CN110396124B - 自组装多肽及其作为止血剂的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了自组装多肽及其作为止血剂的用途；所述多肽为RAKA16、REKD16或RKDE16。RAKA16、REKD16、RKDE16具有自组装凝胶化的特性，其溶液遇到DMEM培养基或血液时能够自组装形成水凝胶。本发明利用了这三种多肽的自凝胶化的特性，制备了一系列新型多肽止血剂，能够有效的对伤口进行止血。

Description

自组装多肽及其作为止血剂的用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及自组装多肽及其作为止血剂的用途。
背景技术
具有自组装凝胶化特性的多肽由于其优异的原位凝胶特性和生物相容性，近年来逐渐成为国内外化学、生物学、医学领域研究者关注的热点。这类多肽的自组装行为是由分子间的静电相互作用力、氢键相互作用力以及亲疏水相互作用力共同作用下实现的，故属于物理交联水凝胶的范畴。具有代表性是自组装多肽是RADA，它最初是由美国麻省理工学院和香港大学的Ellis-Behnke小组报道的(Nanomedicine，2006，2:207-215)。其溶液具有快速凝胶化的特性，1％的RADA溶液在与DMEM培养基混合后即可在15s内生成水凝胶。此外，它还广泛的应用于各种组织工程的研究中(Nanoscale,2017,9:16281–16292；Journal ofControlled Release 2017,261:234-245)。
在各种意外事故或者手术过程中，如果人体的出血量过大，除了按压、包扎、缝合等传统止血手段外，还需要止血剂来辅助止血。如果一类止血剂在发挥止血作用的过程中启动了人体自身的凝血血机制，则该止血剂属于药物范畴，如凝血酶类止血剂、纤维蛋白胶类止血剂等等；如果一类止血剂在止血过程中仅仅是通过吸收伤口血液或者使伤口血液凝胶化，而不触发人体自身的凝血机制，则该类止血剂属于医疗器械范畴，例如氧化纤维素止血膜、壳聚糖止血粉等等。自组装多肽的溶液具有遇到血液快速凝胶化的特性，其自凝胶机制是溶液中的多肽分子遇到血液中带电荷的氨基酸分子时，触发了其自组装凝胶化，形成的血液凝胶能够封堵住伤口，从而作为止血剂来使用。自组装多肽止血剂的止血过程不涉及人体自身的凝血机制，故属于医疗器械范畴。
经过对现有专利文献的检索发现，中国发明专利CN 101267831 B公开了用于促进止血和其它生理活动的组合物和方法，其列举了多种多肽序列；但这些多肽序列的核心理念是相邻重复单元之间的正负电荷交替。
发明内容
本发明的目的在于提供自组装多肽及其作为止血剂的用途；所述多肽简称为RAKA16、REKD16、RKDE16。RAKA16、REKD16、RKDE16能够溶解于纯水、生理盐水中，在其质量浓度为0.5％-3％时，其能够在溶剂中快速溶解，并呈现溶液态。RAKA16、REKD16、RKDE160.5％-3％溶液在与DMEM培养基以体积比2:1-1:1混合后，其溶液能够形成水凝胶，其凝胶时间为10s-40s。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明涉及具有自组装特性的多肽，所述多肽包含的氨基酸为赖氨酸(K)、丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、精氨酸(R)，多肽序列中氨基酸个数为16个。
作为本发明的一个实施方案，所述多肽为RAKA16多肽，包含如SEQ ID NO.1所示的序列。对应的序列结构为：Ac-RADA-KAEA-RADA-KAEA-NH2。
作为本发明的一个实施方案，所述多肽为REKD16多肽，包含如SEQ ID NO.2所示的序列。对应的序列结构为：Ac-RARA-EAEA-KAKA-DADA-NH2。
作为本发明的一个实施方案，所述多肽为RKDE16多肽，包含如SEQ ID NO.3所示的序列。对应的序列结构为：Ac-RARA-KAKA-DADA-EAEA-NH2。
本发明中，利用固相合成法制备相应多肽。
本发明的多肽在使用纯水或生理盐水配制成0.5wt％-3wt％的溶液后与DMEM培养基混合，在10s-40s内形成水凝胶。
作为本发明的一个实施方案，所述溶液与DMEM培养基的体积比为2:1-1:1。
本发明还涉及本发明的具有自组装特性的多肽在制备止血剂中的用途。
DMEM培养基含有多种无机盐和氨基酸，与血液中的无机盐和氨基酸类似，将RAKA16、REKD16、RKDE16的溶液应用于止血实验时发现，RAKA16、REKD16、RKDE16的纯水溶液或生理盐水溶液(浓度1％-3％)能够快速的遇血凝胶化(凝胶时间小于20s)，从而封堵伤口止血，其止血性能优异。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明中的三种多肽序列与RADA16(RADA-RADA-RADA-RADA SEQ ID NO.4)不同，它们不会在PBS中生成凝胶，仅能够与含有不同电荷的氨基酸培养基(DMEM培养基)或者血液接触时生成凝胶，拓宽了多肽的应用范围；
2)通过调节配比，本发明中的三种专利的最短凝血时间均在16s以内，止血效果优异；
3)本发明中涉及的三种多肽的凝胶强度高，优于RADA16多肽。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明所述的新型多肽RAKA16的液质联用检测的质谱图，其分子离子峰为422.20(带有四个电荷和四个氢)，经过计算，实际分子量为422.20*4-4＝1684.80，与理论分子量1684.80一致；
图2为本发明所述的新型多肽REKD16的液质联用检测的质谱图，其分子离子峰为562.65(带有三个电荷和三个氢)，经过计算，实际分子量为562.65*3-3＝1684.95，与理论分子量1684.95一致；
图3为本发明所述的新型多肽RKDE16的液质联用检测的质谱图，其分子离子峰为562.60(带有三个电荷和三个氢)，经过计算，实际分子量为562.60*3-3＝1684.80，与理论分子量1684.80一致；
图4为实施例4中2％RAKA16水溶液与DMEM培养基以2:1混合后生成的凝胶照片；
图5为实施例6中2％REKD16水溶液与DMEM培养基以2:1混合后生成的凝胶照片；
图6为实施例8中2％RKDE16水溶液与DMEM培养基以2:1混合后生成的凝胶照片；
图7为实施例1、实施实例2、实施实例3中制备得到的2％RAKA16、2％REKD16、2％RKDE16纯水溶液应用于SD大鼠切尾止血实验的效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例涉及具有自组装特性的新型多肽RAKA16，其序列结构为：Ac-RADA-KAEA-RADA-KAEA-NH2(SEQ ID NO.1)。
该新型多肽RAKA16的液质联用检测的质谱图如图1所示，由图1可知，其分子离子峰为422.20(带有四个电荷和四个氢)，经过计算，实际分子量为422.20*4-4＝1684.80，与理论分子量1684.80一致。
本实施例制备RAKA16溶液的方法包括如下步骤：
在纯水中：将20mg RAKA16加入到离心管中，加入1mL的去离子水。然后将离心管置于震荡混匀器上震荡3min，2000rpm离心脱气3min，即制备得到浓度为2％的KAEA16水溶液。
在生理盐水中：将20mg RAKA16加入到离心管中，加入1mL的生理盐水。然后将离心管置于震荡混匀器上震荡3min，2000rpm离心脱气3min，即制备得到浓度为2％的KAEA16生理盐水溶液。
实施例2
本实施例涉及具有自组装特性的新型多肽REKD16，其序列结构为：Ac-RARA-EAEA-KAKA-DADA-NH2(SEQ ID NO.2)。
该新型多肽REKD16的液质联用检测的质谱图如图2所示，由图2可知，其分子离子峰为562.65(带有三个电荷和三个氢)，经过计算，实际分子量为562.65*3-3＝1684.95，与理论分子量1684.95一致。
本实施例制备REKD16溶液的方法包括如下步骤：
在纯水中：将20mg REKD16加入到离心管中，加入1mL的去离子水。然后将离心管置于震荡混匀器上震荡3min，2000rpm离心脱气3min，即制备得到浓度为2％的KAEA16水溶液。
在生理盐水中：将20mg REKD16加入到离心管中，加入1mL的生理盐水。然后将离心管置于震荡混匀器上震荡3min，2000rpm离心脱气3min，即制备得到浓度为2％的KAEA16生理盐水溶液。
实施例3
本实施例涉及具有自组装特性的新型多肽RKDE16，其序列结构为：Ac-RARA-KAKA-DADA-EAEA-NH2(SEQ ID NO.3)。
该新型多肽RKDE16的液质联用检测的质谱图如图3所示，由图3可见，其分子离子峰为562.60(带有三个电荷和三个氢)，经过计算，实际分子量为562.60*3-3＝1684.80，与理论分子量1684.80一致。
本实施例制备RKDE16溶液的方法包括如下步骤：
在纯水中：将20mg RKDE16加入到离心管中，加入1mL的去离子水。然后将离心管置于震荡混匀器上震荡3min，2000rpm离心脱气3min，即制备得到浓度为2％的KAEA16水溶液。
在生理盐水中：将20mg RKDE16加入到离心管中，加入1mL的生理盐水。然后将离心管置于震荡混匀器上震荡3min，2000rpm离心脱气3min，即制备得到浓度为2％的KAEA16生理盐水溶液。
实施例4
将实施例1所制得的1mL RAKA16水溶液中加入0.5mL DMEM培养基(葡萄糖浓度4.5g/L，无酚红)，可以观察到体系从溶液态快速的转变为凝胶态，凝胶时间为10s，凝胶图片如图4所示。
实施例5
将实施例1所制得的1mL RAKA16生理盐水溶液中加入0.5mL DMEM培养基(葡萄糖浓度4.5g/L，无酚红)，可以观察到体系从溶液态快速的转变为凝胶态，凝胶时间为15s。
实施例6
将实施例2所制得的1mL REKD16水溶液中加入0.5mL DMEM培养基(葡萄糖浓度4.5g/L，无酚红)，可以观察到体系从溶液态快速的转变为凝胶态，凝胶时间为12s，凝胶图片如图5所示。
实施例7
将实施例2所制得的1mL REKD16生理盐水溶液中加入0.5mL DMEM培养基(葡萄糖浓度4.5g/L，无酚红)，可以观察到体系从溶液态快速的转变为凝胶态，凝胶时间为18s。
实施例8
将实施例3所制得的1mL RKDE16水溶液中加入0.5mL DMEM培养基(葡萄糖浓度4.5g/L，无酚红)，可以观察到体系从溶液态快速的转变为凝胶态，凝胶时间为11s，凝胶图片如图6所示。
实施例9
将实施例3所制得的1mL RKDE16生理盐水溶液中加入0.5mL DMEM培养基(葡萄糖浓度4.5g/L，无酚红)，可以观察到体系从溶液态快速的转变为凝胶态，凝胶时间为17s。
实施例10
取3周龄体重180g左右的SD大鼠若干只，在其尾部四分之一处用手术刀制造2mm深的创口，然后分别使用实施例1的RAKA16、实施例2的REKD16、实施例3的RKDE16水溶液1mL涂覆于已经开始渗血的创口上，对照组不采用止血处理，切尾止血实验的效果如图7所示，止血时间如下表1所示：
表1
Figure BDA0002174668020000061
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
序列表
<110> 上海交通大学；深圳海王医药科技研究院有限公司
<120> 自组装多肽及其作为止血剂的用途
<130> DAG41265
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Arg Ala Asp Ala Lys Ala Glu Ala Arg Ala Asp Ala Lys Ala Glu Ala
1 5 10 15
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Arg Ala Arg Ala Glu Ala Glu Ala Lys Ala Lys Ala Asp Ala Asp Ala
1 5 10 15
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Arg Ala Arg Ala Lys Ala Lys Ala Asp Ala Asp Ala Glu Ala Glu Ala
1 5 10 15
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala
1 5 10 15

Claims (4)

1.具有自组装特性的多肽，所述多肽包含的氨基酸为赖氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸；多肽序列中氨基酸个数为16个，所述多肽为RAKA16多肽，对应的序列结构为：Ac-RADA-KAEA-RADA-KAEA-NH2；或所述多肽为REKD16多肽，对应的序列结构为：Ac-RARA-EAEA-KAKA-DADA-NH2；或所述多肽为RKDE16多肽，对应的序列结构为：Ac-RARA-KAKA-DADA-EAEA-NH2。
2.如权利要求1所述的具有自组装特性的多肽，其特征在于，所述多肽在使用纯水或生理盐水配制成0.5wt％-3wt％的溶液后与DMEM培养基混合，在10s-40s内形成水凝胶。
3.如权利要求2所述的具有自组装特性的多肽，其特征在于，所述溶液与DMEM培养基的体积比为2:1-1:1。
4.一种如权利要求1所述的多肽在制备止血剂中的用途。
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