CN103012778A - 一种具有肿瘤主动靶向性的水溶性紫杉醇聚合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种主动靶向于肿瘤的紫杉醇和紫杉醇酯的水溶性聚合物及其制备方法，它是将紫杉醇或多西他赛与聚谷氨酸的聚合物共轭而制得，并在聚谷氨酸-紫杉烷类化合物的结构基础上修饰了肿瘤主动靶向分子叶酸，该聚合物可以用于肿瘤的治疗。

Description

一种具有肿瘤主动靶向性的水溶性紫杉醇聚合物

技术领域

本发明属于医药领域，更具体而言涉及一种主动靶向于肿瘤的水溶性紫杉醇聚合物，特别是以叶酸作为肿瘤主动靶向配体的聚谷氨酸紫杉醇聚合物。

背景技术

紫杉醇(paclitaxel，PTX)是目前临床上广泛使用的一种抗肿瘤药物。它是一种从红豆杉中提取出的天然的三环二萜类物质，通过破坏微管蛋白质-微管系统而起作用。它能与微管多聚体结合，并抑制微管解聚，形成稳定的微管束，因而破坏肿瘤细胞的有丝分裂。紫杉醇于1992年被FDA正式批准用于临床，先后批准用于卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌，以及食管癌、头颈部肿瘤、胃癌等的治疗。紫杉醇抗瘤谱广，疗效好。但是，紫杉醇用于临床试验开发的主要难点是其不溶于水的特性，在水中溶解度≤0.4μM，难溶于许多药用溶媒。

多西他塞是由10-脱乙酰浆果赤霉素制成的半合成品，10-脱乙酰浆果赤霉素是一种从浆果红豆衫的针叶提取并经化学合成的侧链酯化而得到的无细胞毒性前体。已知多西他塞对各种癌细胞系，包括乳腺、肺、卵巢和结肠直肠癌和黑素瘤有治疗作用。在临床实验中，已将多西他塞用于乳腺、肺、卵巢、头颈部癌和恶性黑素痛以达到部分或全部的治疗效果。

有代表性的制剂方法是将紫杉醇配制成浓缩溶液，即每毫升聚氧乙烯蓖麻油(EL)和脱水乙醇(50％v/v)中含有6mg紫杉醇，用药前需将它进一步稀释。运送所需剂量紫杉醇所需要的聚氧乙烯琵麻油的量明显高于在聚氧乙烯蓖麻油中配制其它药物的所需要的用量。聚氧乙烯蓖麻油有一定的毒性作用，会引起血管舒张、呼吸困难和低血压。已发现这种载体也会导致实验动物和人严重的超敏反应。事实上，可以给小鼠静脉注射的紫杉酵的最大剂量是按聚氧乙烯蓖麻油的急性致死毒性而定的。另外，已知表面活性剂聚氧乙烯蓖麻油可以从聚氯乙烯袋和静脉内给药管中溶出邻苯二甲酸酯增塑剂，如邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP)。已知邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯可引起动物的肝细胞毒性，并使啮齿动物致癌。还已知这种紫杉醇制剂经过一段时间后会形成颗粒物，因此用药期间需过滤。因此，需要对这种紫杉醇溶液的制备和给药进行特殊预制，以确保给患者用药时的安全，这些预制的过程成本较高。

为了提高紫杉醇的溶解性，减少紫杉醇对病人的毒副作用，国内外学者就紫杉醇的新技术与新剂型方面开展了大量的研究。现有的水溶性紫杉醇前药一般在2′-羟基或7-羟基位置上加上琥珀酸和氨基酸之类的助溶基团。但是，还没有证据证实这些前药具有足够的化学稳定性。为了解决紫杉醇水溶性差的技术难题，进行了其它试验，例如将脂质体和微球中的紫杉醇制成微型胶囊，这种脂质体制剂与游离紫杉醇相比，具有相似的疗效，但只有含量少于2％的紫杉醇脂质体制剂在物理上是稳定的，并且已证实微球制剂有毒。因此临床上仍需要有一种能运输有效量紫杉醇的水溶性紫杉醇制剂。

其中另一个研究热点是制备紫杉醇的前体药物，如把紫杉醇与大分子物质偶联，有助于改善紫杉醇的水溶性，并且改善小分子化疗药物在肿瘤部位的分布，从而提高其治疗指数，降低其毒副作用。Cell Therapeutics公司于1998年开发出了聚谷氨酸-紫杉醇化合物(paclitaxel poliglumex，PG-TXL，OPAXIO^TM(xyotax)，CT2103)，是迄今为止最有前景的聚合物-抗癌药物组合物，目前正进行临床Ⅲ期试验。与紫杉醇相比，CT2103的水溶性大大提高，体内清除速度较慢，在肿瘤内的聚集度增强，从而降低了脱发、呕吐、过敏反应等毒副作用，临床使用过程中不需要预防性使用抗过敏药物。

通过共价键将化疗药物连接在聚合物上，形成聚合物-药物共轭物，可以减少化疗药物的系统毒性，提高治疗指标。分子量大于30KDa的聚合物不容易通过正常毛细管和小球的内皮，因此，减少化疗药物引起的对正常组织的毒性。而恶性肿瘤常常使毛细管内皮紊乱，与正常组织的脉管系统相比，恶性肿瘤的脉管渗透性更强。因此，通常脉管系统中的聚合物-药物共轭物会选择性地从血管中滤出进入肿块，导致活性治疗药物在肿瘤块聚集。另外，聚合物-药物共轭物也可作为药物持续释放的仓库，对肿瘤细胞产生长期的药物作用。最后，水溶性聚合物可用于使药物保持稳定，增加水不溶性药物的溶解度。目前，已经对各种合成的和天然的聚合物对抗肿瘤药物的运输的能力进行了检测。

CT2103利用肿瘤组织的血管通透性增强及延缓效应(EPR效应)而富集于肿瘤组织中，被动靶向于肿瘤。所谓延缓效应是指，快速生长的肿瘤组织内的新生血管其通透性要大于正常组织的成熟血管，使得许多无法通过正常血管壁的大分子可以通过肿瘤血管壁，同时淋巴管排液障碍限制了大分子的清除，导致大分子在实体肿瘤内的蓄积。然而，CT2103在富集于肿瘤的同时，在肝、肺、脾等网状内皮系统的分布也显著增加，并且，聚合物主链带负电，不利于被表面负电性的肿瘤细胞摄取。临床前试验和临床试验表明，CT2103往往需要提高剂量才能显著提高疗效。为此，有必要提高CT2103的肿瘤特异性，实现其对肿瘤的主动靶向，以便进一步提高紫杉醇的疗效，降低其毒副作用。

主动靶向策略主要是利用肿瘤细胞表面过度表达的特异性抗原或受体作为靶点，当药物载体上结合了相应的抗体或配体后，通过抗原-抗体、配体-受体的专一性结合作用，把抗癌药物传递到肿瘤细胞，增强药物的肿瘤选择性，实现药物对肿瘤的特异性传递。近年来的研究表明，叶酸是一种较为理想的肿瘤主动靶向配体。

叶酸是一种人体必需的维生素，也是DNA合成所需酶系统中一碳单位转移酶的重要辅酶。因此，叶酸对维持体内正常细胞和增殖细胞的生长发育有重要作用。细胞对叶酸的吸收有两种机制：一是通过低亲合力的跨膜蛋白转运二氢叶酸、四氢叶酸进入细胞；二是通过高亲合力的叶酸结合蛋白即叶酸受体(folate receptor，FR)介导细胞内化将叶酸摄入。后者为叶酸偶联药物进入细胞的主要途径。

叶酸受体是一种与糖基化磷脂酰肌醇(glycosylp-hosphatidylinositol，GPI)连接的膜糖蛋白，对叶酸有高度亲合性。叶酸通过γ-羧基偶联其它小分子化合物如抗肿瘤药物后，仍能保持与叶酸受体的高亲合性。研究表明，叶酸受体在大部分恶性肿瘤细胞表面均有过度表达。叶酸受体的表达水平也与肿瘤的发展阶段有关，早期肿瘤的叶酸受体表达较低，晚期及高度恶变的肿瘤受体表达增强，此外，部分转移瘤的表达水平显著高于原发瘤。因此，叶酸受体被认为是一种较好的肿瘤标记物，目前已被开发作为临床诊断肿瘤的标记物。叶酸受体一般在正常组织中的表达高度保守，只在脉络丛、胎盘、肺、肠以及肾等一些正常上皮组织中有不同的表达，且仅分布于上皮细胞极化表面，不易接近血中的叶酸组合物。例如，脉络丛的叶酸受体主要在血脑屏障的脑侧有表达，而肺部的叶酸受体分布在气道的空气接触面，与血循环中的叶酸组合物不能接触。因此，叶酸-药物组合物在杀伤高表达叶酸受体的肿瘤细胞的同时，对正常组织的毒性较低。基于叶酸受体在肿瘤细胞与正常细胞中的这种表达差异，可实现叶酸-药物组合物的主动靶向输送。叶酸-药物组合物与肿瘤细胞表面的叶酸受体特异性结合后，通过内吞作用(endocytosis)进入肿瘤细胞。在细胞内的弱酸性环境(pH5)中，叶酸受体构型发生改变，释出叶酸-药物组合物，而受体又可回到细胞膜表面，再转运其它的叶酸分子或叶酸-药物组合物。

叶酸作为靶向分子具有许多独特的优点，如相对分子质量小、无免疫原性、廉价易得、稳定性好、与药物分子或载体之间的化学键合简单易行，靶向应用范围广泛。

CN101438252A中公开了紫杉醇-肝素-FA(叶酸)共轭体及其制备方法、表征、药理活性评价。同时公开了一种紫杉醇-PG(聚谷氨酸)-FA的药理活性数据，但并未公开其制备方法与表征数据。

发明内容

本发明通过在聚谷氨酸主链上修饰靶向性的基团——叶酸，可以有效提高聚谷氨酸-抗癌药物组合物对肿瘤的主动选择性，从而提高抗癌药物对肿瘤的疗效，降低抗癌药物对正常组织的伤害。

本发明的一个目的是提供一种主动靶向于肿瘤的聚谷氨酸-抗癌药物聚合物，使用丁二胺作为连接部分，将靶向基团叶酸与聚谷氨酸的部分自由羧基偶联，同时将抗肿瘤药物如紫杉醇、多西他赛也与聚谷氨酸的另外部分的自由羧基偶联，得到同时连接有紫杉醇或多西他赛和叶酸-丁二胺部分的聚谷氨酸。

本发明中所述的紫杉烷类化合物包括但不限于紫杉醇和多西他赛，本领域技术人员都了解紫杉烷类化合物有共同的母核的骨架结构，具有相类似的抗肿瘤作用，均有相应的2’位和7位羟基，与聚谷氨酸上的羧基进行反应，有相似的反应条件和结果。

本发明提供了一种式I所示的聚谷氨酸衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于：

式I

每个重复单元中R₁独立地选自羟基、紫杉烷类基团、式II所示基团中的一个；

式II

所述式II所示基团中的R₂为式III所示基团；

式III

n为整数，并且使得所述聚谷氨酸衍生物的分子量为20000-80000道尔顿，优选为30000-60000道尔顿；

所述聚谷氨酸衍生物中紫杉烷类基团占所述聚谷氨酸衍生物的质量百分数为20～23％，优选为21～22％；叶酸基团占所述聚谷氨酸衍生物的质量百分数的8～12％，优选为9～11％。

式I所示的聚谷氨酸衍生物中每个含有紫杉烷类基团的重复单元中紫杉烷类基团独立地选自式IV-A、式IV-B中的一个；或者独立地选自式V-A、式V-B中的一个：

式IV-A式IV-B

式V-A

式V-B。

式I所示的聚谷氨酸衍生物具有三类重复单元：

1)自由的谷氨酸残基，即R₁为羟基；

2)连接有紫杉烷类化合物的谷氨酸残基；优选地为紫杉醇或多西他赛通过2’位或7位的羟基与聚谷氨酸的羧基形成酯键连接在聚合物上；

3)连接有叶酸-丁二胺部分的谷氨酸残基。

本发明的另一个目的是提供了制备上述聚谷氨酸衍生物的方法。制备过程中所用的聚谷氨酸可以按照本发明中实施例中所述的方法制备，也可以按照现有技术（化学试剂，2004,26(2)，105-106；高等学校化学学报，2008,29(1)，197-200）制备。

本发明中合成所用的试剂的英文简写定义如下：

EDC：1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐

NHS：N-羟基丁二酰亚胺

DMAP：4-二甲胺基吡啶

本发明中所述的聚谷氨酸衍生物可以按照以下两种方法制备。

方法一：(1)叶酸与丁二胺反应，制备叶酸-丁二胺；(2)叶酸-丁二胺与聚谷氨酸反应，制备叶酸-丁二胺-聚谷氨酸；(3)叶酸-丁二胺-聚谷氨酸与紫杉烷类化合物反应制备上述的目标聚谷氨酸衍生物。

方法二：与方法一不同的是，先将紫杉烷类化合物与聚谷氨酸连接以后，再将叶酸-丁二胺部分连接在聚合物上。包括：(1)叶酸与丁二胺反应，制备叶酸-丁二胺；(2)聚谷氨酸与紫杉烷类化合物反应，制备聚谷氨酸-紫杉烷类化合物；(3)叶酸-丁二胺与聚谷氨酸-紫杉烷类化合物反应，制备上述的目标聚谷氨酸衍生物。

上述方法一或方法二的步骤(1)中，叶酸与丁二胺在缩合试剂和催化剂作用下反应，叶酸的γ羧基与丁二胺的一个氨基反应，形成叶酸-丁二胺。反应所用的缩合试剂为EDC和NHS，催化剂为DMAP。所用的溶剂为极性非质子溶剂二甲亚砜，析晶所用溶剂为二氯甲烷。优选的制备方法为将叶酸溶解于二甲亚砜中，加入NHS、EDC、DMAP搅拌半小时。强烈搅拌下，将溶液缓慢滴加到丁二胺的二甲亚砜的溶液中，室温反应12小时。反应液用二氯甲烷冲析，氮气保护下快速抽滤、淋洗，真空干燥，得到叶酸-丁二胺。

上述方法一中步骤(2)和方法二中步骤(3)，所用的缩合试剂为EDC和NHS，催化剂为DMAP。反应所用的溶剂为极性非质子溶剂，选自二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰、N-甲基吡咯烷酮，优选二甲亚砜。

上述方法一中步骤(3)和方法二中步骤(2)，所用的缩合试剂为EDC，催化剂为DMAP。反应溶剂为极性非质子溶剂，选自二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰、N-甲基吡咯烷酮，优选N，N-二甲基甲酰胺。析晶所用溶剂为卤代烃类溶剂，选自氯仿、二氯甲烷，优选二氯甲烷。

本发明的又一个目的是提供了含有上述聚谷氨酸衍生物的药用组合物。

含有上述聚谷氨酸衍生物的药用组合物中含有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂以及等渗剂等任意组分。这些介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域技术人员周知的。任何常用介质或试剂除了与该聚谷氨酸衍生物不相容外，应该可用于治疗组合物中。组合物中也可加入补充的活性成分。

“药用的”一词也是指当将分子本身和组合物给动物或人使用时，不会产生变态反应或类似的不良反应。

本发明的又一个目的是提供了上述聚谷氨酸衍生物在制药中的用途。

本发明中的谷氨酸衍生物可以用于制备治疗癌症的药物。所述的癌症为乳腺癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤、肺癌、胃癌、结肠癌、头颈癌或白血病。优选为肺癌。

本发明的有益效果在于，在聚谷氨酸主链上修饰主动靶向基团叶酸，有利于将抗癌药物导向到肿瘤细胞，降低药物在正常组织的分布，从而提高药效降低毒副作用。特别是本发明中使用通过丁二胺将靶向基团修饰在聚谷氨酸主链上，相对于现有技术可以获得更高的疗效与更低的毒性。

本发明制备的肿瘤主动靶向的聚谷氨酸-抗癌药物组合物，水溶性好，疗效高毒性低，可以用于抗肿瘤药物的制备。

附图说明

图1：紫杉醇对照组、对照例组、PDFT组、阴性对照组对S180移植瘤小鼠的肿瘤生长抑制作用(肿瘤体积)。

图2：紫杉醇对照组、对照例组、PDFT组、阴性对照组对S180移植瘤小鼠的体重影响。

图3：紫杉醇对照组、对照例组、PDFT组、阴性对照组对S180移植瘤小鼠的瘤重影响。

图4：紫杉醇对照组、对照例组、PDFT组、阴性对照组对A549移植瘤裸鼠的肿瘤生长抑制作用(肿瘤体积)。

图5：紫杉醇对照组、对照例组、PDFT组、阴性对照组对A549移植瘤裸鼠的体重影响。

图6：紫杉醇对照组、对照例组、PDFT组、阴性对照组对A549移植瘤裸鼠的瘤重影响。

具体实施方式

下面的实施例是用以证明本发明的优选实施方式。本领域普通技术人员应该清楚下面实施例所公开的技术是本发明人发现的、在本发明实施中能很好发挥作用的技术，因此可将它视为优选的实施方式的一部分。但是，根据本发明，本领域普通技术人员还应知道，在不脱离本发明的内容和范围的前提下，可以对所公开的特殊实施方式进行多种修改，但仍可得到相同或相似的结果。

实施例1制备聚谷氨酸

将54.0g三光气溶解于300mL无水四氢呋喃中，于室温下分三批加入50.0g L-谷氨酸-γ苄酯，体系放热升温，必要时加冰水浴冷却，待反应稳定后，油浴升温到50℃，待全部固体溶清后，保温半小时。减压旋蒸除去溶剂，得到类白色或浅黄色固体，加入50℃热的150mL四氢呋喃、200mL石油醚混合溶剂重结晶，按照以上溶剂比例，再次重结晶，抽滤，室温下减压真空干燥12小时，得到22.7g白色固体，收率：40.9％，mp：91.4-92.7℃。¹HNMR(500MHz，CDCl₃)：δ7.25～7.38(m，5H，Ar-H)，6.71(s，1H，-NH)，5.13(s，2H，-CH₂)，4.37(t，1H，J=6.2Hz，-CH)，2.57(d，1H，J=7.0Hz，-CH₂)，2.21～2.29(m，2H，-CH₂).

将22g上步反应产物溶解于660mL无水四氢呋喃中，待溶清后，于室温下搅拌加入0.21g三乙胺，静置反应3天，然后将反应液缓慢倒入2000mL乙醇中搅拌冲析。抽滤，30℃真空干燥12小时，得到片状类白色半透明固体16.2g。收率：88.4％.

将11.4g上步产物溶解于200mL2,2-二氯乙酸中，升温至35℃，搅拌下，加入43％氢溴酸的乙酸溶液34mL。保温反应13小时，冲入2000mL乙醚中冲析，抽滤、淋洗，30℃减压干燥4小时，得到类白色-浅黄色的聚谷氨酸5.5g。收率82.5％，分子量42.9kDa(TSKgelG4000PW凝胶柱，洗脱液为pH=6.8的含0.2M NaNO₃的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液等度洗脱，保留时间为8.3分钟)。

实施例2：制备聚谷氨酸紫杉醇钠盐

取0.3g聚谷氨酸溶解于7.5mL N，N-二甲基甲酰胺中，加入0.1g紫杉醇、0.1g EDC及少量DMAP，避光、室温下搅拌6小时，薄层层析检测，展开剂为二氯甲烷∶甲醇=95∶5(v/v)，检测紫杉醇完全消失。将反应液倒入500mL二氯甲烷中冲析，抽滤、淋洗，室温下避光真空干燥6小时。得到0.33g类白色聚谷氨酸紫杉醇。收率82.5％。通过改变起始物质中紫杉醇与聚谷氨酸的重量比，可合成含不同浓度紫杉醇的聚谷氨酸紫杉醇。

将聚谷氨酸紫杉醇溶解在0.5mol/L碳酸氢钠溶液中得到聚谷氨酸紫杉醇钠盐。用蒸馏水对聚谷氨酸紫杉醇钠盐的水溶液进行渗析，以去除分子量小的杂质和剩余的碳酸氢钠。将渗析物冷冻干燥得到白色粉末。

用紫外吸收检测方法测得这种聚谷氨酸紫杉醇钠盐中的紫杉酵的含量为24％(w/w)。以结合到聚谷氨酸上的紫杉醇比例计算，产率为93％。

用相似方法增加所用的紫杉醇与聚谷氨酸的比例，可以提高生成的聚谷氨酸紫杉醇钠盐中的紫杉醇比例，所合成的聚合物中，紫杉醇含量最高达到35％（w/w）。

¹H NMR(500MHz，D₂O)：δ7.26～7.80(紫杉醇的芳香族成分)，紫杉醇的脂肪族成分的¹HNMR分布为：δ6.39(C₁₀-H)，5.98(C₁₃-H)，5.65和4.85(C₂’-H)，5.40～5.58(C₃’-H和C₂-H)，5.13(C₅-H)，4.45(C₇-H)，4.02(C₂₀-H)和1.19～1.21(C-CH₃)。紫杉醇的其它共振信号被聚谷氨酸的共振信号掩盖了。

聚谷氨酸紫杉醇钠盐的特征

在Beckman DU-640光谱仪(Fullerton，CA)中得到紫外光谱。假设水中的聚谷氨酸紫杉醇中的紫杉醇基团具有和甲醇中的紫杉醇具有同样的摩尔消光系数，且两者都遵守朗伯比尔定律(Lambert Beer's law)，根据甲醇中已知浓度的紫杉醇在λ=227nm处产生的标准曲线用紫外分光光度法可测定与聚谷氨酸共轭的紫衫醇含量。

如其紫外光谱所示，λ位移从227至230nm聚谷氨酸紫杉醇有特征性的紫杉醇吸收。假设230nm处水中的聚谷氨酸紫杉醇中的紫杉醇基团具有和227nm处甲醇中的紫杉醇具有同样的摩尔消光系数，且两者都遵守朗伯比尔定律(Lambert Beer's law)，根据甲醇中已知浓度的紫杉醇在227nm吸收产生的标准曲线可测定聚谷氨酸紫杉醇中的紫杉醇含量。

聚谷氨酸紫杉醇的凝胶渗透色谱研究

用凝胶渗透色谱(GPC)来表征聚谷氨酸紫杉醇的相对分子量。该凝胶渗透色谱系统由以下组成：岛津LC-20A高效液相色谱仪、TSKgel G4000PW凝胶柱和RID-10A示差折光检测器。洗脱液为pH=6.8的含0.2mol/L NaNO₃的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液，等度洗脱。紫杉醇与聚谷氨酸的共轭作用导致聚谷氨酸紫杉醇的分子量增加，聚谷氨酸的保留时间8.3分钟，聚谷氨酸紫杉醇的保留时间6.4分钟，用凝胶渗透色谱分析得到的结果。含15～25％紫杉醇(w/w)的聚谷氨酸紫杉醇的分子量为45-55kDa。将聚谷氨酸紫杉醇转化为其钠盐可有效去除此粗制品中所含的小分子量杂质，然后对粗制品进行渗析。

实施例3叶酸-丁二胺的制备

将5g叶酸溶解于20mL二甲亚砜中，加入1.66g NHS、4.4g EDC、0.5g DMAP搅拌半小时。强烈搅拌下，将溶液缓慢滴加到溶有40g丁二胺的5mL二甲亚砜的溶液中，室温反应12小时。反应液用1000mL二氯甲烷冲析，氮气保护下快速抽滤、淋洗，30℃真空干燥，得到浅黄色固体5.1g，避水封装备用。收率87.2％。

实施例4叶酸-丁二胺-聚谷氨酸的制备

将0.3g聚谷氨酸溶解于7.5mL二甲亚砜中，搅拌下加入0.1g EDC、0.05g NHS、0.2gDMAP，室温下搅拌半小时，将上步制备的0.1g叶酸-丁二胺加入到反应液中，室温搅拌12小时，将橙红色溶液用500mL二氯甲烷冲析、抽滤、淋洗，30℃真空干燥4小时，得到浅黄色固体0.34g，收率85％。叶酸含量19％（w/w）。

叶酸-丁二胺-聚谷氨酸的特征

在Beckman DU-640光谱仪(Fullerton，CA)中得到紫外光谱。假设水中的叶酸-丁二胺-聚谷氨酸中的叶酸基团和0.4％氢氧化钠溶液中的叶酸具有同样的摩尔消光系数，且两者都遵守朗伯比尔定律(Lambert Beer's law)，根据0.4％NaOH溶液中已知浓度的叶酸在波长λ=254nm下产生的标准曲线用紫外可见分光光度法测定与聚谷氨酸共轭的叶酸含量。如其紫外吸收光谱所示，波长位移从254至257nm，叶酸-丁二胺-聚谷氨酸有特征性的紫外吸收。假设257nm时水中的叶酸-丁二胺-聚谷氨酸中的叶酸基团和254nm时0.4％氢氧化钠溶液中的叶酸具有同样的摩尔消光系数，且两者都遵守朗伯比尔定律(Lambert Beer's law)，根据0.4％氢氧化钠溶液中已知浓度的叶酸在254nm吸收产生的标准曲线可测定叶酸-丁二胺-聚谷氨酸中的叶酸含量。

实施例5叶酸-丁二胺-聚谷氨酸-紫杉醇钠盐的制备

方法一

将0.3g叶酸-丁二胺-聚谷氨酸溶解于7.5mL N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌下加入0.2gEDC、少量DMAP、0.2g紫杉醇，室温下反应12小时，薄层色谱检测，至紫杉醇基本消失后，反应液加入500mL二氯甲烷冲析，抽滤、淋洗，25℃真空干燥4小时，得到浅黄色固体0.35g，收率70.0％。

将上述产物溶解在0.5mol/L NaHCO₃中得到叶酸-丁二胺-聚谷氨酸-紫杉醇的钠盐。用蒸馏水对叶酸-丁二胺-聚谷氨酸-紫杉醇的水溶液进行渗析，以去除分子量小的杂质和剩余的NaHCO₃盐。将渗析物冷冻干燥得到白色粉末。紫杉醇含量22％(w/w)，叶酸含量9％(w/w)。分子量48kDa。

方法二

将0.3g聚谷氨酸紫杉醇溶解于7.5mL二甲亚砜中，搅拌下加入0.1g EDC、0.1g NHS、少量DMAP、0.08g叶酸-丁二胺，室温下反应12小时，反应液加入500mL二氯甲烷冲析，抽滤、淋洗，25℃真空干燥4小时，得到浅黄色固体0.29克，收率94.1％。

将上述产物溶解在0.5mol/L NaHCO₃中得到叶酸-丁二胺-聚谷氨酸-紫杉醇的钠盐。用蒸馏水对叶酸-丁二胺-聚谷氨酸-紫杉醇的水溶液进行渗析，以去除分子量小的杂质和剩余的NaHCO₃盐。将渗析物冻干得到白色粉末。紫杉醇含量21％(w/w)，叶酸含量11％(w/w)。分子量46kDa。

对照例1叶酸-乙二胺-聚谷氨酸-紫杉醇钠盐的制备

参考实施例3，用乙二胺代替丁二胺制备得到叶酸-乙二胺，再参考实施例4，用得到的叶酸-乙二胺制备得到叶酸-乙二胺-聚谷氨酸，最后参考实施例5方法一用叶酸-乙二胺-聚谷氨酸制备得到叶酸-乙二胺-聚谷氨酸-紫杉醇钠盐。

实施例6叶酸-丁二胺-聚谷氨酸-紫杉醇钠盐对S180移植瘤小鼠的抑瘤作用

(1)动物

雌性ICR小鼠，体重18-22g。

(2)药物

紫杉醇注射液，江苏奥赛康药业有限公司，批号E110601；氯化钠注射液，南京小营药业集团有限公司，批号2010020106；葡萄糖注射液，南京小营药业集团有限公司，批号2010101404；聚谷氨酸(实施例1)；叶酸-乙二胺-聚谷氨酸-紫杉醇钠盐(对照例1)；叶酸-丁二胺-聚谷氨酸-紫杉醇钠盐(实施例5方法1)；PBS缓冲溶液。

(3)方法

3.1小鼠肉瘤S180模型建立

选取饲养10天的S180腹水瘤小鼠，抽取乳白色腹水，血性腹水不用，用PBS缓冲溶液将腹水稀释，冲洗，离心，计数，最后调细胞数为5×10⁶个/mL。提前一天将ICR小鼠右侧前肢腋下剪毛，每只鼠接种0.2mL细胞悬液于右前肢腋窝皮下，整个接种时间在1小时内完成。

3.2分组及给药

接种细胞后第二天，将40只小鼠随机平均分4组，每组10组。

①紫杉醇对照组：剂量为10mg/kg，葡萄糖注射液配制成1mg/mL，隔天尾静脉注射0.1mL/10g；

②叶酸-乙二胺-聚谷氨酸-紫杉醇钠盐给药组(也称为对照例组)：剂量为10mg/kg，氯化钠注射液配制成1mg/mL的浓度，隔天尾静脉注射0.1mL/10g；

③叶酸-丁二胺-聚谷氨酸-紫杉醇钠盐给药组(也称为PDFT组)：剂量为10mg/kg，氯化钠注射液配制成1mg/ml的浓度，隔天尾静脉注射0.1mL/10g；

④阴性对照组(也称为溶媒对照组/载体组/Vehicle组)：聚谷氨酸用氯化钠注射液配制成3mg/mL的浓度，隔天尾静脉注射0.1mL/10g。

3.3每天测量肿瘤体积（体积=长轴×短轴×短轴/2）、体重，并与第五次给药后第二天处死小鼠，迅速取出肿瘤组织，称重。

(4)结果

不同组对S180移植瘤小鼠的肿瘤生长抑制作用(肿瘤体积)见图1；不同组对S180移植瘤小鼠的体重影响见图2；不同组对S180移植瘤小鼠的瘤重影响见图3。

实施例7叶酸-丁二胺-聚谷氨酸-紫杉醇钠盐对A549移植瘤裸鼠的抑瘤作用

(1)动物

雌性BALB/c裸鼠，体重18-22g。

(2)药物

紫杉醇注射液，江苏奥赛康药业有限公司，批号E110601；氯化钠注射液，南京小营药业集团有限公司，批号2010020106；葡萄糖注射液，南京小营药业集团有限公司，批号2010101404；聚谷氨酸(实施例1)；叶酸-乙二胺-聚谷氨酸-紫杉醇钠盐(对照例1)；叶酸-丁二胺-聚谷氨酸-紫杉醇钠盐(实施例5方法2)；PBS缓冲溶液。

(3)方法

3.1A549移植瘤裸鼠模型建立

选取生长状态较好，没有坏死的肿瘤用无菌PBS冲洗，快速剪碎。置入组织匀浆器中顺时针方向充分研磨，匀浆过200目滤网。将滤过细胞悬液置入无菌离心管中1000rpm，5min。弃上清，沉淀用无菌PBS重悬，1000rpm，5min洗涤一次。弃上清，加入适量PBS重悬，计数，调节细胞数至5×10⁶个/mL。充分混匀细胞悬液，以每只小鼠5×10⁵个细胞(0.1mL)注射于小鼠右前肢腋窝处皮下。

3.2分组及给药

接种细胞后第二天，将40只小鼠随机平均分4组，每组10组。

①紫杉醇对照组：剂量为10mg/kg，葡萄糖注射液配制成1mg/mL，每隔两天尾静脉注射0.1mL/10g；

②叶酸-乙二胺-聚谷氨酸-紫杉醇钠盐给药组(也称为对照例组)：剂量为10mg/kg，氯化钠注射液配制成1mg/mL的浓度，每隔两天尾静脉注射0.1mL/10g；

③叶酸-丁二胺-聚谷氨酸-紫杉醇钠盐给药组(也称为PDFT组)：剂量为10mg/kg，氯化钠注射液配制成1mg/ml的浓度，每隔两天尾静脉注射0.1mL/10g；

④阴性对照组(也称为溶媒对照组/载体组/Vehicle组)：聚谷氨酸用氯化钠注射液配制成3mg/mL的浓度，每隔两天尾静脉注射0.1mL/10g。

3.3第3、7、10、14、17、21天测量肿瘤体积（体积=长轴×短轴×短轴/2）、体重，并与第七次给药后第三天处死小鼠，迅速取出肿瘤组织，称重。

(4)结果

不同组对A549移植瘤裸鼠的肿瘤生长抑制作用(肿瘤体积)见图4；不同组对A549移植瘤裸鼠的体重影响见图5；不同组对A549移植瘤裸鼠的瘤重影响见图6。

Claims (10)

1.一种式I所示的聚谷氨酸衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于：

式I

每个重复单元中R₁独立地选自羟基、紫杉烷类基团、式II所示基团中的一个；

式II

R₂为式III所示基团；

式III

n为整数，并且使得所述聚谷氨酸衍生物的分子量为20000-80000道尔顿。

2.根据权利要求1中所述的聚谷氨酸衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于每个含有紫杉烷类基团的重复单元中紫杉烷类基团独立地选自式IV-A、式IV-B中的一个；或者独立地选自式V-A、式V-B中的一个：

式IV-A式IV-B

式V-A

式V-B。

3.根据权利要求1中所述的聚谷氨酸衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于所述聚谷氨酸衍生物的分子量为30000-60000道尔顿。

4.根据权利要求1中所述的聚谷氨酸衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于所述聚谷氨酸衍生物中紫杉烷类基团占所述聚谷氨酸衍生物的质量百分数为20～23％，叶酸基团占所述聚谷氨酸衍生物的质量百分数的8～12％。

5.权利要求1-4中任一项所述的聚谷氨酸衍生物的制备方法，包括：

将叶酸-丁二胺-聚谷氨酸与紫杉烷类化合物在缩合试剂和催化剂作用下反应得到所述聚谷氨酸衍生物，所述叶酸-丁二胺-聚谷氨酸由叶酸-丁二胺与聚谷氨酸在缩合试剂和催化剂作用下缩合得到；

或者将叶酸-丁二胺与聚谷氨酸-紫衫烷类化合物在缩合试剂和催化剂作用下反应得到所述聚谷氨酸衍生物，所述聚谷氨酸-紫衫烷类化合物由聚谷氨酸与紫杉烷类化合物在缩合试剂和催化剂作用下反应得到。

6.根据权利要求5中所述的聚谷氨酸衍生物的制备方法，其特征在于：

所述缩合试剂为1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐和/或N-羟基丁二酰亚胺，

所述催化剂为4-二甲胺基吡啶；

所述叶酸-丁二胺由叶酸与丁二胺在缩合试剂和催化剂作用下反应制得；

所述紫杉烷类化合物为紫杉醇或者多西他赛。

7.一种药用组合物，其特征在于含有权利要求1-4中任一项所述的聚谷氨酸衍生物或其药学上可接受的盐。

8.权利要求1-4中任一项所述的聚谷氨酸衍生物或其药学上可接受的盐用于制备治疗癌症的药物的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于所述的癌症为乳腺癌、卵巢癌、恶性黑色素瘤、肺癌、胃癌、结肠癌、头颈癌或白血病。

10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于所述的癌症为肺癌。

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