CN101321781B - 一种核苷酸疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种疫苗，它包含核酸构建体诸如DNA构建体，特别是包含编码操作上被连接至抗原性蛋白或者肽编码序列的恒定链的序列的核酸构建体。本疫苗刺激免疫应答，特别是以MHC‑I依赖型、而CD4⁺T细胞独立型方式的免疫应答。

Description

一种核苷酸疫苗

在申请中或者在本申请中所引用的所有专利和非专利参考文献，同样地以它们全部的内容引入这里作为参考。

技术领域

本发明涉及一种技术和方法，藉此，当应用病毒的和基于DNA的疫苗时，可获得更快、更宽泛和更强的免疫应答。

背景技术

尽管在免疫学领域中已具备当前的知识尤其是关于疫苗的技术，但是尚未获得适于抗多种病原体的疫苗。广泛传播的HIV(人免疫缺陷病毒)、HTLV(人T细胞亲淋巴病毒)、结核病和HCV(丙型肝炎病毒)的大流行病仍然是有效接种力所未及的，同时禽流感和其他出现的病原体威胁着颠覆我们的卫生健康体系。同样地，世界范围恐怖主义的爆发已将潜在的流行病扩大到包括外来的且致命的病原体诸如埃博拉病毒、拉沙病毒和马尔堡病毒。

疫苗可以是预防性的：它们是在实际感染发生前就被施用，或是治疗性的：这样它们引起或促进对已在体内病原体的免疫应答。接种的两种方法都需要建立稳固的免疫应答。由感染或接种激活的免疫应答依赖于几种细胞类型的交互作用，该细胞类型诸如T、B和抗原呈递细胞以及几种不同的分子，主要是抗原、MHC分子、T和B细胞受体，等等。

抗原是肽片段，由MHC分子在抗原呈递细胞表面上呈递。抗原可以是外来的，即病原性来源，或者源自生物体本身，因而称作自身或自体抗原。MHC分子是由特定染色体区域编码的多态性基因家族的代表，被称为“主要组织相容性复合体”，即MHC。存在两种类型的MHC分子，MHCI型(MHC-I)和MHC II型(MHC-II)。

辅助性T细胞是由存在于抗原呈递细胞表面上的MHC II型(MHC-II)分子所呈递的抗原而刺激。MHC-II分子是在内质网内合成的。在合成过程中，它们以防止MHC-II分子被与自身或自体抗原一起负载的方式与恒定链(Ii)组合在一起。MHC-II分子经恒定链中的信号序列被转运至特定细胞室(compartment)内的细胞表面。随着该室经处理它的内容物的成熟，它从溶酶体进展到次级内体(在与内吞囊泡融合后)再到MHC II类室(MIIC)。内吞囊泡包含外源抗原，即蛋白酶切割的细菌肽片段。这些片段是经它们的降解而制备的，以便被负载到MHC-II分子。MHC-II分子是由恒定链以两部分处理而释放的，恒定链首先被蛋白酶降解，在MHC-II结合域内只留下被称作CLIP的肽，然后用HLA-DM分子除去CLIP。此时，MHC-II分子是游离的，以便于结合外源抗原并且在MIIC囊泡融合至质膜后将这些呈递在细胞表面。这启动了体液的免疫应答，因为被呈递的抗原刺激了辅助性T细胞的激活，反过来又以多种方式激活B细胞，它最终分化为抗体分泌细胞。

细胞免疫应答被启动，当T细胞毒性细胞的T细胞受体识别了在抗原呈递细胞上被结合至MHC I类分子的抗原时。MHC-I分子不与功能性类似于恒定链(其与MHC-II缔合)的分子缔合。另外，MHC-I至抗原呈递分子的加工不同于MHC-II分子的加工，区别之处在于MHC-I分子已在内质网中与抗原一起被负载。由MHC-I分子呈递的抗原主要是蛋白质的蛋白酶体切割的肽片段，它已由抗原呈递细胞自身合成。这些蛋白可以是在细胞内拥有的DNA编码的异常蛋白，或者是衍生于病毒或已感染细胞并寄生于它的蛋白质合成机器的其他病原体的蛋白。涉及MHC I类的蛋白酶解系统存在于几乎所有的细胞中。

两种类型T细胞的功能是明显不同的，如它们的名称所隐含的。细胞毒性T细胞消除细胞内病原体和肿瘤，是通过直接的细胞溶解和通过分泌细胞因子诸如γ-干扰素。主要的细胞毒性T细胞是CD8⁺T细胞，它还是抗原特异性的。辅助性T细胞也可以溶解细胞，但是它们的主要功能是分泌细胞因子，该细胞因子提高了B细胞(产生抗体的细胞)和其他T细胞的活性，因此它们广泛地增强了对外源抗原的免疫应答，包括抗体介导的和细胞毒性T细胞介导的应答机制。CD4⁺T细胞是免疫应答中的主要辅助性T细胞表型。

传统的疫苗依靠于完整的生物体，即已被杀灭的病原性菌株或者减弱病原性的菌株。一方面，这些疫苗冒着引入它们被设计去预防的疾病的风险，如果减毒不充分或者如果在疫苗制备过程中足够多的生物体经杀灭步骤而存活下来。另一方面，这种疫苗已减少了传染性而且常常是免疫原性不足的，其导致源自接种的保护不充分。

最近，分子生物学技术已被用于开发新的疫苗，基于来自病原性生物体的个体抗原性蛋白。概念上，使用抗原性肽而非完整生物体可避免病原性，同时提供包含最大免疫原性抗原的疫苗。但是，已证明选择给定蛋白或多肽的最佳抗原是困难的，此外，已发现，纯的肽或碳水化合物趋于是弱的免疫原。

遗传(DNA)疫苗是新的且有希望的候选者，用于预防性和治疗性两种疫苗的研发。通过组合载体(即，裸DNA、病毒载体、减毒活病毒，等)的效能、抗原的表达水平以及重组的抗原本身(即，高的或低的亲合性MHC结合物，结构决定子的选择用于或多或少地限制T或B细胞库等)来确定后来发生免疫应答的强度。通常这被认为是正确的，即免疫记忆的有效诱导需要或者得益于CD4⁺(辅助性细胞)T细胞与CD8⁺(细胞毒性的)T细胞和B细胞的相互作用，它们介导了许多免疫记忆的作用。但是，常规DNA疫苗的一种潜在缺点是它们在人体中的低免疫原性。这种低免疫原性的一种可能起因是细胞内所形成的抗原限制性进入用于抗原加工和对辅助性T细胞呈递的MHC II途径。

发明概述

因此，本发明以提高应答动力学的方式解决了刺激免疫应答的问题，同时扩展和改善了应答，此外，避免了现有技术中所述接种方法的上述缺点。尤其是，特此提供了一种用于直接的、特异性和快速刺激免疫系统的新系统，以便改善所有动物的接种。

这种问题是用本发明的实施方案解决的，它们的特征列于权利要求。根据本发明，发现抗原融合至恒定链极大地加强了后来发生的抗病毒CD4⁺和CD8⁺T细胞应答。此外，令人惊奇地发现，这种作用是通过CD4⁺T细胞独立性机理而获得的。进一步还发现，这种保护在急性局部化且致命性感染中不仅被加速而且被加强，和在高剂量系统性感染中被加强。

因此，本发明的一个目的是提供一种核酸构建体，其包含编码以下的序列：至少一个恒定链，该恒定链在操作上被连接至至少一个抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段。

一方面，本发明还提供了一种腺病毒载体，其包含编码以下的核苷酸构建体：刺激免疫应答的、至少一个抗原和至少一个蛋白或者肽或者蛋白或肽的片段。

因此，一方面，本发明提供了用腺病毒载体刺激MHC-I介导的免疫应答的手段，该载体包含编码至少一个抗原和至少一个蛋白或者肽或者蛋白或肽的片段的核苷酸构建体。

另一方面包括了用腺病毒载体刺激MHC-II应答，该载体包含编码至少一个抗原和至少一个蛋白或者肽或者蛋白或肽的片段的核苷酸构建体。

另一方面，本发明提供了刺激核酸构建体、腺病毒载体、任意这些或任意这些的任意部分内所编码蛋白的细胞间传播的手段。

本发明的另一个目的是提供一种包含如这里所详述核酸构建体的传输媒介物，特别是与本发明相关的一种传输媒介物，例如复制缺陷腺病毒载体。

本发明的另一个目的和方面是提供一种细胞，其包含根据本发明的核酸构建体或腺病毒载体。

本发明的另一个目的是提供一种嵌合蛋白，如这里所述核酸构建体所编码的或者这里所述腺病毒载体所编码的。

本发明的另一方面是提供一种抗体，其识别由这里所述的核酸构建体或腺病毒载体所编码的嵌合蛋白。

本发明的一个方面是提供一种疫苗，其包含如这里所详述的核酸构建体或腺病毒载体。本发明特别涉及一种疫苗，在该疫苗中至少一个恒定链在操作上被连接至刺激MHC-I应答的、至少一个蛋白或者肽或者蛋白或肽的片段。这可以经由在操作上将至少一个恒定链与至少一个抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段相连接而实现。

本发明的另一个方面是提供一种疫苗，其包含如这里所详述的核酸构建体或腺病毒载体内所编码的嵌合蛋白。

本发明的另一个方面是提供一种成套试剂盒(kit in parts)，所述试剂盒包括包含如这里所述腺病毒载体或核酸构建体的疫苗组合物，同时带有医疗仪器或者将所述疫苗施用的其他手段，以及另外的关于如何使用成套试剂盒的说明书。

此外，本发明提供了用于在动物中诱导免疫应答的手段，其借助对动物施用一种包含如下所详述核酸构建体或腺病毒载体的疫苗进行。

附图说明

图1：在腺病毒载体中插入的示意图。

图2：CD8⁺和CD4⁺T细胞对编码表位腺病毒的应答。

图3：在F₁杂种小鼠中CD8⁺和CD4⁺T细胞对编码表位腺病毒的应答。

图4：Ad-IiGP发挥与CD4⁺T细胞无关的CD8⁺T细胞刺激作用。

图5：Ad-IiGP赋予快速和上佳的保护，防止致命性LCMV感染。

图6：Ad-IiGP有效地保护，防止高剂量、静脉内LCMV感染。

图7：对具有优势免疫表位中突变的致命性LCMV变体，Ad-IiGP赋予上佳保护。

图8：在Ad-IiGP接种和用带有优势免疫表位中突变的LCMV变体攻击之后，CD8⁺或CD4⁺T细胞对特异性LCMV表位反应的频率。

图9：CD8⁺和CD4⁺T细胞对用裸DNA-IiGP和DNA-GP接种的应答。

图10：用Ad-Ii-GP预防性接种增加肿瘤的排斥。

图11：用Ad-Ii-GP治疗性接种在携带肿瘤小鼠中增加平均寿命。

图12：用Ad-Ii-VSVGP或Ad-VSVGP接种后的存活率。

图13：CD8⁺和CD4⁺T细胞对更多编码表位腺病毒的应答。

图14：用CD8⁺T细胞对编码表位腺病毒的应答测量Ad-Ii-GP构建体相比于Ad-GP-Lamp-1构建体的有效性。

图15：基于框内多聚接头(polylinker)的载体。

图16：具有IRES2位点的载体。

发明的详述

定义：

腺病毒：一组含有双链DNA的病毒。腺病毒可进行遗传上修饰，使得它们成为无能力的复制体或者有条件的无能力复制体。在这种形式中，作为腺病毒构建体或腺病毒载体(adenovector)，它们可被用作基因传输媒介物，用于接种或基因疗法。

佐剂：任意物质，它与被施用的免疫原性决定子/抗原/核酸构建体的混合物增加或以其他方式修饰对所述决定子的免疫应答。

氨基酸：任意的、合成或天然的氨基羧酸，包括在肽和多肽(包括体内合成的蛋白质和酶)中存在的任意氨基酸，因此包括修饰的氨基酸。术语氨基酸在这里是与术语“氨基酸残基”同义地使用，“氨基酸残基”的含义预期包括规定的氨基酸，该氨基酸已与至少一个其他种类，诸如2，例如3，诸如多于3个的其他种类发生了反应。通用术语氨基酸既包括天然的也包括非天然的氨基酸，其任一个可以是“D”或“L”异构体的形式。

抗体：免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的活性部分。抗体是例如完整的免疫球蛋白分子或其保留免疫原活性的片段。

抗原：任何的能结合至克隆分布免疫受体(T细胞或B细胞受体)的物质。通常为肽、多肽或多聚多肽(multimeric polypeptide)。抗原优选地能引起免疫应答。

加强：用追加注射或用药以增强是指规定在初次用药之后的一段时间给予额外剂量的免疫剂例如疫苗，以便持续早期相同药剂用药所引起的免疫应答。

载运体(Carrier)：与抗原偶合以有助于诱导免疫应答的实体或化合物。

嵌合蛋白：一种遗传工程蛋白，它是由两种或以上完整的或部分的基因或者一系列(非)随机的核酸剪接在一起制造的核苷酸序列所编码的。

补体：一种复合系列的血蛋白，其作用“互补(complement)”抗体的工作。补体破坏细菌，产生炎症，而且调节免疫反应。

细胞因子：生长或分化调节剂，这里是非限定性使用，并且不应当用于限制本发明及权利要求的解释。除了细胞因子，粘附或附属分子，或者它们的任意组合物，可以单独地利用或与细胞因子组合使用。

CTL：细胞毒性T淋巴细胞。一个亚组的T细胞，其与T细胞受体一起表达CD8，因而能够对I类分子呈递的抗原应答。

传输媒介物：一种实体，藉此核苷酸序列或多肽或两者可被从至少一种介质转运至另一种。

片段：用于表示非全长部分的核酸或多肽。因此，片段本身也分别是核酸或多肽。

个体：任意物种或亚种的鸟、哺乳动物、鱼、两栖动物或爬行动物。

恒定链：一种整合的膜蛋白糖蛋白，其缔合于和稳定内质网及随后细胞室的MHCII分子。这里的术语恒定链涵盖了所有天然的或人工产生的全长或者片段化同源基因以及一定程度近似于人恒定链的蛋白质。这里，恒定链简化为Ii。

分离出的(Isolated)：与此处所公开的核酸、多肽和抗体联合使用的“分离出的”是指这些已被鉴别和从它们天然的(主要是细胞的)环境分开和/或回收。本发明的核酸、多肽和抗体优选地是分离出的，而且，本发明的疫苗和其他组合物优选地包含分离出的核酸、多肽或者分离出的抗体。

MHC：主要组织相容性复合体，存在MHC的两个主要亚类，I类和II类。

核酸：传达遗传信息的核苷酸链或序列。就本发明而言，核酸是脱氧核糖核酸(DNA)。

核酸构建体：一种遗传工程核酸。一般地包含几种元件，例如基因或其片段、启动子、增强子、终止子、聚A尾、接头、多聚接头、操作接头(operative linker)、多克隆位点(MCL)、标记、终止密码子，其他的调节元件、内部核糖体进入位点(IRES)或其他。

操作接头：一种核苷酸或氨基酸残基序列，其将两部分核酸构建体或(嵌合)多肽结合在一起，可以保证核酸或多肽的生物学加工。

病原体：一种特异性疾病致因剂，尤其是生物剂，例如病毒、细菌、朊病毒或能引起它的宿主生病的寄生物，也被称为传染剂。

肽：多种共价连接的氨基酸残基所限定的序列并且以酰胺键连接。该术语与寡肽和多肽近似地使用。天然和/或非天然氨基酸可以肽键或者以非肽键相连。术语肽还包括翻译后的修饰，通过化学的或酶催化的反应而引入，如本领域已知的。该术语可以指多肽的变异体或片段。

药物载运体：也被称作赋形剂或稳定剂，对细胞或者个体是无毒性的，当以所用剂量和浓度使细胞或个体暴露于它们时。通常，生理学上可接受的载运体是含水的pH缓冲溶液。生理学上可接受载运体的实例包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐，以及其他的有机酸类；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖及其他的碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐的抗衡离子，诸如钠离子；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN^TM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS^TM。

多个(Plurality)：至少两个。

启动子：在DNA链的结合位点，在此RNA聚合酶结合从而起始信使RNA和一个或多个的邻近结构基因的转录。

信号肽：一种短序列的氨基酸，其决定细胞中蛋白质的最终定位，也被称为分选肽。

siRNA：小干扰RNA(siRNA)，其靶向于(以序列特异性的方式)内源性RNA，用于降解，藉此减少基因产物的量。

表面活性剂：表面的活性剂，其能够降低液体的表面张力，当它溶解在液体中时。表面活性剂是一种包含亲水性极性基团和疏水性非极性基团的化合物，而且通常由脂肪链组成。

疫苗：一种物质或组合物，其能够在动物中诱导免疫应答。在本发明的正文中，也被称作免疫原性组合物。免疫应答是一种在生物体内诱导记忆的免疫应答(体液的/抗体和/或细胞的)，产生传染剂，是由继发性而非初始性应答应付的，因此降低了对宿主生物体的影响。本发明的疫苗可以规定为或者预防性的和/或治疗性药物。该组合物可以包含一种或多种的下列物质：抗原、包含一个或多个在操作上被连接至Ii的抗原的核酸构建体、载运体、佐剂以及药物载运体。

变体：一种已知的参照核酸或多肽的变体，是指这样的核酸或多肽——其表现一定程度的相对于所述参照核酸或多肽的序列同源性/同一性，但是与所述参照核酸或多肽不相同。

本发明涉及一种疫苗，其包含一种核酸构建体诸如DNA构建体，特别是包含编码在操作上被连接至抗原性蛋白或者编码肽的序列的恒定链的序列的核酸构建体。该疫苗刺激免疫应答，特别是以MHC-I依赖型、而CD4⁺T细胞独立型方式的免疫应答。

核酸构建体

一方面，本发明涉及核酸构建体，其包含编码至少一个恒定链的序列，该恒定链在操作上被连接至至少一个抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段，简言之，一种抗原。

核酸构建体可理解为一种遗传工程核酸。该核酸构建体可以是一种非复制的而且线性的核酸、一种循环表达的载体、一种自主复制质粒或病毒表达载体。核酸构建体可包含几种元件，例如但不限于基因或其片段、启动子、增强子、终止子、聚-A尾、接头、聚多接头、操作接头、多克隆位点(MCS)、标记、终止密码子、内部核糖体进入位点(IRES)以及宿主同源性整合序列或者其他的已定义元件。工程核酸构建体的方法是本领域内熟知的(参见，例如，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)，Sambrook等，编辑，Cold Spring Harbor Laboratory，第2版，冷泉港，纽约，1989年)。

在图1、15和16，以及在鉴定为SEQ ID NO：5、6、7、8、9和10的序列中，给出核酸构建体的部分实例。SEQ ID NO：5、6、7、8、9和10的部分载体序列已用如上所述的亚克隆各种元件而产生，并且表示于图1、15和16中。这些部分序列都被插入pAC-CMVpLpARS(+)载体(Becker等，1994，Methods Cell Biol.43A部分：161-189)，参见基因库登录号AY590429.1。

恒定链

恒定链(Ii)或CD74，是一种非多态II型整合膜蛋白，参见分别用于人和小鼠Ii氨基酸序列的SEQ TD NO：2和4，以及同样地分别用于人和小鼠Ii核酸序列的SEQ ID NO：1和3。恒定链具有多重功能，在淋巴细胞成熟方面和在适应性免疫应答方面，特别是在靶向于溶酶体室方面，IiCLIP序列可占用MHC II类分子直至这些与核内体室相融合(PietersJ.1997，Curr.Opin.Immunol.，9：8996)。此外，Ii已显示作为MHC I类分子伴侣的功能(Morris等，2004，Immunol.Res.30：171-179)，而且用它的核内体靶向序列，以有助于CD4⁺而非CD8⁺T细胞的刺激，针对共价地连接的抗原(Diebold等，2001，Gene Ther.8：487-493)。

恒定链蛋白包含多个域：包括信号肽或分选肽的胞质域(又被称作溶酶体靶向序列)，跨膜域，以及本身包含CLIP区、KEY区、核心域和三聚体域的腔内域。这些域的两个的侧翼存在高弹性区(Strumptner-Cuvelette&Benaroch，2002，Biochem.Biophys.Acta.，1542：1-13)。恒定链已被表征于数种生物体，包括脊椎动物(例如鸡)、哺乳动物(例如，牛、犬、小鼠和大鼠)和人。

本发明涉及核酸构建体，它包含其中至少一个恒定链是生物体特异性的或者与特异性生物体相关的序列。优选地，至少一个恒定链是脊椎动物来源的，更优选地，哺乳动物来源的和最优选地人来源的。关于这里SEQID NO：1所定义的序列是来源于人的恒定链核酸序列。所利用的恒定链优选地是待接受接种的生物体恒定链。本发明的一个目的是恒定链和宿主生物体或者治疗接受者为相同的物种。

本发明还涉及一种核酸构建体，其中编码的至少一个恒定链是SEQ IDNO：2所鉴定序列的片段，该片段具有至少40个氨基酸，而且至少85％等同于SEQ ID NO：2的相同片段。

所述的片段是一种至少40个氨基酸的片段，来自恒定链的任意部分，如SEQ IDNO：2中所列出的。这包括这样的片段，包括1至40，10至50，20至60，25至65，30至70，35至75，40至80，45至85，50至90，55至95，60至100，65至105，70至110，75至115，80至120，85至125，90至130，95至135，100至140，105至145，110至150，115至155，120至160，125至165，130至170，135至175，140至180，145至185，150至190，155至195，160至200，165至205，170至210以及175至216个残基。它还包括如上述所列出的每端扩展多达5个的片段。它进一步包括至少50个残基的、至少60个残基的、至少70个残基的、至少80个残基的、至少90个残基的、至少100个残基的、至少110个残基的、至少120个残基的、至少130个残基的、至少140个残基的、至少150个残基的、至少160个残基的、至少170个残基的、至少180个残基的、至少190个残基的、至少200个残基的以及至少210个残基的片段。

与SEQ ID NO：2至少85％序列同一性，例如至少90％序列同一性，例如至少91％序列同一性，诸如至少92％序列同一性，例如至少93％序列同一性，诸如至少94％序列同一性，例如至少95％序列同一性，诸如至少96％序列同一性，例如至少97％序列同一性，诸如至少98％序列同一性，例如99％序列同一性的任意上述片段都包括在本发明的范围内。

氨基酸序列间的同一性/同源性是可以使用熟知的计分矩阵计算的，例如BLOSUM30、BLOSUM 40、BLOSUM 45、BLOSUM 50、BLOSUM 55、BLOSUM 60、BLOSUM 62、BLOSUM 65、BLOSUM 70、BLOSUM 75、BLOSUM 80、BLOSUM 85和BLOSUM 90中的任何一种。

优选地，本发明是一种核酸构建体，其中编码的至少一个恒定链是SEQ ID NO：2片段，该片段具有至少186个氨基酸。这包括如上所定义的任一序列，以及因此与SEQ ID NO：2恒定链序列共享同一性的。

本发明进一步涉及一种核酸构建体，其中编码的至少一个恒定链是至少85％等同于SEQ ID NO：2。

这包括衍生自如SEQ ID NO：2中所提出的恒定链、至少85％序列同一性的任一序列，与SEQ ID NO：2例如至少90％序列同一性，例如至少91％序列同一性，诸如至少92％序列同一性，例如至少93％序列同一性，诸如至少94％序列同一性，例如至少95％序列同一性，诸如至少96％序列同一性，例如至少97％序列同一性，诸如至少98％序列同一性，例如99％序列同源性都包括在本发明的范围内。这包括比SEQ ID NO：2中所述序列更长或者更短的序列。

最优选地，本发明涉及一种核酸构建体，其中编码的至少一个恒定链等同于SEQID NO：2。

上述的任意序列，无论来源、序列同一性或长度，都是来自这里所定义恒定链的变体。

接下来，在本发明的范围内的是，来自任意生物体的恒定链变体可以是根据上述的变体的片段，即，变体可以是生物体恒定链的片段，和/或是至少85％等同于所述的恒定链全部序列或者其中的片段。恒定链还可以是来自生物体的相关物种或者是来自较远相关的物种。

另一方面，本发明涉及添加、除去或取代核酸构建体所编码的至少一个恒定链的区、肽或域。一个或多个这些区、肽或域的除去将平截所得的恒定链。区、肽或域的添加或者替代包括从已知来源如天然的蛋白质或多肽挑选这些序列或者从人工合成的编码这些序列的多肽或核酸中挑选。区、域或肽的添加包括添加一个、两个或多个每种类型或不同类型的区、域、肽，以及一个、两个、三个或多个编码这些区、域和肽的核酸。这些可基于序列彼此相同或不同。区、肽和域不必源自与支架恒定链一样的生物体。在本领域中，实现个体的添加、缺失和取代以及编码最终多肽的核苷酸延伸都是熟知的。

比对核酸和特别是同源性基因的蛋白质或来自不同生物的蛋白质序列是非常有帮助的，当确定哪种取代、缺失、重排或其他变更有益于构建时。如下所示比对人和鼠的恒定链序列提供了一种指示，哪些氨基酸残基对于这些生物体中恒定链的结构和功能是重要的—这些是两种序列间保守的残基。同样地，预计不重要的残基是那些其中序列不同的。实现变体残基/区的取代和/或缺失是涉及本发明的兴趣点。当尝试突变或缺失或以其它方式变更序列例如人恒定链从而改善其免疫应答刺激能力时，检查保守残基和制造例如同源性取代(即，被认为是具有例如相同结构性质、极性、疏水性或其他的氨基酸取代)也是相关的。

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鼠120MTQDHVMHLLTRSGPLE-YPQLKGTFPENLKHLKNSMDGWWKIFESWMKQWLLFEMSKN

人181SLEQK-PTDAPPKESLELEDPSSGLGVTKQDLGPVPM

鼠179SLEEKKPTEAPPKEPLDMEDLSSGLGVTRQELGQVTL

本发明优选的实施方案涉及至少一个恒定链，其中信号肽被除去、替换或添加至编码恒定链的序列。信号肽是一种短的氨基酸序列，其决定细胞中蛋白质的最后位置，又称作分选肽。决定蛋白质定位于亚细胞室如内质网、高尔基体以及包含高尔基体的各种室、核、质膜、线粒体和各种空间和其中膜、过氧化物酶体、溶酶体、内体以及分泌囊泡等的信号肽都被包括在本发明的范围内。一种优选的实施方案包含单独的溶酶体恒定链靶向序列。另一种优选的实施方案包含单独的KEY区恒定链。

本发明优选的实施方案涉及至少一个恒定链CLIP区的除去、添加或替换。如上所述，CLIP区的添加或替换包括添加或替换在恒定链或所选链的变体中已有的CLIP区，以来自它们或其他生物体的恒定链CLIP区或者来自(form)它们或其他生物体CLIP区的变体。变体CLIP区，根据上述的，是特异性产生的CLIP区突变类型，由单个或多个核酸取代、缺失或添加所产生。优选的实施方案包含单独的CLIP区，或者与N-末端相邻序列或者C-末端相邻序列而非恒定链任何其他区或域一起的CLIP区。其他优选的实施方案包含单独的N-末端或C末端相邻于CLIP区而非CLIP区本身的序列。相邻的含义是在CLIP区10个残基内，CLIP区的20个残基内，30个残基内，40个残基内，50个残基内，75个残基内或者100个残基内的任意氨基酸。

本发明的一种实施方案涉及如上所述恒定链的而不带有CLIP区的片段。这些片段可以是至少5个氨基酸残基长度，至少10个残基，至少15个残基，至少20个残基，至少25个残基，至少30个残基或者至少35个残基长度。另一种实施方案涉及恒定链的片段，其中信号肽被除去而且恒定链片段是至少10个氨基酸残基长度，至少15个残基，至少20个残基，至少25个残基，至少30个残基，至少35个残基，至少50个残基，至少60个残基，至少70个残基，至少80个残基，至少90个残基，至少100个残基，至少110个残基，至少120个残基，至少130个残基，至少140个残基，至少150个残基，至少160个残基，至少170个残基，或者至少180个残基长度。

抗原

任意的上面恒定链变体都以这样的形式包括在本发明中，其中至少一个所述变体是在操作上被连接至至少一个抗原诸如抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段。

本发明的一个目的是包括但不限于源自病原性生物体的抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的片段、癌特异性多肽和抗原，以及与异常生理学应答相关联的蛋白或肽。

更优选地，本发明的一个目的是包括一种源自下列任一病原体类型的抗原：病毒、微生物和寄生物。这包括任何已知动物的病原体。优选的是具有来自哺乳动物病原体的抗原，即，一种特异性靶向哺乳动物的病原体。更优选的是具有来自人病原体的抗原。总之，可使用任何被发现与人病原体相关的抗原。

在优选的实施方案中，至少一种抗原可以源自但不限于任意下列病毒科：腺病毒、沙粒病毒科、星状病毒科、布尼亚病毒科、杯状病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、疱疹病毒科、正黏液病毒科、副黏液病毒科、小核糖核酸病毒科、痘病毒科、呼肠孤病毒科、逆转录病毒科、弹状病毒科和披膜病毒科。

更具体地，至少一种抗原或抗原性序列可以是衍生自任意下列的病毒：甲型流感诸如H1N1、H1N2、H3N2和H5N1(禽流感)、乙型流感、丙型流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、轮状病毒、诺瓦克病毒组的任意病毒、肠腺病毒、细小病毒、登革热病毒、猴痘、马尔堡病毒、狂犬病毒属如狂犬病毒、拉各斯蝙蝠病毒、莫科拉病毒、杜文海格病毒、欧洲蝙蝠病毒1&2以及澳大利亚蝙蝠病毒、暂时热病毒属、水泡病毒属、水泡性口炎病毒(VSV)、疱疹病毒诸如单纯疱疹病毒1型和2型、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒、爱波斯坦-巴尔病毒(EBV)、人疱疹病毒(HHV)、人疱疹病毒6型和8型、人免疫缺陷病毒(HIV)、乳头瘤病毒、鼠γ疱疹病毒、沙粒病毒诸如阿根廷出血热病毒、玻利维亚出血热病毒、萨比亚相关出血热病毒、委内瑞拉出血热病毒、拉沙热病毒、马丘波病毒、淋巴细胞性脉络丛脑炎病毒(LCMV)、布尼亚病毒科诸如克里米亚-刚果出血热病毒、汗他病毒、引起出血热伴有肾综合症的病毒、裂谷热病毒、丝状病毒科(丝状病毒)包括埃博拉出血热以及马尔堡出血热、黄病毒科包括科萨努尔森林病毒、鄂木斯克出血热病毒、引起蜱传脑炎的病毒以及副粘液病毒科诸如亨德拉病毒和尼帕病毒、大天花和小天花(天花)、甲病毒属诸如委内瑞拉马脑炎病毒、东部马脑炎病毒、西部马脑炎病毒、SARS-相关的冠状病毒(SARS-CoV)、西尼罗病毒和任何引起脑炎的病毒。

在本发明优选的实施方案中，至少一种抗原性蛋白或肽是来自病毒，该病毒选自下列组：HIV、丙型肝炎病毒、流感病毒、疱疹病毒、拉沙、埃博拉、天花、禽流感、丝状病毒、马尔堡以及乳头瘤病毒。

在本发明更优选的实施方案中，至少一种抗原性蛋白或肽是选自下列的组和/或可以是至少一种任意下列物质的抗原性片段：水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、甲型流感NS-1(非结构性蛋白1)、甲型流感M1(基质蛋白1)、甲型流感NP(核蛋白)、LCMV NP、LCMV GP、埃博拉GP、埃博拉NP、鼠γ疱疹病毒M2、M3和ORF73(例如MHV-68M2、M3和ORF73)、鸡卵白蛋白(OVA)，或者一种辅助性T细胞表位。将两种以上这里所提到的任意抗原组合是在本发明的范围内。

本发明的一种实施方案包括了来自微生物的至少一种抗原性蛋白或者肽或者抗原性蛋白或肽的片段。更具体地说，至少一种抗原是衍生自下列非穷尽目录中之一：炭疽(炭疽杆菌)、分支杆菌结核病、沙门氏菌(鸡沙门氏菌、雏沙门氏菌、伤寒热沙门氏菌、肠炎沙门氏菌(S.enteridtidis)、副伤寒热沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、鼠伤寒热沙门氏菌)、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、白喉棒状杆菌、百日咳博德特氏菌、弯曲杆菌属诸如空肠弯曲菌、新型隐球酵母、鼠疫耶耶尔森氏杆菌、结肠炎耶尔森氏杆菌、假结核耶尔森氏杆菌、单核细胞增生李斯特菌、钩端螺旋体、嗜肺军团杆菌、伯氏疏螺旋杆菌、链球菌诸如肺炎链球菌、脑膜炎内瑟菌、流感嗜血杆菌、弧菌诸如霍乱弧菌O1、霍乱弧菌非-O1、副溶血弧菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、弗尼斯弧菌、鲨鱼弧菌、霍里斯弧菌、辛辛那提弧菌、梅氏弧菌、海鱼弧菌、拟态弧菌、河流弧菌、致伤弧菌、芽孢杆菌、亲水性气单胞菌、豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌&威隆气单胞菌、志贺邻单胞菌、志贺氏菌诸如宋内志贺菌、鲍氏志贺菌、福氏志贺菌、以及痢疾志贺菌、肠道毒性大肠杆菌EEC(大肠杆菌-产肠毒性(ETEC)、大肠杆菌-肠致病性(EPEC)、大肠杆菌O157:H7肠出血性(EHEC)、大肠杆菌-肠侵袭性(EIEC))、葡萄球菌诸如金黄色葡萄球菌以及特别是万古霉素中介/抗性种(VISA/VRSA)或者多重药物抗性种(MRSA)、志贺氏菌诸如福氏志贺菌、宋内志贺菌、痢疾志贺菌孢子虫、布鲁氏菌诸如牛布鲁氏菌、羊布鲁氏菌、绵羊布鲁氏菌、猪布鲁氏菌和犬布鲁氏菌、鼻疽伯克霍尔德氏菌和假鼻疽伯克霍尔德氏菌、鹦鹉热衣原体、贝氏柯克斯体、土拉热弗朗西丝菌、普氏立克次体、荚膜组织胞浆菌、粗球孢子菌。

在本发明一种优选的实施方案中，至少一种抗原性蛋白或者肽是来自微生物，该微生物选自下列组：结核分支杆菌、炭疽杆菌、葡萄球菌以及弧菌。

本发明的一种实施方案涉及一种核酸构建体，其中至少一种被编码的抗原性蛋白或者肽是来自寄生物。

本发明的另一种实施方案涉及一种核酸构建体，其包含来自任意上述病原体的至少两种抗原性蛋白或者肽的组合。

优选地，抗原是衍生自，但不限于，选自下列组的寄生物：疟原虫诸如三日疟原虫，卵形疟原虫，间日疟原虫，恶性疟原虫，微小内蜒阿米巴，蓝氏贾第鞭毛虫，溶组织内阿米巴，微小隐孢子虫，人芽囊原虫，阴道毛滴虫，弓形虫，圆孢子虫，鼠隐孢子虫，肺孢子虫，杜氏利什曼原虫，热带利什曼原虫，巴西利什曼原虫，墨西哥利什曼原虫，棘阿米巴诸如卡氏棘阿米巴，以及柯氏棘阿米巴，福氏内格勒，克氏锥虫，布氏罗得西亚锥虫，布氏冈比亚锥虫，贝氏等孢球虫，大肠纤毛虫，蛔虫(似蚓蛔线虫)，钩虫(美洲钩虫，十二指肠钩口线虫)，蛲虫(蠕形住肠线虫)，蛔虫(犬弓首蛔虫，猫弓首蛔虫)，心丝虫(犬恶丝虫)，类圆线虫属(粪类圆线虫)，毛线虫属(旋毛线虫)，丝虫属(班氏吴策线虫，马来布鲁线虫，盘尾丝虫，罗阿罗阿丝虫，链尾曼森丝虫，常规曼森丝虫，奥氏曼森丝虫)，以及异尖线虫属幼虫(简单异尖线虫(鲱鱼线虫)，拟地新(海豹线虫，钻线虫)线虫(鳕鱼或海豹线虫)，对盲肠线虫，以及宫脂蛔属(鲔蛔线虫属)鞭虫，牛肉绦虫(牛带绦虫)，猪肉绦虫(猪带绦虫)，鱼绦虫(阔节裂头绦虫)，以及犬绦虫(犬复孔绦虫)，肠吸虫(布氏姜片吸虫)，血吸虫(日本血吸虫，曼氏血吸虫)埃及血吸虫)，肝吸虫(华支睾吸虫)，东方肺吸虫(卫氏并殖吸虫)，以及绵羊肝吸虫(肝片吸虫)，鲑隐孔吸虫和希氏侏形吸虫。

在一种本发明优选的实施方案中，至少一种抗原性蛋白或肽是从选自下列组的寄生物获得的：疟原虫、利什曼原虫以及锥虫。

一方面，本发明涉及从疾病或物质衍生的抗原和/或抗原性序列，所述疾病或物质传染驯养动物，尤其是商业上相关的动物，例如，猪、牛、马、绵羊、山羊、美洲鸵、家兔、水貂、小鼠、大鼠、犬、猫，家禽诸如鸡、火鸡、雉等，鱼诸如鳟鱼、鲑鱼等饲养的品种。至少一种抗原或抗原性序列可从其中衍生的疾病或物质实例，包括但不限于：多重种的疾病诸如：炭疽病、伪狂犬病、蓝舌病；布鲁氏病诸如：牛布鲁氏病、羊布鲁氏病或猪布鲁氏病；克里米亚刚果出血热、包虫病/棘球蚴病、小核糖核酸病毒科病毒，引起口蹄疫的口疮病毒属，尤其是任意七种免疫学上不同的血清类型：A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3、亚洲1型，或心水病、日本脑炎、钩端螺旋体病、新大陆螺旋蝇蛆病(嗜人锥蝇)、旧大陆螺旋蝇蛆病(倍氏金蝇)、副结核病、q热、狂犬病、裂谷热、牛瘟、旋毛虫病、野兔病、水泡性口炎或西尼罗热；牛疾病诸如：牛边虫病、牛巴贝西虫病、牛生殖性弯曲杆菌病、牛海绵状脑炎、牛结核病、牛病毒性腹泻、传染性牛胸膜肺炎、牛地方性白血病、出血性败血症、牛传染性鼻气管炎/传染性化脓性外阴道炎、疙瘩皮肤病、恶性卡他热、泰勒氏梨浆虫病、毛滴虫病或锥虫病(棘蝇传播)；绵羊及山羊疾病诸如：山羊关节炎/脑炎、传染性无乳症、传染性山羊胸膜肺炎、羊地方性流产(绵羊衣原体病)、梅迪-维斯纳病、内罗毕绵羊病、绵羊附睾炎(绵羊布氏杆菌)、小反刍兽疫、沙门菌病(流产沙门氏菌)、羊痒病、绵羊痘和山羊痘；马疾病诸如：非洲马疾病、马传染性子宫炎、马媾疫、马脑脊髓炎(东方型)、马脑脊髓炎(西方型)、马感染性贫血、马流感、马梨浆虫病、马鼻肺炎、马病毒性动脉炎、马鼻疽、苏拉病(伊氏锥虫)或委内瑞拉马脑脊髓炎；猪疾病诸如：非洲猪瘟、古典型猪瘟、尼帕病毒脑炎、猪囊尾蚴病、猪生殖呼吸综合症、猪水泡病或者传染性胃肠炎；禽类疾病诸如：禽类衣原体病、禽类感染性支气管炎、禽类感染性喉气管炎、禽类支原体病(败血支原体)、禽类支原体病(滑液支原体)、鸭病毒肝炎、禽霍乱、禽伤寒、高致病性禽流感(这是任意甲型或乙型以及特别是H5N1型流感病毒)、感染性囊疾病(甘保罗病)、马列克氏病、纽卡斯尔病、稚白痢或火鸡鼻气管炎；兔类及啮齿动物疾病诸如：病毒肠炎、黏液瘤病或家兔出血热；鱼类疾病诸如：地方流行性造血器官坏死、感染性造血器官坏死、鲤春病毒病、病毒性出血性败血症、感染性胰脏坏死、感染性鲑鱼贫血症、地方流行性溃疡综合症、细菌性肾病(鲑肾杆菌)、三代虫病(鲑鱼三代虫)、红海鲷虹彩病毒病；或者其他疾病诸如驼痘或利什曼病。

在一种本发明优选的实施方案中，至少一种抗原性蛋白或肽是源于伪狂犬病、口蹄疫、水泡性口炎病毒、禽流感或者纽卡斯尔病。

另外，一种本发明优选的实施方案涉及至少一种抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的片段，它是与上述任意抗原具有至少85％同一性的抗原性肽或蛋白。氨基酸之间的同源性或同一性可以用任意的上述BLOSUM计分矩阵计算。

本发明涉及一种核酸构建体，其中至少一种抗原性蛋白或者肽或者抗原性蛋白或肽的片段是源自癌特异性多肽或癌抗原。

许多蛋白/糖蛋白已被鉴别而且连接至某些类型的癌；这些被称作癌特异性多肽、肿瘤相关抗原或癌抗原。通常，已发现与癌肿瘤相关的任何抗原都可被使用。一种可发现癌特异性抗原的方法是用减法分析例如各种微阵列分析，诸如DNA微阵列分析。比较这里的健康者与癌患者之间、癌患者组之间或者相同患者中健康组织与癌组织之间的基因表达模式(如以所述基因编码的蛋白或RNA水平中所见到的)。具有大约相等表达水平的基因被彼此“减去”，留下健康组织与癌组织间不同的基因/基因产物。这种方法是本领域中已知的，并且可被用作一种鉴别新癌抗原的方法，或者创造一种专用于规定患者或患者组的基因表达概况。这样所鉴别的抗原，无论是单个的抗原还是它们已被发现组合在其中的，都落入本发明的范围内。

优选地，至少一种本发明的抗原是衍生自，但不限于癌特异性多肽，其选自下列的组：MAGE-3、MAGE-1、gp100、gp75、TRP-2、酪氨酸酶、MART-1、CEA、Ras、p53、B-连环蛋白、gp43、GAGE-1、BAGE-1、PSA、 MUC-1，2，3，和HSP-70、TRP-1、gp100/pmel17、β-HCG、Ras突变体、p53突变体、HMW黑素瘤抗原、MUC-18、HOJ-1、周期素-依赖型激酶4(Cdk4)、半胱氨酸蛋白酶(caspase)8、HER-2/neu、人乳头瘤病毒HPV类型6、11、16、18、31和33，Bcr-Abl酪氨酸激酶、癌胚抗原(CEA)、端粒酶以及SV40大T。

一种本发明优选的实施方案，至少一种抗原性蛋白或者肽或者抗原性蛋白或肽的片段是源自癌特异性多肽，该多肽选自这样的组：p53、HER-2/neu、端粒酶以及黑素瘤抗原。

一种本发明的实施方案涉及核酸构建体，其中至少一种抗原性蛋白或者肽或者抗原性蛋白或肽的片段是源自与异常生理学应答相关的多肽。这种异常生理学应答包括，但不限于自身免疫疾病、变态反应、癌以及先天性疾病。关于这些的非穷尽性实例目录包括疾病诸如风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、银屑病和克罗恩病。

操作接头

一方面，本发明涉及核酸构建体，其中位于恒定链与抗原性蛋白或者肽或者抗原性蛋白或肽的片段之间的操作接头或者是直接的连接或者是由间隔区介导的连接。术语操作接头应当被理解为一种核苷酸或氨基酸残基序列，其将两部分核酸构建体或嵌合多肽结合在一起，可以保证核酸或多肽的生物学加工。如果操作接头是直接的连接，那么每个编码开放读码框架或者开放读码框架片段的两个核酸被安置彼此紧密相邻并且也在框架内。如果操作接头是由间隔区相介导的，一连串的核苷酸被插入分别编码至少一个恒定链与至少一个抗原性肽的核苷酸之间。具有间隔区的是属于本发明的范围内，其中所述间隔区只是连接至少本发明两个元件的一连串核苷酸，这样保留了开放读码框架，或者该间隔区可编码如这里所定义的、一种或多种的信号或者分隔元件。

一种优选的实施方案中，本发明包含了操作接头，其中所述操作接头是一种间隔区。

在一种更优选的实施方案中，本发明包含了编码至少一个MHC II类分子辅助性表位(helper epitope)的间隔区。辅助性表位的实例是一种免疫原性决定子如白喉毒素。特别是，白喉毒素B片段COOH-末端区已被证明在小鼠中是免疫原性的。此外，HSP70，部分地或者全部地，以及其他免疫原性肽，例如流感病毒或具有对HLAI类和II类分子锚定基序的免疫原性序列或者肽，同样可以被编码于核酸构建体的间隔区内。

在另一种优选的实施方案中，核酸构建体的间隔区编码至少一个蛋白酶切位点。溶酶体蛋白酶诸如组织蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和锌蛋白酶以及其他细胞内蛋白的酶切位点属于本发明的范围内。

在另外一种优选的实施方案中，核酸构建体的操作接头可包含至少一个siRNA或miRNA编码的序列。siRNA(小干扰RNA)和miRNA(微小RNA)靶向内源的RNA，以序列特异性的方式，用于降解。因此，选取在本发明核酸构建体内编码的siRNA或miRNA，以便靶向不期望的基因产物。

在更优选的实施方案中，操作接头包含至少一个多聚接头或者多克隆位点(MCS)。多聚接头和MCS是包含限制性酶识别序列的连串核苷酸，即，这样的位点——其中限制酶以平头或交错的方式酶切DNA，有助于将DNA的其他片段/序列亚克隆至核酸构建体。多聚接头/MCS的识别序列通常具有独特的含义，即它们在核酸构建体上其他地方未被发现。此外，操作接头包含一个或多个停止或终止密码子，其作出从核糖体释放初始多肽的信号。操作接头还可包含至少一个IRES(内部核糖体进入位点)和/或至少一个启动子。IRES是一种核苷酸序列，其允许在信使RNA(mRNA)序列的中部翻译启动，作为更大的蛋白合成过程的一部分。启动子是一个使基因被转录的DNA序列。启动子是由RNA聚合酶识别的，其随后启动转录，参见下面。启动子可以是单向的或双向的。

在特别优选的实施方案中，跨越恒定链与至少一个抗原之间区的操作接头是包含至少一个多聚接头和至少一个启动子和任选地同样地至少一个IRES的操作接头。这些元件可以任意次序安置。在一种进一步优选的实施方案中，恒定链的终止密码子已被缺失，而且多聚接头已被克隆至载体，以便保留开放的读码框架，使得被插入至多聚接头的至少一种抗原在框架内读码。这样的优点是有助于以一步或多个克隆步骤将多种抗原亚克隆至同一构建体，并且允许多种抗原在同一框架内同时表达为恒定链。终止密码子可以在多聚接头翻译终止后被插入。这种实施方案可以与任意的上述辅助性表位、mi/siRNA或者这里所述的任意其他元件相组合。

本发明的一种实施方案涉及将操作接头安置于至少一个恒定链和至少一个抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的片段，其中抗原性肽编码序列被安置在：在恒定链序列内、在恒定链序列的前端、在恒定链序列的终止部分。这样做的目的是，确保构建体开放读码框架的可读性，以便抗原性肽被至少一种操作接头：前导、环绕或者结束。

一种优选的本发明实施方案进一步地涉及将操作接头安置于至少一个恒定链和至少一个抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的片段，其中优选地将至少一个抗原性肽编码序列安置于恒定链的终止部分而且将操作接头插入这里的两者之间。所述终止部分是恒定链或其片段的最初或最后残基。

组合

核酸构建体编码多种元件属于本发明的范围内。该元件是至少一个恒定链和至少一个抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的片段。因此，具有多种恒定链属于本发明的保护范围内，这些中的每一个在操作上被连接至彼此和被连接至多种抗原性蛋白或者肽或者抗原性蛋白或肽的片段，其中这些同样地在操作上被连接。因此，核酸构建体的多个元件在操作上必须彼此相连接。几个连串的恒定链中每一个在操作上被连接至一个抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的片段，这些连串的每一个在操作上被彼此相连接是包括在本发明之内。

本发明的优点和非常重要的方面涉及这样的事实，即任意类型的免疫应答，例如T细胞介导的和抗体介导的应答，既可以用已知为弱抗原的表位、用未知抗原性特征的多肽来起始，也可以同时用多表位/抗原来起始。

因此，同样地属于本发明保护范围的是，一种优选的实施方式是编码至少一个恒定链的核酸构建体，该恒定链在操作上被连接至多种抗原性蛋白或者肽或者蛋白或肽的片段，例如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、十个、十二个或更多的抗原性蛋白或者肽或者蛋白或肽的片段。核酸构建体可包含额外的元件。这些包括但不限于：内部核糖体进入位点(IRES)，编码关于抗原呈递蛋白诸如LAMP、钙网蛋白和Hsp70的基因，编码与细胞内扩展相关蛋白诸如VP22、HIV Tat、Cx43或者其他接合素以及细胞间间隙连接的基因，编码天然杀伤细胞(NK细胞)活化分子诸如H60和细胞因子、鸡卵白蛋白、或者任意T辅助性细胞表位的基因。

在一种优选的本发明实施方案中，核酸构建体包含至少一个编码关于抗原呈递的蛋白如LAMP、LIMP、钙网蛋白或Hsp70的基因。

在另外一种优选的本发明实施方案中，核酸构建体包含至少一个编码关于细胞内扩展的蛋白如VP22、Cx43、HIV Tat、其他接合素或细胞间间隙连接成分的基因。

启动子

这里所用的术语启动子是指一组转录控制组件，其被簇集在RNA聚合酶II的起始位点周围。考虑比较多的是启动子如何被组织的，这源自分析几种病毒启动子，包括用于HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期转录单元的那些。这些研究，最近的工作予以扩大，已证明启动子是由离散功能组件所组成，每个由大约7-20bp DNA组成，并且包含一个或多个转录激活蛋白识别位点。每个启动子功能中的至少一种模式是定位RNA合成的起始位点。最熟知的这种实例是TATA盒，但是在一些启动子中缺少TATA盒，诸如用于哺乳动物末端脱氧核苷酰转移酶基因的启动子和用于SV40晚期基因的启动子，覆盖起始位点的离散元件本身有助于固定起始的位置。

另外的启动子元件调节转录起始的频率。一般地，这些位于起始位点上游的30-110bp区，即使大量的启动子最近已被证明还包含起始位点下游的功能元件。元件间的间距是弹性的，这样，当元件被逆向或相对另一个而被移动时，启动子功能被保留。在tk启动子中，元件间的间距在活性开始下降前可被增加至50bp间隔。依赖于启动子，各个元件可能合作性地或者独立性地发挥功能从而激活转录。在本发明中，可使用能够指示核酸构建体所编码序列转录起始的任意启动子。

一方面，本发明包含核酸构建体，其中一个在操作上被连接的恒定链和抗原性蛋白或者肽的编码序列之前有能够表达该构建体的启动子。

另一方面，启动子选自这样的组：组成型启动子、诱导型启动子、生物体特异性启动子、组织特异性启动子以及细胞类型特异性启动子。

启动子的实例包括，但不限于：组成型启动子诸如：猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳房肿瘤病毒启动子、人免疫缺陷病毒长末端重复启动子、莫洛尼病毒启动子、禽白血病病毒启动子、爱波斯坦-巴尔病毒即时早期启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子、人肌动蛋白启动子、人肌球蛋白启动子、人血红蛋白启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子和人肌肉肌酸启动子，诱导型启动子诸如：金属硫蛋白启动子、糖皮质类启动子、孕酮启动子以及四环素启动子(tet-on或者tet-off)，组织特异性启动子诸如：HER-2启动子和PSA相关启动子以及双向启动子，即能够以启动子的每个方向起始转录。

使用诱导型启动子的优点包括提供“休眠的”疫苗，根据需要而被激活。这是有用的，如果优选地仅在体内局部地诱导接种，相对于系统性地诱导(例如，在涉及癌症的情况下)，或者在接种时该疫苗对接受者的健康是有害的。

在一种优选的实施方案中，核酸构建体包含选自下面组的启动子：CMV启动子、SV40启动子和RSV启动子。

传输媒介物

一方面，本发明包含如上所述的核酸构建体，其被包含在传输媒介物内。传输媒介物是一种实体，藉此核苷酸序列或多肽或两者可被从至少一种介质转运至另一种。传输媒介物通常是用于核酸构建体内编码序列的表达和/或用于在这里构建体或所编码多肽的细胞内传输。属于本发明范围内的是，传输媒介物是选自下列组的媒介物：基于RNA的媒介物、基于DNA的媒介物/载体、基于脂质的媒介物、基于病毒的媒介物以及基于细胞的媒介物。这种传输媒介物的实例包括，但不限于：可生物降解的聚合物微球、基于脂质的制剂诸如脂质体载运体、将构建体包被到胶体金粒子上、脂多糖、多肽、多糖以及病毒媒介物的聚乙二醇化。

一种优选的本发明实施方案涉及用机械或电学技术传输以裸DNA形式的核酸构建体。特别是，将核酸构建体包被到金粒子上是有利的实施方式。应用粒子轰击设备如基因枪，用弹道转移而实现将核酸构建体传输至金粒子。

一种更优选的本发明实施方案包括作为传输媒介物的病毒，所述病毒选自下列非穷尽的组：腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、泡沫状病毒、巨细胞病毒、西门利克森林病毒、痘病毒、RNA病毒载体以及DNA病毒载体。这种病毒载体是本领域中熟知的。

病毒载体常常是由两个组份构成，修饰病毒基因组和环绕它的外壳结构，尽管有时病毒载体是以裸形式被引入或者用蛋白而非病毒蛋白包被的。最新的载体具有类似于野生型病毒的外壳(coat)结构。这种结构包装和保护了病毒核酸并且提供了结合和进入靶细胞的手段。

优选地，病毒载体是从野生型病毒基因组被修饰为使病毒在靶细胞中不能生长，同时使病毒能在宿主细胞(例如，诸如包装或辅助性细胞)中生长，用于制备感染性粒子。载体核酸通常是基本顺式作用的、用于复制的病毒序列，而且包装于辅助性细胞系中，和表达控制序列，用于调节将多聚核苷酸的表达传输至靶细胞。其他病毒功能是以反式在特定包装或辅助性细胞系中表达的，如本领域中已知的。

腺病毒

在一种更优选的实施方案中，包含如这里所述核酸构建体的载体是腺病毒。腺病毒基因组的组成为线性双链DNA分子，大约36kb，其携带着完成病毒复制周期所需的超过约三十个基因。早期的基因被分成4个区(E1至E4)，这些区是病毒复制必需的，除了E3区，它被认为用于调节抗病毒宿主免疫应答。E1区(E1A和E1B)编码负责调节病毒基因组转录的蛋白。E2区基因(E2A和E2B)的表达导致病毒复制所需的多肽合成。由E3区编码的蛋白防止细胞毒性T细胞和肿瘤坏死因子造成的细胞溶解。由E4区编码的蛋白参与DNA复制、晚期基因表达和剪接以及宿主细胞关闭。晚期基因通常编码有助于病毒壳体的结构蛋白。此外，腺病毒基因组携带DNA所必需的顺式作用5’和3’ITR(反向末端重复)和包装序列。ITR容纳DNA复制的起源，同时壳体化区是将腺病毒DNA包装为感染性粒子所需要的(参见实例US 2004/0157307)。

在最优选的本发明实施方案中，包含如这里所述核酸构建体的载体是复制缺陷腺病毒或者有条件的复制缺陷腺病毒。腺病毒载体可以是遗传工程化为有条件的复制性(CRAd载体)，以便在特定细胞(例如，诸如增殖细胞)中选择性复制。在另一方面，腺病毒载体是缺失E1功能的复制(例如，以全部的或部分的缺失或者E1的诱变)。载体的腺病毒骨架可包含另外的修饰(在一个或多个病毒基因中缺失，插入或突变)。一个E2修饰的实例是以位于DBP(DNA结合蛋白)编码基因上的热敏突变来说明。腺病毒序列还可以是缺失全部或部分E4区的。在非必要E3区内的另外缺失可使被传输多肽的大小增加。但是，保留编码多肽(例如，诸如gp19k)的全部或部分E3序列是有利的，使得病毒逃脱免疫系统或炎性反应。同样地也可以使用保留ITR和包装序列而且包含基本上遗传的修饰以中止病毒抗原的残基合成的第二代载体，目的是改善被表达基因在转导细胞中长期表达。被引入细胞的核酸构建体可以被插入病毒基因组的任意位置中，除了顺式作用的序列(参见示例US 2004/0157307)。

腺病毒可以是衍生自任何人类或动物来源，特别是犬、禽类、牛、鼠类、羊、猫、猪或猿猴的来源，或者可以是杂合病毒。可利用任何的血清型。但是，人腺病毒是优选的，而且这种病毒是可以获得的，例如，从ATCC(美国典型培养物保藏中心)。

一种优选的本发明实施方案包含腺病毒，诸如：羊病毒、犬病毒II型、修饰的安卡拉牛痘(MVA)或MVA-BN。

腺病毒粒子或空白腺病毒壳体还可用于通过病毒介导的共内化过程转移核酸构建体或基于核酸的传输载体。这个过程可在阳离子试剂如聚碳烯或包含一个或多个脂质层的脂质泡存在下实现。

根据本领域中常规的技术，应用互补细胞系或辅助性病毒，它反式地供应病毒复制所需的丢失病毒基因，可制备并繁殖腺病毒粒子。腺病毒粒子可从培养物上清液回收，同样地也可从裂解后的细胞，并且任选地根据标准技术(例如，色谱法和超离心法)进一步纯化。

细胞类型特异性靶向可以用衍生自具有广泛宿主范围的腺病毒、通过修饰病毒表面蛋白而取得。例如，腺病毒感染的特异性是由粘附至存在于易感细胞表面上细胞受体而确定的。在这点上，存在于腺病毒壳体表面上的纤维和五邻体在细胞粘附中发挥了关键作用。因此，腺病毒的细胞靶向可用编码纤维和/或五邻体的病毒基因遗传修饰而实现，从而产生能与独特的细胞表面受体特异性相互作用的修饰纤维和/或五邻体。

一方面，本发明涉及一种腺病毒载体，其包含编码至少一个抗原和刺激MHC-I应答的、至少一个蛋白或者肽或者蛋白或肽的片段的核苷酸构建体。

另一方面，本发明涉及腺病毒载体，其中核苷酸构建体编码至少一个刺激MHC-II应答的蛋白或者肽或者蛋白或肽的片段。

优选地，腺病毒载体包含序列，其中至少一个抗原在操作上被连接至至少一个刺激MHC应答的蛋白或者肽或者刺激MHC应答的蛋白或肽的片段。刺激MHC应答的蛋白或者肽或者蛋白或肽的片段优选地是MHC相关的蛋白或者肽。这种MHC相关肽可以是但不限于选自下列的组：ER定位肽、高尔基体定位肽、载有内体肽的室定位肽、溶酶体、MIIC、CIIV、黑色素体、分泌颗粒、伯贝克颗粒。

更优选地，腺病毒载体包含载有内体肽的室定位肽。这种载有内体肽的室定位肽可以是，但不限于，选自下面的组：分选信号肽、LAMP、LIMP和恒定链。

最优选地，腺病毒载体包含至少一个刺激MHC应答的蛋白或者肽或者蛋白或肽的片段，而且所述刺激MHC应答的蛋白或者肽或者蛋白或肽的片段是恒定链。

此外，腺病毒载体可包含协助扩展病毒或者其中所包含构建体的蛋白。这种蛋白包括接合素、间隙连接相关蛋白以及形成小孔的蛋白。一种本发明的实施方案包含编码或者以其他方式含有任意一个或多个与细胞间传播相关的下列蛋白的腺病毒载体：VP22、Cx43和HIV Tat。

重组细胞

一方面，本发明涉及包含如所定义核酸构建体的细胞。这种重组细胞可以用作体外研究的工具，作为核酸构建体的传输媒介物或者作为部分的基因治疗方案。根据本发明，核酸构建体和基于核酸的载体可用本领域中熟知的技术引入细胞，包括将DNA显微注射入细胞核、转染、电穿孔、脂转染/脂质体融合以及粒子轰击。适合的细胞包括自体的和非自体的细胞，并且可包括异种的细胞。

在一种优选的实施方案中，本发明的核酸构建体是包括在抗原呈递细胞(APC)内。任何在其表面上呈递抗原、与MHC分子相关的细胞都被认为是抗原呈递细胞。这种细胞包括但不限于巨噬细胞、树突细胞、B细胞、杂种APC以及养育的APC。制造杂种APC的方法是本领域中熟知的。

在更优选的实施方案中，APC是专职抗原呈递细胞，而且最优选地，APC是MHC-I和/或MHC-II表达细胞。

根据上面任意一种，APC可以是从患者获得的干细胞。在引入本发明的核酸构建体后，可将干细胞重新引入患者，目的是治疗患有医学疾患的患者。优选地，从患者中分离出的细胞是一种能够分化为抗原呈递细胞的干细胞。

此外，属于本发明范围内的是，包含本发明核酸构建体的抗原呈递细胞不表达任何的共刺激性信号，而且抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段是自体抗原。

嵌合蛋白和抗体

本发明的一个目的是提供由如上所述核酸构建体编码的嵌合蛋白，其包含至少一个在操作上被连接的恒定链以及至少一个抗原性蛋白或者肽或者所述抗原性蛋白或肽的片段。嵌合蛋白被理解为遗传工程化蛋白，它是由两个或以上完整的或者部分的基因剪接在一起或一连串(非)随机核酸所制造的核苷酸序列编码的。

一方面，本发明涉及一种抗体，它能识别如上文所定义的嵌合蛋白。术语抗体应当被理解为免疫球蛋白分子以及免疫球蛋白分子的活性部分。抗体是例如完整的免疫球蛋白分子或其保留免疫学活性的片段。这种抗体可被用于动物的被动免疫，或者用于检测抗体所结合蛋白的检验中的应用。

疫苗组合物

一方面，本发明涉及一种疫苗，其包含编码以下的核酸序列：至少一个在操作上被连接至至少一个抗原性蛋白或者肽或者所述抗原性蛋白或肽的片段的恒定链。因此，所述的疫苗包含如上述任一个中所定义的核酸构建体。此外，所述的疫苗可被用作药品。

根据本发明，疫苗组合物可根据已知的方法诸如将一种或多种的药学上可接受的载运体(又被称作赋形剂或稳定剂)与活性剂相混合而配制。这些赋形剂可以是对任意个体/动物，优选地对脊椎动物和更优选地对人给药可接受的，因为它们以所用的剂量和浓度暴露于细胞或个体而言是无毒性的。生理学上可接受的载运体常常是pH缓冲水溶液。这种赋形剂、载运体以及配制方法的实例可在例如雷明顿氏制药学(Maack出版公司，伊斯顿市，宾夕法尼亚州)中找到。生理学上可接受的载运体实例包括但不限于：缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐、以及其他的有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质诸如血清白蛋白、明胶、或者免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖，双糖，以及其他的碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或者糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；成盐的抗衡离子，诸如钠离子；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN^TM，聚乙二醇(PEG)和PLURONICS^TM。

为了将药学上可接受的组合物配制成适于有效给药的，根据本发明，这种组合物包含有效量的核酸构建体，该核酸构建体被包含在如这里所述的传输媒介物内或者这种组合物包含有效量的在核酸构建体内编码的嵌合蛋白。时常，如果用如本发明核酸构建体编码的蛋白或多肽接种，载运体就被用作支架偶联上该蛋白或肽，因此有助于诱导免疫应答。载运体蛋白可以是任何常规的载运体，包括任何适于呈递免疫原性决定子的蛋白质。适合的载运体一般是大的、缓慢代谢的大分子，例如，蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集物(诸如油滴或脂质体)，以及失活的病毒粒子。这种载运体对于本领域的普通技术人员而言是熟知的。此外，这些载运体可发挥如免疫刺激剂(“佐剂”)的功能。用佐剂和/或制药的载运体可完成动物的免疫。常规的载运体蛋白包括，但不限于，钥孔虫戚血蓝蛋白，血清蛋白诸如转移蛋白，牛血清白蛋白，或人血清白蛋白，卵白蛋白，免疫球蛋白，或者激素，诸如胰岛素。载体可以与佐剂一起存在或者在这里各自独立地存在。

在下文中，疫苗组合物是指包括在预防性和治疗性用途(包括在患者中刺激免疫应答)方面有用的组合物。本发明进一步地考虑到，本发明的疫苗组合物不会诱导任何系统的或局部的毒性反应或者任何其他的副作用。

在一种优选的实施方案中，疫苗的核酸构建体是被包装的。包装核酸构建体的手段包括选自但不限于下面组的手段：基于RNA或基于DNA的载体、基于脂质的载运体、病毒表达载体、病毒传输载体、基于细胞的媒介物、胶体金粒子的包层(coating)、可生物降解的聚合物微球。因此，可以使用任意的上述传输手段，用于疫苗组合物用途的包装目的。

在一种更优选的实施方案中，用于疫苗的核酸构建体包装手段是病毒表达载体，其选自但不限于下面的组：腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺相关的病毒、疱疹病毒、牛痘病毒以及DNA病毒载体。

在一种更加优选的实施方案中，疫苗的核酸构建体被包装至腺病毒载体中。在最优选的实施方案中，如在上面所描述的任何疫苗中的核酸构建体被包装在复制缺陷或者有条件的复制缺陷腺病毒载体中。腺病毒载体在上面进行了详细地描述。

一方面，本发明涉及一种包含至少两个载体的疫苗。这包括了，任意一个或两个不同的如所述的核酸构建体可被包装至至少两个载体中，这些载体属于在上面任意部分中所描述的类型。此外，本发明涉及一种包含三个、四个、五个或六个载体的疫苗。同样地，这些载体可彼此相区别或者没有区别，并且可载运如上所述的、相同的或不同的核酸构建体。另一方面，本发明涉及一种包含至少一个嵌合蛋白(如由这里所述任意核酸构建体所编码的)的疫苗。当嵌合蛋白或多肽将被用作免疫原时，它可用上述任意一个或多个DNA构建体在重组细胞中表达而生产，或者它可用本领域中已知方法化学合成而制备。如上所述，这种嵌合蛋白和/或肽可以被偶联至载运体，从而提高对该蛋白/肽的免疫学应答，并且可以带有或者没有佐剂和/或赋形剂而被施用。

佐剂

在疫苗组合物中可包括佐剂，以增强特异性免疫应答。因此，鉴别佐剂是特别重要的，当它与抗原/核酸构建体和/或传输媒介物如腺病毒媒介物(任何可同样被称作免疫原性决定子的)相组合，得到能够诱导强特异性免疫学应答的组合物时。免疫原性决定子还可在进行免疫前与两个以上不同的佐剂相混合。疫苗组合物在本文中还被称作免疫原性组合物。

大量的佐剂已被描述，而且在实验室动物诸如小鼠、大鼠和家兔中用于抗体的产生。在这种设定中，副作用的耐受性相当高，主要的目的是获得强的抗体应答。为了使用和为了在药物中使用的批准，特别是为了用于人，要求疫苗组合物的组份，包括佐剂，进行很好地表征。进一步的要求是，组合物具有最小风险的任何副反应如肉芽瘤、脓疮或发热。

本发明的一种实施方案涉及一种包含佐剂的疫苗。在一种优选的实施方案中，疫苗组合物是适于对哺乳动物施用，而且最优选地对人使用。因此优选的佐剂是适于对哺乳动物施用，而且最优选地是适于对人受治疗者的施用。

进一步地，佐剂的选取是根据其刺激所需免疫应答类型、B细胞或/和T细胞活化的能力而选择的，并且疫苗组合物可被配制成制剂，以便优化分布以及对相关淋巴组织的呈递。

与本发明有关的佐剂可根据它们的起源而分组，是矿物的、细菌的、植物、合成的或者宿主产物。在这种分类下的第一组是矿物佐剂，例如铝化合物。为了增加在动物和人中的免疫应答，已广泛地使用了用铝盐沉淀的抗原或者相混合的抗原或者被吸收至成形铝化合物的抗原。在进行免疫后七天，已在家兔的区域性淋巴结中证实了铝粒子，在它们自己的淋巴结内将抗原引导到包含T细胞的区域可能是另一个重要的功能。佐剂的效力已证明与引流淋巴结的提示相关。尽管许多研究已确定与铝盐一起施用的抗原导致人免疫性的提高，细胞介导的免疫性可能只是稍稍地提高，如用延迟型超敏性所测量的。同样地，氢氧化铝已被描述为活化互补的途径。这种机理可在局部炎性应答以及免疫球蛋白的产生和B细胞记忆中起到作用。此外，氢氧化铝可保护抗原免受快速的异化代谢作用。主要地由于它们的优秀安全性记录，目前铝化合物是在人类中使用的唯一佐剂。

另一个大组的佐剂是细菌起源的那些。可以纯化和合成具有细菌起源的佐剂(例如，胞壁酰二肽，脂质A)，而且宿主介质已被克隆(白介素1和2)。在化学纯化几种细菌起源活性组份的佐剂方面，最近十年已带来显著的进步：百日咳杆菌、结核分枝杆菌、脂多糖、弗氏完全佐剂(FCA)和弗氏不完全佐剂(Difco Laboratories，底特律，密西根州)以及默克佐剂65(默克公司，罗维市，新泽西州)。根据本发明，其他适合的佐剂是，例如，Titermax经典佐剂(SIGMA-ALDRICH)，ISCOMS，Quil A，ALUN，参见US 58767和5,554,372，脂质A衍生物，霍乱毒素衍生物，HSP衍生物，LPS衍生物，合成肽基质，GMDP，以及其他和免疫刺激剂的组合(US5,876,735)。在本发明上下文中，百日咳杆菌作为佐剂是让人感兴趣的，由于它通过作用于T淋巴细胞种群而调节细胞介导免疫性的能力。关于脂多糖和弗氏完全佐剂，辅助活性部分已被鉴别和合成，这样允许研究结构-功能关系。根据本发明，这些也被考虑包括在免疫原性组合物中。

脂多糖及其各种衍生物，包括脂质A，已被发现在与脂质体或其他脂质乳剂组合中是强力的佐剂。尚未肯定是否可以生产出通常在人中使用而具有非常低毒性的衍生物。弗氏完全佐剂在多数实验研究中是标准。

为了保护抗原免受快速异化代谢作用，可将矿物油添加至免疫原性组合物。

根据本发明，许多其他类型的材料可被用作免疫原性组合物中的佐剂。它们包括植物产品如皂素，动物产品如甲壳素以及众多的合成化学品。

根据本发明，佐剂还可根据它们的作用机理而分类。这种类型的分类势必存在武断，因为大多数的佐剂可能通过超出一种的机理发挥作用。佐剂可通过抗原的定位和传输而起作用，或者通过直接作用于组成免疫系统的细胞，诸如巨噬细胞和淋巴细胞。根据本发明，佐剂增强免疫应答的另一种机理是通过创造抗原储库。这可能有助于铝化合物、油乳剂、脂质体以及合成聚合物的佐剂活性。脂多糖和胞壁酰二肽的佐剂活性可能主要是通过活化巨噬细胞而介导的，然而百日咳杆菌作用于巨噬细胞和淋巴细胞。根据本发明，当掺入免疫原性组合物时可能有用的进一步佐剂实例被描述于US 5,554,372。

因此，根据本发明，在预防性和治疗性疫苗中都有用的佐剂可以是矿物质盐，诸如氢氧化铝和磷酸铝或钙的凝胶，油乳剂和基于表面活性剂的制剂如MF59(微流体洗涤剂稳定化的水包油乳液)，QS21(纯化皂素)，AS02(SBAS2，水包油乳液+单林酰脂质A(MPL)+QS21)，Montanide ISA51和ISA-720(急定化油包水乳剂)，佐剂65(包含花生油，二缩甘露醇单油酸酯和单硬脂酸铝)，RIBI ImmunoChem Research Inc.，汉密尔顿市，犹他州)，微粒子佐剂，诸如病毒颗粒(掺入流感血凝素的单层脂质体媒介物(cehicles))，AS04(具有MPL的Al盐)，ISCOMS(皂素和脂质(例如胆固醇)的结构化复合物)，聚丙交酯共-乙交酯(PLG)，微生物衍生物(天然的以及合成的)诸如单磷酰脂质A(MPL)，Detox(MPL+草分歧杆菌(M.Phlei)细胞壁骨架)，AGP(RC-529(合成的酰化单糖))，DC_胆固醇(能够自身组织成脂质体的类脂免疫刺激剂)，OM-174(脂质A衍生物)，CpG基序(包含免疫刺激性CpG基序的合成寡核苷酸)，具有非毒性佐剂作用的修饰细菌毒素，LT和CT，内源性人免疫调节剂，例如hGM-CSF或hIL-12或Immudaptin(C3d串联阵列)，惰性媒介物诸如金粒子。

佐剂的其他实例包括：免疫刺激性油乳剂(例如，油包水，水包油，水包油包水，诸如实例弗氏不完全佐剂如Montainde，Specol，矿物盐例如Al(OH)₃，AlPO₄，微生物产物，皂素诸如Qual A，合成的产品，以及辅助性制剂，和免疫刺激性复合物(ISCOM)和细胞因子，热灭活细菌/组份，纳米珠，LPS，LTA。在WO 03089471，第6-8页公开了其他常用佐剂的目录，特此引入该目录作为参考)。

根据本发明，免疫原性组合物还可以含有稀释剂诸如缓冲液，抗氧化剂如抗坏血酸，低分子量(少于约10个残基)多肽，蛋白质，氨基酸，碳水化合物包括葡萄糖、蔗糖或糊精，螯合剂如EDTA，谷胱甘肽以及其他的稳定剂和赋形剂。中性缓冲盐水或者与非特异性血清白蛋白混合的盐水是示例性适宜的稀释剂。

在免疫原性组合物中通常包括佐剂，其用量根据制造商的使用说明。

给药

根据本发明，疫苗组合物可以治疗上有效量对个体施用。所述有效量可以根据各种因素例如个体的疾患、体重、性别和年龄而改变。其他的因素包括给药的模式。

本发明可以各种途径例如皮下的、局部的、口服的和肌内的来对个体提供药物的或兽用的组合物。药物组合物的给药是以口服或非胃肠而实现的。非胃肠递送的方法包括局部的、动脉内的(直接地进入组织)、肌内的、皮下的、髓内的、鞘内的、心室内的、静脉内的、腹膜内的或鼻内的给药。本发明还包括这样的目的，提供适于局部的、口服的、系统的和非胃肠的药物制剂，用于以疫苗组合物的预防和治疗方法中的应用。

例如，疫苗组合物可以如下的口服剂型：片剂、胶囊剂(每个都包括计时释放和持续释放的制剂)、丸剂、粉末剂、颗粒剂、酏剂、酊剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和乳剂，或者用注射而施用。同样地，它们还可以静脉内(推注和输注)、腹膜内、皮下、带有或没有闭合的局部、或者肌内形式而施用，所有的应用形式对于本领域普通技术人员而言是熟知的。包括这里所述的任意化合物的有效而无毒性量的疫苗可用作预防性或治疗性药剂。同样地，本发明包括本领域已知的、适于将可注射免疫原性肽配制成组合物的、任意的和所有的常规剂型，例如冻干形式和溶液剂，混悬液或者乳剂形式，根据需要，它们含有常规的药学上可接受的载运体、稀释剂、防腐剂、佐剂、缓冲剂组份，等。

根据本发明，优选的疫苗组合物给药模式包括，但不限于系统性给药，诸如静脉内或皮下给药、皮内给药、肌内给药、鼻内给药、口服给药、直肠给药、阴道给药、肺部给药以及任何通用形式的粘膜给药。此外，用于本发明中这里所提到的任意给药形式的手段在本发明的范围内。

根据本发明，疫苗可被施用一次，或者任意数目的次数如两次、三次、四次或五次。施用疫苗超过一次具有加强所得免疫应答的作用。凭借以不同于先前给药的形式或身体部位的施用可进一步地加强疫苗。追加注射是同源性或异源性的追加注射。同源性追加注射是指，初次和后续的接种包含了相同的构建体以及更明确地相同的传输媒介物尤其是相同的病毒载体。异源性追加注射是指，相同的构建体被包含在不同的病毒载体中。当利用腺病毒传输时，这是特别感兴趣的，因为如果之前已被暴露过，那么人体提高抗指定腺病毒的免疫应答。因此，一种优选的本发明实施方案涉及腺病毒载体聚乙二醇化，提供了用相同的(同源性的)腺病毒载体加强的选择。一种替代的和优选的实施方案涉及用包含相同构建体的不同腺病毒载体持续地加强疫苗。

根据本发明，一种优选的疫苗给药形式对身体表面、内部或者外部，最可能地是对已知感染的接受部位施用疫苗。所述感染接受部位是接受感染的身体表面，例如就流感而言，感染接受部位是肺部。

本发明的疫苗可以被施用至可能对其有益的任何生物体，特别是诸如脊椎动物的任一动物。属于本发明范围内的是，疫苗给药的手段和模式是适于接受者的。一种优选的疫苗接受者是哺乳动物，而且在本发明更优选的实施方案中该哺乳动物选自下面的组：牛、猪、马、绵羊、山羊、美洲鸵、小鼠、大鼠、犬、猫和人。在最优选的实施方案中该哺乳动物是人。

一种本发明优选的实施方案包括进一步包含第二种活性成分的疫苗组合物。所述第二活性成分选自，但不限于下面的组：抗生素、化疗药、抗过敏药、细胞因子、补体因子以及免疫系统的共刺激性分子。

本发明另一种实施方案包括一种成套试剂盒(kit in parts)，其中所述试剂盒包括至少一种根据上面的疫苗组合物，用于施用所述疫苗的手段，以及关于如何使用的说明书。相同疫苗或几种不同疫苗的多剂量包括在本发明范围内。在优选的实施方案中，成套试剂盒进一步地包括第二活性成分。

本发明进一步地包含一种在动物中诱导免疫应答的方法，包括对动物施用根据上面任意一种的疫苗。所述免疫应答是，但不限于任一下列类型的应答：MHC-I依赖型应答、MHC-I和/或MHC-II依赖型应答、T细胞依赖型应答、CD4T细胞依赖型应答、CD4⁺T细胞独立型应答、CD8⁺T细胞依赖型应答以及B细胞依赖型免疫应答。落入本发明范围内的另一种方法是这样的方法，提供了至少一种根据上面任一的疫苗，和对受治疗者施用所述至少一种疫苗至少一次，用于动物的治疗和预防。本发明还包括根据这里所述的核酸构建体用于制备组合物以生产疫苗。所述疫苗可用于但不限于动物的基因免疫接种，或者用于治疗所需患者的临床疾患。

附图的详细描述

图1：在腺病毒载体中插入的示意图。A)Ad-GP表达盒示意图，B)Ad-IiGP表达盒示意图。还表达各种LCMU GP表位的情况。Ad-GP：腺病毒-糖蛋白，CMV：巨细胞病毒启动子，Ii：恒定链，LCMV GP1-498：源自淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒的糖蛋白，终止(STOP)：终止密码子，聚A：SV40聚腺苷化信号。

图2：CD8⁺和CD4⁺T细胞对编码表位腺病毒的应答。用2×10⁷感染单位(IFU)的Ad-GP或Ad-IiGP在右后足底部对C57BL/6小鼠进行接种。在接种后所示的天数上，用细胞内染色脾细胞的肽诱导IFN-γ而测定表位特异性CD8⁺或CD4⁺T细胞的数目。竖条表示3-5只动物的平均值(Avg)±标准偏差(SD)。

图3：在F₁杂种小鼠中CD8⁺和CD4⁺T细胞对编码表位腺病毒的应答。用2×10⁷IFU的Ad-GP或Ad-IiGP在右后足底部对C57BL/6×BALB/c(H-2^bxd)F₁小鼠进行接种。在接种后21天，用细胞内染色脾细胞的肽诱导IFN-γ而测定表位特异性CD8⁺或CD4⁺T细胞的数目。竖条表示4-5只动物的平均值±SD。

图4：Ad-IiGP发挥独立于CD4⁺T细胞的CD8⁺T细胞刺激性作用。用2×10⁷IFU的Ad-GP或Ad-IiGP在右后足底部对MHC-II^-/-或C57BL/6小鼠进行接种。在接种后21或90天，用细胞内染色脾细胞的肽诱导IFN-γ而测定表位特异性CD8⁺或CD4⁺T细胞的数目。竖条表示4只动物的平均值±SD。

图5：Ad-IiGP赋予了快速和上佳的保护，防止致命性LCMV感染。用2×10⁷IFU的Ad-GP或Ad-IiGP在右后足底部对C57BL/6小鼠进行接种。在接种后所示的天数上，用20pfu(空斑形成单位)LCMV Arm 53b大脑内(脑内)攻击动物。记录共14天的死亡率。每一个组由5至18只动物组成。ND是指没有数据。

图6：Ad-IiGP有效地防止了高剂量、静脉内LCMV感染。用2×10⁷IFU的Ad-GP或Ad-IiGP在右后足底部对C57BL/6小鼠进行接种。在接种后21天，用1×10⁶pfu(空斑形成单位)LCMVArm克隆13静脉注射(静脉内)攻击动物。测定病毒攻击器官后8天的病毒滴度。点代表各个动物。虚线代表检验的检测限度。

图7：Ad-IiGP赋予对在免疫优势表位中具有突变的、致命性LCMV变体的上佳保护。用2×10⁷IFU的Ad-GP、Ad-IiGP或假处理剂感染右后足底部而对C57BL/6小鼠进行接种。在接种后90天，用20pfu LCMV Arm53b(在gp33、gp276或者两者的表位中携带突变)大脑内攻击动物。记录共14天的死亡率。对于gp33近等基因系和gp276近等基因系，每一组由5只动物组成，对于pg33/gp276双近等基因系，该组是10只动物。

图8：在Ad-IiGP接种，而且用在免疫优势表位中具有突变的LCMV变体攻击后，CD8⁺或CD4⁺T细胞对特异性LCMV表位的反应频率。对于从图7中所描述实验中存活的动物进行分析，用细胞内染色脾细胞的肽诱导IFN-γ而分析表位特异性CD8⁺或CD4⁺T细胞。竖条表示3-5只动物的平均值±SD。

图9：CD8⁺和CD4⁺T细胞对用裸DNA-IiGP和DNA-GP接种的应答。用被包被在1.6nm金粒子上的DNA、浓度为2μg DNA/mg金接种C57BL/6小鼠，而且DNA-金复合物被包被到塑料管上，这样每次注射对小鼠递送0.5mg金(每次注射1μg DNA)。在腹部皮肤处，对小鼠进行免疫，应用手持基因枪设备，利用压缩氦气(400psi)作为粒子的动力。以1星期的间隔对小鼠接种四次，然后在开始研究前使其休息1星期。用细胞内染色脾细胞的肽诱导IFN-γ而测定表位特异性CD8⁺或CD4⁺T细胞的数目。竖条表示4-5只动物的平均值±SD。

图10：用Ad-Ii-GP预防性的接种增加了肿瘤的排斥性。在右后足底部用2×10⁷IFU的编码全长LCMV糖蛋白的腺病毒(Ad-GP)或者编码连接至恒定链的糖蛋白(Ad-Ii-GP)的腺病毒对C57BL/6小鼠进行接种。用编码全长β-半乳糖苷酶的腺病毒或者活的LCMV(10³PFU的LCMVArmstrong 53b)感染对照。约3个月后，攻击所有的动物，用皮下注射10⁶表达衍生GP33表位的LCMV的B16.F10黑素瘤细胞。初期，在所有的动物中都形成了肿瘤，但是多数Ad-Ii-GP和LCMV免疫小鼠最终排斥肿瘤。每个组由7-10只动物组成。

图11：用Ad-Ii-GP的治疗性接种增加了携带肿瘤小鼠的平均寿命。攻击C57BL/6小鼠，用皮下注射10⁶表达衍生GP33表位的LCMV的B16.F10黑素瘤细胞。当在所有小鼠中可触及肿瘤(肿瘤注射后5天)时，在右后足底部用2×10⁷IFU编码全长LCMV糖蛋白的腺病毒(Ad-GP)或者编码连接至恒定链的全长LCMV糖蛋白的腺病毒(Ad-Ii-GP)对动物进行接种；用编码全长β-半乳糖苷酶的腺病毒或者活的LCMV(10³PFU的LCMVArmstrong 53b)接种对照。当肿瘤超出12mm长度或者观察到溃疡时处死小鼠。图中心的加粗的数目表示经肿瘤攻击后死亡的平均天数。每个组由7-10只动物组成。

图12：经过用Ad-Ii-VSVGP或Ad-VSVGP接种后的存活率。在右后足底部用2×10⁷IFU的编码全长水泡性口炎病毒糖蛋白的腺病毒(Ad-VSVGP)或者编码连接至恒定链的全长水泡性口炎病毒糖蛋白的腺病毒(Ad-Ii-VSVGP)对C57BL/6小鼠进行接种。(A)在所示的天数，收集血清样品，然后用空斑减少数检验法测定体外中和抗体的滴度，圆点代表各只动物。(B)在所示的天数，用10⁵PFU的VSV鼻内攻击已接种的小鼠，并且登记超过随后14天的死亡率。存活的对照(未接种的)小鼠已包括，用于对比。每个组由5-10只动物组成。

图13：CD8⁺和CD4⁺T细胞对更多编码表位腺病毒的应答。在右后足底部用2×10⁷IFU所示构建体接种C57BL/6小鼠(流感和OVA)或者B6D2F₁小鼠(MHV-68M2和M3)。在所示的天数，用细胞内染色脾细胞的肽诱导IFN-γ而测定表位特异性CD8⁺或CD4⁺T细胞的数目。Iso是确定背景的同型对照组。竖条表示4-5只动物的平均值±SD。

图14：用CD8⁺T细胞对编码表位腺病毒的应答测量Ad-Ii-GP构建体对比于Ad-GP-Lamp-1构建体的有效性。在右后足底部用2×10⁷IFU的所示构建体接种C57BL/6小鼠。在第21天，用细胞内染色脾细胞的肽诱导IFN-γ而测定表位特异性CD8+细胞的数目。竖条表示3只动物的平均值±SD。

图15：基于框架内多聚接头的载体。用AsiSl、Swal、Ascl、Pmel、Fsel以及终止位点包括在3’引物的序列PCR扩增没有终止密码子的Ii，并且克隆至pacCMV载体。得到的载体被编号为770(参见在SEQ ID NO：7中于此的部分序列)。还构建了称为768(参见在SEQ ID NO：8中于此的部分序列)没有掺入Ii序列的对应载体。

图16：带有IRES2位点的载体。用PCR和限制性酶切将IRES2从pLP-IRES2-EGFP克隆至770载体，构建了称为“pacCMV Ii MCS IRES2”(并且编号为1163，参见在SEQ ID NO：9中于此的部分序列)的载体。I-sceI和SrfI的序列被包括在3’引物中。在IRES序列后面的首个ATG位点启动了第二个蛋白的表达。还构建了称为“pacCMV MCS IRES2”且编号为1165(参见在SEQ ID NO：10中于此的部分序列)没有掺入Ii序列的对应载体。

实施例

本发明将参照下面的实施例予以进一步的说明。应当认识到，下列的只是实例的方式，并且可以作详细地改进，但是仍然落入本发明的范围内。

实施例1

CD8⁺和CD4⁺T细胞对编码表位腺病毒的应答。

小鼠：C57BL/6(H-2b)，C57BL/6xBALB/c(H-2bxd)F1杂种和MHCII-/-小鼠(B6.129-H2-Ab1^tmlG1mN12(H-2b))是获得自Taconic M&B(Ry，丹麦)。所用小鼠都是7-10周龄的，并且饲养在特定的无菌设施里。所有的实验操作都是根据当地的实验指南而进行的。

腺病毒载体：为了构建缺失E1和E3腺病毒表达、被融合至恒定链的抗原衍生的LCMV，我们进行了2步PCR。首先，我们获得了含有全长小鼠恒定链和全长LCMV糖蛋白的重叠PCR产物，而且这些被带有恒定链5’和糖蛋白3’引物的二次PCR所联合。表达全长GP的腺病毒在一步PCR中被扩增。将所得到的片段克隆至pacCMV穿梭载体。所得质粒与pJM17质粒被共转染至HEK293细胞中并且得到了病毒溶解物。在测序、大规模生产以及用CsCl梯度离心分离纯化前，用空斑纯化克隆这些，如所述的(Becker等，1994，Methods Cell Biol.43 PtA：161-189)。用腺苷-X快速滴度试剂盒(Clontech)确定腺病毒母液的感染性。所有未修饰病毒母液具有46至201之间的粒子/IFU比率。

接种：在所有的研究中，将待接种的小鼠麻醉并且在右后足底部注射2×10⁷感染单位、0.03ml体积。

病毒感染：将小鼠感染，脑内用20pfu的LCMV Armstrong克隆53b、体积0.03ml或者静脉内用10⁶pfu的LCMV克隆13、0.3ml。脑内感染诱导了致命的CD8⁺T细胞介导脑膜炎，由此免疫活性小鼠在感染后(p.i.)7至10天死亡(Christensen等，Scandinavian Journal ofImmunology40：373-382)。

存活率研究：应用死亡率来评价急性LCMV诱导脑膜炎的临床严重性。在脑内接种后，每天检查小鼠两次，最少2星期；将感染后少于3天发生的死亡从分析中排除。

器官病毒滴度：为了确定器官中病毒的滴度，首先在PBS中将这些均质化从而得到10％(v/w)器官悬浮液，然后制备连续的10倍稀释液。然后，将每一种稀释液装板于MC57G细胞上，一式两份。在感染后四十八小时，检测被感染的细胞簇，应用单克隆大鼠抗LCMV(VL-4)抗体、过氧化酶标记的山羊抗大鼠抗体以及邻苯二胺(底物)(Battegay等，1991，Journalof Virological Methods 33：191-198)。计数pfu的数目，并且结果表示为pfu/g组织。

细胞的制备：挤压器官通过细的不锈钢筛而获得脾细胞的单细胞混悬液。

用于流式细胞仪的抗体：下面的单克隆抗体(mAb)购自BDPharMingen(圣迭戈市，加州)作为大鼠抗小鼠抗体：细胞色素轭合的抗CD8、FITC轭合的抗CD44、藻红蛋白(PE)轭合的抗IFN-γ以及PE轭合的IgG₁同型标准品。

流式细胞仪分析：根据标准实验室操作方法，实施用于流式细胞仪的细胞染色(Andersson等，1994，Journal of Immunology 152：1237-1245；Andreasen等，1999，International Immunology 11：1463-1473)。为了LCMV特异性CD8⁺T细胞的计数，在莫能霉素(3μM，Sigma Chemicals co.，圣路易斯市，密苏里州)以及鼠重组IL-2(10单位/孔，R&DSystems Europe Ltd，阿伯顿市，英国)存在下，将脾细胞在具有相关肽(0.1μg/ml)的5％CO₂中于37℃体外培育5小时。经培育后，将细胞表面染色，冲洗，固定和使用0.5％皂素渗透化。然后，用抗IFN-γ或IgG₁同型对照于4℃染色细胞20分钟。用流式细胞仪BectonDickinson FACSCalibur分析样品，应用低角度以及侧面散射的组合，至少10⁴单核细胞被门控，从而排除了死亡细胞和碎片。应用Cell Quest Pro(B&D Biosciences)进行数据分析。

通过标准的方法(Becker等，Methods Cell Biol.43 Pt A：161-189)可以产生表达淋巴细胞性脉络丛脑炎病毒全长糖蛋白(Ad-GP)或N-端被连接至鼠恒定链的淋巴细胞性脉络丛脑炎病毒全长糖蛋白((Ad-IiGP)表达盒的示意性表示参见图1)的复制缺陷腺病毒载体。然后，用2×10⁷感染单位的Ad-GP或Ad-IiGP在右后爪对C57BL/6小鼠进行接种，并且在5、7、11、14、21、28、90、180或360天后处死小鼠。然后，分析在脾细胞上产生的LCMV糖蛋白特异性T细胞。显然地(参见图2)，在所有的检验计时点处，Ad-IiGP诱导了数量上优越的T细胞应答，相比于Ad-GP，而且这些是加速的并且包括CD4⁺和CD8⁺两种T细胞应答。因此，经Ad-IiGP接种后所产生的T细胞峰数目是在接种后7-14天获得的，取决于表位，Ad-GP在接种后21天出现应答高峰。

实施例2

在F₁杂种小鼠中CD8⁺和CD4⁺T细胞对编码表位腺病毒的应答：由于C57BL/6小鼠在所有的基因座上关于MHC I类和MHC II类分子都是纯合的，所以我们检验了Ad-GP和Ad-IiGP是否也能在表达H-2^b和H2^d两种单倍型的C57BL/6xBALB/c F₁小鼠中诱导免疫应答。这些小鼠类似于远系繁殖的群体，但是具有确定的单倍型。实验是按照上面而实施的，但是检验被限制在接种后21天。如从图3中所能看到的，Ad-IiGP有效诱导CD8⁺T细胞对多数表位的应答，而Ad-GP似乎比在纯合C57BL/6小鼠中表现得更糟。

实施例3

Ad-IiGP发挥独立于CD4⁺T细胞的CD8⁺T细胞刺激性作用：由于在增强CD8⁺T细胞刺激方面Ii功能的潜在机理是能够运输至内体和溶酶体室并且通过MHC II类刺激CD4⁺T细胞(Diebold等，2001，Gene Ther.8：487-493)，所以我们实施了MHC II类缺陷小鼠的接种。在右后足底部用2×10⁷IFU的Ad-GP或Ad-IiGP接种MHC-II^-/-或C57BL/6小鼠。在接种后21或90天，用细胞内染色脾细胞的肽诱导IFN-γ而测定表位特异性CD8⁺或CD4⁺T细胞的数目。如从图4所能看到的，Ad-IiGP有效地诱导CD8⁺T细胞针对几种表位的应答；然而在缺少CD4⁺T细胞辅助下，有些应答低于野生型小鼠中所见的。

实施例4

Ad-IiGP赋予快速的、上佳的和持续的保护，防止致命性LCMV感染：由于我们观察到相比于Ad-GP对Ad-IiGP的应答加速，所以我们研究了接种赋予在接种后21天(Ad-GP的峰值)以及在接种后3、5、7、14、60、90、180和360天(图5)的保护的能力。引人注目地，我们发现了接种Ad-IiGP仅3天的动物被保护免受脑内LCMV感染。由Ad-GP赋予的保护在感染后14和24天只是一部分，而且在60天以后未见保护。此外，Ad-IiGP所赋予的保护持续360天，此时，Ad-GP不再防止脑内LCMV感染。

实施例5

Ad-IiGP有效地防止高剂量、静脉内LCMV感染：由于我们发现Ad-IiGP防止小鼠急性局部化感染，所以我们打算研究是否高剂量系统性感染也是这样的。因此，用Ad-GP、Ad-IiGP或假处理剂(PBS)接种小鼠，并且在21天后用静脉注射106空斑形成单元的快速复制LVMV克隆13菌株进行攻击。5天后，处死动物，并且测定在肺中的感染滴度。尽管Ad-GP对接种动物赋予了显著的保护，但是Ad-IiGP是更佳的，而且将滴度减少到检验的检测限值或之下的水平(图6)。

实施例6

对比分析新构建体的动力学、应答的量级、长期的免疫性以及免疫所需的病毒剂量。

下面描述的所有构建体是彼此间地、以及对Ad-GP和Ad-IiGP进行对比分析的，涉及免疫应答的动力学和量级，例如在实施例1、2和3中所描述的，长期免疫性，例如在实施例1、4和5中所描述的，以及所需免疫性的病毒剂量。

新构建体基于对Ii融合的变更。在每个构建体中，腺病毒编码的GP在N-末端被融合至：

1.Ii的溶酶体靶向序列

2.Ii的CLIP序列

3.Ii的KEY序列

4.CLIP序列以及N-末端邻近CLP序列的序列

5.CLIP序列以及C-末端邻近CLP序列的序列

6.N-末端邻近CLP序列的序列

7.C-末端邻近CLP序列的序列

抗原呈递上下文序列的变更。在每个构建体中，腺病毒编码的GP被融合：

1.在C-末端上至LAMP

2.在N-末端上至钙网蛋白的N-区域

3.在C-末端上至钙网蛋白的N-区域

4.在C-末端上至Hsp70

5.在N-末端上至Ii以及在C-末端上至钙网蛋白的N-区域(AdIiGPCrt)

6.在N-末端上至Ii以及在C-末端上至Hsp70(AdIiGPHsp70)

此外，所有的这些构建体是一系列构建体的起点，其中GP-融合被内部核糖体进入位点(IRES)和编码VP22、HIV tat或Cx4的基因所跟随。

关于细胞间传播的替换。在每个构建体中，腺病毒编码的GP被融合：

1.在N-末端上至编码单纯疱疹病毒的VP22

2.在N-末端上至编码HIV的tat

3.在N末端上至连接蛋白43(Cx43)

4.在N-末端上至其他连接蛋白和细胞间间隙连接成分。

此外，制备构建体，其中腺病毒编码的GP被内部核糖体进入位点(IRES)和编码VP22、HIV tat或Cx43的基因或其他连接蛋白以及细胞间间隙连接成分所跟随。

此外，所有的上述构建体都以任一下列方法进行变更：

1.所有的上述构建体被IRES位点和编码NK-细胞(天然的杀灭细胞)活化分子例如H60的基因所跟随。这种变更赋予了共刺激性信号和细胞因子辅助的传输提高。

2.所有上述涉及IRES位点的构建体，其中下游基因被安置在单独的启动子控制之下。

3.所有上述涉及IRES位点的构建体，其中下游基因是在单独的载体上被编码的。

4.所有上述的构建体安置在诱导型启动子系统之下。

5.所有上述的构建体安置在细胞类型特异性和/或诱导型启动子系统之下。

6.所有上述构建体，其中GP抗原性序列用编码任意下列抗原的序列所代替，它们中有几个包含多抗原，参见图12和13中特异性抗原的实例：VSV-GP、甲型流感NS-1、甲型流感M1、甲型流感NP、LCMV NP、LCMVGP、埃博拉GP、埃博拉NP、鼠γ疱疹病毒(MHV-68)M2、M3(这对应于人EBV和HHV8病毒)和ORF73、鸡卵白蛋白(OVA)，或者辅助性T细胞表位。此外，这些抗原性序列被组合在一起，这样至少2个或更多在同一载体中被编码。

参见图14关于Ad-Ii-GP pg33和gp276构建体的有效性对比实例，相比于Ad-GP-Lamp-1 pg33和gp276构建体，如用CD8+T细胞应答所检测到的。如所见到的，Ad-Ii-GP构建体在激发CD8+T细胞应答能力方面优于Ad-GP-Lamp-1构建体。

实施例7

关于动力学、应答大小、长期免疫性以及免疫性所需病毒剂量方面，对比分析新构建体和替代性给药方法。

实施例6中所述的所有构建体是彼此间地、以及对遵照替换给药方法的Ad-GP和Ad-IiGP对比分析的。所做的对比涉及免疫应答的动力学和大小，例如在实施例1、2和3中所描述的，长期免疫性，例如在实施例1、4和5中所描述的，以及所需免疫性的病毒剂量。

替换性给药方法包括：

1.涉及提高共刺激性信号和细胞因子辅助的传输，其中在实施例6中所述的构建体都是与编码1型干扰素例如四环素可诱导的IFN-β的腺病毒一起共同注射的。此外，在实施例6中所述的所有构建体都是与编码细胞因子例如IL-15的腺病毒一起共同注射的。

2.Ad-IiGP与Ad-Tet-onGP是在身体的不同部位同时给药的(Ad-Tet-onGP在四环素可诱导的启动子控制下编码GP)。

3.实施例6中所述的任一插入物/构建体通过腺病毒进行传输，随后用相同的插入物/构建体进行同源性病毒载体加强，或者随后用编码相同插入物/构建体的慢病毒或者其他腺病毒的传输而进行异源性病毒载体加强。

实施例8

Ad-IiGP赋予快速的和上佳的保护，防止在缺少主要表位下的致命性LCMV感染。淋巴细胞性脉络丛脑炎病毒全长糖蛋白(GP)包含四个不同抗原性的CD8⁺特异性表位，用具有单独表位特异性的CD8⁺细胞相对于对GP接种应答的全部CD8⁺细胞的百分位数进行检测。抗GP的大多数群体CD8⁺细胞是对gp33表位特异性的，稍小的群体是对gp276特异性的，而且少数群体是对gp118和对gp92特异性的。由于gp33和gp276是主要的/优势免疫表位，所以我们研究了表位单独地或者两个同时的近等基因系突变(nil mutation)如何影响Ad-IiGP融合构建体所提供的保护有效性。

用在右后足底部感染2×10⁷IFU Ad-GP和Ad-IiGP或假处理剂接种C57BL/6小鼠。每个组由5只动物组成。在接种后90天，应用20pfu LCMVArm 53b i.c.(脑内)构建体攻击动物，该构建体携带gp33近等基因系突变、gp276近等基因系突变或者gp33/gp276双近等基因系突变。记录14天的死亡率。如从图7中所看到的，Ad-IiGP赋予上佳的保护，防止致命性LCMV感染，尽管gp33或gp276近等基因系突变。gp33/gp276双近等基因系突变导致动物的存活率为70％，相比于在接种Ad-GP和假处理剂组中无存活动物。

对上述实验中存活的动物进行分析，用细胞内染色脾细胞的肽诱导IFN-γ而分析表位特异性CD8⁺或CD4⁺T细胞。所预期地，如从图8中所看到的，在缺少gp33或gp276的情况下，CD8⁺或CD4⁺T细胞的主表位特异性分别是gp276或gp33。在gp33/gp276都缺少的情况下，CD8⁺或CD4⁺T细胞的主表位特异性是gp92。

实施例9

CD8⁺和CD4⁺T细胞对用裸DNA-IiGP和DNA-GP接种的应答。为了研究恒定链融合疫苗而非腺病毒传输的替代平台，我们检验了IiGP和GP作为裸DNA激发GP表位特异性CD8⁺和CD4⁺T细胞的能力。裸DNA包含来自如图1所示腺病毒载体的GP和Ii-GP片段。

用被包被在1.6nm金粒子上的DNA、浓度为2μg DNA/mg金接种C57BL/6小鼠，而且DNA-金复合物被包被在塑料管上，这样每次注射对小鼠递送0.5mg金(每次注射1μg DNA)。在腹部皮肤处，对小鼠进行免疫，应用手持基因枪设备，利用压缩氦气(400psi)作为粒子的动力。以1星期的间隔对小鼠接种四次，然后在开始研究前使其休息1星期。用细胞内染色脾细胞的肽诱导IFN-γ而确定表位特异性CD8⁺或CD4⁺T细胞的数目。如图9中所能看到的，DNA-IiGP有效地诱导CD8⁺T细胞针对几种表位的应答。

实施例10

Ad-IiGP赋予上佳保护，防止表达来自LCMV的gp33表位的肿瘤细胞攻击。在正常状况下，肿瘤细胞表达几种不同的T细胞识别抗原。为了确定这种应答的有效性，来自LCMV的B16.F10黑素瘤细胞表达的gp33被用来攻击被接种的动物。

用2×10⁷IFU Ad-GP或Ad-IiGP在右后足底部对C57BL/6小鼠进行接种。作为对照组，一些动物是用Ad-β-半乳糖苷酶接种的(阴性对照)或者用LCMV感染(阳性对照)。在接种/感染后90天，皮下施用106肿瘤细胞攻击动物，而且在肿瘤生长后，检测肿瘤的大小。最初，肿瘤在所有动物中形成，但是最终针对gp33的免疫应答消除了肿瘤细胞。每个组由7-10只动物组成。用Ad-Ii-GP的预防性接种导致无肿瘤的小鼠占70％的实例，相比于接种Ad-GP的动物仅为10％，如从图10中所能看到的。

在许多病例中，当医师访问患者时，肿瘤已经形成。为了模拟这种情形，用10⁶B16.F10肿瘤细胞对C57BL/6小鼠进行皮下注射。5天后，肿瘤是可触摸识别到的，并可测量。在此计时点，用2×10⁷IFU Ad-GP或Ad-IiGP在右后足底部对动物进行接种。作为对照组，一些动物是用Ad-β-半乳糖苷酶接种的(阴性对照)或者用LCMV感染(阳性对照)。在肿瘤生长后检测肿瘤的尺寸，一旦尺寸在任意方向大于12mm，就将动物处死。如从图11中所看到的，在给予了治疗性Ad-IiGP疫苗的小鼠中，肿瘤发育的速度大约为在给予Ad-GP作为治疗疫苗的小鼠中一半，如用达到12mm尺寸且动物被处死前所经过的天数所检测的。

实施例11

为了证实疫苗构建体同样能诱导保护抗体的应答，使用了VSV感染。

病毒和病毒的定量：在本研究中始终使用的是印第安纳血清型水泡性口炎病毒(VSV)。将病毒母液在L929细胞(ATCC CCL 1)中增殖，并贮存于-70℃直至应用。在单层L929细胞上用空斑检验法进行病毒的定量。简言之，在含有1％L-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素、5％NaHCO₃和10％胎牛血清的伊格尔氏基本培养基(F11)中，制备病毒的连续10倍稀释液。将一毫升的每种稀释液一式两份地加入至48小时前被铺在培养皿中的单层L929细胞上。经过在5％CO₂中37℃培育90分钟后，抽取含有病毒稀释物的培养基，而且用2.5ml1％琼脂糖和2.5ml 2xF11的混合物覆盖该单层。然后在5％CO₂中37℃培育单层24小时，此后用含有1％中性红的1ml 1％琼脂糖和1ml 2xF11混合物染色。在进一步培育24小时后，计数PFU的数目。

存活率研究：基于在CNS中的病毒滴度与临床症状非常相关的早期发现(Thomsen等1997，Int.Immunol.9：1757-1766.)，致死率被用作VSV感染严重性的参数。每天检查小鼠VSV诱导的瘫痪体征，当发现严重瘫痪而且动物在随后的24小时内无法抵御的，予以处死。

血清中和检验：将血清在F11中的连续两倍稀释液与等体积、被稀释至含有大约100PFU/ml的病毒相混合。经室温培育1小时后，将1ml每种血清-病毒混合物一式两份地加入到培养皿中的单层L929细胞上，并且用空斑检验法(参见病毒和病毒定量)检验残留病毒的存在。减少空斑数至少50％的最高血清稀释被视为中和滴度。

用2×10⁷IFU的编码全长糖蛋白水泡性口炎病毒(Ad-VSVGP)或者被连接至恒定链的糖蛋白(Ad-Ii-VSVGP)的病毒在右后足底部对C57BL/6小鼠进行接种。在接种后7天、14天、21天和110天，收集血清样品，而且用空白减少检验法测定体外中和抗体滴度，图12a。在接种后3天、7天、14天、21天和110天，用10⁵PFU的VSV鼻内地攻击动物，并且记录随后14天的致死率，图12b。如图12中所看到的，在两个组中可看到几乎相同的应答，这表明，尽管不是优势，恒定链使得抗体产生，而且对其产生没有有害的作用。

参考文献目录

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Claims (21)

1.一种腺病毒载体，其包含编码以下的核苷酸构建体：

a)至少一个抗原和

b)至少一个恒定链，所述恒定链由SEQ ID NO:2所示，

其中所述至少一个抗原选自下列的组：病原性生物体，以及与异常生理学应答相关的蛋白或肽；

或者所述至少一个抗原为至少85％等同于上述组中抗原的抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段，

并且其中所述至少一个抗原所包含的表位为CD8+表位。

2.根据权利要求1所述的腺病毒载体，其中至少一个信号肽被添加至所述至少一个恒定链或替代所述至少一个恒定链的信号肽；或者所述至少一个恒定链的至少一个信号肽被除去。

3.根据权利要求1所述的腺病毒载体，其中来自病原性生物体的至少一个抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段选自包括下列的病原体组：病毒、微生物和寄生物。

4.根据权利要求3所述的腺病毒载体，其中所述病毒选自下列组：HIV、丙型肝炎病毒、流感病毒、疱疹病毒、拉沙、天花、丝状病毒和乳头瘤病毒。

5.根据权利要求3所述的腺病毒载体，其中所述病毒选自下列组：埃博拉、禽流感和马尔堡。

6.根据权利要求3所述的腺病毒载体，其中所述微生物选自下列组：结核分支杆菌、炭疽杆菌、葡萄球菌和弧菌。

7.根据权利要求3所述的腺病毒载体，其中所述寄生物选自下列的组：疟原虫、利什曼原虫和锥虫。

8.根据权利要求1所述的腺病毒载体，其中所述至少一个抗原选自癌特异性多肽。

9.根据权利要求1所述的腺病毒载体，其中至少一个所述抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段是来自癌特异性多肽。

10.根据权利要求1所述的腺病毒载体，其中至少一个所述抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段是来自与异常生理学应答相关的多肽，其中所述异常生理学应答是自体免疫疾病、变态反应、癌或者先天性疾病。

11.根据权利要求1所述的腺病毒载体，其中在恒定链与抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段之间的操作接头选自下列的组：直接的连接或者是由间隔区介导的连接。

12.根据权利要求11所述的腺病毒载体，其中该操作接头是间隔区，其中该间隔区编码至少一个蛋白酶酶切位点。

13.根据权利要求1所述的腺病毒载体，其中至少一个恒定链在操作上被连接至至少两个所述抗原性蛋白或者肽或者所述蛋白或肽的抗原性片段。

14.根据权利要求1所述的腺病毒载体，其中该载体是复制缺陷腺病毒。

15.根据权利要求1所述的腺病毒载体，其中该载体是有条件地复制缺陷腺病毒。

16.一种用作药品的疫苗组合物，其包含根据权利要求1至15任一项中所定义的腺病毒载体。

17.根据权利要求16所述的疫苗组合物，其中该疫苗包含用于肌内、静脉内或皮下给药的手段。

18.根据权利要求16所述的疫苗组合物，其包含第二活性成分，其中所述第二活性成分选自下列的组：抗生素、化疗药、抗过敏药、细胞因子和免疫系统的共刺激性分子。

19.一种成套试剂盒，其包括：

-根据权利要求16至18任一项的疫苗组合物，其包含腺病毒载体，

-医疗仪器或者施用所述疫苗的其他手段，

-关于如何使用所述成套试剂盒的说明书。

20.根据权利要求16至18任一项的疫苗组合物在制备用于在动物中诱导免疫应答的药物中的用途，其中该免疫应答是MHC-I依赖型的。

21.根据权利要求1至15任一项所述的腺病毒载体用于疫苗生产的用途。