CN109498617A - 藁本内酯在制备防治骨质疏松症药品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了藁本内酯在制备防治骨质疏松症药品中的应用。藁本内酯可以显著改善泼尼松龙所致的斑马鱼骨质疏松并且显著促进成骨细胞分化，同时，提高氧化应激状态下成骨细胞的存活率，抑制细胞凋亡，进而对成骨细胞产生保护作用。也就是说，藁本内酯可通过提高骨形成能力，最终达到治疗骨质疏松症的目的。

Description

藁本内酯在制备防治骨质疏松症药品中的应用

技术领域

本发明属于骨质疏松症防治技术领域，具体涉及藁本内酯在制备防治骨质疏松症药品中的应用。

背景技术

骨质疏松症（Osteoporosis，OP）是一种常见病和多发病，不仅对人们造成大量的经济损失，并且严重降低中老年人生活质量，危及中老年人的健康。OP最显著的特征是骨密度（BMD）和骨矿含量（BMC）下降，骨内骨小梁缺失严重，骨显微组织结构严重退化，OP罹患人群其骨脆性增加，因此易发生骨折。骨重建的正常运转可以保证机体骨代谢水平相对稳定。骨重建包括骨形成和骨吸收。骨形成由成骨细胞（Osteoblast, OB）介导，而骨吸收主要由来源于骨髓造血系统的破骨细胞（osteoclast, OC）介导。当OC的骨吸收能力增强，超过了OB的骨形成水平，将会诱发OP。

临床上OP的治疗药物按照其作用机制可以分为以下几类：（1）拮抗骨吸收药物：雌激素、降钙素（CT）和双膦酸盐等；（2）促骨形成药物：维生素K和氟化物等；（3）骨矿类药物：钙剂、维生素D及硼制剂等。这些药物存在不同程度的毒副作用，长期应用存在治疗效果底下及成骨质量不好等问题，因此寻找新的OP治疗药物是世界性的难点与热点。中医在“整体观念”与辨证施治的医学理论指导下，对OP的治疗和预防上突显出独特的优势，引起国内外学者的广泛关注。

藁本内酯是从当归、川芎等植物中提取出的不溶于水的一类油性物质，也是目前评价当归、川穹等药材及制剂质量的重要依据之一。现有技术中还没有关于藁本内酯在防治骨质疏松的报道。

发明内容

解决的技术问题：本发明的目的是在藁本内酯现有的药理作用基础上，通过大量实验深入研究开发其药理功效，提供藁本内酯在防治骨质疏松症的新用途，以进一步提升其药用价值。

技术方案：藁本内酯在制备防治骨质疏松症药品中的应用。

所述骨质疏松症是一种以骨量地下、骨微结构破坏，导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性骨病。

进一步地，所述骨质疏松症包括原发性骨质疏松症和继发性骨质疏松症。

进一步地，所述原发性骨质疏松症为女性绝经后骨质疏松症和老年退化性骨质疏松症。

进一步地，所述继发性骨质疏松症为由内分泌代谢疾病、结缔组织疾病、肾脏疾病、消化道疾病和药物引起的骨质疏松症。

进一步地，所述应用是将藁本内酯和药剂学上可接受辅料制成丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂或冻干粉剂。

藁本内酯在制备促进骨形成药品中的应用。

防治骨质疏松症的药品，有效成分包括藁本内酯。

所述藁本内酯的有效浓度为0.1~100 μM。

有益效果：藁本内酯可通过提高骨形成能力，最终达到治疗骨质疏松症的目的。从而，藁本内酯可用于制备防治骨质疏松症的药品。

附图说明

图1为实施例1中藁本内酯对泼尼松龙所致的斑马鱼骨质疏松的影响结果，a为斑马鱼颅骨内骨成像照片、b为斑马鱼椎骨成像照片、c为斑马鱼颅骨内骨量统计结果、d为斑马鱼椎骨数目统计结果。

图2为实施例2中藁本内酯对成骨细胞分化的影响结果。

图3为实施例3中藁本内酯对氧化应激状态下MC3T3-E1细胞存活率的影响结果，a为24 h内藁本内酯对MC3T3-E1细胞活力影响结果、b为加入DMSO后MC3T3-E1细胞活力结果。

图4为实施例4中藁本内酯对氧化应激状态下MC3T3-E1细胞凋亡的影响结果，a为荧光分析结果、b为统计结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

本发明所述的藁本内酯结构式如式Ⅰ所示：

藁本内酯目前可以由含有该成分的常用中药，如当归、川芎、茶芎等植物中提取得到，也可以由合成方式人工制备得到，如公开号CN1552702A、CN1084851A和CN1778799A等中国专利文献，及其它相关文献（如：胡长鹰，丁宵霖等当归中藁本内酯的提取、分离与结构鉴定在《无锡经工大学学报》2003，9：69中的报道）都有合成方式制备藁本内酯的相关报道。由于藁本内酯在许多天然植物/药物中都存在，且多为顺式结构形式，因此在本发明的实施例中，作为有效成分使用的藁本内酯，以采用来源更为丰富的天然存在形式的藁本内酯更为有利。

以下实施例所采用的藁本内酯均是购买市售产品，CAS NO：81944-09-4，产品货号：ZT-71536，品牌：zzstandard，中文名：藁本内酯，英文名：Z-Ligustilide。

在以下实施例中所采用的藁本内酯有效浓度为0.1~100μM。

实施例1

藁本内酯对泼尼松龙所致的斑马鱼骨质疏松的影响

实验动物：斑马鱼AB品系购于凯基生物有限公司；昼夜节律：昼:夜=14h:10h；温度：(28.5±0.5)℃。

试剂和药品：泼尼松龙购自上海源叶生物科技有限公司；依替膦酸二钠购自上海源叶生物科技有限公司。

仪器：Leica M205FA体式荧光显微镜等。

分组与给药：分为对照组control（0.2%DMSO）、模型组model（25 μM泼尼松龙）、阳性药组DE（15 μg/ml依替磷酸二钠）、藁本内酯组LIG（0.1、1和10 μM）

实验方法：在受精后3天（dpf）开始，用25 μM泼尼松龙处理斑马鱼幼鱼连续6天。在造模2天后用依替膦酸二钠（DE;15 μg/ml）作为阳性药物，或给予藁本内酯（0.1、1和10 μM）治疗。为了检测斑马鱼幼鱼中的钙沉积，将活鱼在0.2％钙黄绿素中孵育1小时，用0.02%三卡因麻醉幼鱼，并用Leica M205FA体式荧光显微镜成像。在整个实验中使用相同的放大率，曝光时间，增益和对比度，并使用Image J中的绘图轮廓工具进行面积测量。成像图如图1的a和b所示。

统计分析：实验结果采用均数±标准差(mean±SD)表示，使用Graphpad Prism 5软件中one-way ANOVA的分析方法比较各组之间的差异，以P＜0.05代表有统计学意义。

图1的c和d为斑马鱼颅骨内骨量及椎骨数目的统计结果。结果显示，25 μM泼尼松龙组与空白组相比，斑马鱼颅骨内骨量及椎骨数目分别减少47%和91%左右。与25 μM泼尼松龙组比，依替磷酸二钠（15μg/ml）组颅骨内骨量及椎骨数目分别增加67%和47%左右，10 μM藁本内酯组颅骨内骨量及椎骨数目分别增加66%和39%左右，这与依替磷酸二钠的治疗效果相似。该结果表明藁本内酯可以治疗泼尼松龙诱导的斑马鱼骨形成抑制。

实施例2

藁本内酯对成骨细胞分化的影响

细胞：前成骨细胞系MC3T3-E1购自上海中科学院细胞库，大鼠股骨来源的骨髓间充质干细胞（BMSCs）自提。

试剂和药品：β-甘油磷酸盐购自Sigma；地塞米松购自Sigma；抗坏血酸购自Sigma。

仪器：Leica体式显微镜等。

分组与给药：分为空白组（0.1%DMSO）、藁本内酯组（10、50和100 μM）

实验方法：用含10%热灭活FBS的α-MEM培养液，同时按1：100的稀释比在培养液中添加双抗，于37℃，5% CO₂，饱和湿度的培养箱中进行培养。每两天更换培养基。当细胞长至90%左右时，用胰酶消化细胞至离心管中。以1000 rpm离心3 min。细胞离心后用α-MEM培养液重悬计数。将成骨细胞接种在12孔板（1×10⁵个细胞/孔）中，用含10%热灭活FBS的α-MEM培养液，添加10mM β-甘油磷酸盐、10nM地塞米松、50 mg/ml抗坏血酸，同时按1：100的稀释比在培养液中添加双抗，配置成骨分化诱导液，于37℃，5% CO₂，饱和湿度的培养箱中进行培养。空白组（0.1%DMSO）和藁本内酯组（10、50和100 μM）用成骨分化诱导液培养7~21天，茜素红染色观察成骨细胞分化形成的矿化结节。（茜素红染色检测钙化结节：将细胞在实验时间点取出后，用PBS小心清洗2次，每次1 min，清洗时注意不要将细胞钙化结节冲掉。细胞清洗后，向每孔加入3 mL的4%多聚甲醛，置于通风橱内固定15 min。弃去固定液，每孔加入3 mL的PBS清洗2次，每次1 min。将茜素红染液加入细胞培养孔，每孔1 mL，然后室温静置15min，进行茜素红染色。染色完毕后弃去茜素红染液，并用三蒸水冲洗掉多余染液，然后将细胞培养板放入60℃恒温箱中30 min烘干。细胞板中的白色钙化结节将与茜素红反应染成橘红色。体式显微镜下观察各组钙化结节染色结果，并拍照保存。）

如图2所示，MC3T3-E1细胞诱导分化7天时，均没有发现明显的钙化结节产生；分化14天时，空白组产生少量钙化结节，藁本内酯组以浓度依赖的方式促进钙化结节的产生；分化21天时，由于空白组成骨分化产生的钙化结节较多，与加药组没有显著差异；BMSCs诱导分化14天时，空白组开始分化，藁本内酯组与空白组相比，以浓度依赖的方式促进钙化结节的产生。该结果表明，藁本内酯可以有效促进成骨细胞分化成熟。

实施例3

藁本内酯对氧化应激状态下MC3T3-E1细胞存活率的影响

细胞：前成骨细胞系MC3T3-E1购自上海中科学院细胞库。

仪器：Bio-Tek酶标仪。

分组与给药：分为空白对照组control（0.1%DMSO），模型组model（0.4 mM H₂O₂），藁本内酯组LIG（1、10、50、100 μM）。

实验方法：用含10%热灭活FBS的α-MEM培养液，同时按1：100的稀释比在培养液中添加双抗，于37℃，5% CO₂，饱和湿度的培养箱中进行培养。每两天更换培养基。当细胞长至90%左右时，用胰酶消化细胞至离心管中。以1000 rpm离心3 min。细胞离心后用α-MEM培养液重悬计数，以每孔含培养液200 μl，1×10⁴个/孔接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁生长24 h后，加入藁本内酯（0.1、1、5、25、50和100 μM）继续培养24 h，MTT法检测细胞活力，观察藁本内酯的细胞毒性。以同样的方式种板，细胞贴壁生长24 h后，加入含0.4 mM H₂O₂损伤4 h后加入藁本内酯（0.1、1、5、25、50和100 μM）继续培养24 h。MTT法检测细胞活力，观察藁本内酯对过氧化损伤后细胞活力的影响。（MTT法：孵育结束后弃除板中培养液，每孔加入5mg/mL的MTT溶液10 μL和100 μL不含血清的α-MEM培养基。4 h后弃去培养上清，加入每孔加入150 ml DMSO。将细胞培养板放到振荡器上震荡10 min。设定酶标仪波长490 nm，检测并记录光密度（OD值）。）

统计分析：实验结果采用均数±标准差(mean±SD)表示，使用Graphpad Prism 5软件中one-way ANOVA的分析方法比较各组之间的差异，以P＜0.05代表有统计学意义。

图3为MC3T3-E1细胞活力统计结果。如图a所示，24 h内藁本内酯对MC3T3-E1细胞活力没有显著影响，说明藁本内酯的细胞毒作用不明显。如图b所示，与空白组相比，0.4 mMH₂O₂损伤MC3T3-E1细胞4 h后细胞活力降低20%左右，此时，与模型组相比，50 μM及100 μM藁本内酯组细胞活力分别增加7%和17%左右，说明藁本内酯能显著改善氧化应激状态下的细胞存活率。

实施例4

藁本内酯对氧化应激状态下MC3T3-E1细胞凋亡的影响

细胞：前成骨细胞系MC3T3-E1。

仪器：BECKMAN流式细胞仪

分组与给药：分为空白对照组control（0.1%DMSO），模型组model（0.4 mM H₂O₂），藁本内酯组LIG（1、10、50、100 μM）。

实验方法：用含10%热灭活FBS的α-MEM培养液，同时按1：100的稀释比在培养液中添加双抗，于37℃，5% CO₂，饱和湿度的培养箱中进行培养。每两天更换培养基。当细胞长至90%左右时，用胰酶消化细胞至离心管中。以1000 rpm离心3 min。细胞离心后用α-MEM培养液重悬计数。以每孔含培养液1.5 ml，3×10⁵个/孔接种于6孔细胞培养板中，细胞贴壁生长24 h后加入含0.4 mM H₂O₂损伤4 h后加入藁本内酯共培养24 h。用Annexin V-FITC/PI标记细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡。（流式细胞仪检测细胞凋亡：用FITC标记的膜联蛋白-V（Annexin V FITC）检测成骨细胞的凋亡。 碘化丙啶（PI）用于确定细胞坏死。 在暴露于各种实验条件后，将细胞用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化并在37℃下用荧光染料标记，然后用流式细胞仪进行细胞荧光分析。）

统计分析：实验结果采用均数±标准差(mean±SD)表示，使用Graphpad Prism 5软件中one-way ANOVA的分析方法比较各组之间的差异，以P＜0.05代表有统计学意义。

如图4所示，与空白对照组相比，0.4 mM H₂O₂损伤MC3T3-E1细胞4 h后可造成明显的细胞凋亡，凋亡率增加约2.73倍，同时，与模型组相比，1、10、50和100 μM藁本内酯可以以剂量依赖的方式抗成骨细胞凋亡，凋亡率分别减少23%、33%、53%、51%左右，说明藁本内酯能显著抗氧化应激状态下的细胞凋亡。

上述实验结果表明，藁本内酯可以显著改善泼尼松龙所致的斑马鱼骨质疏松并且显著促进成骨细胞分化，同时，提高氧化应激状态下成骨细胞的存活率，抑制细胞凋亡，进而对成骨细胞产生保护作用。证明藁本内酯可能通过提高骨形成能力，最终达到治疗骨质疏松症的目的，从而，可将藁本内酯应用于制备治疗骨质疏松症的药物。另外，藁本内酯也可用作骨形成促进，与已上市骨质疏松症药物协同，用于防治骨质疏松症。

Claims (7)

1.藁本内酯在制备防治骨质疏松症药品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述骨质疏松症包括原发性骨质疏松症和继发性骨质疏松症。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述原发性骨质疏松症为女性绝经后骨质疏松症和老年退化性骨质疏松症。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述继发性骨质疏松症为由内分泌代谢疾病、结缔组织疾病、肾脏疾病、消化道疾病和药物引起的骨质疏松症。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用是将藁本内酯和药剂学上可接受辅料制成丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂或冻干粉剂。

6.藁本内酯在制备促进骨形成药品中的应用。

7.防治骨质疏松症的药品，有效成分包括藁本内酯。