CN110923203A - 脐带间充质干细胞的扩增培养工艺 - Google Patents

脐带间充质干细胞的扩增培养工艺 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种脐带间充质干细胞的扩增培养工艺，包括原代培养和传代培养，传代培养的条件为：将原代培养的脐带间充质干细胞接种至含培养基的培养容器中，接种密度为11040个/cm2，培养容器的底面积为160.5cm2，培养时间为89.76h，培养环境为：37℃，5％CO2饱和湿度。在此培养条件下，UC‑MSC的扩增能力可达到11.86倍，脐带间充质干细胞的实际扩增倍数为11.40倍。本发明的培养工艺，可在体外大规模扩增间充质干细胞，且保持其多向分化潜能。

Description

脐带间充质干细胞的扩增培养工艺
技术领域
本发明涉及一种脐带间充质干细胞的扩增培养工艺，具体涉及脐带间充质干细胞的扩增培养工艺中培养时间、传代密度和培养容器底面积三者之间的交互作用对脐带间充质干细胞的扩增培养影响，属于细胞培养技术领域。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于中胚层的一类具有自我更新能力及多向分化潜能的成体干细胞，在特定的培养条件下可分化为造血细胞、骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等，还可分化为神经细胞、肝细胞、胰岛细胞等。MSC可从骨髓、脂肪、脐带、牙髓等组织中分离获得，因其具有来源广泛、容易分离、能快速扩增、具有较低免疫原性等优点，成为组织工程、再生医学和免疫抑制治疗领域重要的种子细胞来源。
MSC在人体组织中比例较低，通过分离得到的细胞数量很少，若要达到临床治疗所需细胞数量，则需要在体外进行大规模扩增，同时保持其多向分化潜能是临床应用亟待解决的问题。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种脐带间充质干细胞的扩增培养工艺，对培养时间、传代密度和培养容器这三个关键影响参数进行了交互作用分析，得到了最佳的参数，可在体外大规模扩增间充质干细胞，且保持其多向分化潜能。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种脐带间充质干细胞的扩增培养工艺，包括原代培养和传代培养，其中，传代培养的条件为：将原代培养的脐带间充质干细胞接种至含培养基的培养容器中，接种密度为11040个/cm2，培养容器的底面积为160.5cm2，培养时间为89.76h，培养环境为：37℃，5％CO2饱和湿度。本发明通过实验证明，在此培养条件下，UC-MSC的扩增能力可达到11.86倍，脐带间充质干细胞的实际扩增倍数为11.40倍。
所述原代培养的具体方式为：将脐带间充质干细胞加入无血清培养基(现有技术中已有的常规培养基)中进行原代培养，置37℃、体积分数为5％CO2饱和湿度培养箱内培养，每3天半量换液1次，待有成纤维样细胞爬出后的1～2周去掉组织块，待细胞长至90％融合时，进行传代培养。
本发明选取了传代密度、容器底面积、培养时间3个因素，在单因素试验的基础上，采用响应面分析法，利用Box-Benhnken中心组合实验设计原理对脐带间充质干细胞(UC-MSC)培养工艺的参数进行了优化，以细胞扩增倍数为响应值，获得了最佳的培养工艺条件(培养时间、传代密度和培养容器底面积三者之间有交互作用，对干细胞的扩增培养有不可预测的影响)。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
附图说明
图1：接种密度对细胞扩增倍数的影响。
图2：培养时间对UC-MSC扩增能力的影响。
图3：培养容器底面积对UC-MSC扩增能力影响。
图4：传代密度和容器底面积交互作用对UC-MSC扩增能力影响的响应面图。
图5：传代密度和容器底面积交互作用对UC-MSC扩增能力影响的等高线图。
图6：传代密度和培养时间交互作用对UC-MSC扩增能力影响的响应面图。
图7：传代密度和培养时间交互作用对UC-MSC扩增能力影响的等高线图。
图8：容器底面积和培养时间交互作用对UC-MSC扩增能力影响的响应面图。
图9：容器底面积和培养时间交互作用对UC-MSC扩增能力影响的等高线图。
图10：YF-01无血清培养基培养的人MSC维持了三系分化潜能，其中，A为成骨染色(茜素红染料)，B为成脂染色(油红O染料)，C为成软骨染色(阿利新蓝染料)。
图11：培养后脐带间充质干细胞的免疫表型情况。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实验 脐带间充质干细胞的扩增培养工艺的优化
1.材料与仪器：如表1所示。
表1
Figure BDA0002300781040000031
2.实验方法
2.1新鲜脐带制备脐带间充质干细胞
选取自足月健康新生儿的脐带，超净台内从储运瓶中取出脐带，用无菌PBS洗涤去除残血，剔除脐动静脉，用组织剪将其剪碎至1mm3大小，接种于的T75培养瓶中，加入XSF-YF-01无血清培养基(可购自北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司)进行原代培养，置37℃、体积分数为5％CO2饱和湿度培养箱内培养。每3d半量换液1次，待有成纤维样细胞爬出后一两周去掉组织块，细胞长至90％融合时，传代培养。
2.2脐带间充质干细胞(UC-MSC)培养工艺的单因素试验
自P2代起选取传代密度、培养时间、接种底面积3个参数进行单因素试验，观察细胞生长的状况，台盼蓝染色计数，计算细胞增殖能力。
2.3响应面法优化脐带间充质干细胞的培养工艺
在单因素实验的基础上，选取传代密度、培养容器底面积、培养时间作为自变量进行三因素三水平的Box-Benhnken的中心组合实验设计，水平分别以-1、0、1编码，以细胞扩增倍数为响应值，实验因素水平见表2所示。
表2实验因素与水平
Figure BDA0002300781040000041
3.结果与分析
3.1单因素实验
本实验选取了传代密度、容器底面积以及培养时间三个单因素进行三因五水平的单因素试验，分析各因素对脐带间充质干细胞扩增倍数的影响。
3.1.1不同传代密度对细胞扩增倍数的影响
在确定传代底面积为150cm2、培养时间为72h不变的条件下，比较传代密度分别为6000/cm2、8000/cm2、10000/cm2、12000/cm2、14000/cm2时对脐带间充质干细胞扩增倍数的影响，因素水平及记过如表3、图1所示。
表3因素与水平
Figure BDA0002300781040000042
由表3和图1可知，在固定培养容器底面积、细胞培养时间的基础上，调整传代密度从6000/cm2起至14000/cm2之间，脐带间充质干细胞的扩增倍数随着接种密度的升高而升高，在接种密度调整至10000/cm2后，脐带间充质干细胞的扩增倍数趋于平缓并有所下降，由于考虑到细胞的接种密度过大可能影响到细胞的活率，所以将单因素最佳接种密度定为10000/cm2。
3.1.2不同培养时间对脐带间充质干细胞扩增倍数的影响
在确定传代密度为10000/cm2、容器内底面积及150cm2不变的条件下，比较培养时间分别为48h、60h、72h、84h、96h时对细胞扩增倍数的影响，如表4、图2所示。
表4因素与水平
Figure BDA0002300781040000051
由表4和图2可知，在96h内脐带间充质干细胞的扩增倍数随着培养时间的延长而增大，当培养时间超过84h时，细胞的扩增倍数趋于平衡，此时，由于细胞已经长满容器地面，融合率基本达到100％，所以细胞的扩增倍数不再提高，同时趋于平衡。当培养时间过低时，由于细胞生长时间较短，细胞处于对数生长期，此时增殖不完全，细胞数量相对较少。因此培养取时间应选择84h为最佳。
3.1.3不同的培养容器底面积对细胞扩增倍数的影响
在确定传代密度为10000/cm2、培养时间为72h不变的条件下，比较容器底面积10cm2、25cm2、75cm2、150cm2、225cm2对细胞扩增倍数的影响，如表5、图3所示。
表5因素与水平
Figure BDA0002300781040000052
由表5和图3可知，细胞扩增倍数随着培养容器的底面积的增大而升高，在150cm2以后培养容器的底面积对细胞扩增倍数的影响趋于平衡，并且有所下降，所以选取150cm2作为最佳的培养容器底面积。
3.2.响应面法优化脐带间充质干细胞的培养工艺
3.2.1Box-Benhnken的中心组合设计试验结果及分析
如表6、表7、表8所示。
从模型的方差分析表(表6)可知，本实验所选取的二次多项式模型具有高度的显著性(P<0.0001)。失拟项为0.3625，大于0.05，故失拟项不显著。其决定系数0.9766，校正决定系数为0.9464，此数值说明本实验模型可以解释94.64％响应值的变化，只有总变异的5.36％不可以用此模型来解释，该模型的拟合度良好，可以使用此模型对脐带间充质干细胞的培养工艺进行优化。
表6响应面实验设计及实验结果
Figure BDA0002300781040000061
表7回归模型方差分析表
Figure BDA0002300781040000062
表8回归方程系数显著性检验
Figure BDA0002300781040000063
利用Design Expert6.0软件对实验数据进行多元拟合，得到回归方程如下：
Y＝11.57+0.50A+0.23B+0.58C-0.90A2-2.57B2-1.08C2+0.48AB+0.79AC+0.47BC
式中，Y--细胞扩增倍数；A--传代密度(个/cm2)；B—容器底面积(cm2)；C—培养时间(h)。
从上面的方程的回归系数显著性检验(见表8)得知0.01<PA<0.05，由此可以说明传代密度对细胞扩增倍数的影响比较显著，PB>0.05表明了培养容器底面积对细胞扩增倍数影响不显著，PC<0.01，表明了培养时间对细胞扩增倍数影响极显著。
3.2.2响应面与等高线分析
图4～图9是根据多元回归方程所得到的不同因素对细胞扩增能力影响的响应面及其等高线图。通过该组图可以对任意两因素及其交互作用进行分析和评价，并从中确定出最佳的因素水平的范围。
研究表明，等高线的形状可以反映出交互作用的强弱，越趋向于椭圆表示交互作用越强，越趋向于圆形表示交互作用越弱。
由图4、图5可见，传代密度和培养容器底面积UC-MSC扩增能力的交互作用，等高线呈椭圆，说明了传代密度和培养容器底面积之间的交互作用显著。当传代密度不变时，UC-MSC的扩增能力随着培养时间的增大而呈现先上升后下降的趋势；当培养容器底面积不变时，UC-MSC的扩增能力随着传递密度的增大而呈现上升的趋势，上升到一定值，UC-MSC的扩增能力变化趋于平缓。
由图6、图7可见，传代密度和培养时间对UC-MSC扩增能力的交互作用，等高线呈椭圆，说明了传代密度和培养容器底面积之间的交互作用显著。当传代密度不变时，UC-MSC的扩增能力随着培养时间的增大而呈现先上升后趋于平稳；当培养时间不变时，UC-MSC的扩增能力随着传代密度的增大而呈现上升的趋势，上升到一定值，UC-MSC的扩增能力变化趋于平缓。
由图8、图9可见，培养时间和培养容器底面积UC-MSC扩增能力的交互作用，等高线呈椭圆，说明了培养时间和培养容器底面积之间的交互作用不显著。当培养时间不变时，UC-MSC的扩增能力随着容器底面积的增大而呈现先上升后下降的趋势；当培养容器底面积不变时，UC-MSC的扩增能力随着培养时间的增大而呈现上升的趋势，上升到一定值，UC-MSC的扩增能力变化趋于平缓。
3.3验证性实验
根据Box-Behnken实验所得到的数据结果和回归方程，利用Design Expert6.0软件处理所得数据，从中可以获得一组最佳的脐带间充质干细胞的培养条件，接种密度为11040个/cm2、培养容器底面积160.5cm2、培养时间为89.76h,在此条件下得到的脐带间充质干细胞的扩增倍数为11.86倍。为了验证此响应面法的可行性，使用实验得出的最佳条件进行脐带间充质干细胞培养的验证性实验，通过3组平行实验得到UC-MSC的扩增倍数为11.28、10.78和12.15，得到的平均扩增倍数为11.40，实际扩增后的间充质干细胞P5和P10代流式表型鉴定CD105、CD90、CD73阳性表达率均大于95％，CD34、CD45、CD19、CD11b、HLA-DR等阳性表达率均低于2％，符合2006年ISCT的标准，同时维持了三系分化的能力，如图10、图11所示。通过验证性实验可以说明，本模型可以较好的预测实际脐带间充质干细胞的扩增情况。
4.结论
本研究在单因素试验的基础上，确定了提取传代密度为10000个/cm2、培养容器底面积150cm2、培养时间84h。应用Box-Benhnken设计三因素三水平的实验，利用Design-Expert6.0进行多元回归拟合，得到一个UC-MSC扩增倍数和各影响因素的多元二次回归方程：
Y＝11.57+0.50A+0.23B+0.58C-0.90A2-2.57B2-1.08C2+0.48AB+0.79AC+0.47BC
经方差分析表明，该模型可以较好的反映出传代密度、培养容器底面积、培养时间与UC-MSC扩增倍数的关系。传代密度和培养时间对UC-MSC扩增影响是显著的(P<0.05)，培养容积底面积对UC-MSC扩增的影响是不显著的(P>0.05)，传代密度和培养容器底面积的交互作用、传代密度和培养时间的交互作用表现为显著，培养容器底面积和培养时间的交互作用表现为不显著(P>0.05)。并用该软件对UC-MSC的培养扩增工艺进行了优化，得到了UC-MSC的最佳培养扩增条件为：接种密度为11040个/cm2、培养容器底面积160.5cm2、培养时间为89.76h,在此条件下，UC-MSC的扩增能力可达到11.86倍，而经验证实验所得到的实际值为11.40倍，此实验的理论值与实际值相差不大。实验证明，响应面分析法可以有效地对UC-MSC的扩增培养工艺进行优化，这对进行UC-MSC的大规模扩增工艺优化具有一定的指导意义。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

Claims (3)

1.一种脐带间充质干细胞的扩增培养工艺，包括原代培养和传代培养，其特征在于：传代培养的条件为：将原代培养的脐带间充质干细胞接种至含培养基的培养容器中，接种密度为11040个/cm2，培养容器的底面积为160.5cm2，培养时间为89.76h，培养环境为：37℃，5％CO2饱和湿度。
2.根据权利要求1所述的脐带间充质干细胞的扩增培养工艺，其特征在于：所述培养基为XSF-YF-01无血清培养基。
3.根据权利要求1或2所述的脐带间充质干细胞的扩增培养工艺，其特征在于：所述原代培养的具体方式为：将脐带间充质干细胞加入无血清培养基中进行原代培养，置37℃、5％CO2饱和湿度培养箱内培养，每3天半量换液1次，待有成纤维样细胞爬出后的1～2周去掉组织块，待细胞长至90％融合时，进行传代培养。
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