CN104758946A - 一种抗体偶联药物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗体偶联药物及其制备方法和应用，所述抗体偶联药物由异端基双官能团聚乙二醇共价偶联药物分子和Fab’片段得到，结构如式I所示：Fab’-异端基双官能团聚乙二醇-药物分子(I)其中，Fab’为抗CD20抗体的片段，药物分子为细胞毒性药物分子。本发明通过将抗CD20抗体降解得到的F(ab’)₂片段还原为铰链区带有两个游离巯基的Fab’片段，而后通过异端基双官能团聚乙二醇将其与药物分子共价偶联得到所述抗体偶联药物。本发明制备的抗体偶联药物具有载药比固定、载药位点结构明确的特点，保留了抗CD20抗体对于CD20蛋白的结合能力，对CD20阳性细胞具有靶向能力，可用于非霍奇金氏淋巴瘤的治疗。

Description

一种抗体偶联药物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种抗体偶联药物及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤是威胁人类健康的重要疾病，目前的治疗方法主要包括手术、放疗、化疗等手段。手术治疗后的高复发率、肿瘤转移以及相应并发症是导致手术治疗失败的主要原因。而对于放疗与化疗，其在杀伤肿瘤细胞的同时也不可避免的对人体正常组织细胞造成损伤，导致严重副作用的产生，因此，放/化疗的无差别杀伤作用也严重限制了他们在临床上的应用。

在肿瘤治疗中使用的阿霉素等广谱抗肿瘤药物，虽然能够通过抑制细胞DNA的合成、破坏DNA的结构和功能、抑制蛋白质合成或者抑制细胞有丝分裂来干扰或阻断细胞的增殖过程，从而达到杀灭肿瘤细胞的效果。但是抗肿瘤药物分子在治疗癌症时，不具有对癌细胞的靶向作用，在治疗的同时也会对正常细胞产生毒性作用，从而引发各种副作用，因此期望对药物分子进行改造使得其具有靶向作用，从而降低其毒副作用。

鉴于抗肿瘤单克隆抗体对肿瘤细胞表面抗原的特异性，抗体药物已经成为肿瘤治疗的新方向，但单独使用时疗效经常不尽如人意。抗体药物偶联物(antibody drug conjugate,ADC)是将单克隆抗体与细胞毒性药物偶联(Sievers,E.L.,Senter,P.D.Antibody-drug conjugates in cancer therapy.Annual Review ofMedicine.2013,64:15-29.)，充分结合了前者靶向选择性强和后者活性高的特点，不仅可以将细胞毒性药物特异性地靶向于肿瘤细胞，降低细胞毒性药物对于正常细胞的杀伤作用，同时还具备缓释、提高药物抗肿瘤活性等效果，是未来肿瘤治疗的发展方向之一。

ADC由抗体、偶联剂和效应分子三个部分组成。通过靶向特定抗原，ADC能够有效地渗透到肿瘤组织，并被肿瘤细胞吞噬进入酶溶体，释放效应分子。

目前，已经有三种ADC药物通过美国FDA批准上市，其中，在2013年通过的用于治疗HER2阳性乳腺癌患者的Kadcyla(Antibody-drug conjugate againstbreast cancer approved.Bioengineered，2013，4:121.)，是具有里程碑意义的治疗实体肿瘤的ADC药物，引发了新一轮的研究热潮。尽管ADC新药的开发已经获得前所未有的成功，技术上仍然有待进一步优化。目前大多数ADC研究采用载药量不可控的无选择性偶联模式(Sammet,B.,Steinkuhler,C.,Sewald,N.Antibody-drug conjugates in tumor therapy.Pharmaceutical Patent Analyst.2012,1:65-73.)，导致无法获得载药位点确定、载药比明确的ADC产物，严重影响ADC药物的药效药代评价及临床应用。另外，现在常用的完整抗体分子量较大，通常在100kDa以上，过大的分子体积使ADC很难有效抵达肿瘤细胞，从而导致有效给药率过低。偶联剂也大多是短链的刚性疏水分子，这对于药物本身的水溶性与免疫原性也存在一定的影响。

因此，在本领域中，需要开发一种能够获得载药位点确定、载药比明确的抗体偶联药物。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抗体偶联药物及其制备方法和应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供了一种抗体偶联药物，所述抗体偶联药物由异端基双官能团聚乙二醇共价偶联药物分子和Fab’片段得到，结构如式I所示：

Fab’-异端基双官能团聚乙二醇-药物分子(I)

其中，Fab’为抗CD20抗体的片段，药物分子为细胞毒性药物分子。

本发明将Fab’片段通过异端基双官能团聚乙二醇与药物分子偶联来达到对药物分子进行修饰的目的，在得到的偶联抗体偶联药物中，Fab’片段保留有抗CD20抗体对于非霍奇金淋巴瘤的靶向活性，同时结合了小分子细胞毒性药物对于肿瘤细胞的杀伤作用，能够靶向性将药物递送至非霍奇金淋巴瘤以达到治疗目的。

在本发明的抗体偶联药物中，所述Fab’片段为铰链区带有两个游离巯基的Fab’片段。

优选地，所述Fab’片段为抗CD20抗体降解并将铰链区二硫键还原所得的抗体片段。

优选地，所述抗CD20抗体为人鼠嵌合型抗体或全人源化抗体，优选为全人源化抗体。

在本发明的抗体偶联药物中，所述异端基双官能团聚乙二醇具有式II所示的结构：

A-PEG-B(II)

其中，A为能与巯基反应的活性官能团，B为能与氨基或羰基反应的活性官能团。

优选地，A选自马来酰亚胺基、乙烯基砜基、巯基、卤代乙酰胺基、二硫化邻吡啶基或硫代磺酸酯基中的任意一种。

优选地，B选自琥珀酰亚胺酯基、醛基、二氯三嗪基、三氟乙基磺酸酯基、苯并三唑碳酸酯基、三氯苯基碳酸酯基、羰基咪唑基、氨基、氧氨基、酰肼基中的任意一种。

在本发明的抗体偶联药物中，所述异端基双官能团聚乙二醇的分子量为1000Da-20000Da，例如1000Da、2000Da、3000Da、4000Da、5000Da、6000Da、7000Da、8000Da、9000Da、10000Da、11000Da、12000Da、13000Da、14000Da、15000Da、16000Da、17000Da、18000Da、19000Da或20000Da，优选为2000Da-5000Da。

在本发明的抗体偶联药物中，所述细胞毒性药物分子为抗肿瘤药物分子，优选为美登素(Maytansine)、卡其霉素(Calicheamicin)、阿里他汀(Auristatin)及其同系物、丝裂霉素(Mitomycin)、倍癌霉素(Duocarmycin)或阿霉素(DOX)中的任意一种。

优选地，所述阿里他汀的同系物为monomethyl auristatin E(MMAE)和/或Monomethyl auristatin F(MMAF)。

在本发明的抗体偶联药物中，所述Fab’与药物分子的摩尔比为1:2。这是利用Fab’片段铰链区带有的两个游离巯基可通过异端基双官能团聚乙二醇与两分子药物偶联而实现的。

优选地，所述聚乙二醇与Fab’的连接键为硫醚键或二硫键。

优选地，所述聚乙二醇与药物分子的连接键为酰胺键、酰腙键或胺键。

另一方面，本发明提供了本发明所述抗体偶联药物的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)降解抗CD20抗体得到F(ab’)₂片段，将F(ab’)₂片段还原，得到铰链区带有两个游离巯基的Fab’片段，之后分离纯化备用；

(2)将药物分子与异端基双官能团聚乙二醇的B端共价偶联，得到中间产物A-PEG-药物分子；

(3)将步骤(1)得到的铰链区带有两个游离巯基的Fab’片段与步骤(2)得到的中间产物A-PEG-药物分子的A端共价偶联得到所述抗体偶联药物(I)。

在本发明所述的抗体偶联药物的制备方法中，步骤(1)所述降解抗CD20抗体通过胃蛋白酶降解实现。

优选地，步骤(1)所述还原使用的还原剂为β-巯基乙胺。

F(ab’)₂片段在β-巯基乙胺的还原作用下，还原为铰链区带有两个游离巯基的Fab’片段，游离的巯基能够与A-PEG-药物分子的A端共价偶联，获得抗体偶联药物(I)，并能够保证药物分子与Fab’片段的定量偶联，实现药物分子的定量负载。

优选地，所述还原剂加入还原体系后的浓度为5-20mM，例如5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM或20mM。

通过对还原剂浓度的选择，能够使还原反应保持合适的反应速率，还原剂浓度过低，反应动力不足，容易残存较多原料F(ab’)₂，而还原剂浓度过高，则反应动力过大，容易使得F(ab’)₂片段内部二硫键断裂后形成轻重链片段产物，而选择本发明所述浓度，可以使得F(ab’)₂片段更多地还原为铰链区带有两个游离巯基的Fab’片段，避免由于过多副产物的生成而造成后续分离纯化极其困难。

优选地，步骤(1)所述还原的反应时间为5-35min，例如5min、10min、15min、20min、25min、30min或35min，优选为30min。

还原反应时间的控制也对反应有很大影响，反应时间过短，反应不充分，容易残存较多原料，反应时间过长，容易使F(ab’)₂片段内部二硫键断裂后产生内部二硫键也被还原的产物，进而无法保证药物分子的定点定量负载。将反应时间控制在本发明所述范围内，可以达到控制F(ab’)₂片段更高效地还原为铰链区带有两个游离巯基的Fab’片段的目的。

优选地，步骤(1)所述还原的反应温度为0℃-37℃，例如0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃或37℃，优选为25℃。本发明使用较温和的反应温度进行还原反应，避免了苛刻的反应条件对反应操作以及仪器的特殊要求。

在本发明所述的抗体偶联药物的制备方法中，步骤(3)所述Fab’片段与中间产物A-PEG-药物分子的投料量摩尔比为1:2-1:10，例如1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10，优选为1:5。

在本发明所述的Fab’片段的制备方法中，步骤(1)得到的铰链区带有两个游离巯基的Fab’片段与中间产物A-PEG-药物分子共价偶联过程中，Fab’片段的两个巯基分别与中间产物A-PEG-药物分子发生共价偶联，使得生成的抗体偶联药物中Fab’片段与药物分子的摩尔比为1:2，因此本发明的抗体偶联药物具有载药比固定、载药位点结构明确的特点。

作为优选技术方案，本发明抗体偶联药物的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)用胃蛋白酶降解抗-CD20抗体，得到F(ab’)₂片段，反应式如下所示：

(2)利用还原剂将F(ab’)₂片段还原成铰链区带有两个游离巯基的Fab’片段，反应式如下所示：

(3)使药物分子与异端基双官能团聚乙二醇的B端共价偶联，得到中间产物A-PEG-药物分子，反应式如下所示；

A-PEG-B+药物分子→A-PEG-药物分子；

(4)步骤(2)得到的Fab’片段与中间产物A-PEG-药物分子的A端共价偶联得到所述抗体偶联药物(I)，反应式如下所示：

Fab'-(SH)₂+A-PEG-药物分子→Fab'-[PEG-药物分子]₂。

另一方面，本发明提供了本发明所述抗体偶联药物在制备用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤的药物中的应用。

本发明所述抗体偶联药物能够保留抗CD20抗体对于非霍奇金淋巴瘤的靶向活性，同时结合了小分子细胞毒性药物对于肿瘤细胞的杀伤作用，对非霍奇金淋巴瘤的治疗具有良好的效果。

本发明中使用的抗CD20抗体是针对CD20蛋白的单克隆抗体。CD20蛋白为B淋巴细胞表面特有的分化抗原，它表达于90％以上的B淋巴瘤细胞，而在造血干细胞、原始B淋巴细胞、正常血细胞以及其他组织上不表达，所以可将CD20蛋白作为治疗B细胞淋巴瘤的理想靶点，而抗CD20抗体作为B细胞来源型肿瘤的靶向抗体，目前临床上主要用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤。

本发明使用保留了抗原结合能力的抗体片段Fab’代替完整的抗体分子与药物效应分子进行偶联，以减小药物分子体积，达到提高ADC肿瘤细胞透过率从而提高有效给药率的目的；同时，Fab’抗体片段具有位点固定和数目固定的巯基位点，通过适当的偶联剂的选择和偶联过程控制，可实现定点/定量的药物负载。此外，抗体片段与效应分子间采用无毒无免疫原性的高分子链状聚乙二醇作为偶联剂，其柔性长链亲水结构的引入可以在保留ADC良好抗原结合性的同时不引入新的抗原决定簇，减少了ADC在到达肿瘤位点前的降解。并且，偶联剂两个互不相同的端基设计可实现载药位点和载药比的固定化，其中偶联剂与小分子药物间可控缓释的偶联结构，使ADC药物能在靶向部位有效释放恢复完整活性结构的小分子药物以杀伤癌症细胞，有效解决以往研究中ADC药物的药代和药效难以两全的问题。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明将抗体片段和药物分子通过PEG进行偶联，得到的偶联物与药物分子本身相比，具有明确的肿瘤靶向性，抗肿瘤活性有明显提高，药物体内半衰期延长。在本发明抗体偶联药物的制备过程中，通过对还原条件的筛选获得铰链区带有两个游离巯基的Fab’片段，并保证了获得的Fab’片段的纯度，使得可以通过PEG偶联剂在一个Fab’片段上偶联两个药物分子，实现了药物的定点定量负载。制备得到的抗体偶联药物保留了抗CD20抗体对于CD20蛋白的结合能力，对CD20阳性细胞具有靶向能力，对非霍奇金淋巴瘤模型细胞Daudi细胞具有杀伤作用，可用于非霍奇金淋巴瘤等肿瘤疾病的靶向治疗。

附图说明

图1为使用SDS-PAGE检测实施例1中抗CD20抗体经胃蛋白酶酶解成F(ab’)₂片段的电泳图，其中泳道1为标准蛋白样，各条带对应的分子量依次为14.4kDa、20.1kDa、29.0kDa、43.1kDa、66.4kDa、97.2kDa、116kDa和200kDa；泳道2为抗CD20抗体(还原电泳)；泳道3为抗CD20抗体(非还原电泳)；泳道4为抗CD20抗体经胃蛋白酶酶解成的F(ab’)₂片段(非还原电泳)；泳道5为抗CD20抗体经胃蛋白酶酶解成的F(ab’)₂片段(还原电泳)。

图2为使用SDS-PAGE检测实施例1和对比例1中利用不同还原剂在浓度分别为1、5、10、20和50mM时室温(25℃)下对F(ab’)₂片段的还原情况，其中泳道1为标准蛋白样，各条带对应的分子量依次为14.4kDa、20.1kDa、29.0kDa、43.1kDa、66.4kDa、97.2kDa、116kDa和200kDa；泳道2为F(ab’)₂；泳道3-7分别为还原剂在浓度1、5、10、20和50mM时对F(ab’)₂片段还原后的产物。

图3为实施例2中使用浓度为10mM的β-巯基乙胺(β-MEA)还原剂还原F(ab’)₂片段时产物组分比例随时间的变化。

图4为利用Superdex 75 10/300柱对实施例2中使用浓度为10mM的β-巯基乙胺(β-MEA)还原剂还原F(ab’)₂片段30min后产物进行分离的层析谱图。

图5为实施例3中使用SDS-PAGE检测F(ab’)₂经还原剂还原成Fab’片段的电泳图，其中泳道1为标准蛋白样，各条带对应的分子量依次为14.4kDa、20.1kDa、29.0kDa、43.1kDa、66.4kDa、97.2kDa、116kDa和200kDa；泳道2为F(ab’)₂片段(非还原电泳)；泳道3为Fab’片段(非还原电泳)；泳道4为F(ab’)₂片段(还原电泳)；泳道5为Fab’片段(还原电泳)。

图6为实施例3中MAL-PEG-NHS与阿霉素的偶联反应的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱图。

图7为实施例3中使用SDS-PAGE检测Fab’片段偶联上阿霉素制备得到抗体偶联药物终产物的电泳图，其中泳道1为标准蛋白样，各条带对应的分子量依次为14.4kDa、20.1kDa、29.0kDa、43.1kDa、66.4kDa、97.2kDa、116kDa和200kDa；泳道2为Fab’片段(非还原电泳)；泳道3为Fab’片段和MAL-PEG-DOX反应混合物(非还原电泳)；泳道4为体偶联药物Fab’-PEG-DOX(非还原电泳)。

图8为实施例9中Fab’、Fab’-PEG-DOX和DOX对于CD20蛋白阳性细胞Daudi细胞的体外抑制活性检测图。

图9为实施例11中细胞ELISA检测抗体偶联药物Fab’-PEG-DOX对于Daudi细胞的结合能力的结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

在本实施中，将胃蛋白酶降解得到的F(ab’)₂片段用还原剂β-巯基乙胺(β-MEA)还原，具体方法和步骤如下：

(1)用胃蛋白酶降解抗CD20抗体

称量抗CD20抗体5mg溶解于2mL的乙酸钠缓冲溶液中，测定浓度值。加入胃蛋白酶溶液，抗CD20抗体与胃蛋白酶的质量比为20:1，37℃下反应12h，调节pH值为8.0，终止反应，分离后经SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测反应进行情况及样品纯度，如图1所示，结果表明，抗CD20抗体经胃蛋白酶降解得到F(ab’)₂片段。

(2)利用还原剂将F(ab’)₂片段还原

F(ab’)₂片段浓度为1.63mg/mL，以β-MEA作为还原剂，在浓度分别为1、5、10、20和50mM时，于温度0℃、室温(25℃)和37℃条件下反应30min，得到产物。

利用SDS-PAGE检测实施例1在不同条件下制备的产物，结果所示，在5、10和20mM浓度下，在温度0℃、室温和37℃条件下反应30min后均能够得到仅铰链区二硫键被还原的Fab’片段，而不产生轻重链间二硫键被还原的产物。图2示出了各浓度β-MEA在室温条件下对F(ab’)₂片段进行还原反应30min后的SDS-PAGE检测结果，由图2可见，在25℃下条带4、5和6中仅存在铰链区二硫键被还原的Fab’产物。

对比例1

该对比例与实施例1相比，不同的是将还原剂分别替换为三(2-羰基乙基)磷酸酯(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇(β-ME)，其他反应条件以及操作步骤均与实施例1相同。

利用SDS-PAGE检测实施例1在不同条件下制备的产物，结果所示，在1、5、10、20和50mM浓度下，在温度0℃、室温和37℃条件下反应30min后，产物均为混合物，图2示出了室温下利用还原剂TCEP、DTT和β-ME所得产物SDS-PAGE检测结果，如图中所示，在1-50mM浓度下，三种还原剂电泳条带均比较复杂，证明其还原产物为复杂混合物，这使得后续分离极为困难，无法得到纯度较高的仅铰链区二硫键被还原的Fab’片段。

实施例2

在本实施中，将胃蛋白酶降解得到的F(ab’)₂片段用还原剂β-巯基乙胺(β-MEA)还原，具体方法和步骤如下：

(1)用胃蛋白酶降解抗CD20抗体

称量抗CD20抗体5mg溶解于2mL的乙酸钠缓冲溶液中，测定浓度值。加入胃蛋白酶溶液，抗CD20抗体与胃蛋白酶的质量比为20:1，37℃下反应12h，调节pH值为8.0，终止反应得到F(ab’)₂片段。

(2)利用还原剂将F(ab’)₂片段还原

F(ab’)₂片段浓度为0.5mg/mL，以β-MEA作为还原剂，在浓度分别为10mM时，于室温条件下反应，在加入还原剂的同时开始计时，分别在5、10、20、30、60、90min取样，经脱盐柱除去还原剂，然后使用SDS-PAGE检测还原情况，结果如图3所示。

由图3可知，β-MEA作为还原剂，浓度为10mM的条件下，在还原过程的前30min之内，F(ab’)₂逐步转化成铰链区二硫键被还原的Fab’，这一过程中没有轻重链间二硫键被还原的产物的生成，F(ab’)₂与铰链区二硫键被还原的Fab’可通过凝胶色谱容易地分离。在30min时间点时，F(ab’)₂全部转化成铰链区二硫键被还原的Fab’。随着时间继续增加，Fab’含量下降，而轻重链间二硫键被还原的产物增加，由于轻重链产物与铰链区二硫键被还原的Fab’在分子量上很接近，因此二者的分离比较困难，而且如果产物中存留轻重链产物，由于轻重链间二硫键被还原为巯基，此巯基也会在后续反应中与药物分子偶联，进而影响到药物分子的定点定量偶联效果。

取F(ab’)₂经10mM的β-MEA还原30min后的反应混合溶液经Superdex 7510/300柱进行分离纯化。层析谱图如图4所示，F(ab’)₂的保留体积为9.3mL，Fab’的保留体积为11mL。F(ab’)₂和Fab’实现了基线分离，反应液中的F(ab’)₂含量少于5％。因此，经可以纯化得到纯净的仅铰链区二硫键被还原的Fab’片段。

实施例3

在本实施例中，通过以下方法来制备Fab’-PEG-DOX(阿霉素)偶联药物，具体包括以下步骤：

(1)用胃蛋白酶降解抗CD20抗体

称量抗CD20抗体5mg溶解于2mL的乙酸钠缓冲溶液中，测定浓度值。加入胃蛋白酶溶液，抗CD20抗体与胃蛋白酶的质量比为20:1，37℃下反应12h，调节pH值为8.0，终止反应，分离得到F(ab’)₂片段。

(2)利用还原剂将F(ab’)₂片段还原

取步骤(1)得到的F(ab’)₂溶液2mL，加入1.54mg还原剂β-MEA固体(β-MEA浓度为10mM)，室温静置反应30min。反应完成后将混合物分离纯化，得到铰链区二硫键被还原的Fab’片段。

(3)药物分子阿霉素(DOX)与一端为马来酰亚胺、另一端为琥珀酰亚胺琥珀酸酯的异端基双官能团聚乙二醇MAL-PEG2000-NHS共价偶联

取DOX固体50mg，溶解于CHCl₃中，加入258mg的MAL-PEG2000-NHS，室温搅拌反应48h，得到中间产物。

(4)还原型Fab’片段与中间产物共价偶联

取纯化好的Fab’2mL，加入为Fab’片段5倍摩尔量的中间产物固体，室温振荡反应2h，反应结束后分离纯化，得到产物。

利用SDS-PAGE监测实施例3步骤(2)的反应进行情况及产物纯度，如图5所示，结果表明，F(ab’)₂片段经巯基乙胺还原成铰链区二硫键被还原的Fab’片段。

利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测实施例3步骤(3)的反应情况及产生的中间产物，如图6所示，结果显示，PEG原料的平均分子量为2200，经过与DOX的反应，质谱上出现了平均分子量在2650左右的吸收，即为一分子PEG与一分子DOX反应的产物，即产生的中间产物结构式为MAL-PEG-DOX，表明发生了偶联反应。

对实施例3最终得到的产物进行SDS-PAGE检测，检测结果如图7所示，结果表明，经过偶联反应与分离纯化得到了一个Fab’片段通过异端基双官能团聚乙二醇偶联两个DOX药物分子的抗体偶联药物Fab’-PEG-DOX。

实施例4

本实施例与实施例3不同的是，应用的偶联剂为一端为邻二硫吡啶基、另一端为琥珀酰亚胺的异端基双官能团聚乙二醇OPSS-PEG-SC，中间产物固体的加入量为Fab’片段的10倍摩尔量，除此之外，反应步骤以及条件均与实施例3相同。

通过SDS-PAGE检测发现同样得到了一个Fab’片段通过异端基双官能团聚乙二醇偶联两个DOX药物分子的抗体偶联药物Fab’-PEG-DOX。

实施例5

本实施例与实施例3不同的是，应用的偶联剂为一端为邻二硫吡啶基、另一端为琥珀酰亚胺乙酸酯的异端基双官能团聚乙二醇OPSS-PEG-SCM，中间产物固体的加入量加入为Fab’片段的2倍摩尔量，除此之外，反应步骤以及条件均与实施例3相同。

通过SDS-PAGE检测发现同样得到了一个Fab’片段通过异端基双官能团聚乙二醇偶联两个DOX药物分子的抗体偶联药物Fab’-PEG-DOX。

实施例6

在本实施例中，通过以下方法来制备Fab’-PEG-Mitomycin(丝裂霉素)偶联药物，具体包括以下步骤：

(1)用胃蛋白酶降解抗CD20抗体

称量抗CD20抗体5mg溶解于2mL的乙酸钠缓冲溶液中，测定浓度值。加入胃蛋白酶溶液，抗CD20抗体与胃蛋白酶的质量比为20:1，37℃下反应12h，调节pH值为8.0，终止反应，分离得到F(ab’)₂片段。

(2)利用还原剂将F(ab’)₂片段还原

取步骤(1)得到的F(ab’)₂溶液2mL，加入1.54mg还原剂β-MEA固体(β-MEA浓度为10mM)，室温静置反应30min。反应完成后将混合物分离纯化，得到铰链区二硫键被还原的Fab’片段。

(3)丝裂霉素(Mitomycin)与异端基双官能团聚乙二醇MAL-PEG2000-NHS共价偶联

取丝裂霉素固体50mg，溶解于CHCl₃中，加入329mg的MAL-PEG2000-NHS，室温避光搅拌反应48h，得到中间产物。

(4)还原型Fab’片段与中间产物MAL-PEG-Mitomycin共价偶联

取纯化好的Fab’2mL，加入其5倍摩尔量的中间产物固体，室温振荡反应2h，反应结束后，将样品分离纯化，得产物。

利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测实施例6步骤(3)的反应情况及产生的中间产物，结果显示，PEG原料的平均分子量为2200，经过与丝裂霉素的反应，质谱上出现了平均分子量在2450左右的吸收，即为一分子PEG与一分子丝裂霉素反应的产物，即产生的中间产物结构式为MAL-PEG-Mitomycin，表明发生了偶联反应。

对实施例6最终得到的产物进行SDS-PAGE检测，结果表明，经过偶联反应与分离纯化得到了一个Fab’片段通过异端基双官能团聚乙二醇偶联两个Mitomycin药物分子的抗体偶联药物Fab’-PEG-Mitomycin。

实施例7

本实施例与实施例6不同的是，应用的偶联剂为一端为邻二硫吡啶基、另一端为苯并三唑碳酸酯的异端基双官能团聚乙二醇OPSS-PEG-BTC，除此之外，反应步骤以及条件均与实施例6相同，同样可以制备得到一个Fab’片段通过异端基双官能团聚乙二醇偶联两个Mitomycin药物分子的抗体偶联药物Fab’-PEG-Mitomycin。

实施例8

本实施例与实施例6不同的是，应用的偶联剂为一端为邻二硫吡啶基、另一端为羰基咪唑基的异端基双官能团聚乙二醇OPSS-PEG-CDI，除此之外，反应步骤以及条件均与实施例6相同，同样可以制备得到一个Fab’片段通过异端基双官能团聚乙二醇偶联两个Mitomycin药物分子的抗体偶联药物Fab’-PEG-Mitomycin。

实施例9

在本实施例中，考察实施例3制备的抗体偶联药物Fab’-PEG-DOX的体外抗病毒活性，使用的检测方法如下：

将Daudi细胞(非霍奇金淋巴瘤模型细胞)悬浮液以5000个细胞/孔铺于96孔板上，每孔100μL，37℃培养过夜。设阿霉素组、Fab’-PEG-DOX组和Fab’组，其中阿霉素的剂量均设0、0.5、1、2.5、5、7.5、10、25μg/mL 7个浓度，Fab’组的浓度设置和相应的Fab’-PEG-DOX中Fab’量保持一致。每孔设置两个复孔。药物加入以后开始计时，37℃下培养48h，加入CCK-8每孔10μL。孵育1.5h后于450nm处检测OD值，结果如图8所示。

由图8可知，Fab’对Daudi细胞基本上不存在杀伤作用，Fab’偶联阿霉素以后，对Daudi细胞具有一定的杀伤作用。

实施例10

在本实施例中，考察实施例3制备的抗体偶联药物Fab’-PEG-DOX进入细胞的能力，使用的检测方法如下：

通过激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP 5，德国徕卡)观察不同时间情况下DOX和Fab’-PEG-DOX进入CD20阳性细胞和阴性细胞的情况。其中CD20阳性细胞为细胞表面表达CD20蛋白的Daudi细胞，CD20阴性细胞为细胞表面不表达CD20蛋白的K562细胞。

将Petri皿使用多聚赖氨酸固定，Daudi细胞和K562细胞悬浮液以10000个细胞/孔，铺于petri皿中，每孔200μL，37℃孵育24h。小心吸取培养液，弃去。加入200μL培养基，然后加入Fab’-PEG-DOX和DOX使得DOX的终浓度为10μL/mL，37℃孵育0.5h和1h。使用Hochest染细胞核以后经激光共聚焦显微镜在波长405nm和488nm观察药物进入细胞的情况(Hochest的激发波长为405nm)。

结果显示，单独的DOX药物均可以进入K562细胞和Daudi细胞，不具有选择性，而Fab’-PEG-DOX可以顺利进入抗CD20阳性细胞(Daudi细胞)，而不能进入抗CD20阴性细胞(K562细胞)。表明抗体偶联药物保留了抗CD20抗体对于CD20蛋白的结合能力。

实施例11

在本实施例中，考察实施例3制备的抗体偶联药物Fab’-PEG-DOX的细胞结合能力，通过细胞ELISA来检测其细胞结合能力，方法如下：

将Daudi细胞悬浮液2×10⁴个细胞/孔铺于96孔多聚赖氨酸板，每孔100μL，37℃培养24h，用去离子水洗涤2次，贮存于4℃备用。每孔加250μL含5％脱脂牛奶的PBS(封闭液)，37℃孵育1h。去除封闭液，每孔分别加入抗CD20抗体、Fab’和Fab’-PEG-DOX各50μL做为一抗，所含的抗体浓度分别为50、20、10、5、2、1、0μg/mL 7个浓度，37℃孵育2h，用0.1％PBST洗板3次。每孔加50μL含1％BSA的PBS稀释的HRP酶标羊抗人Fab(1:1000)，37℃孵育1h，PBS洗涤两次。TMB显色后加1mol/L硫酸溶液，每孔50μL，终止反应，5min内酶标仪检测OD450值，结果如图9所示。

由图9可知，Fab’-PEG-DOX大幅度地保留了抗体对CD20阳性细胞表面抗原的结合能力，即具有对CD20阳性细胞的靶向能力。

因此，本发明通过对F(ab’)₂片段还原过程中还原剂以及还原条件的筛选，得到了仅铰链区二硫键被还原从而得到铰链区带有两个巯基的Fab’片段，应用该片段实现了药物的定点定量负载，制备得到的抗体偶联药物保留了抗CD20抗体对于CD20蛋白的结合能力，对CD20阳性细胞具有靶向能力，并能够对非霍奇金淋巴瘤模型细胞Daudi细胞具有杀伤作用，可用于非霍奇金淋巴瘤等肿瘤疾病的靶向治疗。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的抗体偶联药物及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种抗体偶联药物，其特征在于，所述抗体偶联药物由异端基双官能团聚乙二醇共价偶联药物分子和Fab’片段得到，结构如式I所示：

Fab’-异端基双官能团聚乙二醇-药物分子 (I)

其中，Fab’为抗CD20抗体的片段，药物分子为细胞毒性药物分子。

2.根据权利要求1所述的抗体偶联药物，其特征在于，所述Fab’片段为铰链区带有两个游离巯基的Fab’片段；

优选地，所述Fab’片段为抗CD20抗体降解并将铰链区二硫键还原所得的抗体片段；

优选地，所述抗CD20抗体为人鼠嵌合型抗体或全人源化抗体，优选为全人源化抗体。

3.根据权利要求1或2所述的抗体偶联药物，其特征在于，所述异端基双官能团聚乙二醇具有式II所示的结构：

A-PEG-B (II)

其中，A为能与巯基反应的活性官能团，B为能与氨基或羰基反应的活性官能团；

优选地，A选自马来酰亚胺基、乙烯基砜基、巯基、卤代乙酰胺基、二硫化邻吡啶基或硫代磺酸酯基中的任意一种；

优选地，B选自琥珀酰亚胺酯基、醛基、二氯三嗪基、三氟乙基磺酸酯基、苯并三唑碳酸酯基、三氯苯基碳酸酯基、羰基咪唑基、氨基、氧氨基、酰肼基中的任意一种。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体偶联药物，其特征在于，所述异端基双官能团聚乙二醇的分子量为1000Da-20000Da，优选为2000Da-5000Da。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体偶联药物，其特征在于，所述细胞毒性药物分子为抗肿瘤药物分子，优选为美登素、卡其霉素、阿里他汀及其同系物、丝裂霉素、倍癌霉素或阿霉素中的任意一种；

优选地，所述阿里他汀的同系物为monomethyl auristatin E和/或Monomethylauristatin F。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的抗体偶联药物，其特征在于，所述Fab’与药物分子的摩尔比为1:2；

优选地，所述聚乙二醇与Fab’的连接键为硫醚键或二硫键；

优选地，所述聚乙二醇与药物分子的连接键为酰胺键、酰腙键或胺键。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体偶联药物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)降解抗CD20抗体得到F(ab’)₂片段，将F(ab’)₂片段还原，得到铰链区带有两个游离巯基的Fab’片段，之后分离纯化备用；

(2)将药物分子与异端基双官能团聚乙二醇的B端共价偶联，得到中间产物A-PEG-药物分子；

(3)将步骤(1)得到的铰链区带有两个游离巯基的Fab’片段与步骤(2)得到的中间产物A-PEG-药物分子的A端共价偶联得到所述抗体偶联药物(I)。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述降解抗CD20抗体通过胃蛋白酶降解实现；

优选地，步骤(1)所述还原使用的还原剂为β-巯基乙胺；

优选地，所述还原剂加入还原体系后的浓度为5-20mM；

优选地，步骤(1)所述还原的反应时间为5-35min，优选为30min；

优选地，步骤(1)所述还原的反应温度为0℃-37℃，优选为25℃。

9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述Fab’片段与中间产物A-PEG-药物分子的投料量摩尔比为1:2-1:10，优选为1:5。

10.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体偶联药物在制备用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤的药物中的应用。