CN115073552B - 一种多肽、水凝胶及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生化领域，公开了一种多肽，所述多肽为β发夹结构，其包括如下序列1或序列2：序列1：VX1VX2VX3VDPPTX4VX5VX6V‑NH2；序列2：VX1VX2VX3YNGTX4VX5VX6V‑NH2；其中，X1与X6、X2与X5、X3与X4中至少有一对是由碱性氨基酸、芳香族氨基酸组成，且其余对均为碱性氨基酸。该多肽制备得到的水凝胶易合成、无毒、具有非常强的凝胶稳定性、能够缓释活性成分。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料领域，具体为一种多肽、水凝胶及其用途。
背景技术
超分子水凝胶是凝胶因子通过氢键、静电作用、π-π堆积作用、疏水效应、等非共价相互作用形成三维微观网络结构，保留大量的水形成的一类软物质。例如从钙通道蛋白(stargazin)和神经元触突相关蛋白(SAP102)中提取了两个相互作用的多肽片段，并与 相应的核苷酸连接形成核酸肽。研究发现单独任何一个核酸肽都不能形成水凝胶，但是简 单混合两个核酸肽，就能通过分子间氢键作用诱导其自组装形成水凝胶。文献中尚未报道过通过阳离子-π相互作用形成的超分子水凝胶。
超分子水凝胶有着许多用途在组织工程，伤口愈合，药物递送，生物研究以及水凝胶 装置等方面2008年Riek等人将十肽促性腺激素释放激素同源物进行自组装形成淀粉体，包括已通过临床Ⅲ期实验的degarelix 3，来治疗激素响应的前列腺癌、乳腺癌和妇科癌症 等，其自组装形式经皮下给药后，均可达到长至35天的缓慢控制释放效果，远远超过了 未组装的单体分子。兰瑞肽可以用来治疗肢端肥大症，单纯的溶液注射需要2天一次，然而诱导其组装形成多肽凝胶后注射，其给药频率降低到1月1次。这足以说明自组装形式 确实大大提高了多肽药物的稳定性。
本案解决的技术问题是：如何开发出一种新型多肽水凝胶，易合成、无毒、具有非常 强的凝胶稳定性且能够缓释活性成分。
本发明要求本多肽至少具有如下特性：1.合成方便，天然氨基酸可表达；2.新型多肽且稳定的凝胶结构；3.毒性低，可用于肾移植。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多肽，该多肽制备得到的水凝胶易合成、无毒、具有非常 强的凝胶稳定性且能够缓释活性成分。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种多肽，所述多肽为β发夹结构，其包括如下序列1或序列2：
序列1：VX1VX2VX3VDPPTX4VX5VX6V-NH2；
序列2：VX1VX2VX3YNGTX4VX5VX6V-NH2
其中，X1与X6、X2与X5、X3与X4中至少有一对是由碱性氨基酸、芳香族氨基酸组 成，且其余对均为碱性氨基酸。
上述序列1和2中V、P、T、N、G、Y均为氨基酸简写代码，DP代表D型脯氨酸， 右端NH2为封端氨基；
需要说明的是，本发明的多肽并不严格限定为16个氨基酸，在上述的序列1和序列2 的两端适当的增加1个、2个或3个氨基酸且与本发明的效果类似都是包含在本发明的保护范围之内的。
本发明的多肽为β发夹结构，其转角为VDPPT(缬氨酸-D型脯氨酸-脯氨酸-苏氨酸)或YNGT(酪氨酸-天冬酰胺-甘氨酸-苏氨酸)；
可以推理的是：序列1、序列2中缬氨酸可替换为其他的疏水性氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸等。
本发明的β发夹结构具有如下结构特点：
1.具有发夹结构；
2.发夹结构的任意一个臂的一面是疏水的缬氨酸,另一面是亲水的碱性氨基酸，在分子 内折叠以后，形成分子间相互作用，通过表面疏水缔合形成薄片双层，发生自组装驱动水 凝胶化的形成；上述的臂为VX1VX2VX3、X4VX5VX6V。
3.发夹结构中X1与X6、X2与X5、X3与X4中至少有一对是由碱性氨基酸、芳香族氨 基酸组成。碱性氨基酸、芳香族氨基酸可以构成阳离子-π键结构，触发上述的序列1和序列2在水中迅速形成水凝胶，并提高水凝胶的稳定性。
在上述多肽中，所述碱性氨基酸为赖氨酸、精氨酸、组氨酸之一，所述芳香族氨基酸 为酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸之一。
在上述多肽中，X1与X6、X2与X5、X3与X4中至少有一对是由赖氨酸、色氨酸组成， 且其余对均为赖氨酸。
在上述多肽中，所述多肽为SEQ ID No.1～SEQ ID No.5中任一所示的氨基酸序列。
同时，本发明还公开了一种水凝胶，所述水凝胶中含有如上任一所述多肽。
在上述水凝胶中，所述水凝胶中含有0.5-2wt％，优选为1wt％的所述多肽。
最后，本发明还公开了如上所述水凝胶可用于药物载体的用途。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的多肽通过氢键相互作用折叠成一个两亲性的β发夹，发夹的一面是疏水的缬 氨酸,另一面是亲水的碱性氨基酸，在分子内折叠以后，形成分子间相互作用，通过表面疏 水缔合形成薄片双层，发生自组装驱动水凝胶化，并引入阳离子-π键相互作用，合成相应 的分子，验证了阳离子-π键相互作用能够触发如序列1和序列2的多肽在水中能够快速、 稳定的形成水凝胶。形成的水凝胶可用其包裹药物以达到缓释的效果，进而用于器官移植手术后发生的免疫排斥反应，并且鉴于其良好的生物相容性以及合成的方便性，它还有更 多的潜在的应用前景。
附图说明
图1为对比多肽YT和VT的成胶效果图。
图2为本发明的多肽的成胶效果图。
图3为本发明多肽VT-W和YT-W的透射电子显微镜照片。
图4为本发明的多肽利用圆二色光谱法检测其二级结构的照片。
图5为本发明的多肽VT-W的流变性质图；
图6为本发明的多肽VT-W的流变性质图；
图7为本发明的多肽(YT-WR)的细胞毒性实验结果图以及生物相容性图。
图8为本发明的多肽YT-WR的缓释效果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地 描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本 发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一、多肽合成说明
本发明所涉及的多肽均委托商业公司合成。
如果在实验室中进行合成，可采用常规的固相多肽合成法基于常规的多肽合成的操作手册进行合成。
固相多肽合成法具体为：利用AM树脂进行，将所需的氨基酸计算称量好后，投入到多肽合成仪上，按照相关操作进行合成，即可得到所需的分子。通过高效液相色谱仪进行纯化及冻干即可得到相应的干粉状目标多肽产品。
二、多肽序列
2.1.目标多肽的序列
其如SEQ ID No.1～SEQ ID No.5中任一所示；
其具体的序列为：
VT-W(SEQ ID No.1)：VKVWVKVDPPTKVKVKV-NH2；
其结构如下：
VT-2W(SEQ ID No.2)：VKVWVKVDPPTKVKVWV-NH2；
其结构如下：
YT-W(SEQ ID No.3)：VKVWVKYNGTKVKVKV-NH2；
其结构如下：
YT-2W(SEQ ID No.4)：VKVWVKYNGTKVKVWV-NH2；
其结构如下：
YT-WR(SEQ ID No.5)：VKVWVKYNGTKVRVKV-NH2；
2.2.对比多肽的序列
VT(SEQ ID No.6)：VKVKVKVDPPTKVKVKV-NH2；
其结构可参考如下：
YT(SEQ ID No.7)：VKVKVKYNGTKVKVKV-NH2；
其结构可参考如下：
三、制备多肽水凝胶及其表征的方法
称取2mg的多肽成品，加入100mL的纯水，得到肽溶液，再加入100mL的 2XBTP(pH＝7.4)，放于37℃即可形成水凝胶。
在同样的条件下，YT和VT不能成胶，具体可参见图1中a和b。
VT-W、VT-2W、YT-W、YT-2W、YT-WR在1wt％都可以成胶，依次如图2所示。
表1多肽参数
将形成的水凝胶利用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscopy，TEM)检测。 结果表明SEQ ID No.1～SEQ ID No.5所示多肽是一种纳米级的纤维结构，图3中scar bar＝100nm，图3中a所示的为多肽VT-W的检测结果，图3中b所示的为多肽YT-W的检测结果，图3表明VT-W和YT-W发生自组装，二者都发生了水凝胶化，形成水凝胶。
图4中是本发明的VT-W和YT-W的多肽圆二色光谱，在216nm处有一个负峰，表 明VT-W和YT-W都是β-折叠结构。
称量2mg的多肽冻干粉，加入100μL的纯水，进行超声溶解，得到多肽水溶液；再加入100μL的BTP，混合均匀后，迅速转移到流变仪的平台。在测试过程中，平台温度设定 在37℃。此时体积需要100μL，间隙为0.5mm。紧接着进行时间扫描和剪切稀化，测定该 水凝胶的储能模量(G’)和损耗模量(G”)来判断该水凝胶的强度和稳定。时间扫描设定 参数：时间一般设定为2.5h，频率为6rad/s，应变为0.2％，通过在该时间段内其G’和G” 的变化判断所形成水凝胶的强度，利用流变仪时间扫描测定其稳定性，结果表明其具有稳定性，图5为含VDPPT转角代表的多肽，图6是含YNGT转角的多肽。
四、缓释效果评估
称量2mg多肽粉末(YT-WR)，在里面加入8μl药物(他克莫司)、92μl H2O、100μl 2×BTP 缓冲溶液(pH＝7.4)，放置一段时间成胶，在里面加入1×BTP buffer，设置一系列时间分 别取点作出标准曲线，观测缓释效果，通过图8可以看出，144h时药物缓释才大约40％左右，说明此水凝胶对他克莫司药物达到了缓释效果，且效果很好。
图7为本发明的多肽的细胞毒性实验的结果以及生物相容性图scar bar＝100μm，本发 明的多肽在引入阳离子-π键相互作用后其细胞毒性为无毒(IC50＝1Mm)，生物相容性实验 表明与对照组相比生物相容性良好。
YT和VT由于不能成胶，在本发明的研究过程中并未做细胞毒性实验，但是已有文献 说明它们的类似物是有毒的，详情请见(Shi J,Schneider JP.De novo Design ofSelective Membrane-Active Peptides by Enzymatic Control of TheirConformational Bias on the Cell Surface.Angew Chem Int Ed Engl,2019,58(39):13706-13710.)
总结：引入阳离子-π键相互作用的多肽制备得到的水凝胶易合成、无毒、具有非常强 的凝胶稳定性、能够缓释活性成分。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背 离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从 哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有 变化囊括在本发明内，不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
Claims (5)
1.一种多肽，其特征在于，所述多肽为SEQ ID No.1或SEQ ID No.2：
SEQ ID No.1：VKVWVKVDPPTKVKVKV-NH2；
SEQ ID No.2：VKVWVKVDPPTKVKVWV-NH2。
2.一种水凝胶，其特征在于，所述水凝胶中含有如权利要求1所述多肽。
3.根据权利要求2所述水凝胶，其特征在于，所述水凝胶中含有0.5-2wt%的所述多肽。
4.根据权利要求3所述水凝胶，其特征在于，所述水凝胶中含有1wt%的所述多肽。
5.如权利要求2、3或4所述水凝胶用于制备药物载体的用途。
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