CN109692326A - 一种蜂毒脂质纳米颗粒的应用 - Google Patents

一种蜂毒脂质纳米颗粒的应用 Download PDF

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张智红
余祥
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Abstract

本发明公开了一种蜂毒脂质纳米颗粒的应用，涉及生物科学和药物载体技术领域，本发明蜂毒脂质纳米颗粒由蜂毒杂合多肽和磷脂、胆固醇脂结合组成。该蜂毒脂质纳米颗粒制备的免疫激活与抗癌药剂用于靶向抗原提呈细胞，并激活抗原提呈细胞以改善免疫微环境，从而引起全身性的免疫反应，实现抑制肿瘤生长和转移作用；还用于靶向并激活树突状细胞、巨噬细胞和B细胞，以抑制远位肿瘤的生成；还用于靶向肝血窦内皮细胞，并促使其释放多种免疫因子，以抑制肿瘤肝转移。该蜂毒脂质纳米颗粒制备的免疫激活和抗癌药剂无毒副作用，不依赖于肿瘤类型，抗肿瘤效果好。

Description

一种蜂毒脂质纳米颗粒的应用
技术领域
本发明涉及生物科学和药物载体技术领域，具体涉及一种蜂毒脂质纳米颗粒的应用。
背景技术
癌症是严重危害人类健康的重大疾病，肿瘤转移和复发是肿瘤患者死亡的主要原因。恶性肿瘤的化疗是肿瘤治疗的重要手段之一，可以与手术与放疗相媲美，短期内能起到较好的临床治疗效果，其具体的作用机制主要是干扰核酸的合成代谢、DNA的复制、抑制有丝分裂和蛋白质的合成。但直接杀灭肿瘤细胞的药物或药物载体也存在缺陷：直接杀灭肿瘤细胞的药物或药物载体一般都具有细胞毒性作用，杀灭肿瘤细胞的同时也会作用于生物体内正常的细胞，特别是机体免疫细胞，从而损害机体免疫系统，导致肿瘤复发。同时，肿瘤细胞对化疗药物产生耐药往往最终导致化疗失败。一般而言，机体对一种抗肿瘤药物产生耐药性，可能会对结构和功能相似的药物产生交叉耐药性。一旦耐药性出现不但使该药物治疗不敏感，而且反复多次治疗会增加化疗的毒性，加重病人病情，降低患者生活质量。因此，急需开发一种肿瘤治疗效果好且对免疫系统没有直接毒副作用的药物或药物载体。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种蜂毒脂质纳米颗粒的应用，激活抗原提呈细胞改善免疫微环境，肿瘤治疗效果好。
为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：一种蜂毒脂质纳米颗粒的应用：
所述蜂毒脂质纳米颗粒由蜂毒杂合多肽和磷脂、胆固醇脂结合组成，所述蜂毒脂质纳米颗粒用于制备免疫激活与抗癌药剂，所述免疫激活与抗癌药剂靶向抗原提呈细胞，并激活抗原提呈细胞以改善免疫微环境。
在上述技术方案的基础上，所述抗原提呈细胞为树突状细胞、巨噬细胞和B细胞，所述免疫激活与抗癌药剂靶向并激活淋巴结的树突状细胞、巨噬细胞以及B细胞，以抑制远位肿瘤的生长。
在上述技术方案的基础上，所述抗原提呈细胞为肝血窦内皮细胞，所述免疫激活与抗癌药剂靶向肝血窦内皮细胞，并促使其释放多种免疫因子，以抑制肿瘤肝转移。
在上述技术方案的基础上，所述肿瘤包括黑色素瘤、乳腺肿瘤及结肠肿瘤。
在上述技术方案的基础上，所述蜂毒杂合多肽由α螺旋多肽、连接序列和蜂毒肽以共价键的形式串连而成。
在上述技术方案的基础上，所述α螺旋多肽的氨基酸序列为DWFKAFYDKVAEKFKEAF。
在上述技术方案的基础上，所述连接序列的氨基酸序列为GSG。
在上述技术方案的基础上，所述磷脂为二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)。
在上述技术方案的基础上，所述蜂毒杂合多肽、磷脂和胆固醇脂的摩尔比例为0.19:3:0.2。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
本发明公开了一种蜂毒脂质纳米颗粒的应用，蜂毒脂质纳米颗粒由蜂毒杂合多肽和磷脂、胆固醇脂结合组成。该蜂毒脂质纳米颗粒靶向抗原提呈细胞，并激活抗原提呈细胞以改善免疫微环境，从而引起全身性的免疫反应，实现对肿瘤的治疗作用。
蜂毒脂质纳米颗粒制备的免疫激活与抗癌药剂不依赖于肿瘤类型，直接和间接地对肿瘤细胞起到抑制作用，可以适用于多种肿瘤类型。现有结果表明该纳米颗粒能够明显多种肿瘤的发生并延长生存率。
蜂毒脂质纳米颗粒制备的免疫激活与抗癌药剂无毒副作用，使用该药剂抑制肿瘤的同时，没有看到任何脏器的毒副作用。
蜂毒脂质纳米颗粒制备的免疫激活与抗癌药剂靶向淋巴结的树突状细胞、巨噬细胞以及B细胞，以抑制远位肿瘤的生长。在肿瘤处注射该药剂不仅能明显抑制原位肿瘤的生长，同时激活淋巴结的树突状细胞、巨噬细胞以及B细胞，引起的全身性免疫反应，有效地抑制的远位肿瘤的生长。
蜂毒脂质纳米颗粒制备的免疫激活与抗癌药剂靶向肝血窦内皮细胞，并促使其释放多种免疫因子，适用于抑制肿瘤肝转移。通过诱导肝脏组织免疫因子适度升高而抑制肿瘤转移，没有任何脏器的毒副作用。
附图说明
图1为蜂毒脂质纳米颗粒对肿瘤细胞及免疫细胞的杀伤作用曲线图；
图2为蜂毒脂质纳米颗粒对淋巴结的靶向作用示意图；
图3为蜂毒脂质纳米颗粒对淋巴结抗原提呈细胞的激活作用示意图；
图4为瘤内注射蜂毒脂质纳米颗粒的治疗方案示意图；
图5为瘤内注射蜂毒脂质纳米颗粒对原位黑色素瘤肿瘤的抑制作用曲线图；
图6为瘤内注射蜂毒脂质纳米颗粒对远位(对侧)黑色素瘤肿瘤的抑制作用曲线图；
图7为瘤内注射蜂毒脂质纳米颗粒对原位乳腺癌肿瘤的抑制作用曲线图；
图8为瘤内注射蜂毒脂质纳米颗粒的肿瘤治疗后的毒副作用检测示意图；
图9为蜂毒脂质纳米颗粒对肝血窦内皮细胞靶向作用；
图10为蜂毒脂质纳米颗粒对肝脏组织内细胞因子及趋化因子影响；
图11为蜂毒脂质纳米颗粒对肝脏组织内免疫细胞的影响；
图12为瘤内注射蜂毒脂质纳米颗粒的治疗方案；
图13为蜂毒脂质纳米颗粒对黑色素瘤肿瘤肝转移的抑制作用；
图14为蜂毒脂质纳米颗粒对黑色素瘤肿瘤肝转移小鼠生存率的影响；
图15为蜂毒脂质纳米颗粒对乳腺癌肿瘤肝转移的抑制作用；
图16为蜂毒脂质纳米颗粒对乳腺癌肿瘤肝转移的生存率的影响；
图17为蜂毒脂质纳米颗粒对结肠癌肿瘤肝转移的抑制作用；
图18为蜂毒脂质纳米颗粒对结肠癌肿瘤肝转移小鼠生存率的影响；
图19为肿瘤治疗后的毒副作用检测。
具体实施方式
以下结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1：蜂毒脂质纳米颗粒的应用
本发明实施例提供一种蜂毒脂质纳米颗粒的应用，蜂毒脂质纳米颗粒由蜂毒杂合多肽和磷脂、胆固醇脂结合组成。蜂毒杂合多肽由α螺旋多肽、连接序列和蜂毒肽以共价键的形式串连而成。α螺旋多肽的氨基酸序列为DWFKAFYDKVAEKFKEAF，α螺旋多肽的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.1所示。连接序列的氨基酸序列为GSG。磷脂为二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC，即1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)。蜂毒杂合多肽、磷脂和胆固醇脂的摩尔比例为0.19:3:0.2。
蜂毒脂质纳米颗粒用于制备免疫激活与抗癌药剂，免疫激活与抗癌药剂靶向抗原提呈细胞，并激活抗原提呈细胞以改善免疫微环境。
抗原提呈细胞(antigen-presenting cell，APC)是指摄取、加工、处理抗原，并将抗原信息提呈给T细胞的一类免疫细胞，其活化状态、分化阶段、共刺激分子的表达在抗肿瘤免疫中起到决定性的作用。根据APC表面膜分子的表达和功能的差异，可以将抗原提呈细胞分为两类：1、专职抗原提呈细胞，包括树突状细胞(DC)、巨噬细胞以及B细胞；2、非专职抗原提呈细胞：包括内皮细胞、成纤维细胞等。
抗原提呈细胞为树突状细胞、巨噬细胞和B细胞，免疫激活与抗癌药剂靶向并激活淋巴结的树突状细胞、巨噬细胞以及B细胞，以抑制远位肿瘤的生长。
抗原提呈细胞为肝血窦内皮细胞，免疫激活与抗癌药剂靶向肝血窦内皮细胞，并促使其释放多种免疫因子，以抑制肿瘤肝转移。肿瘤包括黑色素瘤、乳腺癌及结肠癌。
肝血窦内皮细胞(Hepatic Sinusoidal Endothelial cell,HSCE)是肝非实质细胞中数量最大的一种细胞，属于非专职抗原提呈细胞，约占肝非实质细胞总数的50％，是肝脏免疫耐受的起点，被认为是一群独一无二的器官常驻抗原提呈细胞，与专职的抗原提呈细胞不同，其在肝内原位即可同时完成抗原的摄取、处理和提呈过程，但是由于HSCE表达低水平的共刺激分子，当与CD4+、CD8+T细胞直接接触之后，往往诱导CD4+T细胞向调节性T细胞转变，CD8+T细胞共抑制性分子表达上调，从而导致T细胞免疫耐受；HSCE还能够影响树突状细胞(DC)的功能，抑制DC活化，从而介导免疫耐受。但是，在非直接接触情况下，肝血窦内皮细胞通过分泌细胞因子起到一定促进免疫应答过程。
实施例2：蜂毒脂质纳米颗粒的制备方法
本发明实施例提供一种蜂毒脂质纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
S1，将3μmol DMPC(1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、0.2μmol胆固醇脂(Cholesteryl oleate，简称C.O)的氯仿溶液在玻璃试管中充分混合，并用封口膜将试管口密封好；
S2，在稳定的氮气流中将试管内的氯仿吹干，使步骤S1中的混合物能够在试管底部形成一层薄膜；将试管放入真空干燥器中真空干燥1h；
S3，向试管中加入1mL的磷酸缓冲液，充入氮气密封后，利用涡旋震荡仪将试管底部的药品薄膜充分重悬形成均匀的乳白色的悬浊液；将试管48℃超声1h；
S4，使用注射器向密封的试管中加入含有0.19μmol运载蜂毒肽的多肽的PBS溶液，混匀后密封，4℃放置过夜；
S5，使用FPLC系统纯化，收集有效溶液浓缩，检测多肽浓度备用。
实施例3：蜂毒脂质纳米颗粒对肿瘤细胞与免疫细胞的杀伤作用比较
将实施例2中制备得到的蜂毒脂质纳米颗粒对肿瘤细胞与免疫细胞的杀伤作用比较，免疫细胞以树突状细胞(DC)为例。
图1结果显示10μM的蜂毒脂质纳米颗粒和肿瘤细胞孵育24h后，杀伤性几乎达到了100％，而对免疫细胞(树突状细胞)几乎是没有任何毒性的。由此说明蜂毒脂质纳米颗粒对肿瘤微环境乃至淋巴结中的抗原提呈细胞是没有毒性作用的，相反，对肿瘤细胞有很强的杀伤作用。
蜂毒脂质纳米颗粒对淋巴结的靶向作用，参照图2。通过荧光成像，发现蜂毒脂质纳米颗粒能够顺利达到引流淋巴结，在24h达到最强，72h基本恢复正常。
蜂毒脂质纳米颗粒对淋巴结抗原提呈细胞的刺激作用，参见图3。通过图3，发现蜂毒脂质纳米颗粒能够显著激活淋巴结中的三种抗原提呈细胞：树突状细胞(DC)、B细胞、巨噬细胞。对于DC细胞，也发现DC不同亚群也有明显的活化作用，由此说明蜂毒脂质纳米颗粒能够全面改善淋巴结的微环境，为后期的肿瘤治疗实验提供依据。
实施例4：蜂毒脂质纳米颗粒对原位肿瘤与远位肿瘤治疗效果验证
实施例2中制备得到的蜂毒脂质纳米颗粒在体治疗肿瘤的实验方案和模型建立如下：参见图4所示，构建双侧B16皮下肿瘤模型。培养消化B16细胞，使用无菌的PBS漂洗2次后，200μL PBS重悬细胞，取10μL使用viacount流式计数活细胞密度，调整细胞浓度至1×106个/mL。提前对接种小鼠麻醉脱毛，将肿瘤细胞溶液注射只小鼠左侧腿根部皮下，注射体积为100μL。接种日期定为第0天，此后的日期分别记为第1、2、3……天。在第4天时候再在小鼠大腿对侧同样的位置接种5×104个/100μL细胞。
在第7天时，淘汰左侧肿瘤没有不均一的小鼠，随机分成2组，每组10只，称量小鼠体重并做好小鼠观察记录表。然后开始瘤内注射蜂毒脂质纳米颗粒(图中用α-mellitin-NP表示)。对照组注射时只需要瘤内注射等体积的无菌PBS溶液即可。
每天两天注射一次，一共注射3次，每次注射前测量肿瘤体积大小，注射后每隔一天开始监测小鼠双侧肿瘤体积大小，并做好小鼠观察记录表。肿瘤体积计算公式为V＝0.5×L×W2，由于高度测量不准确，故采用该种计算方法检测肿瘤体积。
经过3次给药后，能够明显抑制原位肿瘤(注射部位肿瘤)的生长，与对照组相比有非常明显的差异。同时引起的全身性免疫反应也很好抑制了远位肿瘤(对侧肿瘤)的生长，抑制效率到达100％，同时该效应也与对侧肿瘤的细胞数量由很大关系，当接种数量提高一倍时，抑制率为28％。具体结果见图5和图6。
为了进一步扩展蜂毒脂质纳米颗粒的应用范围，尝试了其他肿瘤类型，比如乳腺癌，结果显示对乳腺癌也有很好的抑制效果，结果见图7。
检测瘤内注射蜂毒脂质纳米颗粒治疗后小鼠生理生化指标及血常规参数，结果见图8，从图中发现该方法治疗后并没有产生明显的肝肾功能损害和血常规参数变化。
实施例5：在体检测蜂毒脂质纳米颗粒对肝血窦内皮细胞的靶向作用以及对肝脏微环境的改善作用
使用实施例2中的制备方法得到的蜂毒脂质纳米颗粒，在体检测蜂毒脂质纳米颗粒对肝血窦内皮细胞的靶向作用以及对肝脏微环境的改善作用：
图9结果显示尾静脉注射蜂毒脂质纳米颗粒后，通过转盘共聚焦成像观察发现该纳米颗粒组合物对肝血窦内皮细胞有很好的靶向作用，并且靶向作用很快，注射后20s即可看到肝血窦内皮细胞被点亮，但是注射染料标记的纳米颗粒对照组(HPPS组)只在血管内流动，并没有靶向肝脏内部任何细胞；
该纳米颗粒对肝脏组织细胞因子及趋化因子影响，参照图10。通过多因子试剂盒检测，我们发现肝脏组织中升高比较明显的有：CCL5、CXCL1、CXCL9、CXCL10、CCL3、CCL4、CXCL13、IL-1α，其中与NK和T细胞募集到肝脏相关的趋化因子有：CCL5、CXCL9、CXCL10、CCL3等，与NK细胞和T细胞激活相关的因子有：CXCL9、CXCL10、IL-1α等。
该组合物对免疫细胞募集作用，参见图11。通过多色流式分析，我们发现在没有负荷肿瘤时，该纳米颗粒能够明显诱导先天性免疫细胞(自然杀伤细胞、中性粒细胞、巨噬细胞)和适应性免疫细胞(T细胞和B细胞)募集至肝脏，从而起到对肿瘤转移病灶的清除作用。
实施例6：蜂毒脂质纳米颗粒在体治疗肿瘤肝转移的实验方案和模型建立
参见图12所示，构建肝转移肿瘤模型：培养消化黑色素瘤细胞(B16)、乳腺癌细胞(4T-1)及结肠癌细胞(CT-26)，使用无菌的PBS漂洗2次后，1mL PBS重悬细胞，取18μL加2μL的台盼蓝染色，然后使用细胞计数仪计数活细胞密度，调整细胞浓度至3×106个/mL。提前对接种小鼠麻醉腹部脱毛，手术剪依次剪开脾脏外面的表皮和肌肉，暴露脾脏，双边结扎脾脏，中间剪开脾脏，将100μL的肿瘤细胞溶液缓慢注射至一半脾脏，时间约为7min，然后结扎血管，去除接种肿瘤一侧的脾脏，保留另外一半脾脏并回纳至腹腔，分层缝合肌肉层和皮肤层，随机分成3组，标记PBS、HPPS、α-melittin-NP三组，接种日期定为第0天，此后的日期分别记为第1、2、3……天，在0、2、4天分别给药，对照组分别静脉注射等摩尔量的HPPS、等体积的PBS，在第15天(B16)、21天(CT-26、4T-1)处死小鼠，剥离肝脏，然后称重并做HE染色统计肿瘤转移负荷；
生存率的统计：肝转移模型制作同上，统计时间为100天，前21天隔天观察小鼠腹部情况及精神状态，统计小鼠体重，并做好小鼠观察记录表，之后时间延长至4-5天观察，小鼠死亡的判断标准为：自然死亡、精神状态差、体重增加或减少10％以上、腹部膨隆出现血腹水等，出现其中任何一项即可认定为小鼠死亡。
经过3次给药后，结果如图13-图18所示，从肉眼观即可发现该蜂毒脂质纳米颗粒能够明显抑制黑色素瘤(参见图13)、乳腺癌(参见图15)及结肠癌(参见图17)的肝转移，肝脏称量统计结果也可以看出，该蜂毒脂质纳米颗粒(α-melittin-NP)与对照组(HPPS、PBS)相比有非常明显的差异。
生存率试验中，在黑色素瘤肝转移组，8只小鼠中3只小鼠没有发生肝转移(参见图14)；乳腺癌肝转移组，8只小鼠中有4只没有发生肝转移(参见图16)；结肠癌肝转移组，10只小鼠汇总有7只没有发生肝转移(参见图18)，所有没有发生肝转移的小鼠均能生存100天。
检测静脉注射蜂毒脂质纳米颗粒治疗后小鼠肝功能改变，结果见图19，我们以B16肿瘤的肝转移为例说明，检测了肝功能指标：ALT(谷丙转氨酶)、ASL(谷草转氨酶)、TP(血浆总蛋白)、Alb(白蛋白)，我们发现和肝转移负荷一致，对照组ALT和ASL升高很明显，TP和Alb下降很明显，均表明肝损伤很严重，而治疗组相关指标和生理水平比较接近，所以我们确定使用该方法抑制了肝转移并没有产生明显的肝功能损害。
本发明不局限于上述实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围之内。本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
序列表
<110> 华中科技大学
华中科技大学鄂州工业技术研究院
<120> 一种蜂毒脂质纳米颗粒的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Trp Phe Lys Ala Phe Tyr Asp Lys Val Ala Glu Lys Phe Lys Glu
1 5 10 15
Ala Phe

Claims (9)

1.一种蜂毒脂质纳米颗粒的应用，其特征在于：
所述蜂毒脂质纳米颗粒由蜂毒杂合多肽和磷脂、胆固醇脂结合组成，所述蜂毒脂质纳米颗粒用于制备免疫激活与抗癌药剂，所述免疫激活与抗癌药剂靶向抗原提呈细胞，并激活抗原提呈细胞以改善免疫微环境。
2.如权利要求1所述的一种蜂毒脂质纳米颗粒的应用，其特征在于：所述抗原提呈细胞为树突状细胞、巨噬细胞和B细胞，所述免疫激活与抗癌药剂靶向并激活淋巴结的树突状细胞、巨噬细胞以及B细胞，以抑制远位肿瘤的生长。
3.如权利要求1所述的一种蜂毒脂质纳米颗粒的应用，其特征在于：所述抗原提呈细胞为肝血窦内皮细胞，所述免疫激活与抗癌药剂靶向肝血窦内皮细胞，并促使其释放多种免疫因子，以抑制肿瘤肝转移。
4.如权利要求3所述的一种蜂毒脂质纳米颗粒的应用，其特征在于：所述肿瘤包括黑色素瘤、乳腺肿瘤及结肠肿瘤。
5.如权利要求1所述的一种蜂毒脂质纳米颗粒的应用，其特征在于：所述蜂毒杂合多肽由α螺旋多肽、连接序列和蜂毒肽以共价键的形式串连而成。
6.如权利要求5所述的一种蜂毒脂质纳米颗粒的应用，其特征在于：所述α螺旋多肽的氨基酸序列为DWFKAFYDKVAEKFKEAF。
7.如权利要求5所述的一种蜂毒脂质纳米颗粒的应用，其特征在于：所述连接序列的氨基酸序列为GSG。
8.如权利要求1所述的一种蜂毒脂质纳米颗粒的应用，其特征在于：所述磷脂为二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)。
9.如权利要求1所述的一种蜂毒脂质纳米颗粒的应用，其特征在于：所述蜂毒杂合多肽、磷脂和胆固醇脂的摩尔比例为0.19:3:0.2。
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