JPH01305960A - 基体および生体複合人工臓器 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、生体複合人工臓器用基体及び人工臓器に関す
る。さらに詳しくは、生体複合人工臓器の製造に於て基
体に動物細胞及び組織を接着させることのできる生体複
合人工臓器用基体及び生体複合人工臓器に関するもので
ある。

［従来の技術］ 従来、人工血管や人工心臓などの人工臓器の作成に当た
っては、生体とは異なるセルロース、ガラス繊維、合成
高分子などのポリマー基体が用いられてきたが、これら
のポリマー基体の生体適合性については充分満足得られ
て、いないのが実状であった。また生体内の組織は多種
多様な機能を有しているのに対して、上記ポリマーだけ
ではこれらの生体機能を全て満足させるのが困難であっ
た。

これらの問題を解決する方法として、ポリマー基体と生
理機能を有する動物細胞とを組み合わせる方法（生体複
合人工臓器）が有効である事が見いだされポリマーと動
物細胞とを接着させる手段が＼ 検討されてきた。しかしながら上記ポリマー基体だけで
（′！ポリマー表面に対する動物細胞の接着、伸展及び
増殖は、不充分であった。このため動物細胞と親和性の
高い物質（接着性付与物質）を上記ポリマー基体表面に
コーティングし、動物細胞の接着を効率よく行う研究が
進められてきた。例えば、動物細胞などの接骨性付与の
方法としてフラーゲンーアミノ多糖を用いる方法（特表
昭５９−５００７０２号公報）やバイオ接着性ポリフェ
ノールを用いる方法（特開昭６３−３９５８３号、公報
）が知られている。

［発明が解決しようとする問題点］ しかしながら、従来用いられてきた生体複合人工臓器用
基体および生体複合人工臓器は、以下の幾つかの問題点
を有していた。■ポリマー基体表面に接着付与物質をコ
ーティングしただけの基体では、滅菌操作や大組培養操
作において、剥離や変性を受けることがしばしば見られ
た。■ポリマー基体と接着性物質とを架橋剤を用いて結
合させた基体では、水溶液中で反応させていることから
架橋効率がよくなかった。■接着付与物質として生体内
から得られた成分やその誘導体を用いていることから接
着付与物質に出来する不純物の混入や、これに伴う拒否
反応（人工臓器として生体内に適用する場合の抗原抗体
反応による）を引き起こす恐れがあり人工１ａ器を利用
する患者にとって危険性が見られた。■生体複合人工臓
器用基体上に必要とする細胞＠組織を接着−増殖させ生
体複合人工臓器として用いる場合、牛胎児血清（以下Ｆ
ＣＳと記載）を添加する必要がある。このため得られた
生体複合人工臓器は、生体に取って抗原となりつる異種
タンパクの混入が避けられないものとなり、人工臓器を
使用する患者にとって危険性は更に高まることとなる。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、上記問題点に鑑みて動物細胞の接骨性付
与良好で抗原抗体反応の見られない物質を効率よく共有
結合させた生体複合人工臓器用基体を見いだすべく鋭意
検討した結果、本発明に到達した。すなわち、本発明は
ポリマー基体に対してアルギニン−グリシン−アスパラ
ギン酸を必須構成単位として有する接着性ペプチドを共
有結合させてなる動物細胞の接着性を改良した生体複合
人工臓器用基体及び本基体に動物細胞・組織を接着させ
てなる生体複合人工臓器である。

本発明に用いられる接着性ペプチドとしては、以下の３
つのアミノ酸すなわちアルギニン（以下Ａｒｇと記載）
、グリシン（以下ｃｔｙと記載）、アスパラギン酸（以
下Ａｓｐと記載）を必須成分として結合した一般式 ％式％（１） ＸＩ、Ｘ２：０または１〜３０個のアミノ酸残基のペプ
チド鎖。アミノ酸の種類及び結合 の順序は特に限定しない。

を構成成分とする９分子ｆｆ１３．０００以下のペプチ
ドがあげられる。好ましくは上記Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓ
ｐにセリン（以下Ｓｅｒと記載）の結合した一般式 ％式％（２） Ｙｌ、Ｙ２：０または１〜３０個のアミノ酸残基のペプ
チド鎖。アミノ酸の種類及び結合 の順序は特に限定しない。

を構成成分とする分子［３，０００以下のペプチドであ
り、特に好ましくは疎水性のアミノ酸であるプロリン（
以下Ｐｒｏと記載）を含む一般式％式％（３） Ｚｌ、Ｚ２：Ｐｒｏを１個以上含む１〜３０個のアミノ
酸残基のペプチド鎖。アミノ酸の種類及び 結合の順序は特に限定しない。

を構成成分とする分子ｆｆｌ　３．０００以下のペプチ
ドである。一般式（１）、（２）、（３）におけるＸＩ
、Ｘ２．Ｙｌ、Ｙ２、ｚＩ％Ｚ２のアミノ酸残基を構成
するアミノ酸としては特に限定されず、生化学データブ
ック　Ｉ　　Ｐ２９〜Ｐ５９（日本生化学金部・東京化
学同人発行）に記載されているアミノ酸が挙げられる。

本発明に係わる接着性ペプチドに用いられるアミノ酸は
、Ｌ体、０体どちらでもよいが、好ましくはＬ体である
。また構成アミノ酸であるＰｒｏは、接着性ペプチドに
疎水性の性質を与えることから、ポリマー基体に結合反
応させる際ＤＭＦ　（ジメチルホルムアミド）等の有機
溶媒を反応溶媒として用いることか出来ることから、従
来の水溶液中の反応゛＼ と比較して反応効率の向上が図れる。

本発明に係わる接着性ペプチドの分子毒は、通常３，０
００以下である。：ｌｌ、０００を越える場合、抗原に
なる可能性があり、１０，０００以上では完全抗原とし
て作用することから、本発明に使用するペプチドの分子
量を３，０００以下とした。

ペプチドの合成方法としては特に限定しないが、液相法
、固相法および固相法を応用した自動合成装置による合
成方法などが挙げられる。これらの合成方法の詳細につ
いては、生化学実験講座・タンパク質の化学■Ｐ２Ｏ７
〜Ｐ４９５　（日本生化学金部舎東京化学同人発行）、
続生化学実験講座・タンパク質の化学（下）　Ｐｅ４１
−１’Ｇ９４　（日木生化学会ｍ−東京化学同人発行）
等に記載されている。

生体複合人工臓器用基体及び生体複合人工臓器を作成す
るためのポリマー基体としては、従来用いられているセ
ルロース、デキストラン、キチン等の多糖類：ナイロン
、ガラス繊維、ポリビニルアルコール、ポリエステル、
ポリプロピレン１．ポリカーボネート、ウレタン樹脂、
フッ素樹脂、シリコーン樹脂等の合成ポリマーが挙げら
れる。これらポリマー基体は、フオーム状、エラストマ
ー状、フィルム状、多孔膜、中空管、中空糸、繊維、ビ
ーズ等成形加工された物が用いられる。

本発明に用いる接着性ペプチドを生体複合人工臓器用基
体及び生体複合人工臓器に用いるには、本ペプチドを基
体に共仔結合させる必要があるＯ結合させる方法として
は特に限定しないが、基体表面の水酸基、アミノ基、カ
ルボン酸基等と接着性ペプチドとを架橋剤を利用して結
合させる合成法、基体表面に反応性官能基がない場合反
応性官能基を導入して結合させる合成法等が挙げられる
。

例えば、臭化シアン、酸アジド、水溶性カルボジイミド
等を利用したペプチド結合合成法；基体に導入した芳香
族アミノ基と亜硝酸ナトリウムとを反応させて得たジア
ゾニウム化合物を利用するジナゾ合成法；ハロゲン化ア
セチル誘導体、トリア゛ジニル誘導体を利用するアルキ
ル化法；°グルタルジアルデヒド等のアルデヒド基と基
体のアミノ基との反応２利用す６７ｙ７塩基）ｂ成合成
法；ｈ　／Ｌ／　ｒレル基、アミノ基、アルデヒド基及
びイソニトリル基を共存させて縮合を行うＵｇｉ反応合
成法；トレシルエステルを利用するトレシルクロリド合
成法；　スペリン酸ジ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
エステル、酒石酸ジーＮ−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステ等ルの活性エステル基を用いる合成法；　ジメチル
スベロイミデートニ塩基酸、メチル−４−メルカプトブ
チルイミデート塩酸塩、メチル−４−アジドベンゾイミ
デート塩酸塩等のイミドエステル基を用いる合成法；ｐ
−フェニレンビスマレイミド等のマレイミド基を用いる
合成法；基体の水酸基をＮ。

Ｎ′−カルボニルジイミダゾールで活性化する合成法が
挙げられる。上記合成法は、水溶液中やＤＭＦやピリジ
ンのような極性有機溶媒中で行うことができる。好まし
い溶媒は悟性有機溶媒である。

架橋剤をポリマー基体に架橋剤を利用して結合させる方
法としては、架橋剤をポリマー基体に直接結合させる方
法、ポリマー基体にポリエチレングリコールやポリプロ
ピレングリコール等をグラフトさせその末端に上記架橋
剤を結合させる方法が挙げられる。

本発明の生体複合人工臓器用基体の適用については、人
工臓器を使うにあたって必要な動物細胞の培養を行い、
充分培養された生体複合人工臓器、例えば人工皮溝、人
工血管、人工心臓、人工心肺、人工腎臓、人工肝臓、人
工膵臓、人工角膜等を患者に用いる方法；生体人工臓器
用基体そのものを患者の創傷部や欠損部に適用し、速や
かな細胞の接着Φ進展・培養が行われることで患者の治
癒効果を促進させる方法などが挙げられる。必要とされ
る動物細胞の種類としては、生体複合人工臓器の適用さ
れる小部によって異なるが、例えば繊維芽細胞、表皮細
胞、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、腎細胞、筋芽細胞等
が挙げられる。動物細胞は、患者自身から得た細胞を用
いるのが最も好ましいが、抗原抗体反応による拒否反応
が押さえることが出来るならば他の動物細胞を用いるこ
とも可能である。

［実施例コ 以下、実施例により本発明を更に説明するが、＼本発明
はこれに限定されるものではない。

製造例１ 接着性ポリペプチドの合成 Ｍｅｒｒｌｆ　１ｅｌｄ方式によるペプチド自動合成装
置を用いて合成を行った。αアミノ基の保護にはＢｏｃ
基を用い、セファデックスゲル、ＣＭ−セルロースイオ
ン交換りａマドグラフィーおよび分配クロマトグラフィ
ーによって精製を行い、）ＩＰＬｃ　（高速液体クロマ
トグラフィー）上型−ピークを示す接着性合成ペプチド
表−１を得た。

表−１接着性合成ペプチド 実施例ｌ ＰＶＡフィルムにＤＭＦ溶媒中ジイソシアン酸へキサメ
チレンを反応させた後、側鎖のイソシアネート基を加水
分解してアミノ化を行った。次いでスペリン酸ジーＮ−
ヒドロキシスクシ、ンイミジル（Ｏ５５）でアミノ基を
活性化し緩ｉ÷ｊ溶液中にて上記の接着性合成ペプチド
−１と反応ざＷ生体複合人工臓器用基体を得た。

実施例２．３ ＰＶＡフィルムに接着性合成ペプチド−２，３を実施例
１に従って反応させ生体複合人工臓器用基体を得た。

実施例４ ＰＶＡフィルムの表面水酸基をＮ、Ｎ’−カルボニルジ
イミダゾールで活性化しＤＭＦ溶媒中にて上記の接着性
合成ペプチド−３と反応させ生体複合人工臓器用基体を
得た。

実施例５ ＰＶＡフィルムに接着性合成ペプチド−４を実施例／１
に従−って反応させ生体複合人工臓器用基体を得た。

比較例１ 実施例で用いたＰＶＡフィルムを生体複合人工臓器用基
体とした。

比較例２ キチン膜を生体複合人工臓器用基体とした。

試験例１ （１）接着性合成ペプチドの固定化密度接着性合成ペプ
チド−３を固定化した実施例３．４の基体の固定化密度
を測定し、反応条件による差を調べたｏ　ＥＳＣＡ　（
Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　５ｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ　ｆｏｒ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いポリマー
基体表面におけるペプチドの割合を測定したところ、Ｏ
ＭＦの溶媒で反応させた実施例４の方が固定化密度で７
５χ増加していた。

（２）動物細胞の接着性、増殖性の評価実施例１〜５、
比較例１．２の生体複合人工臓器用基体を用い細胞培養
を行った。動物細胞は血管内皮細胞を用い、培養液はＤ
ｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’
ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　（以下ＤＭ　ＥＭと記載する）を用
いた。位相差顕微鏡および走査型電子顕微鏡で接着製及
び増殖性の観察を行い、その結果を表−２に示した。

表−２動物細胞の接着性、増殖性 Ｏ：良好、　Δ：やや不良、　Ｘ：不良実施例４および
比較例１上における血管内皮細胞の増殖結果を第１図、
第２図に示した。（１日後の位相差顕微鏡写真）　第１
図（実施例４）では充分な細胞接着および増殖がみられ
るものの、第２図（比較例１）においては細胞は全く接
着せず、細胞同士がコロニーを形成している状態でほと
んど増殖も見られなかった。

実施例６ 生体複合人工皮膚の作成 キチンフィルムの表面水酸基なＮ、Ｎ’−カルボニルジ
イミダゾールで活性化しＤＭＦ溶媒中にて上記の接着性
合成ペプチドー：３と反応させ、人工皮膚の基体膜を作
成した。培養液ＤＭＥＭを用い、この膜の表面にマウス
表皮細胞を５日問培養して生体複合人工皮膚を作成した
。

マウスの創傷部に適用したところ、キチンフィルムだけ
を用いた物と比較して創傷部の快復は速かった。

比較のため、本試験で用いたキチンフィルムの表面でマ
ウス表皮細胞を５日間培７５３ｉｅ験を行った。

培養液としてＤＭＥＭにＦＣ５１０％添加した培地では
、細胞の接着、増殖とも若干見られたが、ＤＭＥＭ単独
の培地では細胞の接着、増殖は殆ど見られなかった。

［発明の効果コ 本発明の生体複合人工臓器用基体は、ポリマー基体に対
してＡｒｇ−Ｇ　Ｉｙ−Ａｓｐを必須構成単位として有
する接着性ペプチドを共有結合させていることから、次
のような効果を奏する。■創傷部に適用した場合、細胞
の接着性、増殖・性が良好となり治苅（促進の効果がみ
られる。■本発明の生体複合人工＋１１ｉ器を人工血管
等に用いた場合、適用部位における組繊細胞の接着が促
進され組織適合性は速やかに行われる。■フィブロネク
チン等細胞接着性ペプチドを含む牛胎児血清（以下ＦＣ
５と記載）を加えなくても、ポリマー基体に対する生細
胞の接着性は良好となり、細胞の進展・増殖が促進され
る。

従って、ここで得られた生体複合人工臓器を患者に適用
する場合、Ｆｅ２中に含まれる抗原となりうる成分の混
入がなくなり患者にとって安全性が高まる。また本発明
で用いられる接着性ペプチドは低分子量であることから
、これ自体が抗原となる可能性が低減され、安全性はさ
らに高まる。■本発明の接着性ペプチドは、共有結合で
基体に結合されていることから基体からの脱落もなく、
滅菌操作も安全に行うことが可能となる。■接着性ペプ
チド中にＰｒｏを含有した疎水性ペプチドは、有ｎ溶媒
中にて反応することが可能となり、基体への共有結合に
おける反応効率は格段に向上する。

現在人工臓器の基体に用いられている高分子材料は、何
れも汎用高分子であることから生体の持っている機能全
てを満足するものではなかったが、動物細胞と複合化を
行う本発明の生体複合人工臓器はこれらの欠点を解決す
るものであり医療全般に亙って高信頼性と高性能を付与
する効果がみられる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例４て得られた基体表面における血管内皮
細胞の増殖結果（１日後の位相差顕微鏡写真）である。 第２図は比較例１て得られた基体表面における血管内皮
細胞の増殖結果（１日後の位相差顕微鏡写真）である。 ２ち　　よ　　パ く、〈 ２　二　・７

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ポリマー基体に対してアルギニン−グリシン−アス
   パラギン酸を必須構成単位として有する接着性ペプチド
   を共有結合させてなる動物細胞接着性を改良した生体複
   合人工臓器用基体。 ２、ポリマー基体に対してアルギニン−グリシン−アス
   パラギン酸を必須構成単位として有する接着性ペプチド
   を共有結合させた生体複合人工臓器用基体に動物細胞・
   組織を接着させてなる生体複合人工臓器。