CN107088200A - 黑灵芝多糖用于制备哺乳动物肠上皮细胞炎性因子调节药物的应用 - Google Patents
黑灵芝多糖用于制备哺乳动物肠上皮细胞炎性因子调节药物的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明发现黑灵芝多糖对处于丙烯酰胺损伤条件下的肠上皮细胞中多种炎症细胞因子具有确切的调节作用。具体而言，可下调促炎性细胞因子IL‑1β、IL‑2、TNF‑α的表达量，提升抗炎性细胞因子IL‑4、IL‑10的表达量，从而缓解炎症性损伤；此外，通过口服黑灵芝多糖后肠组织中碱性磷酸酶含量与尿酸含量的变化表明，黑灵芝多糖作用下的肠上皮细胞的正常生理功能得到了保护，黏膜上皮的完整性更好；与此同时，实验发现黑灵芝多糖可显著改善肠粘膜的通透性，提升包括CAT、T‑GSH、GSH在内的抗氧化酶的表达水平。基于黑灵芝多糖的以上新性质，本发明确定了利用其治疗肠上皮细胞炎性损伤的药物用途，其中又以丙烯酰胺性肠道损伤的治疗效果较佳。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，进一步涉及物质的新的医药用途，具体涉及黑灵 芝多糖用于制备哺乳动物肠上皮细胞炎性因子调节药物的应用。
背景技术
肠上皮细胞是实现肠道消化、免疫、内分泌功能的主要组织细胞，也是构筑 肠道黏膜屏障的主要成分，因此成为多种肠毒性物质的致病作用对象。以丙烯酰 胺(acrylamide，AA)为例，在经口服途径进入人体后，可以快速到达肠道，进 入小肠细胞后导致胞内还原型谷胱甘肽显著下降，促进活性氧自由基大量生成， 导致细胞死亡；同时，AA还能够导致肠道肌层损伤、小肠壁和黏膜结构改变等。 在以上致病作用中，通常伴随着广泛的炎症性损伤，尽管其并非上述毒性物质的 的直接病理损伤，但客观上加剧了病情，也成为肠上皮细胞损伤对症治疗的重要 环节。
黑灵芝多糖是多孔菌科灵芝属黑灵芝真菌菌丝体的次生代谢产物，存在于黑 灵芝的菌丝体和子实体中。现有技术研究表明，黑灵芝多糖具有确切的抗氧化作 用，同时具有一定的抗肿瘤活性；此外，有研究者发现黑灵芝多糖对免疫系统具 有调节作用，尤其可作用于巨噬细胞和脾淋巴细胞，对淋巴细胞亚群和细胞因子 表达水平具有影响。然而对于黑灵芝多糖对肠上皮细胞、尤其是丙烯酰胺损伤条 件下的肠上皮细胞的免疫调节作用，现有技术未见披露。
发明内容
本发明要解决的一个技术问题是提供黑灵芝多糖的一种新用途。
本发明要解决的另一技术问题是提供可用于哺乳动物肠上皮细胞炎性损伤 治疗的一种新药物。
本发明要解决的再一技术问题是实现丙烯酰胺损伤条件下肠上皮细胞多种 病理损伤的治疗。
为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了黑灵芝多糖用于制备哺乳动物肠上皮细胞炎性因子调节药物 的应用，其中，所述调节是降低细胞因子IL-1β、IL-2、TNF-α的表达量，同时 提升细胞因子IL-4、IL-10的表达量。
作为优选，所述哺乳动物是处于丙烯酰胺损伤条件下的哺乳动物。
作为优选，所述药物还降低肠组织中的碱性磷酸酶含量。
作为优选，所述药物还提升肠粘膜的通透性。
作为优选，所述药物降低肠组织中D-乳酸含量、内皮素-1、一氧化氮的含 量。
作为优选，所述药物还降低肠组织中尿酸的含量。
作为优选，所述药物还提升肠组织中抗氧化酶CAT、T-GSH、GSH的活性。
作为优选，所述药物的剂型是口服剂。
作为优选，所述药物还降低肠组织中抗氧化酶SOD的活性、降低过氧化产 物MDA的含量。
作为优选，所述药物的有效计量为20mg/kg。
在以上技术方案中，所述“丙烯酰胺损伤条件下”，是指由丙烯酰胺作用于 肠上皮细胞而导致其发生病理损伤的过程中。所述黑灵芝多糖是指以黑灵芝菌丝 体或子实体为原料，经常规的灵芝多糖提取手段提取得到的多糖；其中所述常规 提取手段，可以是以下步骤：干燥的黑灵芝子实体粉碎到适合的粒度，用95％ 乙醇室温下搅拌48h脱脂，加入蒸馏水，100℃下提取2h，过滤，浓缩，过滤。 滤液加入乙醇4℃下沉淀多糖(加入4倍于多糖水溶液的乙醇)，醇沉后，4000×g 下离心20min，Sevag法(氯仿：正丁醇＝4：1)去除游离蛋白，透析，浓缩，冻 干，得精多糖；当然，在以上技术思路的指引下，采用其他常规提取手段得到的黑灵芝多糖亦可用于本发明。
本发明创新性的发现黑灵芝多糖对处于丙烯酰胺损伤条件下的肠上皮细胞 中多种炎症细胞因子具有确切的调节作用，从而改善免疫系统效应，进而用于治 疗相关病理损伤。具体而言，可下调促炎性细胞因子IL-1β、IL-2、TNF-α的表 达量，提升抗炎性细胞因子IL-4、IL-10的表达量，从而缓解炎症性损伤；此外， 通过口服黑灵芝多糖后肠组织中碱性磷酸酶含量与尿酸含量的变化表明，黑灵芝 多糖作用下的肠上皮细胞的正常生理功能得到了保护，黏膜上皮的完整性更好； 与此同时，实验发现黑灵芝多糖可显著改善肠粘膜的通透性，提升包括CAT、 T-GSH、GSH在内的抗氧化酶的表达水平。
基于黑灵芝多糖的以上新性质，可应用其治疗以肠上皮细胞炎性损伤为效应 的多种疾病，其中又以丙烯酰胺性肠道损伤的治疗效果较佳。
附图说明
图1是本发明具体实施方式中实验分组情况及流程图。
图2是本发明具体实施方式中不同实验组肠组织抗氧化酶CAT活性对比图。
图3是本发明具体实施方式中不同实验组肠组织抗氧化酶GSH活性对比图。
图4是本发明具体实施方式中不同实验组肠组织抗氧化酶SOD活性对比图。
图5是本发明具体实施方式中不同实验组肠组织抗氧化酶T-GSH活性对比 图。
图6是本发明具体实施方式中不同实验组肠组织过氧化产物MDA含量对比 图。
图7是本发明具体实施方式中不同实验组肠组织尿酸含量对比图。
图8是本发明具体实施方式中不同实验组肠组织碱性磷酸酶含量对比图。
图9是本发明具体实施方式中不同实验组肠上皮细胞促炎细胞因子IL-1β、 IL-2、TNF-α的含量对比图。
图10是本发明具体实施方式中不同实验组肠上皮细胞抗炎细胞因子IL-10、 IL-4的含量对比图。
图11是本发明具体实施方式中不同实验组肠组织D-乳酸、ET-1、NO含量 对比图。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细 节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能 的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的 数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值 在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到 110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同 时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的 精度有关。
除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技 术人员普遍理解的相同含义。
1、材料与方法
1.1材料与试剂
黑灵芝采自江西赣州赣南灵芝基地，黑灵芝多糖由本实验室自制，黑灵芝多 糖的分离纯化采用标准程序对黑灵芝多糖进行分离。干燥的黑灵芝子实体粉碎到 适合的粒度，用95％乙醇室温下搅拌48h脱脂，加入蒸馏水，100℃下提取2h， 过滤，浓缩，过滤。滤液加入乙醇4℃下沉淀多糖(加入4倍于多糖水溶液的乙醇)， 醇沉后，4000×g下离心20min，Sevag法(氯仿：正丁醇＝4：1)去除游离蛋白， 透析，浓缩，冻干，得精多糖。
超氧化物歧化酶测定试剂盒(SOD)、过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒、谷胱甘 肽过氧化物酶测定试剂盒(GSH-Px)、丙二醛测定试剂盒(MDA)及BCA蛋白 浓度测定试剂盒均购买于碧云天生物技术研究或者南京建成生物工程研究所。大 鼠IL-6和IL-10ELISA试剂盒购自于武汉博士德公司，IL-Iβ、TNF-α、IL-2、 L-4、IL-6、IL-10、D-lac、ET-1ELISA试剂盒购自于南京建成生物工程研究所。 一氧化碳(NO)试剂盒、碱性磷酸酶(AKP)试剂盒、尿酸(UA)试剂盒、总 谷胱甘肽(T-GSH)试剂盒均购买于南京建成生物工程研究所。
实验动物：清洁级大鼠Sprague Dawley(SD)雄性大鼠，体重160-180g(资 格证号)，购自于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。
1.2主要仪器设备
高速台式离心机德国Sigma公司；全波长扫描式多功能读数仪(多功能酶标 仪)美国Thermo公司；超纯水仪美国Millipore公司；生化培养箱上海森信实验 仪器公司。
2、实验方法
2.1动物实验设计
健康成年雄性SD大鼠56只，体重(160±180)g，大鼠在12h：12h明暗循环 的动物房内适应性饲养1周。然后将小鼠随机分为7组，每组8只，灌胃给药： 1组为正常对照组，给同体积生理盐水；2组为AA染毒模型组，AA水溶液 (20mg/kg bw)；3组为阳性对照组(N-乙酰半胱氨酸组，N-acetyl-L-cysteine，NAC：200mg/kg bw)；4-6组为毒性抑制组，分别在染毒AA水溶液中同时添加 黑灵芝多糖低剂量(50mg/kg bw)、中剂量(100mg/kg bw)、高剂量(200mg/kg bw)； 7组为高剂量多糖组(200mg/kg bw)。正常对照组给予等体积的生理盐水，2-6 组在给予相应药物半小时候后，口腔灌胃AA水溶液，每天一次，连续30d，最 后一次给药24h后处死动物，进行各相关指标的测定。动物实验流程如图1所示。
动物实验过程中选用的N-乙酰半胱氨酸是一种常用的抗氧化剂，N-乙酰半 胱氨酸已经有大量文献报道，能够有效的减弱丙烯酰胺所导致的机体损伤，提高 机体内的抗氧化防御能力等，因此本实验选用N-乙酰半胱氨酸作为阳性对照组 是合适的。
2.2大鼠处理及样品的收集
大鼠处理及血清的制备：最后一次给药24h后，用4％的水合氯醛(1ml/100g) 进行麻醉，用摘眼球取血法取大鼠外周血，放置室温待血清分层后，以4000r/min， 4℃冷冻离心10min，吸取上层血清部分，4℃条件下备用。
解剖分离收集小肠组织。并用生理盐水清洗，放置于EP管中，放于-80℃备 用。
用于制作肠组织切片：空肠中部取约5cm肠段，在冰冷生理盐水中漂洗净 内容物后，于2.5％戊二醛-多聚甲醛中固定；其余肠组织放置于EP管中，放于 -80℃备用。
2.3动物一般情况观察
在实验期间观察老鼠状态，并记录体重。
2.4小肠组织切片材料的准备及形态学的观察
按石蜡切片的常规制作方法：经固定-冲洗-脱水-透明-浸蜡-包埋-切片-固定-染色(脱蜡-染色-脱水)-封片-观察记录结果。光镜下观察组织形态学变化。测 定肠黏膜厚度、肠绒毛高度、隐窝深度并比较肠绒毛高度/隐窝深度值(V/C)。 评价肠黏膜屏障结构损伤程度。
肠组织切片的制作：
(1)固定：大鼠解剖后，迅速取出小肠组织，截取5cn左右的空场，注意 不能人为损伤肠粘膜组织，并小心去除肠壁上粘附的结缔组织，将取出的小肠组 织立即投入装有4％多聚甲醛的EP管中，固定5h后在横切面切口，利于组织内 部固定，后再固定24h。
(2)脱水：将组织依次从低浓度酒精投入到高浓度酒精。具体为85％酒精 2h，
95％酒精Ⅰ1.5h，95％酒精Ⅱ2h，100％酒精Ⅰ1.5h，100％酒精Ⅱ1h。
(3)透明、浸蜡：将组织置于二甲苯中25min使组织透明，后移入石蜡内， 于60℃孵箱3h。
(4)包埋、切片：将石蜡加热溶解后倒入长条纸盒内，浸蜡组织放于纸盒 中央，应注意应切面朝下，位置正放，待石蜡变成固体状；于切片机上切成3μm 的切片后，放入温水中，使切片平整无褶皱；将平整的切片小心移于载玻片上， 放在40℃孵箱24h以烘干。
(5)石蜡切片脱蜡入水：将有切片的载玻片放入二甲苯Ⅰ(56℃)20min， 二甲苯Ⅱ(56℃)20min，然后置于梯度酒精：100％酒精3min，95％酒精3min， 85％酒精3min，70％酒精3min，自来水冲洗5min，蒸馏水漂洗5min。
(6)染色：将载玻片放入苏木精溶液中5min，过蒸馏水；饱和碳酸锂10～ 20s，自来水洗数秒；盐酸酒精分化2～3s，自来水冲洗数秒。
(7)石蜡脱水、透明及封片：将载玻片放入梯度酒精以脱水：95％酒精Ⅰ 3min，95％酒精Ⅱ3min，95％酒精Ⅲ3min，100％酒精Ⅰ3min，100％酒精Ⅱ3min， 100％酒精Ⅲ3min，然后放入二甲苯以透明：二甲苯Ⅰ5min，二甲苯Ⅱ5min，二 甲苯Ⅲ5min，中性树脂胶封片。
(8)显微镜观察组织病理变化。
2.5小肠组织中氧化与损伤相关指标的测定
氧化损伤指标：超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA) 和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，以及还原性谷胱甘肽、总谷胱甘肽试 剂盒。按试剂盒说明书上的操作步骤进行检测和计算。
2.6小肠组织中免疫指标的测定
用预冷的生理盐水或者PBS(0.01M，pH7.0-7.4)冲洗组织，去除残余血液， 称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按照1：9的重量体 积比)加入组织匀浆器中，于冰上充分研磨，最后将匀浆液于4000×g离心15min， 取上清检测。上清液可分装保存-80℃备用。免疫功能指标：IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α；均采用酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒检测。按照说明 书上的操作步骤进行检测和计算。
2.7肠黏膜通透性指标的测定
尿酸、D-乳酸、NO(一氧化氮)、ET-1(内皮素-1)、碱性磷酸酶(AKP/ALP)。 按说明书上的操作步骤进行检测和计算。
2.8统计学处理
实验数据采用平均值±标准偏差(means±S.D)表示，组间均数比较采用 SPSS16.0统计软件，Graph Pad Prism 6作图，以单因素方差分析和Turkey’s 多因素t检验进行。
3、结果与分析
3.1黑灵芝多糖对AA染毒模型大鼠肠组织损伤的修复作用
3.1.1黑灵芝多糖对AA染毒模型大鼠肠组织抗氧化酶活性(SOD、CAT、T-GSH、 GSH)和过氧化产物MDA含量的影响
黑灵芝多糖对AA染毒模型大鼠肠组织抗氧化酶活性(SOD、GSH、T-GSH、 CAT)的影响如图2～5所示。
经检测得，阳性对照组(N-乙酰半胱氨酸组)和黑灵芝多糖处理组结果比较 得出，肠组织中SOD、CAT、GSH、T-GSH的活力无显著性差异，与染毒模型 组相比，阳性对照组和黑灵芝多糖处理组中SOD、CAT、GSH、T-GSH的活力 均有所升高，与染毒组相比，具有明显的显著性差异。而黑灵芝多糖单独处理组 (200mg/kg body weight)中抗氧化物酶：SOD、CAT、GSH、T-GSH与正常组 相比，无明显的显著性差异，可以说明，黑灵芝多糖单独处理时，对机体内的抗 氧化防御系统无损伤、对机体无毒害作用。
不同实验组中肠组织过氧化产物MDA含量的对比情况见图6。
结果发现，丙烯酰胺染毒组中，过氧化产物MDA的含量明显高于正常对照 组，且具有显著性的差异，从阳性对照组(N-乙酰半胱氨酸组)和黑灵芝多糖处 理组的结果发现，不同浓度的黑灵芝多糖均能够明显降低机体内MDA的含量， 随着黑灵芝多糖浓度的升高，机体内MDA含量逐渐降低，具有浓度依赖性。从 图中还可以发现，低浓度的黑灵芝多糖(50mg/kg body weight)实验组中MDA 的含量与阳性对照组相比，水平相当，说明低浓度的黑灵芝多糖对机体具有明显 的保护作用。
3.1.2黑灵芝多糖对AA染毒模型大鼠肠组织中尿酸含量的影响
肠组织中尿酸含量的对比情况如图7所示。与染毒模型组相比，阳性对照组 和不同浓度的黑灵芝多糖保护组检测得UA含量均明显的降低，具有显著性差 异。同时，从图中可以发现，低浓度的黑灵芝多糖实验组中NO的含量最低。 3.1.3黑灵芝多糖对AA染毒模型大鼠肠组织碱性磷酸酶活性的影响
黑灵芝多糖对AA染毒模型大鼠肠组织碱性磷酸酶含量的影响如图8所示。 与染毒模型组相比，阳性对照组和不同浓度的黑灵芝多糖保护组检测得AKP含 量均明显的降低，具有显著性差异。同时，从图中可以发现，阳性对照组中AKP 的含量最低。
3.1.4黑灵芝多糖对AA染毒模型大鼠肠组织免疫因子的影响
不同实验组中，肠组织中促炎因子IL-1β、IL-2、TNF-α含量的对比情况如 图9所示。与染毒模型组相比，黑灵芝多糖对体内炎症因子具有下调作用，使用 不同浓度黑灵芝多糖处理的实验组大鼠其体内肠组织中促炎细胞因子IL-1β、 IL-2、TNF-α含量均有所降低，尤其是对促炎细胞因子IL-1β、TNF-α的作用显 著。从图9结果可以发现，口服不同浓度的黑灵芝多糖均可以有效的缓解丙烯酰 胺所导致的炎症临床症状，黑灵芝多糖能够抑制丙烯酰胺诱导的大鼠肠组织中促 炎细胞因子IL-1β、IL-2、TNF-α的表达，对其细胞因子的分泌的一直作用均具 有显著性。
黑灵芝多糖对AA染毒模型大鼠肠组织中抗炎因子IL-4、IL-10含量的影响 图10所示。黑灵芝多糖能够抑制丙烯酰胺诱导的大鼠肠组织中抗炎细胞因子 IL-10、IL-4的表达，对其细胞因子的分泌的一直作用均具有显著性。
3.2黑灵芝多糖对AA染毒模型大鼠肠黏膜通透性的影响
D-Lactate是细菌发酵、代谢、裂解的产物，当肠黏膜上皮细胞受到损伤后， 肠黏膜的通透性会增加，肠道中细菌会产生大量的D-Lactate通过受损黏膜进入 血液，是血液中的D-Lactate含量升高因此检测血清中D-Lactate水平能够间接的 反应肠黏膜的完整性和通透性的变化；ET-2主要由血管内皮细胞合成,并以旁分 泌的形式作用于管平滑肌，是迄今所知作用最强，持续时间最长的缩血管活性物 质。目前认为一是肠道组织缺血、缺氧、损伤、病理时释放出的一种内源性致病 因子,能致肠系膜静脉发生收缩反应,使胃肠道缺血、缺氧而导致胃肠道载膜损伤。 NO作为内源性舒张因子，其生物学效应与ET-1相反，同时对ET-1具有明显的 拮抗和负反馈调节作用，正常情况下，,二者含量相对稳定，达到一种平衡状态。
本实验中，黑灵芝多糖对AA染毒模型大鼠肠黏膜通透性D-乳酸、NO(一 氧化氮)、ET-1(内皮素-1)含量变化的影响如图11所示。结果表明，与对照组 相比，染毒模型组中D-Lactate、ET-1的含量可导致肠粘膜通透性降低，而不同 浓度黑灵芝多糖可使肠粘膜通透性升高，保护肠黏膜的完整性。
4、实验结论
黑灵芝多糖可下调促炎性细胞因子IL-1β、IL-2、TNF-α的表达量，提升抗 炎性细胞因子IL-4、IL-10的表达量，从而缓解炎症性损伤；此外，通过口服黑 灵芝多糖后肠组织中碱性磷酸酶含量与尿酸含量的变化表明，黑灵芝多糖作用下 的肠上皮细胞的正常生理功能得到了保护，黏膜上皮的完整性更好；与此同时， 实验发现黑灵芝多糖可显著改善肠粘膜的通透性，提升包括CAT、T-GSH、GSH 在内的抗氧化酶的表达水平。基于以上药理作用，可利用黑灵芝多糖以口服给药 的方式对由丙烯酰胺所造成的肠组织损伤实现治疗作用。
以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施 例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换 和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.黑灵芝多糖用于制备哺乳动物肠上皮细胞炎性因子调节药物的应用，其中，所述调节是降低细胞因子IL-1β、IL-2、TNF-α的表达量，同时提升细胞因子IL-4、IL-10的表达量。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述哺乳动物是处于丙烯酰胺损伤条件下的哺乳动物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述药物还降低肠组织中的碱性磷酸酶含量。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述药物还提升肠粘膜的通透性。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述药物降低肠组织中D-乳酸含量、内皮素-1、一氧化氮的含量。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述药物还降低肠组织中尿酸的含量。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述药物还提升肠组织中抗氧化酶CAT、T-GSH、GSH的活性。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物的剂型是口服剂。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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