunní1	pMBot2	pHisBot2
	ředění vzorku	ředění vzorku	ředění vzorku
myš	1:50	1:250	1:1250	1:6250	1:50	1:250	1:1250	1:6250	1:50	1:250	1:1250	1:620
1					0,678	0,190	0,055	0,007	1,574	0,799	0,320	0,093
2					1,161	0,931	0,254	0,075	1,513	0,829	0,409	0,134
3					1,364	0,458	0,195	0,041	1,596	1,028	1,453	0,122
4					1,622	1,189	0,334	0,067	1,552	0,840	0,348	0,090
5					1,612	1,030	0,289	0,067	1,629	1,580	0,895	0,233
6					0,913	1,242	0,069	0,013	1,485	0,952	0,477	0,145
7					0,910	0,235	0,058	0,014	1,524	0,725	0,269	0,069
8					0,747	0,234	0,058	0,014	1,274	0,427	0,116	0,029
stř. titr	0,048	0,021	0,011	0,002	1,133	0,564	0,164	0,037	1,518	0,896	0,411	0,411

¹ preimunní vzorek představuje průměr ze dvou sad jamek obsahujících sérum z jednotlivé myši imunizované rekombinačním antigenem enterotoxinu B Staphylococcus (SEB). Tento antigen není imunologicky příbuzný toxinu C. botulinum a poskytuje kontrolní sérum ² průměr ze zdvojených jamek

Výsledky uvedené v tabulce 41 demonstrují, že jak protein pMBot, tak protein pHisBot je u myší imunogenní, protože 100 % myší (8/8) v každé skupině sérokonvertovalo z neimunního do imunního stavu. Výsledky dále ukazují, že průměrný titr IgG proti toxoidu typu A C. botulinum je po imunizaci proteinem pHisBot

198 « · · · * · I • · ·· • · · · • · a • · <

» · · až 3krát vyšší oproti imunizaci proteinem pMBot. Z toho vyplývá, že protein pHisBot může být lepším imunogenem než protein pMBot.

Příklad 27

Imunizace rekombinačním proteinem pHisBot vytváří neutralizující protilátky

Výsledky uvedené v příkladu 26 demonstrují, že jak protein pHisBot, tak protein pMBot je schopen indukovat v imunizovaných hostitelích vysoký titr protilátek reaktivních proti toxoidu typu A C. botulinum. Pomocí myšího neutralizačního testu, popsaného v příkladu 23b, byla zjišťována schopnost imunního séra z myší, imunizovaných buď proteinem pHisBot nebo pMBot, neutralizovat toxoid typu A C. botulinum in vivo.

Dvě skupiny po osmi myších BALBc, imunizované v příkladu 26 buď proteinem pMBot nebo proteinem pHisBot, dostaly po jednom týdnu po odebrání krve v den 77 další posilovači dávku. Tato dávka byla provedena smísením proteinu pMBot (v PBS s obsahem 10 mM maltózy) nebo proteinu pHisBot (v 50 mM NaHPO₄, 0,3 M NaCl, 10 % glycerolu, pH 4,0) s Gerbuho adjuvans podle příkladu 26. Každá myš dostala IP injekci 100 μί směsi antigen/adjuvans (50 pg antigenu plus 1 pg adjuvans). 6 dní po této posilovači dávce byla myším odebrána krev a sérum z myší ve skupině bylo spojeno. Rovněž bylo odebráno sérum preimunních myší (toto sérum je stejné jako sérum uvedené v poznámce k tabulce 40).

Přítomnost neutralizujících protilátek ve spojeném nebo preimunním séru byla detekována imunizací myší 5 jednotkami LD₅₀ toxoidu typu A smíšeného se 100 pl spojeného séra. Imunizace byla prováděna smísením (pro každou ošetřovanou myš) 100 pl séra z každé skupiny se 100 pl čištěného standardu čištěného toxinu typu A (50 LD₅₀/ml připraveného podle příkladu 23b) a 500 pl gel-fosfátu. Tyto směsi byly inkubovány 30 min pri teplotě místnosti s občasným zamícháním. Směsi byly injekčně IP aplikovány každé ze čtyř myší (0,7 ml/myš). Po dobu 72 h byly myši sledovány z hlediska znaků botulismu. Myši, které dostaly toxin smísený se sérem z myší imunizovaných buď proteinem pHisBot nebo pMBot, nevykazovaly žádné

199 • · • · · · ··· · · · • · ·· ·· «·· ·· ·♦ znaky intoxikace botulismem. Naproti tomu myši, které dostaly preimunní sérum, během méně než 24 h uhynuly.

Tyto výsledky demonstrují, že použije-li se jako imunogen kterýkoli z rekombinačních proteinů pHisBot nebo pMBot fragmentu C C. botulinum, jsou indukovány protilátky schopné neutralizovat toxin typu A C. botulinum.

Příklad 28

Exprese a čištění rekombinačních proteinů toxinu A C. difficile, obsahujících interval 1870-2680, 1870-2190 a 1960-2680

Jiní autoři již vytvořili protilátky proti toxinu A C. difficile aktivní imunizací křečků proti rekombinačnímu polypeptidu umístěnému v oblasti intervalu 6 [Lyerly, D.M. a d. (1990), Curr. Microbiol. 21:29], Struktura rekombinačního klonu, použitého Lyerlym a d. [(1990), Curr. Microbiol. 21:29], je schematicky znázorněna na obr. 31 jako pUC1960-2680.

Na obr. 31 jsou použity následující zkratky: pP označuje vektor pET23, pM označuje vektor pMal-c, pGEX označuje vektor pGEX, Trx označuje thioredoxin, pUC označuje vektor pUC9, A označuje toxin A C. difficile. Čísla označují interval aminokyselin, exprimovaný v daném konstruktu. Plné černé čtverečky představují kódující oblasti, prázdný čtvereček na 3’ konci konstruktu pUC1960-2680 představuje část α-peptidu genu lacZ, který je kódován sekvencemi vektoru. Plné oválky představují MBP. „HHH“ představuje polyhistidinový úsek. Prázdné kroužky představují thioredoxin. Šrafované oválky představují GST.

S použitím křeččího modelu nemoci související s C. difficile (CDAD), kdy se protilátky podávají profylakticky, byly pouze protilátky Lyerlyho a d. (intra-interval 6; pUC1960-2680) schopny částečně chránit křečky proti infekci C. difficile, hodnoceno přežitím (přežila 4 z 8 zvířat), a tyto protilátky navíc nezabránily u žádného zvířete průjmu. Zvířata ošetřovaná protilátkami intra-interval 6 [Lyerly a d. (1990), viz výše] navíc po skončení ošetření uhynula. Naproti tomu bylo v příkladu 16 demonstrováno, že pasivní aplikace protilátek proti intervalu 6 (anti-pMA1870-2680) zabraňuje průjmu

200

u 6 ze 7 zvířat a v modelovém systém profylaktického ošetření kompletně brání úhynu v důsledku CDAD. Pasivní aplikace protilátek proti intervalu 6 navíc poskytuje dlouhodobé vyléčení (tj. léčbu je možno bez nehody zastavit).

Zatímco se o Lyerlyho protilátkách uvádí, že poskytují určitou ochranu proti CDAD, nebyl zaznamenána integrita a čistota rekombinačního proteinu exprimovaného z konstruktu pUC1960-2680. Konstrukt pUC1960-2680 potenciálně exprimuje ve vektoru pUC9 interval aa 1960-2680 toxinů A C. difficile·, tento interval je uložen v klonu pMA1870-2680 (viz obr. 31).

Tento příklad zahrnoval: (a) konstrukci pUC1960-2680 a charakterizaci exprimovaného proteinu Western blot analýzou, (b) klonování a expresi intervalu 1960-2680 jako afinitně značeného proteinu ve vektorech pET a pMal a (c) afinitní čištění a charakterizaci rozpustných proteinů, značených MBP, z klonů exprimujících intervaly 1870-2680, 1870-2190 nebo 1960-2680.

a) Konstrukce pUC1960-2680 a charakterizace exprimovaného proteinu

Western blot analýzou

Konstrukt pUC1960-2680 obsahuje fragment genu toxinů A C. difficile, kódující 33 z 38 opakujících se jednotek; tento konstrukt byl vytvořen, aby poskytl stejný rekombinačni protein, jaký použil Lyeriy a d. [(1990) Curr. Microbiol. 21:29] pro vytvoření protilátek proti toxinů a C. difficile. pUC1960-2680 byl konstruován tímto způsobem: Stručně řečeno byl z pPA1100-2680 (příklad 11) odebrán fragment Pstl, obsahující repetice toxinů A C. difficile, a klonován do pUC9, který byl rozštěpen Ps/I a defosforylován. Defosforylační reakce byla provedena s použitím telecí střevní alkalické fosfatasy (CIP) podle pokynů výrobce (New England Biolabs). Po restrikčním štěpení a ošetření CIP byly reakční produkty rozděleny na agarózovém gelu a příslušné fragmenty byly vyříznuty, smíseny a čištěny pomocí soupravy Prepa-Gene (BioRad). eluovaná DNA byla ligována, transformována do kompetentních buněk JM109 a byly izolovány rekombinačni klony a potvrzeny restrikčním štěpením s použitím standardních metod molekulární biologie. Plasmidová DNA byla izolována pomocí soupravy QIA-prep spin plasmid (Qiagen).

201 • · • · · · • · • ·

Byly kultivovány JM109 obsahující konstrukt pUC1960-2680, indukovány a popsaným způsobem [Lyerly a d. (1990), Curr Microbiol. 21:29] byly připraveny totální a rozpustné extrakty. Stručně řečeno bylo 500 ml kultury média Terrific inokulováno pUC1960-2680 (v JM109) a kultivováno při 37 °C do časné stacionární fáze /0,8 ODgoo). Byl přidán IPTG do konečné koncentrace 1 mM a kultura byla indukována po dobu 2 h. Před přídavkem IPTG byl odebrán alikvot 1 ml kultury a soužil jako neindukovaný vzorek. Po 2 h kultivace v přítomnosti IPTG byl odebrán další alikvot 1 ml kultury a sloužil jako indukovaný vzorek. Oba tyto vzorky byly zpracovány následovně. Bakterie byly peletovány odstředěním. Pelety buněk byly resuspendovány ve 100 μΙ 2x vzorkového pufru (0,125 mM Tris-HCi, pH 6,8, 2 mM EDTA, 6 % SDS, 20 % glycerolu, 0,25 % bromfenolové modři; před použitím byl přidán β-merkaptoethanol do 5 %).

Zbylá kultura pak byla zpracována pro přípravu totálního a rozpustného extraktu pro analýzu. Kultura byla rozdělena do 500 ml odstředivkových lahviček. Lahvičky byly 15 min chlazeny v lázni ledu a vody a buňky byly peletovány odstředěním při 5000 min'¹ v odstředivce Beckman JA10. Peleta buněk byla resuspendována v 1/10 počátečního objemu kultury (tj. 50 ml) TBS (0,05 M Tris-HCI, 0,15 M NaCl, pH 7,5) a rozdělena do dvou 35 ml zkumavek Oakridge. Do každé zkumavky bylo přidáno 1,25 ml 10 mg/ml roztoku lysozymu (v TBS) a směsi byly inkubovány 20 min na ledu. Zkumavky byly ponechány přes noc při -70 °C. jedna ze dvou zkumavek z indukované kultury pak byla rozmražena a sonifikována na ledové vodě s použitím čtyř dvacetisekundových impulsů (Branson Sonifier model 45é nastavený na hodnotu 5 až 6). Vzorek byl vyčeřen odstřeďováním po dobu 20 min při 9000 min'¹ (Beckman J2-21) a rozpustný lyzát byl sterilně filtrován přes filtr 0,45 μιτη. Pro elektroforézu byl připraven totální (před odstředěním) a rozpustný (po sterilní filtraci) extrakt smísením 4 μΙ extraktu se 16 μΙ PBS a 20 μΙ 2x vzorkového pufru.

Vzorky proteinů byly rozděleny elektroforézou na gelu 12,5 % SDS-PAGE a proteiny byly detekovány buď barvením Coomassie blue (detekuje všechny proteiny) a analýzou Westernových blotů (detekuje specifické proteiny) s použitím kozí protilátky specifické proti toxinu A (TechLabs) následovně. Na gely 12,5 % SDSPAGE byly naneseny vzorky proteinů. Po elektroforéze byl gel rozdělen na dva díly.

202 • · · » · · · ···* « · ··· * · · · · ·· • · « » · · · » · ··· · · • · · · ··· · · · ·· ··> ·· «·· ·· ·· polovina byla obarvena Coomassie blue a proteiny na druhé polovině byly přeneseny na pevný nosič pro analýzu westernových blotů. Přenos proteinů byl potvrzen barvením pomocí Ponceau S (jako v příkladu 12b). Blot byl pak inkubován po dobu 1 h při 20 °C v PBS s obsahem 0,1 % Tween 20 (PBST) a 5 % mléka (blokující pufr). pak bylo přidáno 10 ml roztoku obsahujícího ředění 1/1000 afinitně čištěné kozí protilátky proti toxinů A C. difficile (Tech Lab) v blokujícím pufru a blot byl inkubován 1 h při teplotě místnosti. Pak byl blot promyt a přítomnost navázané protilátky proti C. difficile byla detekována pomocí králičího anti-kozího konjugátu alkalické fosfatasy jako sekundární protilátky, jak je uvedeno v příkladu 3. Výsledný gel, obarvený Coomassie blue, a vyvinutý Westernův blot jsou znázorněny na obr. 32.

Na obr. 32 je gel obarvený Coomassie blue znázorněn vlevo (pruhy 1 až 5) a Westernův blot vpravo (pruhy 6 až 9), Jsou použity tyto zkratky: neindukovaný (U), indukovaný (I), totální (T), rozpustný (S) a molekulární markéry pro široké rozmezí (M; BioRad). Velikost markérů molekulové hmotnosti je uvedena čísly napravo od pruhu 5. Obr. 32 ukazuje, že barvením Coomassie blue nejsou detekovatelné indukované pásy odpovídající velikosti očekávané pro rekombinační protein pUC1960-2680. Detekce materiálu, reaktivního s toxinem A C. difficile, Westernovým blotem však odhalila převládající indukovatelný protein o molekulové hmotnosti předpokládané pro plnou délku rekombinačního proteinu toxinů A C. difficile. Přestože je určitá část indukovaného proteinu rozpustná, jeho většina je nerozpustná [srovnej množství proteinu reaktivního s protilátkou přítomnou v pruzích 8 (celkový) a 9 (rozpustný)]. Rekombinační protein, produkovaný pUC1960-2680, byl rovněž jasně nestabilní, protože rozkladné produkty byly detekovány i v neindukovaných (pruh 6) nebo indukovaných (pruh 7) vzorcích kultury.

b) Klonování a exprese intervalu 1960-2680 jako afinitně značeného proteinu ve vektorech pET a pMal

Jak výše prokázáno, je protein produkovaný konstruktem pUC1960-2680 nestabilní (tj. náchylný k proteolytické degradaci) a dále nemá afinitní značku. Nestabilita proteinu pUC1960-2680 může být důsledkem přítomnosti α-peptidu genu lacZ na C-terminálním konci fúzního proteinu; je známo, že přítomnost těchto

203

sekvencí na fúzním proteinu vede k produkci nestálého proteinu. Za účelem zjištění, zda je možno izolovat rozpustný stabilní afinitně čištěný fúzní protein představující interval pUC1960-2680, byly připraveny následující dva konstrukty: Konstrukt pPA1960-2680 obsahuje interval 1960-2680 toxinu A C. difficile ve vektoru pET23c (Novagen). Řada vektorů pET23 umožňuje expresi vložených genů ve formě fúzního proteinu obsahujícího polyhistidinovou značku buď na C-terminálním nebo Nterminálním konci fúzního proteinu; konstrukt pPA1960-2680 exprimuje repetiční oblast toxinu A C. difficile jako fúzní protein obsahující C-terminální polyhistidinový úsek. Konstrukt pMA1960-2680 obsahuje interval 1960-2680 toxinu A C. difficile ve vektoru pMal-c (New England BioLabs) a exprimuje fúzní protein, obsahující na Nterminálním konci MBP.

Konstrukt pPA1960-2680 byl získán následovně: Způsoby uvedenými v odstavci (a) byl izolován klon pUC1960-2680, v němž byl 2,1 kb fragment Psfl v opačné transkripční orientaci (vzhledem ke směru transkripce skrze sekvence LacZ na vektoru). Insert toxinu A C. difficile byl oddělen štěpením BamHI a Hind\\\ a způsobem uvedeným v odstavci (a) byl klonován do vektoru pET23c (Novagen), štěpeného pomocí BamHI a HindlW.

Konstrukt pMA1960-2680 byl vytvořen klonováním repetiční oblasti toxinu A C. difficile z pPA1960-2680 ve formě Nhe\-Hind\\\ fragmentu do vektoru pMal-c, štěpeného Xbal (konce Xbal jsou kompatibilní s konci Nhel) a H/nďlll.

Exprese rekombinačního proteinu z těchto dvou plasmidů byla hodnocena v malém měřítku v kulturách pěstovaných při 30 °C s použitím hostitelů BL21(DE3)pLysS (pPA1960-2680) nebo BL21pLysS (pMA1960-2680). Byly měněny tyto podmínky: kultivační médium (2X YT, LB, Terrific) a množství induktoru (0,1, 0,3 nebo 1,0 mM IPTG). Byly testovány všechny kombinace těchto proměnných [kromě média Terrific, v němž byla testována pouze jedna koncentrace (1 mM) IPTG]. Množství rekombinačního proteinu, exprimovaného po indukci, a rozpustnost rekombinačního proteinu byla hodnocena SDS-PAGE analýzou celkového a rozpustného extraktu (připraveného ze vzorků po 1 ml, jak je uvedeno v příkladu 25). Všechny kultury byly pěstovány v 15 ml zkumavkách (Falcon 2057); veškeré kultivační médium bylo přes noc předehřátou na příslušnou teplotu a doplněno 100 «· fc · » » · · · · • · 99 ► · · « » 9 99

999 9 «

9 «

9 99

204 • · · ··* · · · · · · · · ιί ·········· ·· ·* ·· ··· ·· ·· pg/ml ampicilinu a glukózou do 0,2 %. Kultury byly pěstovány v inkubátoru na otočném disku (k zajištění provzdušňování) do hodnoty OD₆₀₀ přibližně 0,5 až 0,7 a indukovány uvedenou koncentrací IPTG.

Ve všech případech byla pozorována vysoká úroveň exprese nerozpustného proteinu pPA1960-2680 bez ohledu na použité médium nebo koncentraci induktoru. Protein pMA1960-2680 byl za všech testovaných podmínek částečně rozpustný, přičemž maximální množství rozpustného proteinu bylo produkováno v médiu 2X YT při nižších koncentracích induktoru (tj. 0,1 a 0,3 mM IPTG).

Tyto výsledky demonstrují, že exprese intervalu 1960-2680 toxinu A C. difficile v konstruktu pPY1960-2680 vede za testovaných podmínek k produkci nerozpustného rekombinačního proteinu. Exprese tohoto intervalu v konstruktu pMA1960-2680 umožnila expresi určitého množství rozpustného proteinu.

c) Afinitní čištění a charakterizace rozpustných MBP-značených proteinů z konstruktů exprimujících intervaly 1870-2680, 1870-2190 nebo 1960-2680 toxinu A C. difficile

Byly pěstovány větší (1 litr) kultury vektoru pMal-c (tj. vektoru neobsahujícího insert) a každého z dále uvedených konstruktů, načež byly indukovány a byly izolovány frakce rozpustného proteinu: pMA1870-2190 (příklad 17), pMA1960-2680 (příklad 28b) a pMA1870-2680 [příklad 11: interval 6; interval 6 obsahuje aminokyselinové zbytky 1873 až 2684 (SEQ ID NO:29) proteinu toxinu A C. difficile]. Tyto kultury byly pěstovány při 32 °C v médiu 2X YT a exprese rekombinačního proteinu byla indukována přídavkem IPTG to 0,3 mM při OD₆₀₀ 0,6. Kultury byly indukovány po dobu 4 až 5 h a pak byly buňky získávány. Byly připraveny extrakty rozpustných proteinů a podrobeny afinitní chromatografii za účelem izolace rekombinačního fúzního proteinu (příklad 11d) a analyzovány barvením Coomassie a Westernovou analýzou (popsanou v příkladu 11 b).

Stručně řečeno byly připraveny rozpustné extrakty a naneseny v PBS na sloupec amyiózové pryskyřice (New England Biolabs). Sloupec byl eluován PBS s obsahem 10 mM maltózy. Výtěžek proteinu činil pro každý rekombinant 40 mg na 1

205

I výchozího objemu (tj. 1 I kultur). Vzorky proteinů byly analyzovány elektroforézou na 7,5% SDS-PAGE gelech s následným barvením Coomassieovou modří a analýzou Westernových blotú, jak je uvedeno v odstavci (a). Vzorky proteinů byly připraveny elektroforézou smísením 1 μί celkového (T) nebo rozpustného (S) proteinu s 4 μΙ PBS a 5 μΙ 2X vzorkového pufru nebo 5 μΙ eluovaného (E) proteinu a 5 μΙ 2X vzorkového pufru nebo 0,5 μί eluovaného proteinu, 4,5 μΙ PBS a 5 μί 2X vzorkového pufru (1/1 OE). Na gelu byly rovněž rozděleny vzorky pMA1870-2680 a pPA1870-2680 (preparáty inkluzních tělísek popsané v příkladu 11). Vzorky byly zahřívány 5 min na 95 °C, pak ochlazeny a naneseny na gel 7,5 % SDS-PAGE. Byly naneseny rovněž markéry širokého rozmezí molekulové hmotnosti (BioRad) pro odhad molekulové hmotnosti identifikovaných fúzních proteinů.

Po elektroforéze byl protein detekován barvením Coomassieovou modří nebo byly proteiny podrobeny Westernovu blotu s použitím kozí protilátky proti toxinu A (Tech Labs), jak je uvedeno v odstavci (a). Výsledný gel a Westernův blot je znázorněn na obr. 33.

Na obr. 33 je gel barvený Coomassieovou modří znázorněn vlevo (pruhy 1 až 10) a Westernův blot vpravo (pruhy 1’ až 10’). pruhy 1 až 10 a 1’ až 10’ představují navzájem zrcadlové obrazy a obsahují tyto vzorky: pruhy 1 a 1’ obsahují pMA18702190 (T), pruhy 2 a 2’ obsahují pMA1870-2190 (E), pruhy 3 a 3’ obsahují pMA19602680 )T), pruhy 4 a 4’ obsahují pMA1960-2680 (S), pruhy 5 a 5’ obsahují pMA19602680 (E), pruhy 6 a 6’ obsahují pMA1960-2680 (1/10 E), pruhy 7 a 7’ obsahují pMA1870-2680 (E), pruhy 8 a 8’ obsahují pMA1870-2680 (1/10 E), pruhy 9 a 9’ obsahují pPA1870-2680 (N/C) (E) [pPA1870-2680(N/C) je popsán v příkladech 15 a 29d] a pruhy 10 a 10’ obsahují markéry molekulové hmotnosti.

Výsledky znázorněné na obr. 33 demonstrují, že:

1) Protein pMA1870-2190 byl za použitých růstových podmínek nestálý, ale alespoň částečně rozpustný. Afinitně čištěný preparát pMA1870-2190 však neobsahuje významné koncentrace fúzního proteinu o plné délce (obr. 33, pruh 2).

206

2) Protein pMA1960-2680 byl částečně rozpustný (srovnej pruhy 3’ a 4’ na obr. 33) a integrita afinitně čištěného proteinu (obr. 33, pruhy 5’ a 6’) byla srovnatelná s preparátem pMA1870-2680 (obr. 33, pruh 2).

3) Proteiny plné délky pMA1960-2680, pMA1870-2680 a pPA1870-2680 vážou protilátku proti toxinu A C. difficile, zatímco protein plné délky pMA1870-2190 ji neváže (avšak menší rozkladné produkty proteinu pMA1870-2190 se na protilátku vážou, jak je znázorněno na obr. 33, pruhy 1’ a 2’). To implikuje, že buď jsou epitopy identifikované protilátkou přítomny pouze na C-terminálním konci repetic nebo že protilátky rozpoznávají konformaci, která nemůže vzniknout s N-terminálním fragmentem, představovaným pMA1870-2190. Toto zjištění je podobné nedostatku reaktivity N-terminálních fragmentů genu toxinu B C. difficile (pMB1750-1970) s protilátkou proti toxinu B (Tech Labs) na Westernových biotech, pozorovanému v příkladu 19b (obr. 24).

Výše uvedené výsledky poskytují postup získání afinitně čištěného rekombinačního proteinu toxinu A C. difficile z intervalů 1870-2190 a 1960-2680. Tyto výsledky jsou v rozporu s výsledky získanými při použití konstruktu pUC1960-2680, který byl připraven podle popisu Lyerlyho a d. [(1990) Curr. Microbiol. 21:29], Protein exprimovaný konstruktem pUC1960-2680 byl převážně nerozpustný a nemohl být afinitně čištěn pro nepřítomnost afinitní značky na rekombinačním proteinu.

Příklad 29

Čištění rozpustného proteinu pPA1870-2680(N/C), v podstatě prostého endotoxinu

Pro potenciální použití jako humánní vakcina (tj. pro vyvolání aktivní imunity) nebo jako antigenu v hostitelském živočichovi pro vyvolání tvorby ochranných protilátek (tj. antitoxinu) pro pasivní imunizaci lidí je třeba, aby proteinový antigen byl 1) snadno čistitelný, 1) dobře charakterizovatelný a s vysokou čistotou, 3) s nízkým obsahem pyrogenů (používá-li se jako humánní vakcina), 4) imunogenní a 5) schopný indukovat ochrannou imunitní odpověď. V případě repetičního antigenu toxinu A C. difficile musí být protein rozpustný a schopný zaujímat konformaci, která

207 • · vyvolá ochrannou reakci. Jak bylo prokázáno v příkladu 17, byl-li protein pPA18702680(N/C), který byl exprimován jako nerozpustný protein uvnitř inkluzních tělísek, solubilizován pomocí SDS a pak použit k imunizaci kuřat, nebyly produkovány žádné ochranné protilátky proti toxinu A.

V tomto příkladu byly exprimovány rekombinační proteiny toxinu A C. difficile a hodnoceny s použitím výše uvedených kriterií z hlediska použitelnosti pro vakciny. Tento příklad zahrnoval: a) hodnocení použitelnosti afinitně čištěného proteinu pMA1870-2680 jako vakcinového antigenu, b) konstrukci, čištění a hodnocení proteinu pGA1870-2680, c) vývoj postupu pro produkci rozpustného pPA1870-2680,

d) konstrukci pPA1870-2680(N) a čištění N, C a N/C-his značeného proteinu 18702680 ve velkém měřítku, e) konstrukci pPTrxA1870-2680(N) (G) a (N/C) a čištění N, C a N/C-his značených proteinů Trx 1870-2681 ve velkém měřítku, f) afinitní čištění proteinů pPA1870-2680 a pPB1750-2360 ve velkém měřítku a stanovení hladin endotoxinů a g) konstrukci, afinitní čištění pPB1750-2360(N/C) ve velkém měřítku a stanovení hladin endotoxinů.

a) Hodnocení použitelnosti afinitně čištěného proteinu pMA1870-2680 jako vakcinového antigenu

I když se ukázalo, že protein pMA1870-2680 (příklad 11) je snadno čistitelný, imunogenní a schopný indukovat ochrannou odpověď (příklad 17), je možnost použít tento protein jako vakcinu limitována špatnou čistotou afinitně čištěného proteinu (viz obr. 33, pruhy 7’ a 8’) Bylo odhadnuto, že pouze 50 % afinitně čištěného proteinu představuje fúzní protein plné délky. Zbytek proteinů v afinitně čištěném preparátu, jak bylo zjištěno, je primárně MBP samotný a kontaminující proteiny E. coli.

Za účelem zjištěním, zda je možno použít afinitně čištěný protein pMA18702680 jako případnou vakcinu, byl stanoven obsah endotoxinů ve dvou nezávisle afinitně čištěných preparátech pMA1870-2680. Obsah pyrogenů ve vzorku byl zjišťován testem Limulus (kit LAL; Associates of Cápe Cod), jak je popsán v příkladu 24d. Bylo zjištěno, že oba vzorky afinitně čištěného pMA1870-2680 obsahují vysokou hladinu endotoxinů (> 50000 EU/mg čištěného rekombinačního proteinu). Jak je zřejmé z příkladů 24a a 24b, bylo zjištěno, že vysoká endotoxinová zátěž je obecným i

208

99 99 ··· · 9 ·· 9 9 9 9 • 9 999 9 9 · 9 9 99

99 999 9 9 9 999 9 ·

9999 99 9 999

A9 ·· 99 999 99 99 znakem afinitně čištěných fúzních proteinů MBP nebo MBP samotného. Výše uvedené výsledky naznačují, že fúzní proteiny toxinu A C. difficile, afinitně čištěné současnými postupy, nejsou vhodné pro použití jako vakcinové antigeny.

Expresní konstrukt pMA1870-2680 byl navržen pro usnadnění čištění proteinu toxinu A od značky MBP rozštěpením fúzního proteinu na vytvořeném místu štěpení faktorem Xa, umístěném mezi doménou MBP a doménou proteinu toxinu A. Byla hodnocena schůdnost získávání v podstatě endotoxinu prostého rozpustného proteinu toxinu A C. difficile čištěním odštěpeného proteinu toxinu A C. difficile od fúzního proteinu MBP-toxin A. Faktor Xa (New England Biolabs) byl přidán k afinitně čištěnému proteinu pMA1870-2680 (poměr 0, 0,2, 0,5 1,0 a 2,5 % faktoru Xa/protein pMA1870-2680) v PBS s obsahem 10 mM maltózy a směsi byly inkubovány 5,5 a 20 h při teplotě místnosti. Rozsah štěpení byl hodnocen barvením proteinů pomocí Coomassie blue po elektroforéze na gelech SDS-PAGE.

Výsledky prokázaly, že u vzorku s 2,5 % faktoru Xa bylo zaznamenáno určité štěpení po 20 h, ale toho štěpení bylo pouze částečné. Naznačuje to, že štěpení pMA1870-2680 s použitím výše testovaných reakčních podmínek není účinná purifikační strategie pro získání rozpustného endotoxinu prostého repetičního proteinu toxinu A C. difficile.

b) Konstrukce, čištění a hodnocení proteinu pG1870-2680

Pro usnadnění hodnocení proteinů obsahujících GST jako prostředku pro velkoobjemovou produkci antigenů byly repetice toxinu A C. difficile exprirnovány jako fúze s GST. Repetice toxinu A C. difficile byly izolovány štěpením pPA1100-2680 (příklad 11) Spěl s následným ošetřením Kienowovým fragmentem pro vyplnění konců; Dna pak byla štěpena pomocí Xho\. Fragment Spěl (Klenowem vyplněný)Xho\ byl klonován do EcoRi (Klenowem vyplněný)-X/7ol-štěpeného vektoru pGEX3T (Pharmacia) za vzniku expresního konstruktu pGA1870-2680.

Velkoobjemová (1 litr) kultura pGA1870-2680 [v hostitelských buňkách BL21 (Novagen)] byla pěstována v médiu 2X YT s obsahem 50 pg/ml ampicilinu a indukována (s použitím IPTG do 1,0 mM) po dobu 3 h při 30 °C způsobem popsaným

209 ·· ·· • · · • · · ·· • · 4 4

4 4 4

49

44

9 4 9

9 49

444 4 · • · · • ·· ·· v příkladu 28. Byl připraven rozpustný lyzát velkoobjemové kultury pGA1870-2680 (resuspendované v PBS) a použit k afinitnímu čištění rozpustného afinitně značeného proteinu. Lyzát pGA1870-2680 byl afinitně čištěn na pryskyřici glutathionagaróza (Pharmacia) postupem podle [Smith a Corcoran, Current Protocols in Molecular Biology, Suppl. 28 (1994), str. 16.7.1-16.7.7] s výjimkou, že navázání proteinu na pryskyřici probíhalo po dobu 1 h při 4 °C.

Stručně řečeno byly po 3 h indukce 1 I kultury buňky získány odstředěním po dobu 10 min při teplotě místnosti při 5000 g. Peleta buněk byla resuspendována v 10 ml ledově chladného PBS. Pak byly buňky porušeny sonifikací, jak je uvedeno v příkladu 24 d. Byl přidán Triton X-100 do konečné koncentrace 1 % a vzorek byl důkladně promíchán. Nerozpustný odpad byl odstraněn odstřeďováním vzorku po dobu 5 min při 4 °C při 10000 g. Supernatant byl opatrně odebrán a přidán k 1 ml 50% suspenze glutathion-agarózovým kuličkám (Pharmacia). Směs byla ponechána inkubovat po dobu 1 h při 4 °C pro navázání GST-značeného fúzního proteinu na pryskyřici. Glutathion-agarózové kuličky pak byly promyty přídavkem 50 ml ledově chladného PBS, rozmícháním a odstřeďováním po dobu 10 s při teplotě místnosti při 500 g. Promývací krok byl dvakrát opakován (tj. celkem 3 promytí). Pryskyřice byla resuspendována v 1 ml ledově chladného PBS a přenesena do 1,5 ml mikrocentrifugovací nádobky. Pryskyřice byla peletována odstředěním po dobu 10 s při teplotě místnosti při 500 g. Supernatant byl odebrán a fúzní protein byl z pryskyřice vymyt přídavkem 1 ml 50 mM Tris-HCI (pH 8,0) a 5 mM redukovaného glutathionu. Nádobka byla 2 min mírně promíchávána a pak odstřeďována 1% s při teplotě místnosti při 500 g. Eluce byla dvakrát opakována a supernatanty byly spojeny. Spojený supernatant, obsahující eluovaný fúzní protein, byl uchováván v roztoku obsahujícím 50 mM Tris-HCI (pH 8,0), 5 mM redukovaného glutathionu a 10 % glycerolu. Obsah endotoxinu v čištěném fúzním proteinu byl stanoven s použitím kitu LAL, jak je uvedeno v příkladu 24d.

Vzorky ze stupně kultivace, indukce a čištění (neindukovaným indukovaným totální, rozpustný a afinitně čištěný eluát) byly děleny na gelech SDS-PAGE a proteiny byly detekovány barvením Coomassieovou modří (jak uvedeno v příkladu 28). Bylo zjištěno, že fúzní protein je částečně rozpustný (tj. většina proteinu zůstala

21Λ ..

• · · · · ······* ······· • · · · · · • · · · · · v peletě) a afinitně čištěno bylo přibližně 0,5 mg/l výchozí kultury proteinu převážně plné délky. Afinitně čištěný preparát obsahoval přibližně 5000 EU/mg afinitně čištěného fúzního proteinu. Z těchto výsledků vyplývá, že za výše uvedených podmínek expresní systém pGEX neusnadňuje vysokou produkci rekombinačního fúzního proteinu toxinu A C. difficile a získaný protein obsahuje významnou kontaminaci endotoxinem.

c) Vývoj pracovního postupu pro produkci rozpustného pPA1870-2680

V příkladu 11 bylo prokázáno, že indukovaný protein pPA1870-2680, je-li produkován kultivací při 37 °C, je téměř zcela nerozpustný. Pro zjištění, zda je možno rozpustnost zvýšit expresí při nižší teplotě, byla pěstována kultura pPA18702680(N/C) při 30 °C a stanovena hladina rozpustného afinitně čistitelného proteinu. Rozpustný lyzát (v 1X vazebném pufru Novagen) z indukovaného 1 I kultury 2X YT byl připraven dále popsaným způsobem.

Stručně řečeno byla kultura pPA1870-2680(N/C) [v hostiteli BL21(DE3)pLysS] pěstována při 30 °C do OD₆₀₀ 0,9 v 1 I média 2X YT s obsahem 100 pg/ml ampicilinu, 34 pg/ml chloramfenikolu a 0,2 % glukózy. Exprese proteinu byla indukována přídavkem IPTG do 1 mM. Po 5 h indukce byly buňky po dobu 15 min chlazeny na lázni ledové vody a pak odstřecfovány 10 min při 4 °C při 5000 g v odstředivce JA10 (Beckman). pelety byly resuspendovány v celkovém objemu 40 ml 1X vazebného pufru Novagen (5 mM imidazolu, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,9), přeneseny do dvou nádobek Oakridge a zmrazovány pod obu alespoň 1 h na -70 °C. Nádobky byly rozmraženy a buňky lyžovány sonifikací (4 x 20 s impulsy) na ledu s použitím přístroje Branson Sonifier 450 s nastavením výkonu na 6 až 7. Suspenze byla vyčeřena odstředěním po dobu 20 min při 9000 min'¹ (10000 g) v přístroji JA-17. Rozpustný lyzát (po přídavku NP40 do 0,1 %) byl po dávkách absorbován do 7 ml suspenze 1:1 pryskyřice Ni-NTA (Qiagen) : vazebný pufr [50 mM NaHPO₄, 0,5 M NaCl, 60 mM imidazolu (pH 8,0)] mícháním směsi po dobu 3 h při 4 °C. Suspenze byla nalita do kolony s vnitřním průměrem 1 cm (BioRad) a promyta postupně těmito roztoky: 15 ml vazebného pufru s obsahem 0,1 % NP40, 15 ml vazebného pufru, 15 promývacího pufru (40 mM imidazolu, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,9).

211, • ·

Navázaný protein byl eluován ve 200 mM imidazolu, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,9.

Vzorky celkového, rozpustného a eluovaného proteinu byly děleny pomocí SDS-PAGE. Celkový protein byl detekován barvením gelu Coomassieovou modři. Čištěním se získalo 34 mg afinitně čištěného proteinu z 1 I výchozí kultury (3,2 % celkového rozpustného extraktu), u něhož bylo zjištěno, že alespoň 90 až 95 % proteinu migrovalo jako jediný pás o předpokládané molekulové hmotnosti (90 kD) pro rekombinační fúzní protein toxinu A C. difficile [tj. protein pPA1870-2682(N/C)].

Tyto výsledky poskytují postup s použitím snížené teploty kultivace, který usnadňuje účinné čištění vysokých hladin rozpustného rekombinačního proteinu toxinu A C. difficile s použitím expresního plasmidů pPA1870-2680(N/C).

d) Konstrukce pPA1870-2680(N) a velkoobjemové čištění N, C a N/C Hisznačeného proteinu 1870-2680

Expresní plasmidy, které usnadňují expresi intervalu 1870-2680 toxinu A C. difficile buď s N-terminální značkou his [pPA1870-2680 (N)], C-terminální značkou his [pPA1870-2680(C)j nebo se značkami his na C- i N- konci [pPA1870-2680(N/C)j byly hodnoceny z hlediska velkoobjemový produkce a afinitního čištění repetičního proteinu toxinu A C. difficile.

Znaky expresních vektorů pPA1870-2680© a pPA1870-2680(N/C) byly popsány v příkladech 11 a 15. V příkladu 11 byl pPA1870-2680(C) označen jako pPA1870-2682 a v příkladu 15 byl pPA1870-2680(N/C) označen jako pPA18702680(H). Pro jasnější identifikaci polohy polyhistidinového úseku (značky his) jsou plasmidy v dalším označovány příponami (C), (N) a (N/C). Tyto tři expresní plasmidy byly konstruovány následovně:

pPA1870-2680(C) byl konstruován vložením repetice toxinu A C. difficile, obsahující fragment Spe\-Hind\l\ z pPA1000-2680 (příklad 11a) do vektoru pET23b (Novagen), štěpeného Nhe\ a /7/ňďlll.

212.

• ·

Plasmid pPA1870-2680(N/C) byl konstruován nahrazením promotorové oblasti pPA1870-2680(C), obsažené na fragmentu Bgl\\-Nde\, odpovídajícím fragmentem Bgl\\-Nde\ z vektoru pET16b (Novagen).

Vektor pPA1870-2680(N) byl vytvořen štěpením pPA1870-2680(N/C) na Cterminálním místě HindlW s následným ošetřením Klenowovým enzymem pro vyplnění vyříznutých konců. Ztupený plasmid pak byl iigací cirkularizován za vzniku pPA1870-2680(N).

Byly kultivovány velkoobjemové kultury pPA1870-2680(N) a pPA1870-2680(C) (s použitím hostitele BL21(DE3)pLysS), indukovány a rozpustný protein byl afinitně čištěn a eluován stejně jako v odstavci (c). V každém případě bylo získáno 10 až 20 mg afinitně čištěného proteinu a analýzou SDS-PAGE bylo odhadnuto, že se jedná o více než z 50 % o protein plné délky. Velká část proteinu pPA1860-2680(C) se však vymývala ve 40 mM promývacím pufru. Ve snaze identifikovat podmínky, které by nevedly k eluci významných množství proteinu pPA1860-2680(C), byl proveden následující experiment.

Výše popsaným způsobem byl kultivován 1 I kultury pPA1870-2680(C) a čištěn vazbou s použitím fosfátového pufru, promývacího a elučního pufru. Buňky byly resuspendovány ve fosfátovém vazebném pufru (50 mM NaPO₄, 0,5 M NaCl, 5 mM ímidazolu, pH 8,0) a postupně promyty ve fosfátovém vazebném pufru obsahujícím bucf 20, 40 nebo 200 mM ímidazolu. Rekombinační protein se vymýval při všech třech elucích (5,5, resp. 12, 5, resp. 12 mg celkového proteinu), což ukazuje, že Cterminální his-značený protein není při koncentraci Ímidazolu 40 mM v žádném z použitých pufrovacích systémů pryskyřicí zadržován.

Z uvedených výsledků vyplývá, že rozpustný afinitně čištěný protein toxinu A C. difficile byl izolován z použitím kteréhokoli z expresních plasmidů pPA1870-2680 (N), (C) nebo (N/C).

• · • · · · · · · «·· • · ·· · · · · · ·· ··

c) Konstrukce pPTrxA1870-2680(N), (C) a (N/C) a velkoobjemové čištění N, C a N/C his-značených proteinů Trx 1870-2680

Thioredoxinový (Trx) expresní systém (invitrogen) byl vyvinut pro usnadnění exprese normálně nerozpustných nebo obtížně exprimovatelných proteinů. Geny jsou klonovány do vektoru pTrxFus a exprimovány jako fúze s thioredoxinovým proteinem E. colř, toto spojení často propůjčuje fúznímu proteinu rozpustnostni charakteristiky thioredoxinu [La Vallie a d., (1993), Bio/Technology 11:187], Vektor pTrxFus má však několik vlastností, které jsou pro expresní vektor nežádoucí. Všechny plasmidy musejí být pěstovány ve specifických kmenech a kultivačních médiích, protože exprese fúzního proteinu v tomto systému je indukovatelná tryptofanem. Kromě toho není promotor striktně kontrolován, takže při nižších teplotách (tj. 30 °C) dochází k nízké expresi fúzního proteinu, konečně expresní vektor neobsahuje afinitní značku, která by usnadňovala vysokou hladinu afinitního čištění rozpustného fúzního proteinu.

Pro usnadnění konstrukce IPTG-indukovatelných afinitně značených fúzních proteinů Trx byl konstruován vektor pETHisTrx. Thioredoxinový gen pTrxFus (Invitrogen) byl vyříznut jako Λ/del-BamHI fragment DNA a klonován do Ndel-BamH\ štěpeného vektoru pETHisb (příklad 18) za vzniku vektoru pETHisTrx.

Ve vektoru pETHisTrx je gen Trx exprimován z promotoru pET16b a pro konstrukci C-terminálních genetických fúzí obsahuje před Trx N-terminální leader sekvenci pET16b a sekvenci histidinové značky a za genem Trx poiylinker pET23b (od místa BamHI). Expresní konstrukty, které usnadňují expresi fúze Trx-interval 1870-2680 toxinu A jako N, C nebo N/C-terminální histidinové značky, byly konstruovány následovně.

Konstrukt pTrxA1870-2680(NPC) byl konstruován ligací Ndel-BamřW (vyplněno) Trx genu (izolovaného z vektoru pTrxFus) a Spěl (vyplněno) -Xho\ fragmentu obsahujícího gen 1870-2680 toxinu A C. difficile [izolovaného z konstruktu pPA1100-2680 (příklad 11)] do Ndel-Xho\ štěpeného vektoru pETHis (vyplněná místa BamHI a Spěl se ligují tupými konci a vytvářejí in-frame fúzi Trx-toxin A C. difficile).

214.

• · • ·

Výše uvedená fúze Trx-toxin A C. difficile byla vyříznuta jako Nde\-Hind\\\ fragment a vložena do Ndel-HindlW štěpeného vektoru pET23a (Novagen) za vzniku pPTrxA1870-2680(C).

Místo HindlW pPTrxA1870-2680(N/C) bylo štěpeno, vyplněno působením Klenowova enzymu a religováno za vzniku pPTrxA1870-2680(N).

Výše uvedené konstrukce byly prováděny standardními technikami molekulární biologie, popsanými v přikladu 29.

Byly pěstovány velkoobjemové kultury všech tří fúzí TrxA1870-2680 [tj. pPTrxA1870-2680(C), pPTrxAI 870-2680(N) a pPTrxA1870-2680(N/C)j a postupem uvedeným v odstavci (c) byl izolován rozpustný afinitně čištěný protein. Ve všech případech byly afinitně čištěné fúzní proteiny Trx podobné, pokud jde o rozpustnost, výtěžky v mg/l kultury a čistotu, s paralelními konstrukty pPA1870-2680 N, C nebo N/C, popsanými v odstavci (d).

f) Velkoobjemové afinitní čištění proteinů pPA1870-2680 a pPB17502360 a stanovení hladiny éndotoxinů

Byly získány preparáty afinitně čištěných proteinů pPA1870-2680(N/C) (příklad 15) a pPB1750-2360 (příklad 15b) za účelem stanovení hladiny éndotoxinů v čištěných vzorcích. Všechny pufry byly sterilně přefiltrovány a po celou dobu přípravy pufrů byly nošeny rukavice pro snížení endotoxinové kontaminace čištěných vzorků rekombinačních proteinů, zprostředkované pufrem. Velkoobjemové čištění proteinů pPA1870-2680(C) a pPB1750-2360 bylo prováděno následovně.

Stručně řečeno byly kultury pPA1870-2680(N/C) a pPB1750-2360 [v hostiteli BL21(DE3)pLysS] pěstovány při 30 °C do OD₆₀₀ 1,0 v 1 I média 2X YT s obsahem 100 pg/ml ampicilinu, 34 pg/ml chloramfenikolu a 0,2 % glukózy. Exprese rekombinačního proteinu byla indukována přídavkem IPTG do 0,3 mM. Po 5 až 6 h indukce byly buňky chlazeny po dobu 15 min v lázni ledu a vody a pak odstřeďovány 10 min při 4 °C při 5000 min'¹ v odstředivce JA10 (Beckman).. Pelety buněk byly přes noc zmrazovány při -70 °C a pak rozmraženy a resuspendovány v celkovém objemu 40 ml vazebného pufru (5 mM imidazolu, 0,5 M NaCl, 50 mM NaPO₄, pH 8,0) a

215

9

9 přeneseny do dvou 35 ml Oakridgeových nádobek. Buňky byly lyžovány sonifikaci (8 x 20 s impulsy) postupem uvedeným v příkladu 29c. Suspenze byla vyčeřena odstřeďováním po dobu 30 min při 9000 min'¹ (10000 g) v odstředivce JA-17 (Beckman). Supernatant byl odebrán (tvoří rozpustný lyzát) a byl přidán NP40 do konečné koncentrace 1 %. Rozpustný lyzát (po přídavku NP40 do 0,1 %) byl po dávkách mícháním po dobu 3 h při 4 °C absorbován do 8 ml suspenze 1:1 pryskyřice NiNTA (Qiagen): vazebný pufr. Suspenze byla 1 min odstřeďována při 500 g v 50 ml nádobce (Falcon), resuspendována v 5 ml vazebného pufru s obsahem 0,1 % NP40 a nalita do kolony o průměru 2,5 cm (BioRad). Pryskyřice pak byla promyta 20 ml vazebného pufru s obsahem 0,1 % NP40. Kolona byla připojena na UV monitor (ISCO) a pak promývána vazebným pufrem do ustavení základní hodnoty. Po ustavení základní hodnoty absorbance byla kolona promyta promývacím pufrem [20 mM (pPB1750-2360) nebo 40 mM (pPA1870-2680) imidazolu, 0,5 M NaCl, 50 mM NaPO₄, pH 8,0] do nového ustavení základní hodnoty. Imidazol byl odstraněn promytím kolony 50 mM NaPO₄, 0,3 M NaCl, 10 % glycerolu, pH 7,0, a navázané proteiny byly eluovány 50 mM NaPO₄, 0,3 M NaCl, 10 % glycerolu, pH 3,5 až 4,0. Proteinové vzorky z různých stupňů čistícího procesu byly rozdělovány elektroforézou na gelu SDS-PAGE; vzniklý gel je znázorněn na obr. 34.

Obr. 34 znázorňuje gel, barvený pomocí Coomassie blue, a ukazuje stupně čištění. Vzorky proteinů byly pro elektroforézu připraveny smísením 1 μΙ celkového (T) nebo rozpustného (S) proteinu nebo rozpustného proteinu po navázání na pryskyřici NiNTA a odstředění (A) se 4 μΙ PBS a 5 μΙ vzorkového pufru 2X SDSPAGE nebo 5 μΙ eluovaného (E) proteinu a 5 μΙ 2X vzorkového pufru. Vzorky byly zahřívány 5 min na 95 °C, pak ochlazeny na naneseny na 7,5% SDS-PAGE gel. Byly naneseny rovněž markéry molekulové hmotnosti v širokém rozmezí (M; BioRad) pro odhad molekulové hmotnosti identifikovaných fúzních proteinů, po elektroforéze byl protein detekován obecně barvením gelu Coomassieovou modří. Na obr. 34 obsahují pruhy 1 až 4 protein z čištění proteinu pPA1870-2680 a pruhy 5 až 8 obsahují protein z čištění proteinu pPB1750-2360.

Čištění vedlo k výtěžku přibližně 30 mg/l afinitně čištěného proteinu z 1 I výchozích kultur (2 až 2,5 % celkového rozpustného extraktu) u obou proteinů,

216 .

·· ··

9 9 • · • · · · · · · • · · · «•a ·· ·· z čehož alespoň 90 až 95 % proteinu migrovalo jako jednotlivý pás o předpokládané molekulové hmotnosti (90 kD) pro rekombinační protein toxinu A C. difficile. V obou případech byla většina (tj. více než 90 %) indukovaného proteinu za použitých podmínek čištění rozpustná a kvantitativně navázaná na pryskyřici.

Hladina endotoxinu v čištěných rekombinačních proteinech byla stanovena s použitím kitu LAL (příklad 24d) a pro pPA1870-2680(N/C) byla nižší než 1,0 EU/mg čištěného proteinu a pro pPB1750-2360 vyšší než 250 EU/mg čištěného proteinu. Rozdíl hladin endotoxinu mezi těmito dvěma čištěnými rekombinačními proteiny může odrážet méně striktní promývání, použité během čištění proteinu pPB17502360.

g) Konstrukce, velkoobjemové afinitní čištění pPB1750-2360(N/C) a stanovení hladiny endotoxinu

Jak výše uvedeno, afinitně čištěný protein pPB1750-2360 obsahoval vyšší hladinu endotoxinu než čištěný protein pPA1870-2680(N/C). Protein pPB1750-2360 obsahuje poiyhistidinový úsek na karboxyterminálním konci, zatímco pPA18702680(N/C) obsahuje poiyhistidinový úsek jak na aminoterminálním, tak na karboxyterminálním konci. Přítomnost polyhistidinového úseku na obou koncích fúzního proteinu umožnila použití striktnějších podmínek promývání během afinitního čištění pPA1870-2680(N/C) v porovnání s pPB1750-2360 (40 mM imidazolu versus 20 mM imidazolu).

Pro získáni fúzního proteinu zahrnujícího interval 1750-2360 toxinu B C. difficile, obsahujícího poiyhistidinový úsek jak na aminoterminálním, tak na karboxyterminálním konci, byl následujícím způsobem konstruován pPB17502360(N/C). pPB1750-2360 (příklad 15b) byl štěpen Nde\ a Xho\ a 1,5 kb fragment Nde\IXho\ byl izolován a vložen do vektoru pETHisb (příklad 18), štěpeného pomocí Nde\ a Xho\. Pro tuto konstrukci byly použity rutinní postupy, popsané v předchozích příkladech.

Velkoobjemové čištění pPB1750-2360(N/C) bylo prováděno stejně jako v odstavci (f) v případě pPB1750-2360, s tou výjimkou, že promývací pufr obsahoval mM imidazolu, 0,5 M NaCl, 50 mM NaPO4, pH 8,0. Po promývacím stupni byl imidazol odstraněn promytím kolony 50 mM NaPO₄, 0,3 M NaCl, 10 % glycerolu, pH 7,0. Pak byla kolona propláchnuta 50 mM NaPO₄, 0,3 M NaCl, 10 % glycerolu, pH 3,0, ve snaze vymýt navázaný protein. Za těchto podmínek se pPB1750-2360(N/C) nevymýval.

Poté bylo velkoobjemové čištění opakováno výše uvedeným způsobem s tou výjimkou, že po promývacím stupni s použitím promývacího pufru s obsahem 40 mM imidazolu, 0,5 M NaCl, 50 mM NaPO₄, pH 8,0 byl navázaný protein eluován s použitím roztoku s obsahem 200 mM imidazolu, 0,5 M NaCl, 50 mM NaPO₄, pH 8,0. Z eluovaného proteinu byl imidazol odstraněn dialýzou proti PBS.

Analýza eluovaného pPB1750-2360(N/C) na gelech SDS-PAGE, barvených Coomassie blue, odhalila jediný pás o molekulové hmotnosti, očekávané pro fúzní protein plné délky.

Hladiny endotoxinu v čištěném proteinu pPB1750-2360(N/C) byly stanoveny pomocí kitu LAL (příklad 24d). Byla prováděna nezávislá stanovení a byla zjištěna hadina endotoxinu 80, 300 nebo 450 EU/mg čištěného rekombinačního proteinu. Bez omezení na určitý konkrétní mechanismus se má za to, že nekonsistentní výsledky testu LAL, pozorované u pPB1750-2360(N/C), a vysoká hodnota pozorovaná u pPB1750-2360 (viz odstavec f) je důsledkem nespecifické aglutinace komponent LAL uhlohydrétovými vazebnými jednotkami, přítomnými na sekvencích toxinu B C. difficile, přítomných na těchto proteinech. Bez ohledu na to, zde je skutečná hladina endotoxinu 80 nebo 450 EU/mg čištěného proteinu, představuje afinitně čištěný preparát pPB1750-2360(N/C) v podstatě endotoxinu prostý preparát rekombinačního proteinu (Podání 10 až 500 μg čištěného pPB1750-2360(N/C) by vedlo k zavedení pouze 4,5 až 225 EU; u 70 kg člověka činí toto množství endotoxinu 1,3 až 64,5 % maximální povolené dávky).

Výše uvedené výsledky poskytují postup pro afinitní čištění v podstatě endotoxinu prostých preparátů z rekombinačního repetičních proteinů toxinu A a B C.

difficile ve vysokých výtěžcích.

218 • ·

Příklad 30

Čištění rozpustných proteinů pPA1870-2680(N/C), pPA1960-2680 a pPA1870-2190

V příkladu 29 byly popsány způsoby výroby rozpustných, v podstatě endotoxinů prostých vzorků pPA1870-2680(N), (C) nebo (N/C), které vedly k získání proteinů, splňujících počáteční kriteria stanovená pro produkci antigenů, tzn. že proteiny jsou 1) snadno čistitelné, 2) dobře charakterizované a o vysoké čistotě a 3) v podstatě endotoxinů prosté. V tomto příkladu byla zkoumána možnost produkovat podobně čistý antigen z expresních konstruktů pPA1870-2190 nebo pPA1960-2680. Tento příklad zahrnoval a) velkoobjemové čištění rozpustných proteinů pPA18702190 a pPA1960-2680 a b) konstrukci vektoru pPTrxAI 870-2190 a velkoobjemové čištění rozpustného proteinu pPTrxI 870-2190.

a) Velkoobjemové čištění rozpustných proteinů pPA1870-2190 a pPA19602680

Dřívější pokusy o produkci afinitně čištěného proteinu s použitím vektorů pPA1870-2190 (příklad 17a) nebo pPA1960-2680 (příklad 28) byly neúspěšné, jak bylo zjištěno analýzou celkového a rozpustného proteinu produkovaného v maoobjemových kulturách. Rozpustnostní vlastnosti proteinu, stanovené s použitím maloobjemových kultur nebo minikultur, se v důsledku rozdílností pufrů, podmínek sonifikace apod. nemusejí přenášet na velkoobjemové kultury. Úspěšná exprese rozpustného repetičního proteinu toxinu A C. difficile, v podstatě prostého endotoxinů, s použitím konstruktů pPA1870-2680 N, C nebo N/C, skutečně naznačuje, že podmínky použité pro solubilizaci těchto proteinů by mohly také zvýšit rozpustnost proteinů pPA1870-2190 a pPA1960-2680. Tato hypotéza byla testována následovně.

Velkoobjemové kultury pPA1870-2190 a pPA1960-2680 byly pěstovány a rozpustný protein čištěn na pryskyřici Ni-NTA způsobem uvedeným v příkladu 29c. Pro pPA1960-2680 byl použit jak hostitel BL21(DE3), tak BL21(DE3)pLysS, a pro pPA1870-2190 byl použit hostitel BL21(DE3)pLysS. Kultura pPA1870-2680(N/C)

219 • · · ·· ·· [v hostiteli BL21(DE3)pLysS] byla pěstována při 30 °C do OD_6(X) 0,9 v 1 I média 2X YT s obsahem 100 pg/ml ampicilinu a 0,2 % glukózy; jestliže použitý hostitel obsahoval plasmid LysS, bylo k uvedenému médiu přidáno 34 pg/ml chloramfenikolu. Exprese proteinu byla indukovány přídavkem IPTG do 1 mM. po 5 h indukce byly buňky chlazeny po dobu 15 min v lázni ledu a vody a pak 10 min odstřeďována při 4 °C při 5000 min'¹ v zařízení JA10 (Beckman). Pelety byly resuspendovány v celkovém objemu 40 ml 1x vazebného pufru Novagen (5 mM imidazolu, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,9), přeneseny do dvou 35ml Oakridgeových nádobek a zmrazovány po dobu alespoň 1 h při -70 °C. Poté byly nádobky rozmraženy a buňky lyžovány sonifikací (impulsy 4 x 20 s s použitím zařízení Branson Sonifier 450 s nastavením výkonu na 6 až 7) na ledu. Suspenze byla vyčeřena odstřeďováním po dobu 20 min při 4 °C při 9000 min'¹ (10000 g) v zařízení JA-17 (Beckman). Rozpustný lyzát (po přídavku NP40 do 0,1 %) byl po dávkách mícháním po dobu 3 h při 4 °C absorbován do 7 ml suspenze 1:1 pryskyřice NiNTA (Qiagen): Novagen 1X vazebný pufr. Suspenze byla vlita do kolony o vnitřním průměru 1 cm (BioRad) a promyta postupně těmito roztoky: 15 ml 1X vazebného pufru Novagen s obsahem 0,1 % NP40, 15 ml 1X vazebného pufru Novagen, 15 promývacího pufru (40 mM imidazolu, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,9). Navázaný protein byl eluován pomocí 200 mM imidazolu, 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,9.

Vzorky celkového, rozpustného a eluovaného proteinu (jak z vymývání 40 mM a 200 mM, tak eluční pufry) byly rozdělovány pomocí SDS-PAGE. Celkový protein byl detekován barvením Coomassie a protein reaktivní s toxinem A C. difficile (v případě pPA1960-2680) byl detekován pomocí Westernových blotů s použitím afinitně čištěné protilátky proti toxinu A způsobem, uvedeným v příkladu 28.

Výsledky těchto analýz ukazují, že v případě proteinu pPA1870-2190 bylo vymýváním 200 mM imidazolem vyčištěno pouze 600 μg proteinu/litr kultury. Protein toxinu A C. difficile byl s tímto konstruktem exprimován ve vysokých hladinách, avšak většina indukovaného proteinu byla nerozpustná. Protein pPA1870-2190 rovněž představoval méně než 10 % celkového eluovaného proteinu. U konstruktu pPA1960-2680 byl celkový výtěžek rozpustného afinitně čištěného proteinu buď 1 mg [hostitel BI21(DE3)pLysS] nebo 200 μρ [hostitel BL21(DE3)] ve 200 mM eluční frakci.

220 • · · · « • · « ·· ··

Coomassie a Westernová analýza ukázaly, že protein pPA1960-2680 byl exprimován do vysoké hladiny, ale většina indukovaného proteinu byla nerozpustná, a že eluované proteinové preparáty obsahovaly pouze přibližně 20 % proteinu reaktivního s toxinem C. difficile.

Výše uvedené výsledky demonstrují, že podmínky použité pro solubilizací proteinu pPA1870-2680 úspěšně nevytvořily rozpustný repetiční protein toxinů A C. difficile, exprimovaný bud konstruktem pPA1960-2680 nebo pPA1870-2190.

b) Konstrukce plasmidu pPTrxAI 870-2190 a velkoobjemové čištění rozpustných proteinů

Pro stanovení, zda je možno zvýšit rozpustnost rekombinačních proteinů, zahrnujících interval 1870-2680 toxinů A C. difficile, využitím solubilizačních vlastností proteinu Trx, byl konstruován fúzní konstrukt, v němž byl interval 18702680 exprimován jako fúze s thioredoxinem (Trx).

Konstrukt pPTrxAI870-2190 byl vytvořen ve dvou stupních. Nejdříve byl interval 1870-2190 klonován do vektoru pTrxFus (Invitrogen). Bylo to provedeno ligací Kpn\-Sal\ fragmentu pMA1870-2190, který obsahuje interval 1870-2190 toxinů A C. difficile, do vektoru pTrxFus, štěpeného pomocí KpnPSall. Byl vybrán rekombinační klon obsahující příslušné fragmenty DNA a s použitím Nde\ a Sa/I byly vyříznuty sekvence, kódující fúzní protein Trx - toxin A C. difficile, a klonovány do vektoru pETHis (příklad 18), štěpeného Nde\ a Xho\. Vzniklý konstrukt, pPTrxA18702190, obsahuje N-terminálně his-značenou fúzi Trx - toxin A C. difficile, řízenou promotorem pET16b.

Čištění rozpustného afinitně čištěného proteinu Trx-toxin A C. difficile z konstruktu pTrxAI 870-2190 bylo prováděno z velkoobjemové kultury způsobem uvedeným v odstavci (a). Celkový, rozpustný a eluční vzorek byly děleny na 12,5% SDS-PAGE gelu a protein byl detekován barvením Coomassieovou modří.

Výsledky této analýzy odhalily, že celkový výtěžek afinitně čištěného rekombinačního proteinu činí při eluci 200 mM imidazolu 2 mg proteinu o čistotě vyšší než 50 %. Tento výtěžek 1 mg specifického proteinu (50 % z 2 mg celkového

221 ♦ ·

• · čištěného proteinu) představuje desetinásobný vzrůst oproti výtěžku získaného u konstruktu pPA1870-2190 (10 % ze 600 pg čili méně než 100 pg specifického proteinu) a demonstruje solubilizační vlastnosti proteinu Trx. Většina indukovaného proteinu však byla nerozpustná v případě obou konstruktů (tj. pPTrxAI 870-2190 i pPA1870-2190) a celkový výtěžek afinitně čistitelného proteinu s vektorem pPTrxAI 870-2190 byl ještě méně než 20krát nižší než v případě konstruktů pPA1870-2680.

Příklad 31

Ochrana křečků proti onemocnění C. diffícile ptačími protilátkami (IgY) proti rekombinačnímu toxinů A a toxinů B C. diffícile

V tomto příkladu byly prováděny experimenty za účelem zjištění, zda může orálně aplikovaný IgY proti rekombinačnímu fragmentu toxinů A C. diffícile a/nebo rekombinačnímu toxinů B C. diffícile účinně bránit křečky před onemocněním C. diffícile. Tento příklad zahrnoval a) imunizaci slepic rekombinačním proteinem toxinů A nebo B C. diffícile, b) čištění, detekci a kvantifikaci IgY proti rekombinačnímu toxinů A a toxinů B C. diffícile a c) studii in vivo ochrany proti infekci s použitím buď IgY proti rekombinačnímu toxinů A C. diffícile nebo směsi IgY proti rekombinačnímu toxinů A C. diffícile a IgY proti rekombinačnímu toxinů B C. diffícile.

a) Imunizace slepic rekombinačními proteiny toxinů A nebo B C. diffícile

Každá z leghornských nosnic byla imunizována rekombinačním proteinem pMA1870-2680 toxinů A C. diffícile (interval 1870-2680 toxinů A C. diffícile se označuje jako interval A-6) nebo rekombinačním proteinem pPB 1750-2360 toxinů B C. diffícile (interval 1750-2360 toxinů B C. diffícile je označen jako interval B-3). Oba rekombinační proteiny byly exprimovány jako rozpustné produkty a čištěny způsobem uvedeným v příkladu 28 (pMA1870-2680) a příkladu 29 (pPB1750-2360). Asi 1 mg každého rekombinačního proteinu byl smísen s kompletním Freundovým adjuvans (připraveným způsobem uvedeným v příkladu 1) a podán slepicím subkutánně na

222

• 4 několika místech. Slepice byly imunizovány desetkrát. První čtyři imunizace byly provedeny v den 1, 14, 21 a 35. Zbylé imunizace byly prováděny ve čtyřtýdenních intervalech.

b) Čištění, detekce a kvantifikace IgY proti rekombinačnímu toxinu A a toxinu

B C. difficile

Asi po 1 týdnu po poslední posilovači dávce byla sebrána vejce a IgY byly extrahovány způsobem uvedeným v příkladu 1. IgY proti rekombinačnímu toxinu A a B C. difficile byly resuspendovány jako 4X PEG koncentrát (tj. resuspendovány v 1/4 původního objemu žloutku) v 0,1 M karbonátovém pufru, pH 9,5. Celková koncentrace proteinu v obou 4X koncentrátech byla 20 mg/ml na základě absorbance při 280 nm. Relativní hladiny IgY, specifické pro reaktivitu s imunogenem, byly detekovány pomocí ELISA:

Mikrotitrační destičky byly povrstveny 100 μΙ/jamku buď 0,05 μg/ml rekombinačního proteinu toxinu A C. difficile pPA1870-2680 (příklad 11) nebo 1 pg/ml rekombinačního toxinu B C. difficile pPB1750-2360 (příklad 18b). Postup ELISA byl stejný jako v příkladu 13c. Výsledek této analýzy ukázal, že oba titry protilátek byly vyšší než 1:125000. (Titr protilátky je definován jako převrácená hodnota nejvyššího zředění protilátky, které poskytuje při ELISA signál alespoň 3krát větší než preimunní IgY.) Množství specifického IgY proti rekombinačnímu toxinu A a proti rekombinačnímu toxinu B bylo stanoveno afinitním čištěním, jak je popsáno v příkladu 15c. Množství specifických protilátek proti rekombinačnímu toxinu A a B C. difficile, přítomné v preparátech anti-pMA1870-2680 a anti-pPB1750-2360, bylo stanoveno jako asi 160 pg/ml, resp. 200 pg/ml.

c) Studie in vivo ochrany proti infekci s použitím buď IgY pro rekombinačnímu toxinu A C. difficile nebo směsi IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile a IgY proti rekombinačnímu toxinu B C. difficile

S použitím křeččího modelu C. difficile byla provedena studie ochrany in vivo s použitím protilátek vytvořených proti pMA1870-2680 (příklad 15) a pPB1750-2360 • 9 1 » 9 9

I 9 «

9 9 ·

9

1

223

99 ··

9 9 · · · • 9 9 9 9 · · • 9 9 9 · · ·

9 9 9 · · • 9 99 99 9 (příklad 18b). V této studii byl použit křečci model, který byl modifikován z modelu použitého v příkladu 9, následujícím způsobem.

Křečci byli predisponováni vůči infekci C. difficile I.P. aplikací 1 mg/100 g tělesné hmotnosti klindamycin fosfátu (Biomol) v 1 ml sterilní vody. Klindamycin byl I.P. podáván pomocí 1 ml tuberkulinové stříkačky (Terumo). Po asi 20 až 24 h byl každý křeček orálně infikován 1 ml salinického roztoku s obsahem 1.10⁴ C. difficile (ATCC 43596). C. difficile bylo před infekcí kultivováno asi 48 h na destičkách CCFA (selektivní agar C. difficile) (BBL).

S použitím výše uvedených modifikací křeččího modelu byl časový průběh infekce (zejména doba nástupu onemocnění) mnohem více konzistentní a rychlejší v porovnání s výsledky získanými za podmínek popsaných v příkladu 9. V současné studii byly 3 skupiny po 8 křečcích (Sasco) ošetřovány vždy 2 ml 4X koncentrátu preimunního IgY nebo IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile, obsahujícího 40 mg celkového IgY; množství specifické protilátky proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile bylo přibližně 400 pg. Třetí skupina byla ošetřována 2 ml stejné směsi 4X koncentrovaných IgY proti rekombinačním toxinům A a B s výslednou koncentrací specifické protilátky proti každému 2X (množství specifického IgY proti rekombinačnímu toxinu A a B bylo v obou případech přibližně 200 pg). Třetí skupina má tedy poloviční množství specifických protilátek proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile v porovnání s ošetřením pouze protilátkou proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile.

Křečci byli ošetřováni 3krát denně ve zhruba 4h intervalech, počínaje 24 h před infekcí. Ošetřování trvalo 5 dní; tedy zhruba o týden méně než v příkladu 9. Výsledek této studie profylaktického ošetření je znázorněn na obr. 35.

Na obr. 35 je na ose souřadnic uveden procentický podíl souhrnné mortality a na ose úseček čas (ve dnech). Doba ošetření je označena pomocí úsečky mezi dny 0 a 4. Je označeno podávání klindamycinu a inokulace pomocí C. difficile (označeno na obr. 35 jako „infekce). Plné čtverečky představují křečky, kteří dostávali preimunní IgY; prázdné čtverečky představují křečky, kteří dostávali IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile (anti-interval A-6) a plné kosočtverce představují

224 ·· ·· « · · • · ··· • · · · · • · · · křečky, kteří dostávali směsi IgY proti rekombinačním toxinům A a B C. difficile (antiinterval A-6/B-3).

Výsledky znázorněné na obr. 35 demonstrují, že za těchto modelových podmínek se u všech křečků, ošetřovaných preimunním IgY, vyvinul do méně než 24 h po inokulaci průjem. Jeden den po inokulaci byla všechna zvířata v této skupině mrtvá. Naproti tomu za podmínek použitých v příkladu 9 trvalo u skupiny ošetřované preimunním IgY několik dní, než se objevil nástup onemocnění a na onemocnění často několik členů neuhynulo.

Jak je znázorněno na obr. 35, křečci ošetřovaní bud IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile (anti-pMA1870-2680) nebo směsí proti rekombinačnímu toxinu A (anti-pMA1870-2680) a toxinu B (anti-pPB1750-2360) C. difficile byli před uhynutím chráněni; z každé skupiny přežilo 62, resp. 88 %. Analýza chi-square výsledků skupiny ošetřovaných protilátkou proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile a skupiny ošetřované směsí byla statisticky významná v porovnání se skupinou ošetřovanou preimunní protilátkou s hodnotami P menšími než 0,05, resp. než 0,005. Přestože porovnání na bázi úhynu jako koncového bodu mezi oběma zkušebními skupinami nebylo statisticky významné (P < 0,75), byl průjem pozorovaný u zvířat, která dostávala směs IgY proti rekombinačnímu toxinu A a B C. difficile, méně úporný než u preimunní kontrolní skupiny.

Tyto výsledky s použitím vysoce agresivního křeččího modelu CDAD ukazují, že IgY proti rekombinačnímu proteinu toxinu A C. difficile (pMA1870-2680) chrání, ale přídavek protilátek proti rekombinačnímu toxinu B C. difficile (pPB1750-2360) poskytuje ochranu navíc (tj. zmenšení síly příznaků nemoci).

Příklad 32

Ošetření křečků s nepopiratelnou infekcí C. difficile ptačími protilátkami (IgY) proti rekombinačnímu toxinu A a toxinu B C. difficile

Za účelem zjištění, zde je orálně podávaný IgY proti rekombinačnímu proteinu toxinu A C. difficile a/nebo rekombinačnímu toxinu B C. difficile schopen účinně léčit

I

225 ·· ·· ·· · ·· ·· ··· · · · · ···· • ···· 9 9 · · ··· • ·· ··· · · · · · · 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 křečky infikované C. difficile, byly provedeny následující experimenty. Tento příklad zahrnoval a) imunizaci slepic rekombinačním proteinem toxinu A nebo B C. difficile, b) čištění a detekci kuřecího IgY proti rekombinačnímu toxinu A a B C. difficile, c) studii infekce in vivo, kdy byli křečci ošetřováni IgY proti bucf rekombinačnímu toxinu A nebo rekombinačnímu toxinu B C. difficile (infekční studie č. 1). Kromě toho byla k ošetřování křečků po infekci C. difficile použita také směs IgY proti rekombinačním toxinům A a B (infekční studie č. 2). Opakováním podmínek použitých v infekční studii č. 2 byla provedena infekční studie č. 3.

a) Imunizace slepic rekombinačnimi proteiny toxinu A nebo B C. difficile

Každá z leghornských nosnic byla imunizována rekombinačním proteinem pMA1870-2680 rekombinačního toxinu A C. difficile (interval A-6) nebo rekombinačním pPB1750-2360 toxinu B C. difficile (interval B-3). Každý rekombinant zahrnuje repetiční oblasti toxinu A a toxinu B C. difficile. Oba rekombinační proteiny byly exprimovány jako rozpustné proteiny s použitím vektoru pMal pro rekombinant toxinu A (přiklad 15) a pET pro rekombinant toxinu B (příklad 18b).

Asi 1 mg každého rekombinačního proteinu bylo smíseno s 500 pg Fowlova adjuvans (RIBI Immunochemical Research) pro rekombinant toxinu A C. difficile a Freundova adjuvans (připraveného jak uvedeno v příkladu 1) pro rekombinant toxinu B C. difficile. Každá slepice byla subkutánně imunizována asi 7krát ve zhruba dvouaž čtyřtýdenních intervalech.

b) Čištění a detekce kuřecích IgY proti rekombinačním toxinům A a B C. difficile

Asi 1 týden po poslední dávce byla sebrána vejce a popsaným postupem (příklad 1) byly pomocí PEG extrahovány protilátky. IgY byly resuspendovány jako 8X nebo 4X koncentrát (tj. resuspendování v 1/8 nebo 1/4 objemu žloutku 0,1 M karbonátového pufru, pH 9,5). Relativní hladiny specifických protilátek proti rekombinačním imunogenům byly detekovány pomocí ELISA jako v příkladu 13c s těmito modifikacemi: 96jamková mikrotitrační destička byla povrstvena 0,05 pg/ml

226

rekombinačního proteinu pPTrxA1870-2680N/C toxinu A (příklad 29e) nebo 1 pg/ml rekombinantu pPB1750-2360 toxinu B (příklad 18b) v množství 100 μΙ/jamku. Byl proveden standardní formát ELISA pro detekci protilátek proti rekombinačnímu toxinu A nebo B C. difficile (příklad 13c). Pomocí ELISA bylo zjištěno, že oba titry protilátek jsou větší než 1:125000.

c) Infekční studie in vivo

S použitím křeččího modelu popsaného v příkladu 31 byly provedeny tři infekční studie, č. 1, č. 2 a č.3.

i) Infekční studie č. 1

V infekční studii č. 1 byly použity tři oddělené experimentální skupiny, každá tvořená 12 zlatými syrskými křečky (Sasco) o hmotnosti přibližně 80 až 90 g. Zvířata byla ustájena v klecích po 3 a během studie dostávala potravu a vodu ad libitum. Křeččí model byl proveden postupem uvedeným v příkladu 31. Na začátku studie byl každý křeček predisponován vůči infekci intraperitoneální aplikací klindamycin fosfátu (Biomol) v množství 1 mg/100 g tělesné hmotnosti v 1 ml vody s použitím 1 ml tuberkuiinové stříkačky (jehla velikosti 27). Po přibližně 24 h bylo každé zvíře s použitím krmné jehly velikosti 18 orálně imunizováno 1 ml C. difficile (kmen ATCC 43596) s přibližně 10³ až 10⁴ organismy ve sterilním salinickém roztoku. Před infikováním byly organismy kultivovány 48 h na destičkách CCFA (BBL).

h po inokulaci (den 1) bylo zahájeno ošetřování obou skupin. K ošetřování byla použita krmná jehla o velikosti 18 k podávání 2 ml 4X koncentrátu bud preimunního IgY nebo specifického imunního IgY proti bud rekombinačnímu toxinu A (pMA1870-2680; interval A-6) nebo toxinu B (pPB1750-2360; interval B-3) C. difficile. V den 1 byli křečci ošetřeni ještě dvakrát ve dvouhodinových intervalech. Ve dny 2 až 4 byly každému křečkovi podány 2 ml příslušného preparátu protilátky třikrát denně ve zhruba čtyřhodinových intervalech. Každá 2 ml dávka obsahovala asi 40 mg IgY, z čehož asi 400 pg je specifický IgY (stanoveno afinitním čištěním postupem podle příkladu 15c) k rekombinačnímu toxinovému proteinu, nebo asi 1200 pg specifické

227

protilátky proti toxinovému proteinu C. difficile za den. Během doby ošetření a po ní byla zvířata sledována z hlediska nástupu průjmu a úhynu. Výsledky jsou znázorněny na obr. 36.

Na obr. 36 je na ose souřadnic uveden procentický podíl souhrnné mortality a na ose úseček čas (ve dnech). Doba ošetření je označena pomocí úsečky mezi dny 1 a 4. Je označeno podávání klindamycinu a organismů C. difficile („infekce“). Plné čtverečky představují křečky, kteří dostávali preimunní IgY; prázdné čtverečky představují křečky, kteří dostávali 4X preparát IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile (anti-interval A-6) a plné kosočtverce představují křečky, kteří dostávali 4X preparát IgY proti rekombinačnímu toxinu B C. difficile (anti-interval B-3).

Výsledky uvedené na obr. 36 demonstrují, že polovina křečků (6/12), ošetřovaných po infekci protilátkami proti rekombinantu toxinu A C. difficile, byla chráněna před úhynem v důsledku CDAD. Stupeň ochrany ve skupině protilátek proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile byl statisticky významný (P < 0,025 pomocí analýzy chi-square). Většina křečků (10/12) v této skupině vykazovala průjem. Zdá se, že při testované koncentraci nejsou protilátky proti rekombinantu toxinu a C. difficile schopny průjmu u křečků zabránit. Naproti tomu se u všech křečků ošetřených preimunní protilátkou a protilátkou proti rekombinačnímu toxinu B C. difficile vyvinul průjem a krátce nato uhynuli.

Z těchto výsledků vyplývá, že IgY, vytvořený proti rekombinačnímu proteinu toxinu A C. difficile (pMA1870-2680), může chránit křečky před úhynem v důsledku CDAD.

ii) Infekční studie č. 2

Druhý experiment byl prováděn v zásadě stejně s tou výjimkou, že na schopnost chránit křečky před CDAD byla testována směs protilátek proti rekombinačním toxinům A a B C. difficile. Byly smíseny stejné objemy 8X koncentrátů IgY k oběma rekombinantům (pMA1870-2680 a pPB1750-2360), takže konečná koncentrace pro každý rekombinant byla 4X. Každá dávka (2 ml) obsahovala přibližně 80 mg/ml proteinu s obsahem asi 400 pg specifického IgY (1 % specifického

228 • · · · · · · ·· · ·

proteinu proti toxinu C. difficile oproti celku) ke každému rekombinantu. Množství specifického anti-rekombinantního IgY proti každému toxinovému rekombinantu bylo stanoveno afinitním čištěním s použitím příslušného rekombinačního proteinu. Vzniklý preparát proto obsahuje stejnou konečnou koncentraci protilátky proti rekombinačnímu toxinu A jako v předchozím experimentu (viz výše odstavec c(i)), avšak obsahuje dvojnásobné množství proteinu. Z důvodu tohoto rozdílu byla sestavena další zkušební skupina a ošetřována stejnými objemy 8X koncentrátů IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile a preimunního IgY. Jako kontrola byla třetí skupina křečků ošetřována 8X koncentrátem pouze preimunního IgY. Devět křečků v každé skupině bylo infikováno 1.10⁴ organismů C. difficile (ATCC 43596) a po 4 h jim bylo podáno 2 ml buď preimunního IgY, IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile, smíšeného s preimunním IgY, nebo směsi IgY proti rekombinačním toxinům A a B C. difficile. Zvířata byla ošetřována stejně jako v odstavci c(i) třikrát denně po dobu 4 dní. Výsledky tohoto experimentu jsou znázorněny na obr. 37.

Na obr. 37 je na ose souřadnic uveden procentický podíl souhrnné mortality a na ose úseček čas (ve dnech). Doba ošetření je označena pomocí úsečky mezi dny 1 a 4. Je označeno podávání klindamycinu a organismů C. difficile („infekce“). Plné čtverečky představují křečky, kteří dostávali 8X preparát preimunního IgY; prázdné čtverečky představují křečky, kteří dostávali směs 8X preparátů preimunního séra a IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile (anti-interval A-6) a plné kosočtverce představují křečky, kteří dostávali směs 8X preparátů IgY proti rekombinačním toxinům A a B C. difficile (anti-interval A-6 a B-3).

Výsledky uvedené na obr. 37 demonstrují, že směs IgY k toxinům A a B C. difficile (pMA1870-2680 a pPB1750-2360) chránila kompletně všechny křečky před úhynem na CDAD. Pouze 1/3 (3 z 9) zvířat, ošetřených směsí protilátek k toxinům A a B C. difficile, vykazovala průjem (jedno mělo velmi mírný průběh). Křečci, ošetřovaní směsí protilátky IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile (anti-interval A-6) a preimunního IgY, byli částečně chráněni s procentem přežití 56 %. Všichni kromě jednoho křečka ve skupině anti-interval 6/preimunní IgY vykazovali průjem. Podíl přežití v této skupině byl srovnatelný s hodnotou pozorovanou v infekční studii č. 1 (50 %) s použitím pouze IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile bez

229 přídavku preimunního IgY. To naznačuje, že přídavek preimunního IgY pravděpodobně měl malý nebo neměl žádný účinek (pokud jde o specifickou ochranu proti proteasám v gastrointestinálním traktu) na účinnost IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile. Ošetření zvířat samotnými preimunními protilátkami jako obvykle křečky nechránilo před infekcí C. difficile a všichni křečci uhynuli do 2 dnů po infekci. Poměry přežití, pozorované v důsledku podání IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile a proti rekombinačním toxinům A a b C. difficile, byly oba statisticky významné ve srovnání s preimunním IgY s hodnotami P menšími než 0,05, resp. 0,001. Hodnota P při porovnání obou skupin ošetřovaných rekombinanty byla nižší než 0,10.

Zvířata, která přežila v obou infekčních studiích č. 1 a 2, přežívala dlouhodobě (tj. po dobu větší nebo rovnou 30 dní po přerušení léčby; po asi jednom měsíci po přerušení léčby, kdy byl experiment ukončen, byla zvířata euthanatizována). U těchto zvířat navíc nebyla pozorována recidiva (recidiva je běžně pozorována u živočichů, včetně člověka, ošetřovaných léčivy, jako je vankomycin nebo metronidazol, pro potírání infekce C. difficile). Tyto výsledky reprezentují první případ, kdy byly protilátky, vytvořené proti rekombinačním proteinům odvozeným od toxinů A a B C. difficile, kompletně účinné u zvířat, kterým byla podána letální infekce C. difficile.

iii) Infekční studie č. 3

Po několika dalších imunizacích slepic samotným rekombinačním toxinem A C. difficile (pMA1870-2680) a rekombinanty toxinu A/B C. difficile (směs pMA18702680 a pPB1750-2360) byla opakována výše popsaná terapeutická studie (infekční studie č. 2) s použitím směsi obou protilátek (infekční studie č. 3). Tři skupiny křečků po 10 členech byly ošetřovány 4 h po infekci buď preimunním IgY, IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile nebo směsí IgY proti rekombinačním toxinům A a B C. difficile s použitím stejných dávek a dob jako prve. Výsledky této studie jsou znázorněny na obr. 38.

Na obr. 38 je na ose souřadnic uveden procentický podíl souhrnné mortality a na ose úseček čas (ve dnech). Doba ošetření je označena pomocí úsečky mezi dny 1 a 4. Je označeno podávání klindamycinu a organismů C. difficile („infekce“). Plné

230 ··· · · a é · · · · • · · · · · · · 9 9 9 0 • 99 909 9 9 0 009 0 0

0 9 9 9 0 9 6 · · •· 9 9 09 999 99 99 čtverečky představují křečky, kteří dostávali 8X preparát preimunního IgY; prázdné čtverečky představují křečky, kteří dostávali směs 8X preparátů preimunního séra a IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile (anti-interval A-6) a plné kosočtverce představují křečky, kteří dostávali směs 8X preparátů IgY proti rekombinačním toxinům A a B C. difficile (anti-interval A-6 a B-3).

Jak je z obr. 38 patrné, křečci ošetřovaní směsí protilátek k oběma rekombinačním toxinům A a B C. difficile byli kompletně chráněni před úhynem, jak bylo prokázáno v předchozím experimentu (infekční studie č. 2), ale navíc žádné z ošetřených zvířat (proti rekombinačním toxinům A a B) nevykázalo průjem. Zatímco křečci, ošetřovaní protilátkou proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile, byli rovněž chráněni před úhynem (uhynul pouze jeden z deseti), měli všichni kromě jednoho (90 %) průjem. U všech křečků ošetřovaných preimunním IgY se vyvinul průjem a uhynuli do 48 h po infekci.

Prevence mortality s použitím protilátek k rekombinačnímu toxinu A a k toxinům A a B C. difficile byla statisticky významná (P < 0,001) v porovnání s výsledky získanými s použitím preimunní protilátky. Jak je prokázáno v předchozích příkladech (16 i a ii), všichni ošetřovaní křečci také dlouhodobě přežívali bez známek recidivy. Prevence morbidity u křečků, která zahrnuje přítomnost průjmu a úbytku hmotnosti, ošetřováním IgY proti rekombinantům A a B je dokumentována v tabulce 42.

Tabulka 42. Protilátky intervalu A-6 a B-3 snižují morbiditu CDAD

skupina	% zvířat s průjmem	P	% úbytku hmotnosti3	P
preimunní	100		Nab
pmA1870-2680 (A-6)	90	NS°	16	< 0,001
pmA1870-2680 plus pPB 1750-2360 (A-6/B-3)	0	< 0,001	1	NS

a úbytek hmotnosti přeživších zvířat, vypočtený jako rozdíl mezi výchozí hmotností a hmotností po skončení ošetření

231 • · · · · · • · · · · · · • · · · · · · * « s · · » * · · · · » · nehodí se ^c nevýznamný

Jak je z tabulky 42 patrné, procento úbytku hmotnosti u přeživších zvířat, ošetřených samotným IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile (pMA1870-2680; A-6) činilo v porovnání se střední hmotností před infekcí asi 16 %. Křečci, ošetřovaní oběma protilátkami k oběma rekombinantům (pMA1870-2680 a pPB1750-2360; A6/B-3) ztratili pouze 1 % své střední výchozí hmotnosti. Tyto výsledky demonstrují, že protilátky vytvořené proti rekombinantu toxinu A C. difficile chránily křečky proti fatálnímu stadiu CDAD, ale pro prevenci diaroického stadia spojeného s CDAD byl nutný přídavek protilátek k rekombinantu toxinu B C. difficile.

Příklad 33

Recidiva během ošetření křečků infikovaných C. difficile in vivo s použitím vankomycinové terapie

Pro stanovení, zda se po vankomycinové léčbě, použité v předchozích terapeutických studiích, objevuje recidiva C. difficile, byl proveden následující experiment.

Podmínky použité pro křeččí model byly stejné jako podmínky použité v příkladu 32. Tři skupiny křečků (Sasco) po 6 členech byly ošetřovány 0,2, 1 nebo 5 mg/kg vankomycinu (Vancomycin HCI, Lilly) v 1 ml sterilní vody. Dávky byly podávány jednou denně po dobu 5 dní. Jako kontrola byla použita další neošetřovaná skupina. Křečci byli orálně infikováni 1.10³ organismů C. difficile (ATCC 43596) a pak byla 3 h po infekci zahájena léčba vankomycinem. Výsledky experimentu po 20 dnech po infekci jsou znázorněny na obr. 39.

Na obr. 39 je na ose souřadnic uveden procentický podíl souhrnné mortality a na ose úseček čas (ve dnech). Doba ošetření je označena pomocí úsečky mezi dny 1 a 5. Je označeno podávání klindamycinu a organismů C. difficile („infekce“). Plné čtverečky představují křečky, kteří nebyli ošetřováni (neošetření); prázdné čtverečky

232 ·» · • » · · 9 • · ·99 9 9

9 4 9 4 9 4

9 9 9 9 9 · 9 99 • * · · » · • « · · · • v · · · · · • « « · • · · 9 9 9 9 představují křečky, kteří dostávali 0,2 mg/kg vankomycinu; plné kosočtverce představují křečky, kteří dostávali 1,0 mg/kg vankomycinu a prázdné kosočtverce představují křečky, kteří dostávali 5,0 mg/kg vankomycinu.

Výsledky znázorněné na obr. 39 demonstrují, že všichni křečci, ošetřovaní 0,2 mg/kg vankomycinu, v průběhu léčby uhynuli. Křečci ošetřovaní 1 nebo 5 mg/kg vankomycinu byli během doby léčby chráněni, ale rychle recidivovali a většina uhynula po skončení léčby. U všech ošetřovaných křečků se vyvinul průjem a 83 % (5/6) křečků ošetřovaných 1 mg/kg vankomycinu, resp. 100 % (6/6) křečků ošetřovaných 5 mg/kg vankomycinu uhynulo 7 nebo 9 dní po přerušení léčby.

Tento recidivující účinek při použití vankomycinu, jak je zde ilustrován, nebo metronidazolu k léčbě infekcí C. difficile v křeččím modelu nebo u lidí je běžným jevem, který byl často zaznamenán. Recidivuje až 100 % křečků a asi 25 % lidí, léčených jedním z těchto dvou léčiv. Tento recidivující účinek je ve výrazném kontrastu k účinku projevujícímu se při aplikaci tohoto vynálezu, jsou-li křečci infikovaní C. difficile ošetřováni IgY vytvořenými proti buď nativnímu nebo rekombinačnímu toxinu A nebo B C. difficile. Jsou-li zvířata ošetřována IgY proti toxinu C. difficile, dochází k recidivě zřídka nebo vůbec nikdy. Prevence recidivy podáváním IgY proti toxinu C. difficile tedy představuje významnou terapeutickou výhodu oproti běžné léčbě antibiotiky.

Příklad 34

Porovnání neutralizace toxinu A C. difficile in vivo s použitím IgY proti třem různým rekombinačním proteinům obsahujícím repetici toxinu A C. difficile

Me vektoru pMal-c byly exprimovány tři rekombinační proteiny toxinu A C. difficile z repetiční oblasti toxinu A C. difficile. Byly vytvořeny protilátky proti každému z nich a porovnávána jejich schopnost neutralizovat toxin A C. difficile u křečků. Příklad zahrnoval a) imunizaci slepic, b) čištění a detekci IgY proti rekombinačnímu toxinu A a c) neutralizační studii toxinu A C. difficile u křečků s použitím IgY proti rekombinačnímu toxinu A.

233 • 9 9 • 9 • ·

a) Imunizace slepic

Tři skupiny leghornských nosnic byly imunizovány různými rekombinačními proteiny toxinu A, produkovanými ve vektoru pMal. Všechny byly exprirnovány jako fúze MBP. Jednalo se o proteiny pMA1870-2190 (příklad 17), pMA1960-2680 (příklad 28) a pMA1870-2680 (příklad 11). První dva rekombinační proteiny zahrnují překrývající se subfragmenty z intervalu obsaženého v rekombinačním pMA18702680.

Každé slepici bylo podáno přibližně 1 mg každého rekombinačního proteinu s Freundovým adjuvans. Byl proveden standardní postup imunizace s tímto adjuvans, popsaný v příkladu 1. Slepice byly imunizovány čtyřikrát na více místech v časových intervalech uvedených v příkladu 32a.

b) Čištění a detekce IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile

Protilátky byly pomocí PEG extrahovány z vajec sebraných alespoň jeden týden po poslední dávce. Jako kontroly byl také připraven IgY proti toxinu A C. difficile (CTA) a preimunní IgY. IgY byly resuspendovány v 0,1 M karbonátovém pufru (pH 9,5) ve 4x koncentraci (1/4 původního objemu žloutku). Hladina specifických protilátek z každé skupiny byla stanovena použitím ELISA. Byla stanovena reaktivita proti rozpustnému rekombinačnímu proteinu toxinu A pPTrxI 870-2680. Protein pPTrxI 870-2680 neobsahuje MBP jako zbylé tři imunogeny a proto je reaktivita ELISA specifická pouze pro rekombinant toxinu A. Byl použit standardní postup ELISA (příklad 13c). Z výsledků ELISA se ukázalo, že všechny čtyři IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile mají velmi podobné titry, v porovnání s preimunním IgY větší než 1:31250.

234

c) Neutralizační studie toxinu A C. difficile u křečků s použitím IgY proti rekombinačnímu toxinu A

Schopnost výše uvedených IgY proti rekombinačnímu toxinu A (tj. pMA18702190, pMA1960-2680 a pMA1870-2680) poskytovat ochranu proti toxinu A C. difficile byla zjišťována na křeččím modelu. Dvě skupiny křečků dostávaly IgY proti pMA1870-2680; proto bylo vyšetřováno celkem 6 skupin. Test byl prováděn postupem uvedeným v příkladu 14.

ml IgY byl smísen a 1 h preinkubován s 30 pg toxinu A C. difficile (Tech Labs) a pak orálně podán zlatým syrským křečkům o hmotnosti 30 až 40 g (Charles River). Jako negativní, resp. pozitivní kontrola sloužil preimunní IgY, resp. IgY CTA (příklad 8). Zvířata byla pozorována po dobu 24 h a byl označen počet mrtvých zvířat v každé skupině. Výsledky experimentu jsou uvedeny v tabulce 43.

Tabulka 43. Tvorba protilátek neutralizujících toxin A proti různým rekombinačním fragmentům toxinu A

skupina	živá1	mrtvá1
preimunní	0	5
CTA	5	0
pM A 1870-2190	0	5
pMA 1960-2680	5	0
pMA 1870-2680 a	5	0
pMA 1870-2680 b	3	2

výsledky studie po 24 h

Jak z tabulky 43 vyplývá, předběžné ošetření toxinu A C. difficile pomocí IgY proti pMA1870-2680 zabránilo úhynu u všech 5 ošetřených křečků ve skupině označené „pMA1870-2680 a“ a u 3 z 5 křečků ve skupině označené „pMA1870-2680 b“. Protilátky vytvořené proti pMA1870-2680 i mírně menšímu karboxyterminálnímu polypeptidu pMA1960-2680 zabránily úhynu u všech 5 zvířat. Naproti tomu, stejně jako u preimunního IgY neměl IgY vytvořený proti aminoterminálnímu polypeptidu

235 ·

pMA1870-2190 žádný vliv na prevenci úhynu. Podle očekávání byli křečci, ošetřovaní IgY CTA, kompletně chráněni před enterotoxickými účinky toxinů A C. difficile.

Příklad 35

Identifikace adjuvans, která optimálně indukují neutralizující protilátky proti nativnímu toxinů A C. difficile in vivo

Za účelem porovnání schopnosti různých adjuvans vyvolávat tvorbu neutralizujících protilátek proti toxinů C. difficile u slepic s použitím rekombinačního proteinu toxinů A C. difficile jako imunogenu byly provedeny následující experimenty. Příklad zahrnoval a) imunizaci slepic rekombinačním proteinem toxinů A C. difficile s použitím čtyř různých adjuvans, b) stanovení titrů IgY proti rekombinačnímu toxinů A C. difficile pomocí ELISA a c) testování neutralizační schopnosti IgY proti rekombinačnímu toxinů A C. difficile vůči toxinů A C. difficile in vivo.

a) Imunizace slepic rekombinačním proteinem toxinů A C. difficile s použitím čtyř různých adjuvans

Osm skupin leghornských nosnic, každá po 4 slepicích, byly imunizovány buď 100 pg nebo 1 mg rekombinačního proteinu toxinů A (pMA1870-2680; příklad 11) v kombinaci se čtyřmi různými adjuvans. Byla testována tato adjuvans: Freundovo (GIBCO), Fowlovo LES-STM (dále označováno jako adjuvans RIBI; RIBI Immunochemical Research, lne.), Gerbuho (Biotech) a Quil A (Accurate Chemical). Každé adjuvans bylo testováno při obou koncentracích antigenu. Příprava a podávání každého adjuvans se prováděla postupem podle pokynů výrobce. Dávka adjuvans pro slepice byla rovněž stanovena podle případných pokynů výrobce.

Pro imunizaci s Freundovým adjuvans byl použit standardní postup (přiklad 1). Stručně řečeno byl 1 objem antigenu emulgován v 1,2 objemu buď úplného Freundova adjuvans při první imunizaci nebo neúplného Freundova adjuvans pro následné posilovači dávky. Každé slepici byl podán 1 ml směsi antigen/Freund na

236

čtyřech místech, protože Freundovo adjuvans obsahuje olej, vyžaduje míšení Freundova adjuvans s imunogenem intenzivní emulgaci materiálu pomocí dvou stříkaček spojených válcovou spojkou až do ztuhnutí. Ostatní tři adjuvans (RIBI, Gerbu a Quil A) mají složení na bázi vody a rovnoměrné promísení s rekombinačním antigenem bylo oproti Freundovu adjuvans mnohem snadnější. Pro rozmíchání těchto tří adjuvans postačovalo pouze mírné promísení. Konečná směs s použitím těchto vodných adjuvans zůstala rovněž homogenní kapalinou, umožňující snadnější podávání slepicím v porovnání s použitím Freundova adjuvans.

Při použití adjuvans RIBI dostávala každá slepice 500 μΙ směsi antigen/adjuvans v jednom místě s obsahem 100 μg adjuvans. Doporučená dávka Quil-A pro morčata, resp. králíky, je 50 pg, resp. 100 pg. Extrapolací hmotnosti bylo každé slepici podáno 75 pg adjuvans Quil A v jednom místě s objemem směsi antigen/adjuvans 500 μΙ. Při použití Gerbuho látky dostala každá slepice 5pg adjuvans v 500 μΙ antigenní směsi v jednom místě. Všechny slepice byly imunizovány subkutánně 4krát ve zhruba dvoutýdenních intervalech.

b) Stanovení titrů IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile pomocí ELISA

Hladiny protilátek k rekombinačnímu toxinu A, vytvořených s použitím různých adjuvans, byly porovnávány pomocí ELISA. Po asi 1 týdnu po poslední dávce byla sebrána alespoň 3 vejce z každé z 8 skupin spolu s preimunními vejci, žloutky spojeny podle skupin a IgY extrahovány pomocí PEG jako v příkladu 1. Čištěné IgY proti rekombinačnímu toxinu A pak byly resuspendovány v PEG v 1X objemu žloutku. Koncentrace proteinů v každém preparátu, stanovená na základě absorbance při 280 nm, byla ve všech případech podobná, asi 4 až 5 mg/ml. Reaktivita IgY a titr každého jednotlivého preparátu proti pMA1870-2680 byly stanoveny pomocí ELISA proti rozpustnému (pPTrxA1870-2680N/C; příklad 29) a nerozpustnému (pPA1870-2190; příklad 17a) analogu intervalu 1870-2680 toxinu A C. difficile. Tyto rekombinační analogy toxinu A C. difficile byly použity k povrstvení mikrotitračních destiček pro ELISA místo rekombinantů použitého při imunizaci (pMA1870-2680), protože ani pPTrxA1870-2680N/C ani pPA1870-2680 nebyly na rozdíl od imunogenu pMA18702680 exprimovány jako fúze s MBP. Bylo to provedeno za účelem stanovení

237 • · · · · · · · · · · • · · · · · · · · · · * • · · ··· 9 9 · ··· · · • · · · · · · ··· • · 9 9 99 9 99 9 9 9 9 reaktivity protilátky vůči konkrétně toxinové části rekombinantu toxinů A C. difficile spíše než MBP části fúzního proteinu.

Rozpustný analog pPTrxA1870-2680N/C, použitý k povrstvení mikrotitrační destičky, byl exprimován jako fúze s thioredoxinem, což napomáhá rozpustnosti a vzniklý fúzní protein pravděpodobně existuje v nativní konformaci. Nerozpustný analog pPA1870-2190, který pravděpodobně obsahuje denaturované epitopy, byl rovněž použit k povrstvení mikrotitračních destiček. Byla testována ELISA reaktivita každého IgY jak vůči rozpustnému, tak nerozpustnému analogu pro zjištění, zde existuje preferenční reaktivita vůči jednomu nebo druhému analogu, jsou-li pro vytvoření IgY použita různá adjuvans.

Byl použit standardní postup ELISA, popsaný v příkladu 13c, stou výjimkou, že k povrstvení mikrotitračních destiček (Falcon, destičky Pro-Bind Assay) bylo použito 20 až 40krát menší množství proteinu pPTrxA1870-2680N/C než normálně za účelem redukce pozadí. Přes noc při 4 °C byl ponechán nános 0,01 μΙ/jamku s rozpustným proteinem pPTrxA1870-2680N/C v koncentraci 0,05 pg/ml nebo nerozpustným proteinem pPA1870-2680 v koncentraci 1 pg/ml. Výsledky jsou znázorněny na obr. 40.

Na obr. 40 jsou znázorněny výsledky ELISA reaktivity, porovnávající titr protilátek pro každou kombinaci adjuvans/antigen vůči buď nerozpustnému (I) nebo rozpustnému (S) rekombinantu toxinů A C. difficile. Byly použity tyto zkratky: Pl (preimunní); adjuvans byla označena F (Freundovo), R (RIBI), Q (Quil-A) a G (Gerbuho) při buď 1 mg (1) nebo 100 pg (100).

Navíc byl porovnáván titr protilátky v každé skupině po 3 nebo 4 imunizacích za účelem stanovení, zda má odpověď protilátky prodlevu (na obr. 40 označeno pomocí -3 nebo -4). Všechny čtyři adjuvans byla schopna vyvolat u slepic protilátkovou odpověď do určitého stupně, ale jejich odpovědi na rozpustný či nativní antigen a nerozpustný či denaturovaný antigen byly odlišné. Freundovo adjuvans vyvolalo větší reakci na nerozpustný analog oproti rozpustnému analogu. Téměř žádná reaktivita nebyla pozorována při použití Freundova adjuvans se 100 pg antigenu vůči rozpustnému analogu. Nebyl rozdíl v odpovědi s použitím Freundova adjuvans vůči nerozpustnému analogu u obou koncentrací (100 pg nebo 1 mg)

238 • · · ·· · • · · · · · • · · · · ·· ·· ·· imunogenu, zatímco byl pozorován vzestup reaktivity vůči rozpustnému analogu při vyšší oproti nižší koncentraci. Naproti tomu byla reaktivita protilátek vůči rozpustnému analogu při použití ostatních tří vodných adjuvans obecně větší než u nerozpustného analogu. Reaktivity protilátek při ELISA vůči rozpustnému analogu byly v porovnání s nerozpustným analogem asi 2krát vyšší. Reaktivita protilátek se zlepšila ve skupinách Gerbu, RIBI a Quil-A při použití zvýšené dávky antigenu (1 mg oproti 100 pg) a byla výraznější vůči rozpustnému oproti nerozpustnému analogu. Hladina protilátek k nerozpustnému i rozpustnému analogu se ve většině skupin zvýšila po další posilovači dávce v porovnání se 3. a 4. imunizací.

Z výsledků na obr. 40 je zřejmé, že imunizace kuřat Freundovým adjuvans s použitím rozpustného rekombinačního imunogenu toxinu A C. difficile vyvolává tvorbu protilátek primárně proti nerozpustnému analogu. Toto zjištění je významné, jsou-li požadovány konformační protilátky, poskytující ochranu in vivo. Jsou-li požadovány konformační protilátky, byla by preferována alternativní adjuvans, jako jsou zde použitá Gerbu nebo RIBI. Použije-li se Freundovo adjuvans, může dojít k denaturaci rozpustného antigenu v důsledku nutnosti drsnějšího emulgačního postupu oproti jiným adjuvans. Vzniklý denaturovaný antigen by pak pravděpodobně vyvolával tvorbu protilátek primárně proti nerozpustnému nebo nekonformačnímu analogu. Tento účinek použití Freundova adjuvans je možno překonat použitím většího množství antigenu pro imunizaci, protože se denaturuje méně než celkové množství a je přítomno větší množství nativního antigenu. Skutečně také při vyšší koncentraci imunogenu došlo ke zvýšení reaktivity rozpustného analogu protilátky, zatímco nebyl rozdíl reaktivity nerozpustné protilátky mezi oběma koncentracemi imunogenu.

c) Testování schopnosti neutralizace IgY k rekombinačnímu toxinu A C. difficile vůči toxinu A C. difficile in vivo

Byla porovnávána in vivo schopnost výše popsaných protilátek proti proteinu pMA1870-2680, vytvořených výše popsaným způsobem s použitím různých adjuvans, neutralizovat toxin A. PEG-čištěné IgY z vajec slepic, imunizovaných každým ze čtyř adjuvans při koncentraci imunogenu 1 mg, byly zředěny na 0,5X

239 objem žloutku karbonátovým pufrem 0,1 M, pH 9,5. Tato koncentrace protilátek (0,5X) byla zvolena proto, že nejlépe osvětluje rozdíly v neutralizační schopnosti IgY s použitím různých adjuvans. Jako kontroly byly připraveny preimunní protilátky také v koncentraci 0,5X v karbonátu. Protilátky byly ředěny karbonátovým pufrem, aby mohly být podávány orálně s menší degradací kyselinou v žaludku.

Koncentrace proteinu IgY podle absorbaňce při 280 nm všech 0,5X preparátů byla 2,4 až 2,5 mg/ml, z čehož 25 až 50 μg/ml byla specifická protilátka proti rekombinačnímu proteinu toxinu A C. difficile. Studie ochrany křečků in vivo proti toxinu A C. difficile s použitím pěti preparátů IgY byla prováděna postupem podle příkladu 14(c). Bylo použito pět skupin po čtyřech samečcích zlatých syrských křečků (Charles River) o hmotnosti 30 až 40 g. Každému křečkovi byla podávána směs 30 pg toxinu A C. difficile (Tech Labs) v 1 ml IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile nebo preimunního IgY. Před orální aplikací byla nejprve tato směs podrobena preinkubaci po dobu 1 h při 37 °C. Po aplikaci byla zvířata pozorována po dobu 24 h na přítomnost průjmu a úhyn. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 44.

Tabulka 44. Tvorba protilátek neutralizujících toxin A s použitím různých adjuvans s pMA 1870-2680

skupina	zdraví3	průjem3	mrtví3
preimunní	0	1	3
Freund	0	0	4
Gerbu	4	0	0
RIBI	4	0	0
Quil A	4	0	0

výsledek studie po 24 h

Z výsledků uvedených v tabulce 44 je zřejmé, že preimunní toxin A C. difficile s 0,5X IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile, vytvořeným s použitím adjuvans Gerbu, RIBI a Quil A, před podáním u křečků zabránil všem zjevným příznakům a úhynu v důsledku onemocnění. Naproti tomu všechna zvířata ošetřovaná IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile, vytvořeným s použitím Freundova adjuvans

240

0'ako 0,5X preparát protilátky), ve směsi s toxinem A C. difficile nebyla chráněna a během 24 h si křečci vyvinuli průjem a uhynuli. Tři ze čtyř křečků, ošetřovaných preimunním IgY, uhynuli a ten, který přežil, měl těžký průjem. Tyto výsledky prokázaly, že IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile, vytvořené s použitím adjuvans Gerbu, RIBI a Quil A, jsou schopny neutralizovat aktivitu toxinu A C. difficile in vivo, zatímco IgY vytvořený s pomocí Freundova adjuvans ve stejné koncentraci toho schopen není. Neschopnost neutralizovat toxin A C. difficile pomocí IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile vytvořeného s Freundovým adjuvans koreluje s jeho nízkou reaktivitou ELISA vůči rozpustnému analogu toxinu A. Naopak všechna ostatní adjuvans vyvolávala tvorbu vysokých hladin protilátek k rozpustnému analogu, které byly neutralizující. Tyto výsledky naznačují, že neutralizační potenciál protilátek koreluje dobře s jejich reaktivitou vůči rozpustnému, avšak nikoli nerozpustnému analogu. Tyto výsledky naznačují dále, že při tvorbě neutralizujících protilátek je významné udržování rozpustného nebo konformačního imunogenu toxinu A C. difficile. Volba adjuvans, jako je RIBI nebo Gerbu, je tedy významná pro zachování konformace imunogenu, která je důležitá při tvorbě protilátek proti toxinu A C. difficile, které chrání in vivo.

Příklad 36

Neutralizace toxinu A in vivo s použitím protilátek proti rekombinačnímu proteinu pPA1870-2680

Za účelem zjištění, zda imunizace slepic rekombinantem pPA1870-2680(N/C) toxinu A C. difficile vyvolává tvorbu neutralizujících protilátek, byl proveden následující experiment. Přiklad zahrnoval: a) imunizaci slepic rekombinantem pPA1870-2680(N/C) toxinu A C. difficile s použitím čtyř různých adjuvans, b) čištění a detekci IgY proti rekombinantu a c) neutralizační studii in vivo na křečcích s použitím protilátek proti pPA1870-2680 inkubovaných s toxinem A.

241

a) Imunizace slepic rekombinantem pPA1870-2680 toxinu A C. difficile s použitím čtyř různých adjuvans

Každá z leghornských nosnic byla imunizována rekombinantem pPA18702680(N/C) toxinu A C. difficile (příklad 29d). Tento rekombinační protein je exprimován ve vektoru pET a ukázalo se, že je schopen izolace ve velmi čisté formě s velmi nízkým obsahem endotoxinu v porovnání se stejnou oblastí exprimovanou v jiných vektorech, jako je pMal-c (příklad 11). Tyto výsledky naznačují, že rekombinační protein pPA1870-2680 může být kompatibilní pro použití ve vakcině. Proto byla testována schopnost pPA1870-2680 stimulovat reakci protilátek.

Čtyři skupiny slepic (po 2 slepicích) byly imunizovány 100 g pPA18702680(N/C) (čištěného postupem podle příkladu 29d) s použitím 4 různých adjuvans. Byla použita adjuvans Freund (GIBCO), Fowl (RIBI) (RIBI Immunochemícal), Gerbu (Biotech) a Quil A (Accurate Chemical). Množství každého adjuvans použitého pro rekombinant je uvedeno v příkladu 35. Všechny slepice byly imunizovány čtyřikrát ve dvoutýdenních intervalech.

b) Čištění a detekce IgY proti rekombinantu

Hladiny pPA1870-2680(N/C) s použitím různých adjuvans byly porovnávány pomocí ELISA. Po asi 1 týdnu od poslední dávky byly z vajec od každé skupiny připraveny standardní preparáty PEG a resuspendovány v koncentraci 4X (všechny obsahovaly asi 20 mg/ml IgY) v 0,1 M karbonátovém pufru, pH 9,5. Standardním postupem ELISA (příklad 13c) byla zjišťována reaktivita specifických protilátek k rozpustnému imunogenu pPA1870-2680. Výsledky ELISA jsou znázorněny na obr. 41.

Na obr. 41 je vynesena absorbance při 410 nm proti log₁₀ zředění každé testované protilátky. Plné černé čtverečky představují výsledky ELISA s použitím preimunního IgY; prázdné čtverečky, černé kosočtverce, prázdné kosočtverce, resp. černé trojúhelníky představují výsledky ELISA s použitím adjuvans Gerbu (G-A2), Quil A (Q-A2), RIBI (R-A2), resp. Freundova (F-A2).

242

Po 4 imunizacích vytvořily všechny slepice specifickou odpověď IgY proti rekombinantu toxinu A C. difficile, exprimovanému ve vektoru pET [tj. pPA18702680(N/C)]. Jak je z obr. 41 patrné, byly odpovědi získané s použitím adjuvans Freundova, Fowlova (RIBI) a Quil A srovnatelné. U slepic imunizovaných pomocí Gerbu byla pozorována nižší odpověď protilátek. Je zajímavé, že použití Freundova adjuvans s pPA1870-2680(N/C) poskytlo nejvyšší aktivitu proti rekombinantu, zatímco v předchozím příkladu (příklad 35) vyvolalo Freundovo adjuvans s použitím stejné rekombinační oblasti exprimované vpMal-c (pMA1870-2680) nejslabší odpověď. Ostatní adjuvans vyvolala při porovnání obou rekombinantů podobnou odpověď protilátek. Tyto výsledky naznačují, že úroveň odpovědi protilátek s použitím Freundova adjuvans může být závislá na tom, jaký typ antigenu je použit.

c) Neutralizační studie in vivo na křečcích s použitím protilátek proti pPA18702680(N/C) inkubovaných s toxinem A C. difficile

Schopnost protilátek neutralizovat toxin A C. difficile byla porovnávána s použitím protilátek vyvolaných proti proteinu pPA1870-2680(N/C), vytvořených s pomocí adjuvans RIBI a Freundova. Tento pokus byl prováděn postupem uvedeným v příkladu 35c s tou výjimkou, že protilátky byly zředěny na koncentraci 2X s obsahem 10 mg/ml proteinu IgY. Toxin A C. difficile (Tech Labs) byl smísen s protilátkami vytvořenými s použitím Freundova a Fowlova (RIBI) adjuvans a orálně aplikován křečkům. Jako kontrola sloužili křečci ošetření preimunním IgY. Počet křečků, kteří do 24 h po podání lgY zůstali zdrávi, měli průjem nebo uhynuli, je uveden v tabulce 45.

Tabulka 45. Tvorba protilátek neutralizujících toxin A s použitím různých adjuvans spPA1870-2680

skupina	zdraví	průjem	mrtví
preimunní	0	0	4
Freund	4	0	0
RIBI	4	0	0

243

Jak je z tabulky 45 patrné, bylo jak Freundovo, tak RIBI adjuvans, použité ve spojení s pPA1870-2680(N/C), schopno vyvolávat in vivo neutralizující protilátky proti toxinu A C. difficile na rozdíl od preimunního IgY. Schopnost protilátek neutralizovat toxin A C. difficile, prokázaná v tomto příkladu a v příkladu 35, jak se zdá, dobře koreluje s jejich ELISA reaktivitou vůči rozpustnému (nativnímu) rekombinačnímu proteinu. Z těchto výsledků vyplývá, že rekombinant toxinu A C. difficile, pPA18702680(N/C) je u slepic imunogenní a je schopen in vivo vytvářet neutralizující protilátky; protein pPA1870-2680(N/C) je tedy vynikající potenciální vakcinou.

Příklad 37

Enterosolventní povlak IgY, vytvořeného proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile, pro orální aplikaci

Pro zjištění, zda je možno ptačí protilátky (IgY), vytvořené proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile, opatřit enterosolventním povlakem, aby si případně ponechaly ochranné schopnosti in vivo, byl proveden následující experiment. Příklad zahrnoval a) enterosolventní povlékání protilátek proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile, b) rozpouštěcí studii pro stanovení kinetiky desintegrace enterosolventně povlečených IgY v závislosti na pH a c) stanovení stability reaktivity protilátky po povlečení a rozpuštění pomocí ELISA.

a) Enterosolventní povlékání protilátek proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile

Pro nalezení efektivního postupu povlékání byly provedeny předběžné studie. Ptačí protilátky, opatření enterosolventním povlakem, by měly být v porovnání s protilátkami dodávanými v roztoku odolnější vůči degradaci v žaludku, provádí-li se aplikace orální cestou. Enterosolventní povlaky by měly zůstat v oblasti nízkého pH, nacházejícího se v žaludku, intaktní, a tudíž by měl být IgY schopen projít žaludkem

244

bez degradace, ale rozpouštět se až při vyšším pH (asi 6,0) a uvolňovat se ve střevech. Dodatečnou vlastností enterosolventních filmů, zvolených pro testování, je skutečnost, že jsou během povlékacího procesu kompatibilní ve vodných roztocích místo organických rozpouštědel. Tato vlastnost enterosolventního filmu by pravděpodobně umožnila zachovat konformaci a integritu protilátky IgY během povlékacího procesu. Protože místem onemocnění C. difficile jsou střeva, umožnil by enterosolventní povlak IgY k toxinu C. difficile koncentrovat množství protilátek, jsoucích k dispozici v místě infekce, a tak zlepšit účinnost a snížit potřebnou účinnou dávku v porovnání s použitím nepovlečeného IgY.

Protilátky proti toxinu A C. difficile byly povlékány následujícím způsobem. Bylo připraveno 60 g lyofilizovaných protilátek proti rekombinačnímu proteinu pMA1870-2680 toxinu A C. difficile (příklad 11). IgY z vajec slepic, imunizovaných rekombinačním proteinem, byl čištěn srážením PEG. Pelety IgY po čištění byly resuspendovány v 0,1X PBS, pH 7,4 o asi 1/4 výchozího objemu žloutku (4X) a množství 200 až 250 ml byla přenesena do 600 ml lyofilizačních baněk (Labconco). Roztoky IgY byly v baňkách mžikově zmrazený otáčením v lázni reagenčního alkoholu, obsahující suchý led. Zmrazené protilátky byly lyofilizovány na zařízení Labconco Freeze Dry System/Lyph Lock 4.5 unit podle pokynů výrobce. Z asi 250 ml 4X preparátu IgY se po lyofilizaci získalo asi 10 g sušiny.

Lyofilizovaný IgY byl odeslán do The Coating Plače lne. (Verona, Wl) pro opatření enterosolventním povlakem. Protilátky byly enkapsulovány pomocí Wursterova kapslovací komory, která je velmi vhodná pro účinné a rovnoměrné povlékání materiálů v malém měřítku v jediné operaci. Enkapsulované IgY byly připraveny pomocí dvou různých procesů povlékání, buď jednostupňového přímého procesu nebo dvoustupňového procesu s použitím nonpareil (tj. cukrové částice o velikosti 40 až 60 mesh). Lyofilizovaný IgY byl buď přímo překrýván filmovým povlakem nebo byl prováděn dvoustupňový postup, při němž byl nejprve použit IgY k povlečení nonpareile. Cukrová částice, povlečená IgY, pak byla překryta enterosolventním filmem. Použití cukrové částice poskytuje objem navíc, který je potřebný k udržení protilátek v kapslovací komoře a může napomoci rovnoměrnějšímu nanesení enterosolventního filmu.

245 ·· • · · ···· ···· λ · · ··· · · · · · ·· • · · · · · · · · ··· · · • · · · ··· ··· ·· ·· ·· ··· ··

Byly vybrány dva různé vodné enterosolventní filmy a použity v každém povlékacím procesu. Lyofilizovaný IgY byl povlečen buď filmem Aquateric (FMC Corp.) nebo Eudragit® L30D (Rohm Tech lne.). Oba tyto povlaky jsou vodorozpustné enterosolventní filmové povlaky, které se rozpouštějí při pH 6,5, resp. 5,5. Oba tyto filmy byly vybrány proto, že splňují výběrová kriteria vhodná pro výše uvedené potřeby. Každým z různých povlékacích postupů s použitím obou enterosolventních filmů byl získán produkt protilátky s enterosolventním povlakem. Dvoustupňový proces s použitím cukrové částice technicky usnadňoval celkový postup povlékání ve Wursterově zařízení, neboť vedl k menším ztrátám materiálu a tudíž vyšším výtěžkům konečného produktu. S použitím přímé metody bylo na IgY naneseno přibližně 27 až 30 % hmotnostních enterosolventního povlaku. Asi 70 % zbylé hmotnosti tohoto materiálu s enterosolventním povlakem tvořil IgY. S použitím cukrových částic, překrývaných IgY, bylo dosaženo asi 32 až 33 % enterosolventního povlaku. Zbylých 67 % hmotnostních enterosolventní částice bylo z asi 40 až 50 % tvořeno cukrovou částicí a asi z 20 % IgY.

b) Rozpouštěcí studie pro stanovení kinetiky desintegrace enterosolventního

IgY v závislosti na pH

Pro každý IgY s enterosolventním povlakem byl stanoven rozpouštěcí profil. Správně povlečené částice IgY s enterosolventními filmy by měly zůstat intaktní v žaludečních šťávách o pH 1 až 2, ale měly by se rozpouštět a uvolňovat IgY ve střevním prostředí o pH 7,5. Simulovaná žaludeční tekutina o pH asi 1,2 a simulovaná střevní tekutina o pH 7,5 byly připraveny podle metodiky USP, avšak s vynecháním trávicích enzymů [United States Pharmacopeia, sv. XXII (1990), United States Pharmacopeial Convention, Rockville, MD, str. 1788-1789]. Na 1 ml těchto simulovaných tekutin bylo přidáno 10 mg každého enterosolventně povlečeného preparátu (tj. s povlaky Aqauteric a Eudragit®) a mírně mícháno po dobu 1 až 2 h při teplotě místnosti. V různých časových intervalech byl odebírán alikvot roztoku a zjišťována v něm přítomnost proteinu, uvolněného do roztoku. Množství proteinu v roztoku bylo stanoveno buď absorbancí při 280 nm nebo s použitím proteinového testu BCA (Pierce).

246 ·· ·· • · • · ·· ·· ·· • · ·

·· ·· ·

Provedené studie demonstrovaly, že IgY, přímo povlékaný jak povlakem Aquateric, tak Eudragit®, a cukrové částice, překryté povlakem Aquateric, se při rozpouštěcí studii nechovají adekvátně. Po přídavku těchto částic byl během několika minut IgY uvolněn do roztoku jak při pH 1,2, tak 7,5. Rozpouštěcí profil pro cukrové částice IgY s povlakem Aquateric, monitorovaný absorbancí, je znázorněn na obr. 42. Rozpouštěcí profil pro cukrové částice IgY s povlakem Eudragit® je znázorněn na obr. 43.

Na obr. 42 je vynesena absorbance při 280 nm proti času v minutách, uvolňování IgY z částice překryté pomocí Aquateric v simulované žaludeční tekutině je znázorněno plnými čtverečky; uvolňování IgY z povlečené částice v simulované střevní tekutině je znázorněno prázdnými čtverečky. Protože film Aquateric samotný absorbuje UV při podobné vlnové délce jako protein (275 až 276 nm), není možno absorbanci UV při 280 nm použít k přesné kvantifikaci množství IgY v roztoku. Pro přesné stanovení koncentrace proteinu byl tedy protein kvantifikován po 1 h (60 min) rozpouštění metodou BCA.

Jak z obr. 42 vyplývá, bylo množství IgY, nalezené po rozpuštění preparátu s povlakem Aquateric v obou tekutinách podobné: 4 mg/ml při pH 1,2 a 4,9 mg/ml při H 7,5. Rozdíl v absorbanci, patrný na obr. 42 mezi žaludeční a střevní tekutinou, je důsledkem přítomnosti většího množství rozpuštěného filmu Aquateric ve střevní tekutině.

Na rozdíl od těchto nevyhovujících povlaků se cukrová částice s IgY překrytá povlakem Eudragit®, řádně otvírala a uvolňovala IgY do roztoku v simulované střevní tekutině, a to v závislosti na čase, zatímco v žaludeční tekutině zůstávala intaktní. Rozpouštěcí profil cukrové částice s IgY, překryté povlakem Eudragit®, v žaludeční a střevní tekutině v závislosti na čase je znázorněn na obr. 43.

Na obr. 43 je vynesena absorbance při 280 nm proti času v minutách. Uvolňování IgY z částice překryté povlakem Eudragit® v simulované žaludeční tekutině je znázorněno plnými čtverečky; uvolňování IgY z povlečené částice v simulované střevní tekutině je znázorněno prázdnými čtverečky. Protože Eudragit® v množství, nalézajícím se v povlaku, UV neabsorbuje, je možno hodnoty absorbance při 280 nm přímo převést na koncentraci proteinu.

247

Jak z obr. 43 vyplývá, v žaludeční tekutině bylo uvolněno pouze málo nebo žádný protein, zatímco do střevní tekutiny byl protein uvolňován lineární rychlostí, dosahující maximálního uvolnění po asi 2 h. Z 10 mg/ml částic s povlakem Eudragit® bylo po rozpuštění získáno 2 až 2,5 mg/ml IgY. Částice s povlakem Eudragit® v žaludeční tekutině zůstaly intaktní po dlouhou dobu, dokonce i po další inkubaci při 4 °C po dobu ještě jednoho týdne.

Rozpouštěcí profil cukrových částic s IgY s povlakem Eudragit® byl stanoven za podmínek, které simulují normální fyziologické podmínky (tj. simulovaný průchod gastrointestinálním traktem). Částice byla nejprve vložena na 120 min do žaludeční tekutiny a pak 180 min inkubována ve střevní tekutině. Obě tyto inkubace probíhaly za mírného míchání při 37 °C. Za těchto podmínek (tj. inkubace v žaludeční tekutině následovaná inkubací ve střevní tekutině) nebyl IgY z cukrové částice s povlakem Eudragit® uvolněn do proteinu žaludeční tekutiny, jako tomu je na obr. 42 (tj. inkubace pouze v žaludeční tekutině), ale v podobných hladinách jako na obr. 42 (2 až 2,5 mg/ml proteinu uvolněného po 2 h) byl uvolněn a detekován pouze ve střevní tekutině.

Výše popsané rozpouštěcí studie demonstrovaly, že IgY proti rekombinačnímu toxinu a C. difficile lze úspěšně povlékat s použitím Eudragit® a nonpareil.

c) Stanovení stability reaktivity protilátky po povlečení a rozpuštění pomocí

ELISA

Byla zjišťována stabilita IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile po procesu povlékání. Testování bylo prováděno porovnáváním reaktivity ELISA protilátek před povlékáním a pak po povlečení s následným rozpouštěním při pH 1,2 a pak pH 7,5. Preimunní IgY, lyofilizovaný výchozí IgY proti rekombinačnímu toxinu A a IgY proti rekombinačnímu toxinu A, získaný z cukrové částice s IgY s povlakem Eudragit® po rozpuštění byly nejprve kvantifikovány na protein a normalizovány na 2 mg/ml v PBS (pH 7,4). Postupem podle příkladu 35 b byla provedena ELISA, detekující protilátky proti rekombinačnímu toxinu A pTrxA1870-2680N/C. Výsledky ELISA jsou shrnuty v tabulce 46.

248

Tabulka 46. Porovnání titrů anti-rekombinantového toxinu A pomocí ELISA před a po enterosolventním povlékání

ředění	preimunní IgY*	anti-rekombinant A před povlakem	anti-rekombinant A po povlaku
1:50	0,017	1.4	1.2
1:250	0,005	0,59	0,38
1:1250	0,004	0,15	0,10
1:6250	0,005	0,037	0,026
1:31250	0,007	0,015	0,009
1:156250	0,009	0,009	0,007

průměr hodnot A280

Výsledky uvedené v tabulce 46 demonstrují, že reaktivita IgY k rekombinantnímu toxinu A C. difficile před a po povlečení Eudragitem® vůči rekombinačnímu proteinu toxinu A C. difficile, byla velmi podobná. Tyto výsledky naznačují, že proces povlékání není vůči IgY škodlivý a IgY zůstává po rozpouštění za fyziologických podmínek aktivní a funkční.

Výše uvedené výsledky prokázaly, že byl vytvořen IgY s enterosolventním povlakem, který zůstal stabilní a aktivní.

Příklad 38

Vakciňace křečků proti infekci C. difficile rekombinačními proteiny toxinu A C. difficile

Za účelem zjištění, zda si křečci, vakcinovaní rekombinačními proteiny toxinu A C. difficile, vytvoří ochranné protilátky proti infekci C. difficile, byl proveden následující experiment. Byly porovnávány tři různé rekombinanty toxinu A C. difficile, exprimované ve vektoru pMal-c nebo pET. Příklad zahrnoval a) imunizaci křečků, b) detekci humorální a mukosální odpovědi protilátek proti rekombinantu pomocí ELISA a c) expoziční studii křečků s použitím C. difficile.

249

• · ·

a) Imunizace křečků

Tři skupiny po 9 až 11 samicích zlatých syrských křečků (Charles River) o hmotnosti 90 až 100 g byiy testovány následujícím způsobem. Křečci z každé skupiny byli pro identifikaci jednotlivě označeni tetováním uší. Zvířata z každé skupiny byla ustájena společně a v průběhu experimentu jim byla podávána potrava a voda ad libitum. Křečci byli imunizováni dvěma různými rekombinačními fragmenty repetic proteinu toxinu A C. difficile, produkovanými ve vektoru pMal-c a exprimovanými s fúzí maltózu vázajícího proteinu (MBP), a jedním rekombinačním fragmentem repetic toxinu A C. difficile, produkovaným ve vektoru pET. Zvířata byla imunizována subkutánně 25 pg čištěného proteinu, bud pPA1870-2680N/C (příklad 15), pMA1870-2680, subfragmentu pMA1870-2680 označeného pMA1960-2680 nebo samotného MBP (pMal-c) jako kontroly. Všechny tři rekombinační vektory pMal byly pěstovány a protein čištěn a exprimován postupem uvedeným v příkladu 28c. Rekombinační pPA1870-2680N/C byl čištěn postupem uvedeným v příkladu 29f.

Směsi, obsahující 200 μΙ antigenu a kompletní Freundovo adjuvans (pro první injekci) a nekompletní Freundovo adjuvans (pro následné injekce), byly podány subkutánně za krk. Vakcinace byla prováděna s použitím 1 ml tuberkulinové stříkačky velikosti 27 po lehké etherizaci zvířat. Zvířata byla vakcinována pětkrát ve zhruba dvoutýdenních intervalech.

b) Detekce humorální a mukosální odpovědi protilátek proti rekombinantu

Detekce humorálního a mukosálního titru IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile u křečků byla prováděna pomocí ELISA. Pro humorální odpověď bylo shromážděno sérum z každé skupiny a testováno na hladinu IgY proti rekombinačnímu toxinu A. Alespoň 1 týden po poslední dávce byli křečci etherizováni, odebrána krev kardiální punkcí a shromážděno sérum. 96jamkové mikrotitrační destičky (Probind, Falcon) byly přes noc povlečeny rozpustným rekombinantem toxinu A C. difficile, pTrxA1870-2680N/C (příklad 29e) o koncentraci 0,05 pg/ml v PBS (pH 7,4) v množství 100 μΙ na jamku. Byl použit standardní postup

250 — ···» · · · · · ··• .·♦··· ·· ··· · 2 • · · · · · · .- · · ·· w «· ««· ·· ··

ELISA, jak je popsán v příkladu 35b. Jako sekundární protilátka byl použit kozí antikřeččí IgG-alkalická fosfatasa (Southern Biotech) ve zředění 1/2000. Průměrná absorbance při 410 nm ze zdvojených testovacích jamek každého vzorku séra, zředěného 1/250, je zobrazena na obr. 44.

Na obr. 44 jsou uvedeny hodnoty OD₄₁₀ při zředění séra 1:250, odebraného křečkům imunizovaným buď pMal-c (vektor pMal-c bez insertu), pMA1870-2680 (příklad 28c), pMA1960-2680 (příklad 28b) nebo pPA1870-2680 (příklad 15). Čísla uvedená na ordinátě představují čísla přidělená zvířatům ve skupině.

Výsledky zobrazené na obr. 44 demonstrují, že všichni křečci, imunizovaní rekombinanty toxinu A C. difficile, reagovali produkcí IgG proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile v séru. Existovala určitá variabilita odpovědi mezi křečky ve skupině, avšak tento rozdíl nebyl větší než 4násobný. průměrná reakce na pMA19602680 a pPA1870-2680 byla jednotně vyšší než odpověď na pMA1870-2680. Křečci imunizovaní proteinem pMal neprodukovali odpověď anti-sérového IgG na rekombinační protein toxinu A C. difficile.

Pomocí ELISA bylo rovněž stanoveno, zda došlo k mukosální reakci IgA po imunizaci. Byla shromážděna čerstvě izolovaná stolice od 4 členů každé skupiny, zvážena a resuspendována promícháním ve 300 μί PBS, pH 7,4, s obsahem 0,05 % thimerosalu na 100 mg stolice. Fekální suspenze byla odstřeďována 5 min při 14000 min'¹ v mikrocentrifuze. Výše uvedeným způsobem byly rekombinačním antigenem povrstveny mikrotitrační destičky. Byly použity standardní postupy ELISA s kozím anti-myším IgA-alkalickou fosfatasou (Southern Biotech) při 1/1000 jako sekundární protilátkou. Tento konjugát byl použit místo anti-křeččího IgA, protože anti-křeččí IgA není komerčně dostupný a již dříve bylo uvedeno, že anti-myší protilátka s křeččím IgA křížově reaguje. V žádném vzorku fekálních extraktů nebyl pomocí ELISA detekován mukosální IgA proti rekombinačnímu toxinu A. Tyto výsledky potvrzují předchozí studie [Kim a Rolfe (1989), Microbial Ecology in Health and Disease 2:47], při nichž nebyl u křečků, imunizovaných toxoidem připraveným z toxinu A C. difficile, detekován IgA proti toxoidu A.

251

c) Expoziční studie křečků pomocí C. difficile

Vakcinovaní křečci (popsaní v odstavci a) byli vystaveni působení C. difficile za účelem zjištění, zda protilátky proti rekombinačnímu toxinů A C. difficile chrání proti onemocnění C. difficile. Normální křečci, infikovaní toxigenním kmenem C. difficile, si vyvinou fatální onemocnění, začínající průjmem, a nakonec uhynou v důsledku silné enterokolitidy apendixu (proximálního tlustého střeva) a ilea (jak uvedeno v příkladu 9).

Čtyři skupiny vakcinovaných křečků byly nejprve predisponovány intraperitoneální dávkou klindamycin-fosfátu (Biomol) v 1 ml vody v množství 1 mg na 100 g tělesné hmotnosti. Po asi 24 h byli křečci orálně exponováni pomocí krmné jehly o velikosti 18 1.10⁶ organismů C. difficile, v 1 ml sterilního salinického roztoku. Před podáním byla zvířata lehce anestetizována etherem. Byl použit toxigenní kmen C. difficile ATCC 43596 po 48 h kultivaci na destičkách CCFA (BBL). Jeden křeček ze skupiny imunizované pMA1960-2680 uhynul náhodně v důsledku předávkování etheru a snížil tak počet zvířat ve skupině z 9 na 8. Výsledky imunizační studie jsou uvedeny v tabulce 47.

Tabulka 47. Vakcinace proti letální enterokolitidě C. difficile pomocí rekombinačních fragmentů toxinů A

skupina	% ochrany
pMal-c (MBP)	10% (1/10)
pMA1960-2680	62 % (5/8)
pMA1870-2680	30% (3/10)
pPA1870-2680	19% (2/11)

Výsledky uvedené v tabulce 47 demonstrují, že k ochraně proti úhynu došlo u některých křečků, imunizovaných každým z rekombinačních proteinů toxinů A (tj. pMA1960-2680 a pMA1870-2680). Tyto výsledky nejsou statisticky významné ve srovnání s fúzní kontrolou (pMal-c, který exprimuje pouze MBP) s hodnotou P 0,05 nebo menší pň analýze chi-square. V kontrolní skupině imunizované fúzním

252 proteinem (pMal-c) došlo k devadesátiprocentní mortalitě. Procento mortality ve skupině imunizované pMA1960-2680 bylo 38 %. Procento mortality ve skupině imunizované pMA1870-2680 bylo 70 % a ve skupině imunizované pPA1870-2680 81 %. Doba do úhynu nebyla ve skupině vakcinované rekombinačním toxinem A C. difficile nebyla oproti kontrole prodloužena a činila až 3 dny po infekci. Nekropsie uhynulých křečků ukázala typickou patologii, jako je silné megacékum.

Specifické hodnoty P pro zkušení skupiny ve srovnání s kontrolní skupinou pro pMA1960-2680, pMA1870-2680 a pPA1870-2680 byly menší než 0,10, resp. menší než 0,75, resp. menší než 0,90. Všichni křečci až na jednoho ve skupině imunizované pMA1870-2680 měli do 1 až 2 dnů po infekci průjem. Zdá se, že není korelace mezi titry protilátek proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile a úrovní ochrany. Například křeček č. 6 ve skupině imunizované pMA1960-2680 měl nižší titr ELISA oproti křečkovi č. 2 (viz obr. 44), a přesto č. 6 přežilo a č. 2 nebylo chráněno a uhynulo. Z těchto výsledků vyplývá, že křečci, vakcinovaní kterýmkoli z repetičních proteinů rekombinačního toxinu A C. difficile, nebyli chráněni před průjmem, vyvolaným C. difficile, a z 19 až 62 % byli chráněni před letálním stadiem nemoci.

Výše uvedené výsledky korelují s dříve publikovanou prací [Lyerly a d. (1990), Curr. Microbiol. 21:29], která ukázala, že křečci, vakcinovaní menším rekombinačním fragmentem toxinu A C. difficile (interval 1960-2680), exprimovaným v pUC9, mohli být před letálním stadiem nemoci chráněni také pouze částečně a žádný z těchto křečků nebyl chráněn proti průjmu. Lyerly a d. [(1990), Curr. Microbiol. 21:29] uvedli, že testované protilátky k rekombinačnímu proteinu toxinu A C. difficile nezabránily diaroickému stadiu nemoci a úhyn u poloviny křečků byl důsledkem různých hladin neutralizujících sérových protilátek k rekombinantu toxinu A. Na základě těchto výsledků je možno soudit, že rozdíly titrů proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile mezi křečky nemusejí vysvětlovat, proč k ochraně nedochází u všech zvířat. Tyto výsledky naznačují, že pro účinnější vakcinu proti onemocnění C. difficile je pravděpodobně potřebná další složka, pravděpodobně rekombinační protein toxinu B.

253 • · · · • ·

Příklad 39

Vakcinace křečků proti infekci C. diffícile rekombinačními proteiny toxinů A a toxinů B C. diffícile

Křečci byli imunizováni rekombinačním toxinem A nebo rekombinačním toxinem B C. diffícile samotným nebo v kombinaci za účelem zjištění, zda to vyvolá humorální odpověď na tyto rekombinační proteiny. Dále byla testována schopnost protilátek, produkovaných těmito vakcinacemi, chránit křečky před infekcí C. diffícile. Konkrétně bylo zjišťováno, zda protilátky, vytvořené proti rekombinačnímu toxinů B C. diffícile, budou poskytovat nějakou ochranu in vivo jako takové nebo nad ochranu poskytovanou vakcinaci rekombinačním toxinem A C. diffícile samotným. Příklad zahrnoval a) imunizaci křečků, b) stanovení humorální a mukosální odpovědi pomocí ELISA a c) expoziční studie in vivo u vakcinovaných křečků.

a) Imunizace křečků

Pro vakcinaci byl použit rekombinační protein toxinů A C. diffícile pPA18702680N/C (příklady 11 a 29) a rekombinační protein toxinů B C. diffícile pPB17502360 (příklad 15b). Rekombinační proteiny byly místo vektoru pMal-c, použitém v příkladu 38, exprimovány ve vektoru pET, protože bylo zjištěno, že proteiny exprimované a izolované pomocí vektoru pET jsou schopny vyčištění na vyšší úroveň čistoty s nižší hladinou endotoxinu. Produkce rekombinačních proteinů ve vektoru pET je zvlášť vhodná v případě potenciálního využití rekombinačního proteinu jako humánní vakciny, která vyžaduje vysokou čistotu a nízkou hladinu potenciálně škodlivého endotoxinu.

Pro imunizaci bylo smíseno 100 pg pPA1870-2680, 100 pg pPB1750-2360 nebo 100 pg každého z nich v kombinaci (celkem 200 pg) s 2 pg Gerbuho adjuvans (Biotech). Kontrolní skupina byla imunizována 100 pg bovinního sérového albuminu (BSA) s Gerbuho adjuvans. Každá skupina (z celkem čtyř) byla tvořena 9 až 10 samicemi zlatých syrských křečků (Charles River) o hmotnosti 100 g. Zvířata byla pro identifikaci individuálně označena. Před subkutánní injekcí za krk pomocí 1 ml

254 • · : ..........i.··.

·· ··· · · • · · · · · · -. — • · ·· <· ··· ·· ** stříkačky s jehlou velikosti 27 byli křečci lehce anestetizováni. Křečci byli imunizováni čtyřikrát ve zhruba dvoutýdenních intervalech.

b) Stanovení humoráiní a mukosální odpovědi protilátek pomocí ELISA

Pomocí ELISA bylo sérum ode všech jedinců ze všech výše uvedených skupin testováno na hladinu IgG proti rekombinačnímu proteinu. Alespoň 1 týden po poslední dávce byla zvířatům z každé skupiny odebrána kardiální punkcí krev a bylo shromážděno sérum. Ve vzorcích séra byly pomocí ELISA stanovovány protilátky proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile a proti rekombinačnímu toxinu B C. difficile. 96jamkové mikrotitrační destičky (Probind, Falcon) byly přes noc překryty při 4 °C bucf proteinem pPA1870-2680 v koncentraci 0,05 pg/ml nebo proteinem pPB17502360 v koncentraci 1,0 pg/ml v PBS (pH 7,4) v množství 100 pl na jamku. Byly použity standardní postupy ELISA přesně podle uvedeného popisu (příklad 13c). Výsledky jsou znázorněny na obr. 45 a 46.

Na obr. 45 a 46 je uvedena průměrná absorbance zdvojených vzorků séra ve zředění 1/250. Obr. 45 ukazuje individuální reaktivitu protilátek vůči rekombinantu toxinu A C. difficile ve skupinách imunizovaných buď rekombinantem toxinu A C. difficile (pPA1870-2680) nebo směsí rekombinačních toxinů A a B C. difficile (pPA1870-2680 a pPB1750-2360). Obr. 46 znázorňuje reaktivitu protilátek vůči rekombinačnímu toxinu B C. difficile ve skupinách imunizovaných bud rekombinantem toxinu B C. difficile (pPB1750-2360) nebo směsí rekombinačních toxinů A a B C. difficile (pPA1870-2680 a pPB1750-2360).

Výsledky znázorněné na obr. 45 a 46 demonstrují, že ve všech případech každé zvíře reagovalo a produkovalo specifickou odpověď protilátky IgG vůči imunogenu. Jak bylo očekáváno, křečci imunizovaní BSA (negativní kontrolní skupina) nevyvolali žádnou odpověď protilátek vůči rekombinačním antigenům. Odpověď vůči rekombinačnímu toxinu A nebo B C. difficile u členů téže skupiny byla podobná.

Pomocí ELISA bylo rovněž provedeno stanovení, zda byla po imunizaci vyvolána také mukosální odpověď IgA proti rekombinačnímu toxinu a C. difficile nebo

255

... · · ·· · · · ° : .... ... . · ··

...·.·» ·· ··· · · • · · · · · · . ..

rekombinačnímu toxinu B C. difficile. Byla shromážděna čerstvě izolovaná stolice od 4 členů každé skupiny, zvážena a zpracována postupem uvedeným v příkladu 21. Destičky byly převrstveny výše uvedeným antigenem rekombinačního toxinu A C. difficile nebo rekombinačního toxinu B C. difficile za účelem zjištění hladiny sérového IgG. byly použity standardní postupy ELISA (příklad 13c) ve spojení s kozí anti-myší IgA-alkalickou fosfatasou (Southern Biotech, Birmingham, AL). V žádném vzorku fekálního extraktu nebyl detekován IgA proti rekombinačnímu toxinu A nebo B. Tento výsledek s použitím různých rekombinantů opět potvrzuje, co již bylo zjištěno v příkladu 38 a dřívějších studiích [Kim a Rolfe (1989), viz výše].

c) Expoziční studie u vakcinovaných křečků in vivo

Vakcinovaní křečci, popsaní v odstavci a), byli vystaveni působení C. difficile za účelem zjištění, zda odpověď protilátek séra vůči rekombinačním toxinům A nebo B C. difficile jednotlivým nebo v kombinaci chrání proti CDAD. Každá ze čtyř skupin vakcinovaných křečků byla nejprve predisponována vůči CDAD intraperitoneální dávkou klindamycin-fosfátu (Biomol) v 1 mi vody v množství 1 mg na 100 g hmotnosti. Po asi 24 h bylo křečkům pomocí krmné jehly o velikosti 18 orálně podáno 1.10⁶ organismů C. difficile v 1 ml sterilního salinického roztoku. Před podáním byla zvířata lehce anestetizována etherem. Byl použit toxigenní kmen ATCC 43596 po 48 kultivaci na destičkách CCFA (BBL). Výsledky imunizační studie jsou uvedeny v tabulce 48.

Tabulka 48. Vakcinace proti letální enterokolitidě C. difficile pomocí rekombinačních polypeptidů toxinu A a toxinu B

skupina3	% ochrany
BSA	0 % (0/10)
pPA1870-2680N/C	20% (2/10)
pPB 1750-2360	0 % (0/10)
pPA1870-2680N/C & pPB1750-2360	100% (9/9)

256 • ·

^a vakcinováni subkutánně čtyřikrát ve dvoutýdenních intervalech 100 pg rekombinačního proteinu na křečka

Jak z tabulky 48 vyplývá, po jednom až třech dnech po expozici C. difficile se u všech křečků imunizovaných buď pPA1870-2680 nebo pPB 1750-2360 a kontrolní skupiny BSA vyvinul průjem. Všichni křečci v těchto třech skupinách, kromě dvou členů imunizovaných pPA1870-2680, uhynuli do několika až 48 h po detekovaném nástupu průjmu. Nekropsie zvířat ukázala silnou enterokolitidu se zaníceným a zvětšeným apendixem, charakteristickým pro onemocnění C. difficile. Naproti tomu křečci, imunizovaní vakcinou obsahující kombinaci proteinů pPA1870-2680 a pPB1750-2360, nevykazovali žádné známky onemocnění, jako je průjem, a zůstali zdraví po celou dobu 14 dní pozorování po infekci. Ve skutečnosti zůstala tato zvířata zdravá po dobu alespoň 5 měsíců po infekci; tyto výsledky demonstrují, že vakciňace kombinací proteinů pPA1870-2680 a pPB1750-2360 poskytuje kompletní a dlouhodobou ochranu křečků, inokulovaných pomocí C. difficile.

Ochranný účinek, pozorovaný u kombinované vakciny, nebyl důsledkem rozdílného titru protilátek v této skupině oproti titrům protilátek u křečků vakcinovaných pouze rekombinačním toxinem A C. difficile nebo toxinem B C. difficile. Ochrana křečků, imunizovaných kombinací toxinů A/B C. difficile (tj. pPA1870-2680 a pB1750-2360), byla ve srovnání s kontrolou statisticky významná; hodnota P byla stanovena jako méně než 0,001.

Uvedené výsledky demonstrují, že oba rekombinační proteiny toxinu A a toxinu B C. difficile jsou klíčovými složkami účinné vakciny proti C. difficile a vyvolání protilátek proti rekombinačním toxinům A nebo B C. difficile samotným nepostačuje k dodání kompletní ochrany. Protilátky vytvořené proti rekombinačnímu toxinu B C. difficile navíc k rekombinačnímu toxinu A C. difficile spolu poskytují ochranu a působí synergicky při neutralizaci průjmu a úhynu spojeného s C. difficile. I když není vynález omezen na určitý mechanismus, může ochrana sérovými protilátkami proti toxinu C. difficile vyplývat z úniku protilátek, neutralizujících toxin A a B C. difficile, do tkání nebo do střevní dutiny během zánětu, který doprovází časná stadia enterokolitidy C. difficile.

257

Výsledky uvedené výše (vakcinace křečků rekombinačními toxiny A a B C. difficile) a v příkladu 32(c)(iii) (podávání antitoxinu obsahujícího směs protilátek vytvořených proti oběma toxinům A a B C. difficile) se navzájem silně podporují. Společně demonstrují, že plná ochrana před CDAD (tj. ochrana před morbiditou i mortalitou) vyžaduje použití rekombinačních proteinů odvozených od obou toxinů A i B C. difficile pro buď aktivní nebo pasivní imunizaci.

Příklad 40

Ochrana in vivo proti infekci C. difficile parenterálním podáním protilátek proti rekombinačním proteinů, toxinu A a B C. difficile

Výsledky uvedené v příkladu 39 demonstrují, že vakcinace křečků proteiny A a B C. difficile vytváří u příjemců neutralizující sérové protilátky, které poskytují kompletní ochranu (tj. ochranu před morbiditou i mortalitou) proti zhoubným účinkům infekce C. difficile. Příklad 38 demonstruje, že vakcinace křečků rekombinačními proteiny toxinu A C. difficile produkuje neutralizující sérové protilátky proti toxinu A (IgG), ale nedetekovatenou hladinu mukosálních (IgA) protilátek proti toxinu A. Produkce sérových protilátek proti toxinu A a B je dostatečná pro ochranu proti CDAD. Pro zjištění, zda účinným způsobem léčby infekce C. difficile je parenterální aplikace IgY proti rekombinačním toxinům A a B, se provádí následující experiment.

Šest skupin samic zlatých syrských křečků (Charles River) po 9 až 10 členech o hmotnosti 80 až 100 g se způsobem uvedeným v příkladu 32c) infikuje C. difficile. Zvířata jsou ustájena ve klecích po třech a během studie dostávají potravu a vodu ad libitum. Na začátku studie je každý křeček predisponován vůči infekci intraperitoneální aplikací klindamycin-fosfátu (Biomol) v množství 1 mg/100 g tělesné hmotnosti v 1 ml vody pomocí 1 ml tuberkulinové stříkačky (velikost jehly 27). Po přibližně 24 h se každému zvířeti podá pomocí krmné jehly o velikosti 18 1 ml C. difficile (kmen ATCC 43596) s přibližně 10³ až 10⁴ organismy ve sterilním salinickém roztoku. Před infekcí se organismy kultivují 48 h na destičkách CCFA (BBL).

258

h po infekci (den 1) se následujícím způsobem zahájí léčba. Každý křeček dostane 2 ml roztoku obsahujícího buď preimunní IgY (jako 8X PEG preparát) nebo směs látek proti rekombinačním toxinů A a B (tj. antitoxin vytvořený proti pMA18702680 a pPB 1750-2360). 8X PEG preparáty se připraví a mísí způsobem uvedeným v příkladu 32(c)(ii) s tou výjimkou, že IgY se místo v karbonátovém pufru resuspendují ve sterilním salinickém roztoku. Preparáty IgY se podávají intraperitoneální injekcí. Preparáty IgY se podávají jednou, dvakrát nebo třikrát denně po dobu 4 dnů (doba léčby).

Zvířata se pozorují z hlediska nástupu průjmu a úhynu během doby léčby a po ní. Vypočte se úroveň ochrany poskytnutá každou léčebnou dávkou. Poskytuje-li nejnižší dávka ochranu u významného počtu křečků, testují se v následných experimentech za výše uvedených podmínek nižší dávky. Například se zjištěni nejnižší intraperitoneální dávky, dostatečné pro ochranu, testuje 1,0 a 0,5 ml preparátu IgY na zvíře během 4 dnů. Jsou-li pro dodání ochrany intraperitoneální injekcí potřebné pouze velmi malé dávky IgY, podává se IgY i intravaskulární injekcí za účelem zjištění, zda ochranu před infekcí C. difficile poskytuje také intravaskulární aplikace PEG preparátů IgY.

Příklad 41

Léčba křečků infikovaných C. difficile pomocí enterosolventně povlečeného IgY proti rekombinačnímu proteinu toxinů A C. difficile

Pro zjištění, zda je enterosolventně povlečený IgY proti rekombinačnímu toxinů A (příklad 37a) účinný při léčbě infekce C. difficile u křečků v nižší dávce, která je potřebná v případě použití stejného IgY bez enterosolventního povlaku, byl proveden následující experiment.

Křeččí model infekce se provádí přesně podle údajů v příkladu 32c, avšak stou výjimkou, že místo nepovlečeného IgY v karbonátovém pufru se použije enterosolventně povlečený antitoxin (pMA1870-2680 nanesený na nonpareil a poté povlečený Eudragitem®). Stručně řečeno se tři skupiny křečků (Sasco) po 7 členech

259

predisponují vůči infekci pomocí klindamycin-fosfátu (Biomol) v dávce 1 mg/100 g tělesné hmotnosti. Po 24 h se každému zvířeti orálně podá pomocí krmné jehly o velikosti 18 1 ml C. difficile (ATCC 43596) s obsahem přibližně 1.10³ organismů ve sterilním salinickém roztoku. Před infekcí se organismy 48 h kultivují na destičkách CCFA (BBL).

Po 3 h po infekci (den 1) se zahájí léčba orální aplikací různých koncentrací antitoxinu IgY s povlakem Eudragitu®: Každá skupina dostává po dobu 4 dní jednou denně 0 (kontrolní skupina), 2, 20, 50, 100 nebo 600 mg IgY s enterosolventním povlakem. Orální aplikace enterosolventně povlečených částic křečkům se provádí tak, že každá dávka se vloží do mikrocentrifugační nádobky, částice se resuspendují v pufru o nízkém pH, jako je acetát (pufry o nízkém pH se používají pro zabránění uvolňování IgY z enterosolventně povlečené částice před dodáním křečkovi); pak se suspenze orálně podává pomocí krmné jehly o velikosti 14. Během doby léčby a po jejím skončení se zvířata pozorují z hlediska nástupu průjmu a úhynu. Vypočte se procento souhrnné mortality (tj. úhynu) a morbidity (tj. průjmu).

Výsledky výše uvedeného experimentu (podávání enterosolventně povlečeného IgY) se porovnávají s výsledky získanými v příkladu 32c. V příkladu 32c byly použity stejné podmínky infekce, ale protilátky proti toxinů A byly podávány v karbonátovém pufru a neměly enterosolventní povlak. V příkladu 32c bylo 50 % křečků, léčených po infekci nepovlečeným IgY, chráněno před úhynem v důsledku C. difficile. Množství celkového IgY, podané za den v příkladu 32c, bylo asi 120 mg. Z této dávky činilo množství specifické protilátky za den, potřebné k dosažení této úrovně ochrany (tj. 50 % přežití), asi 1200 pg specifického IgY. V nynějším příkladu bylo každému křečkovi podáváno 2, 20, 50, 100 nebo 600 mg enterosolventně povlečeného IgY. Protože IgY tvoří pouze 1/5 hmotnosti takovéhoto enterosolventního materiálu, je skutečné množství IgY, podávané v dávkách 2, 20, 50, 100 a 600 mg asi 0,40 mg, 4 mg, 10 mg, 20 mg, resp. 120 mg. Z toho asi 1 % je specifický IgY proti rekombinačnímu toxinů A. Dávka 600 mg enterosolventní částice (tj. preparátu IgY proti rekombinačnímu toxinů A C. difficile, povlečeného Eudragitem®) je zhruba ekvivalentní množství protilátky dodané v karbonátovém pufru v příkladu 32c, která poskytla 50% ochranu. Porovnání dávky

260 • · enterosolventních částic, potřebné k poskytnutí stejné (tj. 50%) úrovně ochrany, ukazuje stupeň zvýšené účinnosti, poskytované enterosolventním povlečením preparátu IgY. Výsledky výše uvedeného experimentu demonstrují, zda je enterosolventně povlečený IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile (příklad 37a) účinný při léčbě infekce C. difficile u křečků při nižší dávce ve srovnání s nepovlečenou protilátkou k rekombinačnímu toxinu A.

Podobně se způsobem uvedeným v příkladu 37a enterosolventně povleče také IgY rekombinačního toxinu B C. difficile (tj. anti-pPB1750-2360). Enterosolventně povlečený IgY proti rekombinačnímu toxinu B C. difficile je testován na výše popsaném křeččím modelu infekce samotný nebo v kombinaci s enterosolventně povlečenou protilátkou proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile (tj. povlečeným preparátem IgY proti pMA1870-2680). Výsledky těchto experimentů demonstrují, zda jsou enterosolventně povlečené IgY proti rekombinačním toxinům A a B C. difficile (příklad 37a) účinné při kompletní ochraně zvířat před morbiditou a mortalitou spojenou s infekcí C. difficile při nižších dávkách oproti použití nepovlečených IgY proti rekombinačním toxinům A a B C. difficile.

Příklad 42

Stanovení minimální účinné dávky ptačích protilátek v karbonátovém pufru proti rekombinačnímu toxinu A a toxinu B C. difficile pro léčbu křečků infikovaných C. difficile

Byla stanovena minimální účinná dávka ptačích protilátek (IgY), vytvořených proti rekombinačnímu proteinu toxinu A a rekombinačnímu proteinu B, potřebná k léčbě onemocnění spojeného s C. difficile (CDAD) u křečků. Experiment zahrnoval infekční studii in vivo, při níž byli křečci ošetřováni různými koncentracemi IgY, vytvořených proti rekombinačnímu toxinu A a rekombinačnímu toxinu B.

Byly vytvořeny protilátky proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile (pMA18702680 - interval A-6) s použitím adjuvans RIBI a proti rekombinačnímu toxinu B C. difficile (pPB1750-2360; interval B-3) s použitím Freundova adjuvans. Postup

261 • 9

imunizace byl prováděn podle příkladu 35. Protilátky byly přečištěny pomocí PEG a resuspendovány v koncentraci 8X (všechny obsahovaly asi 40 mg/ml IgY) v 0,1 M karbonátovém pufru, pH 9,5.

Infekční studie zahrnovala testování tří experimentálních skupin (I, II a lil). Zvířata ve skupině I dostávala 2 ml preimunního IgY. Zvířata ve skupině II dostávala 1 ml směsi obsahující IgY proti toxinu A C. difficile a proti toxinu B C. difficile. Zvířata ve skupině lil dostávala 2 ml směsi podávané skupině II. Každou skupinu tvořilo osm zlatých syrských křečků (Sasco), vážících v průměru 79 ± 3,2 g. Křečci byli ustájeni v klecích po dvou nebo třech a během studie jim byla podávána potrava a voda ad libitum. Infekční studie byla prováděna postupem uvedeným v přikladu 31c.

Křečci byli predisponováni vůči infekci C. difficile I.P. aplikací 1 mg/100 g tělesné hmotnosti klindamycin-fosfátu (Biomol) v 1 mi sterilní vody. I.P. aplikace klindamycinu byla prováděna pomocí 1 ml tuberkulinové stříkačky (Terumo) o velikosti 27. Po asi 24 h byl každý křeček orálně infikován přibližně 1 ml steriiního saiinického roztoku s obsahem 1.10⁴ C. difficile (kmen ATCC 43596). Před inokulaci bylo C. difficile kultivováno asi 48 h na destičkách CCFA (agar cykloserin-cefoxitinfruktóza-vaječný žloutek, médium selektivní a diferenciální pro C. difficile) (BBL).

Po 8 h od inokulace (den 1) byla zahájena léčba. Křečci v každé ze tří skupin byli pomocí krmné jehly o velikosti 18 (Popper) ošetřováni jedním ze tří způsobů. Skupina I dostávala 2 ml preimunního IgY (jako 8X PEG preparát), skupina II dostávala 1 ml imunního IgY (tj. směs protilátek vytvořených proti pMA1870-2680 [interval A-6] a pPB1750-2360 [interval B-3j) a skupina III dostávala 2 ml imunního IgY.

Směs imunního IgY byla připravena smísením stejných objemů 8X koncentrátu IgY, vytvořeného proti pMA1870-2680, a 8X koncentrátu IgY vytvořeného proti pPB1750-2360; výsledná směs byla označena A-6/B-3 IgY. Množství specifických protilátek proti toxinovému proteinu, obsažené v této směsi A6/B-3 IgY bylo asi 1,2 mg/ml IgY proti rekombinačnímu toxinu A a asi 400 pg/ml IgY proti rekombinačnímu toxinu B. Tato množství byla stanovena afinitním čištěním postupem podle příkladu 15c. Množství celkového IgY v dávce 2 ml IgY bylo asi 80 mg a v dávce 1 ml asi 40 mg.

262 • ·

Křečci byli ošetřováni jedno denně po dobu 3 dní. [Dávkovači schéma se v tomto léčebném režimu liší od schématu použitého v předchozích příkladech (například příkladu 32), kde byli křečci ošetřováni po dobu 3 dní třikrát denně 2 ml.] Všichni křečci byli během doby léčby a po ní pozorováni z hlediska nástupu průjmu a úhynu. Výsledky jsou znázorněny na obr. 47 a tabulce 49.

Na obr. 47 je na ose souřadnic zobrazena úhrnná mortalita (vyjádřená procentem) a na ose úseček čas (vyjádřený ve dnech). Délka doby léčby, označená na obr. 47 vodorovnou úsečkou, byla 3 dny. Podání klindamycinu a inokulace pomocí C. diffícile („infekce“) jsou označeny šipkami. Plné čtverečky představují křečky ze skupiny I (tj. křečky ošetřované 2 ml preimunního IgY). Prázdné čtverečky představují křečky ze skupiny II (tj. křečky ošetřované 1 ml IgY A-6/B-3). Plné kosočtverce představují křečky ze skupiny III (tj. křečky ošetřované 2 ml IgY A-6/B-3).

Výsledky znázorněné na obr 47 demonstrují, že všichni křečci (tj. 8/8) ve skupině III byli chráněni proti úhynu. Naproti tomu ve skupinách I a II přežilo pouze 13 % (tj. 1/8) křečků. Stupeň ochrany ve skupině III byl pomocí analýzy chi-square statisticky významný s hodnotou P < 0,005.

V následující tabulce jsou uvedeny výsledky získané s použitím IgY A-6/B-3. Dávka uvedená v této tabulce se vztahuje na koncentraci celkového (nikoli specifického) IgY, podávaného zvířatům v dávce 1 nebo 2 ml.

Tabulka 49. Prevence morbidity in vivo pomocí IgY A-6/B-3

skupina	% zvířat s průjmem	střední hmotnost1
preimunní, 80 mg (skupina I)	100	67,3 ±3,9
A-6/B-3, 40 mg (skupina II)	100	69 ± 4,2
A-6/B-3, 80 mg (skupina III)	0	81,6 ±5,5

hmotnost vyjádřená v gramech ± SD; střední výchozí hmotnost křečků byla 79 ± 3,2 g. U zvířat, která uhynula, byla hmotnost zjišťována v době smrti. U přeživších byla hmotnost zjišťována po skončení léčby.

263

Z výsledků uvedených v tabulce 49 vyplývá, že morbiditě bylo zabráněno také, jestliže byli křečci ošetřováni s použitím 2 ml IgY A-6/B-3 denně. Morbidita v důsledku CDAD je zde definována jako zahrnující průjem a úbytek hmotnosti. Jak je patrné z tabulky 49, žádný křeček ve skupině III neměl průjem. Naproti tomu křečci, ošetřovaní buď 1 ml IgY A-6/B-3 (skupina II) nebo 2 ml preimunního IgY (skupina I) průjem vykazovali. Navíc všichni až na jednoho křečka ve skupinách I a II do asi 48 h po nástupu průjmu uhynuli, prevence průjmu ve skupině III byla v porovnání se zbylými dvěma skupinami statisticky významná (P < 0,001).

Výsledky uvedené v tabulce 49 navíc ukazují, že křečci ošetřovaní bud 2 ml preimunního IgY (skupina I) nebo 1 ml IgY A-6/B-3 (skupina II) ztratili 14 % své střední výchozí hmotnosti před infekcí. Naproti tomu zvířata ošetřovaná 2 ml IgY A6/B-3 (skupina III) po skončení léčby přibyla o asi 2 % své střední výchozí hmotnosti.

Na základě výše uvedených výsledků je minimální účinná terapeutická dávka specifického IgY k oběma rekombinačním toxinům A a B C. difficile (pMA1870-2680 a pPB 1750-2360;, interval A-6, resp. B-3), nutná k prevenci mortality a morbidity v důsledku CDAD u křečků za výše uvedených podmínek (tj. v karbonátovém pufru), asi 2,4 mg IgY A-6 a asi 800 pg IgY B-3 denně po dobu 3 dní.

Příklad 43

Stanovení specifického IgY ve slepém střevu křečka ošetřovaného protilátkami proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile a proti rekombinačnímu toxinu B C. difficile

Bylo zjišťováno množství specifického IgY proti toxinu C. difficile, nacházející se ve slepém střevě křečka, ošetřovaného protilátkami, vytvořenými proti rekombinačnímu toxinu A (pMA1870-2680; A-6) a rekombinačnímu toxinu B (pPB1750-2360; B-3). Výsledky této studie poskytují přibližnou velikost terapeutické dávky IgY proti rekombinačnímu toxinu A a rekombinačnímu toxinu B (IgY A-6/B-3), která musí být přítomna v místě infekce, aby chránila zvíře infikované C. difficile.

Tento příklad zahrnoval a) získání cekálního obsahu od neošetřovaného křečka a od křečka ošetřovaného IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile a

264

proti rekombinačnímu toxinu B C. difficile (tj. IgY A-6/B-3), b) přímé stanovení množství specifického IgY A-6 a IgY B-3 vcekálním obsahu pomocí ELISA a c) přímé stanovení celkového IgY ve slepém střevě pomocí ELISA a nepřímé stanovení specifického IgY..

a) Získání cekálního obsahu od neošetřeného křečka a od křečka ošetřeného

IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile a proti rekombinačnímu toxinu B

C. difficile (IgY A-6/B-3)

Křeček byl ošetřován postupem pro skupinu III, uvedeným v příkladu 42 (tj. křeček úspěšně léčený na CDAD pomocí 2 ml 8X IgY A-6/B-3 denně po dobu 3 dní). Po 4 h po podání poslední dávky IgY byl křeček usmrcen pomocí etheru. Kontrolní křeček byl pro predispozici vůči infekci C. difficile ošetřen klindamycinem, avšak nedostal ani IgY, ani C. difficile a sloužil jako negativní kontrola. Kontrolní křeček byl usmrcen dva dni po podání klindamycinu.

Oběma křečkům bylo odebráno slepé střevo a většina cekálního obsahu byla shromážděna do 15 ml odstředivkové nádobky. Každá nádobka obsahovala několik ml cekálního materiálu. Obsah každé nádobky byl promíchán a z každé nádobky byl odebrán alikvot 1 ml do 1,5 ml mikrocentrifugační nádobky. Tyto nádobky byly podrobeny mikrocentrifugaci po dobu 1 min při 14000 min'¹. Byl sebrán získaný supernatant a ve vzorcích byl pomocí ELISA kvantifikován specifický IgY.

b) Přímé stanovení množství specifického IgY A-6 a IgY B-3 v cekálním obsahu pomocí ELISA

Hladiny IgY proti rekombinačnímu toxinu A a toxinu B, přítomného v cekálním obsahu, byly detekovány pomocí ELISA postupem uvedeným v příkladu 13c s těmito modifikacemi: 96jamkové mikrotitrační destičky byly přes noc pri 4 °C povlečeny (100 μΙ/jamku) pomocí 0,05 pg/ml rekombinačního proteinu toxinu a C. difficile [pPA18702680 (N/C) (příklad 29)] nebo 1 pg/ml rekombinačního proteinu toxinu B C. difficile [pPB1750-2360 (příklad 18b)] v PBS, pH 7,4. Cekální vzorky byly nejprve dvojnásobně zředěny PBS a umístěny do jamek. Zředěné vzorky pak byly

265 • · • · • ·

v mikrotitračních jamkách pětinásobně sériově ředěny. Všechny vzorky byly testovány zdvojeně.

Kvantifikace hladin specifického IgY vcekálních vzorcích byla při testech ELISA prováděna porovnáváním reaktivity protilátek, zaměřené buď proti rekombinačnímu toxinu A nebo rekombinačnímu toxinu B, s reaktivitou vyvolanou známým množstvím afinitně čištěného IgY. IgY, specifické pro rekombinační toxiny A a B C. difficile, byly čištěny postupem uvedeným v příkladu 15c. Stručně řečeno byly z PEG-čištěných IgY z vajec slepic, imunizovaných buď pMA1870-2680 (interval A-6) nebo pPB1750-2360 (interval B-3), izolovány afinitně čištěné protilátky. PEG-čištěný IgY proti pMA1870-2680 byl afinitně čištěn pomocí sloupce, obsahujícího pMA18702680 vázaný na Actigel (Sterogene). PEG-čištěný IgY proti pPB 1750-2360 byl afinitně čištěn pomocí sloupce Actigel, obsahujícího pPB1850-2360 (příklad 15c), což je rekombinační protein toxinu B C. difficile, o 100 aminokyselin menší než pPB17502360.

Afinitně čištěné IgY proti pMA1870-2680 (A-6) a proti pPB1750-2360 (B-3) byly kvantifikovány měřením absorbance při 280 nm a každý preparát byl zředěn na koncentraci 10 pg/ml v PBS. Afinitně čištěné IgY byly pomocí ELISA testovány počínaje výchozí koncentrací 10 pg/ml a sériovým pětinásobným ředěním v odpovídající povlečené mikrotitrační destičce podél cekálních extraktů. Jako sekundární protilátka pro detekci navázaného IgY pomocí ELISA byl použit králičí anti-kuřecí IgY konjugováný s alkalickou fosfatasou (Sigma) ve zředění 1:750.

Porovnání ekvivalence reaktivity ELISA vůči známým koncentracím afinitně čištěného IgY mezi cekálními extrakty umožnilo odhadnout množství specifického IgY proti rekombinantů, přítomného v cekálních extraktech. Z výsledků ELISA bylo zjištěno, že množství specifického IgA proti pMA1870-2680 (A-6) je asi 12 pg/ml. Množství specifického IgY proti pPB1750-2360 (B-3) bylo stanoveno jako asi 800 ng/ml. Tyto koncentrace specifických IgY poskytují odhad účinných terapeutických koncentrací potřebných k dosažení ochrany v místě infekce. Protože množství specifického IgY, podávaného orálně před odebráním cekální tekutiny, bylo asi 2400 až 2800pg proti rekombinantů toxinu A a 400 až 800 pg proti rekombinantů toxinu B, došlo přibližně k 200 až 233násobnému snížení, resp. 500 až lOOOnásobnému

266 snížení detekovatelného množství IgY proti rekombinačnímu proteinu toxinu, nacházejícího se ve slepém střevě, zaměřeného proti intervalu A-6, resp. intervalu B3.

Těchto výsledků bylo dosaženo s použitím protilátek přítomných v karbonátovém pufru. Kdyby byly orálně podávané IgY proti rekombinačnímu toxinu chráněny před degradací během průchodu gastrointestinálním traktem (tj. použitím enterosolventního povlaku, popsaného v příkladu 37), byla by účinná terapeutická dávka, potřebná pro orální aplikaci, menší než je uvedeno v příkladu 42.

c) Nepřímé stanovení množství specifických IgY proti rekombinačnímu toxinu

A a B C. difficile v cekálním obsahu pomocí ELISA

Za účelem potvrzení hodnot, stanovených v příkladu 43(b) pro hladiny IgY proti rekombinačním toxinům, nacházející se ve slepém střevě ošetřovaného křečka, byl proveden následující experiment. Není-Ii uvedeno jinak, byl použit standardní formát ELISA (popsaný v příkladu 13c).

V tomto experimentu byl použit cekální extrakt z neošetřeného křečka (sloužícího jako negativní kontrola) a křečka ošetřovaného IgY jak proti rekombinačnímu toxinu A, tak proti rekombinačnímu toxinu B [jak popsáno výše v odstavci (a)]. Přímo byl stanoven celkový cekální IgY, nikoli jen množství cekálního IgY, specifického pro rekombinační proteiny C. difficile. Protože byla známa procentická množství specifické protilátky obsažené v preparátech IgY, umožnilo tedy stanovení hladiny celkového IgY, přítomného v cekálních extraktech, vypočítat množství specifické protilátky v cekálním extraktu.

Pro zachycení IgY v cekálním materiálu byl použit následující sendvičový test ELISA. Mikrotitrační destičky byla přes noc při 4 °C pokryta králičím anti-kuřecím IgG (Cappel) v koncentraci 0,1 gg/ml v PBS (100 μί na jamku). Oba cekální extrakty byly testovány v počátečním zředění 1:500 a se sériovým pětinásobným ředěním do konečného zředění 1:312500. Všechna zředění vzorků byla testována zdvojeně. Afinitně čištěné protilátky, zaměřené proti rekombinačnímu toxinu A (pPA1870-2680, interval A-6), byly zředěny na 0,1 μς/ιτιί a pak dále sériově pětinásobně ředěny do

267 • · · · « • · « • · · · konečné koncentrace 0,16 ng/ml a byly také testovány pomocí ELISA, aby byla umožněna kvantifikace srovnáním. Po inkubaci a promytí byla k destičkám přidána králičí anti-kuřecí alkalická fosfatasa-lgG (Sigma) (ve zředění 1:1000). Po promytí destiček pak byl přidán substrát (p-nitrofenylfosfát) a destičky byly hodnoceny podle příkladu 13c.

Jak je uvedeno v příkladu 43(b), byla reaktivita ELISA získaná pomocí afinitně čištěného IgY proti rekombinačnímu toxinů A, za účelem kvantifikace množství celkového IgY ve slepém střevě ošetřeného křečka přiřazena k reaktivitě ELISA získané ředěním cekálního extraktu.

Na základě výsledků testu ELISA bylo množství celkového IgY ve slepém střevě ošetřeného křečka odhadnuto jako 50 pg/ml. Studie afinitním čištěním ukázaly, že celkové preparáty IgY obsahovaly asi 7 % či 3,5 pg/ml IgY specifického pro rekombinačni toxin A (anti-A-6 IgY) a asi 1 až 2 % či 500 až 1000 ng/ml IgY specifického pro anti-rekombinační toxin B (anti-B-3 IgY). Koncentrace obou takto detekovaných specifických IgY dosti úzce korelují s množstvím detekovaným v příkladu 43(b), tj. 3,5 pg/ml oproti 12 pg/ml pro anti-interval A-6 a 800 ng/ml oproti 500 až 1000 ng/ml pro anti-interval B-3.

Tyto výsledky a výsledky v odstavci (b) tohoto příkladu ukazují, že v místě infekce C. difficile byly detekovány velmi nízké hladiny specifických IgY proti intervalu A-3 a B-3. Protože byl křeček chráněn proti CDAD, je tato hladina antirekombinačního toxinů A a B v terapeutickém rozmezí. Tyto výsledky rovněž podporují názor, že pokud by byly IgY proti rekombinačním toxinům podávány s použitím ochrany proti degradaci v gastrointestinálním traktu (tj. enterosolventního povlaku), bylo by nutno orálně podávat pouze značně nižší dávky.

Příklad 44

Léčba diaroických křečků s použitím IgY proti rekombinačnímu toxinů A C. difficile

Pro zjištění, zda křečci, vykazující po infekci C. difficile průjem, mohou být účinně léčeni pomocí IgY proti rekombinačnímu toxinů A C. difficile samotným nebo

268

je-li nutná kombinace IgY proti rekombinačnímu toxinu A a B, byl proveden následující experiment.

Křečkům byl podán klindamycin a byli infikováni C. difficile v podstatě způsobem uvedeným v příkladu 32c. IgY proti rekombinačnímu toxinu A byl produkován proti pMA1870-2680 (interval A-6) a IgY proti rekombinačnímu toxinu B byl produkován proti pPB1750-2360 (interval B-3).

Tři skupiny křečků (Sasco) byly predisponovány vůči infekci C. difficile I.P. injekcí 1 ml klindamycin-fosfátu (Biomol) v množství 1 mg/100 g tělesné hmotnosti. Po asi 24 h byla každému křečkovi podána pomocí jehly o velikosti 18 provokační dávka 1 ml inokula s obsahem přibližně 1.10⁴ organismů C. difficile (ATCC 43596) ve sterilním salinickém roztoku. Bakterie byly před infekcí pěstovány asi 48 h na plotnách agaru CCFA (BBL).

Všem třem skupinám po 9 až 10 členech byly pomocí krmné jehly podány preparáty IgY. Skupina I dostala preimunní IgY; skupina II dostala IgY proti rekombinačnímu toxinu A (anti-A-6 IgY); skupina III dostala směs IgY proti rekombinačnímu toxinu A a IgY proti rekombinačnímu toxinu B (anti-A-6/B-3/lgY). Každý preparát IgY zahrnoval 8X PEG preparát v 0,1 M karbonátovém pufru, pH 9,5 a obsahoval asi 40 mg/ml proteinu. K vytvoření směsi anti-A-6/B-3 IgY byly navzájem smíseny stejné objemy dvou 8X koncentrátů (tj. anti-A-6 a anti-B-3). Množství specifického IgY proti toxinu A C. difficile v preparátu anti-A-6-lgY bylo asi 2,8 mg/ml. Množství specifického IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile v preparátu antiA-6/B-3 IgY na ml bylo tedy poloviční než v preparátu IgY A-6 (tj. 1,4 mg/ml). V preparátu anti-A-6/B-3 IgY bylo přítomno asi 200 až 400 pg/ml specifického IgY proti rekombinačnímu toxinu B.

Poté, co byl u každého jednotlivého křečka detekován nástup průjmu, bylo zvířeti podáno 2 ml příslušného preparátu (tj. buď preimunního, anti-A-6 IgY nebo anti-A-6/B-3 IgY). Nástup průjmu byl u křečků detekován 20 až 44 h po inokulaci C. difficile. Většina křečků (82 %) vykazovala průjem do 24 h po inokulaci organismy, Většině zvířat byly podány 3 dávky IgY denně ve zhruba čtyřhodinových intervalech po dobu 2 dní; některým křečkům však byla podána jen jedna nebo dvě dávky první den léčby v důsledku pozdějšího nástupu průjmu.

269

Výsledky tohoto experimentu ukázaly, že IgY proti A-6 byl schopen ochránit mnoho křečků před úhynem i v případě podání po nástupu průjmu. Asi polovina (55 %) křečků ošetřených anti-A-6 IgY přežila přibližně jeden měsíc, zatímco z křečků ošetřených preimunním IgY přežilo pouze 11 % a z křečků ošetřených anti-A-6/B-3 IgY přežilo 20 %.

Protože se zdá, že anti-A-6 IgY je v křeččím modelu nejvýznamnější složkou z hlediska prevence úhynu (například příklad 32(a)), byly výsledky získané u křečků ošetřených anti-A-6/B-3 IgY (který obsahuje polovinu množství specifického IgY proti A-6 v porovnání se samotným preparátem A-6 IgY) neočekávané (pouze 20 % zvířat bylo chráněno před úhynem). V tomto příkladu nebyl anti-A-6 IgY samotný schopen zabránit úhynu u 50 % křečků a anti-B-3 IgY samotný neposkytoval ochranu. Kromě toho výsledky získané v předchozích studiích (například příklad 32c) ukázaly, že protilátky anti-B-3 jsou významnější při prevenci nástupu průjmu než při prevenci úhynu v důsledku CDAD.

Všechna zvířata, která byla úspěšně léčena anti-A-6 IgY, vykazovala před zahájením léčby mírný průjem. Pokud byl průjem před zahájením léčby silný a byly přítomny neurologické příznaky, nebyla orální aplikace anti-A-6 IgY schopna poskytnou úspěšnou léčbu.

Výše uvedený experiment s křečky byl opakován s tou výjimkou, že byl podáván pouze preimunní nebo anti-A-6 IgY. Skupinám po 10 až 11 zvířatech bylo podáno 2 ml 8X IgY koncentrátů poté, co byl u každého jednotlivého zvířete detekován průjem. Schéma podávání bylo stejné jako v předchozím případě.

Průjem byl u křečků detekován asi 20 až 45 h po inokulaci C. difficile. 85 % zvířat (17/20) vykázalo průjem asi 28 h po infekci. Data z těchto dvou studií byla spojena a jsou znázorněna na obr. 48.

Na obr. 48 je na ose souřadnic zobrazeno procento souhrnné mortality a na ose úseček čas (ve dnech). Doba léčby je vyznačena úsečkou mezi dny 2 a 3. Podání klindamycinu a inokulace organismy C. difficile (označena na obr. 48 jako „infekce“) je označena šipkami. Plné čtverečky představují křečky, kteří dostávali preimunní IgY, a prázdné čtverečky představují křečky, kteří dostávali anti-A-6 IgY.

270 • ·

Údaje znázorněné na obr. 48 prokazují, že 45 % křečků, ošetřovaných po průjmu anti-A-6 IgY, po léčbě přežilo (průjem se u většiny těchto křečků upravil sám). Výsledky získané s použitím anti-A-6 IgY v porovnání s výsledky získanými s použitím preimunního IgY byly statisticky významné s hodnotou P < 0,05. Všichni křečci, ošetřovaní anti-A-6 IgY, přežívali po léčbě dlouhodobě (> 1 měsíc) do skončení experimentu.

Tyto výsledky poskytují první popis léčebného režimu, který může být použit k léčbě křečků po nástupu průjmu v důsledku infekce C. difficile. Navíc demonstruji, že IgY proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile je účinným terapeutikem i při podání v pozdních stadiích CDAD (tj. po nástupu průjmu).

Příklad 45

Léčba nepopiratelné infekce C. difficile pomocí IgY proti rekombinačnímu proteinu toxinu A a proteinu toxinu B C. difficile s použitím dvou různých adjuvans

Byla zkoumána schopnost rekombinačních proteinů toxinu A toxinu B, produkovaných s použitím vektoru pET, vyvolávat tvorbu neutralizujícího IgY u slepic, schopného chránit křečky před infekcí C. difficile. V předchozích studiích (příklad 32 nebo 44) byl vytvořeny IgY proti rekombinačním proteinům toxinu A C. difficile, exprimovaným s použitím vektoru pMal (pMA1870-2680, interval A-6). Protože rekombinační proteiny, exprimované s použitím systému pET, mohly být izolovány v čistší formě oproti proteinům exprimovaným s použitím vektoru pMal, byla dána přednost produkci protilátek proti rekombinantu toxinu A, produkovanému v pET (pPA1870-2680, A-6).

IgY proti pPA1870-2680 byiy testovány na křeččím modelu spolu s protilátkami proti proteinu toxinu B, exprimovanému rovněž s použitím vektoru pET (pPB17502360, interval B-3). Použití společného expresního systému k produkci obou rekombinačních toxinů má určité výrobní výhody. Například je možno pro oba rekombinanty použít stejné kolony pro afinitní čištění a stejné postupy a oba antigeny by měly mít srovnatelnou čistotu a výtěžek.

271 ·· ·· ♦ · · • · · · · • · · * • · · · ·> · ·· *· • · ν· · · · · • · · · · ·· • · ···«··· • · · · · ·

Dalším cílem tohoto vynálezu byl vytvořit protilátky proti oběma proteinům toxinů A-6 a B-3, získaných pomocí pET, s použitím stejného adjuvans. V předchozích příkladech (příklad 32 nebo 44) byly testované IgY vytvořeny bud proti rekombinantu A-6 nebo B-3 pomocí různých adjuvans (pro IgY proti rekombinačnímu toxinu A bylo použito adjuvans RIBI a pro IgY rekombinačního toxinu B Freundovo adjuvans).

Tento příklad zahrnoval a) imunizaci slepic rekombinačnimi proteiny toxinů C. difficile, exprimovanými pomocí vektoru pET a 2 různých adjuvans, a stanovení titrů IgY proti rekombinačním proteinům pomocí ELISA a b) ošetření křečků, infikovaných C. difficile, pomocí směsi IgY proti rekombinačnímu toxinu A (A-6) a toxinu B (B-3), vytvořených pomocí Gerbu nebo Quil A.

a) Imunizace slepic rekombinačnimi proteiny toxinu C. difficile, exprimovanými s použitím vektoru pET a dvou různých adjuvans, a stanovení titrů IgY proti rekombinačním proteinům pomocí ELISA

Slepice byly imunizovány rekombinačnimi proteiny exprimovanými s použitím vektoru pET; proteiny rekombinačního toxinu A (pPA1870-2680) nebo rekombinačního toxinu B (pPB1750-2360), afinitně čištěné na niklové koloně, byly smíseny buď s adjuvans Quil A (Accurate Scientific) nebo Gerbu (CC Biotech). Tato dvě adjuvans byla vybrána na základě vlastností (uvedeny v příkladu 35) a ceny. Imunizace byla prováděna v podstatě postupem uvedeným v příkladu 35.

Stručně řečeno byly slepice imunizovány nejprve čtyřmi imunizacemi 100 pg pPA1870-2680 a pak dvěma imunizacemi s použitím 1 mg proteinu. Proteinem pPB1750-2360 byly slepice imunizovány šestkrát s použitím 1 mg na imunizaci. Každé slepici bylo subkutánně podáno 500 μΙ roztoku obsahujícího jeden z rekombinačních toxinových proteinů a bud 5 μg adjuvans Gerbu nebo 75 μg adjuvans Quil A. Asi po 1 týdnu po poslední injekci byla sebrána vejce a v každé skupině (čtyři skupiny slepic s použitím obou toxinových rekombinantů a obou adjuvans) byl pomocí PEG extrahován IgY postupem uvedeným v příkladu 1. Byl rovněž zpracován IgY z preimunních vajec.

272 • · · · • · ··· · • · · · · · • · · · · • ·· · · · · • · · · ·· • · · ··· · · • · · · ·

IgY byly resuspendovány v 0,1 M karbonátovém pufru, pH 9,5, v 8X koncentraci žloutku (asi 40 mg/ml) a byla provedena ELISA (způsobem popsaným v příkladu 35) pro stanovení titrů proti rekombinačnímu toxinu A a proti rekombinačnímu toxinu B. Bylo zjištěno, že titr protilátek, vytvořených buď proti proteinu pPA1870-2680 (A-6) nebo pPB1750-2360 (B-3) s použitím buď adjuvans Gerbu nebo Quil A, je 1:62.500. Po afinitním čištění bylo s použitím adjuvans Gerbu množství specifického A-6 IgY 4,3 % a specifického B-3 IgY 1,0 %. Množství specifického IgY s použitím adjuvans Quil A bylo 2,2 % pro A-6 a 1,9 % pro B-3.

b) Léčba křečků, infikovaných C. difficile, pomocí směsi IgY proti rekombinačnímu toxinu A (A-6) a toxinu B (B-3), vytvořených s použitím buď adjuvans Gerbu nebo Quil A

Byly smíseny stejné objemy PEG preparátů anti-A-6 a anti-B-3 IgY, vytvořené podle odstavce (a) s použitím stejného adjuvans. Tyto preparáty byly označeny jako A-6/B-3 Gerbu a A-6/B-3 Quil A. Studie ošetření křečků byla provedena přesně jako je uvedeno v příkladu 42. Po 6 h po expozici 10⁴ organismů C. difficile (kmen ATCC 43596) bylo křečkům podáno 2 ml preparátu bud preimunního nebo imunního IgY (A6/B-3 Gerbu a A-6/B-3 Quil A). Křečci pak dostávali 2 ml IgY ještě po dva dny jednou denně.

Výsledky této studie léčby křečků jsou znázorněny na obr. 49. Na obr. 49 je na ose souřadnic uvedeno procento souhrnné mortality a na ose úseček čas (ve dnech). Doba léčby je označena úsečkou mezi dny 1 a 3. Podání klindamycinu a inokulace organismy C. difficile (na obr. 49 označena jako „infekce“) je označena šipkami. Plné čtverečky představují křečky, kteří dostávali preimunní IgY; prázdné čtverečky představují křečky, kteří dostávali anti-A-6/B-3 Gerbu IgY a plné kosočtverce představují křečky, kteří dostávali anti-A-6/B-3 Quil A IgY.

Výsledky znázorněné na obr. 49 ukazují, že oba imunní preparáty IgY (A-6/B-3 Gerbu i A-6/B-3 Quil A) chránily křečky kompletně před úhynem v důsledku CDAD. Infekci C. difficile přežilo devět z devíti křečků, ošetřených kterýmkoli z imunních preparátů IgY, zatímco všech devět křečků, ošetřených preimunním IgY, uhynulo. Poměry přežití, pozorované u každého z preparátů A-6/B-3 Gerbu nebo A-6/B-3 Quil

273 • · • · · · • ·

A, byly statisticky významné v porovnání s výsledkem získaným u preimunního IgY (hodnota P pomocí analýzy chi-square < 0,001).

U tří z devíti zvířat ošetřovaných A-6/B-3 Gerbu a jednoho z devíti zvířat ošetřovaných A-6/B-3 Quil A se projevil velmi mírný průjem. Tento mírný průjem, pozorovaný u těchto léčených křečků (oproti úplné absenci průjmu, pozorované v předchozích příkladech, například příkladu 32) může být důsledkem nižšího titru protilátek ve zde použitých preparátech (1:62.500 oproti 1:125.000). Další posilovači imunizace slepic imunizovaných s použitím adjuvans Gerbu nebo Quil A by měly zvýšit titr na rozmezí 1:125.000, a tak zvýšit terapeutickou účinnost vůči průjmu.

Výše uvedené výsledky naznačují, že je možno s použitím vektoru pET (místo vektoru pMal) produkovat rekombinační proteiny toxinu A a B C. difficile bez nepříznivého účinku na produkci neutralizujícího antitoxinu. Kromě toho je možno stejného adjuvans použití ve spojení s pET-produkovanými proteiny k vyvoláni tvorby neutralizujícího IgY in vivo. Stejné adjuvans může být navíc použito s oběma rekombinačními proteiny k vyvolání terapeutické odpovědi IgY proti rekombinantů in vivo.

Příklad 46

Produkce protilátek s použitím směsi obsahující rekombinační toxiny A a B C. difficile ve slepicích

Byla zkoumána schopnost vyvolávat tvorbu kuřecích protilátek, zaměřených proti oběma rekombinačním toxinů A a B C. difficile, s použitím směsi obou proteinů jako kombinovaného imunogenu. Příklad zahrnoval a) imunizaci slepic směsí rekombinačních proteinů toxinu A a B C. difficile a b) čištění a detekci IgY proti rekombinačnímu toxinu A a toxinu B C. difficile.

a) Imunizace slepic směsí rekombinačních proteinů toxinu A a B C. difficile

Leghornské nosnice byly imunizovány směsí proteinů rekombinačního toxinu A (pPA1870-2680, interval A-6) a rekombinačního toxinu B (pPB1750-2360, interval

274

B-3); oba rekombinační proteiny byly exprimovány pomocí vektorového systému pET. Dvě skupiny slepic (každá po 4 slepicích) byly imunizovány 500 pg každého rekombinačního proteinu, smíšeného buď s adjuvans Quil A (Accurate Scientifič) nebo Gerbu (CC Biotech). Každé slepici byl podán celkový objem 1 ml, obsahující rekombinační protein a buď 5 pg adjuvans Gerbu nebo 75 pg adjuvans Quil A. Imunizace pro každé adjuvans byla prováděna postupem uvedeným v příkladu 35. Slepice byly imunizovány dvakrát v odstupu 2 týdnů.

b) Čištění a detekce IgY proti rekombinačnímu toxinu A a toxinu B C. difficile

Po asi 1 týdnu po poslední dávce byla sebrána 3 vejce od každé skupiny a pomocí PEG byl způsobem uvedeným v příkladu 1 extrahován IgY. IgY byly resuspendovány v PBS (pH 7,4) v koncentraci 4X s obsahem asi 20 mg/ml celkového proteinu. Jako negativní kontrola sloužil preimunní IgY.

Množství protilátek proti rekombinačnímu toxinu A (A-6 IgY) a proti rekombinačnímu toxinu B (B-3 IgY), přítomné v obou imunních preparátech IgY, bylo stanoveno pomocí ELISA v podstatě způsobem uvedeným v příkladu 13c nebo 43b. Stručně řečeno byly jamky mikrotitrační destičky pasivně povlečeny buď rekombinantem toxinu A (pPA1870-2680) nebo rekombinantem toxinu B (pPB17502360). Vzorky IgY byly nejprve zředěny 250násobně a pak postupně 5násobně ředěny. Všechny vzorky byly testovány zdvojeně. Pro detekci specifického IgY byla použita králičí anti-kuřecí IgG alkalická fosfatasa (Sigma) ve zředění 1:1000.

Výsledky těchto testů ELISA odhalily, že antigeny obou rekombinačních toxinů jsou schopny vyvolat u slepice odpověď lgY. Titry protilátek jsou vyjadřovány jako převrácená hodnota nejvyššího zředění, u kterého byla zjištěna asi 3krát vyšší reaktivita ELISA v porovnání s preimunní, tj. negativní kontrolou ve stejném zředění. Titry obou IgY anti-A-6 i anti-B-3 s použitím Gerbuho adjuvans byly velmi nízké a činily asi 1:250. Titr pro anti-A-6 IgY a anti-B-3 IgY, vytvořené s použitím adjuvans Quil A, byl ve srovnání s Gerbuho adjuvans 5 až 25krát vyšší. Titr protilátek vytvořených s použitím adjuvans Quil A pro anti-A-6 IgY byl větší než 1:6250 a pro anti-B-3 IgY větší než 1:1250.

275 • · • β ·

Zatímco titry IgY proti rekombinačním toxinům s použitím Quil A jsou nižší než úroveň dosažená v předchozích příkladech (například v příkladu 32) (hlavně proto, že slepice v tomto příkladu byly imunizovány pouze dvakrát; naproti tomu slepice v předchozích příkladech byly imunizovány 5 až 10 nebo vícekrát a získané titry antitoxinového proteinu dosahovaly 1:100.000 nebo více), naznačují výsledky, že oba rekombinační toxinové proteiny jsou u slepic stejně antigenní a protilátky produkované proti nim oběma jsou přítomny ve srovnatelných hladinách. Výsledky také naznačují, že hladina vyvolané odpovědi protilátek závisí na použitém adjuvaňs. Bylo zjištěno, že adjuvaňs Quil A ve srovnání s výsledky získanými s použitím adjuvaňs Gerbu vyvolává vyšší odpověď IgY proti A-6 a proti B-3 v časném stadiu imunizačního procesu.

Příklad 47

Afinitní čištění nativního toxinu A C. difficile s použitím protilátek proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile

Ptačí protilátky (IgY), vytvořené proti rekombinačnímu proteinu toxinu A C. difficile, byly afinitně čištěny s použitím intervalu A-6 jako afinitního ligandu. Vzniklé specifické protilátky pak byly imobilizovány na pevném nosiči za účelem přečištění nativního toxinu A z organismů C. difficile (ATCC 43255), pěstovaných v dialýzních sáčcích, ponořených v médiu BHI. Následující příklad popisuje a) afinitní čištění ptačích protilátek zaměřených proti rekombinačnímu fragmentu toxinu A a vytvoření afinitní kolony toxinu A, b) kultivaci organismů C. difficile pro produkci toxinu A a B v supernatantech kultury dialýzních sáčků, c) afinitní čištění toxinu A, d) charakterizaci afinitně čištěného toxinu A C. difficile in vitro, e) vyšetřování alternativní strategie pro navázání anti-A-6 IgY na pevný nosič pro afinitní čištění toxinu A, f) afinitní čištění toxinu A C. difficile na afinitní koloně vytvořené oxidací A-6 IgY jodistanem a g) charakterizaci afinitně čištěného toxinu A C. difficile in vitro.

276 • ·

9 » <

fc <

9 • 99

a) Afinitní čištění ptačích protilátek zaměřených proti rekombinačnímu fragmentu toxinu A a vytvoření afinitní kolony toxinu A

Protilátky specifické pro interval A (aa 1870-2680) toxinu A C. difficile byly afinitně čištěny pro získání činidel pro vytvoření afinitní kolony, umožňující čištění toxinu A C. difficile z kapalných supernatantu kultur a poskytující činidlo pro imunoanalýzu, umožňující detekci toxinu A C. difficile v supernatantu kultury a afinitně čištěných vzorcích toxinu A C. difficile.

ii) Afinitní čištění A-6 IgY

Hyperimunní IgY z vajec obsahujících protilátky k rekombinačnímu proteinu A6 s použitím Freundova adjuvans byl extrahován pomocí frakcionační metody PEG (příklad 1). Supernatant s obsahem protilátky byly nanesen na afinitní kolonu A-6, získanou kovalentním navázáním proteinu pPA1870-2680 (připraveného podle příkladu 29) na afinitní pryskyřici Actigel (Sterogene Biochemicals) podle pokynů výrobce. Na 5 ml afinitní pryskyřice Actigel bylo navázáno přibližně 10,2 mg proteinu pPA1870-2680 (A-6). Anti-A-6 IgY byl eluován pomocí elučního média Actisep (Sterogene Biochemicals) postupem podle příkladu 15c a dialyzován proti PBS po dobu 24 až 48 h při 2 až 8 °C.

ii) Navázání afinitně čištěného anti-A-6 IgY na aktivovanou afinitní pryskyřici za vzniku afinitní kolony toxinu A C. difficile

Původní afinitní kolona toxinu A byla připravena postupem uvedeným dále v příkladu 48a navázáním anti-A-6 na afinitní pryskyřici Actigel A. Porovnáním hodnot absorbance IgY při 580 nm před navázáním a po navázání bylo odhadnuto, že na afinitní pryskyřici bylo navázáno 58 % čili asi 7,6 mg anti-A-6 IgY.

277

b) Kultivace organismů C. difficile za vzniku toxinů A a B v kultuře v dialýzních sáčcích

Kmen C. difficile 43255 byl kultivován postupem uvedeným dále v příkladu 49b, část (iv) a (v). Přítomnost toxinu A v supernatantech kultury dialýzních sáčků C. difficile byla hodnocena na základě analýzy SDS-PAGE/Western blot následujícím způsobem.

Vzorky supernatantu kultury dialýzních sáčků a vzorek známého toxinu A, zakoupený na trhu, byly analyzovány způsobem uvedeným v příkladu 49b, část (iv), s tou výjimkou, že však byl jako primární protilátka pro westernový blot použit afinitně čištěný A-6 IgY.

Po analýze SDS-PAGE (5 % polyakrylamidový gel) byly proteiny přeneseny na nitrocelulózu pomocí přenosového zařízení Milliblot (Millipore) podle pokynů výrobce. Blot byl dočasně obarven pomocí 10% Ponceau Sa blokován přes noc v PBS s obsahem 1 mg/ml sušeného mléka. Primární preimunní a anti-A-6 IgY protilátky byly zředěny na 1 pg/ml pomocí PBS s obsahem 1 mg/ml BSA a příslušná protilátka byla inkubována s odpovídajícím blotem s mírným mícháním po dobu 2 h při teplotě místnosti. K odstranění nenavázané primární protilátky byly pruhy promyty PBS (10 mM fosfát sodný, 150 mM NaCl, pH 7,2), BBS-Tween (0,1 M kyselina boritá, 0,025 M borát sodný, 1 M NaCl, 0,1 % v/v Tween 20) a PBS a inkubovány se sekundární protilátkou, konjugovanou a králičí anti-kuřecí IgG alkalickou fosfatasou (Sigma Chemical Co.), zředěnou 1:2000 v PBS/BSA. Bloty byly promyty k odstranění nenavázané sekundární protilátky a pruhy byly vyvíjeny v roztoku substrátu BCIP/NBT (popsán dále v příkladu 48).

Při analýze westernovým blotem se jevilo, že oba analyzované vzorky supernatantu kultur obsahují imunoreaktivní toxin A C. difficile. Tento protein komigroval s komerčním toxinem A a byl rozpoznáván afinitně čištěným anti-A-6 IgY. Před afinitním čištění toxinu A byly vzorky supernatantú kultur spojeny. Supernatanty spojených kultur nebyly před nanesením na finitní kolonu koncentrovány.

278 • · • · • · « 4 • · · · • · · · 4 • · 4 • · · ·

c) Afinitní čištění toxinu A C. difficile

Vzorky supernatantů kultur C. difficile byly afinitně čištěny způsobem popsaným v příkladu 48c. Objem frakce Actisep po eluci a dialýze činil 42 ml, z čehož bylo 15 ml odebráno a před analýzou zkoncentrováno na 3 ml. Ke zkoncentrování vzorku byl použit přístroj Centricon 30 (Amicon).

d) Analýza supematantu kultur C. difficile, eluované frakce Actisep a eluátu z kolony na přítomnost toxinu A

Za účelem zjištění přítomnosti nebo nepřítomnosti toxinu A ve vzorku eluovaném pomocí Actisep a v odtékající kapalině z afinitní kolony byly tyto vzorky analyzovány pomocí SDS-PAGE a westernovým blotem spolu s výchozím materiálem supematantu kultury. Tyto analýzy byly prováděny způsobem popsaným v odstavci (b) za účelem zjištění relativního množství toxinu A ve vzorcích a účinnosti afinitního čištění.

Získaný western blot je znázorněn na obr. 50. Pruhy 1 až 3 na obr. 50 byly inkubovány s preimunním IgY jako primární protilátkou a pruhy 4 až 6 s anti-A-6 IgY jako primární protilátkou. Pruhy 1 a 4 obsahují výchozí materiál supematantu kultury; pruhy 2 a 5 obsahují materiál protekiý kolonou a pruhy 3 a 6 obsahují afinitně čištěný toxin A.

Výsledky, zobrazené na obr. 50, ukazují, že imunoreaktivní toxin A byl detekován ve výchozím materiálu supematantu kultury a ve frakci Actisep. Ve vzorku proteklém kolonou nebyl pozorován žádný toxin A, což ukazuje, že většina toxinu byla navázána na afinitní kolonu. Zdá se, že ve výchozím materiálu bylo významně více toxinu A než ve frakci Actisep. Protože materiál protekiý kolonou zjevně toxin A neobsahuje, ukazuje rozdíl mezi množstvím toxinu A ve výchozím materiálu a ve frakci Actisep na to, že i po eluci Actisep zůstalo na kolonu navázáno dosud významné množství toxinu. Jedno z možných vysvětlení neschopnosti Actisep eluovat veškerý toxin A spočívá v tendenci toxinu A nespecificky se vázat na uhlohydrátovou oblast molekul, jako jsou imunoglobuliny. To je možné proto, že antiA-6 IgY na koloně je navázán přes primární aminy, což by umožňovalo navázání

279 • · » I • · subpopulace IgY přes oblast Fab, čímž zůstane přístupná pro vazbu na toxin A oblast Fc, obsahující uhlohydráty.

e) Výzkum alternativní strategie navázání anti-A-6 IgY na pevný nosič za účelem afinitního čištění toxinů A

Dále byla zkoumána možnost navázání IgY na pevný nosič oxidací jodistanem v uhlohydrátové oblasti. Bylo předpokládáno, že tímto způsobem navázání se dosáhne: 1) navázání IgY na nosič přes oblast Fc za ponechání přístupu pro vazbu toxinů C. difficile v oblasti Fab a 2) dostatečné změny uhlohydrátů, aby byla eliminována nebo redukována nespecifická vazba toxinů A C. difficile.

i) Oxidace anti-A-6 IgY jodistanem sodným

Oxidace anti-A-6 IgY s použitím jodistanu sodného (Sigma Chemical Co) byla prováděna následujícím způsobem. Byl připraven zásobní roztok jodistanu sodného rozpuštěním 25 mg jodistanu sodného v 1,2 ml destilované deionizované vody. K 6 ml A-6 IgY (2,7 mg/ml) v 15ml polystyrénové zkumavce bylo přidáno 600 μΙ (0,1 objemu) zásobního roztoku jodistanu sodného. Zkumavka pak byla zakryta aluminiovou fólií a 1 h a 20 min mírně míchána za teploty místnosti. Poté byl přidán glycerol do konečné koncentrace 20 mM a zkumavka byla na dalších 10 min převrácena. Pak byl roztok dialyzován proti 100 mM acetátu sodnému, 150 mM NaCl, pH 5,5, k odstranění jodistanu sodného.

ii) Navázání oxidovaného IgG na hydrazidový gel Affi-Gel Hz (BioRad) ml pryskyřice Affi-Gel bylo promyto kondenzačním pufrem (100 mM acetát sodný, pH 5,5, a 150 mM chlorid sodný). Oxidovaný anti-A-6 IgY byl přefiltrován přes filtr s jehlou se skleněnou vatou pro odstranění sraženiny, která se vytvořila během procesu oxidace, a byl odebrán alikvot 100 μΙ pro analýzu A_28o. Promytá pryskyřice Affi-Gel byla v 15>ml polystyrénové zkumavce přidána k oxidovanému IgY a zkumavka byla přes noc ponechána v převrácené poloze (celkový objem 12 ml).

280

9 9 99 9 9 9 9 999

9 9 999 9 9 9 9999 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 999 9 9 9 9 iii) Stanovení účinnosti navázání

Afinitní pryskyřice anti-A-6 IgY-Affi-Gel byla vlita do kolony BioRad Econo a nenavázaná protilátka byla z pryskyřice vymyta a uchována pro analýzu A₂₈₀. Pak byla pryskyřice promyta 1 objemem lože PBS (10 mM fosfát sodným 0,5 M NaCl, pH 7,2). Tento podíl byl rovněž uschován pro analýzu A₂₈₀. Poté byla pryskyřice promyta ještě několika objemy PBS a pro odstranění veškeré zbylé nenavázané protilátky byla promyta elučním pufrem Actisep (Sterogene Bioseparations). Porovnáním hodnot A₂₈₀ před a po navázání bylo odhadnuto, že na pryskyřici bylo navázáno 95 % čili 8,4 mg IgY.

f) Afinitní čištění toxinu A C. difficile na afinitní koloně vytvořené oxidací anti-A6 IgY jodistanem

Supernatanty kultur ze dvou dialýzních sáčků, kultivovaných způsobem popsaným v příkladu 48b, oddíl (iv) a (v), byly spojeny a objem byl pomocí zařízení Amicon centriprep zkoncentrován na asi 10,5 ml. Tento materiál byl pak nanesen na afinitní kolonu Affi-Gel s anti-A-6 IgY a několikrát sbírán a vracen na kolonu za účelem navázání co největšího množství toxinu. nenavázaný protein pak byl odstraněn promytím kolony několika objemy lože PBS a navázaný toxin A byl eluován 2 objemy lože elučního média Actisep. Látka vytékající z kolony byl uschována pro analýzu za účelem hodnocení účinnosti afinitního čištění. Toxin eluovaný pomocí Actisep pak byl dialyzován 24 až 48 h při 2 až 8 °C proti TBS a zkoncentrován pomocí zařízení Centriprep (Amicon) z 53 na 3 ml.

g) Charakterizace afinitně čištěného toxinu A C. difficile in vitro

i) Analýza proteinů

Pomocí proteinové analýzy BCA (Pierce) byla stanovena koncentrace čištěného toxinu a bylo zjištěno, že činí 70 pg/ml čili celkem asi 210 pg z 37 ml

281 • · · · • · · · • · · · • »· · · · • · · · « · • · · · · ♦ • · · · · · · • » · » ♦ · » • · · · · * supernatantu kultury, což ukazuje, že v supernatantu kultury bylo asi 5,7 pg toxinu/ml.

ii) Porovnání čistoty toxinů a retenčních časů pomocí HPLC

K porovnání jak čistoty, tak retenčních časů afinitně čištěných vzorků toxinů A byla použita analýza HPLC. Na HPLC kolonu Shodex KW 803 byly naneseny vzorky komerčního a afinitně čištěného toxinů A a byly eluovány pomocí PBS s použitím systému HPLC Waters. Retenční časy toxinů A byly pro oba vzorky toxinů přibližně 7 min, z čehož vyplývá, že toxiny jsou identické. Navíc i čistota obou toxinů byla podobná.

iii) Western blotová analýza výchozího materiálu supernatantu kultury, afinitně čištěného toxinů A a materiálu proteklého kolonou

Pro zhodnocení účinnosti afinitního čištění a pro imunochemickou identifikaci byly vzorky afinitně čištěného toxinů A, supernatantu kultury a materiálu proteklého kolonou podrobeny standardními metodami elektroforéze SDS-PAGE na 5% gelu za redukčních podmínek a přeneseny na nitrocelulózu. Blot byl dočasně obarven 10% Ponceau S k vyznačení pruhů a zbylá vazebná místa proteinů byla blokována přes noc při 2 až 8 °C roztokem PBS s obsahem 1 mg/ml sušeného mléka. Blot byl rozříznut na dvě poloviny, z nichž jedna byla inkubována s primární protilátkou anti-A6 IgY, zředěnou PBS s obsahem 1 mg/ml BSA na 1 pg/ml, a druhá s preimunním IgY, zředěným PBS/BSA na 1 pg/ml. Po 2 h inkubace v přítomnosti primární protilátky (za mírného míchání) byla odstraněna nenavázaná protilátka postupným promytím PBS, BBS-Tween a PBS. Ke každému blotu pak byl jako sekundární protilátka přidán králičí anti-kuřecí IgY konjugovaný s alkalickou fosfatasou, zředěný 1:2000 pomocí PBS s obsahem 1 mg/ml BSA. Po 2 h byly bloty promyty k odstranění nenavázané sekundární protilátky a vyvíjeny pomocí substrátové roztoku BLIP/NBT (Kirkegaard a Perry). Vyvíjení barvy bylo zastaveno zalitím blotů vodou. Výsledný westernový blot je znázorněn na obr. 51.

« ·

282

• · · ·

Pruhy 1 až 7 na obr. 51 byly jako s primární protilátkou konjugovány s anti-A-6 IgY a pruhy 8 až 15 s preimunním IgY. Pruhy 1 a 9 obsahují markéry širokého rozmezí molekulových hmotností (BioRad). Pruhy 2 a 10 obsahují supernatant kultury C. difficile č. 1. Pruhy 3 a 11 obsahují supernatant kultury C. difficile č. 2. Pruhy 4 a 12 obsahují supernatanty kultury C. difficile č. 1 a 2 (spojené). Pruhy 5 a 13 obsahují materiál proteklý kolonou, pruhy 6 a 14 obsahují afinitně čištěný toxin A (vysoká náplň, tj. 2x náplň uvedená v pruzích 7 a 15). pruhy 7 a 15 obsahují afinitně čištěný toxin A (nízká náplň). Pruh 8 neobsahuje žádný vzorek (slepý pokus).

Vzorek afinitně čištěného toxinu A (pruh 7) byl 3,5krát koncentrovanější než vzorek spojeného výchozího materiálu (pruh 4); byla však nanesena 1/3 objemu (5 μΙ oproti 15 μΙ) afinitně čištěného vzorku oproti vzorku spojeného výchozího materiálu. Byla-li z kolony získána většina toxinu A, měly by pak být hladiny toxinu A, detekované na westernových biotech, podobné. Jak je patrné z obr. 51, jsou signály, odpovídající hlavním pásům molekulové hmotnosti, srovnatelné. Zdá se tedy, že regenerace toxinu A z afinitní kolony je kvantitativní.

Příklad 48

Afinitní čištění nativního toxinu B C. difficile s použitím protilátek proti rekombinačnímu toxinu B C. difficile

Ptačí protilátky (IgY), vytvořené proti rekombinačnímu proteinu toxinu B C. difficile (pPB1750-2360; interval B-3) byly afinitně čištěny s použitím intervalu B-3 (tj. aa 1750-2360 toxinu B C. difficile) jako afinitního ligandů. Vzniklé čištěné specifické protilátky proti intervalu B-3 pak byly imobilizovány na pevném nosiči k usnadnění čištění nativního toxinu B získaného z organismů C. difficile (ATCC 43255), kultivovaných za podmínek příznivých produkci toxinu.

Tento příklad zahrnoval a) afinitní čištění ptačích protilátek zaměřených proti rekombinačnímu fragmentu toxinu B C. difficile a vytvoření afinitní kolony toxinu B C.

difficile, b) kultivaci organismů C. difficile pro produkci toxinu A a B v kapalné kultuře

283 a supernatantech kultury dialýzních sáčků, c) afinitní čištění toxinu B C. difficile a d) charakterizaci afinitně čištěného toxinu B z C. difficile in vitro a in vivo.

a) Afinitní čištění ptačích protilátek zaměřených proti rekombinačnímu fragmentu toxinu B C. difficile a vytvoření afinitní kolony toxinu B C. difficile

Protilátky, specifické pro interval B-3 proteinu toxinu B C. difficile, byly afinitně čištěny pro získání činidel pro vytvoření afinitní kolony, umožňující čištění toxinu B C. difficile z kapalných supernatantů kultur a k získání imunoanalytických činidel umožňujících detekci toxinu B C. difficile ve vzorcích supernatantů kultur a afinitně čištěného toxinu B C. difficile.

i) Afinitní čištění ani-B-3 IgY

Hyperimunní IgY byl získán z vajec obsahujících protilátky k rekombinačnímu proteinu intervalu B-3 (pPB 1750-2360),, vytvořené s použitím Gerbuho adjuvans (viz příklad 45), pomocí frakcionační metody PEG (příklad 1). Supernatant s obsahem protilátek byl nanesen na afinitní kolonu intervalu B-3, získanou kovalentním navázáním proteinu pPB1750-2360 (připraveného podle příkladu 29) na afinitní pryskyřici Actigel A (Sterogene), popsanou v příkladu 15c. Tento fragment byl vybrán z toho důvodu, že obsahuje repetiční oblast toxinu B C. difficile a neobsahuje oblasti homologie s proteinem toxinu A C. difficile, takže by vzniklá čištěná protilátka neměla křížově reagovat s toxinem A C. difficile. Protilátky proti intervalu B-3 (anti-B-3 IgY) byly z kolony eluovány pomocí 4M guanidin HCI, pH 8,0, a dialyzovány 24 až 48 h při 2 až 8 °C proti PBS.

ii) Navázání afinitně čištěného anti-B-3 IgY na aktivovanou afinitní pryskyřici pro získání afinitní kolony toxinu B C. difficile

Afinitní kolona toxinu B C. difficile byla získána navázáním 11 mg afinitně čištěných ptačích anti-B-3 protilátek, připravených výše uvedeným způsobem, na 5 ml afinitní pryskyřice Actigel (Sterogene). Místo minimálně 2 h, doporučovaných

284 • · · • · · · · • · · · • · · · výrobcem, byla použita doba navázání 30 min, aby byl minimalizován počet míst, kde je na pryskyřici navázána každá molekula protilátky, aby byla protilátka vůči toxinu více přístupná. Kromě toho byla kolona vystavena pouze působení vysoce solných pufrů nebo elučnímu pufru Actisep (Sterogene): během přípravy kolony nebyly použity žádné roztoky guanidinu, aby byla minimalizována denaturace protilátek antiB-3. Porovnáním hodnot absorbance IgY při 289 nm před a po navázání bylo zjištěno, že na pryskyřici bylo navázáno podle odhadu přibližně 62 % či asi 6,8 mg anti-B-3 IgY.

b) Kultivace organismů C. difficile pro produkci toxinů A a B v kapalné kultuře a supernatantech kultury dialýzních sáčků

i) Kapalná kultura C. difficile v médiu BHI

Zmrazená zásobní lahvička C. difficile (ATCC 43255) byla rozmražena, nanesena na plotny CCFA (BBL) a pěstována v anaerobní komoře 36 až 48 h při 37 °C. Sklizené kolonie byly použity k inokulaci 20 ml kapalné kultury média BHI (BBL). Tato kultura byla pěstována přibližně 24 h při 37 °C v anaerobní nádobě. 10 ml této kultury bylo použito k inokulaci 500 ml kapalné kultury média BHI a kultura byla pěstována přibližně 72 h při 37 °C v anaerobní komoře.

ii) Sklizeň supernatantu kapalné kultury

Kultura po 72 h byla odstředěna po dobu 10 min při 5000 min'¹ (4420 g) v odstředivce Beckman J2-21 za účelem peletizace organismů C. difficile a supernatant byl přefiltrován přes filtr 0,45 pm (Nalgene) a uschován při 2 až 8 °C pro čištění toxinu a analýzu.

iii) Analýza supernatantu kultury in vitro pro detekci přítomnosti toxinu B C. difficile

Za účelem stanovení, zde je v supernatantu kultury přítomen toxin B C. difficile, byl supernatant následujícím způsobem analyzován pomocí nativního PAGE

285 • · • ·

a westernového blottingu. Sklizený supernatant kultury byl před elektroforézou na nativních gelech PAGE asi 10křát zkoncentrován pomocí zařízení Centricon 30 (Amicon). Koncentrovaný vzorek byl smíchán se stejným objemem vzorkového pufru nativního gelu (50% sacharóza, 0,1 % bromfenolové modři) a nanesen na gel s gradientem 4 až 15 % Tris-glycin (Bio-Rad) spolu se známým vzorkem toxinu B C. difficile, zakoupeným od Techlab. Vzorky byly podrobeny elektroforéze po dobu 3 h při konstantním napětí 150 V s použitím zdroje napětí Hoefer. Po elektroforéze byl gel rozříznut na poloviny a jedna polovina byla obarvena Coomassieovou modři a pro visualizaci proteinových pásů odbarvena roztokem obsahujícím 10 % ledové kyseliny octové a 40 % methanolu. druhá polovina gelu byla podobena blottingu a sondována s použitím afinitně čištěné anti-B-3 protilátky (viz odstavec (i)).

Gel obarvený Coomassieovou modří je znázorněn na obr. 52. Pruh 1 na obr. 52 obsahuje markéry širokého rozmezí molekulové hmotnosti. Pruh 2 obsahuje komerční toxin B (Techlab); pruh 3 obsahuje médium BHI; pruh 4 obsahuje supernatant kultury a pruh 5 obsahuje koncentrovaný supernatant kultury.

Jak je z obr. 52 zřejmé, byl komerční toxin B detekovatelný na gelu, barveném Coomassieovou modří. Koncentrovaný supernatant kultury vykazoval několik relativně slabých pásů, avšak žádné detekovatelné proteiny ve vzorcích supernatantu nemigrovaly spolu se známým vzorkem toxinu B C. difficile. Navíc nebyly v supernatantu kultury detekovány westernovým blotem žádné proteiny, které jsou rozpoznávány afinitně čištěnou protilátkou anti-B-3. Z těchto výsledků vyplývá, že výše uvedené podmínky růstu nejsou optimální pro produkci toxinu.

iv) Produkce toxinu B C. difficile v kultuře dialýzních sáčků

Pro identifikaci optimálních růstových podmínek pro produkci toxinu B C. difficile byl proveden následující experiment. Výše popsaným způsobem byla přes noc pěstována kapalná kultura C. difficile 43255. Tato kultura byla použita k inokulaci velkoobjemových kultur, pěstovaných v dialýzních sáčcích s obsahem PBS a ponořených v médiu BHI, podle Meadora a Twetena [Infection and Immunity, 56:7 (1988). Stručně řečeno bylo do dvou kultivačních lahví se širokým hrdlem o objemu 500 ml vloženo 400 ml média BHI. Dialýzní sáček s řezem molekulové hmotnosti

286 • · • ·

12000-14000 (Spectrapor), obsahující 25 ml PBS byla na obou koncích zavázán a ponořen do média BHI v každé 500ml láhvi. Láhve s dialýzními sáčky pak byly 30 min autoklávovány za účelem sterilizace média a PBS. Poté byly láhve inkubovány 1 h při 37 °C za anaerobních podmínek k ochlazení kapalin a odstranění kyslíku z média.

PBS v každém dialýzním sáčku pak bylo inokulováno 10 ml kultury, získané přes noc, s použitím injekční stříkačky 10 ml, opatřené jehlou o velikosti 27, kterou byly sáčky propíchnuty nad hladinou média. Láhve pak byly inkubovány 48 až 72 za anaerobních podmínek při 37 °C. Obě láhve vykazovaly masivní růst uvnitř dialýzních sáčků, jedna z lahví však vykazovala i zákal v médiu BHI mimo dialýzní sáček, což ukazuje na to, že BHI bylo kontaminováno. Obsah obou dialýzních sáčků byl proto uchováván odděleně do doby, než bylo možno jej odděleně analyzovat. Mělo se za to, že růst BHI v kontaminovaném sáčku nastal vlivem C. difficile, které mohlo spadnout z jehly během inokulace diaiýzního sáčku.

v) Sklizeň supernatantů kultur dialýzních sáčků

Obsah dialýzních sáčků byl odebrán, buňky byly peletovány odstředěním při 5000 min'¹ (3440x g) pro dobu 10 min a supernatanty kultur dialýzních sáčků byly manipulovány odděleně: každý byl přefiltrován přes filtr 0,45 pm a zkoncentrován pomocí koncentrátoru Centriprep 30 (Amicon). Oba vzorky byly zkoncentrovány z 35 na 3 ml a uchovávány při 2 až 8 °C.

Supernatanty kapalných kultur z dialýzních sáčků byly analyzovány pomocí nativního PAGE a westernového biotu za účelem zjištění množství toxinu B, produkovaného v supernatantech kultur dialýzních sáčků.

vi) Analýza supernatantů dialýzních kultur C. difficile pomocí nativní PAGE/Western blot

Způsobem popsaným výše v části (iii) byly alikvoty koncentrovaných supernatantů kultur dialýzních sáčků a známý vzorek toxinu B C. difficile podrobeny elektroforéze na 4-15% gelu s tris-glycinem (Βίο-Rad). Jedna polovina gelu byla

287

obarvena Coomassieovou modří a druhá polovina byla přenesena na nitrocelulózovou membránu pro analýzu westernovým blotem s použitím zařízení pro přenos za polosuchá (Millipore) a standardních podmínek přenosu (12 V, konstantní napětí po dobu 30 min). Zbylá vazebná místa proteinů na membráně byla přes noc blokována v PBS s obsahem 1 mg/ml sušeného mléka.

Obr. 53 znázorňuje výsledný gel, obarvený Coomassieovou modří, a westernový blot. Pruhy 1 až 4 na obr. 53 představují bloty, obarvené Coomassieovou modří, a pruhy 6 až 9 představují westernový blot. Pruhy 1 a 6 obsahují markéry v širokém rozmezí molekulových hmotností; pruhy 2 a 7 obsahují komerční toxin B (Techlab); pruhy 3 a 8 obsahují supernatant kultury dialýzních sáčků z kultury se sterilním médiem BHI; pruhy 4 a 9 obsahují supernatant kultury dialýzních sáčků s '.kontaminovaným“ médiem BHI; pruh 5 je slepý.

Z obr. 53 je zřejmé, že přítomnost toxinů B C. difficile byla detekována inkubací pásů blotu s afinitně čištěným anti-B-3 IgY. Po promytí blotů k odstranění nenavázaných protilátek anti-B-3 byly detekovány navázané protilátky anti-B-3 inkubací pásů se sekundární protilátkou, zahrnující králičí anti-kuřecí Ig, konjugovaný s alkalickou fosfatasou (Sigma). Bloty byly opět promyty k odstranění veškeré nenavázané sekundární protilátky a bloty byly vyvíjeny v čerstvě připraveném roztoku substrátu BLIP/NBT. Vyvíjení bylo zastaveno přelití blotů vodou, jakmile byl získán adekvátní signál.

Výsledky PAGE a westernové analýzy ukázaly, že množství toxinů B, přítomné ve vzorcích supernatantu dialýzních sáčků, bylo příliš zředěné, aby mohlo být detekováno barvením pomocí Coomassieovy modři. Oba vzorky supernatantů kultur (jeden z láhve se sterilním médiem BHI a jeden z láhve s kontaminovaným médiem BHI) obsahovaly imunoreaktivní toxin B, byly-li analyzovány westernovým blottingem. Jediný pozorovaný rozdíl mezi oběma vzorky supernatantů kultur se zdál být v množství produkovaného toxinů B. Zdálo se, že vzorek se sterilním médiem obsahuje více toxinů B než vzorek s kontaminovaným médiem.

Porovnání vzorku komerčního toxinů B s toxinem produkovaným ve vzorcích supernatantů kultur dialýzních sáčků ukázalo, že vzorek supernatantu kultury obsahuje vyšší procento intaktního proteinu toxinů B (tj. je zde mnohem méně

288

důkazů degradace ve formě menších imunoreaktivních pásů, přítomných ve vzorcích supernatantů kultur). Protože oba vzorky supernatantů kultur obsahovaly toxin B (i když v různých koncentracích), byly před afinitním čištěním spojeny.

c) Afinitní čištění toxinu B C. difficile

Vzorky supernatantů kultur dialýzních sáčků byly spojeny a naneseny na afinitní kolonu toxinu B [připravenou podle odstavce (a)]. Nespecifické proteiny byly odstraněny promytím kolony pomocí PBS do dosažení základní hodnoty OD. Navázaný protein byl eluován elučním médiem Actisep (Sterogene) a pak dialyzován proti fyziologickém roztoku sTris pufrem, pH 7,5 (50 mM Tris, 150 mM NaCl). Po dialýze byl afinitně čištěný protein zkoncentrován ze 40 na 4,5 ml pomocí koncentrátoru Centricon 30 (Amicon).

d) Charakterizace afinitně čištěného toxinu B z C. difficile in vitro a in vivo

Pro zjištění přítomnosti nebo nepřítomnosti toxinu B C. difficile ve vzorku eluovaném pomocí Actisep a v kapalině vytékající z afinitní kolony (tj. průtoku) byly tyto vzorky analyzovány nativním PAGE a Westernovým blottingem spolu s výchozím materiálem supernatantu kultury. Analýzy byly prováděny pro zjištění relativního množství toxinu B C. difficile v supernatantu kultury a účinnosti afinitního čištění.

Vzorky toxinu B C. difficile z afinitního čištění, supernatantu kultury, průtoku kolony a komerčního toxinu B C. difficile byly vždy smíseny se stejným objemem nativního vzorkového pufru a naneseny na nativní gel a gradientem 4 až 15 % Trisglycinu (Bio-Rad). Vzorky byly podrobeny elektroforéze po dobu přibližně 2,5 h při konstantním napětí 200 V s použitím zdroje napětí Hoefer a přeneseny na nitrocelulózu pomocí blottingového zařízení za polosuchá (Millipore) podle pokynů výrobce. Blot byl blokován přes noc pomocí roztoku obsahujícího 1 % sušeného mléka v PBS. Pak byl blot inkubován s afinitně čištěným anti-B-3 IgY jako primární protilátkou a s králičím anti-kuřecím konjugátem s alkalickou fosfatasou jako sekundární protilátkou. Bloty byly zpracovány postupem uvedeným v odstavci b(vi), umožňujícím visualizaci proteinu toxinu B C. difficile.

289 ·· • ·

Obr. 54 znázorňuje gel, obarvený Coomassieovou modří, a odpovídající westernové bloty. Pruhy 1 až 3 na obr. 54 byly obarveny Coomassieovou modří; pruhy 5 až 10 byly sondovány s anti-B-3 IgY a pruhy 8 až 10 byly sondovány s preimunním IgY. Pruhy 1, 5 a 8 obsahují afinitně čištěný toxin B; pruhy 2, 6 a 9 obsahují průtok kolony; pruhy 3, 7 a 10 obsahují komerční toxin B (Techlab). Pruh 4 neobsahuje žádný protein (slepý).

Analýzou westernovým blottingem byly získány následující výsledky. Všechny tři vzorky (supernatant kultury, eluovaný protein a průtok) obsahovaly imunoreaktivní toxin b. Tyto výsledky naznačují, že postup afinitního čištění byl úspěšný při čištěni určitého množství toxinu B. Protože však bylo zjištěno, že proteklá frakce obsahuje významná množství toxinu B, bylo zkoumáno, zda jsou další modifikace schopny dále optimalizovat proces čištění (například navázání B-3 IgY na hydrazidový nosič Affigel (BioRad) oxidací IgY jodistanem).

ii) Výtěžek afinitně čištěného toxinu B C. difficile

Výtěžek afinitně čištěného toxinu B C. difficile byl stanoven proteinovou analýzou BCA (Pierce) s použitím BSA jako proteinového standardu. Tato analýza ukázala, že koncentrace toxinu B je 73 pg/ml x 4,5 ml (objem afinitně čištěného materiálu) = 365 pg toxinu B. Jako výchozí materiál bylo použito přibližně 70 ml supernatantu kultury dialýzních sáčků; na mililitr kultury tedy bylo získáno asi 5 pg toxinu B. Tento výtěžek byl konzistentní s dříve uváděnými výtěžky při použití této metody kultivace C. difficile [7,8 pg toxinu B/ml supernatantu kultury; Meador a Tweten (1988), viz výše].

iii) Měření aktivity afinitně čištěného toxinu B C. difficile in vivo

Aktivita afinitně čištěného toxinu B C. difficile in vivo byla stanovena tak, že různá množství čištěného preparátu toxinu B (dále popsaného) byla injekčně vpravena do samic syrských křečků o hmotnosti 30 až 40 g. Jiné skupině křečků bylo injekčně aplikováno různé množství komerčního preparátu toxinu B (TechLabs) pro srovnání s dříve získanými výsledky. Bylo zjištěno, že LD₁₀₀ preparátu toxinu B C.

290 • 9 9·· 9 · 9 9 999

99 9 · 9 9 9 9 9999 9

9999 99 9 999

99 99 999 99 99 difficile TechLabs je asi 5 pg na 30 až 40g křečka, podává-li se I.P. (příklad 19). Při této koncentraci (5 pg/30-40g křeček) křečci uhynuli do asi 3 h po injekci.

Koncentrace LD₁₀₀ afinitně čištěného toxinu B byla stanovena I.P. injekcí 1 ml roztoku obsahujícího buď 5 nebo 50 pg afinitně čištěného toxinu B, zředěného fyziologickým roztokem. Dvěma 30 až 40g křečkům byla injekčně aplikována každá koncentrace afinitně čištěného toxinu B. Křečci, kteří dostali 50 pg afinitně čištěného materiálu, uhynuli během 2 h; křečci, kteří dostali 5 pg afinitně čištěného toxinu B, uhynuli během 4 h. Tyto výsledky demonstrují, že toxicita preparátu afinitně čištěného toxinu B C. difficile je srovnatelná s komerčně dostupným toxinem B C. difficile.

Příklad 49

Diagnostický aglutinační test pro detekci toxinu A a toxinu B C. difficile

V tomto příkladu byl vyvinut rychlý aglutinační test, určený pro detekci toxinu A a toxinu B C. difficile buď v supernatantech kultur nebo biologických vzorcích, jako je stolice. Afinitně čištěné protilátky proti rekombinačnímu toxinu A a toxinu B ze slepic byly použity k pasivnímu pokrytí malých polystyrénových částic. Částice potažené specifickými ptačími protilátkami (IgY) k toxinu A a toxinu B by měly při smísení se vzorkem obsahujícím tyto toxiny v principu tvořit viditelné agregáty. Tento formát by měl poskytnout specifický, citlivý a rychlý test. Afinitně čištěný IgY v tomto případě dodává specificitu a citlivost vůči toxinu C. difficile, zatímco snadnost použití a rychlost testu je způsobena použitím formátu aglutinačního testu. Tento příklad popisuje: a) počáteční vývoj aglutinačního testu pro detekci toxinu A a toxinu B C. difficile a b) hodnocení a optimalizaci aglutinačního testu.

a) Vývoj aglutinačního testu pro detekci toxinu A a toxinu B C. difficile

Protilátky bylý vytvořeny ve slepicích pomocí rekombinantu toxinu A (pMAL 1870-2680) a rekombinantu toxinu B (pPB1750-2360) s použitím Freundova

291 • · · ·· · · · · ··· • · · · · · · · · ··· · · ····«·· ··· • · ·· ·· ·· · · * ·· adjuvans, jak je popsáno v předchozích příkladech. Protilátky proti rekombinantu toxinu A (A-6 IgY) a protilátky proti rekombinantu toxinu B (B-3 IgY) byly frakcionovány pomocí PEG a pak afinitně čištěny, jak je popsáno v příkladu 15c. A-6 IgY byl afinitně čištěn proti pPA1870-2680 a B-3 IgY byl afinitně čištěn proti pB17502369. Afinitně čištěné protilátky pak byly pasivně naneseny na polystyrénové částice.

Pro každý nanášený preparát IgY byl odebráno 100 μΙ 5% suspenze kuliček o velikosti 1 pm (Spherotech lne., Libertyville, IL) a 2 min odstřeďováno při 14000x g v mikrofuze Beckman za účelem peletizace částic. Částice pak byly promyty TBS (10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8), PBS-Tween (10 mM fosfátu sodného, 150 mM NaCl,, pH 7,2 + 0,05 % Tween 20) a TBS. Po každém promytí byly částice 2 min odstřeďovány a promývací pufr byly kanalizován. Po posledním promytí TBS byly částice resuspendovány v 1 ml povlékacího roztoku protilátek: afinitně čištěného ptačího A-6 nebo B-3 IgY v koncentraci 100 pg/ml v TBS. Stejným způsobem byl povlečen i PEG-frakcionovaný preimunní IgY, který sloužil při aglutinačních testech jako negativní kontrola. Suspenze částic pak byly ponechány 18 až 24 h při teplotě místnosti v převrácené poloze, aby došlo k dokonalému nanesení IgY.

Pro odstranění nenavázané protilátky byly suspenze 2 min odstřeďovány, roztok protilátky byl kanalizován a částice byly promyty stejným způsobem jako dříve (TBS, PBS-Tween, TBS). Po posledním promytí TBS byly částice, povlečené IgY, resuspendovány ve 200 μΙ TBS, čímž se získala 2,5% suspenze částic.

Pro důkaz, že byly částice povlečeny IgY, bylo 10 μΙ částic inkubováno v jamkách s 5 μΙ neředěného kozího anti-kuřecího IgG (Fisher Biotech). Vzorky pak byly hodnoceny na makroskopickou aglutinaci. Částice, které nebyly povlečeny IgY, nevykázaly při tomto postupu žádnou aglutinaci.

Pro důkaz proveditelnosti při použití afinitně čištěného polyklonálního IgY v tomto typu testu byla hodnocena schopnost částic, povlečených A-6 IgY, aglutinovat v přítomnosti různých koncentrací toxinu A.

Komerční toxin A (Tech labs) byl 10křát sériově ředěn z výchozí koncentrace 0,29 mg/ml s použitím PBS s obsahem 1 mg/ml BSA jako ředidla. 10 μΙ každého ředěni bylo na sklíčku s vyhloubenou jamkou rozmícháno s 10 μΙ povlečených kuliček

292 ·· ·» a směs byla inkubována 20 min při 37 °C. Sklíčka pak byla makroskopicky analyzována z hlediska aglutinace.

Silná aglutinace byla pozorována při ředění 1:10 a 1:100 a slabá při ředění 1:1000. Ředění větší než 1:1000 nevykazovala žádnou aglutinaci. Částice povlečené preimunním preparátem neaglutinovaly při žádném testovaném ředění. Ředění toxinu A 1:100 mělo koncentraci 2,9 pg/ml. 10 μΙ tohoto ředění 2,9 μg/ml obsahuje 29 ng toxinu A, test je tedy citlivý na 29 ng toxinu A, čili 2,9 μg/ml. Zdá se, že formát tohoto aglutinačního testu je vhodný pro detekci toxinů A a B C. difficile.

K povlékání částic byly nejběžněji používány afinitně čištěné polyklonální ptačí protilátky, ale bylo zkoumáno i použití PEG-frakcionovaných a vodou ředěných preparátů IgY za účelem zjištění, zda je možno zvýšit citlivost aglutinačního testu použitím polyklonálních protilátek, které by mohly obsahoval populaci vysoce afinních protilátek ztracených během afinitního čištění.

PEG-frakcionovaný A2 IgY byl použit k povlečení 1 μιη polystyrénových částic za stejných podmínek, jaké jsou popsány výše, a částice byly hodnoceny na citlivost v aglutinačním testu toxinu A C. difficile. Tyto částice byly méně citlivé než částice povlečené afinitně čištěným IgY.

Pro prozkoumání možnosti, že by zbytkový PEG v PEG-frakcionovaném IgY mohl inhibovat aglutinaci částic během testu, byl A-2 IgY extrahován metodou ředění okyselenou vodou, popsanou vAkita a Nakai [J. of Food Science, 57:629 (1992)]. Vodou ředěným IgY pak byly povlékány polystyrénové částice za stejných podmínek, jaké jsou popsány výše, a byla hodnocena citlivost Částic v aglutinačním testu toxinu A C. difficile.

Bylo zjištěno, že částice, povlečené vodou ředěnými preparáty IgY, jsou méně citlivé než částice povlečené afinitně čištěným IgY. Zdá se tedy, že při tomto formátu testu více vyhovuje afinitně čištěný IgY než šaržově frakcionované preparáty IgY. Pro zvýšení citlivosti a uchování specificity aglutinačních testů jsme dále hodnotili vliv různých dalších proměnných na průběh testu.

293

·· ·· • » · · • 9 ·· ··· · ·

9 9 ·· ·· ·· • · · • · ··· • · · · • * · · ·· ··

b) Hodnocení a optimalizace aglutinačního testu toxinu A a toxinu B C. difficile

Kuličky povlečené A-6 a B-3 IgY byly hodnoceny z hlediska schopnosti aglutinace s nejmenším množstvím toxinu (tj. citlivosti) a specificity. Místo PEGfrakcionovaného preimunního IgY byl jako negativní kontrola k povlečení částic použit afinitně čištěný IgY proti irelevantnímu antigenu, jedu hada C. atrox. Bylo provedeno sériové ředění toxinu A a toxinu B v PBS z 1 pg/ml na 0,1 ng/ml. 10 μΙ suspenze kuliček bylo v jamkách skleněných aglutinačních destiček smíseno s 20 μ! vzorku a po dobu 2 min podrobeno rotaci na nutátoru (Lab Quake) nebo ručně. Aglutinace byla zjišťována po 2 min. Zcela rovnoměrná suspenze byla označena jako mírně zrnitý vzhled byl označen „±“ a zřetelná aglutinace byla hodnocena jako „+“ nebo „++“ podle velikosti agregátů.

Byly hodnoceny různé parametry, které ovlivňují citlivost a/nebo specificitu testu, jako je velikost kuliček, koncentrace povlékací protilátky, teplota reakce, pH povlékacího pufru, protilátky vytvořené s použitím různých adjuvans, konečná hustota kuliček (% w/v) a ředidla vzorků. Původně byly hodnoceny čtyři různé velikosti kuliček 0,39 pm, 0,81 pm, 1 pm a 1,2 pm. Kuličky 1 pm aglutinovaly velmi rychle a tvořily velké agregáty téměř bez nespecifické aglutinace. Proto byla pro další optimalizační studie zvolena velikost kuliček 1 pm. Vzorky byly původně ředěny v PBS. Jestliže kuličky v PBS autoaglutinovaly, bylo použito PBS s 1 mg/ml BSA nebo PBS s 0,01 % Tween-20. Obě tato ředidla bránila autoaglutinaci, ale PBS s Tween-20 také inhibovalo specifický signál. Jak ředidla byla hodnocena různá jiná blokující činidla, jako je sacharóza, BSA ve vyšší koncentraci a želatina. Bylo zjištěno, že PBS s obsahem 1 mg/ml BSA optimálně brání autoaglutinaci bez inhibice specifického signálu.

Byla hodnocena rovněž hustota kuliček v konečné suspenzi. Za účelem zlepšení citlivosti a specificity byla testována aglutinabilita latexových částic, povlečených A-6 nebo B-3 IgY, v suspenzích 2,5 %, 1,25 % a 0,2 %. Všechny suspenze kuliček kromě 2,5% neposkytovaly téměř žádný signál. Protilátky vytvořené s použitím různých adjuvans mají různé avidity a afinity, a tudíž různě aglutinují. Bylo známo, že protilátky s vyšší aviditou a afinitou tvoří velké a jednotlivé agregáty. A-6 a B-3 IgY, vytvořené s použitím adjuvans Freund a Gerbu, byly hodnoceny z hlediska

294 • · aglutinability při nejnižší koncentraci toxinů. Bylo zjištěno, že protilátky vytvořené s použitím Gerbuho adjuvans poskytují odlišené a velké agregáty při 10křát nižších koncentracích toxinů A a toxinů B v porovnání s protilátkami vytvořenými pomocí Freundova adjuvans.

Byl rovněž testován vliv koncentrace protilátky/mg kuliček při nižší nebo vyšší inkubační teplotě. Polystyrénové částice byly povlečeny 20 pg IgY nebo 50 pg IgY/mg kuliček a inkubovány při teplotě místnosti, 37 °C nebo 56 °C. Existovala přímá korelace mezi vyšší koncentrací povlékací protilátky a vyšší teplotou vzhledem ke zvýšení citlivosti. Bylo však zjištěno, že povlékání částic při vyšší teplotě vede rovněž ke zvýšení nespecifického signálu. Pro optimalizaci maximální citlivosti a specificity byly hodnoceny pufry s nízkým pH a s vysokým pH. Poylstyrenové částice, povlékané v 50 mM acetát sodný, 150 mM chlorid sodný, pH 5,5 (pufr s nízkým pH), aglutinovaly nespecificky, zatímco u kuliček povlékaných s použitím 50 mM uhličitanu sodného, pH 9,5 (pufr s vysokým pH), pufr zvyšoval citlivost a specificitu pro částice povlečené A-6 IgY, ale nikoli pro částice povlečené B-3 IgY. Citlivost a specificita částic, senzitizovaných A-6 nebo B-3 IgY, s použitím různých metod, je shrnuta v tabulce 50.

295 • ·

Shrnutí výsledků

s

1

1

+ +

i +

l +

+ +

+

Uj

«r

o

>Q

tc

Ή

o

_o

1

l

+

|

|

+

+

tí

O Q. CO

o V)

+

+

>

__

o

. O

ΰ r§ cz) tí (1)

00 k. M

1

1

+

1

1

1 +

1 +

(Λ

—

> 00

*00

1

+ 1

+ +

1

1

1 +

1 +

>

c

ro

‘C

ffl

(ZI

O CO

o -S — to

+

+ +

+ +

1

1

1 +

+ 1

c

o ε

+

«

a

+ 1

— 'oo

+

+

c

+

+ 1

+

+

c

-«·» c

c

·»» ř

+

+

+

+

+

+

A

+

/0

+

+

+

+

+

+

υ

Uj

EC

ΰ v cx

<D

co

O

+

+

+

+

+

+

+

+

+

ití

+

+

+

+

+

+

+

+

+

• p

>O

(Λ

.3

JS ·. O

'<U

CO i-

tí cd > O N

SJ

1

I

1

1

1

1

1

1

1

X

£

E

tí

66

<1>

c

CZ)

>

00

Λ

Ό

>

o Z

1

+

+

1

|

J

+ 1

*<

(Λ

CO

c

c

ftj

co

o 1 M

+ 1

-4- 4-

+

+ +

1

+ +

+ 1

+

+ +

c

·♦·

+

+

+

+

+ 1

+ 1

+

+

+

+

o -B

+

+

+

+

+

+

+

+

+

o oo — c

s“—\

co

co

co“

co“

co

co

l··

co“

co“

3 i

p

3 if

3 i

u

3 r— ip

3 H.u =L'r-

iliček amoto

iliček amoto

3 ip:

£* _ o 2· ~v

3 ř— iP

m t- í

P

|

p

o: i

~ Oí ís

Ě

co **» O

,E

oí d

— ro Ě-š

á ε a oo>

5 E a op >

~ eí — ri -5 ES «

O vo - - ^-5 ε = «,

— Oí ε

Ě

eC o

OO 3.

wo

00 wo xr-~

OO 3.

wo, P

oo 3.

wo r*“

~Cft “U

E to

eówo o * r* v

“ o ® β *

ώ «η =*· Κ-

oO 3.

wo r-í”

CL

O O

X

o o X

O O

X

O wo

X

o _ wo a-

O » . ‘

o n

® X »

O -F- o X

O O

X

o.

— CL

cl

Γ4

CL

(N CL

ro O

ro O

—

— H J3

— CL

CL

<

3

J

□

3

XÍ

Ό

X

•“Ί

296 ·· *· » · · > · · · · • · · · « • · 4 «· ··

			t		+	+
			1		+	+
			1		ť	+
			t		+	+
			+ 1		+ +	+ +
<0	Γ3		+	ee c	+ T	T
+ 1	+ +	ί	1	+ +	+	+
+ 1	+ +	1	1	+ +	+ +	+ +
1	1	1	1	+	1	1
	i	'	1	1	+	l
+ 1	+ 1	1	+	+ +	4- •ř	+ +
+ +	4· +	4-	+ +	+ +	+ +	+ +
+ +	Μ- Η»	+ 4-	+ +	Μ- Η·	+ +	+ +
co P H 5P . CZ E* ep <n ® I i~m a.	Z—' H Cxí Lu -3* E * 'Sb ~ o n Jí CM Σ	z“\ H S t. 1 ví n a CM A 2	P - Sř O ó U i*?- — O\ -r I ε CL Λ O Mv» a CM O	.č o cl. 2?oo o χ i ΐ ip ec - U o * 'n o Lu CM & C-	2 c. £ rL ='P c a ut ® «d. (Ν θ'	R. stejně jako Q, ale po překrytí w/BSA

>N

O

P ffi

P

O

N

O

L-l o

cd '<U

T o

P λΓ <υ >o

P4

4-»

CO

O >

<r-l

Λί

	Ό
Ξ	Τ
'Cd	ο
	Ρ
'<U	CJ
O P	C <υ X! ><υ
’>£
P	cd
4—<
	Ο
oo HH	3 <υ
OJ	4-»
o cd h	U3 β cd
c	>
<υ o	• ·—*Ί
q	πζ)
o	cd
P4
Λί
<υ

β ε

τ3

Ο

η.

ί ><υ >

(Λ >>

>

^4 cd >οο >

cd

Ο

CM

Η χ° ο^·

Ο, θ' +

<

CQ +

PQ

Ρ >5-.

ε όί)

G >Ui

Ρ «υ ο

cd

C

ΟΌ cd 'Cd tí

Π3 'cd >Ν

JD

GJ >Lm

CZ)

Ο cd

Ρ

ČJO cd

Ό ο

’3 ο

Ρ

CO <υ

Ρ

C cd >

Ρ

3* cd cd >

Ο 'Ο

Ρ

Ρ «υ

L4 ρ

co

G cd >

□ cd

Ο

-Ρ

Ο >Ν

Ρ

Ο

Ρ

C/5 cd <υ >1-4 cd α

'cd >

Ο

Ο tí <υ

Ρ >»

Ρ

Ρ

Ό >

Ο

L4 cd

ΟΌ cd

Ν cd α

Ό <υ >οο <υ ο

α 1) >J—I ο

4-»

1/3 cd

Ο <υ

Οΰ >Ν □

Ο

Ρ οο ρ

'3 >

>Λ >

>

1—4 χι ο

Ό

Μ <υ ε

jo ο

Pa §

Κ)

Stolice^M 50 mg myší stolice bylo suspendováno v 500 μΐ ředidla, rozmícháno a odstřeďováno 2 min při 14000x g; supernatant byl použit při testu

297 • ·

Na základě informací z různých testovaných parametrů byly navrženy následující postupy povlékání kuliček pomocí A-6 a B-3 IgY:

i) Částice povlečené A-6 IgY pro detekci toxinu A přímo ze stolice lidských pacientů mg polystyrénových částic (1 pm, Spherotech lne., Libertyville, IL) bylo vloženo do zkumavky a promyto 1 ml TBS, PBS-T a TBS s dalším promytím pufrem 50 mM Na₂CO₃, pH 9,5. V posledně uvedeném pufru byly kuličky resuspendovány do konečného objemu 1 ml. Ke kuličkám byl přidán A-6 IgY (afinitně čištěný, vytvořený pomocí Gerbu) do konečné koncentrace 250 pg/ml a byla provedena inkubace přes noc při teplotě místnosti na nutátoru. Příští den byly IgY-sensibilizované částice promyty TBS, PBS-T a TBS a resuspendovány v TBS do konečné koncentrace 2,5 %. Tyto IgY-sensibilizované částice byly do použití skladovány při 4 °C.

ii) Latexové částice, povlečené B-3, pro detekci toxinu B přímo ze stolice lidských pacientů mg polystyrénových částic (1 pm, Spherotech lne., Libertyville, IL) bylo vloženo do zkumavky a promyto 1 ml TBS, PBS-T a TBS s dalším promytím pufrem 50 mM Na₂CO₃, pH 9,5. V posledně uvedeném pufru byly kuličky resuspendovány do celkového objemu 1 ml. Ke kuličkám byl přidán B-3 IgY (afinitně čištěný, vytvořený pomocí Gerbu) do konečné koncentrace 100 pg/ml a inkubován přes noc při teplotě místnosti na nutátoru. Příští den byly IgY-sensibilizované latexové částice promyty TBS, PBS-T a TBS a byly resuspendovány v TBS do konečné koncentrace 2,5 %. Tyto IgY-sensibilizované latexové částice byly do použití skladovány při 4 °C.

Aglutinační test pro detekci toxinu A a B ze stolice byl porovnán s komerčně dostupnými testy pro detekci toxinu A a toxinu B ze vzorků lidské stolice. Pro srovnání byly použity produkty Cyclotone™ A+B EIA (Cambridge Biotech), který detekuje oba toxiny A a B, a Premier™ C. difficile Toxin A Test (Meridian Diagnostics lne.), který detekuje pouze toxin A. Vzorky přírodní lidské stolice byly zpracovány podle pokynů každého výrobce. Ke vzorkům stolice bylo přidáno 1 pg/ml toxinu A

298 • · • · » · » · * · · nebo toxinu B a bylo provedeno sériové 10násobné ředění na 0,01 ng/ml toxinu A a 0,1 ng/ml toxinu B. Pro aglutinační testy byla stolice ředěna 5násobně pomocí PBS s obsahem 1 mg/ml BSA a odstřeďována 3 min při 2500x g. Supernatant pak byl použit v testu.

Analýzy EIA byly prováděny podle pokynů výrobce a výsledky byly odečítány spektrofotometricky. Interpretace výsledků byla prováděna na základě hodnot optické hustoty a doporučení výrobce. Pro aglutinační test bylo do jamek skleněných aglutinačních destiček vloženo 10 μΙ suspenze částic sensibilizovaných A-6, B-3 IgY nebo nespecifickým IgY. Do každé jamky bylo přidáno 20 μΙ vzorku, dobře promícháno a podrobeno otáčení na nutátoru. Aglutinace byla odečítána visuálně po 2 min otáčení. Interpretace výsledků byla provedena výše zmíněným způsobem. Shrnutí výsledků je uvedeno v tabulce 51. Aglutinačním testem podle vynálezu byl detekován toxin A v koncentraci 1 ng/ml, zatímco jak v případě Cyclotone™ A+B EIA, tak Premier™ C. difficile toxin A test byly toxiny detekovány v 10křát nižší hladině. Toxin B byl detekován v koncentraci 1 ng/ml jak při aglutinačním testu, tak pomocí Cyclotone A+B EIA. Tyto výsledky ukazují, že aglutinační test podle vynálezu je jednoduchý, snadno proveditelný a velmi rychlý, protože výsledky je možno získat během 5 min.

299

Tabulka 51. Porovnání tří různých metod detekce toxinu A a toxinu B přidaného ke vzorkům normální lidské stolice

parametr	Cyclotone™ A+B EIA Cambridge Biotech	Premier™ C. difficile toxin A test Meridian Diagnostic	aglutinační test na toxin A & B Ophidian Pharmaceuticals
stolice s přídavkem toxinu A
100 ng/ml	++	++	++
10 ng/ml	++	++	++
1 ng/ml	++	++	+
0,1 ng/ml	+	++	-
0,01 ng/ml	-	ND	ND
stolice s přídavkem toxinu B
100 ng/ml	++	N/A	++
10 ng/ml	++		++
1 ng/ml	+		+
0,1 ng/ml	-		-
celková doba	150 min	150 min	5 min

ND nestanoveno

N/A nehodící se

Příklad 50

Charakterizace křečků po úspěšném ošetření ptačími protilátkami, zaměřenými proti rekombinačním proteinům toxinu A a toxinu B C. difficile

Za účelem zjištění, proč křečci, ošetření před nebo po expozici C. difficile IgY zaměřenými proti rekombinačnímu toxinu A (A-6 IgY) a rekombinačnímu toxinu Β (B300 « · • · • ·

IgY) po skončení léčby nerecidivují a neonemocní znovu nemocí související s C. difficile (CDAD), byl proveden následující experiment.

U křečků (jak dokazuje příklad 33) a lidí, ošetřovaných léčivy, jako je vankomycin nebo metronidazol, proti CDAD jsou po skončení medikace běžně pozorovány recidivy. Naproti tomu z údajů uvedených v příkladech 16 a 32 vyplývá, že je možno IgY, zaměřené proti rekombinačnímu toxinu A C. difficile samotnému (podávané profylakticky), nebo směs, obsahující IgY zaměřené proti rekombinačním proteinům toxinů A a B (podávanou terapeuticky), použít k úspěšné prevenci nebo léčbě CDAD a také k prevenci recidiv.

Tento příklad zahrnoval a) detekci organismů a toxinů C. difficile ve stolici křečků, ošetřovaných anti-A-6/B-3 IgY, b) detekci IgG proti toxinu A C. difficile a proti toxinu B C. difficile v séru léčených křečků pomocí ELISA, c) detekci IgA proti toxinu A C. difficile a proti toxinu B C. difficile ve slinách ošetřovaných křečků pomocí ELISA a d) reexpozici A-6/B-3 ošetřovaných křečků antibiotiky.

a) Detekce organismů a toxinů C. difficile ve stolici křečků ošetřovaných A-6/B3 IgY křečků, kteří byli úspěšně ošetřováni 2 ml A-6/B-3 IgY denně, spolu s jediným přežívajícím křečkem, ošetřovaným 1 ml A-6/B-3 IgY denně (příklad 42), bylo testováno na přítomnost C. difficile a toxinu A a toxinu B ve fekálním materiálu po skončení léčby. Toto stanovení bylo prováděno za účelem zjištění, zda jsou křečci, ošetřovaní A-6/B-3 IgY, chráněni před recidivou, protože ošetření pomocí IgY buď redukuje nebo kompletně eliminuje organismy a toxiny C. difficile z Gl traktu ošetřovaných křečků.

Od 7 jednotlivých křečků byla odebrána stolice 4 dny po skončení ošetření A6/B-3 IgY. Ze vzorků byla následujícím postupem vytvořena suspenze: 50 mg stolice bylo přidáno ke 100 μΙ PBS (pH 7,4) a směs byla promícháním vzorku suspendována. Alikvot (50 μΙ) každé suspenze byl naočkován na selektivní agarovou desku pro C. difficile (desky CCFA; BBL) a desky byly inkubovány za anaerobních

301 • · podmínek 48 h. Zbylá suspenze byla testována na přítomnosti toxinu A a toxinu B s použitím aglutinačního testu toxinů, popsaného v příkladu 49.

Výsledky, získané kultivací suspenzí stolice na deskách CCFA, prokázaly, že všichni křečci, úspěšně ošetřovaní A-6/B-3 IgY, ještě 4 dny po léčbě obsahovali organismy C. difficile (v rozmezí přibližně 6 až 100 kolonií). Toxin A C. difficile byl kromě toho detekován ve stolici všech devíti ošetřovaných křečků pomocí aglutinačního testu (příklad 49). Překvapivé je, že ve stolici žádného ze zvířat nebyl detekován toxin B C. difficile.

Od stejných 7 křečků byly odebrány vzorky stolice ještě po asi 5 týdnech po skončení léčby protilátkami. Byly připraveny suspenze a výše popsaným způsobem umístěny na desky CCFA. Po této prodloužené době byla přítomnost C. difficile detekována pouze ve stolici jednoho z křečků. Je zajímavé, že organismy byly detekovány v tom křečkovi, který byl ošetřován nižší (1 ml) dávkou A-6/B-3 IgY. Ve stolici tohoto zvířete byl detekován pouze nízký počet kolonií (5 kolonií). U kontrolních zvířat, jak je běžné, nebyly detekovány žádné organismy, pouze velmi malé procento křečků mělo detekovatelnou hladinu organismů.

Tyto výsledky ukazují, že i když jsou křečci, ošetřovaní A-6/B-3, úspěšně vyléčeni z CDAD a nemoc nerecidivuje, vylučují krátce po skončení léčby organismy C. difficile a mají ve stolici toxin A. Protilátky proti rekombinačnímu toxinu A a B C. difficile (tj. A-6/B-3 IgY) zjevně eliminují příznaky nemoci, aniž by kompletně eliminovaly organismy nebo toxin A C. difficile z gastrointestinálního traktu ošetřovaných křečků. Přestože se vynález neomezuje na určitou teorii působení, mohou ptačí IgY svůj terapeutický účinek vykonávat tak, že snižují hladinu přítomného toxinu a tak pravděpodobně dostatečně snižují počet organismů, takže nejen chrání před CDAD, ale i před její recidivou, protože je možné, že toxin A může napomáhat kolonizaci C. difficile.

Po pěti týdnech po skončení léčby preparátem ptačího antitoxinu nebyly organismy C. difficile detekovány ve stolici většiny (7/8) ošetřovaných křečků. Tyto výsledky ukazují, že po léčbě pomocí A-6/B-3 IgY nedochází k dlouhodobé kolonizaci gastrointestinálního traktu C. difficile.

302

b) Detekce IgG proti toxinu A C. difficile a toxinu B C. difficile v séru ošetřovaných křečků pomocí ELISA

Od křečků po ošetření anti-A-6/B-3 IgY bylo odebráno sérum za účelem zjištění, zda byla u ošetřovaných křečků vyvolána endogenní sérová odpověď IgG, zaměřená proti toxinům C. difficile. Vyvolání antitoxinové odpovědi IgG by mohlo odpovídat za prevenci následných recidiv u zvířat.

Čtyři dny po skončení léčby byla od sedmi křečků, kteří byli po pěti týdnech ještě k dispozici (jak popsáno výše), odebrána kardiální punkcí krev. Krev byla ponechána vysrážet a odstředěním bylo odděleno sérum. Bylo odebráno také sérum od neinfikovaného křečka a od křečka vakcinovaného směsí rekombinačních proteinů toxinu A a toxinu B (příklad 39), které sloužilo jako negativní, resp. pozitivní kontrola. Byla provedena ELISA postupem popsaným v příkladu 1. Stručně řečeno byly jamky mikrotitrační plotny potaženy 0,05 pg/ml rekombinantu toxinu A pPA18702680 (A-6) nebo 1,0 pg/ml rekombinantu toxinu B pPB 1750-2360 (B-3) v množství 100 μΙ na jamku. Vzorky séra byly testovány při výchozím ředění 1:50 s následným 5násobným sériovým ředěním. Jako sekundární protilátka byla použita kozí antikřeččí IgG alkalická fosfatasa (Southern Biotechnology Assoc.) ve zředění 1:1000. Všechny inkubace protilátek byly prováděny po dobu 2 h při 37 °C. Plotny byly vyvíjeny po dobu 30 min s použitím p-nitrofenylfosfátu (Sigma).

Výsledky ELISA prokázaly, že všechny vzorky séra od testovaných křečků obsahovaly významně nižší hladinu IgG proti toxinu A a proti toxinu B v porovnání s pozitivním kontrolním sérem (sérum od křečka, který si vytvořil ochrannou odpověď IgG po aktivní imunizaci rekombinačními proteiny toxinu A a B). Titry protilátek, přítomných v séru od 7 ošetřovaných křečků byly srovnatelné s hodnotami přítomnými v negativní kontrole. Tyto výsledky ukázaly, že ochrana před recidivou CDAD, dosahovaná ošetřením křečků pomocí A-6/B-3 IgY, pravděpodobně není důsledkem aktivní odpovědi sérového IgG u křečků po infekci organismy C. difficile.

303

c) Detekce odpovědi IgA ve slinách proti toxinu A C. difficile a proti toxinu B C. difficile u ošetřovaných křečků pomocí ELISA

Za účelem zjištění, zda je ochrana před recidivou CDAD, pozorovaná u křečků, ošetřovaných anti-A-6/B-3 IgY, důsledkem vyvolání odpovědi mukosálního IgA u zvířat, byl proveden následující experiment. Od 6 křečků, předtím ošetřovaných anti-A-6/B-3 IgY (příklad 42; 2 ml), byly s použitím pilokarpinu (Sigma), který vyvolává hypersekreci slin, odebrány sliny. Křečkům byl I.P. injekčně vpraven roztok obsahující pilokarpin (1 mg/ml) ve sterilní vodě; zvířatům bylo podáno 1 až 3 mg pilokarpinu. Sliny byly těmto 6 křečkům odebírány pomocí pipety. Jako negativní kontrola byly odebrány sliny od myši, které bylo podáno 200 pg pilokarpinu. Myší vzorek byl jako negativní kontrola použit proto, že jediný komerčně dostupný anti-lgA konjugát je kozí anti-myší IgA (bylo uvedeno, že toto činidlo křížově reaguje s křeččím IgA).

Test ELISA byl prováděn výše popsaným způsobem (odstavec (b)) s následujícími modifikacemi. Vzorky slin byly testovány při počátečním zředění 1:10 s následnými pětinásobnými sériovými ředěními. Jako sekundární protilátka byl použit kozí anti-myší IgA (Southern Biotechnology Assoc.) ve zředění 1:1000.

Výsledky ELISA ukázaly, že sliny pouze od 2 ze 6 ošetřených křečků obsahují hladiny IgA proti toxinu A a proti toxinu B vyšší než se vyskytují u myší negativní kontroly. Sliny od těchto dvou křečků, pozitivních na IgA proti toxinu, měly značně nízké titry (mezi 1:250 a 1:1250). Typické hyperimunní titry IgA se pohybují kolem 1:10000 nebo výše. Zbylí 4 křečci nevykazovali v porovnání s negativní kontrolou významnou odpověď antitoxinového IgA buď k toxinu A nebo toxinu B. Protože všech 6 křečků bylo úspěšně ošetřeno proti recidivě CDAD a většina (4/6) ošetřených křečků neprodukovala významnou odpověď antitoxinového IgA, je nepravděpodobné, že prevence recidivy byla důsledkem vytvoření odpovědi IgA proti toxinu A nebo toxinu B u křečka.

Výsledky uvedené v odstavcích (a) a (b) ukazují, že ochrana proti recidivě, pozorovaná u křečků, úspěšně léčených pomocí IgY, zaměřeného proti intervalům A6 a B-3 C. difficile, není důsledkem produkce humorální odpovědi proti toxinu C. difficile u hostitele. Ochrana před recidivou je tedy funkcí podávání preparátů IgY. To

304

ukazuje, že imunitní status hostitele nemusí být z hlediska odhadu vývoje nemoci (tj. přežití) nebo z hlediska výskytu recidivy relevantní. To je významné, protože mnozí pacienti, pro něž by byla léčba preparátem A-6/B-3 IgY největším přínosem, mají oslabený imunitní systém.

d) Opětná expozice křečků, ošetřovaných A-6/B-3, antibiotiky

Jak je uvedeno výše v odstavci (a), mají ošetření křečci dosud ve stolici organismy C. difficile (4 dny po skončení léčby IgY), a tudíž mají potenciál vývoje CDAD. Byl proveden experiment za účelem zjištění, zda opětná expozice těchto ošetřených křečků klindamycinem vyvolá nástup CDAD.

Čtyři ztěchž křečků, kteří byli použiti ve výše uvedených experimentech (například v příkladu 42), kteří byli úspěšně léčeni A-6/B-3 IgY, byli opět predisponováni vůči infekci C. difficile podáním klindamycin-fosfátu. Sedm dní po skočení počáteční léčby antibiotiky byla křečkům podána další I.P. injekce klindamycin-fosfátu (Biomol) v množství 1 mg/100 g tělesné hmotnosti. 12 dní po klindamycinové predispozici (tj. po druhém podání klindamycinu) se u žádného křečka nevyvinuly žádné známky CDAD.

Tyto výsledky prokázaly, že jakmile byli křečci úspěšně vyléčeni anti-A-6/B-3 IgY, byli odolní vůči vývoji CDAD i po další expozici klindamycinem. K dalšímu potvrzení tohoto výsledku bylo týmž křečkům podáno jiné antibiotikum, totiž Cefoxitin (Sigma), o němž je rovněž známo, že predisponuje křečky vůči infekci C. difficile. Důvodem byla existence možnosti, že prevence CDAD u křečků po opětném ošetření klindamycinem je důsledkem vytvoření normální flóry, resistentní vůči klindamycinu, která mohla zabránit kolonizaci gastrointestinálního traktu C. difficile. Každému z těchto 4 křečků byla podána subkutánní injekce 10 mg Cefoxitinu ve fyziologickém roztoku 11 dní poté (18 dní po ošetření pomocí A-6/B-3 IgY). Je známo, že tato dávka Cefoxitinu křečky predisponuje vůči CDAD.

dní po ošetření Cefoxitinem se u 1 ze 4 křečků vyvinul průjem a křeček uhynul. Zbylí 3 křečci zůstali zdraví a dlouhodobě přežili (tj. alespoň jeden měsíc). Výsledky získané po ošetření Cefoxitinem ukazují, že ochrana před recidivou CDAD

305 • · • · • · · · • » • · «

u ošetřených křečků pravděpodobně není důsledkem vzniklé odolnosti proti určitému antibiotiku (tj. rezistence vůči klindamycinu) ve flóře křečka.

Výše uvedené výsledky společně ukazují, že křečci, léčení na CDAD pomocí anti-A-6/B-3 IgY, obsahují krátce po skončení léčby v gastrointestinálním traktu životaschopné organismy C. difficile a toxin A C. difficile a přesto nerecidivují. Ještě více překvapivé je zjištění, že zatímco křečci mají ještě C. difficile ve vnitřnostech, jsou odolní při následné expozici s použitím antibiotik schopných je predisponovat vůči CDAD. Jak je výše uvedeno, 5 týdnů po odebrání ptačího antitoxinu již křečci nevylučují organismy do stolice a pravděpodobně již tedy nejsou kolonizováni C. difficile. Tyto výsledky dále ukazují, že orálním podáním A-6/B-3 IgY křečkům je možno nejen úspěšně léčit CDAD, ale i dodat odolnost vůči recidivě. A-6/B-3 IgY navíc chránil křečky před CDAD z opakované predispozice antibiotiky při použití dvou různých antibiotik.

Zvýše uvedených skutečností je zřejmé, že vynález poskytuje antitoxiny a vakciny pro léčbu a prevenci onemocnění C. difficile. Tyto antitoxiny navíc zabraňují recidivě onemocnění C. difficile, která je běžně pozorována při obvyklých postupech léčby, navíc poskytuje vynález rychlý aglutinační test pro detekci toxinů A a B C. difficile ve vzorcích.

Příklad 51

Tvorba a enterosolventní povlékání tablet obsahujících ptačí antitoxin zaměřený proti klostridiálním toxinovým proteinům pro orální aplikaci

Tento příklad popisuje tvorbu tablet obsahujících kuřecí IgY, zaměřený proti klostridiálním toxinovým proteinům, vhodných pro orální aplikaci pro účinnou léčbu onemocnění C. difficile. Jak je uvedeno v příkladu 43, podávají-li se IgY křečkům orálně v karbonátovém pufru, je ve slepém střevě, což je relevantní místo, kde dochází k infekci, detekováno jen velmi malé množství dodané protilátky. Většina IgY je pravděpodobně hydrolyzována v kyselém prostředí nebo degradována proteasami v žaludku. Většina zbylého funkčního IgY, který projde žaludkem, je pak však

306 ··· ···· · · · ····· ·· · · · ·· rozložena různými enzymy, nacházejícími se v tenkém střevě. Nízké hodnoty obsahu IgY, nacházeného ve slepém střevě ošetřených křečků, jsou podpořeny prací Losche a d., kteří v experimentech in vitro zjistili, že kuřecí IgY jsou velmi citlivé vůči účinkům nízkého pH a střevních proteas. Pro maximalizaci účinnosti dané dávky orálního léčiva s obsahem protilátky byly prováděny experimenty za účelem zjištění, zda je možno PEG-frakcionované IgY tabletovat pro snadné podávání a enterosolventně povlékat pro zamezení degradace v gastrointestinálním traktu. Tento příklad zahrnoval (a) tvorbu tablet s obsahem PEG-čištěného anti-A-6 IgY, (b) povlékání tablet IgY pH-citlivým enterosolventním filmem, (c) testování rozpouštěcího profilu povlečených tablet IgY, (d) stanovení stability reaktivity IgY po tabletování, enterosolventním povlékání a rozpouštění pomocí ELISA a (e) demonstraci zachování schopnosti tabletovaného IgY neutralizovat toxin A C. diffícile in vivo.

a) Tvorba tablet obsahujících PEG-čištěný anti-A-6 IgY

Kuřecí IgY ze slepic, imunizovaných rekombinačním proteinem toxinů A C. diffícile pMA 1870-2680 (oblast A-6), byl frakcionován pomocí PEG, jak je popsáno v příkladu 37(a), tj. IgY z vajec, sebraných od slepic, imunizovaných rekombinačním proteinem, byly čištěny srážením PEG a po čištění byly pelety IgY resuspendovány v0,1x PBS, pH 7,4. Tento postup se mírně liší od postupu uvedeného v příkladu 1 vtom, že místo 1x PBS (příklad 1) je zde (a v přikladu 37a) použito 0,1x PBS. Úprava na 0,1 x PBS byla provedena primárně pro snížení konečného poměru soli ve vztahu k IgY v konečném vysušeném preparátu.

Bylo frakcionováno 113 vajec a konečná peleta IgY po stupni s 12% PEG byla resuspendována v provozní vodě o 1/4 objemu žloutku. Resuspendovaný IgY byl přenesen do lyofilizačních nádob a rychle zmrazen na suchém ledu s reagenčním alkoholem. Nádoby rotovaly v lázni suchého ledu, aby došlo k rovnoměrnému zamrzání roztoku IgY ukládáním vrstev na stěnách nádoby. Zmrazený roztok IgY byl umístěn na zařízení Labconco Freeze-Dry System/Lyph Lock 4.5 a lyofilizován po dobu asi 18 h do sucha. Konečný lyofilizovaný IgY vážil 13,56 g, čili asi 120 mg sušiny na vejce.

307 ·· ·· ·· · ·· ·· ··· ···· · · · · • ···· · » · « ··· • ·· · · · · · · ···· · ······· · · · • · ·· ·· · · · · · · · g lyofilizovaného IgY bylo v tabletovacím lisu Stokes B2 zpracováno na 40 tablet po 250 mg. Byla použita konvenční vytlačovací hlava s plochým povrchem o velikosti 6,35 mm (1/4 inch). Tablety byly připravovány dvojím lisováním pod tlakem 4500 liber, byly tvrdé a měly plochý povrch a průměrnou hmotnost 256 ± 6 mg.

b) Povlékání tablet IgY enterosolventním filmem, citlivým na pH

Tablety byly povlékány produktem Eudragit $-100 (Rohm Tech, lne., Malden, MA), což je enterosolventní filmový povlak (kopolymer kyseliny methakrylové, typ B, USP/NF), který je rozpustný v roztocích od pH 7,00 a výše. Zásobní roztok Eudragit S-100 byl připraven podle pokynů výrobce. Stručně řečeno byl Eudragit S-100 rozpuštěn smísením 13 dílů (hmotnostních) Eudragit S-100 (12,5 % suché polymerní substance) ve směsi 82 dílů (hmotnostních) isopropylalkoholu a 5 dílů (hmotnostních) provozní vody. Enterosolventní povlékací film byl připraven hmotnostně z: 480 g 12,5% roztoku Eudragit S-100, 6 g triethylcitrátu jako změkčovadla, 30 g talku jako antiadhesiva, 50 g provozní vody a 434 g isopropylalkoholu. Obsah pevného podílu konečné suspenze byl 9,6 % a obsah sušiny polymeru byl 6,0 %.

Směs pro enterosolventní povlak byla umístěna do kádinky a pomocí pinzety s jemnými konci byly do roztoku ponořovány jednotlivé tablety na dobu asi 1 s. Povlečené tablety pak byly ponechány schnout při teplotě místnosti na listu parafilmu. Některé tablety byly do enterosolventního povlaku ponořeny ještě dvakrát se sušením při teplotě místnosti mezi povlékáním. Důvodem bylo zajistit úplnější pokrytí tablet. Tablety ponořené do enterosolventního roztoku jednou, resp. třikrát, byly označeny jako tablety 1x, resp. 3x.

c) Testování rozpouštěcího profilu povlečených tablet IgY

Byly prováděny rozpouštěcí studie pro stanovení desintegrační kinetiky enterosolventních tablet s použitím metod popsaných v příkladu 37(b). Rozpouštění tablet bylo prováděno za dvojích podmínek: bud v simulované žaludeční šťávě o pH 1,2 nebo v simulovaném střevním roztoku o pH 7,5, připravených v obou případech podle návodu USP. Každá tableta byla zvážena a umístěna do kádinky obsahující

308 ·· · · · · · · · ·· • · · ···· · · · * • ···· · · · · · ·· • · · · · · · · · · · · » · ······· · · · příslušný roztok v množství 10 mg tablet na ml roztoku, Byly testovány tyto formy tablet: 1) nepovlečené tablety IgY, 2) 1x povlečené tablety IgY a 3) 3x povlečené tablety IgY.

Tablety byly rozpouštěny mírným mícháním pomocí tyčového míchadla při teplotě místnosti. V různých časových okamžicích byly odebírány alikvoty každého roztoku IgY a byla měřena absorbance při 280 nm pro kvantifikaci množství IgY v roztoku. Rozpouštěcí profil tablet IgY, povlečených Eudragitem, je znázorněn na obr. 55.

Na obr. 55 je vynesena absorbance při 280 nm proti času v minutách. Uvolňování IgY z nepovlečených tablet IgY v žaludečním nebo střevním roztoku je znázorněno plnými čtverečky, resp. prázdnými kosočtverci. Jak je na obr. 55 patrném rychlost rozpouštění nepovlečených tablet IgY byla v žaludečním roztoku oproti střevnímu roztoku menší. Tato inherentní fyzikální vlastnost nepovlečené tablety je její neočekávanou výhodou, která ji činí přirozeně odolnější vůči rozpouštění v žaludku.

Rozpouštěcí profil 1x a 3x povlečených tablet IgY, umístěných do střevního roztoku, je na obr. 55 znázorněn plnými, resp. prázdnými trojúhelníky. Jak je z obr. 55 patrné, 1x i 3x povlečené tablety se rozpouštěly podobnou rychlostí a k úplnému rozpuštění došlo po asi 1 h. Navíc byla rozpouštěcí rychlost ve střevním roztoku u enterosolventních povlečených tablet mírně větší než u nepovlečených tablet. Naproti tomu se 1x nebo 3x povlečené tablety IgY v žaludečním roztoku (znázorněno na obr. 55 prázdnými čtverečky, resp. plnými trojúhelníky) rozpouštěly velmi pomalu a do roztoku byl uvolněn pouze malý zlomek celkového IgY, obsaženého v tabletě. Rozdíl rozpouštěcího profilu 1x nebo 3x povlečených tablet IgY byl minimální. Z těchto výsledků vyplývá, že tablety IgY, povlečené Eudragitem, se správně otevíraly do roztoku v simulovaném střevním roztoku o pH 7,5 v závislosti na čase, zatímco v simulovaném žaludečním roztoku o pH 1,2 zůstávaly převážně intaktní.

Výše popsané rozpouštěcí studie prokazují, že IgY, formulovaný jako tableta, může být úspěšně enterosolventně povlékán.

309 ··· · · · · · · · · • ···· · · · · · ·· • ·· · · · · · · ··· · · ······· · · · « · « · ·· ··· 9· · *

d) Stanovení stability reaktivity IgY po tabletování, enterosolventním povlékání a rozpouštění pomocí ELISA

Stabilita IgY proti rekombinačnímu toxinů A C. difficile (anti-A-6 IgY) po tabletování (tj. formování do tablet) a povlékání enterosolventním povlakem byla zjišťována porovnáváním reaktivity ELISA u lyofilizovaného výchozího materiálu A-6 (netabletovaného) a tablet anti-A-6 IgY, bud enterosolventně povlečených Eudragitem S-100 nebo nepovlečených. Enterosolventně povlečené (3x tablety) nebo nepovlečené tablety IgY byly ponechány rozpustit se v simulovaném střevním roztoku o pH 7,5 v koncentraci 10 mg/ml. Ve střevním roztoku byl ve stejné koncentraci rozpuštěn také výchozí netabletovaný IgY (označený jako objemná protilátka). Byla provedena standardní ELISA detekující přítomnost protilátek zaměřených proti rekombinačnímu proteinu pPA1870-2680 N/C toxinů A (A-6), jak je popsána v příkladu 35. Jako negativní kontrola byl testován také preimunní IgY ve stejné normalizované koncentraci (označen jako placebo; na obr. 56 znázorněn čtverečky). Výsledky ELISA jsou znázorněny na obr. 56.

Na obr. 56 je vynesena absorbance při 410 nm proti reciproké hodnotě ředění testované protilátky. Výsledky znázorněné na obr. 56 demonstrují, že reaktivita antiA-6 IgY po tabletování (bez enterosolventního povlaku; plné kosočtverce) a anti-A-6 IgY po tabletování a enterosolventním povlékání směsí Eudragitu S-100 (3x povlečené tablety; prázdné kosočtverce) je velmi podobná výchozímu objemovému anti-A-6 IgY (objemová protilátka; prázdné čtverečky). Z výsledků vyplývá, že procesy tabletování a opatřování enterosolventním povlakem nejsou pro preparát IgY škodlivé a anti-A-6 IgY zůstává po rozpouštění za fyziologických podmínek aktivní a funkční.

Zvýše uvedených výsledků vyplývá, že byly získány enterosolventně povlečené tablety IgY, které jsou stabilní a reaktivní.

310 ··· ···· ···· ····· · · · ···· • · · ··· · · · ···· · ······· ··· ·· ·· ·« ·· ·· ··

e) Demonstrace uchování schopnosti tabletovaného IgY neutralizovat toxin C. difficile in vivo

Byla zjišťována schopnost tablety A-6 IgY po rozpuštění neutralizovat in vivo toxin A C. difficile. Pro testování neutralizace toxinu A byly použity myši místo křečků, protože myši vyžadují pro LD₁₀₀ méně toxinu.

Hodnota LD₁₀₀ toxinu A C. difficile pro myši byla stanovena I.P. injekcí 1 ml PBS s obsahem buď 50 ng, 500 ng nebo 5000 ng toxinu A C. difficile myším Balb/c o hmotnosti 25 g. Toxin A C. difficile, použitý v této studii, byl zakoupen od Dade International, lne., Bartells Division Seattle, WA. Bylo zjištěno, že minimální testovaná letální dávka činí 50 ng toxinu A C. difficile, při níž všechny myši do 24 h po ošetření uhynuly. Když bylo podáno 500, resp. 5000 ng, toxinu A C. difficile, uhynuly všechny myši do 3, resp. 4 h.

Byl rovněž testován efekt injekce toxinu A C. difficile v přítomnosti preimunního IgY pro zjištění, zda IgY snižuje toxicitu in vivo. 50 ng toxinu A bylo před podáním myším preinkubováno po dobu 1 h při 37 °C saž 50000 ng (100násobné množství) preimunního IgY. Bylo zjištěno, že i v přítomnosti preimunního IgY je 50 ng toxinu A C. difficile letálních pro myši během 24 h.

Schopnost tablety anti-A-6 IgY neutralizovat toxin A C. difficile in vivo byla porovnávána se schopností objemového anti-A-6 IGY (před tabletováním) neutralizovat toxin. Jedna tableta 250 mg anti-A-6 IgY (tableta byla předtím uchovávána 3 týdny při teplotě místnosti) byla rozpuštěna v simulovaném střevním roztoku a množství IgY v roztoku bylo kvantifikováno absorbancí při 280 nm. Byl rovněž připraven lyofilizovaný A-6 IgY před tabletováním (objemový) a preimunní (Pl) IgY ve střevním roztoku a kvantifikován absorbancí při 280 nm. S 50 ng/ml toxinu A C. difficile bylo 1 h při 37 °C preinkubováno 5000 ng, 25000 ng a 50000 ng/ml preimunního IgY, objemového anti-A-6 IgY nebo rozpuštěné tablety anti-A-6 IgY. To představuje 100násobné, 500násobné, resp. 1000násobné množství IgY v porovnání s množstvím toxinu (hmotnostně).

Po 1 h inkubace byly směsi (celkem 9) intraperitoneálně podány myším Balb/c o hmotnosti 20 až 25 g. Bylo testováno celkem devět skupin po třech myších. Po

311 • ·· · · · · · · ···· · ······· · · · ·· ·· ·· *·· ·· ·· skončení doby pozorování, trvající 27 h, byl zjištěn počet přežívajících myší v každé skupině. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 52.

Tabulka 52

	skupina (ng IgY ve směsi s 50 ng toxinu A)	přežití (%)
1	5000 ng tablety anti-A-6	100% (3/3)
2	250000 ng tablety anti-A-6	100% (3/3)
3	500000 ng tablety anti-A-6	100% (3/3)
4	5000 ng obj. anti-A-6	100 % (3/3)
5	250000 ng obj. anti-A-6	100% (3/3)
6	500000 ng obj. anti-A-6	66 % (2/3)
7	5000 ng Pl	0 % (0/3)
8	250000 ng Pl	0 % (0/3)
9	500000 ng Pl	33% (1/3)

Z uvedených výsledků vyplývá, že tableta anti-A-6 po rozpuštění při pH 7,5 je schopna neutralizovat letální účinky toxinu A C. difficile způsobem srovnatelným jako v případě, kdy byl použit výchozí (tj. objemový nebo nepovlečený) materiál. Tyto výsledky ukazují, že tabletovací proces nemá nepříznivé účinky na schopnost anti-A6 IgY neutralizovat toxin A C. difficile. Na rozdíl od výsledků získaných s použitím preimunního IgY byl jak objemový, tak tabletovaný preparát anti-A-6 IgY schopen neutralizovat toxin A C. difficile pri srovnatelném 100násobném přebytku proteinu (5000 ng A-6 IgY neutralizovalo 50 ng toxinu).

Tyto výsledky demonstrují schopnost formulovat IgY proti klostridiálním toxinům v pevné dávkové formě (tj. tabletě), která je opatřena enterosolventním povlakem pro uvolňování v tlustém střevě. IgY proti klostridiálnímu toxinu, přítomný v tabletě, navíc zůstává stabilní, aktivní a funkční.

312

Příklad 52

Profylaktické ošetření onemocnění C. difficile u křečků protilátkami proti rekombinačnímu intervalu 6 toxinu A

Tento experiment zahrnoval infekci křečků pomocí C. difficile a léčbu onemocnění, vyvolaného C. difficile, protilátkami, vytvořenými proti rekombinačnímu toxinu A (IgY). Protilátky IgY byly vytvořeny proti rekombinantu toxinu A C. difficile pMA1870-2680 (interval A-6). Kontrolními zvířaty byli infikovaní křečci, ošetřovaní frakcí preimunizačního imunoglobulinu (Pl). Surový Pl a IgY byly frakcionovány polyethylenglykolem a resuspendovány v 8x koncentraci (40 mg/ml) v 0,1 M karbonátovém pufru o pH 9,5.

Dvě skupiny křečků obsahovaly po devíti nebo deseti samicích zlatých syrských křečků (Sasco; kříženci LVG) o hmotnosti asi 80 g. Křečci byli umístěni v klecích po třech a během celé studie dostávali potravu a vodu ad libitum.

Křečci byli predisponováni vůči infekci C. difficile metodou podle Lyerlyho (Lyerly a d., Infect. Immun. 59(6): 2215-2218 (1991)). Každému křečkovi byl intragastricky žaludeční sondou podán klindamycin-HCI (Sigma) v dávce 3 mg/100 g tělesné hmotnosti v 1 ml sterilní vody. Po 2 a 4 h od podání klindamycinu byla křečkům orálně podána dávka 2 ml 8x Pl nebo 8x IgY. Po 24 h od podání klindamycinu byli křečci exponováni 1 ml fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku (PBS) o pH 7,2 s obsahem přibližně 10® organismů C. difficile VPI 7698. Expoziční dávka byla připravena z kultur v mozkosrdcovém nálevu (BHI), pěstovaných přes noc anaerobně v anaerobní komoře Gaspak při 37 °C (podmínky kultivace se řídily podle Lyerlyho a d.). 1 h před touto expozicí a 8 h po ní bylo křekům podáno 8x Pl nebo 8x IgY. Dávkování pokračovalo ještě dva dny (celkem 4 dny) dvakrát denně v přibližně 8h intervalech.

Výsledky jsou znázorněny na obr. 57. Doba ošetřeni je znázorněna vodorovnou úsečkou pod osou souřadnic. Podání klindamycinu a C. difficile (infekce) je označeno šipkami. Plné čtverečky představují křečky ošetřované Pl a prázdné čtverečky křečky ošetřované A-6 IgY.

313 ·« ·· I ♦ · ·» 9 ·· ·· • ·· · « · · • · · · · · • · · ·· · · · • · · · · ·· ··· ·· ··

Křečci ošetřovaní Pl si do 24 až 48 h vyvinuli průjem a do 24 h po nástupu průjmu uhynuli. Všech devět křečků, ošetřovaných Pl, bylo 48 h po expozici mrtvých. Naproti tomu 60 % (6/10) křečků, kteří dostávali anti-A-6 IgY, přežívalo ještě 19 dní po expozici, kdy bylo ukončeno monitorování. Nástup úhynu u zbylých čtyř křečků, ošetřovaných anti-A-6 IgY, byl ve srovnání s křečky, ošetřovanými Pl, opožděn o 1 až 3 dny. Úroveň dlouhodobé ochrany pomocí anti-A-6 IgY byla statisticky významná (analýza chi square shodnou P < 0,025). I když se u většiny (8 z 10) křečků, ošetřovaných anti-A-6 IgY, vyvinul průjem, pouze polovina z těch, kteří měli průjem, uhynula v důsledku infekce C. difficile. Bez ohledu na nástup průjmu anti-A-6 IgY podporoval přežití nemocných křečků.

Tyto výsledky ukazují, že nízké profylaktické dávky anti-A-6 IgY chrání křečky dlouhodobě před nejvážnějšími účinky onemocnění vyvolaného C. difficile. Této ochrany bylo dosaženo dávkovacím režimem, spočívajícím v osmi podáních během 4 dnů, z čehož pouze 3 dávky byly provedeny před infekcí. Toto minimální ošetření kontrastuje s režimem podle Lyerlyho a d., kde byli křečci profylakticky ošetřeni celkem 39krát: třikrát denně počínaje 3 dny před expozicí a pak ještě 10 dní po expozici byl podáván bovinní antitoxin. Lyerlyho dávky bovinního antitoxinu byly také větší než v experimentu podle vynálezu (tj. 300 mg bovinní protilátky/dávku oproti 80 mg ptačí protilátky/dávku). Navíc, na rozdíl od našich zjištění, Lyerly uvádí, že zvířata nevykazovala dlouhodobou ochranu po skončení léčby (všechny uhynula do 72 h po ošetření) nebo jakmile se vyvinul průjem.

Na rozdíl od Lyerlyho studie prokazují výsledky podle vynálezu, že ptačí protilátky proti rekombinačnímu toxinu A jsou účinným profylaktickým prostředkem, jehož ochranné účinky trvají dlouho po skončení léčby.

314 ·· ««

I · · fc · ··· » · · « » · · <

• 4 *· • · ·· • · · · • · ·· * ··· · · • · · • ·· ··

Příklad 53

Terapeutické ošetření onemocnění C. difficile u křečků protilátkami proti intervalu 6 rekombinantu toxinu A

V dalším experimentu byli křečci terapeuticky ošetřováni (po infekci) anti-A-6 IgY. Tento přístup je obtížnější a Lyerlym nebyl zaznamenán.

Byl použit stejný kmen C. difficile, kultivační médium, expoziční dávka a postup infekce jako v příkladu 52. Dvě skupiny po devíti samicích křečků (Sasco) byly exponovány přibližně 10⁸ organismů kmene C. difficile VPI 7698. 4 h po expozici byla zahájena léčba 2 ml buď Pl nebo anti-A-6 IgY ve stejné koncentraci jako v příkladu 52. Křečci byli ošetřeni ještě po asi 4 h a pak ještě dvakrát denně po 2 dny v 8h intervalech. Celkem byli křečci ošetřeni šestkrát během 3 dnů.

Výsledky jsou znázorněny na obr. 58. Doba ošetření je znázorněna vodorovnou úsečkou pod osou souřadnic a podání klindamycinu a expozice C. difficile jsou označeny šipkami.

Křečci, kteří byli terapeuticky ošetřeni anti-A-6 IgY (prázdné čtverečky) měli nižší souhrnnou mortalitu než kontrolní skupina (plné čtverečky). Kromě toho byl nástup průjmu u skupiny ošetřované anti-A-6 IgY v porovnání se skupinou ošetřovanou Pl odložen o alespoň 24 h. Všichni křečci, ošetřovaní Pl, si vyvinuli průjem a během 2 dní uhynuli, což prokazuje chybějící ochranu před onemocněním při použití kontrolní imunitní frakce. 55 % (5/9) křečků, ošetřovaných anti-A-6, dlouhodobě přežilo (doba pozorování byla 20 dní). Ochrana poskytovaná anti-A-6 IGY (přežití) byla statisticky významná v porovnání se skupinou ošetřovanou Pl (hodnota P při analýze chi square < 0,05).

Tyto výsledky prokazují, že křečkům, infikovaným C. difficile za podmínek stejných jako podle Lyerlyho, poskytl ptačí anti-A-6 IgY účinnou terapeutickou ochranu a dlouhodobé přežití.

315 ·· ·· • · · · • · ·· • · · · a • · a • · · ·

SEZNAM SEKVENCÍ (1) INFORMACE PRO SEQ ID NO:1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:1:

GGAAATTTAG CTGCAGCATC TGAC (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:2:

TCTAGCAAAT TCGCTTGTGT TGAA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 20 párů bází
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	ŘETĚZEC: j ednoduchý
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP	MOLEKULY: DNA (genomová)
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:3:
CTCGCATATA	GCATTAGACC

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 19 párů bází
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	ŘETĚZEC: jednoduchý
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii)	TYP	MOLEKULY: DNA (genomová)
(xi)	POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:4:
CTATCTAGGC	CTAAAGTAT

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 8133 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý

Γ «· · · ·· ♦ ·· ·· ··· ···· ···· ············ • ·· ··· · · · ···· · • · · · ··· .·.· ,, ·· ·· ··· ·· ·· (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) RYS:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) POLOHA: 1..8130 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:5:

ATG 48 Met 1

TCT

TTA

ATA

TCT

AAA

GAA

GAG

TTA

ATA

AAA

CTC

GCA

TAT

AGC

ATT

Ser

Leu

Ile

Ser 5

Lys

Glu

Glu

Leu

Ile 10

Lys

Leu

Ala

Tyr

Ser 15

Ile

AGA 96

CCA

AGA

GAA

AAT

GAG

TAT

AAA

ACT

ATA

CTA

ACT

AAT

TTA

GAC

GAA

Arg

Pro

Arg

Glu 20

Asn

Glu

Tyr

Lys

Thr 25

Ile

Leu

Thr

Asn

Leu 30

Asp

Glu

TAT 144

AAT

AAG

TTA

ACT

ACA

AAC

AAT

AAT

GAA

AAT

AAA

TAT

TTG

CAA

TTA

Tyr

Asn

Lys 35

Leu

Thr

Thr

Asn

Asn 40

Asn

Glu

Asn

Lys

Tyr 45

Leu

Gin

Leu

AAA 192

AAA

CTA

AAT

GAA

TCA

ATT

GAT

GTT

TTT

ATG

AAT

AAA

TAT

AAA

ACT

Lys

Lys 50

Leu

Asn

Glu

Ser

Ile 55

Asp

Val

Phe

Met

Asn 60

Lys

Tyr

Lys

Thr

TCA 240

AGC

AGA

AAT

AGA

GCA

CTC

TCT

AAT

CTA

AAA

AAA

GAT

ATA

TTA

AAA

Ser 65

Ser

Arg

Asn

Arg

Ala 70

Leu

Ser

Asn

Leu

Lys 75

Lys

Asp

Ile

Leu

Lys 80

GAA 288

GTA

ATT

CTT

ATT

AAA

AAT

TCC

AAT

ACA

AGC

CCT

GTA

GAA

AAA

AAT

Glu

Val

Ile

Leu

Ile 85

Lys

Asn

Ser

Asn

Thr 90

Ser

Pro

Val

Glu

Lys 95

Asn

TTA 336

CAT

TTT

GTA

TGG

ATA

GGT

GGA

GAA

GTC

AGT

GAT

ATT

GCT

CTT

GAA

Leu

His

Phe

Val 100

Trp

Ile

Gly

Gly

Glu 105

Val

Ser

Asp

Ile

Ala 110

Leu

Glu

TAC 384

ATA

AAA

CAA

TGG

GCT

GAT

ATT

AAT

GCA

GAA

TAT

AAT

ATT

AAA

CTG

Tyr

Ile

Lys 115

Gin

Trp

Ala

Asp

Ile 120

Asn

Ala

Glu

Tyr

Asn 125

Ile

Lys

Leu

TGG 432

TAT

GAT

AGT

GAA

GCA

TTC

TTA

GTA

AAT

ACA

CTA

AAA

AAG

GCT

ATA

Trp

Tyr 130

Asp

Ser

Glu

Ala

Phe 135

Leu

Val

Asn

Thr

Leu 140

Lys

Lys

Ala

Ile

GTT 480

GAA

TCT

TCT

ACC

ACT

GAA

GCA

TTA

CAG

CTA

CTA

GAG

GAA

GAG

ATT

Val 145

Glu

Ser

Ser

Thr

Thr 150

Glu

Ala

Leu

Gin

Leu 155

Leu

Glu

Glu

Glu

Ile 160

CAA 528

AAT

CCT

CAA

TTT

GAT

AAT

ATG

AAA

TTT

TAC

AAA

AAA

AGG

ATG

GAA

Gin

Asn

Pro

Gin

Phe 165

Asp

Asn

Met

Lys

Phe 170

Tyr

Lys

Lys

Arg

Met 175

Glu

TTT 576

ATA

TAT

GAT

AGA

CAA

AAA

AGG

TTT

ATA

AAT

TAT

TAT

AAA

TCT

CAA

Phe

Ile

Tyr

Asp 180

Arg

Gin

Lys

Arg

Phe 185

Ile

Asn

Tyr

Tyr

Lys 190

Ser

Gin

ATC

AAT

'aaa

CCT

ACA

GTA

CCT

ACA

ATA

GAT

GAT

ATT

ATA

AAG

TCT

CAT

624 =3TT • · · · · * · · · · · » ·· ··· · · · ···· « ► ··· ·· · · · _{Λ Λ} · ·· ·· ·· tu ·· ··

Ile Asn Lys

Pro

Thr

Val

Pro

Thr 200

Ile

Asp

Asp

Ile

Ile 205

Lys

Ser

His

195

CTA 672

GTA TCT

GAA

TAT

AAT

AGA

GAT

GAA

ACT

GTA

TTA

GAA

TCA

TAT

AGA

Leu

Val Ser 210

Glu

Tyr

Asn

Arg 215

Asp

Glu

Thr

Val

Leu 220

Glu

Ser

Tyr

Arg

ACA 720

AAT TCT

TTG

AGA

AAA

ATA

AAT

AGT

AAT

CAT

GGG

ATA

GAT

ATC

AGG

Thr 225

Asn Ser

Leu

Arg

Lys 230

Ile

Asn

Ser

Asn

His 235

Gly

Ile

Asp

Ile

Arg 240

GCT 768

AAT AGT

TTG

TTT

ACA

GAA

CAA

GAG

TTA

TTA

AAT

ATT

TAT

AGT

CAG

Ala

Asn Ser

Leu

Phe 245

Thr

Glu

Gin

Glu

Leu 250

Leu

Asn

Ile

Tyr

Ser 255

Gin

GAG 816

TTG TTA

AAT

CGT

GGA

AAT

TTA

GCT

GCA

GCA

TCT

GAC

ATA

GTA

AGA

Glu

Leu Leu

Asn 260

Arg

Gly

Asn

Leu

Ala 265

Ala

Ala

Ser

Asp

Ile 270

Val

Arg

TTA 864

TTA GCC

CTA

AAA

AAT

TTT

GGC

GGA

GTA

TAT

TTA

GAT

GTT

GAT

ATG

Leu

Leu Ala 275

Leu

Lys

Asn

Phe

Gly 280

Gly

Val

Tyr

Leu

Asp 285

Val

Asp

Met

CTT 912

CCA GGT

ATT

CAC

TCT

GAT

TTA

TTT

AAA

ACA

ATA

TCT

AGA

CCT

AGC

Leu

Pro Gly 290

Ile

His

Ser

Asp 295

Leu

Phe

Lys

Thr

Ile 300

Ser

Arg

Pro

Ser

TCT 960

ATT GGA

CTA

GAC

CGT

TGG

GAA

ATG

ATA

AAA

TTA

GAG

GCT

ATT

ATG

Ser 305

Ile Gly

Leu

Asp

Arg 310

Trp

Glu

Met

Ile

Lys 315

Leu

Glu

Ala

Ile

Met 320

AAG

TAT AAA

AAA

TAT

ATA

AAT

AAT

TAT

ACA

TCA

GAA

AAC

TTT

GAT

AAA

1008

Lys Tyr

Lys

Lys

Tyr

Ile

Asn

Asn

Tyr

Thr

Ser

Glu

Asn

Phe

Asp

Lys

325

330

335

CTT GAT

CAA

CAA

TTA

AAA

GAT

AAT

TTT

AAA

CTC

ATT

ATA

GAA

AGT

AAA

1056

Leu Asp

Gin

Gin

Leu

Lys

Asp

Asn

Phe

Lys

Leu

Ile

Ile

Glu

Ser

Lys

340

345

350

AGT GAA

AAA

TCT

GAG

ATA

TTT

TCT

AAA

TTA

GAA

AAT

TTA

AAT

GTA

TCT

1104

Ser Glu

Lys

Ser

Glu

Ile

Phe

Ser

Lys

Leu

Glu

Asn

Leu

Asn

Val

Ser

355

360

365

GAT CTT

GAA

ATT

AAA

ATA

GCT

TTC

GCT

TTA

GGC

AGT

GTT

ATA

AAT

CAA

1152

Asp Leu

Glu

Ile

Lys

Ile

Ala

Phe

Ala

Leu

Gly

Ser

Val

Ile

Asn

Gin

370

375

380

GCC TTG

ATA

TCA

AAA

CAA

GGT

TCA

TAT

CTT

ACT

AAC

CTA

GTA

ATA

GAA

1200

Ala Leu

Ile

Ser

Lys

Gin

Gly

Ser

Tyr

Leu

Thr

Asn

Leu

Val

Ile

Glu

385

390

395

400

CAA GTA

AAA

AAT

AGA

TAT

CAA

TTT

TTA

AAC

CAA

CAC

CTT

AAC

CCA

GCC

1248

Gin Val

Lys

Asn

Arg

Tyr

Gin

Phe

Leu

Asn

Gin

His

Leu

Asn

Pro

Ala

-

405

410

415

ΑΤΑ GAG TCT GAT AAT AAC TTC ACA GAT ACT ACT AAA ATT TTT CAT GAT 1296

—

•

I · ·

• ·

•

•

•

• ·

• ·

• ·

•

•

• · ·

»

• - ·

•

•

• ·

• ·

• ·

•

• ·

«

• ·

•

• ·

•

• · · ·

• ·

• · ·

•

Ile Glu

Ser

Asp

Asn

Asn

Phe

Thr

Asp

Thr

Thr

Lys

Ile

Phe

His

Asp

420

425

430

TCA TTA

TTT

AAT

TCA

GCT

ACC

GCA

GAA

AAC

TCT

ATG

TTT

TTA

ACA

AAA

1344

Ser Leu

Phe

Asn

Ser

Ala

Thr

Ala

Glu

Asn

Ser

Met

Phe

Leu

Thr

Lys

435

440

445

ATA GCA

CCA

TAC

TTA

CAA

GTA

GGT

TTT

ATG

CCA

GAA

GCT

CGC

TCC

ACA

1392

Ile Ala

Pro

Tyr

Leu

Gin

Val

Gly

Phe

Met

Pro

Glu

Ala

Arg

Ser

Thr

450

455

460

ATA AGT

TTA

AGT

GGT

CCA

GGA

GCT

TAT

GCG

TCA

GCT

TAC

TAT

GAT

TTC

1440

Ile Ser

Leu

Ser

Gly

Pro

Gly

Ala

Tyr

Ala

Ser

Ala

Tyr

Tyr

Asp

Phe

465

470

475

480

ATA AAT

TTA

CAA

GAA

AAT

ACT

ATA

GAA

AAA

ACT

TTA

AAA

GCA

TCA

GAT

1488

Ile Asn

Leu

Gin

Glu

Asn

Thr

Ile

Glu

Lys

Thr

Leu

Lys

Ala

Ser

Asp

485

490

495

TTA ATA

GAA

TTT

AAA

TTC

CCA

GAA

AAT

AAT

CTA

TCT

CAA

TTG

ACA

GAA

1536

Leu Ile

Glu

Phe

Lys

Phe

Pro

Glu

Asn

Asn

Leu

Ser

Gin

Leu

Thr

Glu

500

505

510

CAA GAA

ATA

AAT

AGT

CTA

TGG

AGC

TTT

GAT

CAA

GCA

AGT

GCA

AAA

TAT

1584

Gin Glu

Ile

Asn

Ser

Leu

Trp

Ser

Phe

Asp

Gin

Ala

Ser

Ala

Lys

Tyr

515

520

525

CAA TTT

GAG

AAA

TAT

GTA

AGA

GAT

TAT

ACT

GGT

GGA

TCT

CTT

TCT

GAA

1632

Gin Phe

Glu

Lys

Tyr

Val

Arg

Asp

Tyr

Thr

Gly

Gly

Ser

Leu

Ser

Glu

530

535

540

GAC AAT

GGG

GTA

GAC

TTT

AAT

AAA

AAT

ACT

GCC

CTC

GAC

AAA

AAC

TAT

1680

Asp Asn

Gly

Val

Asp

Phe

Asn

Lys

Asn

Thr

Ala

Leu

Asp

Lys

Asn

Tyr

545

550

555

560

TTA TTA

AAT

AAT

AAA

ATT

CCA

TCA

AAC

AAT

GTA

GAA

GAA

GCT

GGA

AGT

1728

Leu Leu

Asn

Asn

Lys

Ile

Pro

Ser

Asn

Asn

Val

Glu

Glu

Ala

Gly

Ser

565

570

575

AAA AAT

TAT

GTT

CAT

TAT

ATC

ATA

CAG

TTA

CAA

GGA

GAT

GAT

ATA

AGT

1776

Lys Asn

Tyr

Val

His

Tyr

Ile

Ile

Gin

Leu

Gin

Gly

Asp

Asp

Ile

Ser

580

585

590

TAT GAA

GCA

ACA

TGC

AAT

TTA

TTT

TCT

AAA

AAT

CCT

AAA

AAT

AGT

ATT

1824

Tyr Glu

Ala

Thr

Cys

Asn

Leu

Phe

Ser

Lys

Asn

Pro

Lys

Asn

Ser

Ile

595

600

605

ATT ATA

CAA

CGA

AAT

ATG

AAT

GAA

AGT

GCA

AAA

AGC

TAC

TTT

TTA

AGT

1872

Ile Ile

Gin

Arg

Asn

Met

Asn

Glu

Ser

Ala

Lys

Ser

Tyr

Phe

Leu

Ser

610

615

620

GAT GAT

GGA

GAA

TCT

ATT

TTA

GAA

TTA

AAT

AAA

TAT

AGG

ATA

CCT

GAA

1920

Asp Asp

Gly

Glu

Ser

Ile

Leu

Glu

Leu

Asn

Lys

Tyr

Arg

Ile

Pro

Glu

625

630

635

640

AGA TTA

AAA

AAT

AAG

GAA

AAA

GTA

AAA

GTA

ACC

TTT

ATT

GGA

CAT

GGT

1968 • · • · · · · ·

• · · · · • · · ' • · · 4

• • · •

• • • • ·

• • · • • · ·

« · • · · • • ·

• ·

• ·

Arg Leu

Lys

Asn

Lys

Glu

Lys

Val

Lys

Val

Thr

Phe

Ile

Gly

His

Gly

645

650

655

AAA GAT

GAA

TTC

AAC

ACA

AGC

GAA

TTT

GCT

AGA

TTA

AGT

GTA

GAT

TCA

2016 Lys Asp

Glu

Phe

Asn

Thr

Ser

Glu

Phe

Ala

Arg

Leu

Ser

Val

Asp

Ser

660

665

670

CTT TCC

AAT

GAG

ATA

AGT

TCA

TTT

TTA

GAT

ACC

ATA

AAA

TTA

GAT

ATA

2064 Leu Ser

Asn

Glu

Ile

Ser

Ser

Phe

Leu

Asp

Thr

Ile

Lys

Leu

Asp

Ile

675

680

685

TCA.CCT

AAA

AAT

GTA

GAA

GTA

AAC

TTA

CTT

GGA

TGT

AAT

ATG

TTT

AGT

2112 Ser Pro

Lys

Asn

Val

Glu

Val

Asn

Leu

Leu

Gly

Cys

Asn

Met

Phe

Ser

690

695

700

TAT GAT

TTT

AAT

GTT

GAA

GAA

ACT

TAT

CCT

GGG

AAG

TTG

CTA

TTA

AGT

2160 Tyr Asp

Phe

Asn

Val

Glu

Glu

Thr

Tyr

Pro

Gly

Lys

Leu

Leu

Leu

Ser

705

710

715

720

ATT ATG

GAC

AAA

ATT

ACT

TCC

ACT

TTA

CCT

GAT

GTA

AAT

AAA

AAT

TCT

2208 Ile Met

Asp

Lys

Ile

Thr

Ser

Thr

Leu

Pro

Asp

Val

Asn

Lys

Asn

Ser

725

730

735

ATT ACT

ATA

GGA

GCA

AAT

CAA

TAT

GAA

GTA

AGA

ATT

AAT

AGT

GAG

GGA

2256 Ile Thr

Ile

Gly

Ala

Asn

Gin

Tyr

Glu

Val

Arg

Ile

Asn

Ser

Glu

Gly

740

745

750

AGA AAA 2304

GAA

CTT

CTG

GCT

CAC

TCA

GGT

AAA

TGG

ATA

AAT

AAA

GAA

GAA

Arg Lys

Glu

Leu

Leu

Ala

His

Ser

Gly

Lys

Trp

Ile

Asn

Lys

Glu

Glu

755

760

765

GCT ATT

ATG

AGC

GAT

TTA

TCT

AGT

AAA

GAA

TAC

ATT

TTT

TTT

GAT

TCT

2352 Ala Ile

Met

Ser

Asp

Leu

Ser

Ser

Lys

Glu

Tyr

Ile

Phe

Phe

Asp

Ser

770

775

780

ATA GAT 2400

AAT

AAG

CTA

AAA

GCA

AAG

TCC

AAG

AAT

ATT

CCA

GGA

TTA

GCA

Ile Asp

Asn

Lys

Leu

Lys

Ala

Lys

Ser

Lys

Asn

Ile

Pro

Gly

Leu

Ala

785

790

795

800

TCA ATA

TCA

GAA

GAT

ATA

AAA

ACA

TTA

TTA

CTT

GAT

GCA

AGT

GTT

AGT

2448 Ser Ile

Ser

Glu

Asp

Ile

Lys

Thr

Leu

Leu

Leu

Asp

Ala

Ser

Val

Ser

805

810

815

CCT GAT 2496

ACA

AAA

TTT

ATT

TTA

AAT

AAT

CTT

AAG

CTT

AAT

ATT

GAA

TCT

Pro Asp

Thr

Lys

Phe

Ile

Leu

Asn

Asn

Leu

Lys

Leu

Asn

Ile

Glu

Ser

820

825

830

TCT ATT

GGG

GAT

TAC

ATT

TAT

TAT

GAA

AAA

TTA

GAG

CCT

GTT

AAA

AAT

2544 Ser Ile

Gly

Asp

Tyr

Ile

Tyr

Tyr

Glu

Lys

Leu

Glu

Pro

Val

Lys

Asn

835

840

845

ATA

ATT

CAC

AAT

TCT

ATA

GAT

GAT

TTA

ATA

GAT

GAG

TTC

AAT

CTA

CTT

2592 Ile

Ile

His

Asn

Ser

Ile

Asp

Asp

Leu

Ile

Asp

Glu

Phe

Asn

Leu

Leu

850

655

860

GAA AAT GTA TCT GAT GAA TTA TAT GAA TTA AAA AAA TTA AAT AAT CTA 2640 • ·

• ·	•	• ·	• · · --
• ·	• · ·	• ·	• ·
• ·	• ·	• · ·	• · · ·
4 ·	• 4	• ·
• ·	• 4	• ·	• ··' · ·

Glu Asn 865	Val	Ser Asp	Glu 870	Leu Tyr Glu Leu Lys 875	Lys	Leu Asn	Asn	Leu 880
GAT GAG 2688	AAG	TAT TTA	ATA	TCT TTT GAA GAT ATC	TCA	AAA AAT	AAT	TCA
Asp Glu	Lys	Tyr Leu 885	Ile	Ser Phe Glu Asp Ile 890	Ser	Lys Asn	Asn 895	Ser
ACT TAC 2736	TCT	GTA AGA	TTT	ATT AAC AAA AGT AAT	GGT	GAG TCA	GTT	TAT
Thr Tyr	Ser	Val Arg 900	Phe	Ile Asn Lys Ser Asn 905	Gly	Glu Ser 910	Val	Tyr
GTA GAA 2784	ACA	GAA AAA	GAA	ATT TTT TCA AAA TAT	AGC	GAA CAT	ATT	ACA
Val Glu	Thr 915	Glu Lys	Glu	Ile Phe Ser Lys Tyr 920	Ser	Glu His 925	Ile	Thr
AAA GAA 2832	ATA	AGT ACT	ATA	AAG AAT AGT ATA ATT	ACA	GAT GTT	AAT	GGT
Lys Glu 930	Ile	Ser Thr	Ile	Lys Asn Ser Ile Ile 935	Thr 940	Asp Val	Asn	Gly
AAT TTA 2880	TTG	GAT AAT	ATA	CAG TTA GAT CAT ACT	TCT	CAA GTT	AAT	ACA
Asn Leu 945	Leu	Asp Asn	Ile 950	Gin Leu Asp His Thr 955	Ser	Gin Val	Asn	Thr 960
TTA AAC 2928	GCA	GCA TTC	TTT	ATT CAA TCA TTA ATA	GAT	TAT AGT	AGC	AAT
Leu Asn	Ala	Ala Phe 965	Phe	Ile Gin Ser Leu Ile 970	Asp	Tyr Ser	Ser 975	Asn
AAA GAT 2976	GTA	CTG AAT	GAT	TTA AGT ACC TCA GTT	AAG	GTT CAA	CTT	TAT
Lys Asp	Val	Leu Asn 980	Asp	Leu Ser Thr Ser Val 985	Lys	Val Gin 990	Leu	Tyr
GCT CAA 3024	CTA	TTT AGT	ACA	GGT TTA AAT ACT ATA	TAT	GAC TCT	ATC	CAA
Ala Gin	Leu 995	Phe Ser	Thr	Gly Leu Asn Thr Ile 1000	Tyr	Asp Ser 1005	Ile	Gin
TTA GTA 3072	AAT	TTA ATA	TCA	AAT GCA GTA AAT GAT	ACT	ATA AAT	GTA	CTA
Leu Val Asn 1010	Leu Ile	Ser	Asn Ala Val Asn Asp 1015	Thr Ile Asn 1020	Val	Leu
CCT ACA 3120	ATA	ACA GAG	GGG	ATA CCT ATT GTA TCT	ACT	ATA TTA	GAC	GGA
Pro Thr 1025	Ile	Thr Glu	Gly Ile Pro Ile Val Ser Thr 1030 1035	Ile Leu	Asp	Gly 1040
ATA AAC 3168	TTA	GGT GCA	GCA	ATT AAG GAA TTA CTA	GAC	GAA CAT	GAC	CCA
Ile Asn	Leu	Gly Ala Ala 1045	Ile Lys Glu Leu Leu 1050	Asp	Glu His	Asp Pro 1055
TTA CTA 3216	AAA	AAA GAA	TTA	GAA GCT AAG GTG GGT	GTT	TTA GCA	ATA	AAT
Leu Leu	Lys	Lys Glu 1060	Leu	Glu Ala Lys Val Gly 1065	Val	Leu Ala Ile 1070	Asn
ATG TCA 3264	TTA	TCT ATA	GCT	GCA ACT GTA GCT TCA	ATT	GTT GGA	ATA	GGT
Met Ser	Leu Ser Ile 1075	Ala	Ala Thr Val Ala Ser 1080	Ile	Val Gly 1085	Ile	Gly
GCT GAA	GTT	ACT ATT	TTC	TTA TTA CCT ATA GCT	GGT	ATA TCT	GCA	GGA

3312

32T

Ala Glu Val 1090	Thr	Ile	Phe	Leu Leu 1095	Pro	Ile	Ala	Gly Ile 1100 .	Ser Ala	Gly
ATA CCT TCA 3360	TTA	GTT	AAT	AAT GAA	TTA	ATA	TTG	CAT GAT	AAG GCA	ACT
Ile Pro Ser 1105	Leu	Val	Asn 1110	Asn Glu 1	Leu	Ile	Leu 1115	His Asp	Lys Ala	Thr 1120
TCA GTG GTA 3408	AAC	TAT	TTT	AAT CAT	TTG	TCT	GAA	TCT AAA	AAA TAT	GGC
Ser Val Val	Asn	Tyr 1125	Phe	Asn His	Leu	Ser 113C	Glu 1	Ser Lys	Lys Tyr 1135	Gly
CCT CTT AAA 3456	ACA	GAA	GAT	GAT AAA	ATT	TTA	GTT	CCT ATT	GAT GAT	TTA
Pro Leu Lys	Thr 114C	Glu 1	Asp	Asp Lys	Ile 1145	Leu	Val	Pro Ile	Asp Asp 1150	Leu
GTA ATA TCA 3504	GAA	ATA	GAT	TTT AAT	AAT	AAT	TCG	ATA AAA	CTA GGA	ACA
Val Ile Ser Glu 1155	Ile	Asp	Phe Asn 116C	Asn 1	Asn	Ser	Ile Lys 1165	Leu Gly	Thr
TGT AAT ATA 3552	TTA	GCA	ATG	GAG GGG	GGA	TCA	GGA	CAC ACA	GTG ACT	GGT
Cys Asn Ile 1170	Leu	Ala	Met	Glu Gly 1175	Gly	Ser	Gly	His Thr 1180	Val Thr	Gly
AAT ATA GAT 3600	CAC	TTT	TTC	TCA TCT	CCA	TCT	ATA	AGT/ TCT	CAT ATT	CCT
Asn Ile Asp 1185	His	Phe	Phe Ser Ser 1190	Pro	Ser	Ile Ser Ser 1195	His Ile	Pro 1200
TCA TTA TCA 3648	ATT	TAT	TCT	GCA ATA	GGT	ATA	GAA	ACA GAA	AAT CTA	GAT
Ser Leu Ser	Ile	Tyr Ser 1205	Ala Ile	Gly	Ile Glu 1210	Thr Glu	Asn Leu Asp 1215
TTT TCA AAA 3696	AAA	ATA	ATG	ATG TTA	CCT	AAT	GCT	CCT TCA	AGA GTG	TTT
Phe Ser Lys	Lys Ile 1220	Met	Met Leu	Pro Asn 1225	Ala	Pro Ser	Arg Val 1230	Phe
TGG TGG GAA 3744	ACT	GGA	GCA	GTT CCA	GGT	TTA	AGA	TCA TTG	GAA AAT	GAC
Trp Trp Glu Thr 1235	Gly	Ala	Val Pro Gly 1240	Leu	Arg	Ser Leu Glu Asn 1245	Asp
GGA ACT AGA 3792	TTA	CTT	GAT	TCA ATA	AGA	GAT	TTA	TAC CCA	GGT AAA	TTT
Gly Thr Arg 1250	Leu	Leu	Asp	Ser Ile 1255	Arg	Asp	Leu	Tyr Pro 1260	Gly Lys	Phe
TAC TGG AGA 3840	TTC	TAT	GCT	TTT TTC	GAT	TAT	GCA	ATA ACT	ACA TTA	AAA
Tyr Trp Arg 1265	Phe	Tyr	Ala Phe Phe 1270	Asp	Tyr	Ala Ile Thr 1275	Thr Leu	Lys 1280
CCA GTT TAT 3888	GAA	GAC	ACT	AAT ATT	AAA	ATT	AAA	CTA GAT	AAA GAT	ACT
Pro Val Tyr	Glu	Asp Thr 1285	Asn Ile	Lys	Ile Lys 1290	Leu Asp	Lys Asp Thr 1295
AGA AAC TTC 3936	ATA	ATG	CCA	ACT ATA	ACT	ACT	AAC	GAA ATT	AGA AAC	AAA
Arg Asn Phe	I-le Met 1300	Pro	Thr Ile	Thr Thr 1305	Asn	Glu Ile	Arg Asn 1310	Lys
TTA TCT TAT 3984	TCA	TTT	GAT	GGA GCA	GGA	GGA	ACT	TAC TCT	TTA TTA	TTA

Leu Ser	Tvr Ser 1315	Phe Asp Gly Ala Gly Gly Thr Tyr Ser Leu Leu Leu
1320	1325
TCT TCA 4032	TAT CCA	ATA TCA ACG AAT ATA	AAT TTA TCT AAA GAT GAT TTA
Ser Ser 133C	Tyr Pro 1	Ile Ser Thr Asn Ile 1335	Asn Leu Ser Lys Asp Asp Leu 1340
TGG ATA 4080	TTT AAT	ATT GAT AAT GAA GTA	AGA GAA ATA TCT ATA GAA AAT
Trp Ile 1345	Phe Asn	Ile Asp Asn Glu Val 1350	Arg Glu Ile Ser Ile Glu Asn 1355 1360
GGT ACT 4128	ATT AAA	AAA GGA AAG TTA ATA	AAA GAT GTT TTA AGT AAA ATT
Gly Thr	Ile Lys	Lys Gly Lys Leu Ile 1365	Lys Asp Val Leu Ser Lys Ile 1370 1375
GAT ATA 4176	AAT AAA	AAT AAA CTT ATT ATA	GGC AAT CAA ACA ATA GAT TTT
Asp Ile	Asn Lys Asn Lys Leu Ile Ile Gly Asn Gin Thr Ile Asp Phe 1380 1385 1390
TCA GGC 4224	GAT ATA	GAT AAT AAA GAT AGA	TAT ATA TTC TTG ACT TGT GAG
Ser Gly	Asp Ile 1395	Asp Asn Lys Asp Arg 1400	Tyr Ile Phe Leu Thr Cys Glu 1405
TTA GAT 4272	GAT AAA	ATT AGT TTA ATA ATA	GAA ATA AAT CTT GTT GCA AAA
Leu Asp Asp Lys 1410	Ile Ser peu Ile Ile 1415	Glu Ile Asn Leu Val Ala Lys 1420
TCT TAT 4320	AGT TTG	TTA TTG TCT GGG GAT	AAA AAT TAT TTG ATA TCC AAT
Ser Tyr 1425	Ser Leu	Leu Leu Ser Gly Asp 1430	Lys Asn Tyr Leu Ile Ser Asn 1435 1440
TTA TCT 4368	AAT ACT	ATT GAG AAA ATC AAT	ACT TTA GGC CTA GAT AGT AAA
Leu Ser	Asn Thr	Ile Glu Lys Ile Asn	Thr Leu Gly Leu Asp Ser Lys

1445 1450 1455

AAT ATA

GCG

TAC AAT

TAC

ACT

GAT

GAA

TCT

AAT

AAT

AAA

TAT

TTT

GGA

4416 Asn Ile

Ala

Tyr Asn 1460

Tyr

Thr

Asp

Glu 146E

Ser

Asn

Asn

Lys

Tyr Phe 1470

Gly

GCT ATA

TCT

AAA ACA

AGT

CAA

AAA

AGC

ATA

ATA

CAT

TAT

AAA

AAA

GAC

4464 Ala Ile

Ser Lys Thr 1475

Ser

Gin

Lys Ser 1480

Ile

Ile

His

Tyr Lys 1485

Lys

Asp

AGT AAA

AAT

ATA TTA

GAA

TTT

TAT

AAT

GAC

AGT

ACA

TTA

GAA

TTT

AAC

4512

Ser	Lys Asn 1490	Ile	Leu Glu Phe Tyr Asn Asp Ser Thr Leu Glu Phe	Asn
1495	1500
AGT	AAA GAT	TTT	ATT GCT GAA GAT	ATA AAT GTA TTT ATG AAA GAT	GAT
4560
Ser	Lys Asp	Phe	Ile Ala Glu Asp	Ile Asn Val Phe Met Lys Asp	Asp
1505		1510	1515	1520
ATT	AAT ACT	ATA	ACA GGA AAA TAC	TAT GTT GAT AAT AAT ACT GAT	AAA
4608
xle	Asn Thr	Ile	Thr Gly Lys Tyr	Tyr Val Asp Asn Asn Thr Asp	Lys
			1525	1530 1535
AGT	ATA GAT	TTC	TCT ATT TCT TTA	GTT AGT AAA AAT CAA GTA AAA	GTA

4656 • · · · » · · 4 » · · 4 • » · * • · · · • · 4 «« ··

Ser Ile Asp	Phe Ser 1540	Ile	Ser	Leu	Val 1545	Ser	Lys	Asn	Gin	Val Lvs 1550	Val
AAT GGA TTA 4704	TAT TTA	AAT	GAA	TCC	GTA	TAC	TCA	TCT	TAC	CTT GAT	TTT
Asn Gly Leu 1555	Tyr Leu	Asn	Glu	Ser 156C	Val 1	Tyr	Ser	Ser	Tyr 1565	Leu Asp	Phe
GTG AAA AAT 4752	TCA GAT	GGA	CAC	CAT	AAT	ACT	TCT	AAT	TTT	ATG AAT	TTA
Val Lys Asn 1570	Ser Asp	Gly	His 1575	His	Asn	Thr	Ser	Asn Phe 1580	Met Asn	Leu
TTT TTG GAC 4800	AAT ATA	AGT	TTC	TGG	AAA	TTG	TTT	GGG	TTT	GAA AAT	ATA
Phe Leu Asp 1585	Asn Ile	Ser 1590	Phe 1	Trp	Lys	Leu	Phe 1595	Gly	Phe	Glu Asn	Ile 1600
AAT TTT GTA 4848	ATC GAT	AAA	TAC	TTT	ACC	CTT	GTT	GGT	AAA	ACT AAT	CTT
Asn Phe Val	Ile Asp Lys 1605	Tyr	Phe	Thr	Leu 161C	Val )	Gly	Lys	Thr Asn Leu 1615
GGA TAT GTA 4896	GAA TTT	ATT	TGT	GAC	AAT	AAT	AAA	AAT	ATA	GAT ATA	TAT
Gly Tyr Val	Glu Phe 1620	Ile	Cys	Asp	Asn 1625	Asn	Lys	Asn	Ile	Asp Ile 1630	Tyr
TTT GGT GAA 4944	TGG AAA	ACA	TCG	TCA	TCT	AAA	AGC	ACT	ATA	TTT AGC	GGA
Phe Gly Glu Trp Lys 1635	Thr	Ser	Ser Ser 1640	Lys	Ser	Thr	Ile Phe Ser 1645	Gly
AAT GGT AGA 4992	AAT GTT	GTA	GTA	GAG	CCT	ATA	TAT	AAT	CCT	GAT ACG	GGT
Asn Gly Arg 1650	Asn Val	Val	Val Glu 1655	Pro	Ile	Tyr	Asn Pro 1660	Asp Thr	Gly
GAA GAT ATA 5040	TCT ACT	TCA	CTA	GAT	TTT	TCC	TAT	GAA	CCT	CTC TAT	GGA
Glu Asp Ile 1665	Ser Thr	Ser Leu 1670	Asp	Phe	Ser	Tyr Glu 1675	Pro	Leu Tyr	Gly 1680
ATA GAT AGA 5088	TAT ATA	AAT	AAA	GTA	TTG	ATA	GCA	CCT	GAT	TTA TAT	ACA
Ile Asp Arg	Tyr Ile Asn 1685	Lys	Val	Leu	Ile Ala 1690	Pro	Asp	Leu Tyr Thr 1695
AGT TTA ATA 5136	AAT ATT	AAT	ACC	AAT	TAT	TAT	TCA	AAT	GAG	TAC TAC	CCT
Ser Leu Ile	Asn Ile 1700	Asn	Thr	Asn	Tyr Tyr 1705	Ser	Asn	Glu	Tyr Tyr 1710	Pro
GAG ATT ATA 5184	GTT CTT	AAC	CCA	AAT	ACA	TTC	CAC	AAA	AAA	GTA AAT	ATA
Glu Ile Ile Val Leu 1715	Asn	Pro	Asn Thr 1720	Phe	His	Lys	Lys Val Asn 1725	Ile
AAT TTA GAT 5232	AGT TCT	TCT	TTT	GAG	TAT	AAA	TGG	TCT	ACA	GAA GGA	AGT
Asn Leu Asp 1730	Ser Ser	Ser	Phe Glu 1735	Tyr	Lys	Trp	Ser Thr 1740	Glu Gly	Ser
GAC TTT ATT 5280	TTA GTT	AGA	TAC	TTA	GAA	GAA	AGT	AAT	AAA	AAA ATA	TTA
Asp Phe Ile 1745	Leu Val	Arg Tyr 1750	Leu	Glu	Glu	Ser Asn 1755	Lys	Lys Ile	Leu 1760
CAA AAA ATA 5328	AGA ATC	AAA	GGT	ATC	TTA	TCT	AAT	ACT	CAA	TCA TTT	AAT

• ·

-	• · · • · · · · • · · · • · · ·	• • • · • • 4	·. · • • • » ·	• • • •
• ·	• ·
Gin Lys Ile Arg Ile Lys Gly Ile Leu Ser	Asn Thr	Gin	Ser	Phe	Asn
1765 1770			1775
AAA ATG AGT ATA GAT TTT AAA GAT ATT AAA	AAA CTA	TCA	TTA	GGA	TAT
5376
Lys Met Ser Ile Asp Phe Lys Asp Ile Lys	Lys Leu	Ser	Leu	Gly	Tyr
1780 1785			1790
ATA ATG AGT AAT TTT AAA TCA TTT AAT TCT	GAA AAT	GAA	TTA	GAT	AGA
5424
Ile Met Ser Asn Phe Lys Ser Phe Asn Ser	Glu Asn	Glu	Leu	Asp	Arg
1795 1800		1805
GAT CAT TTA GGA TTT AAA ATA ATA GAT AAT	AAA ACT	TAT	TAC	TAT	GAT
5472
Asp His Leu Gly Phe Lys Ile Ile Asp Asn	Lys Thr	Tyr	Tyr	Tyr	Asp
1810 ’ 1815	1820
GAA GAT AGT AAA TTA GTT AAA GGA TTA ATC	AAT ATA	AAT	AAT	TCA	TTA
5520
Glu Asp Ser Lys Leu Val Lys Gly Leu Ile	Asn Ile	Asn	Asn	Ser	Leu
1825 1830	1835				1840
TTC TAT TTT GAT CCT ATA GAA TTT AAC TTA	GTA ACT	GGA	TGG	CAA	ACT
5568
Phe Tyr Phe Asp Pro Ile Glu Phe Asn Leu	Val Thr	Gly	Trp	Gin	Thr
1845 1850			1855
ATC AAT GGT AAA AAA TAT TAT TTT GAT ATA	AAT ACT	GGA	GCA	GCT	TTA
5616
Ile Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Asp Ile	Asn Thr	Gly	Ala	Ala	Leu
1860 1865			1870
ACT AGT TAT AAA ATT ATT AAT GGT AAA CAC	TTT TAT	TTT	AAT	AAT	GAT
5664
Thr Ser Tyr Lys Ile Ile Asn Gly Lys His	Phe Tyr	Phe	Asn	Asn	Asp
1875 1880		1885
GGT GTG ATG CAG TTG GGA GTA TTT AAA GGA	CCT GAT	GGA	TTT	GAA	TAT
5712
Gly Val Met Gin Leu Gly Val Phe Lys Gly	Pro Asp	Gly	Phe	Glu	Tyr
1890 1895	1900
TTT GCA CCT GCC AAT ACT CAA AAT AAT AAC	ATA GAA	GGT	CAG	GCT	ATA
5760
Phe Ala Pro Ala Asn Thr Gin Asn Asn Asn	Ile Glu	Gly	Gin	Ala	Ile
1905 1910	1915				1920
GTT TAT CAA AGT AAA TTC TTA ACT TTG AAT	GGC AAA	AAA	TAT	TAT	TTT
5808
Val Tyr Gin Ser Lys Phe Leu Thr Leu Asn	Gly Lys	Lys	Tyr	Tyr	Phe
1925 1930			1935
GAT AAT AAC TCA AAA GCA GTC ACT GGA TGG	AGA ATT	ATT	AAC	AAT	GAG
5856
Asp Asn Asn Ser Lys Ala Val Thr Gly Trp	Arg Ile	Ile	Asn	Asn	Glu
1940 1945			1950
AAA TAT TAC TTT AAT CCT AAT AAT GCT ATT	GCT GCA	GTC	GGA	TTG	CAA
5904
Lys Tyr Tyr Phe Asn Pro Asn Asn Ala Ile	Ala Ala	Val	Gly	Leu	Gin
1955 1960		1965
GTA ATT GAC AAT AAT AAG TAT TAT TTC AAT	CCT GAC	ACT	GCT	ATC	ATC
5952
Val Ile Asp Asn Asn Lys Tyr Tyr Phe Asn	Pro Asp	Thr	Ala	Ile	Ile
1970 1975	1980

TCA AAA GGT TGG CAG ACT GTT AAT GGT AGT AGA TAC TAC TTT GAT ACT 6000

Ser Lys 1985	Gly	Trp Gin Thr Val Asn Gly Ser Arg Tyr	Tyr <	Phe	Asp	Thr 2000
1990	1995
GAT ACC 6048	GCT	ATT GCC TTT AAT GGT	TAT AAA ACT ATT	GAT	GGT	AAA	CAC
Asp Thr	Ala	Ile Ala Phe Asn Gly 2005	Tyr Lys Thr Ile 2010	Asp	Gly	Lys 2015	His
TTT TAT 6096	TTT	GAT AGT GAT TGT GTA	GTG AAA ATA GGT	GTG	TTT	AGT	ACC
Phe Tyr	Phe	Asp Ser Asp Cys Val 2020	Val Lys Ile Gly 2025	Val	Phe Ser 2030	Thr
TCT AAT 6144	GGA	TTT GAA TAT TTT GCA	CCT GCT AAT ACT	TAT	AAT	AAT	AAC
Ser Asn	Gly Phe Glu Tyr Phe Ala 2035 204C	Pro Ala Asn Thr 1	Tyr 2045	Asn	Asn	Asn
ATA GAA 6192	GGT	CAG GCT ATA GTT TAT	CAA AGT AAA TTC	TTA	ACT	TTG	AAT
Ile Glu Gly 2050	Gin Ala Ile Val Tyr 2055	Gin Ser Lys Phe Leu 2060	Thr	Leu	Asn
GGT AAA 6240	AAA	TAT TAC TTT GAT AAT	AAC TCA AAA GCA	GTT	ACC	GGA	TTG
Gly Lys 2065	Lys	Tyr Tvr Phe Asp Asn 2070	Asn Ser Lys Ala 2075	Val	Thr	Gly	Leu 2080
CAA ACT 6288	ATT	GAT AGT AAA AAA TAT	TAC TTT AAT ACT	AAC	ACT	GCT	GAA
Gin Thr	Ile	Asp Ser Lys Lys Tyr 2085	Tyr Phe Asn Thr 2090	Asn	Thr	Ala Glu 2095
GCA GCT 6336	ACT	GGA TGG CAA ACT ATT	GAT GGT AAA AAA	TAT	TAC	TTT	AAT
Ala Ala	Thr	Gly Trp Gin Thr Ile 2100	Asp Gly Lys Lys 2105	Tyr	Tyr Phe 2110	Asn
ACT AAC 6384	ACT	GCT GAA GCA GCT ACT	GGA TGG CAA ACT	ATT	GAT	GGT	AAA
Thr Asn	Thr Ala Glu Ala Ala Thr Gly Trp Gin Thr 2115 2120	Ile Asp 2125	Gly	Lys
AAA TAT 6432	TAC	TTT AAT ACT AAC ACT	GCT ATA GCT TCA	ACT	GGT	TAT	ACA
Lys Tyr Tyr 2130	Phe Asn Thr Asn Thr 2135	Ala Ile Ala Ser Thr 2140	Gly	Tyr	Thr
ATT ATT 6480	AAT	GGT AAA CAT TTT TAT	TTT AAT ACT GAT	GGT	ATT	ATG	CAG
Ile Ile 2145	Asn	Gly Lys His Phe Tyr 2150	Phe Asn Thr Asp 2155	Gly	Ile	Met	Gin 2160
ATA GGA 6528	GTG	TTT AAA GGA CCT AAT	GGA TTT GAA TAT	TTT	GCA	CCT	GCT
Ile Gly	Val	Phe Lys Gly Pro Asn 2165	Gly Phe Glu Tyr 2170	Phe	Ala	Pro Ala 2175
AAT ACG 6576	GAT	GCT AAC AAC ATA GAA	GGT CAA GCT ATA	CTT	TAC	CAA	AAT
Asn Thr	Asp	Ala Asn Asn Ile Glu 2180	Gly Gin Ala Ile 2185	Leu	Tyr Gin 2190	Asn
GAA TTC 6624	TTA	ACT TTG AAT GGT AAA	AAA TAT TAC TTT	GGT	AGT	GAC	TCA
Glu Phe	Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe 2195 2200	Gly Ser 2205	Asp	Ser
AAA GCA	GTT	ACT GGA TGG AGA ATT	ATT AAC AAT AAG	AAA	TAT	TAC	TTT

6672 • ·

	• • • 4	• · · ·	• · • · • · • ·	• • • · · ·	• • · · • ·
• · • · ».·	• · • 1 ·
Lys Ala Val Thr Gly Trp Arg	Ile Ile Asn Asn	Lys	Lys	Tyr	Tyr	Phe
2210 2215	2220
AAT CCT AAT AAT GCT ATT GCT	GCA ATT CAT CTA	TGC	ACT	ATA	AAT	AAT
6720
Asn Pro Asn Asn Ala Ile Ala	Ala Ile His Leu	Cys	Thr	Ile	Asn	Asn
2225 2230	2235				2240
GAC AAG TAT TAC TTT AGT TAT	GAT GGA ATT CTT	CAA	AAT	GGA	TAT	ATT
6768
Asp Lys Tyr Tyr Phe Ser Tyr	Asp Gly Ile Leu	Gin	Asn	Gly	Tyr	Ile
2245	2250				2255
ACT ATT GAA AGA AAT AAT TTC	TAT TTT GAT GCT	AAT	AAT	GAA	TCT	AAA
6816
Thr Ile Glu Arg Asn Asn Phe	Tyr Phe Asp Ala	Asn	Asn	Glu	Ser	Lys
2260	2265			2270
ATG GTA ACA GGA GTA TTT AAA	GGA CCT AAT GGA	TTT	GAG	TAT	TTT	GCA
6864
Met Val Thr Gly Val Phe Lys	Gly Pro Asn Gly	Phe	Glu	Tyr	Phe	Ala
2275	2280		2285
CCT GCT AAT ACT CAC AAT AAT	AAC ATA GAA GGT	CAG	GCT	ATA	GTT	TAC
6912
Pro Ala Asn Thr His Asn Asn	Asn Ile Glu Gly	Gin	Ala	Ile	Val	Tyr
2290 2295	2300
CAG AAC AAA TTC TTA ACT TTG	AAT GGC AAA AAA	TAT	TAT	TTT	GAT	AAT
6960
Gin Asn Lys Phe Leu Thr Leu	Asn Gly Lys Lys	Tyr	Tyr	Phe	Asp	Asn
2305 2310	2315				2320
GAC TCA AAA GCA GTT ACT GGA	TGG CAA ACC ATT	GAT	GGT	AAA	AAA	TAT
7008
Asp Ser Lys Ala Val Thr Gly	Trp Gin Thr Ile	Asp	Gly	Lys	Lys	Tyr
2325	2330				2335
TAC TTT AAT CTT AAC ACT GCT	GAA GCA GCT ACT	GGA	TGG	CAA	ACT	ATT
7056
Tyr Phe Asn Leu Asn Thr Ala	Glu Ala Ala Thr	Gly	Trp	Gin	Thr	Ile
2340	2345			2350
GAT GGT AAA AAA TAT TAC TTT	AAT CTT AAC ACT	GCT	GAA	GCA	GCT	ACT
7104
Asp Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe	Asn Leu Asn Thr	Ala	Glu	Ala	Ala	Thr
2355	2360		2365
GGA TGG CAA ACT ATT GAT GGT	AAA AAA TAT TAC	TTT	AAT	ACT	AAC	ACT
7152
Gly Trp Gin Thr Ile Asp Gly	Lys Lys Tyr Tyr	Phe	Asn	Thr	Asn	Thr
2370 2375	2380
TTC ATA GCC TCA ACT GGT TAT	ACA AGT ATT AAT	GGT	AAA	CAT	TTT	TAT
7200
Phe Ile Ala Ser Thr Gly Tyr	Thr Ser Ile Asn	Gly	Lys	His	Phe	Tyr
2385 2390	2395				2400
TTT AAT ACT GAT GGT ATT ATG	CAG ATA GGA GTG	TTT	AAA	GGA	CCT	AAT
7248
Phe Asn Thr Asp Gly Ile Met	Gin Ile Gly Val	Phe	Lys	Gly	Pro	Asn
2405	2410				2415
GGA TTT GAA TAC TTT GCA CCT	GCT AAT ACG GAT	GCT	AAC	AAC	ATA	GAA
7296
Gly Phe Glu Tyr Phe Ala Pro	Ala Asn Thr Asp	Ala	Asn	Asn	Ile	Glu
2420	2425			2430
GGT CAA GCT ATA CTT TAC CAA	AAT AAA TTC TTA	ACT	TTG	AAT	GGT	AAA
7344

J

Gly Gin Ala	Ile	Leu Tyr Gin Asn 2440	Lys	Phe Leu	Thr	Leu Asn 2445	Gly	Lys
	2435
AAA TAT 7392	TAC	TTT	GGT AGT GAC TCA	AAA	GCA GTT	ACC	GGA CTG	CGA	ACT
Lys Tyr 2450	Tyr 1	Phe	Gly Ser Asp Ser 2455	Lys	Ala Val	Thr 2460	Gly Leu 1	Arg	Thr
ATT GAT 7440	GGT	AAA	AAA TAT TAC TTT	AAT	ACT AAC	ACT	GCT GTT	GCA	GTT
Ile Asp 2465	Gly	Lys	Lys Tyr Tyr Phe 2470	Asn	Thr Asn 2475	Thr	Ala Val	Ala	Val 2480
ACT GGA 7488	TGG	CAA	ACT ATT AAT GGT	AAA	AAA TAC	TAC	TTT AAT	ACT	AAC
Thr Gly	Trp	Gin	Thr Ile Asn Gly 2485	Lys	Lys Tyr 2490	Tyr	Phe Asn	Thr 2495	Asn 1
ACT TCT 7536	ATA	GCT	TCA ACT GGT TAT	ACA	ATT ATT	AGT	GGT AAA	CAT	TTT
Thr Ser	Ile	Ala Ser Thr Gly Tyr 2500	Thr 2505	Ile Ile	Ser	Gly Lys His 2510	Phe
TAT TTT 7584	AAT	ACT	GAT GGT ATT ATG	CAG	ATA GGA	GTG	TTT AAA	GGA	CCT
Tyr Phe	Asn 2515	Thr	Aso Gly Ile Met Gin 2520	Ile Gly	Val	Phe Lys 2525	Gly	Pro
GAT GGA 7632	TTT	GAA	TAC TTT GCA CCT	GCT	AAT ACA	GAT	GCT AAC	AAT	ATA
Asp Gly Phe 2530	Glu	Tyr Phe Ala Pro 2535	Ala	Asn Thr	Asp Ala Asn 2540	Asn	Ile
GAA GGT 7680	CAA	GCT	ATA CGT TAT CAA	AAT	AGA TTC	CTA	TAT TTA	CAT	GAC
Glu Gly 2545	Gin	Ala	Ile Arg Tyr Gin 2550	Asn	Arg Phe Leu 2555	Tyr Leu	His	Asp 2560
AAT ATA 7728	TAT	TAT	TTT GGT AAT AAT	TCA	AAA GCG	GCT	ACT GGT	TGG	GTA
Asn Ile	Tyr	Tyr	Phe Gly Asn Asn 2565	Ser	Lys Ala 2570	Ala	Thr Gly	Tm Val 2575
ACT ATT 7776	GAT	GGT	AAT AGA TAT TAC	TTC	GAG CCT	AAT	ACA GCT	ATG	GGT
Thr Ile	Asp	Gly Asn Arg Tyr Tyr 2580	Phe Glu Pro 2585	Asn	Thr Ala Met 2590	Gly
GCG AAT 7824	GGT	TAT	AAA ACT ATT GAT	AAT	AAA AAT	TTT	TAC TTT	AGA	AAT
Ala Asn	Gly Tyr 2595	Lys Thr Ile Asp Asn 2600	Lys Asn	Phe	Tyr Phe 2605	Arg	Asn
GGT TTA 7872	CCT	CAG	ATA GGA GTG TTT	'aaa	GGG TCT	AAT	GGA TTT	GAA	TAC
Gly Leu Pro 2610	Gin	Ile Gly Val Phe 2615	Lys	Gly Ser	Asn Gly Phe 2620	Glu	Tyr
TTT GCA 7920	CCT	GCT	AAT ACG GAT GCT	AAC	AAT ATA	GAA	GGT CAA	GCT	ATA
Phe Ala 2625	Pro	Ala	Asn Thr Asp Ala 2630	Asn	Asn Ile Glu 2635	Gly Gin	Ala	Ile 2640
CGT TAT 7968	CAA	AAT	AGA TTC CTA CAT	TTA	CTT GGA	AAA	ATA TAT	TAC	TTT
Arg Tyr	Gin	Asn	Arg Phe Leu His	Leu	Leu Gly	Lys	Ile Tyr	Tyr	Phe

2645 2650 2655

GGT AAT AAT TCA AAA GCA GTT ACT GGA TGG CAA ACT ATT AAT GGT AAA 8016

Gly Asn

Asn

Ser

Lys

Ala

Val

Thr

Gly

Trp

Gin

Thr

Ile

Asn Gly

Lys

2660

2665

2670

GTA TAT

TAC

TTT

ATG

CCT

GAT

ACT

GCT

ATG

GCT

GCA

GCT

GGT GGA

CTT

8064

Val Tyr

Tyr

Phe

Met

Pro

Asp

Thr

Ala

Met

Ala

Ala

Ala

Gly Gly

Leu

2675

2680

2685

TTC GAG

ATT

GAT

GGT

GTT

ATA

TAT

TTC

TTT

GGT

GTT

GAT

GGA GTA

AAA

8112

%

Phe Glu

Ile

Asp

Gly

Val

Ile

Tyr

Phe

Phe

Gly

Val

Asp

Gly Val

Lys

2690 2695 2700

GCC CCT GGG ATA TAT GGC TAA

8133

Ala Pro Gly Ile Tyr Gly

2705 2710 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2710 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární

	(ii) (xi)	TYP MOLEKULY: protein	NO:	6 :
POPIS SEKVENCE:	SEQ ID
Met	Ser Leu	Ile Ser Lys Glu 5	Glu Leu	Ile 10	Lys Leu Ala Tvr Ser Ile 15
Arg	Pro Arg	Glu Asn Glu Tyr 20	Lys Thr 25	Ile	Leu Thr Asn Leu Asp Glu 30
Tyr	Asn Lys 35	Leu Thr Thr Asn	Asn Asn 40	Glu	Asn Lys Tyr Leu Gin Leu 45
Lys	Lys Leu 50	Asn Glu Ser Ile 55	Asp Val	Phe	Met Asn Lys Tyr Lys Thr 60
Ser 6 5	Ser Arg	Asn Arg Ala Leu 70	Ser Asn	Leu	Lvs Lvs Asp Ile Leu Lys 75 ' 80
Glu	Val Ile	Leu Ile Lys Asn 85	Ser Asn	Thr 90	Ser Pro Val Glu Lys Asn 95
Leu	His.Phe	Val Trp Ile Gly 100	Gly Glu 105	Val	Ser Asp Ile Ala Leu Glu 110
Tyr	Ile Lys 115	Gin Trp Ala Asp	Ile Asn 120	Ala	Glu Tyr Asn Ile Lys Leu 125
Trp	Tyr Asp 130	Ser Glu Ala Phe 135	Leu Val	Asn	Thr Leu Lys Lys Ala Ile 140
Val 145	Glu Ser	Ser Thr Thr Glu 150	Ala Leu	Gin	Leu Leu Glu Glu Glu Ile 155 1G0
Gin	Asn Pro	Gin Phe Asp Asn 165	Met Lys	Phe 170	Tyr Lys Lys Arg Met Glu 175
Phe	Ile Tyr	Asp Arg Gin Lys 180	Arg Phe 185	Ile	Asn Tyr Tyr Lys Ser Gin 190
Ile	Asn Lys 195	Pro Thr Val Pro	Thr Ile 200	Asp	Asp Ile Ile Lys Ser His 205
Leu	Val Ser 210	Glu Tyr Asn Arg 215	Asp Glu	Thr	Val Leu Glu Ser Tyr Arg 220

• · · · ··· · · · ... · • ···· · · · · ··· ·· · · ·· ··« ·· · ·

595 600

Ile	Ile 610	Gin	Arg	Asn	Met	Asn 615	Glu	Ser	Ala
Asp 625	Asp	Gly	Glu	Ser	Ile 630	Leu	Glu	Leu	Asn
Arg	Leu	Lys	Asn	Lys 645	Glu	Lys	Val	Lys	Val 650
Lys	Asp	Glu	Phe 660	Asn	Thr	Ser	Glu	Phe 665	Ala
Leu	Ser	Asn 675	Glu	Ile	Ser	Ser	Phe 680	Leu	Asp
Ser	Pro 690	Lys	Asn	Val	Glu	Val 695	Asn	Leu	Leu
Tyr 705	Asp	Phe	Asn	Val	Glu 710	Glu	Thr	Tyr	Pro
Ile	Met	Asp	Lys	Ile 725	Thr	Ser	Thr	Leu	Pro 730
Ile	Thr	Ile	Gly 740	Ala	Asn	Gin	Tyr	Glu 745	Val
Arg	Lys	Glu 755	Leu	Leu	Ala	His	Ser 760	Gly	Lys
Ala	Ile 770	Met	Ser	Asp	Leu	Ser 775	Ser	Lys	Glu
Ile 785	Asp	Asn	Lys	Leu	Lys 790	Ala	Lys	Ser	Lys
Ser	Ile	Ser	Glu	Asp 805	Ile	Lys	Thr	Leu	Leu 810
Pro	Asp	Thr	Lys 820	Phe	Ile	Leu	Asn	Asn 825	Leu
Ser	Ile	Gly 835	Asp	Tyr	Ile	Tyr	Tyr 840	Glu	Lys
Ile	Ile 850	His	Asn	Ser	Ile	Asp 855	Asp	Leu	Ile
Glu 865	Asn	Val	Ser	Asp	Glu 870	Leu	Tyr	Glu	Leu
Asp	Glu	Lys	Tyr	Leu 885	Ile	Ser	Phe	Glu	Asp 890
Thr	Tyr	Ser	Val 900	Arg	Phe	Ile	Asn	Lys 905	Ser
Val	Glu	Thr 915	Glu	Lys	Glu	Ile	Phe 920	Ser	Lys
Lys	Glu 930	Ile	Ser	Thr	Ile	Lys 935	Asn	Ser	Ile
Asn	Leu	Leu	Asp	Asn	Ile	Gin	Leu	Asp	His

945 950

605

Lys	Ser 620	Tyr	Phe	Leu	Ser
Lys 635	Tyr	Arg	Ile	Pro	Glu 640
Thr	Phe	Ile	Gly	His 655	Gly
Arg	Leu	Ser	Val 670	Asp	Ser
Thr	Ile	Lys 685	Leu	Asp	Ile
Gly	Cys 700	Asn	Met	Phe	Ser
Gly 715	Lys	Leu	Leu	Leu	Ser 72 0
Asp	Val	Asn	Lys	Asn 735	Ser
Arg	Ile	Asn	Ser 750	Glu	Gly
Trp	Ile	Asn 765	Lys	Glu	Glu
Tyr	He 780	Phe	Phe	Asp	Ser
Asn 795	Ile	Pro	Gly	Leu	Ala 800
Leu	Asp	Ala	Ser	Val 815	Ser
Lys	Leu	Asn	Ile 830	Glu	Ser
Leu	Glu	Pro 845	Val	Lys	Asn
Asp	Glu 860	Phe	Asn	Leu	Leu
Lys 875	Lys	Leu	Asn	Asn	Leu 880
Ile	Ser	Lys	Asn	Asn 895	Ser
Asn	Gly	Glu	Ser 910	Val	Tyr
Tyr	Ser	Glu 925	His	Ile	Thr
Ile	Thr 940	Asp	Val	Asn	Gly
Thr 955	Ser	Gin	Val	Asn	Thr 960

• ·

	• • • '·	• · • · • · • · • · • ·	» · ·· • • • ·	* * • • 1 · • ··	• · · • · • · • · • ·	• • • • · • ·
Leu Asn Ala Ala Phe Phe	Ile Gin Ser Leu Ile	Asp	Tyr	Ser	Ser	Asn
965	970				975
Lys Asp Val Leu Asn Asp	Leu Ser Thr Ser Val	Lys	Val	Gin	Leu	Tyr
980	985			990
Ala Gin Leu Phe Ser Thr	Gly Leu Asn Thr Ile	Tyr	Asp	Ser	Ile	Gin
995	1000		1005
Leu Val Asn Leu Ile Ser	Asn Ala Val Asn Asp	Thr	Ile	Asn	Val·	Leu
1010	1015	1020
Pro Thr Ile Thr Glu Gly	Ile Pro Ile Val Ser	Thr	Ile	Leu	Asp	Gly
1025 1030 1035				1040
Ile Asn Leu Gly Ala Ala	Ile Lys Glu Leu Leu	Asp	Glu	His	Asp	Pro
1045	1050				1055
Leu Leu Lys Lys Glu Leu	Glu Ala Lys Val Gly	Val	Leu	Ala	Ile	Asn
1060	1065			1070
Met Ser Leu Ser Ile Ala	Ala Thr Val Ala Ser	Ile	Val	Gly	Ile	Gly
1075	1080		1085
Ala Glu Val Thr Ile Phe	Leu Leu Pro Ile Ala	Gly	Ile	Ser	Ala	Gly
1090	1095	1100
Ile Pro Ser Leu Val Asn	Asn Glu Leu Ile Leu	His	Asp	Lys	Ala	Thr
1105 1110 1115				1120
Ser Val Val Asn Tyr Phe	Asn His Leu Ser Glu	Ser	Lys	Lys	Tyr	Gly
1125	1130				1135
Pro Leu Lys Thr Glu Asp	Asp Lys Ile Leu Val	Pro	Ile	Asp	Asp	Leu
1140	1145			1150
Val Ile Ser Glu Ile Asp	Phe Asn Asn Asn Ser	Ile	Lys	Leu	Gly	Thr
1155	1160		1165
Cys Asn Ile Leu Ala Met	Glu Gly Gly Ser Gly	His	Thr	Val	Thr	Gly
1170	1175	1180
Asn Ile Asp His Phe Phe	Ser Ser Pro Ser Ile	Ser	Ser	His	Ile	Pro
1185 1190 1195				1200
Ser Leu Ser Ile Tyr Ser	Ala Ile Gly Ile Glu	Thr	Glu	Asn	Leu	Asp
1205	1210				1215
Phe Ser Lys Lys Ile Met	Met Leu Pro Asn Ala	Pro	Ser	Arg	Val	Phe
1220	1225			1230
Trp Trp Glu Thr Gly Ala	Val Pro Gly Leu Arg	Ser	Leu	Glu	Asn	Asp
1235	1240		1245
Gly Thr Arg Leu Leu Asp	Ser Ile Arg Asp Leu	Tyr	Pro	Gly	Lys	Phe
1250	1255	1260
Tyr Trp Arg Phe Tyr Ala	Phe Phe Asp Tyr Ala	Ile	Thr	Thr	Leu	Lys
1265 1270 1275				1280

Pro Val Tyr Glu Asp Thr Asn Ile Lys Ile Lys Leu Asp Lys Asp Thr 1285 1290 1295 ·· ·· ·· · ·· ·· ··· · · · · ····, • · · · · · · · · · · · • · · · · · · · · · · · · ···· · · · ··· ·· ·· ·· ··· ·· ··

Arg Asn Phe Ile	Met Pro Thr Ile Thr	Thr Asn Glu Ile Arg	Asn Lys
1300	1305	131C	1
Leu Ser Tyr Ser 1315	Phe Asp Gly Ala Gly 1320	Gly Thr Tyr Ser Leu 1325	Leu Leu
Ser Ser Tyr Pro 1330	Ile Ser Thr Asn Ile 1335	Asn Leu Ser Lys Asp 1340	Asp Leu
Trp Ile Phe Asn	Ile Asp Asn Glu Val	Arg Glu Ile Ser Ile	Glu Asn
1345	1350	1355	1360
Gly Thr Ile Lys	Lys Gly Lys Leu Ile 1365	Lys Asp Val Leu Ser 1370	Lys Ile 1375
Asp Ile Asn Lys	Asn Lys Leu Ile Ile	Gly Asn Gin Thr Ile	Asp Phe
138C	» 1385	i 1390
Ser Gly Asp Ile 1395	Asp Asn Lys Asp Arg 1400	Tyr Ile Phe Leu Thr 1405	Cys Glu
Leu Asp Asp Lys 1410	Ile Ser Leu Ile Ile 1415	Glu Ile Asn Leu Val 1420	Ala Lys
Ser Tyr Ser Leu	Leu Leu Ser Gly Asp	Lys Asn Tyr Leu Ile	Ser Asn
1425	1430	1435	1440
Leu Ser Asn Thr	Ile Glu Lys Ile Asn 1445	Thr Leu Gly Leu Asp 1450	Ser Lys 1455
Asn Ile Ala Tyr	Asn Tyr Thr Asp Glu	Ser Asn Asn Lys Tyr	Phe Gly
1460 1465 1470
Ala Ile Ser Lys 1475	Thr Ser Gin Lys Ser 1480	Ile Ile His Tyr Lys 1485	Lys Asp
Ser Lys Asn Ile 1490	Leu Glu Phe Tyr Asn 1495	Asp Ser Thr Leu Glu 1500	Phe Asn
Ser Lys Asp Phe	Ile Ala Glu Asp Ile	Asn Val Phe Met Lys	Asp Asp
1505	1510	1515	1520
Ile Asn Thr Ile	Thr Gly Lys Tyr Tyr 1525	Val Asp Asn Asn Thr 1530	Asp Lys 1535
Ser Ile Asp Phe	Ser Ile Ser Leu Val	Ser Lys Asn Gin Val	Lys Val
1540 1545 1550
Asn Gly Leu Tyr 1555	Leu Asn Glu Ser Val 1560	Tyr Ser Ser Tyr Leu 1565	Asp Phe
Val Lys Asn Ser 1570	Asp Gly His His Asn 1575	Thr Ser Asn Phe Met 1580	Asn Leu
Phe Leu Asp Asn	Ile Ser Phe Trp Lys	Leu Phe Gly Phe Glu	Asn Ile
1585	1590	1595	1600
Asn Phe Val Ile	Asp Lys Tyr Phe Thr 1605	Leu Val Gly Lys Thr 1610	Asn Leu 1615
Gly Tyr Val Glu	Phe Ile Cys Asp Asn	Asn Lys Asn Ile Asp	Ile Tyr
1620 1625 1630

—333----·· ·· ·» · ·· ·· • · · ·'··« ···· • · · · · · · · · ··· • · 9 9 · · · · · ··· · · ····'·· · 9 9 9

99 «· ··· »· ··

Phe Gly Glu	Trp Lys Thr Ser Ser	Ser Lys Ser Thr Ile	Phe Ser Gly
1635	1640	1645
Asn Gly Arg 1650	Asn Val Val Val Glu 1655	Pro Ile Tyr Asn Pro 1660	Asp Thr Gly
Glu Asp Ile	Ser Thr Ser Leu Asp	Phe Ser Tyr Glu Pro	Leu Tyr Gly
1665	1670	1675	1680
Ile Asp Arg	Tyr Ile Asn Lys Val 1685	Leu Ile Ala Pro Asp 1690	Leu Tyr Thr 1695
Ser Leu Ile	Asn Ile Asn Thr Asn 1700	Tyr Tyr Ser Asn Glu 1705	Tyr Tyr Pro 1710
Glu Ile Ile	Val Leu Asn Pro Asn	Thr Phe His Lys Lys	Val Asn Ile
1715	i 172C	i 1725
Asn Leu Asp 1730	Ser Ser Ser Phe Glu 1735	Tyr Lys Trp Ser Thr 1740	Glu Gly Ser
Asp Phe Ile	Leu Val Arg Tyr Leu	Glu Glu Ser Asn Lys	Lys Ile Leu
1745	1750	1755	1760
Gin Lys Ile	Arg Ile Lys Gly Ile 1765	Leu Ser Asn Thr Gin 1770	Ser Phe Asn 1775
Lys Met Ser	Ile Asp Phe Lys Asp 1780	Ile Lys Lys Leu Ser 1785	Leu Gly Tyr 1790
Ile Met Ser	Asn Phe Lys Ser Phe	Asn Ser Glu Asn Glu	Leu Asp Arg
1795 1800 1805
Asp His Leu 1810	Gly Phe Lys Ile Ile 1815	Asp Asn Lys Thr Tyr 1820	Tyr Tyr Asp
Glu Asp Ser	Lys Leu Val Lys Gly	Leu Ile Asn Ile Asn	Asn Ser Leu
1825	1830	1835	1840
Phe Tyr Phe	Asp Pro Ile Glu Phe 1845	Asn Leu Val Thr Gly 1850	Trp Gin Thr 1855
Ile Asn Gly	Lys Lys Tyr Tyr Phe 1860	Asp Ile Asn Thr Gly 1865	Ala Ala Leu 1870
Thr Ser Tyr	Lys Ile Ile Asn Gly	Lys His Phe Tyr Phe	Asn Asn Asp
1875 1880 1885
Gly Val Met 1890	Gin Leu Gly Val Phe 1895	Lys Gly Pro Asp Gly 1900	Phe Glu Tyr
Phe Ala Pro	Ala Asn Thr Gin Asn	Asn Asn Ile Glu Gly	Gin Ala Ile
1905	' 1910	1915	1920
Val Tyr Gin	Ser Lys Phe Leu Thr 1925	Leu Asn Gly Lys Lys 1930	Tyr Tyr Phe 1935
Asp Asn Asn	Ser Lys Ala Val Thr 1940	Gly Trp Arg Ile Ile 1945	Asn Asn Glu 1950
Lvs Tyr Tyr	Phe Asn Pro Asn Asn	Ala Ile Ala Ala Val	Gly Leu Gin
1955 1960 1965

=334=

··

··

·· ·

•

«

• «

• · ··

•

t

• ··«

• · ·

•

4

9 4

•

» · · ·

• ·

«

• «

•

• · - ·

··

··

·· ··

• 4

Val

Ile

Asp

Asn

Asn

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Pro

Asp

Thr

Ala Ile

Ile

1970

1975

1980

Ser

Lys

Gly

Trp

Gin

Thr

Val

Asn

Gly

Ser

Arg

Tyr

Tyr

Phe Asp

Thr

1985

1990

1995

2000

Asp

Thr

Ala

Ile

Ala

Phe

Asn

Gly

Tyr

Lys

Thr

Ile

Asp

Gly Lys

His

2005

2010

2015

Phe

Tyr

Phe

Asp

Ser

Asp

Cys

Val

Val

Lys

Ile

Gly

Val

Phe Ser

Thr

2020

2025

2030

Ser

Asn

Gly

Phe

Glu

Tyr

Phe

Ala

Pro

Ala

Asn

Thr

Tyr

Asn Asn

Asn

2035

2040

2045

Ile

Glu

Gly

Gin

Ala

Ile

Val

Tyr

Gin

Ser

Lys

Phe

Leu

Thr Leu

Asn

2050

2055

2060

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Asn

Asn

Ser

Lys

Ala

Val

Thr Gly

Leu

2065

2070

2075

2080

Gin

Thr

Ile

Asp

Ser

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Thr

Asn

Thr Ala

Glu

2085

2090

2095

Ala

Ala

Thr

Gly

Trp

Gin

Thr

Ile

Asp

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr Phe

Asn

2100

2105

2110

Thr

Asn

Thr

Ala

Glu

Ala

Ala

Thr

Gly

Trp

Gin

Thr

Ile

Asp Gly

Lys

2115

2120

2125

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Thr

Asn

Thr

Ala

Ile

Ala

Ser

Thr

Gly Tyr

Thr

2130

2135

2140

Ile

Ile

Asn

Gly

Lys

His

Phe

Tyr

Phe

Asn

Thr

Asp

Gly

Ile Met

Gin

2145

2150

2155

2160

Ile

Gly

Val

Phe

Lys

Gly

Pro

Asn

Gly

Phe

Glu

Tyr

Phe

Ala Pro

Ala

2165

2170

2175

Asn

Thr

Asp

Ala

Asn

Asn

Ile

Glu

Gly

Gin

Ala

Ile

Leu

Tyr Gin

Asn

2180

2185

2190

Glu

Phe

Leu

Thr

Leu

Asn

Gly

Lys Lys

Tyr

Tyr

Phe

Gly

Ser Asp

Ser

2195

2200

2205

Lys

Ala

Val

Thr

Gly

Trp

Arg

Ile

Ile

Asn

Asn

Lys

Lys

Tyr Tyr

Phe

2210

2215

2220

Asn

Pro

Asn

Asn

Ala

Ile

Ala

Ala

Ile

His

Leu

Cys

Thr

Ile Asn

Asn

2225

2230

2235

2240

Asp

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Ser

Tyr

Asp

Gly

Ile

Leu

Gin

Asn

Gly Tyr

Ile

2245

'2250

2255

Thr

Ile

Glu

Arg

Asn

Asn

Phe

Tyr

Phe

Asp

Ala

Asn

Asn

Glu Ser

Lys

2260

2265

2270

Met

Val

Thr

Gly Val

Phe

Lys

Gly

Pro

Asn

Gly

Phe

Glu

Tyr Phe

Ala

2275

2280

2285

Pro

Ala

Asn

Thr

His

Asn

Asn

Asn

Ile

Glu

Gly

Gin

Ala

Ile Val

Tyr

2290

2295

2300

Gin Asn 2305	Lys	Phe	Leu Thr Leu 2310	Asn Gly Lys	Lys 2315	Tyr	Tyr	Phe	Asp	Asn 2320
Asp Ser	Lys	Ala	Val Thr Gly	Trp Gin Thr	Ile	Asp	Gly	Lys	Lys	Tyr
			2325	2330				2335
Tyr Phe	Asn	Leu	Asn Thr Ala	Glu Ala Ala	Thr	Gly	Trp	Gin	Thr	Ile
		2340	2345				2350
Asp Gly	Lys	Lys	Tyr Tyr Phe	Asn Leu Asn	Thr	Ala	Glu	Ala	Ala	Thr
	2355		2360			2365
Gly Trp	Gin	Thr	Ile Asp Gly	Lys Lys Tyr	Tyr	Phe	Asn	Thr	Asn	Thr
2370		2375		2380
Phe Ile	Ala	Ser	Thr Gly Tyr	Thr Ser Ile	Asn	Gly	Lys	His	Phe	Tyr
2385			2390		2395				2400
Phe Asn	Thr	Asp	Gly Ile Met	Gin Ile Gly	Val	Phe	Lys	Gly	Pro	Asn
			2405	2410				2415
Gly Phe	Glu	Tyr	Phe Ala Pro	Ala Asn Thr	Asp	Ala	Asn	Asn	Ile	Glu
		2420	2425				2430
Gly Gin	Ala	Ile	Leu Tyr Gin	Asn Lys Phe	Leu	Thr	Leu	Asn	Gly	Lys
	2435		2440			2445
Lys Tyr	Tyr	Phe	Gly Ser Asp	Ser Lys Ala	Val	Thr	Gly	Leu	Arg	Thr
2450		2455		2460
Ile Asp	Gly	Lys	Lys Tyr Tyr	Phe Asn Thr	Asn	Thr	Ala	Val	Ala	Val
2465			2470		2475				2480
Thr Gly	Trp	Gin	Thr Ile Asn	Gly Lys Lys	Tyr	Tyr	Phe	Asn	Thr	Asn
			2485	2490				2495
Thr Ser	Ile	Ala	Ser Thr Gly	Tyr Thr Ile	Ile	Ser	Gly	Lys	His	Phe
		2500	2505				2510
Tyr Phe	Asn'	Thr	Asp Gly Ile	Met Gin Ile	Gly	Val	Phe	Lys	Gly	Pro
	2515		2520			2525
Asp Gly	Phe	Glu	Tyr Phe Ala	Pro Ala Asn	Thr	Asp	Ala	Asn	Asn	Ile
2530		2535		2540
Glu Gly	Gin	Ala	Ile Arg Tyr	Gin Asn Arg	Phe	Leu	Tyr	Leu	His	Asp
2545			2550		2555				2560
Asn Ile	Tyr	Tyr	Phe Gly Asn	Asn Ser Lys	Ala	Ala	Thr	Gly	Trp	Val
			2565	2570				2575
Thr Ile	Asp	Gly	Asn Arg Tyr	Tyr Phe Glu	Pro	Asn	Thr	Ala	Met	Gly
		2580	2585				2590
Ala Asn	Gly	Tyr	Lys Thr Ile	Asp Asn Lys	Asn	Phe	Tyr	Phe	Arg	Asn
	2595		2600			2605
Gly Leu	Pro	Gin	Ile Gly Val	Phe Lys Gly	Ser	Asn	Gly	Phe	Glu	Tyr
2610		2615		2620

Phe Ala Pro Ala Asn Thr Asp Ala Asn Asn Ile Glu Gly Gin Ala Ile 2625 2630 2635 2640

33fr——'·~·νΓ· ». «» « • · · · · · · ····· · · · c ·· ··· · · • · · · · · · ·· ·· ·· ···

Arg Tyr Gin Asn Arg Phe Leu His Leu Leu Gly Lys Ile Tyr Tyr Phe

2645

2650

2655

Gly

Asn

Asn

Ser

Lys

Ala.

Val

Thr

Gly Trp

Gin

Thr

Ile

Asn Gly

Lys

2660

2665

2670

•

Val

Tyr

Tyr

Phe

Met

Pro

Asp

Thr

Ala Met

Ala

Ala

Ala

Gly Gly

Leu

2675

2680

2685

Phe

Glu

Ile

Asp

Gly

Val

Ile

Tyr

Phe Phe

Gly

Val

Asp

Gly Val

Lys

4

2690

2695

2700

•

Ala

Pro

Gly

Ile

Tyr

Gly

2705

2710

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 811 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC: neznámý (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:7:

Ser 1

Tyr

Lys

Ile

Ile 5

Asn

Gly

Lys

His

Phe 10

Tyr

Phe

Asn

Asn

Asp 15

Gly

Val

Met

Gin

Leu 20

Gly

Val

Phe

Lys

Gly 25

Pro

Asp

Gly

Phe

Glu 30

Tyr

Phe

Ala

Pro

Ala 35

Asn

Thr

Gin

Asn

Asn 40

Asn

Ile

Glu

Gly

Gin 45

Ala

Ile

Val

Tyr

Gin 50

Ser

Lys

Phe

Leu

Thr 55

Leu

Asn

Gly

Lys

Lys 60

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Asn 65

Asn

Ser

Lys

Ala

Val 70

Thr

Gly

Trp

Arg

Ile 75

Ile

Asn

Asn

Glu

Lys 80

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Pro 85

Asn

Asn'

Ala

Ile

Ala 90

Ala

Val

Gly

Leu

Gin 95

Val

Ile

Asp

Asn

Asn 100

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn 105

Pro

Asp

Thr

Ala

Ile 110

Ile

Ser

Lys

Gly

Trp 115

Gin

Thr

Val

Asn

Gly 120

Ser

Arg

Tyr

Tyr

Phe 125

Asp

Thr

Asp

Thr

Ala 130

Ile

Ala

Phe

Asn

Gly 135

Tyr

Lys

Thr

Ile

Asp 140

Gly

Lys

His

Phe

Tyr 145

Phe

Asp

Ser

Asp

Cys 150

Val

Val

Lys

Ile

Gly 155

Val

Phe

Ser

Thr

Ser 160

Asn

Gly

Phe

Glu

Tyr 165

Phe

Ala

Pro

Ala

Asn 170

Thr

Tyr

Asn

Asn

Asn 175

Ile

Glu Gly Gin Ala Ile Val Tyr Gin Ser Lys Phe Leu Thr Leu Asn Gly 180 185 190

·· ···

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Asn

Asn

Ser

Lys

Ala

Val

Thr

Gly

Leu

Gin

195

200

205

Thr

Ile

Asp

Ser

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Thr

Asn

Thr

Ala

Glu

Ala

210

215

220

Ala

Thr

Gly

Trp

Gin

Thr

Ile

Asp

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Thr

225

230

235

240

Asn

Thr

Ala

Glu

Ala

Ala

Thr

Gly

Trp

Gin

Thr

Ile

Asp

Gly

Lys

Lys

245

250

255

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Thr

Asn

Thr

Ala

Ile

Ala

Ser

Thr

Gly

Tyr

Thr

Ile

260

265

270

Ile

Asn

Gly

Lys

His

Phe

Tyr

Phe

Asn

Thr

Asp

Gly

Ile

Met

Gin

Ile

275

280

285

Gly

Val

Phe

Lys

Gly

Pro

Asn

Gly

Phe

Glu

Tyr

Phe

Ala

Pro

Ala

Asn

290

295

300

Thr

Asp

Ala

Asn

Asn

Ile

Glu

Gly

Gin

Ala

Ile

Leu

Tyr

Gin

Asn

Glu

305

310

315

320

Phe

Leu

Thr

Leu

Asn

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Gly

Ser

Asp

Ser

Lys

325

330

335

Ala

Val

Thr

Gly

Trp

Arg

Ile

Ile

Asn

Asn

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

340

345

350

Pro

Asn

Asn

Ala

Ile

Ala

Ala

Ile

His

Leu

Cys

Thr

Ile

Asn

Asn

Asp

355

360

365

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Ser

Tyr

Asp

Gly

Ile

Leu

Gin

Asn

Gly

Tyr

Ile

Thr

370

375

380

Ile

Glu

Arg

Asn

Asn

Phe

Tyr

Phe

Asp

Ala

Asn

Asn

Glu

Ser

Lys

Met

385

390

395

400

Val

Thr

Gly

Val

Phe

Lys

Gly

Pro

Asn

Gly

Phe

Glu

Tyr

Phe

Ala

Pro

405

410

415

Ala

Asn

Thr

His

Asn

Asn

Asn

' Ile

Glu

Gly

Gin

Ala

Ile

Val

Tyr

Gin

420

425

430

Asn

Lys

Phe

Leu

Thr

Leu

Asn

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Asn

Asp

435

440

445

Ser

Lys

Ala

Val

Thr

Gly

Trp

Gin

Thr

Ile

Asp

Glv

Lys

Lys

Tyr

Tyr

450

455

460

Phe

Asn

Leu

Asn

Thr

Ala

Glu

Ala

Ala

Thr

Gly

Trp

Gin

Thr

Ile

Asp

465

470

475

480

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Leu

Asn

Thr

Ala

Glu

Ala

Ala

Thr

Gly

485

490

495

Trp

Gin

Thr

Ile

Asp

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Thr

Asn

Thr

Phe

500

505

510

Ile

Ala

Ser

Thr

Gly

Tyr

Thr

Ser

Ile

Asn

Gly

Lys

His

Phe

Tyr

Phe

515

520

525

Asn Thr Asp

Glv Ile Met Gin 535

Ile

Gly

Val

Phe

Lys Gly Pro Asn Gly 540

530

Phe

Glu

Tyr

Phe

Ala

Pro

Ala

Asn

Thr

Asp

Ala

Asn

Asn

Ile

Glu

Gly

545

550

555

560

Gin

Ala

Ile

Leu

Tyr

Gin

Asn

Lys

Phe

Leu

Thr

Leu

Asn

Gly

Lys

Lys

565

570

575

Tyr

Tyr

Phe

Gly

Ser

Asp

Ser

Lys

Ala

Val

Thr

Gly

Leu

Arg

Thr

Ile

580

585

590

Asp

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Thr

Asn

Thr

Ala

Val

Ala

Val

Thr

595

600

605

Gly

Trp

Gin

Thr

Ile

Asn

Gly

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Thr

Asn

Thr

610

615

620

Ser

Ile

Ala

Ser

Thr

Gly

Tyr

Thr

Ile

Ile

Ser

Gly

Lys

His

Phe

Tyr

625

630

635

640

Phe

Asn

Thr

Asp

Gly

Ile

Met

Gin

Ile

Gly

Val

Phe

Lys

Gly

Pro

Asp

645

650

655

Gly

Phe

Glu

Tyr

Phe

Ala

Pro

Ala

Asn

Thr

Asp

Ala

Asn

Asn

Ile

Glu

660

665

670

Gly

Gin

Ala

Ile

Arg

Tyr

Gin

Asn

Arg

Phe

Leu

Tyr

Leu

His

Asp

Asn

675

680

685

Ile

Tyr

Tyr

Phe

Gly

Asn

Asn

Ser

Lys

Ala

Ala

Thr

Gly

Trp

Val

Thr

690

695

700

Ile

Asp

Gly

Asn

Arg

Tyr

Tyr

Phe

Glu

Pro

Asn

Thr

Ala

Met

Gly

Ala

705

710

715

720

Asn

Gly

Tyr

Lys

Thr

Ile

Asp

Asn

Lys

Asn

Phe

Tyr

Phe

Arg

Asn

Gly

725

730

735

Leu

Pro

Gin

Ile

Gly

Val

Phe

Lys

Gly

Ser

Asn

Gly

Phe

Glu

Tyr

Phe

740

745

750

Ala

Pro

Ala

Asn

Thr

Asp

Ala

Asn

Asn

Ile

Glu

Gly

Gin

Ala

Ile

Arg

755

760

765

Tyr

Gin

Asn

Arg

Phe

Leu

His

Leu

Leu

Gly

Lys

Ile

Tyr

Tyr

Phe

Gly

770

775

780

Asn

Asn

Ser

Lys

Ala

Val

Thr

Gly

Trp

Gin

Thr

Ile

Asn

Gly

Lys

Val

785

790

795

800

Tyr

Tyr

Phe

Met

Pro

Asp

Thr

Ala

Met

Ala

Ala

805 810 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 91 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC: neznámý (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:8:

Ser 1

Tyr

Lys

Ile

Ile Asn 5

Gly

Lys

His

Phe 10

Tyr

Phe

Asn

Asn

Asp 15

Gly

Val

Met

Gin

Leu

Gly Val

Phe

Lys

Gly

Pro

Asp

Gly

Phe

Glu

Tyr

Phe

55?

25 30

Ala

Pro

Ala 35

Asn

Thr

Gin Asn

Asn 40

Asn

Ile

Glu

Gly

Gin 45

Ala

Ile

Val

Tyr

Gin 50

Ser

Lys

Phe

Leu Thr 55

Leu

Asn

Gly

Lys

Lys 60

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Asn 65

Asn

Ser

Lys

Ala

Val Thr 70

Gly

Trp

Arg

Ile 75

Ile

Asn

Asn

Glu

Lys 80

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Pro 85

Asn Asn

Ala

Ile

Ala 90

Ala

(2) INFORMACE

PRO

SEQ

ID

NO: 9 :

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 7101 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) RYS:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) POLOHA: 1..7098 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:9:

ATG 48 Met 1

AGT TTA GTT

AAT AGA AAA CAG TTA

GAA AAA ATG GCA AAT GTA AGA

Asn 5

Arg

Lys

Gin

Leu

Ser Leu

Val

Glu 10

Lys

Met Ala

Asn

Val 15

Arg

TTT

CGT

ACT

CAA

GAA

GAT

GAA

TAT

GTT

GCA

ATA

TTG

GAT

GCT

TTA

GAA

96

Phe

Arg

Thr

Gin

Glu

Asp

Glu

Tyr

Val

Ala

Ile

Leu

Asp

Ala

Leu

Glu

20

25

30

GAA

TAT

CAT

AAT

ATG

TCA

GAG

AAT

ACT

GTA

GTC

GAA

AAA

TAT

TTA

AAA

144

Glu

Tyr

His

Asn

Met

Ser

Glu

Asn

Thr

Val

Val

Glu

Lys

Tyr

Leu

Lys

35

40

45

TTA

AAA

GAT

ATA

AAT

AGT

TTA

ACA

GAT

ATT

TAT

ATA

GAT

ACA

TAT

AAA

192

Leu

Lys

Asp

Ile

Asn

Ser

Leu

Thr

Asp

Ile

Tyr

Ile

Asp

Thr

Tyr

Lys

50

55

60

AAA

TCT

GGT

AGA

AAT

AAA

GCC

TTA

AAA

AAA

TTT

AAG

GAA

TAT

CTA

GTT

240

Lys

Ser

Gly

Arg

Asn

Lys

Ala'

Leu

Lys

Lys

Phe

Lys

Glu

Tyi'

Leu

Val

65

70

75

80

ACA

GAA

GTA

TTA

GAG

CTA

AAG

AAT

AAT

AAT

TTA

ACT

CCA

GTT

GAG

AAA

288

Thr

Glu

Val

Leu

Glu

Leu

Lys

Asn

Asn

Asn

Leu

Thr

Pro

Val

Glu

Lys

85

90

95

AAT

TTA

CAT

TTT

GTT

TGG

ATT

GGA

GGT

CAA

ATA

AAT

GAC

ACT

GCT

ATT

336

Ala

Xle

Asn

Leu

His

Phe

Val

Trp

Ile

Gly

Gly

Gin

Ile

Asn

Asp

Thr

1

100

105

110

AAT

TAT

ATA

AAT

CAA

TGG

AAA

GAT

GTA

AAT

AGT

GAT

TAT

AAT

GTT

AAT

384

Val

Asn

Tyr

Ile

Asn

Gin

Trp

Lys

Asp

Val

Asn

Ser

Asp

Tyr

Asn

Asn

115

120

125

34CT • · · · > · · « a a a a a a a a a t a a a a

GTT 432	TTT
Val	Phe 130
GTA 480	GTA
Val 145	Val
TTA 528	AAT
Leu	Asn
GAA 576	ATA
Glu	Ile
CAA 624	AGA
Gin	Arg
TAT 672	CTT
Tyr	Leu 210
ATT 720	GAA
Ile 225	Glu
AGA 768	AAC
Arg	Asn
CAA 816	GAG
Gin	Glu
AGA 864	ATA
Arg	Ile
ATG 912	TTA
Met	Leu 290

AGT TCA 960

Ser Ser 305

ATG AAA 1008 Met Lys

ATG TTA 1056 Met Leu

TAT GAT

Tyr Asp

GAA TCA

Glu Ser

GAC CCT

Asp Pro

ATT TAT

Ile Tyr 180

GAA GAA

Glu Glu 195

TCA AAT

Ser Asn

GAA TCC

Glu Ser

TTT GAA

Phe Glu

TTG GTA

Leu Val 260

TCT GCA

Ser Ala 275

CCA GGA

Pro Gly

GTA ACA

Val Thr

TAC AAA

Tyr Lys

GAC GAA

Asp Glu 340

AGT	AAT	GCA	TTT
Ser	Asn	Ala 135	Phe
GCA	ATA	AAT	GAT
Ala	Ile 150	Asn	Asp
AGA	TTT	GAC	TAT
Arg 165	Phe	Asp	Tyr
GAT	AAA	CAG	AAA
Asp	Lys	Gin	Lys

TTG ATA

Leu Ile

ACA CTT

Thr Leu

AAT AAA

AAT CCT

Asn Pro

GAG	TAT
Glu	Tyr
TTA	AAT
Leu	Asn 230
GAA	TTT
Glu	Phe

245

GAA AGG

Glu Arg

TCA AAG
Ser 215	Lys
AAA	ATT
Lys	Ile
AAA	AAT
Lys	Asn
TGG	AAT
Trp	Asn

TTA	AAA	GAA	ATT
Leu	Lys	Glu	Ile 280
ATA	CAA	CCA	GAC
Ile	Gin	Pro 295	Asp
GTG	GAT	TTT	TGG
Val	Asp 310	Phe	Trp
GAA	TAT	ATA	CCA
Glu 325	Tyr	Ile	Pro
GAA	GTT	CAA	AGT
Glu	Val	Gin	Ser

GAA CTT

Glu Leu 200

Asn	Lys 170
AAT	TTC
Asn 185	Phe
ATA	ATT
Ile	Ile
GAG	ATA
Glu	Ile
ACA	CAG
Thr	Gin
GGA	GAG
Gly	Glu 250
TTA	GCT
Leu 265	Ala
GGT	GGT
Gly	Gly
TTA	TTT
Leu	Phe
GAA	ATG
Glu	Met
GAA	TAT
Glu	Tyr 330
AGT	TTT
Ser 345	Phe

AAC ACA

Asn	Thr 140
GAA	TCA
Glu 155	Ser
TTC	TTC
Phe	Phe
ATA	AAC
Ile	Asn
GAT	GAT
Asp	Asp
GAT	GAA
Asp	Glu 220
AAT	AGT
Asn 235	Ser
TCA	TTC
Ser	Phe
GCT	GCT
Ala	Ala
ATG	TAT
Met	Tyr
GAG	TCT
Glu	Ser 300
ACA	AAG
Thr 315	Lys
ACC	TCA
Thr	Ser
GAA	TCT
Glu	Ser

TTG AAA
Leu	Lys
TTT	AGA
Phe	Arg
AGA	AAA
Arg	Lys
TAC	TAT
Tyr	Tyr 190
ATT	GTA
Ile 205	Val
CTT	AAT
Leu	Asn
GGA	AAT
Gly	Asn
AAC	TTA
Asn	Leu
TCT	GAC
Ser	Asp 270
TTA	GAT
Leu 285	Asp
ATA	GAG
Ile	Glu
TTA	GAA
Leu	Glu
GAA	CAT
Glu	His
GTT	CTA
Val	Leu 350

AAA	ACT
Lys	Thr
GAA	AAC
Glu	Asn 160
CGT	ATG
Arg 175	Met
AAA	GCT
Lys	Ala
AAG	ACA
Lys	Thr
ACC	TAT
Thr	Tyr
GAT	GTT
Asp	Val 240
TAT	GAA
Tyr 255	Glu
ATA	TTA
Ile	Leu
GTT	GAT
Val	Asp
AAA	CCT
Lys	Pro
GCT	ATA
Ala	Ile 320
TTT	GAC
Phe 335	Asp
GCT	TCT
Ala	Ser

AAG TCA 1104

GAT

AAA

TCA

GAA

ATA

TTC

TCA

TCA

CTT

GGT

GAT

ATG

GAG

GCA

Lys Ser

Asp 355

Lys

Ser

Glu

Ile

Phe 360

Ser

Ser

Leu

Gly

Asp 365

Met

Glu

Ala

TCA CCA 1152

CTA

GAA

GTT

AAA

ATT

GCA

TTT

AAT

AGT

AAG

GGT

ATT

ATA

AAT

Ser Pro 370

Leu

Glu

Val

Lys

Ile 375

Ala

Phe

Asn

Ser

Lys 380

Gly

Ile

Ile

Asn

CAA GGG 1200

CTA

ATT

TCT

GTG

AAA

GAC

TCA

TAT

TGT

AGC

AAT

TTA

ATA

GTA

Gin Gly 385

Leu

Ile

Ser

Val 390

Lys

Asp

Ser

Tyr

Cys 395

Ser

Asn

Leu

Ile

Val 400

AAA CAA 1248

ATC

GAG

AAT

AGA

TAT

AAA

ATA

TTG

AAT

AAT

AGT

TTA

AAT

CCA

Lys Gin

Ile

Glu

Asn 405

Arg

Tyr

Lys

Ile

Leu 410

Asn

Asn

Ser

Leu

Asn 415

Pro

GCT ATT 1296

AGC

GAG

GAT

AAT

GAT

TTT

AAT

ACT

ACA

ACG

AAT

ACC

TTT

ATT

Ala Ile

Ser

Glu 420

Asp

Asn

Asp

Phe

Asn 425

Thr

Thr

Thr

Asn

Thr 430

Phe

Ile

GAT AGT 1344

ATA

ATG

GCT

GAA

GCT

AAT

GCA

GAT

AAT

GGT

AGA

TTT

ATG

ATG

Asp Ser

Ile 435

Met

Ala

Glu

Ala

Asn 440

Ala

Asp

Asn

Gly

Arg 445

Phe

Met

Met

GAA CTA 1392

GGA

AAG

TAT

TTA

AGA

GTT

GGT

TTC

TTC

CCA

GAT

GTT

AAA

ACT

Glu Leu 450

Gly

Lys

Tyr

Leu

Arg 455

Val

Gly

Phe

Phe

Pro 460

Asp

Val

Lys

Thr

ACT ATT 1440

AAC

TTA

AGT

GGC

CCT

GAA

GCA

TAT

GCG

GCA

GCT

TAT

CAA

GAT

Thr Ile 465

Asn

Leu

Ser

Gly 470

Pro

Glu

Ala

Tyr

Ala 475

Ala

Ala

Tyr

Gin

Asp 480

TTA TTA 1488

ATG

TTT

AAA

GAA

GGC

AGT

ATG

AAT

ATC

CAT

TTG

ATA

GAA

GCT

Leu Leu

Met

Phe

Lys 485

Glu

Gly

Ser

Met

Asn 490

Ile

His

Leu

Ile

Glu 495

Ala

GAT TTA 1536

AGA

AAC

TTT

GAA

ATC

TCT

AAA

ACT

AAT

ATT

TCT

CAA

TCA

ACT

Asp Leu

Arg

Asn

Phe

Glu

Ile

Ser

Lys

Thr

Asn

Ile

Ser

Gin

Ser

Thr

500 505 510

GAA CAA

GAA

ATG

GCT

AGC

TTA

TGG

TCA

TTT

GAC

GAT

GCA

AGA

GCT

AAA

1584 Glu Gin

Glu 515

Met

Ala

Ser

Leu

Trp 520

Ser

Phe

Asp

Asp

Ala 525

Arg

Ala

Lys

GCT CAA

TTT

GAA

GAA

TAT

AAA

AGG

AAT

TAT

TTT

GAA

GGT

TCT

CTT

GGT

1632 Ala Gin 530

Phe

Glu

Glu

Tyr

Lys 535

Arg

Asn

Tyr

Phe

Glu 540

Gly

Ser

Leu

Gly

GAA GAT

GAT

AAT

CTT

GAT

TTT

TCT

CAA

AAT

ATA

GTA

GTT

GAC

AAG

GAG

1680 Glu Asp 545

Asp

Asn

Leu

Asp 550

Phe

Ser

Gin

Asn

Ile 555

Val

Val

Asp

Lys

Glu 560

TAT CTT

TTA

GAA

AAA

ATA

TCT

TCA

TTA

GCA

AGA

AGT

TCA

GAG

AGA

GGA

1728 Tyr Leu

Leu

Glu

Lys 565

Ile

Ser

Ser

Leu

Ala 570

Arg

Ser

Ser

Glu

Arg 575

Gly

TAT ΑΤΑ

CAC

TAT

ATT

GTT

CAG

TTA

CAA

GGA

GAT

AAA

ATT

AGT

TAT

GAA

1776 Tyr Ile

His

Tyr

Ile

Val

Gin

Leu

Gin

Gly

Asp

Lys

Ile

Ser

Tyr

Glu

580

585

590

GCA GCA

TGT

AAC

TTA

TTT

GCA

AAG

ACT

CCT

TAT

GAT

AGT

GTA

CTG

TTT

1824 Ala Ala

Cys

Asn

Leu

Phe

Ala

Lys

Thr

Pro

Tyr

Asp

Ser

Val

Leu

Phe

595

600

605

CAG AAA

AAT

ATA

GAA

GAT

TCA

GAA

ATT

GCA

TAT

TAT

TAT

AAT

CCT

GGA

1872 Gin Lys

Asn

Ile

Glu

Asp

Ser

Glu

Ile

Ala

Tyr

Tyr

Tyr

Asn

Pro

Gly

610

615

620

GAT GGT 1920

GAA

ATA

CAA

GAA

ATA

GAC

AAG

TAT

AAA

ATT

CCA

AGT

ATA

ATT

Asp Gly

Glu

Ile

Gin

Glu

Ile

Asp

Lys

Tyr

Lys

Ile

Pro

Ser

Ile

Ile

625

630

635

640

TCT GAT

AGA

CCT

AAG

ATT

AAA

TTA

ACA

TTT

ATT

GGT

CAT

GGT

AAA

GAT

1968 Ser Asp

Arg

Pro

Lys

Ile

Lys

Leu

Thr

Phe

Ile

Gly

His

Gly

Lys

Asp

645

650

655

GAA TTT

AAT

ACT

GAT

ATA

TTT

GCA

GGT

TTT

GAT

GTA

GAT

TCA

TTA

TCC

2016 Glu Phe

Asn

Thr

Asp

Ile

Phe

Ala

Gly

Phe

Asp

Val

Asp

Ser

Leu

Ser

660

665

670

ACA GAA

ATA

GAA

GCA

GCA

ATA

GAT

TTA

GCT

AAA

GAG

GAT

ATT

TCT

CCT

2064 Thr Glu

Ile

Glu

Ala

Ala

Ile

Asp

Leu

Ala

Lys

Glu

Asp

Ile

Ser

Pro

675

680

685

AAG TCA

ATA

GAA

ATA

AAT

TTA

TTA

GGA

TGT

AAT

ATG

TTT

AGC

TAC

TCT

2112 Lys Ser

Ile

Glu

Ile

Asn

Leu

Leu

Gly

Cys

Asn

Met

Phe

Ser

Tyr

Ser

690

695

700

ATC AAC

GTA

GAG

GAG

ACT

TAT

CCT

GGA

AAA

TTA

TTA

CTT

AAA

GTT

AAA

2160 Ile Asn

Val

Glu

Glu

Thr

Tyr

Pro

Gly

Lys

Leu

Leu

Leu

Lys

Val

Lys

705

710

715

720

GAT AAA 2208

ATA

TCA

GAA

TTA

ATG

CCA

TCT

ATA

AGT

CAA

GAC

TCT

ATT

ATA

Asp Lys

Ile

Ser

Glu

Leu

Met

Pro

Ser

Ile

Ser

Gin

Asp

Ser

Ile

Ile

725

730

735

GTA AGT

GCA

AAT

CAA

TAT

GAA

GTT

AGA

ATA

AAT

AGT

GAA

GGA

AGA

AGA

2256 Val Ser

Ala

Asn

Gin

Tyr

Glu

Val

Arg

Ile

Asn

Ser

Glu

Gly

Arg

Arg

740 745 750

GAA TTA

TTG

GAT

CAT

TCT

GGT

GAA

TGG

ATA

AAT

AAA

GAA

GAA

AGT

ATT

2304 Glu Leu

Leu 755

Asp

His

Ser

Gly

Glu 760

Trp

Ile

Asn

Lys

Glu 765

Glu

Ser

Ile

ATA AAG

GAT

ATT

TCA

TCA

AAA

GAA

TAT

ATA

TCA

TTT

AAT

CCT

AAA

GAA

2352 Ile Lys 770

Asp

Ile

Ser

Ser

Lys 775

Glu

Tyr

Ile

Ser

Phe 780

Asn

Pro

Lys

Glu

AAT AAA

ATT

ACA

GTA

AAA

TCT

AAA

AAT

TTA

CCT

GAG

CTA

TCT

ACA

TTA

2400 Asn Lys 785

Ile

Thr

Val

Lys 790

Ser

Lys

Asn

Leu

Pro 795

Glu

Leu

Ser

Thr

Leu 800

• » 9 · 9 · « · • ' · • ·

« · • • · » • · • · • ·

• a • · · • · a. · · • * • a ·

a a · · • a a a a · ·· • · a · · · • a · • · · · ·

TTA CAA

GAA

ATT

AGA

AAT

AAT

TCT

AAT

TCA

AGT

GAT

ATT

GAA

CTA

GAA

2448 Leu Gin

Glu

Ile

Arg

Asn

Asn

Ser

Asn

Ser

Ser

Asp

Ile

Glu

Leu

Glu

805

810

815

GAA AAA 2496

GTA

ATG

TTA

ACA

GAA

TGT

GAG

ATA

AAT

GTT

ATT

TCA

AAT

ATA

Glu Lys

Val

Met

Leu

Thr

Glu

Cys

Glu

Ile

Asn

Val

Ile

Ser

Asn

Ile

820

825

830

GAT ACG 2544

CAA

ATT

GTT

GAG

GAA

AGG

ATT

GAA

GAA

GCT

AAG

AAT

TTA

ACT

Asp Thr

Gin

Ile

Val

Glu

Glu

Arg

Ile

Glu

Glu

Ala

Lys

Asn

Leu

Thr

835

840

845

TCT GAC

TCT

ATT

AAT

TAT

ATA

AAA

GAT

GAA

TTT

AAA

CTA

ATA

GAA

TCT

2592 Ser Asp

Ser

Ile

Asn

Tyr

Ile

Lys

Asp

Glu

Phe

Lys

Leu

Ile

Glu

Ser

850

855

860

ATT TCT

GAT

GCA

CTA

TGT

GAC

TTA

AAA

CAA

CAG

AAT

GAA

TTA

GAA

GAT

2640 Ile Ser

Asp

Ala

Leu

Cys

Asp

Leu

Lys

Gin

Gin

Asn

Glu

Leu

Glu

Asp

865

870

875

880

TCT CAT

TTT

ATA

TCT

TTT

GAG

GAC

ATA

TCA

GAG

ACT

GAT

GAG

GGA

TTT

2688 Ser His

Phe

Ile

Ser

Phe

Glu

Asp

Ile

Ser

Glu

Thr

Asp

Glu

Gly

Phe

885

890

895

AGT ATA

AGA

TTT

ATT

AAT

AAA

GAA

ACT

GGA

GAA

TCT

ATA

TTT

GTA

GAA

2736 Ser Ile

Arg

Phe

Ile

Asn

Lys

Glu

Thr

Gly

Glu

Ser

Ile

Phe

Val

Glu

900

905

910

ACT GAA

AAA

ACA

ATA

TTC

TCT

GAA

TAT

GCT

AAT

CAT

ATA

ACT

GAA

GAG

2784 Thr Glu

Lys

Thr

Ile

Phe

Ser

Glu

Tyr

Ala

Asn

His

Ile

Thr

Glu

Glu

915

920

925

ATT TCT

AAG

ATA

AAA

GGT

ACT

ATA

TTT

GAT

ACT

GTA

AAT

GGT

AAG

TTA

2832 Ile Ser

Lys

Ile

Lys

Gly

Thr

Ile

Phe

Asp

Thr

Val

Asn

Gly

Lys

Leu

930

935

940

GTA AAA 2880

AAA

GTA

AAT

TTA

GAT

ACT

ACA

CAC

GAA

GTA

AAT

ACT

TTA

AAT

Val Lys

Lys

Val

Asn

Leu

Asp

Thr

Thr

His

Glu

Val

Asn

Thr

Leu

Asn

945

950

955

960

GCT GCA

TTT

TTT

ATA

CAA

TCA

TTA

ATA

GAA

TAT

AAT

AGT

TCT

AAA

GAA

2928 Ala Ala

Phe

Phe

Ile

Gin

Ser

Leu

Ile

Glu

Tyr

Asn

Ser

Ser

Lys

Glu

965

970

975

TCT CTT

AGT

AAT

TTA

AGT

GTA

GCA

ATG

AAA

GTC

CAA

GTT

TAC

GCT

CAA

2976 Ser Leu

Ser

Asn

Leu

Ser

Val

Ala

Met

Lys

Val

Gin

Val

Tyr

Ala

Gin

980

985

990

TTA TTT

AGT

ACT

GGT

TTA

AAT

ACT

ATT

ACA

GAT

GCA

GCC

AAA

GTT

GTT

3024 Leu Phe

Ser

Thr

Gly

Leu

Asn

Thr

Ile

Thr

Asp

Ala

Ala

Lys

Val

Val

995

1000

1005

GAA TTA 3072

GTA

TCA

ACT

GCA

TTA

GAT

GAA

ACT

ATA

GAC

TTA

CTT

CCT

ACA Thr

Glu Leu

Val

Ser

Thr

Ala

Leu

Asp Glu

Thr

Ile

Asp

Leu

Leu

Pro

1010 - 1015 1020

	• · « · · • · · • · · « · * • ·	• · • · • • • ·	• · • • • · • • ·	• · • • • •	·· ·· • · · • · ·· • · · · · · • · · · • · · · ·
TTA TCT GAA GGA TTA CCT ATA ATT	GCA ACT ATT ATA	GAT	GGT	GTA	AGT
3120
Leu Ser Glu Gly Leu Pro Ile Ile	Ala Thr Ile Ile	Asp	Gly	Val	Ser
1025 1030	1035				1040
TTA GGT GCA GCA ATC AAA GAG CTA	AGT GAA ACG AGT	GAC	CCA	TTA	TTA
3168
Leu Gly Ala Ala Ile Lys Glu Leu	Ser Glu Thr Ser	Asp	Pro	Leu	Leu
1045	1050			1055
AGA CAA GAA ATA GAA GCT AAG ATA	GGT ATA ATG GCA	GTA	AAT	TTA	ACA
3216
Arg Gin Glu Ile Glu Ala Lys Ile	Gly Ile Met Ala	Val	Asn	Leu	Thr
1060	1065		1070
ACA GCT ACA ACT GCA ATC ATT ACT	TCA TCT TTG GGG	ATA	GCT	AGT	GGA
3264
Thr Ala Thr Thr Ala Ile Ile Thr	Ser Ser Leu Gly	Ile	Ala	Ser	Gly
1075 1080	1085
TTT AGT ATA CTT TTA GTT CCT TTA	GCA GGA ATT TCA	GCA	GGT	ATA	CCA
3312
Phe Ser Ile Leu Leu Val Pro Leu	Ala Gly Ile Ser	Ala	Gly	Ile	Pro
1090 1095	1100
AGC TTA GTA AAC AAT GAA CTT GTA	CTT CGA GAT AAG	GCA	ACA	AAG	GTT
3360
Ser Leu Val Asn Asn Glu Leu Val	Leu Arg Asp Lys	Ala	Thr	Lys	Val
1105 1110	1115				1120
GTA GAT TAT TTT AAA CAT GTT TCA	TTA GTT GAA ACT	GAA	GGA	GTA	TTT
3408
Val Asp Tyr Phe Lys His Val Ser	Leu Val Glu Thr	Glu	Gly	Val	Phe
1125	1130			1135
ACT TTA TTA GAT GAT AAA ATA ATG	ATG CCA CAA GAT	GAT	TTA	GTG	ATA
3456
Thr Leu Leu Asp Asp Lys Ile Met	Met Pro Gin Asp	Asp	Leu	Val	Ile
1140	1145		1150
TCA GAA ATA GAT TTT AAT AAT AAT	TCA ATA GTT TTA	GGT	AAA	TGT	GAA
3504
Ser Glu Ile Asp Phe Asn Asn Asn	Ser Ile Val Leu	Gly	Lys	Cys	Glu
1155 1160	1165
ATC TGG AGA ATG GAA GGT GGT TCA	GGT CAT ACT GTA	ACT	GAT	GAT	ATA
3552
Ile Trp Arg Met Glu Gly Gly Ser	Gly His Thr Val	Thr	Asp	Asp	Ile
1170 1175	1180
GAT CAC TTC TTT TCA GCA CCA TCA	ATA ACA TAT AGA	GAG	CCA	CAC	TTA
3600
Asp His Phe Phe Ser Ala Pro Ser	Ile Thr Tyr Arg	Glu	Pro	His	Leu
1185 1190	1195				1200
TCT ATA TAT GAC GTA TTG GAA GTA	CAA AAA GAA GAA	CTT	GAT	TTG	TCA
3648
Ser Ile Tyr Asp Val Leu Glu Val	Gin Lys Glu Glu	Leu	Asp	Leu	Ser
1205	1210			1215
AAA GAT TTA ATG GTA TTA CCT AAT	GCT CCA AAT AGA	GTA	TTT	GCT	TGG
3696
Lys Asp Leu Met Val Leu Pro Asn	Ala Pro Asn Arg	Val	Phe	Ala	Trp
1220	1225		1230
GAA ACA GGA TGG ACA CCA GGT TTA	AGA AGC TTA GAA	AAT	GAT	GGC	ACA
3744
Glu Thr Gly Trp Thr Pro Gly Leu	Arg Ser Leu Glu	Asn	Asp	Gly	Thr
1235 1240	1245

v

345

AAA CTG TTA 3792	GAC Asp	CGT Arg	ATA AGA GAT AAC TAT GAA GGT GAG TTT TAT TGG
Ile	Arg Asp 1255	Asn Tyr	Glu Gly Glu 1260	Phe	Tyr	Trp
Lys	Leu Leu 1250
AGA	TAT TTT	GCT	TTT	ATA	GCT GAT	GCT TTA	ATA ACA ACA	TTA	AAA	CCA
3840
Arg	Tyr Phe	Ala	Phe	Ile	Ala Asp	Ala Leu	Ile Thr Thr	Leu	Lys	Pro
1265				1270		1275			1280
AGA	TAT GAA	GAT	ACT	AAT	ATA AGA	ATA AAT	TTA GAT AGT	AAT	ACT	AGA

3888

Arg

Tyr

Glu

Asp

Thr 1285

Asn

Ile

Arg

Ile

Asn 129C

Leu 1

Asp

Ser

Asn

Thr 1295

Arg

AGT 3936

TTT

ATA

GTT

CCA

ATA

ATA

ACT

ACA

GAA

TAT

ATA

AGA

GAA

AAA

TTA

Ser

Phe

Ile

Val

Pro

Ile

Ile

Thr

Thr

Glu

Tyr

Ile

Arg

Glu

Lys

Leu

1300 1305 1310

TCA TAT 3984 Ser Tyr	TCT TTC Ser Phe 1315	TAT Tyr	GGT Gly	TCA Ser	GGA GGA Gly Gly 1320	ACT Thr	TAT Tyr	GCA Ala	TTG TCT Leu Ser 1325	CTT Leu	TCT Ser
CAA TAT 4032	AAT ATG	GGT	ATA	AAT	ATA GAA	TTA	AGT	GAA	AGT GAT	GTT	TGG
Gin Tyr 133C	Asn Met 1	Gly	Ile	Asn 1335	Ile Glu	Leu	Ser	Glu 134C	Ser Asp 1	Val	Trp
ATT ATA 4080	GAT GTT	GAT	AAT	GTT	GTG AGA	GAT	GTA	ACT	ATA GAA	TCT	GAT
Ile Ile 1345	Asp Val	Asp	Asn Val 1350	Val Arg	Asp	Val 1355	Thr	Ile Glu	Ser	Asp 1360
AAA ATT 4128	AAA AAA	GGT	GAT	TTA	ATA GAA	GGT	ATT	TTA	TCT ACA	CTA	AGT
Lys Ile	Lys Lys	Gly Asp 1365	Leu,	Ile Glu	Gly Ile 1370	Leu	Ser Thr	Leu Ser 1375
ATT GAA 4176	GAG AAT	AAA	ATT	ATC	TTA AAT	AGC	CAT	GAG	ATT AAT	TTT	TCT
Ile Glu	Glu Asn Lys 1380	Ile	Ile	Leu Asn Ser 1385	His	Glu	Ile Asn Phe 1390	Ser
GGT GAG 4224	GTA AAT	GGA	AGT	AAT	GGA TTT	GTT	TCT	TTA	ACA TTT	TCA	ATT
Gly Glu	Val Asn 1395	Gly	Ser	Asn	Gly Phe 1400	Val	Ser	Leu	Thr Phe 1405	Ser	Ile
TTA GAA 4272	GGA ATA	AAT	GCA	ATT	ATA GAA	GTT	GAT	TTA	TTA TCT	AAA	TCA
Leu Glu Gly Ile 1410	Asn	Ala	Ile Ile Glu 1415	Val	Asp	Leu Leu Ser 1420	Lys	Ser
TAT AAA 4320	TTA CTT	ATT	TCT	GGC	GAA TTA	AAA	ATA	TTG	ATG TTA	AAT	TCA
Tyr Lys 1425	Leu Leu	Ile	Ser Gly 1430	Glu Leu	Lys	Ile Leu 1435	Met Leu	Asn	Ser 1440
AAT CAT 4368	ATT CAA	CAG	AAA	ATA	GAT TAT	ATA	GGA	TTC	AAT AGC	GAA	TTA
Asn His	Ile Gin	Gin Lys 1445	Ile	Asp Tyr	Ile Gly 1450	Phe	Asn Ser	Glu Leu 1455
CAG AAA 4416	AAT ATA	CCA	TAT	AGC	TTT GTA	GAT	AGT	GAA	GGA AAA	GAG	AAT
Gin Lys	Asn Ile Pro 1460	Tyr	Ser	Phe Val Asp Ser 1465	Glu	Gly Lys Glu 1470	Asn

• · • · · · • · ·*χ » · · · · * • · · • · · ·

GGT TTT 4464 Gly Phe	ATT AAT Ile Asn 1475	GGT Gly	TCA Ser	ACA Thr	AAA GAA Lys Glu 1480	GGT Gly	TTA Leu	TTT Phe	GTA TCT Val Ser 1485	GAA Glu	TTA Leu
CCT GAT 4512	GTA GTT	CTT	ATA	AGT	AAG GTT	TAT	ATG	GAT	GAT AGT	AAG	CCT
Pro Asp 149C	Val Val 1	Leu	Ile	Ser 1495	Lys Val	Tyr	Met	Asp 150C	Asp Ser 1	Lys	Pro
TCA TTT 4560	GGA TAT	TAT	AGT	AAT	AAT TTG	AAA	GAT	GTC	AAA GTT	ATA	ACT
Ser Phe 1505	Gly Tyr	Tyr	Ser 1510	Asn 1	Asn Leu	Lys	Asp 1515	Val	Lys Val	Ile	Thr 1520
AAA GAT 4608	AAT GTT	AAT	ATA	TTA	ACA GGT	TAT	TAT	CTT	AAG GAT	GAT	ATA
Lys Asp	Asn Val	Asn 1525	Ile	Leu	Thr Gly	Tyr Tyr 1530	Leu	Lys Asp	Asp 1535	Ile
AAA ATC 4656	TCT CTT	TCT	TTG	ACT	CTA CAA	GAT	GAA	AAA	ACT ATA	AAG	TTA
Lys Ile	Ser Leu Ser 1540	Leu	Thr	Leu Gin Asp 1545	Glu	Lys	Thr Ile Lys 1550	Leu
AAT AGT 4704	GTG CAT	TTA	GAT	GAA	AGT GGA	GTA	GCT	GAG	ATT TTG	AAG	TTC
Asn Ser	Val His 1555	Leu	Asp	Glu	Ser Gly 1560	Val	Ala	Glu	Ile Leu 1565	Lys	Phe
ATG AAT 4752	AGA AAA	GGT	AAT	ACA	AAT ACT	TCA	GAT	TCT	TTA ATG	AGC	TTT
Met Asn Arg Lys 1570	Gly	Asn	Thr Asn Thr 1575	Ser	Asp	Ser Leu Met 1580	Ser	Phe
TTA GAA 4800	AGT ATG	AAT	ATA	AAA	AGT ATT	TTC	GTT	AAT	TTC TTA	CAA	TCT
Leu Glu 1585	Ser Met	Asn	Ile Lys 1590	Ser Ile	Phe	Val Asn 1595	Phe Leu	Gin	Ser 1600
AAT ATT 4848	AAG TTT	ATA	TTA	GAT	GCT AAT	TTT	ATA	ATA	AGT GGT	ACT	ACT
Asn Ile	Lys Phe	Ile Leu 1605	Asp	Ala Asn	Phe Ile 1610	Ile	Ser Gly	Thr Thr 1615
TCT ATT 4896	GGC CAA	TTT	GAG	TTT	ATT TGT	GAT	GAA	AAT	GAT AAT	ATA	CAA
Ser Ile	Gly Gin Phe 1620	Glu	Phe	Ile Cys Asp 1625	Glu	Asn	Asp Asn Ile 1630	Gin
CCA TAT 4944	TTC ATT	AAG	TTT	AAT	ACA CTA	GAA	ACT	AAT	TAT ACT	TTA	TAT
Pro Tyr	Phe Ile 1635	Lys	Phe	Asn	Thr Leu 1640	Glu	Thr	Asn	Tyr Thr 1645	Leu	Tyr
GTA GGA 4992	AAT AGA	CAA	AAT	ATG	ATA GTG	GAA	CCA	AAT	TAT GAT	TTA	GAT
Val Gly Asn Arg 1650	Gin	Asn	Met Ile Val 1655	Glu	Pro	Asn Tyr Asp 1660	Leu	Asp
GAT TCT 5040	GGA GAT	ATA	TCT	TCA	ACT GTT	ATC	AAT	TTC	TCT CAA	AAG	TAT
Asp Ser 1665	Gly Asp	Ile	Ser Ser 1670	Thr Val	Ile	Asn Phe 1675	Ser Gin	Lys	Tyr 1680
CTT TAT 5088	GGA ATA	GAC	AGT	TGT	GTT AAT	AAA	GTT	GTA	ATT TCA	CCA	AAT
Leu Tyr	Gly Ile	Asp Ser 1685	Cys	Val Asn	Lys Val 1690	Val	Ile Ser	Pro Asn 1695

• · · · « • · · · ·

	• ·	# ·	• · · · ·
ATT TAT ACA GAT GAA ATA AAT ATA	ACG CCT GTA TAT	GAA	ACA AAT AAT
5136
Ile Tyr Thr Asp Glu Ile Asn Ile	Thr Pro Val Tyr	Glu	Thr Asn Asn
1700	1705		1710
ACT TAT CCA GAA GTT ATT GTA TTA	GAT GCA AAT TAT	ATA	AAT GAA AAA
5184
Thr Tyr Pro Glu Val Ile Val Leu	Asp Ala Asn Tyr	Ile	Asn Glu Lys
1715 1720	1725
ATA AAT GTT AAT ATC AAT GAT CTA	TCT ATA CGA TAT	GTA	TGG AGT AAT
5232
Ile Asn Val Asn Ile Asn Asp Leu	Ser Ile Arg Tyr	Val	Trp Ser Asn
1730 1735	1740
GAT GGT AAT GAT TTT ATT CTT ATG	TCA ACT AGT GAA	GAA	AAT AAG GTG
52 8 0
Asp Gly Asn Asp Phe Ile Leu Met	Ser Thr Ser Glu	Glu	Asn Lys Val
1745 1750	1755		1760
TCA CAA GTT AAA ATA AGA TTC GTT	AAT GTT TTT AAA	GAT	AAG ACT TTG
5328
Ser Gin Val Lys Ile Arg Phe Val	Asn Val Phe Lys	Asp	Lys Thr Leu
1765	1770		1775
GCA AAT AAG CTA TCT TTT AAC TTT	AGT GAT AAA CAA	GAT	GTA CCT GTA
5376
Ala Asn Lys Leu Ser Phe Asn Phe	Ser Asp Lys Gin	Asp	Val Pro Val
1780	1785		1790
AGT GAA ATA ATC TTA TCA TTT ACA	CCT TCA TAT TAT	GAG	GAT GGA TTG
5424
Ser Glu Ile Ile Leu Ser Phe Thr	Pro Ser Tyr Tyr	Glu	Asp Gly Leu
1795 1800	1805
ATT GGC TAT GAT TTG GGT CTA GTT	TCT TTA TAT AAT	GAG	AAA TTT TAT
5472
Ile Gly Tyr Asp Leu Gly Leu Val	Ser Leu Tyr Asn	Glu	Lys Phe Tyr
1810 1815	1820
ATT AAT AAC TTT GGA ATG ATG GTA	TCT GGA TTA ATA	TAT	ATT AAT GAT
5520
Ile Asn Asn Phe Gly Met Met Val	Ser Gly Leu Ile	Tyr	Ile Asn Asp
1825 1830	1835		1840
TCA TTA TAT TAT TTT AAA CCA CCA	GTA AAT AAT TTG	ATA	ACT GGA TTT
5568
Ser Leu Tyr Tyr Phe Lys Pro Pro	Val Asn Asn Leu	Ile	Thr Gly Phe
1845	1850		1855
GTG ACT GTA GGC GAT GAT AAA TAC	TAC TTT AAT CCA	ATT	AAT GGT GGA
5616
Val Thr Val Gly Asp Asp Lys Tyr	Tyr Phe Asn Pro	Ile	Asn Gly Gly
1860	1865		1870
GCT GCT TCA ATT GGA GAG ACA ATA	ATT GAT GAC AAA	AAT	TAT TAT TTC
5664
Ala Ala Ser Ile Gly Glu Thr Ile	Ile Asp Asp Lys	Asn	Tyr Tyr Phe
1875 1880	1885
AAC CAA AGT GGA GTG TTA CAA ACA	GGT GTA TTT AGT	ACA	GAA GAT GGA
5712
Asn Gin Ser Gly Val Leu Gin Thr	Gly Val Phe Ser	Thr	Glu Asp Gly

1890 1895 1900

TTT AAA TAT TTT GCC CCA GCT AAT ACA CTT GAT GAA AAC CTA GAA GGA 5760 ’

Phe Lys Tyr Phe Ala Pro Ala Asn Thr Leu Asp Glu Asn Leu Glu Gly 1905 1910 1915 1920

GAA GCA ATT GAT TTT ACT GGA AAA TTA ATT ATT GAC GAA AAT ATT TAT 5808

Glu Ala Ile Asp Phe Thr Gly Lys Leu Ile Ile Asp Glu Asn Ile Tyr 1925 1930 1935

TAT TTT GAT GAT AAT TAT AGA GGA GCT GTA GAA TGG AAA GAA TTA GAT 5856

Tyr Phe Asp Asp Asn Tyr Arg Gly Ala Val Glu Trp Lys Glu Leu Asp 1940 1945 1950

GGT GAA ATG CAC TAT TTT AGC CCA GAA ACA GGT AAA GCT TTT AAA GGT 5904

Gly Glu Met His Tyr Phe Ser Pro Glu Thr Gly Lys Ala Phe Lys Gly 1955 1960 1965

CTA AAT CAA ATA GGT GAT TAT AAA TAC TAT TTC AAT TCT GAT GGA GTT 5952

Leu Asn Gin Ile Gly Asp Tyr Lys Tyr Tyr Phe Asn Ser Asp Gly Val 1970 1975 1980

ATG CAA AAA GGA TTT GTT AGT ATA AAT GAT AAT AAA CAC TAT TTT GAT 6000

Met Gin Lys Gly Phe Val Ser Ile Asn Asp Asn Lys His Tyr Phe Asp

1985 1990 1995 2000

GAT TCT GGT GTT ATG AAA GTA GGT TAC ACT GAA ATA GAT GGC AAG CAT

6048

Asp Ser Gly Val Met Lys Val Gly Tyr Thr Glu Ile Asp Gly Lys His 2005 2010 2015

TTC TAC TTT GCT GAA AAC GGA GAA ATG CAA ATA GGA GTA TTT AAT ACA 6096

Phe Tyr Phe Ala Glu Asn Gly Glu Met Gin Ile Gly Val Phe Asn Thr 2020 2025 2030

GAA GAT GGA TTT AAA TAT TTT GCT CAT CAT AAT GAA GAT TTA GGA AAT 6144

Glu Asp Gly Phe Lys Tyr Phe Ala His His Asn Glu Asp Leu Gly Asn 2035 2040 2045

GAA GAA GGT GAA GAA ATC TCA TAT TCT GGT ATA TTA AAT TTC AAT AAT 6192

Glu Glu Gly Glu Glu Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Leu Asn Phe Asn Asn 2050 2055 2060

AAA ATT TAC TAT TTT GAT GAT TCA TTT ACA GCT GTA GTT GGA TGG AAA 6240

Lys Ile Tyr Tyr Phe Asp Asp Ser Phe Thr Ala Val Val Gly Trp Lys

2065 2070 2075 2080

GAT TTA GAG GAT GGT TCA AAG TAT TAT TTT GAT GAA GAT ACA GCA GAA

6288

Asp Leu Glu Asp Gly Ser Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Asp Thr Ala Glu 2085 2090 2095

GCA TAT ATA GGT TTG TCA TTA ATA AAT GAT GGT CAA TAT TAT TTT AAT 6336

Ala Tyr Ile Gly Leu Ser Leu Ile Asn Asp Gly Gin Tyr Tyr Phe Asn 2100 2105 2110

GAT GAT GGA ATT ATG CAA GTT GGA TTT GTC ACT ATA AAT GAT AAA GTC 6384

Asp Asp Gly Ile Met Gin Val Gly Phe Val Thr Ile Asn Asp Lys Val 2115 2120 2125

TTC TAC TTC TCT GAC TCT GGA ATT ATA GAA TCT GGA GTA CAA AAC ATA 6432

Phe Tyr Phe Ser Asp Ser Gly Ile Ile Glu Ser Gly Val Gin Asn Ile 2130 2135 2140

GAT GAC 6480 Asp Asp 2145

AAT Asn

TAT Tyr

TTC Phe

TAT ATA Tyr Ile 2150

GAT Asp

GAT Asp

AAT Asn

GGT ATA Gly Ile 2155

GTT Val

CAA Gin

ATT Ile

GGT Gly 2160

GTA TTT

GAT

ACT

TCA

GAT GGA

TAT

AAA

TAT

TTT GCA

CCT

GCT

AAT

ACT

6528

Val Phe

Asp

Thr

Ser

Asp Gly

Tyr

Lys

Tyr

Phe Ala

Pro

Ala

Asn

Thr

2165

2170

2175

GTA AAT

GAT

AAT

ATT

TAC GGA

CAA

GCA

GTT

GAA TAT

AGT

GGT

TTA

GTT

6576

Val Asn

Asp

Asn

Ile

Tyr Gly

Gin

Ala

Val

Glu Tyr

Ser

Gly

Leu

Val

2180 2185 2190

AGA GTT 6624 Arg Val	GGG GAA Gly Glu 2195	GAT Asp	GTA Val	TAT Tyr	TAT TTT Tyr Phe 2200	GGA Gly	GAA Glu	ACA Thr	TAT ACA Tyr Thr 2205	ATT Ile	GAG Glu
ACT GGA	TGG ATA	TAT	GAT	ATG	GAA AAT	GAA	AGT	GAT	AAA TAT	TAT	TTC
6672
Thr Gly	Trp Ile	Tyr	Asp	Met	Glu Asn	Glu	Ser	Asp	Lys Tyr	Tyr	Phe
2210			2215			2220
AAT CCA	GAA ACT	AAA	AAA	GCA	TGC AAA	GGT	ATT	AAT	TTA ATT	GAT	GAT
6720
Asn Pro	Glu Thr	Lys	Lys	Ala	Cys Lys	Gly	Ile	Asn	Leu Ile	Asp	Asp
2225			2230			2235			2240
ATA AAA	TAT TAT	TTT	GAT	GAG	AAG GGC	ATA	ATG	AGA	ACG GGT	CTT	ATA
6768
Ile Lys	Tyr Tyr	Phe	Asp	Glu	Lys Gly	Ile	Met	Arg	Thr Gly	Leu	Ile
		2245			2250			2255
TCA TTT	GAA AAT	AAT	AAT	TAT	TAC TTT	AAT	GAG	AAT	GGT GAA	ATG	CAA
6816
Ser Phe	Glu Asn	Asn	Asn	Tyr	Tyr Phe	Asn	Glu	Asn	Gly Glu	Met	Gin
	2260			2265			2270
TTT GGT	TAT ATA	AAT	ATA	GAA	GAT AAG	ATG	TTC	TAT	TTT GGT	GAA	GAT
6864
Phe Gly	Tyr Ile	Asn	Ile	Glu	Asp' Lys	Met	Phe	Tyr	Phe Gly	Glu	Asp
	2275				2280				2285
GGT GTC	ATG CAG	ATT	GGA	GTA	TTT AAT	ACA	CCA	GAT	GGA TTT	AAA	TAC
6912
Gly Val	Met Gin	Ile	Gly	Val	Phe Asn	Thr	Pro	Asp	Gly Phe	Lys	Tyr
2290			2295			2300
TTT GCA	CAT CAA	AAT	ACT	TTG	GAT GAG	AAT	TTT	GAG	GGA GAA	TCA	ATA
6960
Phe Ala	His Gin	Asn	Thr	Leu	Asp Glu	Asn	Phe	Glu	Gly Glu	Ser	Ile
2305			2310			2315			2320
AAC TAT	ACT GGT	TGG	TTA	GAT	TTA GAT	GAA	AAG	AGA	TAT TAT	TTT	ACA
7008
Asn Tyr	Thr Gly	Trp	Leu	Asp	Leu Asp	Glu	Lys	Arg	Tyr Tyr	Phe	Thr
		2325			2330			2335
GAT GAA	TAT ATT	GCA	GCA	ACT	GGT TCA	GTT	ATT	ATT	GAT GGT	GAG	GAG
7056
Asp Glu	Tyr Ile	Ala	Ala	Thr	Gly Ser	Val	Ile	Ile	Asp Gly	Glu	Glu
	2340			2345			2350
TAT TAT	TTT GAT	CCT	GAT	ACA	GCT CAA	TTA	GTG	ATT	AGT GAA
7098
Tyr Tyr	Phe Asp	Pro	Asp	Thr	Ala Gin	Leu	Val	Ile	Ser Glu
	2355				2360				2365

TAG

7101 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2366 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

(xi)

POPIS SEKVENCE:

SEQ ID NO:10:

Met

Ser

Leu

Val

Asn

Arg

Lys

Gin

Leu

Glu

Lys

Met

Ala

Asn

Val

Arg

1

5

10

15

Phe

Arg

Thr

Gin

Glu

Asp

Glu

Tyr

Val

Ala

Ile

Leu

Asp

Ala

Leu

Glu

20

25

30

Glu

Tyr

His

Asn

Met

Ser

Glu

Asn

Thr

Val

Val

Glu

Lys

Tyr

Leu

Lys

35

40

45

Leu

Lys

Asp

Ile

Asn

Ser

Leu

Thr

Asp

Ile

Tyr

Ile

Asp

Thr

Tyr

Lys

50

55

60

Lys

Ser

Gly

Arg

Asn

Lys

Ala

Leu

Lys

Lys

Phe

Lys

Glu

Tyr

Leu

Val

65

70

75

80

Thr

Glu

Val

Leu

Glu

Leu

Lys

Asn

Asn

Asn

Leu

Thr

Pro

Val

Glu

Lys

85

90

95

Asn

Leu

His

Phe

Val

Trp

Ile

Gly

Gly

Gin

Ile

Asn

Asp

Thr

Ala

Ile

100

105

110

Asn

Tyr

Ile

Asn

Gin

Trp

Lys

Asp

Val

Asn

Ser

Asp

Tyr

Asn

Val

Asn

115

120

125

Val

Phe

Tyr

Asp

Ser

Asn

Ala

Phe

Leu

Ile

Asn

Thr

Leu

Lys

Lys

Thr

130

135

140

Val

Val

Glu

Ser

Ala

Ile

Asn

Asp

Thr

Leu

Glu

Ser

Phe

Arg

Glu

Asn

145

150

155

160

Leu

Asn

Asp

Pro

Arg

Phe

Asp

Tyr

Asn

Lys

Phe

Phe

Arg

Lys

Arg

Met

165

170

175

Glu

Ile

Ile

Tyr

Asp

Lys

Gin

Lys

Asn

Phe

Ile

Asn

Tyr

Tyr

Lys

Ala

180

185

190

Gin

Arg

Glu

Glu

Asn

Pro

Glu

Leu

Ile

Ile

Asp

Asp

Ile

Val

Lys

Thr

195

200

205

Tyr

Leu

Ser

Asn

Glu

Tyr

Ser

Lys

Glu

Ile

Asp

Glu

Leu

Asn

Thr

Tyr

210

215

220

Ile

Glu

Glu

Ser

Leu

Asn

Lys

Ile

Thr

Gin

Asn

Ser

Gly

Asn

Asp

Val

225

230

235

240

Arg

Asn

Phe

Glu

Glu

Phe

Lys

Asn

Gly

Glu

Ser

Phe

Asn

Leu

Tyr

Glu

245

250

255

Gin

Glu

Leu

Val

Glu

Arg

Trp

Asn

Leu

Ala

Ala

Ala

Ser

Asp

Ile

Leu

260

265

270

Arg

Ile

Ser

Ala

Leu

Lys

Glu

Ile

Gly

Gly

Met

Tyr

Leu

Asp

Val

Asp

275

280

285

Met

Leu

Pro

Gly

Ile

Gin

Pro

Asp

Leu

Phe

Glu

Ser

Ile

Glu

Lys

Pro

290

295

300

• ♦ • · * ·

• · • · • · • · • ·

• '· · · • · • · • ·

• • • · • ' ·

• · • • • • ·

• * • ·

Ser

Ser

Val

Thr

Val

Asp

Phe

Trp

Glu

Met

Thr

Lys

Leu

Glu

Ala

Ile

305

310

315

320

Met

Lys

Tyr

Lys

Glu

Tyr

Ile

Pro

Glu

Tyr

Thr

Ser

Glu

His

Phe

Asp

325

330

335

Met

Leu

Asp

Glu

Glu

Val

Gin

Ser

Ser

Phe

Glu

Ser

Val

Leu

Ala

Ser

340

345

350

Lys

Ser

Asp

Lys

Ser

Glu

Ile

Phe

Ser

Ser

Leu

Gly

Asp

Met

Glu

Ala

355

360

365

Ser

Pro

Leu

Glu

Val

Lys

Ile

Ala

Phe

Asn

Ser

Lys

Gly

Ile

Ile

Asn

370

375

380

Gin

Gly

Leu

Ile

Ser

Val

Lys

Asp

Ser

Tyr

Cys

Ser

Asn

Leu

Ile

Val

385

390

395

400

Lys

Gin

Ile

Glu

Asn

Arg

Tyr

Lys

Ile

Leu

Asn

Asn

Ser

Leu

Asn

Pro

405

410

415

Ala

Ile

Ser

Glu

Asp

Asn

Asp

Phe

Asn

Thr

Thr

Thr

Asn

Thr

Phe

Ile

420

425

430

Asp

Ser

Ile

Met

Ala

Glu

Ala

Asn

Ala

Asp

Asn

Gly

Arg

Phe

Met

Met

435

440

445

Glu

Leu

Gly

Lys

Tyr

Leu

Arg

Val

Gly

Phe

Phe

Pro

Asp

Val

Lys

Thr

4S0

455

460

Thr

Ile

Asn

Leu

Ser

Gly

Pro

Glu

Ala

Tyr

Ala

Ala

Ala

Tyr

Gin

Asp

465

470

475

480

Leu

Leu

Met

Phe

Lys

Glu

Gly

Ser

Met

Asn

Ile

His

Leu

Ile

Glu

Ala

485

490

495

Asp

Leu

Arg

Asn

Phe

Glu

Ile

Ser

Lys

Thr

Asn

Ile

Ser

Gin

Ser

Thr

500

505

510

Glu

Gin

Glu

Met

Ala

Ser

Leu

Trp

Ser

Phe

Asp

Asp

Ala

Arg

Ala

Lys

515

520

525

Ala

Gin

Phe

Glu

Glu

Tyr

Lys

Arg

Asn

Tyr

Phe

Glu

Gly

Ser

Leu

Gly

530

535

540

Glu

Asp

Asp

Asn

Leu

Asp

Phe

Ser

Gin

Asn

Ile

Val

Val

Asp

Lys

Glu

545

550

555

560

Tyr

Leu

Leu

Glu

Lys

Ile

Ser

Ser

Leu

Ala

Arg

Ser

Ser

Glu

Arg

Gly

565

570

575

Tyr

Ile

His

Tyr

Ile

Val

Gin

Leu

Gin

Gly

Asp

Lys

Ile

Ser

Tyr

Glu

580

585

590

Ala

Ala

Cys

Asn

Leu

Phe

Ala

Lys

Thr

Pro

Tyr

Asp

Ser

Val

Leu

Phe

595

600

605

Gin

Lys

Asn

Ile

Glu

Asp

Ser

Glu

Ile

Ala

Tyr

Tyr

Tyr

Asn

Pro

Gly

610

615

620

Asp

Gly

Glu

Ile

Gin

Glu

Ile

Asp

Lys

Tyr

Lys

Ile

Pro

Ser

Ile

Ile

625

630

635

640

Ser

Asp

Arg

Pro

Lys

Ile

Lys

Leu

Thr

Phe

Ile

Gly

His

Gly

Lys

Asp

645

650

655

Leu

Phe Ser 995

Thr

Gly

Leu Asn

Thr 1000

Ile

Thr Asp

Ala

Ala 1005

Lys

Val

Val

Glu

Leu Val

Ser

Thr

Ala Leu

Asp

Glu

Thr Ile

Asp

Leu

Leu

Pro

Thr

1010

1015

1020

Leu

Ser Glu

Gly

Leu

Pro Ile

Ile

Ala

Thr Ile

Ile

Asp

Gly

Val

Ser

1025

1030

1035

1040

Leu

Gly Ala

Ala

Ile

Lys Glu

Leu

Ser

Glu Thr

Ser

Asp

Pro

Leu

Leu

1045

1050

1055

Arg

Gin Glu

Ile

Glu

Ala Lys

Ile

Gly

Ile Met

Ala

Val

Asn

Leu

Thr

1060

1065

1070

Thr

Ala Thr

Thr

Ala

Ile Ile

Thr

Ser

Ser Leu

Gly

Ile

Ala

Ser

Gly

1075

1080

1085

Phe

Ser Ile

Leu

Leu

Val Pro

Leu

Ala

Gly Ile

Ser

Ala

Gly

Ile

Pro

1090

1095

1100

Ser

Leu Val

Asn

Asn

Glu Leu

Val

Leu

Arg Asp

Lys

Ala

Thr

Lys

Val

1105

1110

1115

1120

Val

Asp Tyr

Phe

Lys

His Val

Ser

Leu

Val Glu

Thr

Glu

Gly

Val

Phe

1125

1130

1135

Thr

Leu Leu

Asp

Asp

Lys Ile

Met

Met

Pro Gin

Asp

Asp

Leu

Val

Ile

1140

1145

1150

Ser

Glu Ile

Asp

Phe

Asn Asn

Asn

Ser

Ile Val

Leu

Gly

Lys

Cys

Glu

1155

1160

1165

Ile

Trp Arg

Met

Glu

Gly Gly

Ser

Gly

His Thr

Val

Thr

Asp

Asp

Ile

1170

1175

1180

Asp

His Phe

Phe

Ser

Ala Pro

Ser

Ile

Thr Tyr

Arg

Glu

Pro

His

Leu

1185

1190

1195

1200

Ser

Ile Tyr

Asp

Val

Leu Glu

Val

Gin

Lys Glu

Glu

Leu

Asp

Leu

Ser

1205

1210

1215

Lys

Asp Leu

Met

Val

Leu Pro

Asn

Ala

Pro Asn

Arg

Val

Phe

Ala

Trp

1220

1225

1230

Glu

Thr Gly

Trp

Thr

Pro Gly

Leu

Arg

Ser Leu

Glu

Asn

Asp

Gly

Thr

1235

1240

1245

Lys

Leu Leu

Asp

Arg

Ile Arg

Asp

Asn

Tyr Glu

Gly

Glu

Phe

Tyr

Trp

1250

1255

1260

Arg

Tyr Phe

Ala

Phe

Ile Ala

Asp

Ala

Leu Ile

Thr

Thr

Leu

Lys

Pro

1265

1270

1275

1280

Arg

Tyr Glu

Asp

Thr

Asn Ile

Arg

Ile

Asn Leu

Asp

Ser

Asn

Thr

Arg

1285

1290

1295

Ser

Phe Ile

Val

Pro

Ile Ile

Thr

Thr

Glu Tyr

Ile

Arg

Glu

Lys

Leu

1300

1305

1310

Ser

Tyr Ser

Phe

Tyr

Gly Ser

Gly

Gly Thr Tyr

Ala

Leu

Ser

Leu

Ser

1315

1320

1325

·· ·· · ·* • · · · · · ·

Gin Tvr 1330	Asn Met Gly	Ile Asn Ile Glu Leu Ser Glu	Ser	Asp	Val	Trp
1335	1340
Ile Ile	Asp Val Asp	Asn Val Val Arg	Asp Val Thr	Ile	Glu	Ser	Asp
1345		1350	1355				1360
Lys Ile	Lys Lys Gly	Asp Leu Ile Glu	Gly Ile Leu	Ser	Thr	Leu	Ser
	1365		1370			1375
Ile Glu	Glu Asn Lys	Ile Ile Leu Asn	Ser His Glu	Ile	Asn	Phe	Ser
	1380	1385		1390
Gly Glu	Val Asn Gly	Ser Asn Gly Phe	Val Ser Leu	Thr	Phe	Ser	Ile
	1395	1400		1405
Leu Glu	Gly Ile Asn	Ala Ile Ile Glu	Val Asp Leu	Leu	Ser	Lys	Ser
1410	1415	1420
Tyr Lys	Leu Leu Ile	Ser Gly Glu Leu	Lys Ile Leu	Met	Leu	Asn	Ser
1425		1430	1435				1440
Asn His	Ile Gin Gin	Lys Ile Asp Tyr	Ile Gly Phe	Asn	Ser	Glu	Leu
	1445	1450			1455
Gin Lys	Asn Ile Pro	Tyr Ser Phe Val	Asp Ser Glu	Gly	Lys	Glu	Asn
	1460	1465		1470
Gly Phe	Ile Asn Gly	Ser Thr Lys Glu	Gly Leu Phe	Val	Ser	Glu	Leu
	1475	1480		1485
Pro Asp	Val Val Leu	Ile Ser Lys Val	Tyr Met Asp	Asp	Ser	Lys	Pro
1490	1495	1500
Ser Phe	Gly Tyr Tyr	Ser Asn Asn Leu	Lys Asp Val	Lys	Val	Ile	Thr
1505		1510	1515				1520
Lys Asp	Asn Val Asn	Ile Leu Thr Gly	Tyr Tyr Leu	Lys	Asp	Asp	Ile
	1525	1530			1535
Lys Ile	Ser Leu Ser	Leu Thr Leu Gin	Asp Glu Lys	Thr	Ile	Lys	Leu
	1540	1545		1550
Asn Ser	Val His Leu	Asp Glu Ser Gly	Val Ala Glu	Ile	Leu	Lys	Phe
	1555	1560		1565
Met Asn	Arg Lys Gly	Asn Thr Asn Thr	Ser Asp Ser	Leu	Met	Ser	Phe
1570	1575	1580
Leu Glu	Ser Met Asn	Ile Lys Ser Ile	Phe Val Asn	Phe	Leu	Gin	Ser
1585		1590	1595				1600
Asn Ile	Lys Phe Ile	Leu Asp Ala Asn	Phe Ile Ile	Ser	Gly	Thr	Thr
	1605	1610			1615
Ser Ile	Gly Gin Phe	Glu Phe Ile Cys	Asp Glu Asn	Asp	Asn	Ile	Gin
	1620	1625		1630
Pro Tyr	Phe Ile Lys	Phe Asn Thr Leu	Glu Thr Asn	Tyr	Thr	Leu	Tyr
	1635	1640		1645
Val Gly Asn Arg Gin	Asn Met Ile Val	Glu Pro Asn	Tyr	Asp	Leu	Asp

1650 1655 1660

35:

Asp Ser 1665	Gly	Asp Ile	Ser Ser Thr Val 1670	Ile Asn Phe 1675	Ser	Gin	Lys	Tyr 1680
Leu Tyr	Gly	Ile Asp	Ser Cys Val Asn	Lvs Val Val	Ile	Ser	Pro	Asn
		1685		1690			1695
Ile Tyr	Thr	Asp Glu	Ile Asn Ile Thr	Pro Val Tyr	Glu	Thr	Asn	Asn
		1700	1705		1710
Thr Tyr	Pro	Glu Val	Ile Val Leu Asp	Ala Asn Tyr	Ile	Asn	Glu	Lys
	1715	1720		1725
Ile Asn	Val	Asn Ile	Asn Asp Leu Ser	Ile Arg Tyr	Val	Trp	Ser	Asn
173 0		1735	1740
Asp Gly	Asn	Asp Phe	Ile Leu Met Ser	Thr Ser Glu	Glu	Asn	Lys	Val
1745			1750	1755				1760
Ser Gin	Val	Lys Ile	Arg Phe Val Asn	Val Phe Lys	Asp	Lys	Thr	Leu
		1765	1770			1775
Ala Asn	Lys	Leu Ser	Phe Asn Phe Ser	Asp Lys Gin	Asp	Val	Pro	Val
		1780	1785		1790
Ser Glu	Ile	Ile Leu	Ser Phe Thr Pro	Ser Tyr Tyr	Glu	Asp	Gly	Leu
	1795	1800		1805
Ile Gly	Tyr	Asp Leu	Gly Leu Val Ser	Leu Tyr Asn	Glu	Lys	Phe	Tyr
1810		1815	1820
Ile Asn	Asn	Phe Gly	Met Met Val Ser	Gly Leu Ile	Tyr	Ile	Asn	Asp
1825			1830	1835				1840
Ser Leu	Tyr	Tyr Phe	Lys Pro Pro Val	Asn Asn Leu	Ile	Thr	Gly	Phe
		1845	1850			1855
Val Thr	Val	Gly Asp	Asp Lys Tyr Tyr	Phe Asn Pro	Ile	Asn	Gly	Gly
		1860	1865		1870
Ala Ala	Ser	Ile Gly	Glu Thr Ile Ile	Asp Asp Lys	Asn	Tyr	Tyr	Phe
	1875	1880		1885
Asn Gin	Ser	Gly Val	Leu Gin Thr Gly	Val Phe Ser	Thr	Glu	Asp	Gly
1890		1895	1900
Phe Lys	Tyr	Phe Ala	Pro Ala Asn Thr	Leu Asp Glu	Asn	Leu	Glu	Gly
1905			1910	1915				1920
Glu Ala	Ile	Asp Phe	Thr Gly Lys Leu	Ile Ile Asp	Glu	Asn	Ile	Tyr
		1925	1930			1935
Tyr Phe	Asp	Asp Asn	Tyr Arg Gly Ala	Val Glu Trp	Lys	Glu	Leu	Asp
		1940	1945		1950
Gly Glu	Met	His Tyr	Phe Ser Pro Glu	Thr Gly Lys	Ala	Phe	Lys	Gly
	1955	1960		1965
Leu Asn	Gin	Ile Gly	Asp Tyr Lys Tyr	Tyr Phe Asn	Ser	Asp	Gly	Val
1970		1975	1980

Met Gin Lys Gly Phe Val Ser Ile Asn Asp Asn Lys His Tyr Phe Asp 1985 1990 1995 2000

35^ • ·

Asp Ser Gly Val	Met 2005	Lys	Val Gly Tyr Thr Glu Ile Asp Gly Lys His
2010	2015
Phe Tyr Phe Ala	Glu	Asn	Gly Glu Met Gin Ile Gly Val	Phe Asn Thr
2020		2025	2030
Glu Asp Gly Phe	Lys	Tyr	Phe Ala His His Asn Glu Asp	Leu Gly Asn
2035			2040 2045
Glu Glu Gly Glu	Glu	Ile	Ser Tyr Ser Gly Ile Leu Asn	Phe Asn Asn
2050			2055 2060
Lys Ile Tyr Tyr	Phe	Asp	Asp Ser Phe Thr Ala Val Val	Gly Trp Lys
2065		207C	( 2075	2080
Asp Leu Glu Asp	Gly	Ser	Lys Tyr Tyr Phe Asp Glu Asp	Thr Ala Glu
	2085	2090	2095
Ala Tyr Ile Gly	Leu	Ser	Leu Ile Asn Asp Gly Gin Tyr	Tyr Phe Asn
2100		2105	2110
Asp Asp Gly Ile	Met	Gin	Val Gly Phe Val Thr Ile Asn	Asp Lys Val
2115			2120 2125
Phe Tyr Phe Ser	Asp	Ser	Gly Ile Ile Glu Ser Gly Val	Gin Asn Ile
2130			2135 2140
Asp Asp Asn Tyr	Phe	Tyr	Ile Asp Asp Asn Gly Ile Val	Gin Ile Gly
2145		2150 2155	2160
Val Phe Asp Thr	Ser	Asp	Gly Ťyř Lys Tyr Phe Ala Pro	Ala Asn Thr
	2165	2170	2175
Val Asn Asp Asn	Ile	Tyr	Gly Gin Ala Val Glu Tyr Ser	Gly Leu Val
2180		2185	2190
Arg Val Gly Glu	Asp	Val	Tyr Tyr Phe Gly Glu Thr Tyr	Thr Ile Glu
2195			2200 2205
Thr Gly Trp Ile	Tyr	Asp	Met Glu Asn Glu Ser Asp Lys	Tyr Tyr Phe
2210			2215 2220
Asn Pro Glu Thr	Lys	Lys	Ala Cys· Lys Gly Ile Asn Leu	Ile Asp Asp.
2225		2230 2235	2240
Ile Lys Tyr Tyr	Phe	Asp	Glu Lys Gly Ile Met Arg Thr	Gly Leu Ile
	2245	2250	2255
Ser Phe Glu Asn	Asn	Asn	Tyr Tyr Phe Asn Glu Asn Gly	Glu Met Gin
2260		2265	2270
Phe Gly Tyr Ile	Asn	Ile	Glu Asp Lys Met Phe Tyr Phe	Gly Glu Asp
2275			2280 2285
Gly Val Met Gin	Ile	Gly	Val Phe Asn Thr Pro Asp Gly	Phe Lys Tyr
2290			2295 2300
Phe Ala His Gin	Asn	Thr	Leu Asp Glu Asn Phe Glu Gly	Glu Ser Ile
2305		2310 2315	2320

Asn Tyr Thr Gly Trp Leu Asp Leu Asp Glu Lys Arg Tyr Tyr Phe Thr 2325 2330 2335

357 ·· • · · · · · ·· ·· »· *

Asp Glu Tyr Ile Ala Ala Thr Gly Ser Val Ile Ile Asp Gly Glu Glu 2340 2345 2350

Tyr Tyr Phe Asp Pro Asp Thr Ala Gin Leu Val Ile Ser Glu 2355 2360 (1) INFORMACE PRO SEQ ID NO:11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:11:

TAGAAAAAAT GGCAAATGT (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:12:

TTTCATCTTG TAGAGTCAAA G (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:13:

GATGCCACAA GATGATTTAG TG 22 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:14:

CTAATTGAGC TGTATCAGGA TC 22 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

358 ·· ·· ·· ·

9 9 9 9 99

9 999 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

99 99 999 ··

9 9 9

9 99

999 9 9

9 9

99

(A)	DÉLKA: 27 párů bází
(B)	TYP: nukleová kyselina
(C)	ŘETĚZEC: j ednoduchý
(D)	TOPOLOGIE: lineární
(ii) TYP	MOLEKULY: DNA (genomová)
(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:15
CGGAATTCCT AGAAAAAATG GCAAATG

(1) INFORMACE PRO SEQ ID NO:16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 26 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:16:

GCTCTAGAAT GACCATAAGC TAGCCA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:17:

CGGAATTCGA GTTGGTAGAA AGGTGGA (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 27 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:18:

CGGAATTCGG TTATTATCTT AAGGATG (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 28 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) ··» ♦ · · · · • · · · ·· ·· ·· · ··· >· ·· • · • · ·· (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:19:

CGGAATTCTT GATAACTGGA TTTGTGAC (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 511 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC: neznámý (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:20:

Leu 1

Ile Thr Gly Phe 5

Val

Thr

Val

Gly Asp Asp 10

Lys Tyr

Tyr

Phe Asn 15

Pro

Ile

Asn

Gly

Gly

Ala

Ala

Ser

Ile

Gly

Glu

Thr

Ile

Ile

Asp

Asp

20

25

30

Lys

Asn

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Gin

Ser

Gly

Val

Leu

Gin

Thr

Gly

Val

Phe

35

40

45

Ser

Thr

Glu

Asp

Gly

Phe

Lys

Tyr

Phe

Ala

Pro

Ala

Asn

Thr

Leu

Asp

50

55

60

Glu

Asn

Leu

Glu

Gly

Glu

Ala

Ile

Asp

Phe

Thr

Gly

Lys

Leu

Ile

Ile

65

70

75

80

Asp

Glu

Asn

Ile

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Asp

Asn

Tyr

Arg

Gly

Ala

Val

Glu

85

90

95

Trp

Lys

Glu

Leu

Asp

Gly

Glu

Met

His

Tyr

Phe

Ser

Pro

Glu

Thr

Gly

100

105

110

Lys

Ala

Phe

Lys

Gly

Leu

Asn

Gin

Ile

Gly

Asp

Tyr

Lys

Tyr

Tyr

Phe

115

120

125

Asn

Ser

Asp

Gly

Val

Met

Gin

Lys

Gly

Phe

Val

Ser

Ile

Asn

Asp

Asn

130

135

140

Lys

His

Tyr

Phe

Asp

Asp

Ser

Gly

Val

Met

Lys

Val

Gly

Tyr

Thr

Glu

145

150

155

160

Ile

Asp

Gly

Lys

His

Phe

Tyr

Phe

Ala

Glu

Asn

Gly

Glu

Met

Gin

Ile

165

170

175

Gly

Val

Phe

Asn

Thr

Glu

Asp

Gly

Phe

Lys

Tyr

Phe

Ala

His

His

Asn

180

185

190

Glu

Asp

Leu

Gly

Asn

Glu

Glu

Gly

Glu

Glu

Ile

Ser

Tyr

Ser

Gly

Ile

195

200

205

Leu

Asn

Phe

Asn

Asn

Lys

Ile

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Asp

Ser

Phe

Thr

Ala

210

215

220

Val

Val

Gly

Trp

Lys

Asp

Leu

Glu

Asp

Gly

Ser

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asp

225

230

235

240

• • • •

• · • · · · • · ·

• • » · • • ·

• · • • • •

• • ♦ •

• * • ··· · ♦ · • ·

• · • ·

• • ·

Glu

Asp

Thr

Ala

Glu

Ala

Tyr

Ile

Gly

Leu

Ser

Leu

Ile

Asn

Asp

Gly

245

250

255

Gin

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Asp

Asp

Gly

Ile

Met

Gin

Val

Gly

Phe

Val

Thr

260

265

270

Ile

Asn

Asp

Lys

Val

Phe

Tyr

Phe

Ser

Asp

Ser

Gly

Ile

Ile

Glu

Ser

275

280

285

Gly

Val

Gin

Asn

Ile

Asp

Asp

Asn

Tyr

Phe

Tyr

Ile

Asp

Asp

Asn

Gly

290

295

300

Ile

Val

Gin

Ile

Gly

Val

Phe

Asp

Thr

Ser

Asp

Gly

Tyr

Lys

Tyr

Phe

305

310

315

320

Ala

Pro

Ala

Asn

Thr

Val

Asn

Asp

Asn

Ile

Tyr

Gly

Gin

Ala

Val

Glu

325

330

335

Tyr

Ser

Gly

Leu

Val

Arg

Val

Gly

Glu

Asp

Val

Tyr

Tyr

Phe

Gly

Glu

340

345

350

Thr

Tyr

Thr

Ile

Glu

Thr

Gly

Trp

Ile

Tyr

Asp

Met

Glu

Asn

Glu

Ser

355

360

365

Asp

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Pro

Glu

Thr

Lys

Lys

Ala

Cys

Lys

Gly

Ile

370

375

380

Asn

Leu

Ile

Asp

Asp

Ile

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Glu

Lys

Gly

Ile

Met

385

390

395

400

Arg

Thr

Gly

Leu

Ile

Ser

Phe

Glu

Asn

Asn

Asn

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Glu

405

410

415

Asn

Gly

Glu

Met

Gin

Phe

Gly

Tyr

Ile

Asn

Ile

Glu

Asp

Lys

Met

Phe

420

425

430

Tyr

Phe

Gly

Glu

Asp

Gly

Val

Met

Gin

Ile

Gly

Val

Phe

Asn

Thr

Pro

435

440

445

Asp

Gly

Phe

Lys

Tyr

Phe

Ala

His

Gin

Asn

Thr

Leu

Asp

Glu

Asn

Phe

450

455

460

Glu

Gly

Glu

Ser

Ile

Asn

Tyr

Thr

Gly

Trp

Leu

Asp

Leu

Asp

Glu

Lys

465

470

475

480

Arg

Tyr

Tyr

Phe

Thr

Asp

Glu

Tyr

Ile

Ala

Ala

Thr

Gly

Ser

Val

Ile

485

490

495

Ile

Asp

Gly

Glu

Glu

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Pro

Asp

Thr

Ala

Gin

Leu

500

505

510

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 608 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC: neznámý (D) TOPOLOGIE: neznámá (ii) TYP MOLEKULY: protein

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:21:

Ser Glu 1

Glu

Asn Lys Val 5

Ser Gin

Val

Lys 10

Ile

Arg

Phe

Val

Asn 15

Val

Phe

Lys

Asp

Lys

Thr

Leu

Ala

Asn

Lys

Leu

Ser

Phe

Asn

Phe

Ser

Asp

20

25

30

Lys

Gin

Asp

Val

Pro

Val

Ser

Glu

Ile

Ile

Leu

Ser

Phe

Thr

Pro

Ser

35

40

45

Tyr

Tyr

Glu

Asp

Gly

Leu

Ile

Gly

Tyr

Asp

Leu

Gly

Leu

Val

Ser

Leu

50

55

60

Tyr

Asn

Glu

Lys

Phe

Tyr

Ile

Asn

Asn

Phe

Gly

Met

Met

Val

Ser

Gly

65

70

75

80

Leu

Ile

Tyr

Ile

Asn

Asp

Ser

Leu

Tyr

Tyr

Phe

Lys

Pro

Pro

Val

Asn

85

90

95

Asn

Leu

Ile

Thr

Gly

Phe

Val

Thr

Val

Gly

Asp

Asp

Lys

Tyr

Tyr

Phe

100

105

110

Asn

Pro

Ile

Asn

Gly

Gly

Ala

Ala

Ser

Ile

Gly

Glu

Thr

Ile

Ile

Asp

115

120

125

Asp

Lys

Asn

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Gin

Ser

Gly

Val

Leu

Gin

Thr

Gly

Val

130

135

140

Phe

Ser

Thr

Glu

Asp

Gly

Phe

Lys

Tyr

Phe

Ala

Pro

Ala

Asn

Thr

Leu

145

150

155

160

Asp

Glu

Asn

Leu

Glu

Gly

Glu

Ala

Ile

Asp

Phe

Thr

Gly

Lys

Leu

Ile

165

170

175

Ile

Asp

Glu

Asn

Ile

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Asp

Asn

Tyr

Arg

Gly

Ala

Val

180

185

190

Glu

Trp

Lys

Glu

Leu

Asp

Gly

Glu

Met

His

Tyr

Phe

Ser

Pro

Glu

Thr

195

200

205

Gly

Lys

Ala

Phe

Lys

Gly

Leu

Asn

Gin

Ile

Gly

Asp

Tyr

Lys

Tyr

Tyr

210

215

220

Phe

Asn

Ser

Asp

Gly

Val

Met

Gin

Lys

Gly

Phe

Val

Ser

Ile

Asn

Asp

225

230

235

240

Asn

Lys

His

Tyr

Phe

Asp

Asp

Ser

Gly

Val

Met

Lys

Val

Gly

Tyr

Thr

245

250

255

Glu

Ile

Asp

Gly

Lys

His

Phe

Tyr

Phe

Ala

Glu

Asn

Gly

Glu

Met

Gin

260

265

270

Ile

Gly

Val

Phe

Asn

Thr

Glu

Asp

Gly

Phe

Lys

Tyr

Phe

Ala

His

His

275

280

285

Asn

Glu

Asp

Leu

Gly

Asn

Glu

Glu

Gly

Glu

Glu

Ile

Ser

Tyr

Ser

Gly

290

295

300

Ile

Leu

Asn

Phe

Asn

Asn

Lys

Ile

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Asp

Ser

Phe

Thr

305

310

315

320

Ala

Val

Val

Gly

Trp

Lys

Asp

Leu

Glu

Asp

Gly

Ser

Lys

Tyr

Tyr

Phe

325

330

335

Asp

Glu

Asp

Thr

Ala

Glu

Ala

Tyr

Ile

Gly

Leu

Ser

Leu

Ile

Asn

Asp

340

345

350

Gly Gin Tyr Tyr Phe Asn Asp Asp Gly Ile Met Gin Val Gly Phe Val 355 360 365

----------------'οσζ « «

F.a........ • · • · · ·

• • • · • • «

• · 5 4» · • · • · -··

1 • •

> · • · · · • · • ·

• « • « • ·

• • • ·

Thr

Ile

Asn

Asp

Lys

Val

Phe

Tyr

Phe

Ser

Asp

Ser

Gly

Ile

Ile

Glu

370

375

380

Ser

Gly

Val

Gin

Asn

Ile

Asp

Asp

Asn

Tyr

Phe

Tyr

Ile

Asp

Asp

Asn

385

390

395

400

Gly

Ile

Val

Gin

Ile

Gly

Val

Phe

Asp

Thr

Ser

Asp

Gly

Tyr

Lys

Tyr

405

410

415

Phe

Ala

Pro

Ala

Asn

Thr

Val

Asn

Asp

Asn

Ile

Tyr

Gly

Gin

Ala

Val

420

425

430

Glu

Tyr

Ser

Gly

Leu

Val

Arg

Val

Gly

Glu

Asp

Val

Tyr

Tyr

Phe

Gly

435

440

445

Glu

Thr

Tyr

Thr

Ile

Glu

Thr

Gly

Trp

Ile

Tyr

Asp

Met

Glu

Asn

Glu

450

455

460

Ser

Asp

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Pro

Glu

Thr

Lys

Lys

Ala

Cys

Lys

Gly

465

470

475

480

Ile

Asn

Leu

Ile

Asp

Asp

Ile

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Glu

Lys

Gly

Ile

485

490

495

Met

Arg

Thr

Glv

Leu

Ile

Ser

Phe

Glu

Asn

Asn

Asn

Tyr

Tyr

Phe

Asn

500

505

510

Glu

Asn

Gly

Glu

Met

Gin

Phe

Gly

Tyr

Ile

Asn

Ile

Glu

Asp

Lys

Met

515

520

525

Phe

Tyr

Phe

Gly

Glu

Asp

Gly

Val

Met

Gin

Ile

Gly

Val

Phe

Asn

Thr

530

535

540

Pro

Asp

Gly

Phe

Lys

Tyr

Phe

Ala

His

Gin

Asn

Thr

Leu

Asp

Glu

Asn

545

550

555

560

Phe

Glu

Gly

Glu

Ser

Ile

Asn

Tyr

Thr

Gly

Trp

Leu

Asp

Leu

Asp

Glu

565

570

575

Lys

Arg

Tyr

Tyr

Phe

Thr

Asp

Glu

Tyr

Ile

Ala

Ala

Thr

Gly

Ser

Val

580

585

590

Ile

Ile

Asp

Gly

Glu

’ Glu

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Pro

Asp

Thr

Ala

Gin

Leu

595

600

605

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

		(A) (B) (C) (D)	DÉLKA: 1330 párů bází TYP: nukleová kyselina ŘETĚZEC: dvoj itý
TOPOLOGIE:	lineární
	(ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) RYS: (A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) POLOHA: 1..1314 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:22:	)
ATG	GCT CGT	CTG	CTG TCT ACC	TTC ACT GAA	TAC	ATC	AAG	AAC	ATC	ATC
48 Met 1	Ala Arg	Leu	Leu Ser Thr 5	Phe Thr Glu 10	Tyr	Ile	Lys	Asn	Ile 15	Ile
AAT	ACC TCC	ATC	CTG AAC CTG	CGC TAC GAA	TCC	AAT	CAC	CTG	ATC	GAC
96 Asn	Thr Ser	Ile 20	Leu Asn Leu	Arg Tyr Glu 25	Ser	Asn	His	Leu 30	Ile	Asp

• · • ·

AAT 816

CTG

TAC

GAT

CCG

AAC

AAA

TAC

GTT

GAC

GTC

AAC

AAT

GTA

GGT

ATC

Asn

Leu

Tyr

Asp 260

Pro

Asn

Lys

Tyr

Val 265

Asp

Val

Asn

Asn

Val 270

Gly

Ile

CGC 864

GGT

TAC

ATG

TAC

CTG

AAA

GGT

CCG

CGT

GGT

TCT

GTT

ATG

ACT

ACC

Arg

Gly

Tyr 275

Met

Tyr

Leu

Lys

Gly 280

Pro

Arg

Gly

Ser

Val 285

Met

Thr

Thr

AAC 912

ATC

TAC

CTG

AAC

TCT

TCC

CTG

TAC

CGT

GGT

ACC

AAA

TTC

ATC

ATC

Asn

Ile 290

Tyr

Leu

Asn

Ser

Ser 295

Leu

Tyr

Arg

Gly

Thr -300

Lys

Phe

Ile

Ile

AAG 960

AAA

TAC

GCG

TCT

GGT

AAC

AAG

GAC

AAT

ATC

GTT

CGC

AAC

AAT

GAT

Lys 305

Lys

Tyr

Ala

Ser

Gly 310

Asn

Lys

Asp

Asn

Ile 315

Val

Arg

Asn

Asn

Asp 320

CGT

GTA

TAC

ATC

AAT

GTT

GTA

GTT

AAG

AAC

AAA

GAA

TAC

CGT

CTG

GCT

1008

Arg Val

Tyr

Ile

Asn

Val

Val

Val

Lys

Asn

Lys

Glu

Tyr

Arg

Leu

Ala

325

330

335

ACC AAT

GCT

TCT

CAG

GCT

GGT

GTA

GAA

AAG

ATC

TTG

TCT

GCT

CTG

GAA

1056

Thr Asn

Ala

Ser

Gin

Ala

Gly

Val

Glu

Lys

Ile

Leu

Ser

Ala

Leu

Glu

340

345

350

ATC CCG

GAC

GTT

GGT

AAT

CTG

TCT

CAG

GTA

GTT

GTA

ATG

AAA

TCC

AAG

1104

Ile Pro

Asp

Val

Gly

Asn

Leu

Ser

Gin

Val

Val

Val

Met

Lys

Ser

Lys

355

360

365

AAC GAC

CAG

GGT

ATC

ACT

AAC

AAA

TGC

AAA

ATG

AAT

CTG

CAG

GAC

AAC

1152

Asn Asp

Gin

Gly

Ile

Thr

Asn

Lys

Cys

Lys

Met

Asn

Leu

Gin

Asp

Asn

370

375

380

AAT GGT

AAC

GAT

ATC

GGT

TTC

ATC

GGT

TTC

CAC

CAG

TTC

AAC

AAT

ATC

1200

Asn Gly

Asn

Asp

Ile

Gly

Phe

Ile

Gly

Phe

His

Gin

Phe

Asn

Asn

Ile

385

390

395

400

GCT AAA

CTG

GTT

GCT

TCC

AAC

TGG

TAC

AAT

CGT

CAG

ATC

GAA

CGT

TCC

1248

Ala Lys

Leu

Val

Ala

Ser

Asn

Trp

Tyr

Asn

Arg

Gin

Ile

Glu

Arg

Ser

405

410

415

TCT CGC

ACT

CTG

GGT

TGC

TCT

TGG

GAG

TTC

ATC

CCG

GTT

GAT

GAC

GGT

1296

Ser Arg

Thr

Leu

Gly

Cys

Ser

Trp

Glu

Phe

Ile

Pro

Val

Asp

Asp

Gly

420

425

430

TGG GGT

GAA

CGT

CCG

CTG

TAACCCGGGA AAGCTT

1330

Trp Gly

Glu

Arg

Pro

Leu

435

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 438 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:23:

• · · ·

• · • ·

• · • ·

•

• • «

• • w ·

« ·

370

375

380

Asn 385

Gly

Asn

Asp

Ile

Gly 390

Phe

Ile

Gly

Phe

His 395

Gin

Phe

Asn

Asn

Ile 400

Ala

Lys

Leu

Val

Ala 405

Ser

Asn

Trp

Tyr

Asn 410

Arg

Gin

Ile

Glu

Arg 415

Ser

Ser

Arg

Thr

Leu 420

Gly

Cys

Ser

Trp

Glu 425

Phe

Ile

Pro

Val

Asp 430

Asp

Gly

Trp

Gly

Glu

Arg

Pro

Leu

435 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC: neznámý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:24:

Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His
1	5	10	15
Ile	Glu Gly Arg His Met Ala
	20
(2)	INFORMACE PRO SEQ ID NO:	:25 :

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1402 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: dvojitý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová) (ix) RYS:

(A) NÁZEV/KLÍČ: CDS (B) POLOHA: 1..1386

ATG 48 Met 1

(xi) GGC Gly

POPIS

SEKVENCE

: SEQ ID NO CAT CAT CAT

:25 : CAT CAT CAC AGC AGC GGC

CAT His

CAT His

CAT His

CAT His 5

CAT His

His

His

His

His 10

His

His

Ser

Ser

Gly 15

ATC 96

GAA

GGT

CGT

CAT

ATG

GCT

AGC

ATG

GCT

CGT

CTG

CTG

TCT

ACC

TTC

Ile

Glu

Gly

Arg 20

His

Met

Ala

Ser

Met 25

Ala

Arg

Leu

Leu

Ser 30

Thr

Phe

ACT 144

GAA

TAC

ATC

AAG

AAC

ATC

ATC

AAT

ACC

TCC

ATC

CTG

AAC

CTG

CGC

Thr

Glu

Tyr 35

Ile

Lys

Asn

Ile

Ile 40

Asn

Thr

Ser

Ile

Leu 45

Asn

Leu

Arg

TAC 192

GAA

TCC

AAT

CAC

CTG

ATC

GAC

CTG

TCT

CGC

TAC

GCT

TCC

AAA

ATC

Tyr

Glu 50

Ser

Asn

His

Leu

Ile 55

Asp

Leu

Ser

Arg

Tyr 60

Ala

Ser

Lys

Ile

AAC 240

ATC

GGT

TCT

AAA

GTT

AAC

TTC

GAT

CCG

ATC

GAC

AAG

AAT

CAG

ATC

• ·

Asn 65

Ile

Gly

Ser

Lys

Val 70

Asn

Phe

Asp

Pro

Ile 75

Asp

Lys

Asn

Gin

Ile 80

CAG 288

CTG

TTC

AAT

CTG

GAA

TCT

TCC

AAA

ATC

GAA

GTT

ATC

CTG

AAG

AAT

Gin

Leu

Phe

Asn

Leu 85

Glu

Ser

Ser

Lys

Ile 90

Glu

Val

Ile

Leu

Lys 95

Asn

GCT 336

ATC

GTA

TAC

AAC

TCT

ATG

TAC

GAA

AAC

TTC

TCC

ACC

TCC

TTC

TGG

Ala

Ile

Val

Tyr 100

Asn

Ser

Met

Tyr

Glu 105

Asn

Phe

Ser

Thr

Ser 110.

Phe

Trp

ATC 384

CGT

ATC

CCG

AAA

TAC

TTC

AAC

TCC

ATC

TCT

CTG

AAC

AAT

GAA

TAC

Ile

Arg

Ile 115

Pro

Lys

Tyr

Phe

Asn 120

Ser

Ile

Ser

Leu

Asn 125

Asn

Glu

Tyr

ACC 432

ATC

ATC

AAC

TGC

ATG

GAA

AAC

AAT

TCT

GGT

TGG

AAA

GTA

TCT

CTG

Thr

Ile 130

Ile

Asn

Cys

Met

Glu 135

Asn

Asn

Ser

Gly

Trp 140

Lys

Val

Ser

Leu

AAC 480

TAC

GGT

GAA

ATC

ATC

TGG

ACT

CTG

CAG

GAC

ACT

CAG

GAA

ATC

AAA

Asn 145

Tyr

Gly

Glu

Ile

Ile 150

Trp

Thr

Leu

Gin

Asp 155

Thr

Gin

Glu

Ile

Lys 160

CAG 528

CGT

GTT

GTA

TTC

AAA

TAC

TCT

CAG

ATG

ATC

AAC

ATC

TCT

GAC

TAC

Gin

Arg

Val

Val

Phe 165

Lys

Tyr

Ser

Gin

Met 170

Ile

Asn

Ile

Ser

Asp 175

Tyr

ATC 576

AAT

CGC

TGG

ATC

TTC

GTT

ACC

ATC

ACC

AAC

AAT

CGT

CTG

AAT

AAC

Ile

Asn

Arg

Trp 180

Ile

Phe

Val

Thr

Ile 185

Thr

Asn

Asn

Arg

Leu 190

Asn

Asn

TCC 624

AAA

ATC

TAC

ATC

AAC

GGC

CGT

CTG

ATC

GAC

CAG

AAA

CCG

ATC

TCC

Ser

Lys

Ile 195

Tyr

Ile

Asn

Gly

Arg 200

Leu

Ile

Asp

Gin

Lys 205

Pro

Ile

Ser

AAT 672

CTG

GGT

AAC

ATC

CAC

GCT

TCT

AAT

AAC

ATC

ATG

TTC

AAA

CTG

GAC

Asn

Leu 210

Gly

Asn

Ile

His

Ala 215

Ser

Asn

Asn

Ile

Met 220

Phe

Lys

Leu

Asp

GGT 720

TGT

CGT

GAC

ACT

CAC

CGC

TAC

ATC

TGG

ATC

AAA

TAC

TTC

AAT

CTG

Gly 225

Cys

Arg

Asp

Thr

His 230

Arg

Tyr

Ile

Trp

Ile 235

Lys

Tyr

Phe

Asn

Leu 240

TTC 768

GAC

AAA

GAA

CTG

AAC

GAA

AAA

GAA

ATC

AAA

GAC

CTG

TAC

GAC

AAC

Phe

Asp

Lys

Glu

Leu 245

Asn

Glu

Lys

Glu

Ile 250

Lys

Asp

Leu

Tyr

Asp 255

Asn

CAG

TCC

AAT

TCT

GGT

ATC

CTG

AAA

GAC

TTC

TGG

GGT

GAC

TAC

CTG

CAG

816 Gin

Ser

Asn

Ser 260

Gly

Ile

Leu

Lys

Asp 265

Phe

Trp

Gly

Asp

Tyr 270

Leu

Gin

TAC

GAC

AAA

CCG

TAC

TAC

ATG

CTG

AAT

CTG

TAC

GAT

CCG

AAC

AAA

TAC

864 Tyr

Asp

Lys 275

Pro

Tyr

Tyr

Met

Leu 280

Asn

Leu

Tyr

Asp

Pro 285

Asn

Lys

Tyr

GTT GAC GTC AAC AAT GTA GGT ATC CGC GGT TAC ATG TAC CTG AAA GGT 912

• 9 • · • · • « • ·

• • · · • · • · • r

• • • · ’ .♦ •

• · 9 • • • ·

• •

Val Asp

Val

Asn

Asn

Val

Gly

Ile

Arg

Gly

Tyr

Met

Tyr

Leu

Lys

Gly

290

1

295

300

CCG CGT

GGT

TCT

GTT

ATG

ACT

ACC

AAC

ATC

TAC

CTG

AAC

TCT

TCC

CTG

960 Pro Arg

Gly

Ser

Val

Met

Thr

Thr

Asn

Ile

Tyr

Leu

Asn

Ser

Ser

Leu

305

310

315

320

TAC CGT 1008

GGT

ACC

AAA

TTC

ATC

ATC

AAG

AAA

TAC

GCG

TCT

GGT

AAC

AAG

Tyr Arg

Gly

Thr

Lys

Phe

Ile

Ile

Lys

Lys

Tyr

Ala

Ser

Gly

Asn

Lys

325

330

335

GAC AAT 1056

ATC

GTT

CGC

AAC

AAT

GAT

CGT

GTA

TAC

ATC

AAT

GTT

GTA

GTT

Asp Asn

Ile

Val

Arg

Asn

Asn

Asp

Arg

Val

Tyr

Ile

Asn

Val

Val

Val

340

345

350

AAG AAC

AAA

GAA

TAC

CGT

CTG

GCT

ACC

AAT

GCT

TCT

CAG

GCT

GGT

GTA

1104 Lys Asn

Lys

Glu

Tyr

Arg

Leu

Ala

Thr

Asn

Ala

Ser

Gin

Ala

Gly

Val

355

360

365

GAA AAG

ATC

TTG

TCT

GCT

CTG

GAA

ATC

CCG

GAC

GTT

GGT

AAT

CTG

TCT

1152 Glu Lys

Ile

Leu

Ser

Ala

Leu

Glu

Ile

Pro

Asp

Val

Gly

Asn

Leu

Ser

370

375

380

CAG GTA

GTT

GTA

ATG

AAA

TCC

AAG

AAC

GAC

CAG

GGT

ATC

ACT

AAC

AAA

1200 Gin Val

Val

Val

Met

Lys

Ser

Lys

Asn

Asp

Gin

Gly

Ile

Thr

Asn

Lys

385

390

395

400

TGC AAA 1248

ATG

AAT

CTG

CAG

GAC

AAC

AAT

GGT

AAC

GAT

ATC

GGT

TTC

ATC

Cys Lys

Met

Asn

Leu

Gin

Asp

Asn

Asn

Gly

Asn

Asp

Ile

Gly

Phe

Ile

405

410

415

GGT TTC 1296

CAC

CAG

TTC

AAC

AAT

ATC

GCT

AAA

CTG

GTT

GCT

TCC

AAC

TGG

Gly Phe

His

Gin

Phe

Asn

Asn

Ile

Ala

Lys

Leu

Val

Ala

Ser

Asn

Trp

420

425

430

TAC AAT 1344

CGT

CAG

ATC

GAA

CGT

TCC

TCT

CGC

ACT

CTG

GGT

TGC

TCT

TGG

Tyr Asn

Arg

Gin

Ile

Glu

Arg

Ser

Ser

Arg

Thr

Leu

Gly

Cys

Ser

Trp

435

440

445

GAG TTC

ATC

CCG

GTT

GAT

GAC

GGT

TGG

GGT

GAA

CGT

CCG

CTG

1386 Glu Phe

Ile

Pro

Val

Asp

Asp

Gly

Trp

Gly

Glu

Arg

Pro

Leu

450 455 460

TAACCCGGGA AAGCTT

1402 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 462 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:26:

Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His 5 10 15

Met

• ·				•	• ·	•____	• ·		• ·
•	•	•			• ·	• ·	• ·	•		•
•	•	•	•	•	« ·	•	• ·		• ·
•	•	•		»	• · ·	« ·	• · ·	•		•
•	«	•		•	* *	•	•	•
• · ·			•	•	• ·	• · ·	• ·		<· 9

Ile

Glu

Gly

Arg 20

His

Met

Ala

Ser

Met 25

Ala

Arg

Leu

Leu

Ser 30

Thr

Phe

Thr

Glu

Tyr 35

Ile

Lys

Asn

Ile

Ile 40

Asn

Thr

Ser

Ile

Leu 45

Asn

Leu

Arg

Tyr

Glu 50

Ser

Asn

His

Leu

Ile 55

Asp

Leu

Ser

Arg

Tyr 60

Ala

Ser

Lys

Ile

Asn 65

Ile

Gly

Ser

Lys

Val 70

Asn

Phe

Asp

Pro

Ile 75

Asp

Lys

Asn

Gin

Ile 80

Gin

Leu

Phe

Asn

Leu 85

Glu

Ser

Ser

Lys

Ile 90

Glu

Val

Ile

Leu

Lys 95

Asn

Ala

Ile

Val

Tyr 100

Asn

Ser

Met

Tyr

Glu 105

Asn

Phe

Ser

Thr

Ser 110

Phe

Trp

Ile

Arg

Ile 115

Pro

Lys

Tyr

Phe

Asn 120

Ser

Ile

Ser

Leu

Asn 125

Asn

Glu

Tyr

Thr

Ile 130

Ile

Asn

Cys

Met

Glu 135

Asn

Asn

Ser

Gly

Trp 140

Lys

Val

Ser

Leu

Asn 145

Tyr

Gly

Glu

Ile

Ile 150

Trp

Thr

Leu

Gin

Asp 155

Thr

Gin

Glu

Ile

Lys 160

Gin

Arg

Val

Val

Phe 165

Lys

Tyr

Ser

Gin

Met 170

Ile

Asn

Ile

Ser

Asp 175

Tyr

Ile

Asrt

Arg

Trp 180

Ile

Phe

Val

Thr

Ile 185

Thr

Asn

Asn

Arg

Leu 190

Asn

Asn

Ser

Lys

Ile 195

Tyr

Ile

Asn

Gly

Arg 200

Leu

Ile

Asp

Gin

Lys 205

Pro

Ile

Ser

Asn

Leu 210

Gly

Asn

Ile

His

Ala 215

Ser

Asn

Asn

Ile

Met 220

Phe

Lys

Leu

Asp

Gly 225

Cys

Arg

Asp

Thr

His 230

Arg

Tyr

Ile

Trp

Ile 235

Lys

Tyr

Phe

Asn

Leu 240

Phe

Asp

Lys

Glu

Leu 245

Asn

Glu

Lys

Glu

Ile 250

Lys

Asp

Leu

Tyr

Asp 255

Asn

Gin

Ser

Asn

Ser 260

Gly

Ile

Leu

Lys

Asp 265

Phe

Trp

Gly

Asp

Tyr 270

Leu

Gin

Tyr

Asp

Lys 275

Pro

Tyr

Tyr

Met

Leu 280

Asn

Leu

Tyr

Asp

Pro 285

Asn

Lys

Tyr

Val

Asp 290

Val

Asn

Asn

Val

Gly 295

Ile

Arg

Gly

Tyr

Met 300

Tyr

Leu

Lys

Gly

Pro 3 05

Arg

Gly

Ser

Val

Met 310

Thr

Thr

Asn

Ile

Tyr 315

Leu

Asn

Ser

Ser

Leu 320

Tyr

Arg

Gly

Thr

Lys 325

Phe

Ile

Ile

Lys

Lys 330

Tyr

Ala

Ser

Gly

Asn 335

Lys

Asp

Asn

Ile

Val 340

Arg

Asn

Asn

Asp

Arg 345

Val

Tyr

Ile

Asn

Val 350

Val

Val

Lys Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gin Ala Gly Val 355 360 365

Glu Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn Leu Ser 370 375 380

Gin Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gin Gly Ile Thr Asn Lys

385 390 395 400

Cys Lys Met Asn Leu Gin Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly Phe Ile

405 410 415

Gly Phe His Gin Phe Asn Asn Ile Ala Lys Leu Val Ala Ser Asn Trp 420 425 430

Tyr Asn Arg Gin	Ile Glu Arg Ser Ser Arg Thr Leu Gly Cys	Ser Trp
	435	440	445
Glu	Phe Ile Pro	Val Asp Asp Gly Trp Gly	Glu Arg Pro Leu
	450	455	460
(2)	INFORMACE PRO SEQ ID NO:27:
	(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 3891 párů bází
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	ŘETĚZEC: dvojitý
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
	(ii) TYP MOLEKULY: DNA (genomová)
	(ix) RYS:
	(A)	NÁZEV/KLÍČ: CDS
	(B)	POLOHA: 1..3888
	(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:27:
ATG	CAA TTT GTT	AAT AAA CAA TTT AAT TAT	AAA GAT CCT GTA	AAT GGT
48
Met	Gin Phe Val	Asn Lys Gin Phe Asn Tyr	Lys Asp Pro Val	Asn Gly
1		5 10		15
GTT	GAT ATT GCT	TAT ATA AAA ATT CCA AAT	GTA GGA CAA ATG	CAA CCA
96
Val	Asp Ile Ala	Tyr Ile Lys Ile Pro Asn	Val Gly Gin Met	Gin Pro
	20	25	30
GTA	AAA GCT TTT	AAA ATT CAT AAT AAA ATA	TGG GTT ATT CCA	GAA AGA
144
Val	Lys Ala Phe	Lys Ile His Asn Lys Ile	Trp Val Ile Pro	Glu Arg
	35	40	45
GAT	ACA TTT ACA	AAT CCT GAA GAA GGA GAT	TTA AAT CCA CCA	CCA GAA
192
Asp	Thr Phe Thr	Asn Pro Glu Glu Gly Asp	Leu Asn Pro Pro	Pro Glu
	50	55	60
GCA	AAA CAA GTT	CCA GTT TCA TAT TAT GAT	TCA ACA TAT TTA	AGT ACA
240
Ala	Lys Gin Val	Pro Val Ser Tyr Tyr Asp	Ser Thr Tyr Leu	Ser Thr
6 5		70	75	80
GAT	AAT GAA AAA	GAT AAT TAT TTA AAG GGA	GTT ACA AAA TTA	TTT GAG
288
Asp	Asn Glu Lys	Asp Asn Tyr Leu Lys Gly	Val Thr Lys Leu	Phe Glu
		85 90		95
AGA	ATT TAT TCA	ACT GAT CTT GGA AGA ATG	TTG TTA ACA TCA	ATA GTA
336 Arg	Ile Tyr Ser	Thr Asp Leu Gly Arg Met	Leu Leu Thr Ser	Ile Val
	100	105	110

4 4 4

• · • 4 • 4 • 4 « 4 « »

« · k k · · » · • ' « ·

• · • • • · • • ·

* « • • • •

• • • •

AGG

GGA

ATA

CCA

TTT

TGG

GGT

GGA

AGT

ACA

ATA

GAT

ACA

GAA

TTA

AAA

384

Arg

Gly

Ile

Pro

Phe

Trp

Gly

Gly

Ser

Thr

Ile

Asp

Thr

Glu

Leu

Lys

115

120

125

GTT

ATT

GAT

ACT

AAT

TGT

ATT

AAT

GTG

ATA

CAA

CCA

GAT

GGT

AGT

TAT

432

Val

Ile

Asp

Thr

Asn

Cys

Ile

Asn

Val

Ile

Gin

Pro

Asp

Gly

Ser

Tyr

130

135

140

AGA

TCA

GAA

GAA

CTT

AAT

CTA

GTA

ATA

ATA

GGA

CCC

TCA

GCT

GAT

ATT

480

Arg

Ser

Glu

Glu

Leu

Asn

Leu

Val

Ile

Ile

Gly

Pro

Ser

Ala

Asp

Ile

145

150

155

160

ATA

CAG

TTT

GAA

TGT

AAA

AGC

TTT

GGA

CAT

GAA

GTT

TTG

AAT

CTT

ACG

528

Ile

Gin

Phe

Glu

Cys

Lys

Ser

Phe

Gly

His

Glu

Val

Leu

Asn

Leu

Thr

165

170

175

CGA

AAT

GGT

TAT

GGC

TCT

ACT

CAA

TAC

ATT

AGA

TTT

AGC

CCA

GAT

TTT

576

Arg

Asn

Gly

Tyr

Gly

Ser

Thr

Gin

Tyr

Ile

Arg

Phe

Ser

Pro

Asp

Phe

180

185

190

ACA

TTT

GGT

TTT

GAG

GAG

TCA

CTT

GAA

GTT

GAT

ACA

AAT

CCT

CTT

TTA

624

Thr

Phe

Gly

Phe

Glu

Glu

Ser

Leu

Glu

Val

Asp

Thr

Asn

Pro

Leu

Leu

195

200

205

GGT

GCA

GGC

AAA

TTT

GCT

ACA

GAT

CCA

GCA

GTA

ACA

TTA

GCA

CAT

GAA

672

Gly

Ala

Gly

Lys

Phe

Ala

Thr

Asp

Pro

Ala

Val

Thr

Leu

Ala

His

Glu

210

215

220

CTT

ATA

CAT

GCT

GGA

CAT

AGA

TTA

TAT

GGA

ATA

GCA

ATT

AAT

CCA

AAT

720

Leu

Ile

His

Ala

Gly

His

Arg

Leu

Tyr

Gly

Ile

Ala

Ile

Asn

Pro

Asn

225

230

235

240

AGG

GTT

TTT

AAA

GTA

AAT

ACT

AAT

GCC

TAT

TAT

GAA

ATG

AGT

GGG

TTA

768

Arg

Val

Phe

Lys

Val

Asn

Thr

Asn’

Ala

Tyr

Tyr

Glu

Met

Ser

Gly

Leu

245

250

255

GAA

GTA

AGC

TTT

GAG

GAA

CTT

AGA

ACA

TTT

GGG

GGA

CAT

GAT

GCA

AAG

816

Glu

Val

Ser

Phe

Glu

Glu

Leu

Arg

Thr

Phe

Gly Gly

His

Asp

Ala

Lys

260

265

270

TTT

ATA

GAT

AGT

TTA

CAG

GAA

AAC

GAA

TTT

CGT

CTA

TAT

TAT

TAT

AAT

864

Phe

Ile

Asp

Seř

Leu

Gin

Glu

Asn

Glu

Phe

Arg

Leu

Tyr

Tyr

Tyr

Asn

275

280

285

AAG

TTT

AAA

GAT

ATA

GCA

AGT

ACA

CTT

AAT

AAA

GCT

AAA

TCA

ATA

GTA

912

Ile

Val

Lys

Phe

Lys

Asp

Ile

Ala

Ser

Thr

Leu

Asn

Lys

Ala

Lys

Ser

290

295

300

GGT

ACT

ACT

GCT

TCA

TTA

CAG

TAT

ATG

AAA

AAT

GTT

TTT

AAA

GAG

AAA

960

Glu

Gly

Thr

Thr

Ala

Ser

Leu

Gin

Tyr

Met

Lys

Asn

Val

Phe

Lys

Lys

305

310

315

320

TAT

CTC

CTA

TCT

GAA

GAT

ACA

TCT

GGA

AAA

TTT

TCG

GTA

GAT

AAA

TTA

1008

Leu

Tyr

Leu

Leu

Ser

Glu

Asp

Thr

Ser

Gly

Lys

Phe

Ser

Val

Asp

Lys

325

330

335

• · · · ·· · · · ·· ···' ·»«· · · · · • · · · · · · · .· · · · • · · · · · · · · ···· · ···· · · 9 9 9 9

9 9 9 9 9 999 9 9 9 9

AAA TTT

GAT

AAG

TTA

TAC

AAA

ATG

TTA

ACA

GAG

ATT

TAC

ACA

GAG

GAT

1056 Lys Phe

Asp

Lys

Leu

Tyr

Lys

Met

Leu

Thr

Glu

Ile

Tyr

Thr

Glu

Asp

340

345

350

AAT TTT

GTT

AAG

TTT

TTT

AAA

GTA

CTT

AAC

AGA

AAA

ACA

TAT

TTG

AAT

1104 Asn Phe

Val

Lys

Phe

Phe

Lys

Val

Leu

Asn

Arg

Lys

Thr

Tyr

Leu

Asn

355

360

365

TTT GAT

AAA

GCC

GTA

TTT

AAG

ATA

AAT

ATA

GTA

CCT

AAG

GTA

AAT

TAC

1152 Phe Asp

Lys

Ala

Val

Phe

Lys

Ile

Asn

Ile

Val

Pro

Lys

Val

Asn

Tyr

370

375

380

ACA ATA

TAT

GAT

GGA

TTT

AAT

TTA

AGA

AAT

ACA

AAT

TTA

GCA

GCA

AAC

1200 Thr Ile

Tyr

Asp

Gly

Phe

Asn

Leu

Arg

Asn

Thr

Asn

Leu

Ala

Ala

Asn

385

390

395

400

TTT AAT

GGT

CAA

AAT

ACA

GAA

ATT

AAT

AAT

ATG

AAT

TTT

ACT

AAA

CTA

1248 Phe Asn

Gly

Gin

Asn

Thr

Glu

Ile

Asn

Asn

Met

Asn

Phe

Thr

Lys

Leu

405

410

415

AAA AAT

TTT

ACT

GGA

TTG

TTT

GAA

TTT

TAT

AAG

TTG

CTA

TGT

GTA

AGA

1296 Lys Asn

Phe

Thr

Gly

Leu

Phe

Glu

Phe

Tyr

Lys

Leu

Leu

Cys

Val

Arg

420

425

430

GGG ATA

ATA

ACT

TCT

AAA

ACT

AAA

TCA

TTA

GAT

AAA

GGA

TAC

AAT

AAG

1344

Gly Ile

Ile

Thr

Ser

Lys

Thr

Lys

Ser

Leu

Asp

Lys

Gly

Tyr

Asn

Lys

435

440

445

GCA TTA

AAT

GAT

TTA

TGT

ATC

AAA

GTT

AAT

AAT

TGG

GAC

TTG

TTT

TTT

1392 Ala Leu

Asn

Asp

Leu

Cys

Ile

Lys

Val

Asn

Asn

Trp

Asp

Leu

Phe

Phe

450

455

460

AGT CCT

TCA

GAA

GAT

AAT

TTT

ACT

AAT

GAT

CTA

AAT

AAA

GGA

GAA

GAA

1440 Ser Pro

Ser

Glu

Asp

Asn

Phe

Thr

Asn

Asp

Leu

Asn

Lys

Gly

Glu

Glu

465

470

475

480

ATT ACA

TCT

GAT

ACT

AAT

ATA

GAA

GCA

GCA

GAA

GAA

AAT

ATT

AGT

TTA

1488 Ile Thr

Ser

Asp

Thr

Asn

Ile

Glu

Ala

Ala

Glu

Glu

Asn

Ile

Ser

Leu

485

490

495

GAT TTA 1536

ATA

CAA

CAA

TAT

TAT

TTA

ACC

TTT

AAT

TTT

GAT

AAT

GAA

CCT

Asp Leu

Ile

Gin

Gin

Tyr

Tyr

Leu

Thr

Phe-

. Asn

Phe

Asp

Asn

Glu

Pro

500

505

510

GAA AAT

ATT

TCA

ATA

GAA

AAT

CTT

TCA

AGT

GAC

ATT

ATA

GGC

CAA

TTA

1584

Glu

Asn

Ile 515

Ser

Ile

Glu

Asn

Leu 520

Ser

Ser

Asp

Ile

Ile 525

Gly

Gin

Leu

GAA

CTT

ATG

CCT

AAT

ATA

GAA

AGA

TTT

CCT

AAT

GGA

AAA

AAG

TAT

GAG

1632 Glu

Leu 530

Met

Pro

Asn

Ile

Glu 535

Arg

Phe

Pro

Asn

Gly 540

Lys

Lys

Tyr

Glu

TTA

GAT

AAA

TAT

ACT

ATG

TTC

CAT

TAT

CTT

CGT

GCT

CAA

GAA

TTT

GAA

168C Leu 545

1 Asp

Lys

Tyr

Thr

Met 550

Phe

His

Tyr

Leu

Arg 555

Ala

Gin

Glu

Phe

Glu 560

373• ·

CAT GGT 1728

AAA

TCT

AGG

ATT

GCT

TTA

ACA

AAT

TCT

GTT

AAC

GAA

GCA

TTA

His Gly

Lys

Ser

Arg 565

Ile

Ala

Leu

Thr

Asn 570

Ser

Val

Asn

Glu

Ala 575

Leu

TTA AAT 1776

CCT

AGT

CGT

GTT

TAT

ACA

TTT

TTT

TCT

TCA

GAC

TAT

GTA

AAG

Leu Asn

Pro

Ser 580

Arg

Val

Tyr

Thr

Phe 585

Phe

Ser

Ser

Asp

Tyr 590

Val

Lys

AAA GTT 1824

AAT

AAA

GCT

ACG

GAG

GCA

GCT

ATG

TTT

TTA

GGC

TGG

GTA

GAA

Lys Val

Asn 595

Lys

Ala

Thr

Glu

Ala 600

Ala

Met

Phe

Leu

Gly 605

Trp

Val

Glu

CAA TTA 1872

GTA

TAT

GAT

TTT

ACC

GAT

GAA

ACT

AGC

GAA

GTA

AGT

ACT

ACG

Gin Leu 610

Val

Tyr

Asp

Phe

Thr 615

Asp

Glu

Thr

Ser

Glu 620

Val

Ser

Thr

Thr

GAT AAA 1920

ATT

GCG

GAT

ATA

ACT

ATA

ATT

ATT

CCA

TAT

ATA

GGA

CCT

GCT

Asp Lys 625

Ile

Ala

Asp

Ile 630

Thr

Ile

Ile

Ile

Pro 635

Tyr

Ile

Gly

Pro

Ala 640

TTA AAT 1968

ATA

GGT

AAT

ATG

TTA

TAT

AAA

GAT

GAT

TTT

GTA

GGT

GCT

TTA

Leu Asn

Ile

Gly

Asn 645

Met

Leu

Tyr

Lys

Asp 650

Asp

Phe

Val

Gly

Ala 655

Leu

ATA TTT 2016

TCA

GGA

GCT

GTT

ATT

CTG

TTA

GAA

TTT

ATA

CCA

GAG

ATT

GCA

Ile Phe

Ser

Gly 660

Ala

Val

Ile

Leu

Leu 665

Glu

Phe

Ile

Pro

Glu 670

Ile

Ala

ATA CCT 2064

GTA

TTA

GGT

ACT

TTT

GCA

CTT

GTA

TCA

TAT

ATT

GCG

AAT

AAG

Ile Pro

Val 675

Leu

Gly

Thr

Phe

Ala 680

Leu

Val

Ser

Tyr

Ile 685

Ala

Asn

Lys

GTT CTA 2112

ACC

GTT

CAA

ACA

ATA

GAT

AAT

GCT

TTA

AGT

AAA

AGA

AAT

GAA

Val Leu 690

Thr

Val

Gin

Thr

Ile 695

Asp

'Asn

Ala

Leu

Ser 700

Lys

Arg

Asn

Glu

AAA TGG 2160

GAT

GAG

GTC

TAT

AAA

TAT

ATA

GTA

ACA

AAT

TGG

TTA

GCA

AAG

Lys Trp 705

Asp

Glu

Val

Tyr 710

Lys

Tyr

Ile

Val

Thr 715

Asn

Trp

Leu

Ala

Lys 720

GTT AAT 2208

ACA

CAG

ATT

GAT

CTA

ATA

AGA

AAA

AAA

ATG

AAA

GAA

GCT

TTA

Val Asn

Thr

Gin

Ile 725

Asp

Leu

Ile

Arg

Lys 730

Lys

Met

Lys

Glu

Ala 735

Leu

GAA AAT 2256

CAA

GCA

GAA

GCA

ACA

AAG

GCT

ATA

ATA

AAC

TAT

CAG

TAT

AAT

Glu Asn

Gin

Ala 740

Glu

Ala

Thr

Lys

Ala 745

Ile

Ile

Asn

Tyr

Gin 750

Tyr

Asn

CAA TAT 2304

ACT

GAG

GAA

GAG

AAA

AAT

AAT

ATT

AAT

TTT

AAT

ATT

GAT

GAT

Gin Tyr

Thr 755

Glu

GlU

Glu

Lys

Asn 760

Asn

Ile

Asn

Phe

Asn 765

Ile

Asp

Asp

TTA AGT 2352

TCG

AAA

CTT

AAT

GAG

TCT

ATA

AAT

AAA

GCT

ATG

ATT

AAT

ATA

Leň Ser

Ser

Lys

Leu

Asn

Glu

Ser

Ile

Asn

Lys

Ala

Met

Ile

Asn

Ile

770 775 780

AAT AAA 2400 Asn Lys 785

ATC CCT 2448 Ile Pro

GAT GCA 2496 Asp Ala

CAA GTA 2544 Gin Val

ATA CCT 2592 Ile Pro

850

ACA TTT 2640 Thr Phe 865

TTA AGA 2688 Leu Arg

AAA ATA 2736 Lys Ile

CAA ATT 2784 Gin Ile

AAA AAT 2832 Lys Asn 930

TTT TGG 2880 Phe Trp 945

GAA TAT 2928 Glu Tyr

TCA CTT 2976 Ser Leu

TTT

TTG

AAT

CAA

TGC

TCT

GTT

TCA

TAT

TTA

ATG

AAT

TCT

ATG

Phe

Leu

Asn

Gin 790

Cys

Ser

Val

Ser

Tyr 795

Leu

Met

Asn

Ser

Met 800

TAT

GGT

GTT

AAA

CGG

TTA

GAA

GAT

TTT

GAT

GCT

AGT

CTT

AAA

Tyr

Gly

Val 805

Lys

Arg

Leu

Glu

Asp 810

Phe

Asp

Ala

Ser

Leu 815

Lys

TTA

TTA

AAG

TAT

ATA

TAT

GAT

AAT

AGA

GGA

ACT

TTA

ATT

GGT

Leu

Leu 820

Lys

Tyr

Ile

Tyr

Asp 825

Asn

Arg

Gly

Thr

Leu 830

Ile

Gly

GAT

AGA

TTA

AAA

GAT

AAA

GTT

AAT

AAT

ACA

CTT

AGT

ACA

GAT

Asp 835

Arg

Leu

Lys

Asp

Lys 840

Val

Asn

Asn

Thr

Leu 845

Ser

Thr

Asp

TTT

CAG

CTT

TCC

AAA

TAC

GTA

GAT

AAT

CAA

AGA

TTA

TTA

TCT

Phe

Gin

Leu

Ser

Lys 855

Tyr

Val

Asp

Asn

Gin 860

Arg

Leu

Leu

Ser

ACT

GAA

TAT

ATT

AAG

AAT

ATT

ATT

AAT

ACT

TCT

ATA

TTG

AAT

Thr

Glu

Tyr

Ile 870

Lys

Asn

Ile

Ile

Asn 875

Thr

Ser

Ile

Leu

Asn 880

TAT

GAA

AGT

AAT

CAT

TTA

ATA

GAC

TTA

TCT

AGG

TAT

GCA

TCA

Tyr

Glu

Ser 885

Asn

His

Leu

Ile

Asp 890

Leu

Ser

Arg

Tyr

Ala 895

Ser

AAT

ATT

GGT

AGT

AAA

GTA

AAT

TTT

GAT

CCA

ATA

GAT

AAA

AAT

Asn

Ile 900

Gly

Ser

Lys

Val

Asn 905

Phe

Asp

Pro

Ile

Asp 910

Lys

Asn

CAA

TTA

TTT

AAT

TTA

GAA

AGT

AGT

AAA

ATT

GAG

GTA

ATT

TTA

Gin 915

Leu

Phe

Asn

Leu

Glu 920

Ser

Ser

Lys

Ile

Glu 925

Val

Ile

Leu

GCT

ATT

GTA

TAT

AAT

AGT

ATG

TAT

GAA

AAT

TTT

AGT

ACT

AGC

Ala

Ile

Val

Tyr

Asn 935

Ser

Met

Tyr

Glu

Asn 940

Phe

Ser

Thr

Ser

ATA

AGA

ATT

CCT

AAG

TAT

TTT

AAC

AGT

ATA

AGT

CTA

AAT

AAT

Ile

Arg

Ile

Pro 950

Lys

Tyr

Phe

Asn

Ser 955

Ile

Ser

Leu

Asn

Asn 960

ACA

ATA

ATA

AAT

TGT

ATG

GAA

AAT

AAT

TCA

GGA

TGG

AAA

GTA

Thr

Ile

Ile 965

Asn

Cys

Met

Glu

Asn 970

Asn

Ser

Gly

Trp

Lys 975

Val

AAT

TAT

GGT

GAA

ATA

ATC

TGG

ACT

TTA

CAG

GAT

ACT

CAG

GAA

Asn

Tyr 980

Gly

Glu

Ile

Ile

Trp 985

Thr

Leu

Gin

Asp

Thr 990

Gin

Glu

ATA AAA 3024 Ile Lys

CAA	AGA GTA GTT TTT AAA TAC AGT CAA ATG ATT AAT	ATA	TCA
Gin	Arg	Val	Val	Phe	Lys Tyr	Ser	Gin	Met	Ile Asn	Ile	Ser
995				1000				1005

=375= ·· ·· t · · k · · · · » ’ · · fl • ·

• ·

• ·

•

• ·

•

GAT TAT

ATA

AAC

AGA

TGG

ATT

TTT

GTA

ACT

ATC

ACT

AAT

AAT

AGA

TTA

3072

Asp Tyr

Ile

Asn

Arg

Trp

Ile

Phe

Val

Thr

Ile

Thr

Asn

Asn

Arg

Leu

1010

1015

1020

AAT AAC

TCT

AAA

ATT

TAT

ATA

AAT

GGA

AGA

TTA

ATA

GAT

CAA

AAA

CCA

3120

Asn Asn

Ser

Lys

Ile

Tyr

Ile

Asn

Gly

Arg

Leu

Ile

Asp

Gin

Lys

Pro

1025

1030

1035

1040

ATT TCA

AAT

TTA

GGT

AAT

ATT

CAT

GCT

AGT

AAT

AAT

ATA

ATG

TTT

AAA

3168

Ile Ser

Asn

Leu

Gly

Asn

Ile

His

Ala

Ser

Asn

Asn

Ile

Met

Phe

Lys

1045

1050

1055

TTA GAT

GGT

TGT

AGA

GAT

ACA

CAT

AGA

TAT

ATT

TGG

ATA

AAA

TAT

TTT

3215

Leu Asp

Gly

Cys

Arg

Asp

Thr

His

Arg

Tyr

Ile

Trp

Ile

Lys

Tyr

Phe

1060

1065

1070

AAT CTT

TTT

GAT

AAG

GAA

TTA

AAT

GAA

AAA

GAA

ATC

AAA

GAT

TTA

TAT

3264

Asn Leu

Phe

Asp

Lys

Glu

Leu

Asn

Glu

Lys

Glu

Ile

Lys

Asp

Leu

Tyr

1075

1080

1085

GAT AAT

CAA

TCA

AAT

TCA

GGT

ATT

TTA

AAA

GAC

TTT

TGG

GGT

GAT

TAT

3312

Asp Asn

Gin

Ser

Asn

Ser

Gly

Ile

Leu

Lys

Asp

Phe

Trp

Gly

Asp

Tyr

1090

1095

1100

TTA CAA

TAT

GAT

AAA

CCA

TAC

TAT

ATG

TTA

AAT

TTA

TAT

GAT

CCA

AAT

3360

Leu Gin Tyr Asp Lys Pro Tyr Tyr Met Leu Asn Leu Tyr Asp Pro Asn

1105 1110 1115 1120

AAA TAT GTC GAT GTA AAT AAT GTA GGT ATT AGA GGT TAT ATG TAT CTT

3408

Lys Tyr Val Asp Val Asn Asn Val Gly Ile Arg Gly Tyr Met Tyr Leu 1125 1130 1135

AAA GGG CCT AGA GGT AGC GTA ATG ACT ACA AAC ATT TAT TTA AAT TCA 3456

Lys Gly Pro Arg Gly Ser Val Met Thr Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ser 1140 1145 1150

AGT TTG TAT AGG GGG ACA AAA TTT ATT ATA AAA AAA TAT GCT TCT GGA 3504

Ser Leu Tyr Arg Gly Thr Lys Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala Ser Gly 1155 1160 1165

AAT AAA GAT AAT ATT GTT AGA AAT AAT GAT CGT GTA TAT ATT AAT GTA 3552

Asn Lys Asp Asn Ile Val Arg Asn Asn Asp Arg Val Tyr Ile Asn Val 1170 1175 1180

GTA GTT AAA AAT AAA GAA TAT AGG TTA GCT ACT AAT GCA TCA CAG GCA 3600

Val Val Lys Asn Lys Glu Tyr Arg Leu Ala Thr Asn Ala Ser Gin Ala

1185 1190 1195 1200

GGC GTA GAA AAA ATA CTA AGT GCA TTA GAA ATA CCT GAT GTA GGA AAT

3648

Gly Val Glu Lys Ile Leu Ser Ala Leu Glu Ile Pro Asp Val Gly Asn 1205 1210 1215

CTA AGT CAA GTA GTA GTA ATG AAG TCA AAA AAT GAT CAA GGA ATA ACA 3696

Leu Ser Gin Val Val Val Met Lys Ser Lys Asn Asp Gin Gly Ile Thr 1220 1225 1230

AAT AAA TGC AAA ATG AAT TTA CAA GAT AAT AAT GGG AAT GAT ATA GGC 3744

Asn Lys Cys Lys Met Asn Leu Gin Asp Asn Asn Gly Asn Asp Ile Gly 1235 1240 1245

TTT ATA GGA 3792 Phe Ile Gly 1250	TTT Phe	CAT His	CAG Gin	TTT AAT Phe Asn 1255	AAT Asn	ATA Ile	GCT Ala	AAA CTA Lys Leu 1260	GTA Val	GCA Ala	AGT Ser
AAT TGG TAT	AAT	AGA	CAA	ATA GAA	AGA	TCT	AGT	AGG ACT	TTG	GGT	TGC
3840
Asn Trp Tyr	Asn	Arg	Gin	Ile Glu	Arg	Ser	Ser	Arg Thr	Leu	Gly	Cys
1265			1270			1275			1280
TCA TGG GAA	TTT	ATT	CCT	GTA GAT	GAT	GGA	TGG	GGA GAA	AGG	CCA	CTG
3888
Ser Trp Glu	Phe	Ile	Pro	Val Asp	Asp	Gly	Trp	Gly Glu	Arg	Pro	Leu
		1285			1290			1295

TAA

38S1 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1296 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

	(xi) POPIS SEKVENCE:	SEQ ID NO:28:
Met 1	Gin Phe Val Asn Lys Gin 5	Phe Asn Tyr Lys Asp Pro Val Asn Gly 10 ' 15
Val	Asp Ile Ala Tyr Ile Lys 20	Ile Pro Asn Val Gly Gin Met Gin Pro 25 30
Val	Lys Ala Phe Lys Ile His 35	Asn Lys Ile Trp Val Ile Pro Glu Arg 40 45
Asp	Thr Phe Thr Asn Pro Glu 50 55	Glu Gly Asp Leu Asn Pro Pro Pro Glu 60
Ala 65	Lys Gin Val Pro Val Ser 70	Tyr Tyr Asp Ser Thr Tyr Leu Ser Thr 75 80
Asp	Asn Glu Lys Asp Asn Tyr 85	Leu Lys Gly Val Thr Lys Leu Phe Glu 90 95
Arg	Ile'' Tyr Ser Thr Asp Leu 100	Gly Arg Met Leu Leu Thr Ser Ile Val 105 110
Arg	Gly Ile Pro Phe Trp Gly 115	Gly Ser Thr Ile Asp Thr Glu Leu Lys 120 125
Val	Ile Asp Thr Asn Cys Ile 130 135	Asn Val Ile Gin Pro Asp Gly Ser Tyr 140
Arg 145	Ser Glu Glu Leu Asn Leu 150	Val Ile Ile Gly Pro Ser Ala Asp Ile 155 160
Ile	Gin Phe Glu Cys Lys Ser 165	Phe Gly His Glu Val Leu Asn Leu Thr 170 175
Arg	Asn Gly Tyr Gly Ser Thr 180	Gin Tvr Ile Arg Phe Ser Pro Asp Phe 185 190

Phe Trp Ile Arg Ile Pro Lys Tyr Phe Asn Ser Ile Ser Leu Asn Asn

945 950 955 960

Glu Tyr Thr Ile Ile Asn Cys Met Glu Asn Asn Ser Gly Trp Lys Val

965 970 975

Ser Leu Asn Tyr Gly Glu Ile Ile Trp Thr Leu Gin Asp Thr Gin Glu 980 985 990

Ile Lys Gin Arg Val Val Phe Lys Tyr Ser Gin Met Ile Asn Ile Ser 995 1000 1005

Asp Tyr Ile Asn Arg Trp Ile Phe Val Thr Ile Thr Asn Asn Arg Leu 1010 1015 1020

Asn Asn 1025	Ser	Lys	Ile	Tyr 1030	Ile	Asn	Gly Arg Leu Ile Asp 1035	Gin	Lys	Pro 1040
Ile Ser	Asn	Leu	Gly 1045	Asn	Ile	His	Ala Ser Asn Asn Ile 1050	Met	Phe 1055	Lys
Leu Asp	Gly	Cys 106C	Arg 1	Asp	Thr	His	Arg Tyr Ile Trp Ile 1065	Lys 1070	Tyr 1	Phe
Asn Leu	Phe 107E	Asp	Lys	Glu	Leu	Asn 108C	Glu Lys Glu Ile Lys i 1085	Asp	Leu	Tyr
Asp Asn Gin 1090	Ser	Asn	Ser	Gly Ile 1095	Leu Lys Asp Phe Trp 1100	Gly	Asp	Tyr
Leu Gin 1105	Tyr	Asp	Lys	Pro 111C	Tyr 1	Tyr	Met Leu Asn Leu Tyr 1115	Asp	Pro	Asn 1120
Lys Tyr	Val	Asp	Val Asn 1125	Asn	Val	Gly Ile Arg Gly Tyr 1130	Met	Tyr 1135	Leu
Lys Gly	Pro	Arg Gly 1140	Ser	Val	Met	Thr Thr Asn Ile Tyr 1145	Leu 115C	Asn 1	Ser
Ser Leu	Tyr Arg 1155	Gly	Thr	Lys	Phe Ile Ile Lys Lys Tyr Ala 1160 1165	Ser	Gly
Asn Lys Asp 1170	Asn	Ile	Val	Arg Asn 1175	Ásn Asp Arg Val Tyr 1180	Ile	Asn	Val
Val Val 1185	Lys	Asn	Lys	Glu Tyr 1190	Arg	Leu Ala Thr Asn Ala 1195	Ser	Gin	Ala 1200
Gly Val	Glu	Lys	Ile Leu 1205	Ser	Ala	Leu Glu Ile Pro Asp 1210	Val	Gly Asn 1215
Leu Ser	Gin	Val Val 1220	Val	Met	Lys	Ser Lys Asn Asp Gin 1225	Gly Ile 1230	Thr
Asn Lys	Cys Lys 1235	Met	Asn	Leu	Gin Asp Asn Asn Gly Asn Asp 1240 1245	Ile	Gly
Phe Ile Gly 1250	Phe	His	Gin	Phe Asn 1255	Asn Ile Ala Lys Leu 1260	Val	Ala	Ser
Asn Trp 1265	Tyr	Asn	Arg	Gin Ile 1270	Glu	Arg Ser Ser Arg Thr 1275	Leu	Gly	Cys 1280
Ser Trp	Glu	Phe	Ile Pro 1285	Val	Asp	Asp Gly Trp Gly Glu 1290	Arg	Pro Leu 1295

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 812 aminokyselin • · ·· (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC: neznámý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:29:

Thr 1

Ser

Tyr

Lys

Ile 5

Ile Asn

Gly

Lys

His 10

Phe

Tyr

Phe

Asn

Asn 15

Asp

Gly

Val

Met

Gin 20

Leu

Gly Val

Phe

Lys 25

Gly

Pro

Asp

Gly

Phe 30

Glu

Tyr

Phe

Ala

Pro 35

Ala

Asn

Thr Gin

Asn 40

Asn

Asn

Ile

Glu

Gly 45

Gin

Ala

Ile

Val

Tyr 50

Gin

Ser

Lys

Phe Leu 55

Thr

Leu

Asn

Gly

Lys 60

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asp 65

Asn

Asn

Ser

Lys

Ala Val 70

Thr

Gly

Trp

Arg 75

Ile

Ile

Asn

Asn

Glu 80

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn 85

Pro Asn

Asn

Ala

Ile 90

Ala

Ala

Val

Gly

Leu 95

Gin

Val

Ile

Asp

Asn 100

Asn

Lys Tyr

Tyr

Phe 105

Asn

Pro

Asp

Thr

Ala 110

Ile

Ile

Ser

Lys

Gly 115

Trp

Gin

Thr Val

Asn 120

Gly

Ser

Arg

Tyr

Tyr 125

Phe

Asp

Thr

Asp

Thr 130

Ala

Ile

Ala

Phe Asn 135

Gly

Tyr

Lys

Thr

Ile 140

Asp

Gly

Lys

His

Phe 145

Tyr

Phe

Asp

Ser

Asp Cys 150

Val

Val

Lys

Ile 155

Gly

Val

Phe

Ser

Thr 160

Ser

Asn

Gly

Phe

Glu 165

Tyr Phe

Ala

Pro

Ala 170

Asn

Thr

Tyr

Asn

Asn 175

Asn

Ile

Glu

Gly

Gin 180

Ala

Ile Val

Tyr

Gin 185

Ser

Lys

Phe

Leu

Thr 190

Leu

Asn

Gly

Lys

Lys 195

Tyr

Tyr

Phe Asp

Asn 200

Asn

Ser

Lys

Ala

Val 205

Thr

Gly

Leu

Gin

Thr 210

Ile

Asp

Ser

Lys Lys 215

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Thr 220

Asn

Thr

Ala

Glu

Ala 225

Ala

Thr

Gly

Trp

Gin Thr 230

Ile

Asp

Gly

Lys 235

Lys

Tyr

Tyr

Phe

Asn 240

Thr

Asn

Thr

Ala

Glu 245

Ala Ala

Thr

Gly

Trp 250

Gin

Thr

Ile

Asp

Gly 255

Lys

Lys

Tyr

Tyr

Phe 260

Asn

Thr Asn

Thr

Ala 265

Ile

Ala

Ser

Thr

Gly 270

Tyr

Thr

Ile

Ile

Asn 275

Gly

Lys

His Phe

Tyr 280

Phe

Asn

Thr

Asp

Gly 285

Ile

Met

Gin

Ile

Gly 290

Val

Phe

Lys

Gly Pro 295

Asn

Gly

Phe

Glu

Tyr 300

Phe

Ala

Pro

Ala

Asn 305

Thr

Asp

Ala

Asn

. Asn Ile 310

Glu

. Gly

Gin

Ala 315

Ile

Leu

Tyr

Gin

Asn 320

Glu Phe Leu Thr Leu Asn Gly Lys Lys Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Ser 325 330 ³³⁵

Lys	Ala	Val	Thr 340	Gly	Trp	Arg	Ile	Ile 345
Asn	Pro	Asn 355	Asn	Ala	Ile	Ala	Ala 360	Ile
Asp	Lys 370	Tyr	Tyr	Phe	Ser	Tyr 375	Asp	Gly
Thr 385	Ile	Glu	Arg	Asn	Asn 390	Phe	Tyr	Phe
Met	Val	Thr	Gly	Val 405	Phe	Lys	Gly	Pro
Pro	Ala	Asn	Thr 420	His	Asn	Asn	Asn	Ile 425
Gin	Asn	Lys 435	Phe	Leu	Thr	Leu	Asn 440	Gly
Asp	Ser 450	Lys	Ala	Val	Thr	Gly 455	Trp	Gin
Tyr 465	Phe	Asn	Leu	Asn	Thr 470	Ala	Glu	Ala
Asp	Gly	Lys	Lys	Tyr 485	Tyr	Phe	Asn	Leu
Gly	Trp	Gin	Thr 500	Ile	Asp	Gly	Lys	Lys 505
Phe	Ile	Ala 515	Ser	Thr	Gly	Tyr	Thr 520	Ser
Phe	Asn 530	Thr	Asp	Gly	Ile	Met 535	Gin	Ile
Gly 545	Phe	Glu	Tyr	Phe	Ala 550	Pro	Ala	Asn
Gly	Gin	Ala	Ile	Leu 565	Tyr	Gin’	Asn	Lys
Lys	Tyr	Tyr	Phe 580	Gly	Ser	Asp	Ser	Lys 585
Ile	Asp	Gly 595	Lys	Lys	Tyr	Tyr	Phe 600	Asn
Thr	Gly 610	Trp	Gin	Thr	Ile	Asn 615	Gly	Lys
Thr 625	Ser	Ile	Ala	Ser	Thr 630	Gly	Tyr	Thr
Tyr	Phe	Asn	Thr	Asp 645	Gly	Ile	Met	Gin
Asp	Gly	Phe	Glu 660	Tyr	Phe	Ala	Pro	Ala 665
Glu	Gly	Gin 675	Ala	Ile	Arg	Tyr	Gin 680	Asn
Asn	Ile 690	Tyr	Tyr	Phe	Gly	Asn 695	Asn	Ser
Thr	Ile	Asp	Gly	Asn	Arg	Tyr	Tyr	Phe

• • • ♦ ·	• · · « • · • · ' · ·	4 • · 4 • 4	1 · » · • • «	• • • • · ·	« • · · • «	• , · · • · • · « ·
Asn	Asn	Lys	Lys	Tyr 350	Tyr	Phe
His	Leu	Cys	Thr 365	Ile	Asn	Asn
Ile	Leu	Gin 380	Asn	Gly	Tyr	Ile
Asp	Ala 395	Asn	Asn	Glu	Ser	Lys 400
Asn 410	Gly	Phe	Glu	Tyr	Phe 415	Ala
Glu	Gly	Gin	Ala	Ile 430	Val	Tyr
Lys	Lys	Tyr	Tyr 445	Phe	Asp	Asn
Thr	Ile	Asp 460	Gly	Lys	Lys	Tyr
Ala	Thr 475	Gly	Trp	Gin	Thr	Ile 480
Asn 490	Thr	Ala	Glu	Ala	Ala 495	Thr
Tyr	Tyr	Phe	Asn	Thr 510	Asn	Thr
Ile	Asn	Gly	Lys 525	His	Phe	Tyr
Gly	Val	Phe 540	Lys	Gly	Pro	Asn
Thr	Asp 555	Ala	Asn	Asn	Ile	Glu 560
Phe 570	Leu	Thr	Leu	Asn	Gly 575	Lys
Ala	Val	Thr	Gly	Leu 590	Arg	Thr
Thr	Asn	Thr	Ala 605	Val	Ala	Val
Lys	Tyr	Tyr 620	Phe	Asn	Thr	Asn
Ile	Ile 635	Ser	Gly	Lys	His	Phe 640
Ile 650	Gly	Val	Phe	Lys	Gly 655	Pro
Asn	Thr	Asp	Ala	Asn 670	Asn	Ile
Arg	Phe	Leu	Tyr 685	Leu	His	Asp
Lys	Ala	Ala 700	Thr	Gly	Trp	Val
Glu	Pro	Asn	Thr	Ala	Met	Gly

• a •

a· • a · *

a

Λ-Λ-

• a

aa a ·

aa-- a a

•

• a

a a a

•

a a

a a ·

a ·

•

« ·

a a

a

a

«

i a a

• a

a a

aa

aaa

• a

aa

705

710

715

720

Ala

Asn

Gly

Tyr

Lys

Thr

Ile

Asp

Asn

Lys

Asn

Phe

Tyr

Phe

Arg

Asn

725

730

735

Gly

Leu

Pro

Gin

Ile

Gly

Val

Phe

Lys

Gly

Ser

Asn

Gly

Phe

Glu

Tyr

-

740

745

750

•

Phe

Ala

Pro

Ala

Asn

Thr

Asp

Ala

Asn

Asn

Ile

Glu

Gly

Gin

Ala

Ile

755

760

765

Arg

Tyr

Gin

Asn

Arg

Phe

Leu

His

Leu

Leu

Gly

Lys

Ile

Tyr

Tyr

Phe

-

770

775

780

Gly

Asn

Asn

Ser

Lys

Ala

Val

Thr

Gly

Trp

Gin

Thr

Ile

Asn

Gly

Lys

785

790

795

800

Val

Tyr

Tyr

Phe

Met

Pro

Asp

Thr

Ala

Met

Ala

Ala

805

810

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO:30: ” (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 609 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC: neznámý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

(xi) POPIS SEKVENCE:	SEQ Val	ID NO:30:	Ile Arg	Phe Val Asn 15
Thr 1	Ser Glu Glu Asn 5	Lys	Ser Gin	Val 10	Lys
Val	Phe Lys Asp Lys 20	Thr	Leu	Ala Asn 25	Lys	Leu	Ser Phe	Asn Phe Ser 30
Asp	Lys Gin Asp Val 35	Pro	Val	Ser Glu 40	Ile	Ile	Leu Ser 45	Phe Thr Pro
Ser	Tvr Tyr Glu Asp 5 0	Gly	Leu 55'	Ile Gly	Tyr	Asp	Leu Gly 60	Leu Val Ser
Leu 65	Tyr Asn Glu Lys	Phe 70	Tyr	Ile Asn	Asn	Phe 75	Gly Met	Met Val Ser 80
Gly	Leu Ile Tyr Ile 85	Asn	Asp	Ser Leu	Tyr 90	Tyr	Phe Lys	Pro Pro Val 95
Asn	Asn Leu Ile Thr 100	Gly	Phe	Val Thr 105	Val	Gly	Asp Asp	Lys Tyr Tyr 110
Phe	Asn Pro Ile Asn 115	Gly	Gly	Ala Ala 120	Ser	Ile	Gly Glu 125	Thr Ile Ile
Asp	Asp Lys Asn Tyr 130	Tyr	Phe 135	Asn Gin	Ser	Gly	Val Leu 140	Gin Thr Gly
Val 145	Phe Ser Thr Glu	Asp 150	Gly	Phe Lys	Tyr	Phe 155	Ala Pro	Ala Asn Thr 160
Leu	Asp Glu Asn Leu 165	Glu	Gly	Glu Ala	Ile 170	Asp	Phe Thr	Gly Lys Leu 175

I

TO

• · · • · · ·· • · · · · • · · ·

• · • · • · • ·

• • ' • • •

·* ·· • · · • · · · • · · · · • ·

Ile

Ile

Asp

Glu 180

Asn

Ile

Tyr

Tyr

Phe 185

Asp

Asp

Asn

Tyr

Arg 190

Gly

Ala

Val

Glu

Trp 195

Lys

Glu

Leu

Asp

Gly 200

Glu

Met

His

Tyr

Phe 205

Ser

Pro

Glu

Thr

Gly 210

Lys

Ala

Phe

Lys

Gly 215

Leu

Asn

Gin

Ile

Gly 220

Asp

Tyr

Lys

Tyr

Tyr 225

Phe

Asn

Ser

Asp

Gly 230

Val

Met

Gin

Lys

Gly 235

Phe

Val

Ser

Ile

Asn 240

Asp

Asn

Lys

His

Tyr 245

Phe

Asp

Asp

Ser

Gly 250

Val

Met

Lys

Val

Gly 255

Tyr

Thr

Glu

Ile

Asp 260

Gly

Lys

His

Phe

Tyr 265

Phe

Ala

Glu

Asn

Gly 270

Glu

Met

Gin

Ile

Gly 275

Val

Phe

Asn

Thr

Glu 280

Asp

Gly

Phe

Lys

Tyr 285

Phe

Ala

His

His

Asn 290

Glu

Asp

Leu

Gly

Asn 295

Glu

Glu

Gly

Glu

Glu 300

Ile

Ser

Tyr

Ser

Gly 305

Ile

Leu

Asn

Phe

Asn 310

Asn

Lys

Ile

Tyr

Tyr 315

Phe

Asp

Asp

Ser

Phe 320

Thr

Ala

Val

Val

Gly 325

Trp

Lys

Asp

Leu

Glu 330

Asp

Gly

Ser

Lys

Tyr 335

Tyr

Phe

Asp

Glu

Asp 340

Thr

Ala

Glu

Ala

Tyr 345

Ile

Gly

Leu

Ser

Leu 350

Ile

Asn

Asp

Gly

Gin 355

Tyr

Tyr

Phe

Asn

Asp 360

Asp

Gly

Ile

Met

Gin 365

Val

Gly

Phe

Val

Thr 370

Ile

Asn

Asp

Lys

Val 375

Phe

Tyr

Phe

Ser

Asp 380

Ser

Gly

Ile

Ile

Glu 385

Ser

Gly

Val

Gin

Asn 390

Ile

Asp

Asp

Asn

Tyr 3 95

Phe

Tyr

Ile

Asp

Asp 400

Ašn

Gly

Ile

Val

Gin 405

Ile

Gly

Val

Phe

Asp 410

Thr

Ser

Asp

Gly

Tyr 415

Lys

Tyr

Phe

Ala

Pro 420

Ala

Asn

Thr

Val

Asn 425

Asp

Asn

Ile

Tyr

Gly 430

Gin

Ala

Val

Glu

Tyr 435

Ser

Gly

Leu

Val

Arg 440

Val

Gly

Glu

Asp

Val 445

Tyr

Tyr

Phe

Gly

Glu 450

Thr

Tyr

Thr

Ile

Glu 455

Thr

Gly

Trp

Ile

Tyr 460

Asp

Met

Glu

Asn

Glu 465

Ser

Asp

Lys

Tyr

Tyr 470

Phe

Asn

Pro

Glu

Thr 475

Lys

Lys

Ala

Cys

Lys 480

Gly

Ile

Asn

Leu

Ile 485

Asp

Asp

Ile

Lys

Tyr 490

Tyr

Phe

Asp

Glu

Lys 495

Gly

Ile

Met

Arg

Thr 500

Gly

Leu

Ile

Ser

Phe 505

Glu

Asn

Asn

Asn

Tyr 510

Tyr

Phe

Claims (61)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   Ti

   1. Fúzní protein, zahrnující netoxinovou proteinovou sekvenci a část sekvence toxinu B Clostridium difficile.
2. 2. Fúzní protein podle nároku 1, kde sekvence toxinu B je vybrána ze skupiny zahrnující SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:20 a SEQ ID NO:21.
3. 3. Fúzní protein podle nároku 1 nebo 2, kde netoxinová proteinová sekvence je vybrána ze skupiny zahrnující maltózu vázající protein a polyhistidinový úsek.
4. 4. Způsob vytváření neutralizujícího antitoxinu zaměřeného proti toxinu B Clostridium difficile, vyznačující se tím, že

   a) se použije v jakémkoli pořadí

   i) fúzní protein podle nároku 1,2 nebo 3, ii) ptačí hostitel,

   b) tento hostitel se imunizuje uvedeným čištěným fúzním proteinem za účelem vytvoření antitoxinu schopného neutralizovat nativní toxin B Clostridium difficile a

   c) tento antitoxin se získá z hostitele.
5. 5. Protilátka získaná způsobem podle nároku 4.
6. 6. Způsob léčby, vyznačující se tím, že

   a) se použije

   i) subjekt a

   386 ii) alespoň jeden neutralizující antitoxin zaměřený proti fúznímu proteinu podle nároku 1,2 nebo 3 a

   b) tento antitoxin se podává uvedenému subjektu.
7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že podávání se provádí orální cestou.
8. 8. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se použije subjekt, který byl před podáváním antitoxinu vystaven působení toxinu B Clostridium difficile.
9. 9. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že se použije subjekt, který nebyl před podáváním antitoxinu vystaven působení toxinu B Clostridium difficile.
10. 10. Fúzní protein, zahrnující netoxinovou proteinovou sekvenci a část sekvence toxinu A Clostridium difficile, vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO:7 a SEQ ID NO;8.
11. 11. Fúzní protein podle nároku 10, kde netoxinová proteinová sekvence je vybrána ze skupiny zahrnující maltózu vázající protein a polyhistidinový úsek.
12. 12. Způsob vytváření neutralizujícího antitoxinu zaměřeného proti toxinu A Clostridium difficile, vyznačující se tím, že

    a) se použije v jakémkoli pořadí

    i) fúzní protein podle nároku 10 nebo 11 a ii) ptačí hostitel,

    387 • · • 4

    I · ·

    b) tento hostitel se imunizuje uvedeným čištěným fúzním proteinem za účelem vytvoření antitoxinu schopného neutralizovat uvedený toxin A Clostridium difficile a

    c) tento antitoxin se získá z hostitele.
13. 13. Přípravek, vyznačující se tím, že zahrnuje ptačí neutralizující antitoxin, zaměřený proti části toxinu A Clostridium difficile a části toxinu B Clostridium difficile.
14. 14. Přípravek podle nároku 13, vy z n a č uj i c i se t í m , že část toxinu A je součástí prvního fúzního proteinu a část toxinu B je součástí druhého fúzního proteinu, přičemž každý fúzní protein dále zahrnuje netoxinovou proteinovou sekvenci.
15. 15. Přípravek podle nároku 14, vyznačující se tím, že část toxinu A Clostridium difficile zahrnuje část SEQ ID NO:6.
16. 16. Přípravek podle nároku 15, vyznačující se tím, že část SEQ ID NO:6 zahrnuje sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO:7, 8 a 29.
17. 17. Přípravek podle nároku 14, vyznačující se tím, že netoxinové proteinové sekvence jsou vybrány ze skupiny zahrnující polyhistidinový úsek, maltózu vázající protein a thioredoxinový protein.
18. 18. Přípravek podle nároku 13, vyznačující se t i m , že část toxinu B Clostridium difficile zahrnuje část SEQ ID NQ:10.

    388
19. 19. Přípravek podle nároku 18, vyznačující se tím, že část SEQ ID NO:10 zahrnuje sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 11, 12, 20, 21 a 30.
20. 20. Přípravek podle nároku 13, vyznačující se tím, že dále zahrnuje enterosolventní povlak.
21. 21. Způsob léčby, v y z n a č u j í c í se tím, že

    a) se použije

    i) subjekt, ii) první ptačí neutralizující antitoxin zaměřený proti části sekvence SEQ ID NO:6 toxinu A Clostrídium difficile a iii) druhý ptačí neutralizující antitoxin zaměřený proti části sekvence SEQ ID NO:10 toxinu B Ciostridium difficile,

    b) první a druhý antitoxin se smísí za vzniku terapeutické směsi a

    c) tato terapeutická směs se podává uvedenému subjektu po dobu léčby.
22. 22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že se před stupněm c) terapeutická směs dále zpracuje za účelem zlepšeni enterické stability.
23. 23. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že další zpracování zahrnuje enkapsulaci antitoxinů v terapeutické směsi.
24. 24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že enkapsulace zahrnuje povlékání enterosolventním filmem.

    389
25. 25. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že se použije subjekt, který byl před podáváním antitoxinu vystaven působení alespoň jednoho toxinu Clostridium difficile.
26. 26. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že se použije subjekt, trpcí příznaky intoxikace, přičemž podávání terapeutické směsi vede k podstatné eliminaci těchto příznaků po uplynutí doby léčby.
27. 27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že uvedené příznaky zahrnují průjem.
28. 28. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že se použije subjekt, který před podáváním antitoxinu nebyl vystaven působení toxinu Clostridium difficile.
29. 29. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že uvedená část toxinu A Clostridium difficile zahrnuje proteinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO:7, 8 a 29.
30. 30. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že uvedená část toxinu B Clostridium difficile zahrnuje proteinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO:11, 12, 20, 21 a 30.
31. 31. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že podávání se provádí orálně nebo parenterálně.
32. 32. Způsob vakcinace subjektu za účelem produkce neutralizujícího antitoxinu zaměřeného proti toxinu C. difficile, vyznačující se tím, že

    390

    a) se použije v jakémkoli pořadí

    i) subjekt, ii) první čištěný rozpustný a vpodstatě endotoxinu prostý protein, zahrnující část sekvence SEQ ID NO:6 toxinu A Clostridium difficile a iii) druhý čištěný rozpustný a vpodstatě endotoxinu prostý protein, zahrnující část sekvence SEQ ID NO:10 toxinu B Clostridium difficile,

    b) první a druhý protein se smísí za vzniku terapeutické vakciny a

    c) uvedený subjekt se vakcinuje touto terapeutickou vakcinou pro vytvoření neutralizujícího antitoxinu.
33. 33. Způsob podle nároku 32, pták nebo savec.
34. 34. Způsob podle nároku 33, savec a tímto savcem je člověk.

    vyznačující se t í m , že subjektem je vyznačující se t í m , že subjektem je
35. 35. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že první i druhý protein dále zahrnuje netoxinovou proteinovou sekvenci, vybranou ze skupiny zahrnující sekvenci polyhistidinového úseku, sekvenci maltózu vázajícího proteinu a sekvenci thioredoxinového proteinu.
36. 36. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že uvedená část sekvence SEQ ID NO:6 toxinu A Clostridium difficile zahrnuje SEQ ID NO:29.
37. 37. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že uvedená část sekvence SEQ ID NO:10 toxinu B Clostridium difficile zahrnuje SEQ ID NQ:30.

    391 • · • · · · • · · · · ·
38. 38. Fúzní protein, zahrnující netoxinovou proteinovou sekvenci a část sekvence toxinů A Clostridium difficile, tvořenou SEQ ID NO:29.
39. 39. Fúzní protein podle nároku 38, kde netoxinovou proteinovou sekvencí je sekvence thioredoxinového proteinu nebo sekvence polyhistidinového úseku.
40. 40. Způsob detekce antigenů Clostridium difficile ve vzorku, vyznačující se t í m , že

    a) se použije v jakémkoli pořadí 1) vzorek s podezřením na obsah antigenů Clostridium difficile, 2) konjugáty s pevným nosičem, zahrnující protilátky reaktivní s antigeny Clostridium difficile, navázané na pevný nosič,

    b) vzorek a konjugáty se smísí za takových podmínek, že tyto konjugáty jsou schopny vázat se na antigeny Clostridium difficile, a

    c) detekuje se tato vazba.
41. 41. Způsob podle nároku 40, vyznačující se tím, že pevný nosič tvoří polystyrénová částice.
42. 42. Způsob podle nároku 40, v y z n a č u j í c í se t í m , že při míšení ve stupni b) vznikají viditelné agregáty.
43. 43. Způsob podle nároku 40, vyznačující se tím, že vzorkem je lidská stolice.
44. 44. Způsob léčby, vyznačující se tím, že a) se použije

    392 • · • · · · • · · · • · · · · • · · ·· ··

    i) subjekt, vystavený působení Clóstridium difficile, vykazující příznaky zahrnující průjem, a ii) protilátka, reaktivní s Clóstridium difficile, v aplikovatelném terapeutickém množství a

    b) protilátka se podává subjektu za takových podmínek, že subjekt přestane vykazovat příznaky a je možno ukončit léčbu.
45. 45. Způsob čištění toxinů Clóstridium difficile z kultury, vyznačující se tím, že

    a) se použije v jakémkoli pořadí 1) kultura, zahrnující organismy Clóstridium difficile a supernatant, zahrnující toxiny v roztoku, 2) protilátky reaktivní s toxiny Clóstridium difficile, imobilizované na pevném nosiči,

    b) z kultury zahrnující toxiny se odebere supernatant,

    c) tento supernatant se přidá k uvedené imobilizované protilátce za takových podmínek, že jsou protilátky schopny vázat se na tyto toxiny,

    d) z imobilizovaných protilátek se eluují toxiny a

    e) tyto eluované toxiny se detekují.
46. 46. Způsob podle nároku 40, 44 nebo 45, vyznačující se tím, že protilátky reaktivní s antigeny Clóstridium difficile jsou ptačí protilátky.
47. 47. Způsob podle nároku 46, vyznačující se tím, že tyto ptačí protilátky reagují s toxinem A Clóstridium difficile.
48. 48. Způsob podle nároku 47, vyznačující se tím, že tyto ptačí protilátky reagují s intervalem A-6 toxinu A.

    393 • · · • · <

    • · · · · • · · · «
49. 49. Způsob podle nároku 46, vyznačující se tím, že tyto ptačí protilátky reagují s toxinem B Clostridium difficile.
50. 50. Způsob podle nároku 49, vyznačující se tím, že tyto ptačí protilátky reagují s intervalem B-3 toxinu B.
51. 51. Způsob podle nároku 46, vyznačující se tím, že tyto ptačí protilátky reagují s toxinem A i s toxinem B.
52. 52. Způsob podle nároku 44, vyznačující se tím, že uvedený subjekt vykazuje dlouhodobé přežití po skončení doby léčby.
53. 53. Přípravek, vyznačující se tím, že zahrnuje ptačí antitoxin, zamřený proti proteinu klostridiálního toxinu, přičemž tento přípravek je v pevné dávkové formě.
54. 54. Přípravek podle nároku 53, vyznačující se tím, že dále zahrnuje enterosolventní povlak.
55. 55. Přípravek podle nároku 54, vyznačující se tím, že enterosolventní povlak se rozpouští při pH přibližně 7,0.
56. 56. Přípravek podle nároku 53, vyznačující se tím, že dávkovou formou je tableta.
57. 57. Přípravek podle nároku 53, vyznačující se tím, že zahrnuje polyethylenglykol.

    394 • · • · · ···· ···· • ···· · · « · · ·· • · » · · · · · * · · · · · ···· · · · e · · ·· · · · · ··· · · ··
58. 58. Způsob vytváření pevné dávkové formy antitoxinu zaměřeného proti proteinu klostridiálního toxinu, vyznačující se tím, že

    a) se použije přípravek zahrnující antitoxin zaměřený proti proteinu klostridiálního toxinu v suché formě a

    b) tento suchý ptačí antitoxin se tvaruje do tablety.
59. 59. Způsob podle nároku 58, vyznačující se tím, že tvarování ve stupni b) se provádí lisováním suchého antitoxinu pomocí tabletovacího lisu.
60. 60. Způsob podle nároku 58, v y z n a č u j i c i se t i m , že se na tabletu dále nanáší enterosolventní povlak.
61. 61. Způsob podle nároku 58, vyznačující se tím, že přípravek zahrnující suchý antitoxin obsahuje polyethylenglykol.

    • · · · » · · » · · · · » · · 4 » · · 4 ·,♦· '.· · .· ·.

    •t · : ·- .ď'x<ěj>ýOW^yď_;’;^ • · 4 4 ' · ·.

    g q ς / t/

    Wd3 ti ^AY1996 / s qoý/^o/·.

    <;„,ίώ;Χ

    ^fillSt 7Y^:;q^;' O- ' · 2 ' O' X · ,>.,Ω_ Uý/S- o o h- 42 < <c 7 < n Q_ ΓΛ

    \ ►,' 7 ^.Κνί^Τ/'.'Τ.- j V ^’7

    ·· ·

    A410

    Obr. 2 •2/sb cytotoxicita % buněk CHO faktor ředění IgY

    Obr. 3

    3/S-&

    ♦

    Obr.4

    ··· ·· ·· o

    τ o

    >φ c

    _Ω

    100

    80 60 CO υ

    x o

    •4-»

    O o

    5 4020-

    ---- *— Anti-Tox. A + Tox. B ——»— PreimmuněnlgY -- Tox. B Raí. (0.1gg/mt)

    -i-1-1-1

    10 100 1000 10000 faktor ředění IgY

    100000

    Obr. 5

    Fragment

    Fragment 3

    EcoRI f

    Pstl

    L

    P3

    Fragment 2

    P4

    P1 až P4 jsou PCR primery 1 až 4. P1 = 5’GGAAATTTAGCTGCAGCATCTGAC3 , P2 = 5TCTAGCAAATTCGCTTGTGTTGAA3’, P3 = 5’CTCGCATATAGCATTAGACC3’, P4 = 5’CTATCTAGGCCTAAAGTAT3’. Označená restrikční místa ve fragmentech 1 a 2 jsou interní místa použitá ke klonování do vektoru pGEX2T (fragment 1; konstrukt zvaný pGA30-660) nebo vektoru pMALc (fragment 2; konstrukt zvaný pMA660-1100). Restrikční místa na koncích fragmentu 3 v závorkách jsou místa polylinkeru pl)C9 použitá ke klonováni fragmentu 3 do vektoru pET23 (konstrukt zvaný pPA1100-2680). Čísla v těchto konstruktech označují interval aminokyselin toxinu A, který je exprimován. Stínovaná část genu toxinu A odpovídá opakující se vazebné doméně ligandu.