CN104788669A

CN104788669A - 新型水溶性聚乙二醇偶联的羟基喜树碱衍生物及其应用

Info

Publication number: CN104788669A
Application number: CN201510181114.5A
Authority: CN
Inventors: 郁彭; 郭娜; 滕玉鸥; 江都; 王璐瑶; 吴丹
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2015-04-15
Filing date: 2015-04-15
Publication date: 2015-07-22

Abstract

本发明涉及一类新型水溶性聚乙二醇偶联的羟基喜树碱衍生物及其应用，结构通式为MPEG-X-H或H-X-PEG-X-H，X是连接基团，例如缬氨酸，H是药物分子，例如羟基喜树碱等，同时涉及前药的合成及其在37℃磷酸缓冲溶液条件下原药的释放。所合成的化合物针对人白血病细胞(K562)、人结肠癌细胞(HT-29)和人肝癌细胞(HepG2)进行了体外肿瘤细胞抑制活性的测试，结果显示这类化合物有着显著的抗肿瘤活性，并且数据显示羟基喜树碱的释放速率和体外活性与所连接的PEG长度以及连接方式密切相关。本发明所述化合物在抗肿瘤药物开发应用方面具有广阔的前景。

Description

新型水溶性聚乙二醇偶联的羟基喜树碱衍生物及其应用

技术领域

本发明属于新化合物合成和药物应用领域，涉及一类新型水溶性聚乙二醇偶联的羟基喜树碱前药：聚乙二醇单甲醚或聚乙二醇与羟基喜树碱类药物的结合物(MPEG-X-H orH-X-PEG-X-H)。

技术背景

喜树碱是从我国内地特有的珙桐科植物喜树的皮、果实中提取得到的一类生物碱。它对治疗多种恶性肿瘤具有显著疗效。研究表明喜树碱及其衍生物可通过作用于DNA拓扑异构酶I来抑制DNA复制、转录和有丝分裂。

目前喜树碱类药物已成为抗肿瘤治疗的主力品种之一，被誉为21世纪的抗癌药。但临床使用中也发现喜树碱的毒副作用较大，易出现呕吐、腹泻、骨髓抑制等副作用。因此寻找毒副作用小、抗癌谱广的喜树碱类似物的研究倍受人们的关注。人们以喜树碱为原料，通过半合成的方法得到许多喜树碱类似物，并从中筛选出了一系列抗癌活性高、毒副作用低的喜树碱衍生物，成为世界抗肿瘤药物市场上的亮点。10-羟基喜树碱是喜树碱的一种天然类似物，它抗癌活性明显高于喜树碱，但它也有一定的毒性，副作用较多，水溶性较差且体内代谢不稳定。目前市场上的羟基喜树碱类药物都是通过注射进入人体发挥作用的。

纳米载体已经被广泛用于抗癌药物的转运来提高药物在水中溶解度和肿瘤的靶向性，并大大提高药物的生物利用度和治疗效果。因此，将纳米载体引入羟基喜树碱的衍生化当中，可以显著提高羟基喜树碱在临床上的优势。通常在高分子前药的制备中，选用的载体有右旋糖酐、血清蛋白、聚乙二醇等，其中聚乙二醇因其中性、低毒等理化性质和良好生物相容性，是FDA批准的可药用聚合物之一，它经常被应用于连接抗癌药物和治疗性蛋白，以提高药物的溶解度、生物利用度。

据检索，发现如下与本申请相关的专利文献，具体公开内容如下：

CN101199857公开了一种新型的基于两亲性嵌段聚合物的喜树碱前体药物：甲氧基聚乙二醇-聚乳酸与喜树碱类药物的结合物(MPEG-X-PLA-T)。MPEG是甲氧基聚乙二醇。X是连接基团,例如丁二酸等。PLA是聚乳酸。T是药物分子,例如喜树碱、10-羟基喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱等喜树碱类药物。聚乳酸与喜树碱类药物通过酯键相连接。

CN1708540提供喜树碱的水溶性衍生物,它具有优异的治疗效果,适合用于癌症的化学治疗。也就是说,喜树碱的水溶性高分子等衍生物,通过聚乙二醇-聚羧酸聚合物中的羧酸基团与酚喜树碱中的酚羟基之间的酯连接而获得,具有优良的持续释放效果。

CN102336904A本发明涉及通式(I)的一种喜树碱及其衍生物的多价PEG修饰物及其用途,式中:POLY表示聚乙二醇(PEG)残基,分子量为200至100000Da；X表示氨基或氧；Y表示含有双氨基的氨基酸结构化合物,其羧基与X成酰胺键或酯键,向远端引出多胺基功能基；n和m表示Y的聚合度,为1至12的任一整数,r和t表示连接臂亚甲基的个数,为1至12的任一整数,D为喜树碱类化合物被酯化后的残基。

本申请在现有专利的基础上提供了一种新的羟基喜树碱衍生物，扩大了羟基喜树碱的用途。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型水溶性聚乙二醇偶联的羟基喜树碱衍生物及其应用，提供了溶解度和抗癌活性均优于羟基喜树碱的化合物。

本法实现目的的技术方案如下：

一种新型水溶性聚乙二醇偶联的羟基喜树碱衍生物，结构通式如下

MPEG-X-H或H-X-PEG-X-H

MPEG是聚乙二醇单甲醚，PEG是聚乙二醇；

X是连接基团；

H是羟基喜树碱类药物分子。

而且，所述聚乙二醇单甲醚和聚乙二醇的分子量范围为300至50000。

而且，连接基团包括是缬氨酸、丙氨酸、半光氨酸等氨基酸和碳酸酯等基团。

而且，羟基喜树碱类药物包括喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱、10-羟基喜树碱等。

新型水溶性聚乙二醇偶联的羟基喜树碱衍生物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。

而且，所述肿瘤包括人肝癌、人白血病和人结肠癌等。

新型水溶性聚乙二醇偶联的羟基喜树碱衍生物在37℃下磷酸缓冲溶液pH＝7.4里羟基喜树碱的释放。

而且，所述化合物为下列化合物之一：

本发明的优点和积极效果：

1、本发明以羟基喜树碱、聚乙二醇单甲醚或聚乙二醇、叔丁氧羰基保护的缬氨酸为原料，经过一系列反应首次合成出具有生物活性的聚乙二醇偶联的羟基喜树碱前药，并对其进行了体外肿瘤细胞抑制活性的测试，结果显示这类衍生物对人白血病细胞(K562)、人结肠癌细胞(HT-29)和人肝癌细胞(HepG2)具有较好的抑制活性，具有抗肿瘤活性，其中发现了溶解度和抗癌活性均优于羟基喜树碱的化合物，同时表明抗癌活性以及原药释放速率与连接的PEG长度、连接基团类型之间有着密切关系。

2、本发明提供的合成方法具有合成路线短、操作简单、反应条件温和、合成工艺和纯化方法简单等优点。

3、本发明所涉及的化合物具有抑制或杀灭肿瘤细胞的作用，可进一步用于研究制备治疗人肝癌、人白血病和人结肠癌抗肿瘤药物及相关治疗试剂。

具体的实施方式

为了理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明所述的新型水溶性聚乙二醇偶联的羟基喜树碱衍生物(一类新型水溶性聚乙二醇偶联的羟基喜树碱前药)的代表性结构如下：

上述化合物的合成路线如下：

第一类型、聚乙二醇单甲醚-缬氨酸-10-喜树碱和聚乙二醇-缬氨酸-10-羟基喜树碱的合成，反应式如下：

试剂:(a)Et₃N,THF；(b)EDCI,DMAP；(c)TFA,DCM；(d)DMF,DCM.

第二类型、

试剂:(a)Et₃N,DCM；(b)HCPT,Et₃N,DMF.

第三类型：

试剂:(a)TsCl,Et₃N,DCM；(b)LiBr,Acetone；(c)HCPT,K₂CO₃,DMSO.

第一部分，下面通过实施例具体说明合成过程和方法。

实施例1

(1)10-(4-硝基碳酸苯酯)-喜树碱(1a)的合成

取10-羟基喜树碱3g(8.23mmol)溶于600mL无水四氢呋喃中，于冰浴下加入三乙胺11.5mL(82.3mmol)，再加入对硝基氯甲酸苯酯6.64g(32.9mmol)，在室温下反应1h。直接减压旋干反应液，用乙酸乙酯，200-300目硅胶柱层析，再用二氯甲烷和正己烷重结晶得白色固体3.59g，投下一步无须进一步纯化，粗产率82.3％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):8.74(s,1H),8.40(d,J＝9.2Hz,2H),8.30(d,J＝9.2Hz,1H),8.20(d,J＝2.4Hz,1H),7.97–7.80(m,1H),7.78(d,2H,J＝9.2Hz),7.37(s,1H),6.54(s,1H),5.44(s,2H),5.32(s,2H),1.85–1.92(m,2H),0.89–0.92(m,3H).

(2)N-叔丁氧羰基缬氨酸聚乙二醇单甲醚酯(2a-2c)和N-叔丁氧羰基缬氨酸聚乙二醇酯(2d-2f)的合成

取N-Boc-L-缬氨酸1.19g(5.47mmol)溶于15ml二氯甲烷中，冰浴下加入4-二甲氨基吡啶76mg(0.622mmol)，分批加入EDCI 1.15g(6mmol)，活化10min之后再加入(2.5mmol)聚乙二醇单甲醚或(1.25mmol)聚乙二醇,室温反应过夜。TLC检测反应完全后,向反应混合物中加入加入二氯甲烷，先后用饱和NaHCO3溶液、0.1N HCl溶液、饱和NaCL溶液洗涤，无水NaSO4干燥，减压旋干二氯甲烷，乙醚重结晶,产率2a-2f(85％-90.5％)。

(3)叔丁氧羰基的脱除

取2a-2f溶于5ml二氯甲烷，冰浴下滴加4.56ml TFA，室温反应1h。TLC检测反应完全后，加水，二氯甲烷萃取，有机相在冰浴下加入饱和NaHCO₃,调节PH＝8,合并有机相，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压旋干二氯甲烷，乙醚重结晶得化合物3a-3f，产率(87％-94％)。

MPEG₃₅₀-Val(3a):¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):4.18-4.23(m,1H),4.09-4.15(m,1H),3.62-3.41(s,mPEG),3.24(s,3H),3.14(d,J＝5.6Hz,1H),1.96(s,2H),1.88-1.82(m,1H),0.88(d,J＝6.8Hz,3H),0.83(d,J＝6.8Hz,3H).

MPEG₂₀₀₀-Val(3b):¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):4.18-4.23(m,1H),4.09-4.15(m,1H),3.69-3.41(s,mPEG),3.24(s,3H),3.15(d,J＝8.0Hz,1H),2.05(s,2H),1.87-1.82(m,1H),0.88(d,J＝6.8Hz,3H),0.83(d,J＝6.8Hz,3H).

MPEG₅₀₀₀-Val(3c):¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):4.18-4.23(m,1H),4.09-4.15(m,1H),3.78-3.36(s,PEG),3.24(s,3H,CH₃O-),3.15(d,J＝5.3Hz,1H),1.86-1.80(m,1H),0.88(d,J＝6.8Hz,3H),0.83(d,J＝6.8Hz,3H).

Val-PEG₂₀₀₀-Val(3d):¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):4.18-4.23(m,2H),4.09-4.14(m,2H),3.69-3.41(s,PEG),3.13(d,J＝5.2Hz,2H),1.86-1.81(m,2H),1.76(s,4H),0.87(d,J＝6.8Hz,6H),0.82(d,J＝6.8Hz,6H).

Val-PEG₂₀₀₀₀-Val(3e):¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):4.12-4.21(m,4H),3.70-3.35(s,PEG),3.15(d,J＝4.0Hz,2H),1.86-1.90(m,6H),0.90(d,J＝6.6Hz,6H),0.85(d,J＝6.6Hz,6H).

Val-PEG₃₀₀-Val(3f):¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):4.10-4.23(m,4H),3.60(t,J＝4.8Hz,2H),3.51(s,PEG),3.12(d,J＝5.6Hz,2H),1.79-1.86(m,6H),0.87-0.89(dd,J＝6.4,4.0Hz,6H),0.82-0.84(d,J＝6.8Hz,6H).

(4)聚乙二醇单甲醚-缬氨酸-10-喜树碱和聚乙二醇-缬氨酸-10-羟基喜树碱的合成

取10-(4-硝基碳酸苯酯)-喜树碱0.57g(1.08mmol)溶于3ml无水DMF和3m无水DCM,再加入3a-3f(0.71mmol)室温反应1h。TLC检测反应完全后，直接用100％乙酸乙酯，二氯甲烷:甲醇＝30:1，200-300目硅胶柱层析纯化，再乙醚重结晶得4a-4f，产率63％-67％。

MPEG₃₅₀-Val-HCPT(4a)¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):8.68(s,1H),8.43(d,J＝8.0Hz,1H),8.18(d,J＝9.2Hz,1H),7.92(d,J＝2.0Hz,1H),7.63-7.66(dd,J＝9.2,2.4Hz,1H),7.34(s,1H),6.52(s,1H),5.43(s,2H),5.30(s,2H),4.28-4.33(m,1H),4.18-4.22(m,1H),4.03-4.07(m,1H),3.49-3.66(s,mPEG),3.23(s,3H),2.14-2.17(m,1H),1.84–1.91(m,2H),0.98-1.01(m,6H),0.89(t,J＝7.2Hz,3H).

MPEG₂₀₀₀-Val-HCPT(4b)¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):8.68(s,1H),8.44(d,J＝8.4Hz,1H),8.19(d,J＝9.2Hz,1H),7.92(d,J＝2.4Hz,1H),7.63-7.66(dd,J＝9.2,2.8Hz,1H),7.35(s,1H),6.53(s,1H),5.43(s,2H),5.30(s,2H),4.28-4.32(m,1H),4.17-4.21(m,1H),4.02-4.06(m,1H),3.41-3.68(s,mPEG),3.24(s,3H),2.13-2.18(m,1H),1.84–1.91(m,2H),0.98-1.01(m,6H),0.89(t,J＝7.2Hz,3H).

MPEG₅₀₀₀-Val-HCPT(4c)¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):8.69(s,1H),8.44(d,J＝8.0Hz,1H),8.19(d,J＝8.8Hz,1H),7.91(s,,1H),7.65(d,J＝7.6Hz,1H),7.35(s,1H),6.54(s,1H),5.43(s,2H),5.30(s,2H),4.29-4.32(m,1H),4.17-4.20(m,1H),4.03-4.06(m,1H),3.44-3.68(s,mPEG),3.24(s,3H),2.14-2.18(m,1H),1.86–1.89(m,2H),0.98-1.01(m,6H),0.89(t,J＝7.2Hz,3H).

HCPT-Val-PEG₂₀₀₀-Val-HCPT(4d)¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):8.68(s,2H),8.43(d,J＝8.0Hz,2H),8.19(d,J＝9.2Hz,2H),7.91(d,J＝2.4Hz,2H),7.63-7.66(dd,J＝9.2,2.4Hz,2H),7.35(s,2H),6.53(s,2H),5.43(s,4H),5.30(s,4H),4.28-4.32(m,2H),4.17-4.20(m,2H),4.02-4.06(m,2H),3.45-3.66(s,PEG),2.13-2.18(m,2H),1.84-1.91(m,4H),0.98-1.01(m,12H),0.89(t,J＝7.2Hz,6H).

HCPT-Val-PEG₂₀₀₀₀-Val-HCPT(4e)¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):8.70(s,2H),8.45(d,J＝7.2Hz,2H),8.20(d,J＝8.8Hz,2H),7.93(s,2H),7.65-7.67(d,J＝7.6,2H),7.37(s,2H),6.55(s,2H),5.44(s,4H),5.32(s,4H),4.21-4.31(m,4H),4.06-4.08(m,2H),3.52-3.69(s,PEG),2.17-2.18(m,2H),1.89(m,4H),1.01(m,12H),0.83(t,J＝7.2Hz,6H).

HCPT-Val-PEG300-Val-HCPT(4f)¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):8.66(s,2H),8.44(d,J＝8.0Hz,2H),8.17(d,J＝8.8Hz,2H),7.90(s,2H),7.63(d,J＝8.4,2H),7.34(s,2H),6.53(s,2H),5.43(s,4H),5.28(s,4H),4.18-4.33(m,4H),4.03-4.07(m,2H),3.50-3.65(s,PEG),2.16-2.17(m,2H),1.85-1.91(m,4H),0.98-1.00(m,12H),0.89(t,J＝7.2Hz,6H).

(5)4-硝基碳酸苯酯-聚乙二醇单甲醚2000(1b)的合成

取3g(1.5mmo)l聚乙二醇单甲醚2000溶于15ml无水DCM,加入4.2ml(30mmol)三乙胺，冰浴下加入1.21g(6mmol)对硝基氯甲酸苯酯，室温反应3h。TLC检测反应完全后，直接用二氯甲烷:甲醇＝25:1，200-300目硅胶柱层析纯化，乙醚重结晶得2.6g(1.2mmol)固体，产率80％

1b(2.6g,80％yield).¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):8.32(d,J＝9.2Hz,2H),7.57(d,J＝9.2Hz,2H),4.38-4.36(m,2H),3.71-3.42(s,mPEG),3.24(s,3H).

(6)化合物5的合成

取HCPT 0.15g(0.41mmol)溶于3mll无水DMF,加入0.24ml三乙胺，再加入0.58g(0.267mmo)化合物8-1，60℃反应45min。TLC检测反应完全后，反应液中加水，再用DCM萃取，无水硫酸钠干燥，用100％乙酸乙酯、二氯甲烷:甲醇＝25:1，200-300目硅胶柱层析纯化，乙醚重结晶得0.35g(0.146mmol)固体，产率55％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):8.70(s,1H),8.24(d,J＝9.2Hz,1H),8.05(d,J＝2.4Hz,1H),7.78-7.81(dd,J＝9.2,2.4Hz,2H),7.36(s,1H),6.55(s,1H),5.44(s,2H),5.31(s,2H),4.39(t,2H),3.75-3.41(s,mPEG),3.24(s,3H),1.82-1.93(m,2H),0.89(t,J＝7.2Hz,3H).

(7)化合物7的合成

取3g(1.5mmol)聚乙二醇单甲醚2000溶于15ml无水二氯甲烷，冰浴下加入4.2mlTEA(29.8mmol)和对甲基苯磺酰氯0.9g(5.1mmol)。回流反应5h，TLC检测反应完全后，减压旋蒸溶液得到油状液体，再加入乙酸乙酯和1N HCl，收集水相，再用二氯甲烷萃取产品，合并有机相，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压旋干二氯甲烷，乙醚重结晶得3g,产率91％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):7.78(d,J＝8.4Hz,2H),7.48(d,J＝8.0Hz,2H),4.11(t,J＝4.4Hz,2H),3.69-3.45(s,mPEG),3.24(s,3H),2.42(s,3H).

(8)化合物8的合成

取3g(1.4mmol)化合物7溶于15ml无水丙酮，再加入LiBr 0.6g(7mmol)。60℃回流过夜。TLC检测反应完全后，直接用二氯甲烷:甲醇＝25:1，200-300目硅胶柱层析纯化，再乙醚重结晶得2.3g固体，产率80％。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):3.80-3.77(t,J＝5.8Hz,2H),3.75-3.73(t,J＝4.8Hz,2H),3.69-3.45(s,mPEG),3.30(s,3H,CH₃O-).

(9)化合物6的合成

取HCPT 0.35g(0.96mmol)，碳酸钾0.27g(1.95mmol)溶于2.5ml无水DMSO,搅拌溶解。再加入1g(0.48mmol)化合物6-1，60℃反应3h。TLC检测反应完全后，过滤，滤液直接用100％乙酸乙酯、二氯甲烷:甲醇＝25:1，200-300目硅胶柱层析纯化，乙醚重结晶得0.65g(0.275mmol)固体，产率57％

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):8.52(s,1H),8.06(d,J＝9.2Hz,1H),7.53(s,1H),7.51(d,J＝2.8Hz,1H)7.28(s,1H),6.50(s,1H),5.42(s,2H),5.26(s,2H),4.29(t,J＝4.2Hz,2H),3.85(t,J＝4.2Hz,2H),3.41-3.68(s,mPEG),3.24(s,3H),1.83–1.90(m,2H),0.89(t,J＝7.2Hz,3H).

第二部分，活性验证

所合成的衍生物的抗肿瘤活性测定

(1)溶液的配制：

DMEM low glucose培养液的配制：购买HyClone MEM low glucose培养基，每瓶500mL，加入10％的胎牛血清和1％的青链霉素溶液，即每瓶培养基加入50mL的胎牛血清和5mL的青链霉素，培养基的配置在超净工作台中进行，后放置冰箱4℃保存。

DMEM/F-12培养液的配制：购买HyClone MEM/F-12培养基，每瓶500mL，加入10％的胎牛血清和1％的青链霉素溶液，即每瓶培养基加入50mL的胎牛血清和5mL的青链霉素，培养基的配置在超净工作台中进行，后放置冰箱4℃保存。

PBS缓冲液的配制：在1000mL锥形瓶中，称取氯化钠8g，氯化钾0.2g，十二水合磷酸氢二钠2.9g，磷酸二氢钾0.2g，加入800mL纯净水充分搅拌溶解后定容至1000mL，高压灭菌后放置冰箱4℃保存。

MTT溶液的配制：称取MTT干粉0.5g，溶于100mL PBS缓冲液中，用0.22μM滤膜过滤除菌后，放置冰箱-12℃保存。

(2)抗肿瘤活性测定的具体步骤：

本发明抗肿瘤活性测定所用3种肿瘤细胞：人肝癌细胞(HepG2)、白血病细胞(K562)和人结肠癌细胞(HT-29)。

利用人肝癌细胞HepG2活性测试

HepG2细胞使用的培养液为含1％的青霉素-链霉素溶液，10％的胎牛血清的DMEM细胞培养液，培养条件为37℃、含5％CO₂的恒温培养箱。具体步骤：

1)用血球计数板对细胞进行计数后，用DMEM low glucose培养液将其稀释至5x10⁴个/mL；

2)在96孔板的每个孔里加入100μL细胞悬液吹打混匀，培养箱37℃温育24h；

3)将所要测试化合物稀释至5种浓度：2mM,0.2mM,20μM,2μM,0.2μM，按照浓度依次加药0.5μL/孔，培养箱37℃温育48h；

4)加入浓度为5mg/mL的MTT，培养箱37℃温育4h；

5)加DMSO将细胞溶解，酶标仪测定在490nm和630nm下的OD值；

6)处理数据，根据OD值计算IC₅₀值。

利用人白血病细胞K562活性测试

K562细胞使用的培养液为含1％的青霉素-链霉素溶液，10％的胎牛血清的PRMI1640细胞培养液，培养条件为37℃、含5％CO₂的恒温培养箱。具体步骤：

1)用血球计数板对细胞进行计数后，用RPMI培养液将其稀释至5x10⁴个/mL；

2)在96孔板的每个孔里加入100μL细胞悬液，培养箱37℃温育2h；

4)加入浓度为5mg/mL的MTT，培养箱37℃温育4小时；

5)加异丙醇与盐酸裂解液，酶标仪测定在570nm和630nm下的OD值；

6)处理数据，根据OD值计算IC₅₀值。

利用人白血病细胞HT-29活性测试

HT-29细胞使用的培养液为含1％的青霉素-链霉素溶液，10％的胎牛血清的DMEM/F-12细胞培养液，培养条件为37℃、含5％CO₂的恒温培养箱。具体步骤：

1)用血球计数板对细胞进行计数后，用DMEM/F-12培养液将其稀释至5x10⁴个/mL；

4)加入浓度为5mg/mL的MTT，培养箱37℃温育4h；

5)加DMSO将细胞溶解，酶标仪测定在490nm和630nm下的OD值；

6)处理数据，根据OD值计算IC₅₀值。

表1 体外抗肿瘤活性测试结果

由上表可知，以缬氨酸为连接基团的前药(4a-4f)显示出与羟基喜树碱相当或更高(2-5倍)的抗增殖活性。最有效的单价化合物是含有一个短的mPEG链的4a，而4b和4c的活性和羟基喜树碱相当。化合物4d-4f的IC₅₀值均低于羟基喜树碱。相比于缬氨酸为连接桥的缀合物，化合物5和6活性显著降低。

第三部分，稳定性测试

各化合物溶解在PBS(pH7.4)中，在37℃下，分别在1，2，3和4小时进行取样分析。用C₁₈分析柱进行HPLC检测，流动相以水和乙腈(60:40)，流速为1.0mL·min^-1，检测波长为360nm。

表2 HCPT释放情况(pH 7.4)

从上述结果可以看出，这些化合物的体外稳定性与PEG长度以及连接桥类型有着密切关系。对于缬氨酸为连接桥的化合物4a-4f来说，连有相对较短链PEG的单价化合物4a和二价化合物4f显示了羟基喜树碱控释的性能，尤其是4f，其释放羟基喜树碱的速率比化合物6还要低。

综合考虑化合物体外稳定性和抗肿瘤活性结果，申请人推测单价偶联物4b和4c的活性形式是羟基喜树碱，因为它们在很短的时间内就释放了几乎全部羟基喜树碱，同时它们的抗肿瘤活性也与羟基喜树碱相当。类似地，二价偶联物4d和4e也在很短时间内将羟基喜树碱释放完全，而他们的体外活性优于羟基喜树碱的原因可能主要是由于二价效应。化合物5和6的活性明显降低，尤其是化合物6，其可能的原因是它们本身不具有明显活性，而他们释放羟基喜树碱的速率又明显低于其它化合物。值得注意的是，连有较短PEG以及以缬氨酸为连接桥的化合物4a和4f，具有较好活性的同时还具有较慢的羟基喜树碱释放速度，尤其是化合物4f，其可能的原因是化合物本身仍可以与羟基喜树碱的靶点拓扑异构酶I相互作用，从而具有抗肿瘤活性。

Claims

1.一种新型水溶性聚乙二醇偶联的羟基喜树碱衍生物，其特征在于：结构通式如下

MPEG-X-H或H-X-PEG-X-H

MPEG是聚乙二醇单甲醚，PEG是聚乙二醇；

X是连接基团；

H是羟基喜树碱类药物分子。

2.根据权利要求1所述的新型水溶性聚乙二醇偶联的羟基喜树碱衍生物，其特征在于：所述聚乙二醇单甲醚和聚乙二醇的分子量范围为300至50000。

3.根据权利要求1所述的新型水溶性聚乙二醇偶联的羟基喜树碱衍生物，其特征在于：连接基团包括是缬氨酸、丙氨酸、半光氨酸等氨基酸和碳酸酯等基团。

4.根据权利要求1所述的新型水溶性聚乙二醇偶联的羟基喜树碱衍生物，其特征在于：羟基喜树碱类药物包括喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱、10-羟基喜树碱等。

5.权利要求1所述的新型水溶性聚乙二醇偶联的羟基喜树碱衍生物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述肿瘤包括人肝癌、人白血病和人结肠癌等。

7.权利要求1所述的新型水溶性聚乙二醇偶联的羟基喜树碱衍生物在37℃下磷酸缓冲溶液pH＝7.4里羟基喜树碱的释放。

8.根据权利要求1所述的新型水溶性聚乙二醇偶联的羟基喜树碱衍生物，其特征在于：所述化合物为下列化合物之一：