CN111202729A - 藁本内酯在制备减轻小胶质细胞损伤、防治缺血性脑卒中或者修复脑损伤的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了藁本内酯在制备减轻小胶质细胞损伤、防治缺血性脑卒中或者修复脑损伤的药物中的应用，属于生物医药技术领域。藁本内酯通过抑制小胶质细胞焦亡和/或抑制NLRP3炎症小体激活来减轻小胶质细胞损伤，进而达到防治缺血性脑卒中和修复脑损伤的目的。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及藁本内酯在制备减轻小胶质细胞损伤、防治缺血性脑卒中或者修复脑损伤的药物中的应用。
背景技术
小胶质细胞是中枢神经系统(centralnervoussystem，CNS)中常见的免疫细胞。中枢神经系统一旦受到内源性或外源性因素侵袭，小胶质细胞便迅速激活并集聚到病灶及其周围，同时分泌和(或)释放各种因子。在中枢神经系统中，NLRP3炎症小体主要表达在小胶质细胞中，在沉默NLRP3基因后，可减少促炎细胞因子的释放，减轻炎性反应和组织损伤。多年来，临床上对CNS疾病的治疗大都以保护神经元为主，对CNS其他的免疫细胞作用机制研究较少。随着对大脑认识的逐步加深，发现小胶质细胞对修复脑损伤有重要作用。目前，现有技术中还没有关于藁本内酯用于减轻小胶质细胞损伤的报道和记载。
发明内容
本发明的目的在于提供藁本内酯在制备减轻小胶质细胞损伤、防治缺血性脑卒中或者修复脑损伤的药物中的应用，藁本内酯通过抑制小胶质细胞焦亡和/或抑制NLRP3炎症小体激活来减轻小胶质细胞损伤，进而达到防治缺血性脑卒中和修复脑损伤的目的。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了藁本内酯在制备减轻小胶质细胞损伤的药物中的应用。
优选的，所述藁本内酯通过抑制小胶质细胞焦亡和/或抑制NLRP3炎症小体激活来减轻小胶质细胞损伤。
本发明提供了藁本内酯在制备抑制小胶质细胞焦亡的药物中的应用。
本发明提供了藁本内酯在制备抑制NLRP3炎症小体激活的药物中的应用。
本发明提供了藁本内酯在制备预防和/或治疗缺血性脑卒中的药物中的应用。
优选的，所述藁本内酯通过减轻小胶质细胞损伤来预防和/或治疗缺血性脑卒。
本发明提供了藁本内酯在制备修复脑损伤的药物中的应用。
优选的，所述藁本内酯通过减轻小胶质细胞损伤来修复脑损伤。
本发明的有益效果：本发明提供了藁本内酯在制备减轻小胶质细胞损伤、防治缺血性脑卒中或者修复脑损伤的药物中的应用，藁本内酯通过抑制小胶质细胞焦亡和/或抑制NLRP3炎症小体激活来减轻小胶质细胞损伤，进而达到防治缺血性脑卒中和修复脑损伤的目的。
附图说明
图1为CCK8法测定细胞活力的结果；
图2为LDH释放测定结果；
图3为藁本内酯抑制OGD/R诱导的BV-2小胶质细胞NLRP3炎症小体的激活的代表性免疫印迹图片；
图4为藁本内酯抑制OGD/R诱导的BV-2小胶质细胞NLRP3炎症小体的激活的半定量分析结果；
图5为藁本内酯抑制OGD/R诱导的焦亡执行蛋白GSDMD的表达及剪切的免疫印迹图；
图6为藁本内酯抑制OGD/R诱导的焦亡执行蛋白GSDMD的表达及剪切的半定量分析结果；
图7为藁本内酯抑制OGD/R诱导的BV-2小胶质细胞焦亡的免疫荧光照片图；
图8为藁本内酯抑制OGD/R诱导的BV-2小胶质细胞焦亡的免疫荧光定量分析结果。
具体实施方式
本发明提供了藁本内酯(ligustilide，LIG)在制备减轻小胶质细胞损伤的药物中的应用；所述藁本内酯优选的通过抑制小胶质细胞焦亡和/或抑制 NLRP3炎症小体激活来减轻小胶质细胞损伤。
本发明提供了藁本内酯在制备抑制小胶质细胞焦亡的药物中的应用。
本发明提供了藁本内酯在制备抑制NLRP3炎症小体激活的药物中的应用。
本发明提供了藁本内酯在制备预防和/或治疗缺血性脑卒中的药物中的应用；所述藁本内酯优选的通过减轻小胶质细胞损伤来预防和/或治疗缺血性脑卒。
本发明提供了藁本内酯在制备修复脑损伤的药物中的应用；所述藁本内酯优选的通过减轻小胶质细胞损伤来修复脑损伤。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、细胞培养方案:
BV-2小鼠小胶质细胞购买自中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)，培养在含体积百分比为10％的FBS、100U/ml双抗、11.1mmol/L葡萄糖的RPMI1640培养基中培养。培养环境为37℃恒温，5％二氧化碳。每2天更换培养液，细胞融合度达80～90％时传代。
2、细胞实验分组方案：
BV-2小胶质细胞分为3组：对照组(control)、糖氧剥夺/再复氧组(OGD/R)、糖氧剥夺/再复氧+藁本内酯组(OGD/R+LIG)。Control组细胞正常培养；OGD/R组和OGD/R+LIG组细胞更换为无糖培养基后放入于厌氧罐中(0.2％O2+4.8％CO2+95％N2)糖氧剥夺处理3h后，换回正常培养基继续正常培养24h；OGD/R+LIG组细胞用浓度为2.5μmol/L的LIG(藁本内酯)预处理3h，以及在OGD/R处理的同时给予LIG处理；实验结束终点采用不同方法处理细胞检测不同指标。
3、CCK8法测定细胞活力
取对数生长期的BV-2小胶质细胞，以细胞浓度1×105mL-1接种于96孔板，每孔100μL，于37℃培养箱(5％CO2+95％O2)培养。细胞培养24h后，对照组正常培养，OGD/R组和OGD/R+LIG组细胞更换为无糖培养基后OGD 处理3h后，换回正常培养基继续正常培养24h。实验结束后，每孔加入10mL CCK8试剂，测定各组450nm的吸光度值，计算细胞存活率。
CCK-8法检测结果显示，OGD/R损伤后小胶质细胞活力明显低于control 组，而OGD/R+LIG组细胞活力较OGD/R组有明显增高(图1)。
4、LDH释放测定
将对数生长的BV-2小胶质细胞，以细胞浓度1×105mL-1接种于96孔板，每孔100μL。实验分为对照组(control)、糖氧剥夺/再复氧组(OGD/R)、糖氧剥夺/再复氧+藁本内酯组(OGD/R+LIG)。BV-2小胶质细胞贴壁10h 以后，处理组给予更换为无糖培养基后OGD处理3h后，换回正常培养基继续培养24h，每孔终体积为200μL。干预结束前的1h，取出96孔板，在裂解细胞孔中加入LDH释放试剂，并吹打混匀，然后继续置于培养箱中孵育。干预结束后，将96孔板400g离心5min。每孔分别取120μL上清液，并转入到一新的96 孔板。各孔分别加入60μLLDH检测工作液。混匀，室温避光孵育30min，然后在490nm处测定吸光度，使用600nm作为参考波长进行双波长测定，进行 LDH释放检测。
LDH检测结果显示，OGD/R损伤组培养上清中LDH浓度显著明显高于 control组，而OGD/R+LIG组培养上清中LDH浓度较OGD/R组有明显下降 (图2)。细胞损伤后会释放LDH至培养上清中，因此培养上清中LDH浓度可反映细胞损伤的严重程度。以上结果均表明，藁本内酯对BV-2小胶质细胞的损伤有修复作用。
5、NLRP3炎症小体激活检测
5.1细胞总蛋白的提取
实验分组及处理同前。实验结束后，细胞用预冷的PBS洗三次，然后加入RIPA裂解液100μL(按照RIPA：PMSF：cocktail＝100：10：1的体积比例配制RIPA裂解液)，将细胞从培养皿中刮下，收集到1.5mLEP管中，振荡，使裂解液和细胞充分接触。置于冰上，每5min振荡一次，裂解30min。细胞裂解后，12000g、4℃离心15min。离心后，取上清，弃去细胞碎片。
5.2BCA蛋白定量检测试剂盒测定蛋白浓度
根据BCA蛋白定量试剂盒说明书进行蛋白定量。2mg/mL的蛋白标准品，双蒸水倍比稀释蛋白标准品，浓度为0mg/mL、0.03125mg/mL、0.0625mg/mL、 0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL。在96孔板中加入20μL稀释后的标准品，样品孔加入4μL蛋白样品(若蛋白浓度较高，需稀释后再加入)，蒸馏水补齐致20μL体积，再加入200μL工作液(A液体积：B液体积＝1：50)，37℃孵育30min，酶标仪检测OD值，检测波长为 562nm。计算标准曲线，拟合公式，测定待测样品的蛋白浓度，保证免疫印迹实验时每组上样的总蛋白量是一致的。
5.3蛋白免疫印迹(westernblot)
SDS-PAGE胶配制：清洗玻璃板，吹干。玻板固定在制胶架上，根据目的蛋白分子量大小配制相应浓度的PAGE分离胶(8％、10％、12％)，注入配好的分离胶，顶层加入乙醇压平液面，待分离胶凝固后倒掉乙醇，吸干残留乙醇。配制好浓缩胶，注入上层胶后插梳子，注意不要产生气泡。
蛋白电泳及转膜：蛋白定量后，根据蛋白80μg/孔的加样量，计算蛋白的加样体积，加入5×上样缓冲液，混匀，沸水煮5min变性，1000g离心2min。上样，将蛋白样品加入预制的PAGE胶中，开始电泳，恒压80V，30min之后， 120V，1h。甲醇浸泡1min激活PVDF膜。电泳结束后，按照黑板-海绵-胶-PVDF 膜-白板-海绵(滤纸)的顺序夹好，避免胶膜之间产生气泡，恒压70V，30min； 90V，1min进行电转，冰浴。转完膜后，用5％脱脂牛奶封闭1h。
抗体孵育：根据抗体说明书要求的浓度用抗体稀释液配制一抗 NLRP3(1：10000，Adipogen，Switzerland)，caspase-1(1：10000，Santa Cruz，USA)andIL-1β(1：10000，CellSignalingTechnology，MA，USA)， GSDMD(1：10000，Abcam，Cambridge，UK)。根据目的蛋白的分子量剪膜，敷育相应的抗体，4℃孵育过夜。β-actin(1:5000)作内参，判断蛋白上样量的一致性。次日，TBST洗膜5min×3次，二抗室温孵育1h后，洗膜。化学发光成像系统曝光。使用ImageJ软件进行半定量分析。
Westernblot结果显示，与control组相比，OGD/R显著增强了NLRP3 蛋白表达及caspase-1和IL-1β的剪切，提示OGD/R刺激可激活NLRP3炎症小体；用LIG处理细胞后，NLRP3蛋白表达以及caspase-1和IL-1β剪切明显下调(图3和图4，其中图3为藁本内酯抑制OGD/R诱导的BV-2小胶质细胞NLRP3炎症小体的激活的代表性免疫印迹图片；图4为藁本内酯抑制OGD/R诱导的BV-2小胶质细胞NLRP3炎症小体的激活的半定量分析结果， **p<0.01,***p<0.001)，提示LIG能抑制OGD/R诱导的NLRP3炎症小体的激活，进而抑制OGD/R引起的BV-2细胞的炎症反应。
6、细胞焦亡分析
细胞焦亡的经典途径，具有caspase-1依赖性，同时细胞焦亡拥有细胞核DNA 断裂的特性，这一特性与细胞凋亡相似都可以被TUNEL(TdT-mediateddUTP nickendlabeling)细胞凋亡检测试剂盒检测为阳性。因此active caspase-1+/TUNEL+双阳性的细胞被认定为是焦亡细胞。
BV-2小胶质细胞接种在共聚焦玻底培养皿中，实验分组及处理同前。实验结束后，4％多聚甲醛固定20min，去除多聚甲醛后PBS洗3次，每次5min。在细胞上滴加0.3％TritonX-100通透，5min后放入PBS洗3次，每次5min。 1％BSA封闭30min后，滴加cleavedcaspase-1一抗(1：100，BiorbytCambridge， UK)，置于4℃冰箱孵育过夜。去除一抗，PBS洗3次，每次5min，滴加荧光二抗Alexa
488goatanti-rabbit(1：100，Abcam，Cambridge， UK)，避光室温孵育30min。去除二抗后，在样品上加50μLTUNEL (TdT-mediateddUTPNick-EndLabeling)检测液，37℃避光孵育60min，PBS 洗涤3次。用抗荧光淬灭封片液封片后激光共聚焦显微镜下观察拍照。
Westernblot结果显示，与control组相比，OGD/R组GSDMD的剪切体 GSDMD-NT明显增加，LIG处理细胞后GSDMD-NT减少(图5和图6，其中图5为藁本内酯抑制OGD/R诱导的焦亡执行蛋白GSDMD的表达及剪切的免疫印迹图；图6为藁本内酯抑制OGD/R诱导的焦亡执行蛋白GSDMD 的表达及剪切的半定量分析结果，*p<0.05，**p<0.01)；免疫荧光检测显示，OGD/R组存在明显的caspase-1和TUNEL双阳性焦亡细胞，OGD/R+LIG 组caspase-1和TUNEL双阳性焦亡细胞比例显著下降(图7和图8，其中图 7为藁本内酯抑制OGD/R诱导的BV-2小胶质细胞焦亡的免疫荧光照片图；图8为藁本内酯抑制OGD/R诱导的BV-2小胶质细胞焦亡的荧光照片定量分析结果，***p<0.001)。以上结果均提示，OGD/R可诱导BV-2小胶质细胞发生焦亡，而LIG可抑制OGD/R诱导的BV-2细胞焦亡，提示LIG对BV-2 小胶质细胞功能的保护作用是通过抑制NLRP3炎症小体激活及其介导的细胞焦亡实现的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.藁本内酯在制备减轻小胶质细胞损伤的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述藁本内酯通过抑制小胶质细胞焦亡和/或抑制NLRP3炎症小体激活来减轻小胶质细胞损伤。
3.藁本内酯在制备抑制小胶质细胞焦亡的药物中的应用。
4.藁本内酯在制备抑制NLRP3炎症小体激活的药物中的应用。
5.藁本内酯在制备预防和/或治疗缺血性脑卒中的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述藁本内酯通过减轻小胶质细胞损伤来预防和/或治疗缺血性脑卒。
7.藁本内酯在制备修复脑损伤的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述藁本内酯通过减轻小胶质细胞损伤来修复脑损伤。
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| CN109498617A (zh) * | 2018-12-26 | 2019-03-22 | 南京中医药大学 | 藁本内酯在制备防治骨质疏松症药品中的应用 |
| CN109568308A (zh) * | 2017-12-28 | 2019-04-05 | 西南大学 | 藁本内酯在制备用于防治急性髓性白血病的药物中的应用 |
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