CN108478600A - 间充质干细胞外泌体在制备防治骨质疏松症药物中的应用 - Google Patents
间充质干细胞外泌体在制备防治骨质疏松症药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种间充质干细胞外泌体在制备防治骨质疏松症药物中的应用，通过静脉注射提取的人脐带间充质干细胞外泌体，实现提升股骨远端松质骨骨体积分数、增强骨小梁厚度、骨小梁数量，达到治疗骨质疏松症的目的；为安全有效治疗骨质疏松症提供一种新的途径。本发明提取的外泌体经离心、浓缩、试剂提取制得，方法简单高效，能有效保持外泌体的活性。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞应用技术领域，具体来说，涉及一种间充质干细胞外泌体在制备防治骨质疏松症药物、食品或保健品中的应用，尤其是涉及一种人脐带间充质干细胞外泌体在制备用于防治骨质疏松症的药物、食品或保健品中的应用。
背景技术
骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种以骨量减少、骨微结构破坏为主要特征，继而导致骨脆性增加而易于骨折的代谢性骨病。OP分为原发性和继发性两大类，其中原发性OP又分为绝经后OP、老年性OP和特发性OP；而继发性OP多由疾病或其他因素引起，包括废用性OP等。根据国际骨质疏松症基金会(IOF)的统计数据，全球有超过2亿的OP患者。OP常诱发脆性骨折，给患者、家庭和社会带来沉重的负担。
目前防治OP的药物主要包括二磷酸盐类和甲状旁腺激素等。二磷酸盐类药物领军当前的OP市场，但是长期使用可导致严重的不良反应，如非典型骨折和下颌骨坏死。抗OP新药特立帕肽(重组甲状旁腺激素)是目前唯一的一个FDA批准的刺激新骨形成的药物，适用于严重OP患者。然而，高昂的价格限制了它的推广使用。总之，目前的OP防治药剂的实际效果与患者的预期还存在较大的差距。因此，新型OP防治药物的研发显得必要和迫切。
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是具有自我更新能力的多潜能祖细胞，来源广泛，在特定条件下能分化为多种组织细胞，是理想的组织修复“种子细胞”来源。人脐带来源MSCs因取材于废弃组织、来源丰富、增殖分化能力强、易于大量扩增培养，与其它组织分离的MSCs相比具有明显优势。过去科学家们普遍认为，MSCs的治疗潜能是由于其归巢并分化，代替损伤组织；而近期报道显示，MSCs可能通过旁分泌的方式促进组织再生。近年来，多项研究发现，人脐带MSCs在骨微环境中通过旁分泌机制支持和促进机体自身骨细胞生成与分化、骨骼再生和成熟。
外泌体(exosomes)是细胞内多泡体与细胞膜融合后释放到细胞外环境中的直径为40～150nm的膜性小囊泡，在细胞的旁分泌作用中扮演极为重要的角色。已有不少研究证实外泌体具有类似于干细胞的组织修复功能，细胞旁分泌的外泌体可独立地作为一种生物活性成分应用于组织再生和修复治疗。但到目前为止，国内外尚没有关于直接采用人脐带MSCs来源的外泌体防治OP的研究报道。
发明内容
针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种间充质干细胞外泌体在制备用于防治OP药物、食品和保健品中的应用，为OP的防治提供一种新的途径。
为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一方面，本发明提供一种间充质干细胞外泌体在制备用于防治OP药物、食品或保健品中的应用。
进一步地，所述间充质干细胞为人脐带来源的间充质干细胞、人胚胎来源的间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或人脂肪来源的间充质干细胞。优选地，所述人脐带来源的间充质干细胞来源于健康足月新生儿脐带。
进一步地，所述间充质干细胞外泌体用于提升股骨远端松质骨骨体积分数。
进一步地，所述间充质干细胞外泌体用于增加骨小梁厚度。
进一步地，所述间充质干细胞外泌体用于提升骨小梁数量。
进一步地，所述OP包括绝经后OP或废用性OP。
进一步地，所述药物还包括药学上可接受的载体。
进一步地，所述药物通过静脉给药。
进一步地，所述间充质干细胞外泌体的提取步骤如下：
1)采用组织块贴壁法分离出人脐带间充质干细胞，经原代培养和传代培养；
2)取第3～6代人脐带间充质干细胞培养，融合至70～80％，清洗后更换培养基继续培养24～48h，收集培养上清液；
3)将培养上清液离心、过滤、浓缩后，用外泌体提取试剂进行提取，得到人脐带间充质干细胞外泌体。
一方面，本发明提供一种用于治疗OP的药物组合物，其包括间充质干细胞外泌体。
进一步地，还包括药学上可接受的载体。
进一步地，所述间充质干细胞外泌体以外泌体中蛋白的浓度计算，含量为0.6～1μg/μl。
进一步地，所述药物组合物的剂型为注射剂、胶囊剂、片剂、口服制剂、微囊制剂、软膏剂或喷雾剂等。
另一方面，本发明提供一种间充质干细胞外泌体的提取方法，具体步骤如下：
1)采用组织块贴壁法分离出人脐带间充质干细胞，经原代培养和传代培养；
2)取第3～6代人脐带间充质干细胞培养，融合至70～80％，清洗后更换培养基继续培养24～48h，收集培养上清液；
3)将培养上清液离心、过滤、浓缩后，用外泌体提取试剂进行提取，得到人脐带间充质干细胞外泌体。
进一步地，所述步骤1)中，原代培养和传代培养的培养基为DMEM-F12完全培养基。
进一步地，所述步骤2)中，清洗使用PBS清洗；培养基更换为去外泌体的胎牛血清配制的DMEM-F12完全培养基。
进一步地，步骤3)中，所述过滤使用的过滤器为0.22μm过滤器。
进一步地，步骤3)中，所述浓缩采用10KD超滤离心管4000×g，4℃，20min浓缩上清液。
进一步地，所述外泌体提取试剂为SBI公司Exoquick-TCTM外泌体提取试剂。
本发明通过动物实验证明了人脐带MSCs外泌体对于改善雌激素缺乏或后肢废用导致的骨丢失非常有效。在小鼠绝经后OP模型中，人脐带MSCs外泌体干预后，股骨远端松质骨骨体积分数(Tb.BV/TV)比PBS溶剂对照组明显升高(P＜0.05)，骨小梁厚度(Tb.Th)比PBS溶剂对照组明显增加(P＜0.05)，骨小梁数量(Tb.N)比PBS溶剂对照组也有所提升。同样，在小鼠废用性OP模型中，人脐带MSCs外泌体干预后，股骨远端松质骨骨体积分数(Tb.BV/TV)比PBS溶剂对照组明显升高(P＜0.05)，骨小梁厚度(Tb.Th)比PBS溶剂对照组明显增加(P＜0.05)，骨小梁数量(Tb.N)比PBS溶剂对照组也明显提升(P＜0.05)。因此，人脐带MSCs外泌体可以用于制备防治绝经后和废用性OP的药物、药物组合物中，为治疗OP提供了新的安全有效的生物治疗手段。
本发明的有益效果：
本发明提供一种间充质干细胞外泌体在制备防治骨质疏松症药物中的应用，通过静脉注射提取的人脐带间充质干细胞外泌体，实现提升股骨远端松质骨骨体积分数、增强骨小梁厚度、骨小梁数量，达到防治OP的目的；为安全有效防治OP提供一种新的途径。本发明通过离心、浓缩提取外泌体，方法简单高效，能有效保持外泌体的活性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1：本发明优选实施例1中人脐带MSCs光镜图；
图2：实施例1中人脐带MSCs外泌体透射电镜图；
图3：各组绝经后骨质疏松症小鼠模型股骨骨微结构对比图；即实施例2中绝经后OP模型小鼠尾静脉注射人脐带MSCs外泌体2个月后，股骨松质骨骨体积分数、骨小梁厚度和骨小梁数量对比图；注：＊P＜0.05表明与Sham组相比，差异有统计学意义；#P＜0.05表明与OVX组相比，差异有统计学意义
图4：实施例2中绝经后OP模型小鼠股骨远端三维成像；
图5：各组后肢废用性骨质疏松症小鼠模型股骨骨微结构对比图；即实施例3中废用性OP模型小鼠尾静脉注射人脐带MSCs外泌体2个月后，股骨松质骨骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量对比图；注：＊P＜0.05表明与Control组相比，差异有统计学意义；#P＜0.05表明与TS组相比，差异有统计学意义
图6：实施例3中废用性OP模型小鼠股骨远端三维成像。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。
实施例1
人脐带MSCs外泌体的分离培养：
(1)人脐带MSCs的分离培养
人脐带MSCs分离自健康足月新生儿近胎儿端脐带10-15em，用含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L链霉素的DMEM-F12完全培养基培养，采用组织块贴壁法分离出人脐带间充质干细胞，经原代培养和传代培养。所得人脐带MSCs形态如图1所示，呈扁平的长梭形状态。
(2)人脐带MSCs外泌体的提取
取P3～P6代人脐带MSCs接种于培养瓶中，待其融合至70％-80％时，用PBS清洗细胞，换用新鲜去外泌体的含有10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L链霉素的DMEM-F12完全培养基继续培养24-48h，收集人脐带MSCs的培养上清液。
低速离心去除培养上清液中的残存细胞和细胞碎片，0.22μm过滤器过滤上清液，10KD超滤离心管4000×g，4℃，20min浓缩上清液，在浓缩液中加入SBI公司Exoquick-TCTM外泌体提取试剂，即得到人脐带MSCs来源的外泌体。
(3)获得的外泌体的鉴定：
采用磷钨酸溶液负染外泌体，通过透射电子显微镜观察外泌体的形态，结果如图2所示，外泌体呈直径100nm左右的茶托样结构。以外泌体中蛋白的浓度计算，所得外泌体的含量为0.6-1μg/μl。
实施例2：
人脐带MSCs外泌体对绝经后OP模型的影响：
(1)小鼠模型：
选取2月龄雌性SPF级C57BL/6小鼠。通过对2月龄雌性小鼠行双侧去卵巢(ovariectomy；OVX)手术，构建绝经后OP模型，同时建立假手术(Sham)组。实验小鼠均从湖南斯莱克景达动物实验有限公司购买。
(2)分组实验：
小鼠行OVX 1周后，等分为OVX对照组(OVX组)和OVX+人脐带MSCs外泌体干预组(OVX+MSCs-Exo组)。分别每周尾静脉注射一次100μg人脐带间充质干细胞外泌体(MSCs-Exo(溶于100μL PBS))或100μL PBS，连续2个月。Sham组也于同一时间点给予等体积的PBS。
按照上述方法干预后在相应时间点麻醉处死小鼠，收集小鼠骨组织等标本，分别检测小鼠股骨远端松质骨骨体积分数(Tb.BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)等，评估人脐带MSCs外泌体对绝经后小鼠OP的改善效果。结果如图3～4。
实施例3：
人脐带MSCs外泌体对废用性OP模型的影响：
(1)小鼠模型：
选取3月龄雌性SPF级C57BL/6小鼠。对3月龄雌性小鼠行尾部悬吊(tailsuspension；TS)，使其双后肢负重减轻，构建废用性OP模型，对照组自由活动。实验小鼠均从湖南斯莱克景达动物实验有限公司购买。
(2)分组实验：
将3月龄雌性SPF级C57BL/6小鼠随机分为不吊尾对照组(Control组)、吊尾组(TS组)及吊尾+人脐带MSCs外泌体干预组(TS+MSCs-Exo组)。TS+MSCs-Exo组每周尾静脉注射两次100μg MSCs-Exo(溶于100μL PBS)，Control组和TS组每周尾静脉注射一次100μL PBS，连续3周。
按照上述方法干预后在相应时间点麻醉处死小鼠，收集小鼠骨组织等标本，分别检测小鼠股骨远端松质骨骨体积分数(Tb.BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)等，评估人脐带MSCs外泌体对废用性小鼠OP的改善效果。结果如图5～6。
图3、图5分别是尾静脉注射人脐带MSCs外泌体2个月和3周后，绝经后和废用性OP小鼠模型股骨松质骨骨体积分数、骨小梁厚度以及骨小梁数量对比图。
结果如图3～6所示，不论是在绝经后还是废用性OP模型中，人脐带MSCs外泌体干预组小鼠股骨远端松质骨骨体积分数(Tb.BV/TV)比对照组均有明显升高(P＜0.05)，骨小梁厚度(Tb.Th)比对照组均有明显增加(P＜0.05)，骨小梁数量(Tb.N)比对照组均明显提升。对小鼠进行人脐带MSCs外泌体干预后，小鼠股骨远端松质骨由于雌激素缺乏或负重减轻导致的骨量丢失均被明显抑制，说明人脐带MSCs外泌体对于骨保护非常有效。因此，人脐带MSCs外泌体可以用于制备防治绝经后和废用性OP的药物或保健品，为治疗绝经后和废用性OP提供了新的安全有效的生物治疗手段。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种间充质干细胞外泌体在制备用于防治骨质疏松症药物、食品或保健品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞为人脐带来源的间充质干细胞、人胚胎来源的间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或人脂肪来源的间充质干细胞。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞外泌体用于提升股骨远端松质骨骨体积分数。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞外泌体用于增加骨小梁厚度。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞外泌体用于提升骨小梁数量。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述骨质疏松症包括绝经后骨质疏松症或废用性骨质疏松症。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述间充质干细胞外泌体的提取步骤如下：
1）采用组织块贴壁法分离出人脐带间充质干细胞，经原代培养和传代培养；
2）取第3~6代人脐带间充质干细胞培养，融合至70~80%，清洗后更换培养基继续培养24~48 h，收集培养上清液；
3）将培养上清液离心、过滤、浓缩后，用外泌体提取试剂进行提取，得到人脐带间充质干细胞外泌体。
8.一种用于治疗骨质疏松症的药物组合物，其特征在于，包括间充质干细胞外泌体和药学上可接受的载体。
9.根据权利要求8所述的用于治疗骨质疏松症的药物组合物，其特征在于，所述间充质干细胞外泌体以外泌体中蛋白的浓度计算，含量为0.6~1 μg/μl。
10.根据权利要求8所述的用于治疗骨质疏松症的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为注射剂、胶囊剂、片剂、口服制剂、微囊制剂、软膏剂或喷雾剂。
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