CN109602765A - 一种人脐带间充质干细胞分泌因子的提取方法及其应用 - Google Patents

Abstract

一种人脐带间充质干细胞分泌因子的提取方法及其应用，所述提取方法包括：选取细胞活力较强的第三代人脐带间充质干细胞作为分泌因子来源，于培养瓶中培养第三代人脐带间充质干细胞；待细胞融合度达到80％以上时，吸去培养上清液，使用PBS液清洗两次，更换为无血清培养基；培养48小时后收集上清液，用0.22μm的滤膜过滤，将上清液倒入90mm无菌培养皿中，放入冻干箱内预冻；当温度降至‑40℃，培养液预冻完毕，抽真空使气压压强下降至100Pa以下，升高温度升至‑36℃，开始冷冻干燥，持续约24h后收集冻干粉末，于‑80℃保存。

Description

一种人脐带间充质干细胞分泌因子的提取方法及其应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉一种人脐带间充质干细胞分泌因子的提取，以及该人脐带间充质干细胞分泌因子在抑制骨髓干细胞衰老方面的应用。

背景技术

我国已经逐渐步入老龄化社会，而且社会老龄化趋势日益加重，随着老龄群体在人群中所占比例的增加，由于衰老所导致的各种疾病的比例也明显升高，包括心血管疾病，阿尔茨海默病，帕金森病以及骨质疏松症，骨关节炎等，而这些病的发生与组织中干细胞的衰老及功能的丧失有着直接的关系。例如老年性骨质疏松症就是一种由于干细胞衰老所导致的疾病。骨质疏松症发生的原因主要是因为成骨量的减少，骨微观结构的改变，造成这种改变的原因主要是因为骨髓间充质干细胞的活性降低，干细胞衰老，增殖分化能力下降，其定向分化为成骨细胞的能力降低，成脂分化能力增强，于此同时骨髓间充质干细胞周围的促进成骨分化的细胞因子，营养因子等微环境改变，骨矿物质基质减少，最终骨量减少，骨骼微结构异常，强度下降。因此补充健康骨髓间充质干细胞，或重新激活加强骨髓间充质干细胞成骨分化能力，增加成骨细胞活性和数量，将成为治疗骨质疏松症，促进局部成骨能力增加，提高骨强度，加速骨形成的新方向。

人脐带间充质干细胞(Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells，HUCMSCs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，具有来源丰富，易于采集、保存和运输，免疫原性低、避免伦理争议等优点，而且相关文献报道人脐带间充质干细胞可通过旁分泌机制分泌多种分泌因子(Secretion Factors,SF),这些分泌因子具有修复衰老损伤细胞，恢复其增殖分化能力，促进干细胞分化等功能。因此，本领域中提取能够实现对衰老骨髓干细胞起到恢复活力，促进成骨分化作用的人脐带间充质干细胞分泌因子，以及利用该分泌因子制备的促进骨质疏松部位骨再生的药物是本领域中的新的技术研发方向。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种人脐带间充质干细胞分泌因子的提取方法，并根据该方法所提取的分泌因子制备用于实现促进骨质疏松部位骨再生的药物。

根据本发明所述的要解决的技术问题，本发明的内容包括如下方面。

一种人脐带间充质干细胞分泌因子的提取方法，所述方法包括如下步骤：

步骤A，选取细胞活力较强的第三代人脐带间充质干细胞作为分泌因子来源，为了大量获得分泌因子，于75cm²培养瓶中培养第三代人脐带间充质干细胞；

步骤B，待细胞融合度达到80％以上时，吸去培养上清液，使用PBS液清洗两次，更换为无血清培养基；

步骤C，培养48小时后收集上清液，用0.22μm的滤膜过滤，将上清液倒入90mm无菌培养皿中，放入冻干箱内预冻；

步骤D，当温度降至-40℃，培养液预冻完毕，抽真空使气压压强下降至100Pa以下，升高温度升至-36℃，开始冷冻干燥；

步骤E，持续约24h后收集冻干粉末，于-80℃保存。

一种用于实现对促进骨质疏松部位骨再生药物的制备方法，所述方法包括如下步骤：

步骤A，将丝素蛋白粉溶解在去离子水中，最终浓度为5.0％(w/v)，将Branson450声波发生器探头伸入液面下，在30％振幅条件下持续作用30秒，30分钟后再次重复此过程；

步骤B，待丝素蛋白溶液冷却至室温加入分泌因子冻干粉末，混合均匀，将复合体吸入1毫升注射器内，放置于37℃环境中8小时待其逐渐成胶。

一种用于检测含有人脐带间充质干细胞分泌因子药物对促进骨质疏松部位骨再生效果的实验方法：所述实验方法包含如下步骤：

将实验生物进行分为年轻组、衰老组、分泌因子组、凝胶组和复合体组，其中年轻组实验生物为3个月龄；衰老组、分泌因子组、凝胶组和复合体组实验生物选择15月龄；

对年轻组实验生物的骨质疏松部位注射PBS；

对衰老组实验生物的骨质疏松部位注射PBS；

对分泌因子组实验生物的骨质疏松部位注射分泌因子溶液；

对凝胶组实验生物的骨质疏松部位注射丝素蛋白凝胶；

对复合体组实验生物的骨质疏松部位注射含有分泌因子的丝素蛋白凝胶；

上述所有组合实验生物，在注射8周后取局部骨组织进行Micro-CT及马松染色观察骨微观结构，收集的数据并进行骨密度、骨小梁体积、骨小梁厚度、骨小梁数目检测。

本发明的优点在于：根据本发明的人脐带间充质干细胞分泌因子的提取方法所制备的分泌因子能够实现恢复衰老骨髓干细胞活力，有效降低骨髓干细胞内活性氧水平，提高骨髓干细胞成骨分化，抑制成脂分化。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例共同用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为本发明一实施例的人脐带间充质干细胞分泌因子提取流程示意图；

图2为本发明一实施例的骨髓间充质干细胞增殖活力对比图；

图3为本发明一实施例的骨髓间充质干细胞内衰老细胞β-半乳糖苷酶染色结果对比图；

图4为本发明一实施例的骨髓间充质干细胞内衰老细胞β-半乳糖苷酶阳性率对比图；

图5为本发明一实施例的骨髓间充质干细胞内活性氧水平荧光强度对比图；

图6为本发明一实施例的骨髓间充质干细胞内活性氧水平DCF阳性率对比图；

图7为本发明一实施例的骨髓间充质干细胞钙盐形成量对比图；

图8为本发明一实施例的骨髓间充质干细胞成骨分化能力对比图；

图9为本发明一实施例的骨髓间充质干细胞脂肪形成量对比图；

图10为本发明一实施例的骨髓间充质干细胞成脂分化能力对比图；

图11为本发明一实施例的不同实验组大鼠骨骼情况对比图；

图12为本发明一实施例的不同实验组大鼠骨骼骨密度、骨小梁体积、骨小梁厚度、骨小梁数目数据对比图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明实施方式做进一步阐述。

实施例1

本实施例中人脐带带间充质干细胞分泌因子的提取过程如下所述：

步骤A，选取细胞活力较强的第三代人脐带间充质干细胞作为分泌因子来源，为了大量获得分泌因子，于75cm²培养瓶中培养第三代人脐带间充质干细胞；

步骤B，待细胞融合度达到80％以上时，吸去培养上清液，使用PBS液清洗两次，更换为无血清培养基；

步骤C，培养48小时后收集上清液，用0.22μm的滤膜过滤，将上清液倒入90mm无菌培养皿中，放入冻干箱内预冻；

步骤D，当温度降至-40℃，培养液预冻完毕，抽真空使气压压强下降至100Pa以下，升高温度升至-36℃，开始冷冻干燥；

步骤E，持续约24h后收集冻干粉末，于-80℃保存。

本实施例中人脐带间充质干细胞分泌因子对骨髓间充质干细胞增殖活力影响的实验结果如下：

分组情况：提取3月龄及15月龄大鼠BMSCs，并根据其月龄分为年轻BMSCs对照组(Y-C)；衰老BMSCs对照组(O-C)，衰老BMSCs治疗组(O-T)，根据培养基中分泌因子浓度的不同可分为1μg/ml组、50μg/ml组、100μg/ml组、150μg/ml组、200μg/ml组。

将BMSCs以每孔2×10³个接种到96孔板上，待细胞长满后，更换为加入分泌因子的培养基，浓度分别为1、50、100μg/ml，150μg/ml，200μg/ml培养5天，利用MTT试剂对各组BMSC培养基行细胞活力检测。

结果如图2所示：横坐标为分组情况，纵坐标为细胞活力，以各组的吸光度OD值来表示，与年轻细胞组相比，衰老细胞在增殖活力方面下降了约42％，但是通过在衰老细胞中加入分泌因子，细胞活力有明显提升，而且随着分泌因子浓度的提高，细胞的活力也随之提高，当分泌因子浓度达到100μg/ml时，增殖活力较衰老组提升了约20％，但是当分泌因子浓度大于100μg/ml后，各组之间的细胞活力无明显差异，所以选择100μg/ml分泌因子浓度作为衰老细胞的治疗剂量。图中*号表示，与衰老BMSCs对照组相比，P＜0.05，结果存在统计学差异。

本实施例中人脐带间充质干细胞分泌因子对骨髓间充质干细胞内衰老细胞β-半乳糖苷酶染色影响的实验结果如下：

分组情况：年轻BMSCs对照组(Y-C)；衰老BMSCs对照组(O-C)，衰老BMSCs治疗组(O-T)。

将BMSCs以每孔3×10⁵个接种到6孔板上，待细胞长满后，衰老-治疗BMSCs组中培养基更换为加入100μg/ml分泌因子的培养基，培养3天，应用β-半乳糖苷酶染色试剂盒进行染色并对比。

衰老细胞在pH 6.0时有高酶活性的β-半乳糖苷酶，在衰老特异性的β-半乳糖苷酶催化下会生成深蓝色产物。从而在光学显微镜下很容易观察到变色表达β-半乳糖苷酶的衰老细胞，结果如图3所示，与年轻细胞组相比，衰老细胞组内的β-半乳糖苷酶阳性细胞的数量明显要多，但是当加入含有分泌因子的培养液培养后，衰老细胞组内的β-半乳糖苷酶阳性细胞的数量显著下降。如图4所示，横坐标为分组情况，纵坐标为β-半乳糖苷酶细胞阳性率，年轻细胞组内β-半乳糖苷酶阳性率约为14％，而衰老细胞组内β-半乳糖苷酶阳性率约为55％，当加入分泌因子，β-半乳糖苷酶阳性降为35％。图中*号表示，与衰老BMSCs对照组相比，P＜0.05，结果存在统计学差异。

本实施例中人脐带间充质干细胞分泌因子对骨髓间充质干细胞内活性氧水平影响的验结果如下：

分组情况：年轻BMSCs对照组(Y-C)；衰老BMSCs对照组(O-C)，衰老BMSCs治疗组(O-T)。

将BMSCs以每孔3×10⁵个接种到6孔板上，待细胞长满后，衰老-治疗BMSCs组更换为加入分泌因子的培养基，浓度100μg/ml，培养3天，应用活性氧检测试剂盒对细胞内活性氧水平进行检测。

由于细胞内活性氧的积累可以加速细胞老化，因此活性氧可以作为细胞衰老的标志之一，活性氧检测试剂盒是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒，DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH，而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内，细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。结果如图5所示：与年轻细胞组相比，衰老细胞组内的荧光强度明显要高，但是当加入分泌因子后，衰老细胞组内的细胞荧光强度有下降趋势.如图6所示：横坐标为分组情况，纵坐标为DCF阳性率，与年轻细胞对照组相比，衰老细胞组DCF阳性率要高出45％左右，但加入分泌因子后，衰老细胞组内的细胞DCF阳性率下降约一半，因此可以推测分泌因子的抗衰老作用也许是通过降低细胞内的活性氧水平来实现的。图中*号表示，与衰老BMSCs对照组相比，P＜0.05，结果存在统计学差异。

本实施例中人脐带间充质干细胞分泌因子对骨髓间充质干细胞成骨分化能力影响的实验结果

分组情况：年轻BMSCs对照组(Y-C)；衰老BMSCs对照组(O-C)，衰老BMSCs治疗组(O-T)。

将BMSCs以每孔3×10⁵个接种到6孔板上，待细胞长满后，更换为成骨诱导培养基，其中衰老-治疗BMSCs组加入100μg/ml的分泌因子，培养14天，应用茜素红S染色试剂盒对培养基内的钙盐进行染色，以测定骨髓间充质干细胞的成骨分化能力，并且可将钙盐溶解在氯化十六烷基吡啶测定吸光度值进行定量检测。

茜素红S染色试剂中的茜素红S可通过与钙离子和其他金属离子发生鳌和反应而形成可以在显微镜下直接观察的带颜色的复合物，以此来观察培养基中钙盐的形成，结果如图7所示：与年轻细胞组相比，衰老细胞组内的钙盐形成量明显要低，但是当加入分泌因子后，衰老细胞组内的钙盐形成量随着分泌因子的加入有了显著的提升。如图8所示：横坐标为分组情况，纵坐标为吸光度值，与年轻细胞对照组相比，衰老细胞组OD值下降约78％，但是当加入分泌因子后，衰老细胞组内的OD值明显升高，这意味着着衰老细胞的成骨分化能力在恢复。图中*号表示，与衰老BMSCs对照组相比，P＜0.05，结果存在统计学差异。

本实施例中人脐带间充质干细胞分泌因子对骨髓间充质干细胞成脂分化能力影响的实验结果如下：

分组情况：年轻BMSCs对照组(Y-C)；衰老BMSCs对照组(O-C)，衰老BMSCs治疗组(O-T)。

将BMSCs以每孔3×10⁵个接种到6孔板上，待细胞长满后，更换为成脂诱导培养基，其中衰老-治疗BMSCs组加入100μg/ml的分泌因子，培养14天，应用油红O染色试剂盒对培养基内的脂肪进行染色，以测定骨髓间充质干细胞的成脂分化能力，并且可将脂肪溶解在异丙醇中测定吸光度值进行定量检测

油红O是很强的脂溶剂和染脂剂，它通过物理上的溶液作用或吸附作用，借溶液作用使脂肪染成橙红色，以此来观察培养基中脂肪的形成，结果如图9所示：与年轻细胞组相比，衰老细胞组内的脂肪形成量明显要多，但是当加入分泌因子后，衰老细胞组内的脂肪形成量随着分泌因子的加入有了显著的下降.如图10所示：横坐标为分组情况，纵坐标为吸光度值，与年轻细胞对照组相比，衰老细胞组OD值明显升高，但是当加入分泌因子后，衰老细胞组内的OD值有所下降，这意味着着与年轻细胞相比，衰老骨髓干细胞的成脂分化能力更强。但是通过分泌因子的加入，可以抑制其成脂分化。图中*号表示，与衰老BMSCs对照组相比，P＜0.05，结果存在统计学差异。

本实施例中分泌因子对衰老大鼠局部骨质的影响的评估。

本实施例中采用超生诱导法来制备丝素蛋白水凝胶并将其与人脐带间充质干细胞分泌因子混合作为大鼠体内实验的凝胶药物，通过穿刺将凝胶药物植入骨质疏松部位

所述凝胶药物的制备方法如下：

步骤A，将丝素蛋白粉溶解在去离子水中，最终浓度为5.0％(w/v)，将Branson450声波发生器探头伸入液面下，在30％振幅条件下持续作用30秒，30分钟后再次重复此过程；

步骤B，待丝素蛋白溶液冷却至室温加入分泌因子冻干粉末，混合均匀，将复合体吸入1毫升注射器内，放置于37℃环境中8小时待其逐渐成胶。

分组情况：年轻组(young)，3个月大，植入PBS；衰老组(old)，15个月大，植入PBS；分泌因子组(secretome)，15个月大，植入分泌因子溶液；凝胶组(gel)，5个月大，植入丝素蛋白凝胶；复合体组(g+s)，15个月大，植入分泌因子-丝素蛋白凝胶复合体；每组6只动物。

根据分组情况将不同材料按照上述方法植入大鼠胫骨骨质疏松部位，术后8周后取局部骨组织行Micro-CT及马松染色观察骨微观结构，收集的数据并进行骨密度(BMD)、骨小梁体积(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数目(Tb.N)检测。

结果如图11，12所示，年轻组BMD评分较高，同时年轻组的骨小梁体积、骨小梁厚度、骨小梁数目评分也明显高于老年组，这说明大鼠的骨量会随年龄的增长而逐渐流失。这种情况并没有随着分泌因子溶液的注射而改变，其原因在于分泌因子在局部发挥作用之前已溶解在血液中进入循环，因此一个能在局部骨质疏松症部位缓慢降解并持续释放分泌因子的载体是必要的，本实施例中选择丝素蛋白凝胶作为载体，衰老组和凝胶组的评分没有明显差异，这说明单纯丝素蛋白凝胶本身并不能发挥抗骨质疏松作用，当将凝胶-分泌因子复合体注入骨髓腔，8周后，发现BMD评分明显升高，骨小梁体积、骨小梁厚度、骨小梁数目评分同时升高，这说明了分泌因子治疗骨质疏松的有效性及丝素蛋白凝胶作为缓释载体的可行性。

由此可见，本实施例中使用衰老大鼠作为老年性骨质疏松症动物模型，将人脐带间充质干细胞来源分泌因子加入衰老骨髓间充质干细胞培养基，发现其不但对大鼠骨髓间充质干细胞无毒副作用，而且可还以增强骨髓间充质干细胞增殖活力，促进其成骨分化，抑制其成脂分化。同时将人脐带间充质干细胞分泌因子植入大鼠骨质疏松部位，发现人脐带间充质干细胞分泌因子可以促进骨质疏松部位骨再生，治疗骨质疏松。

综上所述，仅为本发明的具体实施案例，本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术的技术人员在本发明所述的技术规范内，对本发明的修改或替换，都应在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种人脐带间充质干细胞分泌因子的提取方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤A，选取细胞活力较强的第三代人脐带间充质干细胞作为分泌因子来源，为了大量获得分泌因子，于75cm²培养瓶中培养第三代人脐带间充质干细胞；

步骤B，待细胞融合度达到80％以上时，吸去培养上清液，使用PBS液清洗两次，更换为无血清培养基；

步骤C，培养48小时后收集上清液，用0.22μm的滤膜过滤，将上清液倒入90mm无菌培养皿中，放入冻干箱内预冻；

步骤D，当温度降至-40℃，培养液预冻完毕，抽真空使气压压强下降至100Pa以下，升高温度升至-36℃，开始冷冻干燥；

步骤E，持续约24h后收集冻干粉末，于-80℃保存。

2.一种实现对骨髓干细胞起到恢复活力及促进成骨分化的药物，其特征在于，该药物由权利要求1所述的制备方法制备。

3.一种用于实现促进骨质疏松部位骨再生的药物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

步骤A，将丝素蛋白粉溶解在去离子水中，得到浓度为5.0％(w/v)的预混液，将Branson450声波发生器探头伸入液面下，在30％振幅条件下持续作用30秒，30分钟后再次重复此过程；

步骤B，待丝素蛋白溶液冷却至室温加入分泌因子冻干粉末，混合均匀，将复合体吸入注射器内，放置于37℃环境中8小时待其逐渐成胶。

4.一种用于检测含有人脐带间充质干细胞分泌因子药物对骨质疏松部位骨再生效果的实验方法，其特征在于，所述实验方法包含如下步骤：

选取SD大鼠作为实验生物，将实验生物进行分为年轻组、衰老组、分泌因子组、凝胶组和复合体组，其中年轻组实验生物为3个月龄；衰老组、分泌因子组、凝胶组和复合体组实验生物选择15月龄；

对年轻组实验生物的骨质疏松部位注射PBS；

对衰老组实验生物的骨质疏松部位注射PBS；

对分泌因子组实验生物的骨质疏松部位注射分泌因子溶液；

对凝胶组实验生物的骨质疏松部位注射丝素蛋白凝胶；

对复合体组实验生物的骨质疏松部位注射含有分泌因子的丝素蛋白凝胶；

上述所有组合实验生物，在注射8周后取局部骨组织进行Micro-CT及马松染色观察骨微观结构，收集的数据并进行骨密度、骨小梁体积、骨小梁厚度、骨小梁数目检测。