CN103908444A - 姜黄素在制备抗肠炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药领域，尤其涉及尤其涉及一种姜黄素在制备抗结肠炎药物中的应用，进一步提供在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用。本发明中，姜黄素通过调节多种转录因子的活性及阻断多种信号通路，抑制多种炎症因子及趋化因子的表达，减少中性粒细胞浸润，改善肠炎组织损伤及症状。姜黄素对炎症性肠病尤其溃疡性结肠炎的治疗有效率达到90%以上，明显的加强了炎症性肠病的治疗效果而且副作用小。

Description

姜黄素在制备抗肠炎药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，尤其涉及一种姜黄素在制备抗肠炎药物中的应用。 

背景技术

炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn^，s disease,CD)，是一组以慢性复发性非特异性组织炎症为特征的肠道炎症性疾病，主要表现为长期反复发作的腹痛、腹泻、粘液脓血便。至今其发病机制仍尚未完全明确，目前普遍认为肠道感染、肠道粘膜屏障受损、肠道粘膜免疫调节异常、遗传和环境等多因素共同参与IBD的发生发展，其中免疫调节异常在IBD的发病中起着重要作用。 

目前炎症性肠病（IBD ）的药物治疗主要以5-氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂（6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤）和生物制剂（抗肿瘤坏死因子）为主，然后传统的治疗方法存在诸多不足，持续解率低，严重感染的风险高及副作用大使得临床疗效不佳。比如柳氮磺胺吡啶水杨酸制剂是主要治疗炎症性肠病或溃疡性结肠炎的药物。皮质类固醇常用药为强的松或地塞米松，但目前并不认为长期激素维持可防止复发。在急性发作期亦可用氢化考的松或地塞米松静脉滴注，以及每晚用氢化考的松加于生理盐水中作保留灌肠，在急性发作期应用激素治疗的价值是肯定的，但在慢性期是否应持续使用激素则尚有分歧，由于它有一定副作用，故多数不主张长期使用。另外，免疫抑制剂在溃疡性结肠炎中的价值尚属可疑。据Rosenberg等报道硫唑嘌呤在疾病恶化时并无控制疾病的作用，而在慢性病例中它却有助于减少皮质类固醇的使用。 

姜黄素是从姜科植物中提取的酚类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、清除自由基、免疫调节等多种作用，且毒副作用小、其中炎症抑制和免疫调节功能是近年来国内外研究的热点。 

  

发明内容

本发明提供一种姜黄素在制备抗结肠炎药物中的应用。 

进一步提供在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用。 

CD4+T细胞群及其分泌的细胞因子是肠道炎症发生及持续存在的主要效应因素。我们研究发现，在CD和UD患者病变肠粘膜中有大量的Th17细胞浸润，说明Th17可能在炎症性肠病的发病过程中处于重要地位。Th17细胞是一类产生IL-17为特征并有别于辅助性T细胞1（Th1）、辅助性T细胞2（Th2）和调节性T细胞（Treg）的CD4+T辅助细胞亚群。IL-17是一种促炎因子，具有募集和激活中性粒细胞的能力，能诱导活化T细胞和刺激成纤维细胞、巨噬细胞和上皮细胞产生多种促炎介质（IL-1、IL-6、TNF、NOS2）、趋化因子（KC、MCP-1、MIP-2）及基质金属蛋白酶等促进组织炎症的发生，IL-17 还涉及参与中性粒细胞的增生、成熟和趋化作用。 

IL-23也是CD4+T细胞介导的炎症性肠病中必不可少的因子，它是Th17重要的扩展存活因子，可诱导Th17发育并促进IL-17、IL-6、TNF等炎症因子分泌。IL-23/IL-17轴与炎症性肠病密切相关，并可能成为IBD新的治疗靶点。 

本发明中姜黄素可以抑制IL-17及IL-23表达，减轻大鼠溃疡性结肠炎的肠道炎症，具有抗炎症性肠病的效果。 

我们研究还发现细胞内重要信号传导通路磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/ 丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（AKT）在肠道炎症反应中发挥着重要作用。PI3K-AKT信号传导通路由磷酸肌醇-3激酶（PI3K）和丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（AKT）组成，PI3K是一种与细胞内信号转导有关的脂类第二信使，可被多种细胞因子和理化因素激活并可调节多种细胞功能^[8]，AKT是原癌基因c-akt编码的一种57KD的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶, 是PI3K直接的靶蛋白而且具有与多种蛋白激酶同源的PH结构域。 

PI3K-AKT信号传导通路与细胞因子的调控和释放有着密切关系，PI3K-AKT可以通过调节NF—κB的活化和上调TNF-α的表达而实现对细胞因子的调控作用。核因子kB（nuclear factor kappa B，NF—κB)是一种具有多向性调节作用的转录蛋白，它对一系列由细胞因子炎症介质参与的炎性疾病的发病有着重要影响，在炎症反应复杂的细胞因子网络中核转录因子NF—κB的活化是一个中心环节。在正常状态下，NF—κB在胞质中与它的抑制因子IκB结合在一起，失去转录活性以无活性的形式存在细胞中，当PI3K-AKT 信号通路活化后，活化的AKT通过增强NF—κB抑制蛋白IκB激酶(IKK)主要是IKBα的磷酸化、降解，继而导致NF—κB的活化，NF—κB与抑制蛋白IκB解离并转位到细胞核内，与胞内特定的DNA序列结合，并发挥调节转录作用。肿瘤坏死因子TNF-α是一个参与全身性炎性反应的细胞因子，它能激活多种免疫和炎性细胞促进炎症的形成，与炎症性肠病的发病密切相关，活化的PI3K-AKT信号转导通路可通过一系列反应上调TNF-α等基因的转录水平。因此，阻断PI3K-AKT信号通路可以抑制NF—κB的活化和下调TNF-α的表达，减少细胞因子的产生进而减轻炎症反应达到抗炎效果。姜黄素能够阻断PI3K-AKT信号传导通路继而对TNBS诱导的大鼠溃疡性结肠炎有明显的抗炎治疗效果。 

本发明中，姜黄素通过调节多种转录因子的活性及阻断多种信号通路，抑制多种炎症因子及趋化因子的表达，减少中性粒细胞浸润，改善肠炎组织损伤及症状。 

本发明中，姜黄素对炎症性肠病尤其溃疡性结肠炎的治疗有效率达到90%以上，明显的加强了炎症性肠病的治疗效果而且副作用小。 

  

附图说明

本发明中图1为各组大鼠肠粘膜组织中AktmRNA（a）、Caspase-3mRNA（b）表达 

本发明中图2为各组大鼠肠粘膜组织中Akt、p-Akt和 Caspase-3蛋白的表达

（（图1中，M: marker A：正常对照组 B：模型组 C：姜黄素组 D：SASP组；图2中，A：正常对照组 B：模型组 C：姜黄素组 D：SASP组）

具体实施例

  实验1 

1、实验材料：实验动物  健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠60只，体重250g-280g，购自广西医科大学实验动物中心。

实验主要设备：病理图像分析仪：德国Leica公司DMR+Q550型，酶标仪：美国Bio-Rad公司 

实验主要试剂：

（1）姜黄素：自加拿大BBI 公司

（2）柳氮磺吡啶：美国Sigma公司；

  （3）三硝基苯磺酸（TNBS）：美国Sigma公司；

  （4）IL-17单克隆抗体：美国Santa Cruz公司

  （5）IL-23单克隆抗体：美国Santa Cruz公司

  （6）兔抗大鼠IgG-HRP二抗：工业 美国Santa Cruz公司

  （7）免疫组化试剂盒：北京中杉金桥生物公司

  （8）ELISA试剂盒：武汉华美生物工程公司

2、实验方法：实验动物分组及模型建立

  将60只雄性SD大鼠随即分为4组，分别为A组（正常对照组）、B组（模型组）、C组（姜黄素治疗组）和D组（SASP治疗组），每组均为15只。TNBS模型制作参照。各组大鼠禁食24小时后，以10%水合氯醛2ml/kg腹腔注射麻醉，经肛门插入2mm直径硅胶管至肠道内约7-8cm，B、C、D组大鼠按体重分别以100mg/kg的TNBS+50%乙醇溶液0.25ml灌注。相同的方法A组予相同剂量的0.9%氯化钠溶液及50%乙醇。造模第2日起，C组每日予100mg/kg姜黄素溶液灌胃，D组每日予100mg/kg的SASP溶液灌胃，A、B组每日予相同剂量的0.9%氯化钠灌胃。

  自造模之日起，每日观察记录各组大鼠的食量、毛发色泽、体重变化、大便性状、大便潜血情况并评分。使用联苯胺法检测大便潜血，以造模当日体重为基础体重。计算大鼠的疾病活动指数（DAI=体重下降指数分数+大便性状分数+隐血分数）。评分标准见表-1 

表1 疾病活动指数（DAI）评分标准

 

（注：正常大便干燥成形，松散大便为糊状、半成形但不粘附于肛门，稀便为可粘附于肛门的稀水样便。）

    造模第9天，10%水合氯醛麻醉大鼠后心脏采血约2ml，室温血液自然凝固30min后，离心20min（2000-3000转/分），收集上清液的血清存放于-20℃。剖开腹部，观察大鼠结肠外观形态及肠粘连等情况，取结肠病变部位，沿肠系膜纵轴剖开，以生理盐水清洗，肉眼观察肠黏膜炎症及溃疡病变情况，进行肠黏膜大体形态改变评分（见表2）。以病灶为中心，采集结肠标本，用10%中性缓冲甲醛固定，石蜡包埋，4um切片，取一部分进行HE染色，光镜下观察并进行病理组织学评分（HAI=上皮组织破坏分数+炎性浸润分数)评分（见表3）；另一部分切片待行免疫组化法检测IL-17和IL-23。

表2 大鼠结肠黏膜大体形态评分标准 

表3 组织病理学评分标准

大鼠肠粘膜IL-17和IL-23表达用SP法免疫组化测定及评分

  （1）石蜡切片脱蜡至水

  （3）抗原修复：将切片浸入枸橼酸钠溶液高压修复10分钟

  （4）滴加3%过氧化氢室温处理30分钟，PBS冲洗。   

  （5）血清封闭：滴加正常山羊血清室温封闭10min。

  （6）一抗孵育：滴加抗大鼠IL-17单克隆抗体（1:300稀释），37℃孵育1-2小时。PBS冲洗。（IL-23的检测使用抗大鼠IL-23单克隆抗体（1：300稀释）。 

  （7）二抗孵育：加生物素标记的二抗，室温10min，PBS冲洗。 

  （8）滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，室温10min，PBS冲洗。 

  （9）加DAB液显色5min后，蒸馏水冲洗浸泡10min。 

  （10）苏木精复染，自来水冲洗后盐酸酒精脱水，烤干，封片。 

(11) 光镜下观察切片并进行评价：A组大鼠作阴性对照，B组切片作阳性对照.采用统一的染色积分评价标准：染色强度分4级，阴性染色0分；弱阳性染色1分；中度阳性染色2分；强阳性染色3分。每张切片按所见阳性细胞范围分5级，阴性0分;阳性细胞占1-25%的1分；阳性细胞占26-50%的2分；阳性细胞占51-75%的3分；阳性细胞占76-100%的4分。每张切片的评分为二者的乘积. 

大鼠血清IL-17、IL-23水平均用ELISA法检测，试剂由武汉华美生物工程公司生产。

应用SPSS16.0统计软件经行分析处理，计量资料以X+S表示，多组建比较采用完全随机设计方差分析，组间两两比较采用S-N-K法检验。P<0.05为差异具有统计学意义。 

3、实验结果 

B、C、D三组大鼠造模24小时后则出现食量减少、体重下降，解稀便、糊状便或肉眼血便。B组大鼠结肠病变部位与周围组织发生粘连，肠管明显扩张，肠壁增厚，肠粘膜水肿严重，有溃疡及糜烂形成，镜下见粘膜上皮坏死脱落，腺体结构紊乱，杯状细胞减少，大量腺体破坏消失，形成溃疡，大量中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞和嗜酸性粒细胞浸润至粘膜肌层、粘膜下层。C组和D组予姜黄素和SASP灌胃治疗后，进食量和体重逐渐上升，大便性状、潜血情况好转，结肠黏膜炎症病变改善，与B组比较，DAI评分、大体形态评分、组织病理评分均、结肠黏膜IL-17、IL23及血清IL-17、IL-23表达均有下降，差异具统计学意义(P<0.05)。各组评分及IL-17、IL-23表达情况见表4、表5。

表4 各组大鼠疾病活动指数、大体形态、肠黏膜组织损伤评分 

（注：与正常对照组相比，* P<0.05，与模型组相比^▲ P<0.05，与SASP组相比^■ P>0.05。）

表5各组大鼠肠黏膜及血清IL-17和IL-23的表达

（注：与正常对照组相比，* P<0.05，与模型组相比^▲ P<0.05，与SASP组相比^■ P>0.05。）

由此，姜黄素可以抑制IL-17及IL-23表达，减轻大鼠溃疡性结肠炎的肠道炎症，具有抗炎症性肠病作用。

实验2 

1、实验材料：

材料 10-12周龄雄性健康Sprague-Dawley大鼠80只，体质量200-250g,由广西医科大学实验动物中心提供，在清洁屏障环境中喂养。主要试剂:姜黄素（纯度≥98%）、三硝基苯磺酸、柳氮磺吡啶（纯度≥98%）均购自美国sigma公司。AxyPrep总RNA小量制备提取盒购自美国Axygen公司。兔抗大鼠Akt单克隆抗体、兔抗大鼠p-Akt单克隆抗体、兔抗大鼠Caspase-3单克隆抗体购自cell signaling公司，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

2、实验方法 

动物分组：将80只SD大鼠随机分为四组，每组均为20只。分别是A组：正常对照组、B组：模型组、C组：姜黄素组、D组：柳氮磺吡啶（SASP）组。

模型建立：参照Morris等方法采用TNBS制作大鼠溃疡性结肠炎模型： 

大鼠禁食24h后水合氯醛麻醉，软硅胶管经肛门插入至肠道内约8cm,A组大鼠50%乙醇溶液1ml灌肠，其余组大鼠100mg/kgTNBS(溶于50%乙醇溶液) 1ml灌肠。自建模第二日起A组、B组每日予0.9%氯化钠溶液2ml灌胃；C组、D组分别予相同剂量的100mg/kg姜黄素溶液及SASP溶液灌胃。造模1周后处死大鼠，取出近肛门段约8cm结肠组织标本备检。

造模后观察大鼠的精神活动状态、毛发变化、体重变化、大便性状及便血情况。用联苯胺法测大便隐血程度。参照Okayasu等的经典评分方法，疾病活动指数（DAI）=（体重下降分数+大便形状分数+便血程度分数）/3。 

大鼠结肠组织大体形态及组织学损伤评分  

 将大鼠结肠组织沿纵轴剪开并进行大体形态损伤评分。用10%中性甲醛固定大鼠结肠组织标本，行石蜡包块、切片、苏木精-伊红（HE）染色及组织病理学损伤评分。

肠粘膜组织AktmRNA、Caspase-3mRNA表达水平测定： 

取大鼠结肠粘膜组织约60～100mg按AxyPrep总RNA小量提取制备盒说明书提取总RNA，使用分光光度仪测定总RNA浓度后按照Formentas逆转录试剂盒说明书进行逆转录。取 2ul逆转录产物cDNA进行PCR扩增，RT-PCR引物序列和反应条件见表6。取3ulPCR扩增产物上样于2%的TBE琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下以凝胶电泳成像系统仪测A值，GAPDH校正半定量，比较各组目的基因表达的差异性。

表6 Akt 、Caspase-3 、GAPDH引物序列及PCR反应条件 

肠粘膜组织Akt、p-Akt、caspase-3蛋白表达水平测定：

取60～100mg大鼠结肠粘膜提取总蛋白并于-80℃保存，总蛋白浓度按BCA蛋白定量测试盒说明书在570nm波长测定。12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳后通过湿转将凝胶中的蛋白转移至0.22孔径的硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉TBS缓冲液封闭1h后加入一抗4℃摇床孵育过夜，洗膜30min后加入二抗摇床孵育1h，最后ECL底物化学发光显色柯达X光胶片曝光显影。将胶片进行扫描，用凝胶图像处理系统分析目的条带，比较各组目的蛋白表达的差异性。采用β-actin作为内参校正各组目的蛋白的表达量。

采用SSPS16.0统计软件分析数据。计量资料以`x±s表示，多组间比较采用完全随机设计方差分析，组间两两比较采用最小显著差法（LSD）检验，组间比较采用c2检验。P<0.05为差异有统计学意义。 

3、实验结果与分析（评分标准如实验一中）： 

大鼠的一般情况及DAI评分：   

TNBS诱导溃疡性结肠炎后，A组大鼠基本活动如常，B、C、D组大鼠出现嗜卧扎堆、毛发粗糙、懒动、拱背、厌食、体重减轻、排稀便和血便等现象。分别经姜黄素和SASP治疗后C、D组症状明显减轻，DAI评分比较C、D组与B组有显著差异性（P<0.05）。各组评分见表2。

 结肠组织大体形态及组织学损伤评分：    

与A组大鼠相比，B组大鼠肠粘膜弥漫性充血水肿、糜烂、炎性渗出、溃疡形成，呈连续性分布。C、D组大鼠肠粘膜呈轻度炎症改变，炎症病变较B组明显减轻。将结肠标本切片经HE染色后镜下观察，B组大鼠结肠粘膜广泛的小溃疡、上皮细胞坏死脱落、隐窝及腺体结构破坏、大量炎性细胞浸润深达固有层，C、D 组病变较轻，C组肠粘膜仅有轻微的充血水肿而D组除有少量的炎症细胞浸润外腺体结构基本恢复正常。B组的大体形态和组织学损伤评分明显高于C、D组，具有显著差异性（P<0.05），见表7。

表7各组大鼠疾病活动指数、大体形态、肠粘膜组织学损伤评分（`x±s） 

（注：与正常对照组相比，^* P<0.05，^△P>0.05;与模型组相比,^▲P<0.05;与SASP组相比,^■ P>0.05）姜黄素对大鼠结肠粘膜组织中AktmRNA、Caspase-3mRNA表达水平的影响：与A组相比，B组大鼠结肠粘膜组织中Akt和 Caspase-3mRNA的表达水平明显的升高（P<0.01）。C、D组与B组比较，上述基因表达水平明显的降低（P<0.05） ，而C、D组之间差异无统计学意义（    P>0.05），各基因表达水平见表8、图1。         

表8各组大鼠结肠粘膜组织中Akt、caspase-3mRNA表达的比较（`x±s）

（注：与正常对照组相比, ^* P<0.05, ^△ P>0.05；与模型组相比, ^● P<0.05， ^▲ P>0.05；与SASP组相比，^■ P<0.05,^□ P>0.05）

姜黄素对大鼠结肠粘膜组织中Akt、p-Akt、caspase-3蛋白表达水平的影响 ：与A组相比，B组大鼠结肠粘膜组织中Akt、p-Akt和 Caspase-3蛋白的表达水平明显的升高（P<0.01）。C、D组与B组比较，各蛋白表达水平明显的降低（P<0.05） ，而C与D组蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05），各组蛋白水平表达结果见表9、图2。

表9 各组大鼠结肠粘膜组织中Akt、p-Akt、caspase-3蛋白表达的比较（`x±s） 

（注：与正常对照组相比, ^* P<0.05, ^△ P>0.05；与模型组相比, ^● P<0.05， ^▲ P>0.05；与SASP组相比，^□ P>0.05）

本实验中实验模型组大鼠精神萎靡、毛发粗糙、体重减轻、排稀便和血便，其DAI、结肠组织大体形态及组织学损伤评分均较高，RT-PCR法检测粘膜组织中AktmRNA、Caspase-3mRNA表达水平和western blot 法检测Akt、p-Akt、caspase-3蛋白表达水平较其他组明显升高，姜黄素组大鼠经姜黄素治疗后一般情况显著改善、各项指标均明显降低。姜黄素能够阻断PI3K-AKT信号传导通路继而对TNBS诱导的大鼠溃疡性结肠炎有明显的抗炎治疗效果。

  

Claims (2)

1.姜黄素在制备抗肠炎药物中的应用。

2.根据权利要求1中所述的姜黄素在制备抗肠炎药物中的应用，其特征在于：在制备抗溃疡性结肠炎药物中的应用。