CN107266520A - 一种喜树碱与桦木酸结合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种喜树碱与桦木酸的结合物及其制备方法，该方法通过短链PEG连接喜树碱与桦木酸，包括以下步骤：1)首先将喜树碱和I:Boc‑NH‑PEGn‑(CH2)mCOOH在第一缩合剂作用下，得到中间体II:CPT‑CO‑(CH2)m‑PEGn‑NH‑Boc；2)再将中间体II脱去叔丁氧羰基反应得到III:CPT‑CO‑(CH2)m‑PEGn‑NH2；3)在惰性气体保护条件下，加入桦木酸(BA)、第二缩合剂及路易斯酸在二氯甲烷中搅拌，加入III及三乙胺，常温搅拌，分离结晶得到最终偶联物CPT‑PEGn‑BA。本发明避免了桦木酸的羧基与自身的羟基反应，减少了反应过程中副反应，为高产率地制备高纯度的喜树碱与桦木酸结合物提供了保障，该工艺流程短，反应操作简便，反应选择性高。

Description

一种喜树碱与桦木酸结合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及药物分子PEG化制备技术领域，更具体地涉及一种喜树碱与桦木酸通过PEG连接的结合物以及该结合物的制备方法、及包含该结合物在医药中的应用。
背景技术
喜树碱及其衍生物、紫杉醇以及维生素甲类化合物抗肿瘤作用的发现被誉为“20世纪90年代抗癌药物的三大发现”，其中喜树碱对肿瘤、白血病、肝癌等均有明显的抑制作用。喜树碱为淡黄色针状晶体，不溶于水，难溶于一般溶剂，可溶于氯仿、乙醇、乙酸、乙酸乙酯。喜树碱的化学性质也不同于普通的生物碱,其没有明显的碱性，属于中性的喜树碱，其英文名为Camptothecin，简称CPT；分子量为348.36；溶解性为1mg；作为一种萜类吲哚生物碱，结构中含有5个环，分子几乎完全成平面结构，且多环之问相互共轭，E 环的20位有一个S型手性中心，旁边含有一个内酯结构。结构式如式1所示：
喜树碱是Ⅰ型拓扑异构酶抑制剂抗癌药物的一种，已经被美国FDA授权临床应用。喜树碱类药物是细胞毒类药物的重要代表，也是当前临床使用最为广泛的一类细胞毒类药物，在肿瘤临床治疗中占有不可替代的重要地位。但是，与其它的细胞毒类药物一样，喜树碱类药物严重的毒性问题极大地制约了其临床应用。其中，迟发性腹泻是喜树碱类药物最严重的毒性反应，临床发生率高达40％，且个体差异大，严重者可致患者死亡。一直以来，因机制不明，目前在临床上仅能在腹泻发生之后采用对症治疗的手段，收效甚微，严重制约药物临床获益。
桦木酸，又名白桦脂酸，简称BA,属五萜类有机酸，不溶于水，微溶于甲醇、乙醇、丙酮，易溶于四氢呋喃、吡啶，广泛存在于多种中药中。具有抗肿瘤、抗艾滋病病毒、抗炎和体外抗疟病等多种生物活性，尤其对于恶性皮肤黑痣瘤有很好的效果，而且毒性很小，是最有前途的抗癌药物前体，为治疗艾滋病、肿瘤的新物质。其结构式为：
基于喜树碱优异的抗癌特性与桦木酸毒性小且优良的抗癌活性，及喜树碱以及桦木酸不溶于水的特性，我们想到将喜树碱与桦木酸通过PEG衍生化的化学合成方法桥接起来，一方面使获得的偶联物易溶于水，便于生物体内的代谢研究，另外一方面是能研究喜树碱与桦木酸偶联物在抗肿瘤疗效方面能否集喜树碱与桦木酸的所长。
具有一端氨基，另一端羧基结构的PEG衍生物具有极好的亲水性能，而现有技术中都是通过长链的PEG对药物分子相连，以达到提高药物分子亲水性的作用，但是由于大分子量的长链PEG的分子量很难确定，其分子量通常是一个范围，相当于在化学反应中，大分子量的PEG以混合物的状态与药物分子进行反应连接；此外，由于长链的PEG分子的一端连接一个药物分子之后，另一端由于分子量过长，很难连接到PEG分子的另一端，从而很难实现两个药物分子的亲水性结合。
迄今为止，通过短链PEG将喜树碱和桦木酸连接起来形成亲水性前药在国内外还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种方法能够高效的将喜树碱与桦木酸通过短链PEG连接起来，使得PEG与药物分子的连接更加精确，通过该方法合成喜树碱与桦木酸衍生物避免了桦木酸的羧基在参与反应过程中与自身的羟基反应，提高桦木酸的利用率，该合成路线工艺流程短，反应操作简便，并且反应选择性高。
本发明的目的是提供一种喜树碱与桦木酸结合物，
一种喜树碱与桦木酸结合物，所述喜树碱与桦木酸结合物的结构式为：
其中n为0-12的整数，m为1-2的整数。
其喜树碱与桦木酸结合物的制备方法如下：将喜树碱与桦木酸通过一个短链PEG连接，包括以下步骤：
1)首先将喜树碱和(II):R1-PEGn-R2在第一缩合剂作用下，得到中间体(III):CPT-PEGn-R1；
其中，n 是0-12的整数，m为1-2的整数，R1是连接有叔丁氧羰基(Boc)的氨基，R2＝(CH2)mCOOH， R3＝(CH2)mCO。
2)将(III)脱去叔丁氧羰基(Boc)得到(IV):CPT-PEGn-NH2；
其中，n是0-12的整数，m为1-2 的整数。
3)在惰性气体保护条件下，将桦木酸、第二缩合剂及路易斯酸在二氯甲烷中搅拌，加入(IV) 及三乙胺，搅拌分离后结晶得到最终偶联物(I):CPT-PEGn-BA。
进一步地，所述步骤1)中的第一缩合剂为二环己基碳二亚胺(DCC)及4-二甲氨基吡啶(DMPA)。
进一步地，所述步骤1)中的喜树碱和(II)在第一缩合剂作用下，在有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺中于温度范围30-50℃，反应1-5小时得到中间体(III)。
进一步地，所述步骤1)中的喜树碱和(II)在第一缩合剂作用下，在有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺中于温度范围35-45℃，反应2-3小时得到中间体(III)。
进一步地，所述步骤1)中的Boc-NH-PEGn-(CH2)mCOOH、喜树碱、二环己基碳二亚胺(DCC)以及4-二甲氨基吡啶(DMPA)的摩尔比为2:2:3:3。
进一步地，所述步骤2)中的脱去叔丁氧羰基的反应是在有机溶剂为体积比为5:1的盐酸与甲醇的混合溶剂中进行的，所述盐酸为3.5-4.5mol/l的稀盐酸。
进一步地，所述步骤2)中的反应是(III)在温度为18-20℃条件下搅拌5—7小时制得(IV)。
进一步地，所述步骤3)中(IV)是在有机溶剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)中反应温度为18-26℃条件下搅拌1-12h反应制得(I)。
进一步地，所述步骤3)中的路易斯酸为三氟甲磺酸钠，氯化锌，三氟化硼乙醚中的一种或多种。
进一步地，所述步骤3)中的第二缩合剂为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
进一步地，所述步骤3)中的桦木酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、CPT-PEGn-NH2以及路易斯酸、三乙胺的摩尔比为2:3:3:2:0.1:2。
进一步地，所述的喜树碱与桦木酸结合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步地，所述抗肿瘤药物制剂含有占该制剂总重量1-99％所述的结合物。
进一步地，所述的抗肿瘤药物制剂，其中，所述的结合物占该制剂总重量的5-85％(重量)。
进一步地，所述的制剂为口服剂或者注射剂。
本发明避免了桦木酸的羧基与自身的羟基反应，减少了反应过程中副反应，为高产率地制备高纯度的喜树碱与桦木酸衍生物CPT-PEGn-BA提供了保障。同时该结合物通过短链PEG连接在一起，使得PEG与药物分子的连接更加精确，不仅提高了该结合物的水溶性，克服了喜树碱和桦木酸不溶于水的缺陷，另一方面使得药物分子精准地连接在PEG链上。该工艺流程短，反应操作简便，并且反应选择性高。本发明利用较廉价易得的路易斯酸催化步骤3)的缩合反应，也是该反应能够成功并保持高选择性和产率的关键因素，避免桦木酸的羧基在参与反应过程中与自身羟基发生酯化反应，该工艺操作流程短，反应操作简便，并且反应选择性高。
具体实施方式
将喜树碱与桦木酸通过一个短链PEG连接，包括以下步骤：(1)首先将喜树碱(CPT)和Boc-NH-PEGn-(CH2)mCOOH置于有机溶剂N,N-二甲基甲酰胺中，在第一缩合剂二环己基碳二亚胺(DCC)及4-二甲氨基吡啶(DMAP)的催化作用下于30-50℃温度下反应1-5小时，通过纯化得到中间体CPT-CO-(CH2)m-PEGn-NH-Boc；其中，Boc-NH-PEGn-(CH2)mCOOH、喜树碱、二环己基碳二亚胺(DCC)以及4-二甲氨基吡啶(DMAP)的摩尔比为2:2:3:3；2) 再将中间体CPT-CO-(CH2)m-PEGn-NH-Boc溶解于体积比为5:1，盐酸浓度为3.5-4.5mol/l 的盐酸与甲醇的混合溶剂中，在18-20℃温度下，搅拌5—7小时，经过萃取、干燥得到中间体CPT-CO-(CH2)m-PEGn-NH2；3)在惰性气体保护条件下，将桦木酸、第二缩合剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)及路易斯酸在二氯甲烷中搅拌0.5-1.5小时，加入CPT-CO-(CH2)m-PEGn-NH2及三乙胺，其中桦木酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、 CPT-CO-(CH2)m-PEGn-NH2以及路易斯酸、三乙胺的摩尔比为2:3:3:2:0.1:2，常温搅拌1-12 小时，分离后结晶得到最终偶联物CPT-PEGn-BA，具体操作步骤如下：
其中，n为0-12的整数，m为1-2的整数。
研究表明，本发明的喜树碱与桦木酸的结合物，通过短链PEG连接在一起，使得PEG与药物分子的连接更加精确，不仅提高了该结合物的水溶性，克服了喜树碱和桦木酸不溶于水的缺陷，另一方面使得药物分子精准地连接在PEG链上。
本发明的新型的喜树碱以及桦木酸的结合物可以纯化合物形式或适宜的药物组合物进行给药，可采取任何可接受的给药方式或用于类似用途的试剂进行。因此，本发明的另一个方面是提供包含所述新型衍生物的药物组合物。采用的给药方式可以选择通过口、鼻、直肠、透皮或注射给药方式，其形式为固体、半固体、冻干粉或液体药剂形式给药，例如，片剂、栓剂、丸剂、软和硬明胶胶囊剂、散剂、溶液剂、混悬剂或气雾剂等，优选采用适合用于精确剂量的简单给药的单元剂量方式。组合物可包含常规药用载体或赋形剂作为活性成分(一种或多种)的本发明的新型衍生物，此外，还可以包含其它药剂、载体、辅剂等。
一般地，根据所需给药方式，药学上可接受的组合物将包含约1-99％(重量)的本发明新型结合物、以及99-1％(重量)的适宜的药用赋形剂。优选组合物包含约5-85％的本发明的结合物，其余为适宜的药用赋形剂。
给药途径是注射给药或者口服给药方式，采用常规日剂量方案，该方案可根据疾病的严重程度进行调整。本发明的新型衍生物或者其药学上可接受的盐也可以配制成注射用剂，例如使用1-45％的活性成分分散于可采用液体形式给药的药用辅剂中，实例为水、盐水、含水葡萄糖、甘油、乙醇等，从而形成溶液剂或悬浮剂。可采用液体形式给药的药物组合物例如可通过溶解、分散等手段将本发明的结合物和选择性存在的药用辅剂溶解、分散于载体中，载体的实例为水、盐水、含水葡萄糖、甘油、乙醇等，从而形成溶液剂或混悬剂。本发明的药物组合物还可以包含少量的辅助物质，如润湿剂或乳化剂、PH缓冲剂、抗氧化剂，例如：柠檬酸、脱水山梨单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、丁基化羟基甲苯等。该发明的组合物将含有治疗有效量的本发明结合物，以用于治疗相应的疾病。
下面结合实施例描述本发明的结合物及其制备方法，它不限制本发明，本发明的范围由权利要求限定。
实施例1：
在装有机械搅拌、温度计、氮气包的50ml三口烧瓶中，分别加入3.21克 Boc-NH-PEG3-CH2CH2COOH(10mmol)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)1.83g(15mmol)和二环己基碳二亚胺3.09克(15mmol)以及30ml DMF。氮气保护下，体系在室温25℃温度下搅拌0.5小时。往体系中加入3.48克喜树碱(10mmol)并在30℃继续搅拌5个小时。TLC 跟踪反应进程，反应结束，往反应瓶中加入200ml二氯甲烷，有机相用饱和碳酸氢钠洗涤后干燥并浓缩。粗品通过柱层析(洗脱剂，二氯甲烷：甲醇＝10:1)纯化，得到中间体CPT-CO- CH2CH2-PEG3-NH-Boc共计5.99g，1H NMR(400MHz,DMSO)δ,9.07(s,1H),8.91–8.87 (m,1H),8.56–8.50(m,1H),8.16–8.14(m,1H),7.91–7.85(m,1H),7.75–7.70(m, 1H),7.42(s,1H),6.49(s,1H),4.76-4.73(m,2H),4.24-4.21(t,2H),3.62-3.54(m,12H),3.15(s, 2H),2.47(t,2H),2.02-1.96(m,2H),1.40-1.38(m,9H),0.96–0.93(m,3H).产率为92.4％。
将5.99g中间体CPT-CO-CH2CH2-PEG3-NH-Boc溶于20毫升4mol/l的盐酸水溶液以及4ml甲醇混合溶剂中，TLC跟踪反应，在反应温度为18℃下搅拌7小时反应结束后，往反应瓶中加入碳酸氢钠至反应液饱和。用二氯甲烷萃取反应液，有机相干燥浓缩即得中间体 CPT-CO-CH2CH2-PEG3-NH2共计5.07g.1H NMR(400MHz,DMSO)δ,9.05(s,1H),8.89– 8.86(m,1H),8.55–8.52(m,2H),7.87–7.85(m,1H),7.76–7.73(m,1H),7.40(s,1H), 6.51(s,1H),4.75-4.74(m,2H),4.22-4.19(t,2H),3.58-3.52(m,12H),2.82(t,2H),2.50-2.47 (m,2H),2.04-1.98(m,2H),0.94–0.90(m,3H).收率为98.2％。
氮气保护下，往装有50ml二氯甲烷的100ml三口圆底烧瓶中依次加入4.15g桦木酸(9.1mmol)与2.6g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)和1.57g N- 羟基琥珀酰亚胺(NHS)以及78.26mg三氟甲磺酸钠(0.455mmol)。反应液搅拌0.5小时，加入5gCPT-CO-CH2CH2-PEG3-NH2(9.1mmol)和0.91g三乙胺。反应体系在26℃温度下搅拌1小时。反应结束后直接将有机溶剂减压蒸除，粗产品用快速层析柱分离(二氯甲烷：甲醇＝5:1)后用乙醚重结晶，最终得到红色粉末状固体喜树碱与桦木酸衍生物CPT-CO- CH2CH2-PEG3-BA。产率90.2％，1HNMR(400MHz,DMSO)δ14.0(s,1H),13.3(s,1H),8.70 (s,1H),8.24–8.22(m,1H),8.21–8.18(m,1H),8.15–8.13(m,1H),7.91–7.85(m, 1H),7.75–7.70(m,1H),7.20(s,1H),5.49(s,3H),5.32–5.30(m,3H),3.94–3.88(m, 2H),3.56-3.58(m,12H),3.40(s,2H),3.31(s,9H),2.84–2.77(m,1H),2.72–2.66(m, 1H),2.64–2.55(m,5H),2.39(s,1H),2.18–2.07(m,2H),1.71(s,4H),1.65–1.53(m, 6H),1.51(s,1H),1.47–1.37(m,4H),1.37–1.29(m,1H),1.20–1.06(m,8H),0.96– 0.86(m,8H).LC-MS/MS：MS计算值：990.56；MS实测值：989.07[M-H]-。
实施例2：
在装有机械搅拌、温度计、氮气包的50ml三口烧瓶中，分别加入3.21克 Boc-NH-PEG3-CH2COOH(10mmol)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)1.83g(15mmol)和二环己基碳二亚胺3.09克(15mmol)以及30ml DMF。氮气保护下，体系在室温25℃温度下搅拌 0.5小时。往体系中加入3.48克喜树碱(10mmol)并在50℃继续搅拌1个小时。TLC跟踪反应进程，反应结束，往反应瓶中加入200ml二氯甲烷，有机相用饱和碳酸氢钠洗涤后干燥并浓缩。粗品通过柱层析(洗脱剂，二氯甲烷：甲醇＝10:1)纯化，得到中间体 CPT-CO-CH2-PEG3-NH-Boc-III共计5.88g，1HNMR(400MHz,DMSO)δ,9.09(s,1H),8.90 –8.84(m,1H),8.59–8.54(m,1H),8.18–8.15(m,1H),7.88–7.86(m,1H),7.79– 7.77(m,1H),7.40(s,1H),6.54(s,1H),4.78-4.75(m,2H),4.25-4.22(m,4H),3.59-3.56(m, 12H),3.17(s,2H),2.05-2.02(m,2H),1.40-1.39(m,9H),0.98–0.95(m,3H).产率为 93.1％。
将5.99g中间体CPT-CO-CH2-PEG3-NH-Boc溶于20毫升4mol/l的盐酸水溶液以及4ml 甲醇混合溶剂中，TLC跟踪反应，在温度为20℃下搅拌5小时，反应结束后，往反应瓶中加入碳酸氢钠至反应液饱和。用二氯甲烷萃取反应液，有机相干燥浓缩即得中间体 CPT-CO-CH2-PEG3-NH2-IV共计4.94g.1H NMR(400MHz,DMSO)δ,9.08(s,1H),8.87– 8.84(m,1H),8.60–8.54(m,1H),8.19–8.16(m,1H),7.88–7.86(m,1H),7.79– 7.76(m,1H),7.41(s,1H),6.55(s,1H),4.77-4.75(m,2H),4.25-4.22(m,4H),3.59-3.57(m, 12H),3.17(s,2H),2.05-2.03(m,2H),0.98–0.97(m,3H).收率为99.0％。
氮气保护下，往装有50ml二氯甲烷的100ml三口圆底烧瓶中依次加入4.15g桦木酸(9.1mmol)与2.6g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)和1.57g N- 羟基琥珀酰亚胺(NHS)以及78.26mg三氟甲磺酸钠(0.455mmol)。反应液搅拌0.5小时，加入5gCPT-CO-CH2-PEG3-NH2(9.1mmol)和0.91g三乙胺。反应体系在18℃下搅拌12小时。反应结束后直接将有机溶剂减压蒸除，粗产品用快速层析柱分离(二氯甲烷：甲醇＝5:1) 后用乙醚重结晶，最终得到红色粉末状固体喜树碱与桦木酸衍生物CPT-CO-CH2-PEG3-BA。产率92.4％，1H NMR(400MHz,DMSO)δ14.2(s,1H),13.6(s,1H),8.71(s,1H),8.23– 8.20(m,1H),8.22–8.19(m,1H),8.16–8.15(m,1H),7.94–7.90(m,1H),7.80–7.75 (m,1H),7.23(s,1H),5.46(s,3H),5.31–5.25(m,3H),4.25-4.22(m,2H),3.90–3.86(m, 2H),3.57-3.54(m,12H),3.45(s,2H),3.36(s,9H),2.92–2.87(m,1H),2.76–2.69(m, 1H),2.65–2.61(m,3H),2.38(s,1H),2.19–2.14(m,2H),1.75(s,4H),1.65–1.59(m, 6H),1.55(s,1H),1.45–1.39(m,4H),1.38–1.32(m,1H),1.22–1.09(m,8H),0.95– 0.92(m,8H)。
实施例3：
在装有机械搅拌、温度计、氮气包的50ml三口烧瓶中，分别加入4.53克 Boc-NH-PEG6-CH2CH2COOH(10mmol)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)1.83g(15mmol)和二环己基碳二亚胺3.09克(15mmol)以及30ml DMF。氮气保护下，体系在室温25℃温度下搅拌0.5小时。往体系中加入3.48克喜树碱(10mmol)并在40℃继续搅拌3个小时。TLC 跟踪反应进程，反应结束，往反应瓶中加入200ml二氯甲烷，有机相用饱和碳酸氢钠洗涤后干燥并浓缩。粗品通过柱层析(洗脱剂，二氯甲烷：甲醇＝10:1)纯化，得到中间体CPT-CO- CH2CH2-PEG6-NH-Boc共计7.01g，1H NMR(400MHz,DMSO)δ,9.08(s,1H),8.91–8.88 (m,1H),8.55–8.52(m,1H),8.15–8.14(m,1H),7.90–7.85(m,1H),7.74–7.72(m, 1H),7.43(s,1H),6.50(s,1H),4.75-4.73(m,2H),4.24-4.22(t,2H),3.62-3.54(m,24H),3.16(s, 2H),2.48(t,2H),2.02-1.98(m,2H),1.41-1.36(m,9H),0.97–0.93(m,3H).产率为89.4％。
将5g中间体CPT-CO-CH2CH2-PEG6-NH-Boc溶于20毫升4mol/l的盐酸水溶液以及4ml 甲醇混合溶剂中，TLC跟踪反应。在反应温度为19℃，搅拌时间为6小时，反应结束后，往反应瓶中加入碳酸氢钠至反应液饱和。用二氯甲烷萃取反应液，有机相干燥浓缩即得中间体CPT-CO-CH2CH2-PEG6-NH2共计4.20g.1H NMR(400MHz,DMSO)δ,9.06(s,1H), 8.89–8.87(m,1H),8.54–8.51(m,2H),7.88–7.86(m,1H),7.77–7.72(m,1H), 7.42(s,1H),6.52(s,1H),4.76-4.73(m,2H),4.21-4.19(t,2H),3.59-3.53(m,24H),2.80(t, 2H),2.51-2.47(m,2H),2.05-1.98(m,2H),0.95–0.91(m,3H).收率为96.7％。
氮气保护下，往装有50ml二氯甲烷的100ml三口圆底烧瓶中依次加入4.15g桦木酸(9.1mmol)与2.6g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)和1.57g N- 羟基琥珀酰亚胺(NHS)以及61.88mg氯化锌(0.455mmol)。反应液搅拌1小时，加入5g CPT-CO-CH2CH2-PEG6-NH2(9.1mmol)和0.91g三乙胺。反应体系在温度为22℃下搅拌6.5 小时。反应结束后直接将有机溶剂减压蒸除，粗产品用快速层析柱分离(二氯甲烷：甲醇＝5:1)后用乙醚重结晶，最终得到红色粉末状固体喜树碱与桦木酸衍生物CPT-CO- CH2CH2-PEG6-BA。产率92.3％，1HNMR(400MHz,DMSO)δ14.1(s,1H),13.2(s,1H),8.72 (s,1H),8.25–8.23(m,1H),8.22–8.17(m,1H),8.15–8.14(m,1H),7.92–7.87(m, 1H),7.77–7.72(m,1H),7.23(s,1H),5.48(s,3H),5.33–5.31(m,3H),3.95–3.89(m, 2H),3.56-3.53(m,24H),3.42(s,2H),3.30(s,9H),2.84–2.79(m,1H),2.72–2.68(m,1H), 2.64–2.58(m,5H),2.40(s,1H),2.17–2.07(m,2H),1.72(s,4H),1.66–1.53(m,6H), 1.50(s,1H),1.49–1.39(m,4H),1.36–1.29(m,1H),1.21–1.06(m,8H),0.96– 0.88(m,8H).LC-MS/MS：MS计算值：1122.21；MS实测值：1121.12[M-H]-。
实施例4：
在装有机械搅拌、温度计、氮气包的50ml三口烧瓶中，分别加入4.53克 Boc-NH-PEG6-CH2COOH(10mmol)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)1.83g(15mmol)和二环己基碳二亚胺3.09克(15mmol)以及30ml DMF。氮气保护下，体系在室温25℃温度下搅拌 0.5小时。往体系中加入3.48克喜树碱(10mmol)并在35℃继续搅拌3个小时。TLC跟踪反应进程，反应结束，往反应瓶中加入200ml二氯甲烷，有机相用饱和碳酸氢钠洗涤后干燥并浓缩。粗品通过柱层析(洗脱剂，二氯甲烷：甲醇＝10:1)纯化，得到中间体 CPT-C0-CH2-PEG6-NH-Boc共计6.97g，1H NMR(400MHz,DMSO)δ,9.07(s,1H),8.88– 8.84(m,1H),8.59–8.54(m,1H),8.19–8.16(m,1H),7.88–7.86(m,1H),7.79– 7.77(m,1H),7.40(s,1H),6.53(s,1H),4.78-4.75(m,2H),4.25-4.23(m,4H),3.59-3.55(m, 24H),3.17(s,2H),2.05-2.02(m,2H),1.40-1.39(m,9H),0.97–0.95(m,3H).产率为 91.9％。
将5g中间体CPT-CO-CH2-PEG6-NH-Boc溶于20毫升4mol/l的盐酸水溶液以及4ml甲醇混合溶剂中，TLC跟踪反应。反应结束后，往反应瓶中加入碳酸氢钠至反应液饱和。用二氯甲烷萃取反应液，有机相干燥浓缩即得中间体CPT-CO-CH2-PEG6-NH2-IV共计4.16g.1H NMR(400MHz,DMSO)δ,9.07(s,1H),8.87–8.84(m,1H),8.60–8.54(m,1H),8.19– 8.16(m,1H),7.88–7.86(m,1H),7.79–7.77(m,1H),7.40(s,1H),6.53(s,1H),4.77-4.75 (m,2H),4.24-4.22(m,4H),3.59-3.55(m,24H),3.17(s,2H),2.05-2.03(m,2H),0.98– 0.96(m,3H).产率为98.0％。
氮气保护下，往装有50ml二氯甲烷的100ml三口圆底烧瓶中依次加入4.15g桦木酸(9.1mmol)与2.6g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)和1.57g N- 羟基琥珀酰亚胺(NHS)以及61.88mg氯化锌(0.455mmol)。反应液搅拌1小时，加入5g CPT-PEG6-NH2-IV(9.1mmol)和0.91g三乙胺。反应体系在温度为20℃下搅拌10小时。反应结束后直接将有机溶剂减压蒸除，粗产品用快速层析柱分离(二氯甲烷：甲醇＝5:1) 后用乙醚重结晶，最终得到红色粉末状固体喜树碱与桦木酸衍生物CPT-CO-CH2-PEG6-BA。产率92.6％，1H NMR(400MHz,DMSO)δ14.0(s,1H),13.5(s,1H),8.72(s,1H),8.23– 8.20(m,1H),8.22–8.19(m,1H),8.17–8.15(m,1H),7.94–7.90(m,1H),7.80–7.75 (m,1H),7.22(s,1H),5.46(s,3H),5.30–5.25(m,3H),4.25-4.22(m,2H),3.90–3.86(m, 2H),3.58-3.55(m,24H),3.45(s,2H),3.36(s,9H),2.92–2.87(m,1H),2.76–2.69(m, 1H),2.65–2.61(m,3H),2.38(s,1H),2.19–2.10(m,2H),1.73(s,4H),1.67–1.58(m, 6H),1.55(s,1H),1.45–1.39(m,4H),1.38–1.32(m,1H),1.22–1.09(m,8H),0.95– 0.89(m,8H)。
实施例5：
在装有机械搅拌、温度计、氮气包的50ml三口烧瓶中，分别加入3.21克 Boc-NH-PEG10-CH2CH2COOH(10mmol)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)1.83g(15mmol)和二环己基碳二亚胺3.09克(15mmol)以及30ml DMF。氮气保护下，体系在25℃温度下搅拌 0.5小时。往体系中加入3.48克喜树碱(10mmol)并在45℃继续搅拌2个小时。TLC跟踪反应进程，反应结束，往反应瓶中加入200ml二氯甲烷，有机相用饱和碳酸氢钠洗涤后干燥并浓缩。粗品通过柱层析(洗脱剂，二氯甲烷：甲醇＝10:1)纯化，得到中间体CPT-CO- CH2CH2-PEG10-NH-Boc共计8.99g，1HNMR(400MHz,DMSO)δ,9.08(s,1H),8.87–8.84(m, 1H),8.58–8.54(m,1H),8.18–8.16(m,1H),7.86–7.83(m,1H),7.78–7.75(m, 1H),7.40(s,1H),6.52(s,1H),4.78-4.76(m,2H),4.26-4.23(t,2H),3.59-3.56(m,40H),3.16(s, 2H),2.49(t,2H),2.05-2.03(m,2H),1.41-1.39(m,9H),0.98–0.95(m,3H).产率为93.6％。
将5.25g中间体CPT-CO-CH2CH2-PEG10-NH-Boc溶于20毫升4mol/l的盐酸水溶液以及4ml甲醇混合溶剂中，TLC跟踪反应。反应结束后，往反应瓶中加入碳酸氢钠至反应液饱和。用二氯甲烷萃取反应液，有机相干燥浓缩即得中间体CPT-CO-CH2CH2-PEG10-NH2-IV 共计4.58g.1H NMR(400MHz,DMSO)δ,9.07(s,1H),8.87–8.84(m,1H),8.59– 8.55(m,2H),7.89–7.84(m,1H),7.80–7.77(m,1H),7.36(s,1H),6.57(s,1H),4.77-4.75 (m,2H),4.25-4.22(t,2H),3.62-3.60(m,40H),2.80(t,2H),2.50-2.48(m,2H),2.05-1.99 (m,2H),0.94–0.92(m,3H).收率为97.4％。
氮气保护下，往装有50ml二氯甲烷的100ml三口圆底烧瓶中依次加入4.15g桦木酸(9.1mmol)与2.6g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)和1.57g N- 羟基琥珀酰亚胺(NHS)以及64.16mg三氟化硼乙醚(0.455mmol)。反应液搅拌1小时，加入5gCPT-CO-CH2CH2-PEG10-NH2(9.1mmol)和0.91g三乙胺。反应体系在常温下搅拌 12小时。反应结束后直接将有机溶剂减压蒸除，粗产品用快速层析柱分离(二氯甲烷：甲醇＝5:1)后用乙醚重结晶，最终得到红色粉末状固体喜树碱与桦木酸衍生物CPT-CO- CH2CH2-PEG CH2CH2-BA。产率85.4％，1H NMR(400MHz,DMSO)δ14.1(s,1H),13.4(s,1H), 8.71(s,1H),8.23–8.20(m,1H),8.21–8.19(m,1H),8.17–8.14(m,1H),7.94–7.90(m,1H),7.80 –7.75(m,1H),7.22(s,1H),5.46(s,3H),5.30–5.25(m,3H),3.90–3.88(m,2H),3.58-3.55(m, 40H),3.45(s,2H),3.36(s,9H),2.92–2.87(m,1H),2.76–2.69(m,1H),2.65–2.60(m,5H),2.38(s, 1H),2.19–2.10(m,2H),1.73(s,4H),1.67–1.58(m,6H),1.55(s,1H),1.45–1.39(m,4H),1.38–1.32(m,1H),1.22–1.09(m,8H),0.95–0.89(m,8H).LC-MS/MS：MS计算值：1298.56； MS实测值：1297.65[M-H]-。
实施例6：
在装有机械搅拌、温度计、氮气包的50ml三口烧瓶中，分别加入3.21克 Boc-NH-PEG8-CH2COOH(10mmol)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)1.83g(15mmol)和二环己基碳二亚胺3.09克(15mmol)以及30ml DMF。氮气保护下，体系在室温25℃温度下搅拌 0.5小时。往体系中加入3.48克喜树碱(10mmol)并在35℃继续搅拌2个小时。TLC跟踪反应进程，反应结束，往反应瓶中加入200ml二氯甲烷，有机相用饱和碳酸氢钠洗涤后干燥并浓缩。粗品通过柱层析(洗脱剂，二氯甲烷：甲醇＝10:1)纯化，得到中间体 CPT-CO-CH2-PEG8-NH-Boc共计8.50g，1H NMR(400MHz,DMSO)δ,9.07(s,1H),8.88– 8.84(m,1H),8.59–8.54(m,1H),8.19–8.16(m,1H),7.88–7.86(m,1H),7.79–7.77(m, 1H),7.40(s,1H),6.53(s,1H),4.78-4.75(m,2H),4.25-4.23(m,4H),3.59-3.55(m,32H),3.17(s, 2H),2.05-2.02(m,2H),1.40-1.39(m,9H),0.97–0.95(m,3H).产率为92.2％。
将5.25g中间体CPT-CO-PEG8-NH-Boc-III溶于20毫升4mol/l的盐酸水溶液以及4ml 甲醇混合溶剂中，TLC跟踪反应。反应结束后，往反应瓶中加入碳酸氢钠至反应液饱和。用二氯甲烷萃取反应液，有机相干燥浓缩即得中间体CPT-CO-CH2-PEG8-NH2共计4.52g.1H NMR(400MHz,DMSO)δ,9.07(s,1H),8.87–8.84(m,1H),8.60–8.54(m,1H),8.19–8.16 (m,1H),7.88–7.86(m,1H),7.79–7.77(m,1H),7.40(s,1H),6.53(s,1H),4.77-4.75(m,2H), 4.24-4.22(m,4H),3.59-3.55(m,32H),3.17(s,2H),2.05-2.03(m,2H),0.98–0.96(m, 3H).产率为97.2％。
氮气保护下，往装有50ml二氯甲烷的100ml三口圆底烧瓶中依次加入4.15g桦木酸(9.1mmol)与2.6g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)和1.57g N- 羟基琥珀酰亚胺(NHS)以及64.16mg三氟化硼乙醚(0.455mmol)。反应液搅拌1小时，加入4.92gCPT-CO-CH2-PEG8-NH2(9mmol)和0.91g三乙胺。反应体系在常温下搅拌12 小时。反应结束后直接将有机溶剂减压蒸除，粗产品用快速层析柱分离(二氯甲烷：甲醇＝5:1)后用乙醚重结晶，最终得到红色粉末状固体喜树碱与桦木酸衍生物 CPT-CO-CH2-PEG8-BA。产率88.0％，1HNMR(400MHz,DMSO)δ14.0(s,1H),13.5(s,1H),8.72 (s,1H),8.23–8.20(m,1H),8.22–8.19(m,1H),8.17–8.15(m,1H),7.94–7.90(m, 1H),7.80–7.75(m,1H),7.22(s,1H),5.46(s,3H),5.30–5.25(m,3H),4.25-4.22(m,2H), 3.90–3.86(m,2H),3.58-3.55(m,32H),3.45(s,2H),3.36(s,9H),2.92–2.87(m,1H), 2.76–2.69(m,1H),2.65–2.61(m,3H),2.38(s,1H),2.19–2.10(m,2H),1.73(s,4H), 1.67–1.58(m,6H),1.55(s,1H),1.45–1.39(m,4H),1.38–1.32(m,1H),1.22–1.09 (m,8H),0.95–0.89(m,8H)。
实施例7：
在装有机械搅拌、温度计、氮气包的50ml三口烧瓶中，分别加入3.21克 Boc-NH-PEG12-CH2CH2COOH(10mmol)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)1.83g(15mmol)和二环己基碳二亚胺3.09克(15mmol)以及30ml DMF。氮气保护下，体系在室温25℃温度下搅拌0.5小时。往体系中加入3.48克喜树碱(10mmol)并在35℃继续搅拌2.5个小时。 TLC跟踪反应进程，反应结束，往反应瓶中加入200ml二氯甲烷，有机相用饱和碳酸氢钠洗涤后干燥并浓缩。粗品通过柱层析(洗脱剂，二氯甲烷：甲醇＝10:1)纯化，得到中间体CPT-CO-CH2CH2-PEG12-NH-Boc共计5.32g，1H NMR(400MHz,DMSO)δ,9.08(s,1H),8.88 –8.84(m,1H),8.59–8.56(m,1H),8.18–8.15(m,1H),7.86–7.83(m,1H),7.78–7.75(m,1H),7.40(s,1H),6.52(s,1H),4.78-4.76(m,2H),4.26-4.23(t,2H),3.60-3.56(m, 48H),3.16(s,2H),2.49(t,2H),2.05-2.02(m,2H),1.41-1.39(m,9H),0.98–0.95(m,3H). 产率为95.6％。
将5.3g中间体CPT-CO-CH2CH2-PEG12-NH-Boc溶于20毫升4mol/l的盐酸水溶液以及 4ml甲醇混合溶剂中，TLC跟踪反应。反应结束后，往反应瓶中加入碳酸氢钠至反应液饱和。用二氯甲烷萃取反应液，有机相干燥浓缩即得中间体CPT-CO-CH2CH2-PEG12-NH2-IV 共计5.08g.1H NMR(400MHz,DMSO)δ,9.08(s,1H),8.87–8.84(m,1H),8.59– 8.55(m,2H),7.89–7.85(m,1H),7.80–7.75(m,1H),7.36(s,1H),6.58(s,1H),4.77-4.75 (m,2H),4.25-4.22(t,2H),3.62-3.58(m,40H),2.80(t,2H),2.50-2.48(m,2H),2.05-1.99 (m,2H),0.95–0.92(m,3H).收率为98.3％。
氮气保护下，往装有50ml二氯甲烷的100ml三口圆底烧瓶中依次加入4.15g桦木酸(9.1mmol)与2.6g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)和1.57g N- 羟基琥珀酰亚胺(NHS)以及64.16mg三氟化硼乙醚(0.455mmol)。反应液搅拌1小时，加入5gCPT-CO-CH2CH2-PEG12-NH2(9.1mmol)和0.91g三乙胺。反应体系在常温下搅拌 12小时。反应结束后直接将有机溶剂减压蒸除，粗产品用快速层析柱分离(二氯甲烷：甲醇＝5:1)后用乙醚重结晶，最终得到红色粉末状固体喜树碱与桦木酸衍生物CPT-CO- CH2CH2-PEG12-BA。产率88.9％，1H NMR(400MHz,DMSO)δ14.1(s,1H),13.5(s,1H),8.71 (s,1H),8.23–8.20(m,1H),8.21–8.19(m,1H),8.18–8.14(m,1H),7.94–7.90(m, 1H),7.81–7.75(m,1H),7.24(s,1H),5.46(s,3H),5.31–5.25(m,3H),3.90–3.88(m, 2H),3.59-3.54(m,48H),3.46(s,2H),3.36(s,9H),2.92–2.87(m,1H),2.76–2.69(m, 1H),2.65–2.60(m,5H),2.38(s,1H),2.19–2.10(m,2H),1.73(s,4H),1.67–1.59(m, 6H),1.56(s,1H),1.45–1.39(m,4H),1.38–1.32(m,1H),1.22–1.15(m,8H),0.92– 0.89(m,8H)。
实施例8：
在装有机械搅拌、温度计、氮气包的50ml三口烧瓶中，分别加入3.21克 Boc-NH-PEG12-CH2COOH(10mmol)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)1.83g(15mmol)和二环己基碳二亚胺3.09克(15mmol)以及30ml DMF。氮气保护下，体系在室温25℃温度下搅拌 0.5小时。往体系中加入3.48克喜树碱(10mmol)并在40℃继续搅拌1.5个小时。TLC跟踪反应进程，反应结束，往反应瓶中加入200ml二氯甲烷，有机相用饱和碳酸氢钠洗涤后干燥并浓缩。粗品通过柱层析(洗脱剂，二氯甲烷：甲醇＝10:1)纯化，得到中间体 CPT-CO-CH2-PEG12-NH-Boc共计5.56g，1H NMR(400MHz,DMSO)δ,9.07(s,1H),8.88 –8.84(m,1H),8.59–8.54(m,1H),8.19–8.16(m,1H),7.89–7.86(m,1H),7.79– 7.75(m,1H),7.40(s,1H),6.53(s,1H),4.78-4.75(m,2H),4.25-4.22(m,4H),3.59-3.55(m, 48H),3.17(s,2H),2.05-2.02(m,2H),1.40-1.39(m,9H),0.97–0.94(m,3H).产率为 92.2％。
将5.25g中间体CPT-CO-CH2-PEG12-NH-Boc溶于20毫升4.5mol/l的盐酸水溶液以及 4ml甲醇混合溶剂中，TLC跟踪反应。反应结束后，往反应瓶中加入碳酸氢钠至反应液饱和。用二氯甲烷萃取反应液，有机相干燥浓缩即得中间体CPT-CO-CH2-PEG12-NH2共计 4.40g.1H NMR(400MHz,DMSO)δ,9.07(s,1H),8.87–8.84(m,1H),8.60–8.54(m, 1H),8.19–8.16(m,1H),7.88–7.86(m,1H),7.79–7.77(m,1H),7.40(s,1H),6.53(s, 1H),4.77-4.75(m,2H),4.24-4.22(m,4H),3.59-3.55(m,48H),3.17(s,2H),2.05-2.03(m, 2H),0.98–0.96(m,3H).产率为98.0％。
氮气保护下，往装有50ml二氯甲烷的100ml三口圆底烧瓶中依次加入4.15g桦木酸(9.1mmol)与2.6g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)和1.57g N- 羟基琥珀酰亚胺(NHS)以及64.16mg三氟化硼乙醚(0.455mmol)。反应液搅拌1.5小时，加入4.92g CPT-CO-CH2-PEG8-NH2(9mmol)和0.91g三乙胺。反应体系在常温下搅拌12 小时。反应结束后直接将有机溶剂减压蒸除，粗产品用快速层析柱分离(二氯甲烷：甲醇＝5:1)后用乙醚重结晶，最终得到红色粉末状固体喜树碱与桦木酸衍生物 CPT-CO-CH2-PEG12-BA。产率90.0％，1H NMR(400MHz,DMSO)δ13.8(s,1H),13.3(s,1H), 8.73(s,1H),8.23–8.20(m,1H),8.22–8.18(m,1H),8.17–8.14(m,1H),7.94– 7.90(m,1H),7.80–7.75(m,1H),7.22(s,1H),5.46(s,3H),5.31–5.25(m,3H), 4.25-4.22(m,2H),3.90–3.86(m,2H),3.58-3.55(m,48H),3.46(s,2H),3.37(s,9H),2.92– 2.87(m,1H),2.76–2.69(m,1H),2.65–2.61(m,3H),2.38(s,1H),2.19–2.10(m,2H), 1.73(s,4H),1.67–1.58(m,6H),1.55(s,1H),1.45–1.39(m,4H),1.38–1.32(m,1H), 1.22–1.12(m,8H),0.95–0.90(m,8H)。

Claims (16)

1.一种喜树碱与桦木酸结合物，其特征在于，所述喜树碱与桦木酸结合物的结构式为
(I)
其中n为0-12的整数，m为1-2的整数。
2.制备如权利要求1所述的一种喜树碱与桦木酸结合物的制备方法，其特征在于，将喜树碱与桦木酸通过一个短链PEG连接，包括以下步骤：
1)首先将喜树碱和(II):R1-PEGn-R2在第一缩合剂作用下，得到中间体(III):CPT-PEGn-R1；
(II):(III):
其中，n是0-12的整数，m为1-2的整数，R1是连接有叔丁氧羰基的氨基，R2＝(CH2)mCOOH，R3＝(CH2)mCO。
2)将(III)脱去叔丁氧羰基得到(IV):CPT-PEGn-NH2；
(IV)：
其中，n是0-12的整数，m为1-2的整数。
3)在惰性气体保护条件下，将桦木酸、第二缩合剂及路易斯酸在二氯甲烷中搅拌，加入(IV)及三乙胺，搅拌分离后结晶得到最终偶联物(I):CPT-PEGn-BA。
3.根据权利要求2所述的一种喜树碱与桦木酸结合物的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的第一缩合剂为二环己基碳二亚胺及4-二甲氨基吡啶。
4.根据权利要求2所述的一种喜树碱与桦木酸结合物的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的喜树碱和(II)在第一缩合剂作用下，在有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺中于温度范围30-50℃，反应1-5小时得到中间体(III)。
5.根据权利要求4所述的一种喜树碱与桦木酸结合物的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的喜树碱和(II)在第一缩合剂作用下，在有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺中于温度范围35-45℃，反应2-3小时得到中间体(III)。
6.根据权利要求4所述的一种喜树碱与桦木酸结合物的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中的Boc-NH-PEGn-(CH2)mCOOH、喜树碱、二环己基碳二亚胺以及4-二甲氨基吡啶的摩尔比为2:2:3:3。
7.根据权利要求2所述的一种喜树碱与桦木酸结合物的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中的脱去叔丁氧羟基的过程是在有机溶剂为体积比是5:1的盐酸与甲醇的混合溶剂中进行的，所述盐酸为3.5-4.5mol/l的稀盐酸。
8.根据权利要求2所述的一种喜树碱与桦木酸结合物的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中的反应是(III)在温度为18-20℃条件下搅拌5-7小时制得(IV)。
9.根据权利要求2所述的一种喜树碱与桦木酸结合物的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中(IV)是在有机溶剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐中反应温度为18-26℃条件下搅拌1-12h反应制得(I)。
10.根据权利要求2所述的一种喜树碱与桦木酸结合物的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中的路易斯酸为三氟甲磺酸钠，氯化锌，三氟化硼乙醚中的一种或多种。
11.根据权利要求2所述的一种喜树碱与桦木酸结合物的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中的第二缩合剂为N-羟基琥珀酰亚胺。
12.根据权利要求2所述的一种喜树碱与桦木酸结合物的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中的桦木酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、CPT-PEGn-NH2以及路易斯酸、三乙胺的摩尔比为2:3:3:2:0.1:2。
13.根据权利要求1-12中任意一项中所述的喜树碱与桦木酸结合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
14.一种抗肿瘤药物制剂，其特征在于，所述抗肿瘤药物制剂含有占该制剂总重量1-99％的如权利要求12中所述的喜树碱与桦木酸结合物。
15.根据权利要求14所述的抗肿瘤药物制剂，其中，如权利要求1-12中任意一项所述的喜树碱与桦木酸的结合物占该制剂总重量的5-85％(重量)。
16.根据权利要求15所述的抗肿瘤制剂，其特征在于，所述的制剂为口服剂或者注射剂。
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