CN114341157A - 一系列用于各种生物医学应用的由短肽自组装的可注射水凝胶 - Google Patents
一系列用于各种生物医学应用的由短肽自组装的可注射水凝胶 Download PDFInfo
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Abstract
本文描述了可以自组装成水凝胶的肽。该肽包括交替的疏水氨基酸(X)和亲水氨基酸(Y)的氨基酸序列，其中，每个疏水氨基酸独立地选自异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)，每个亲水氨基酸独立地选自精氨酸(R)、赖氨酸(K)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)，至少一种亲水氨基酸选自精氨酸和赖氨酸，至少一种亲水氨基酸选自谷氨酸和天冬氨酸，并且所述氨基酸序列包含至少8个氨基酸。进一步描述了一种组合物，其包括由β‑片层构型的肽和水形成的水凝胶或水凝胶的干燥形式。水凝胶可用于生长细胞。在另一方面，由IIK 12(IRIKIEIEIRIK)和IK8L(IRIKIRIK)制备的杂化水凝胶可用于治疗细菌和/或真菌感染。
Description
技术领域
本发明涉及自组装成水凝胶的肽。
背景技术
水凝胶是能够储存大量水的3D聚合物网络，已被广泛研究并用作用于生物医学应用的基质[1]。特别地，它们通常被选择用于再生医学应用，因为它们具有生物相容性、与细胞外基质(ECM)的固有结构相似性以及提供合适生化环境的能力[2,3]。
文献中报道了许多类型的水凝胶，其中使用了天然和合成材料二者。人工基膜[4,5]、胶原[6,7]、透明质酸[8]和明胶[9]因为具有被宿主细胞特异性识别的优势，已被广泛用于形成用于组织工程的基于水凝胶的支架。然而，由于分子长度和结构不确定或不一致，以及潜在的免疫原性风险，动物来源支架的使用往往受到限制[10]。基于聚(乙二醇)[10,11]、聚(乙烯醇)[12]、聚(L-丙交酯)(PLLA)[13]、聚(丙交酯-co-乙交酯)(PLGA)[14]和聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(HEMA)[15]的聚合物也被广泛用于产生水凝胶。然而，合成聚合物水凝胶在性质上是生化惰性的并且不能与细胞相互作用，并因此难以允许细胞在基质内增殖[10]。
最近，肽水凝胶受到了很多关注。源自天然氨基酸的肽基水凝胶具有诸如生物相容性、生物降解性和非免疫原性的优点[16,17]。随着固相肽合成的进步，生产成本也大大降低。此外，每个氨基酸偶联步骤都经过精确控制，使得明确限定的序列、分子长度和重现性可以容易获得。20世纪90年代初，Zhang和同事发现了一种天然酵母蛋白质基序，EAK16-II(AEAEAKAKAEAEAKAK)(SEQ ID No.1)，其特征在于离子亲水和疏水氨基酸的交替重复[17]。该肽采用具有明显疏水和亲水表面的β-片层构型，在盐的存在下产生自组装纳米纤维。从那时起，一系列肽自组装体系被设计和开发，以形成具有纳米纤维结构的3D水凝胶。研究最广泛的肽，RADA16-I(AcN-RADARADARADARADA-CONH2)(SEQ ID No.2)[16](PuraMatrixTM)和RADA-II(AcN-RARADADARARADADA-CONH2)(SEQ ID No.3)[18]由周期性交替的亲水精氨酸残基和疏水丙氨酸(A)残基组成。由RADA16-I和RADA16-II自组装的肽支架在生理溶液中形成具有纳米纤维(直径10-20nm)的水凝胶(99％水)。这些肽水凝胶被用作用于3D细胞培养、加速伤口愈合和神经修复的支架[19-21]。例如，支架可以支持神经突外生长和突触形成[21]。此外，RADA16水凝胶已被用于以持续释放方式递送蛋白质和活性细胞因子[22]。
Schneider、Pochan和同事开发了另一类型的肽，其具有中心四肽II’型β转角(VDPPT)，两侧为交替的缬氨酸(疏水)和赖氨酸(亲水)残基[23，24]。在pH、离子和温度变化的触发下，肽，诸如MAX1(VKVKVKVK-VDPPT-VKVKVKVK)(SEQ ID No.4)从无规卷曲转变为β-发夹构型并自组装成富含β片层的水凝胶。MAX1被证明对人红细胞是非溶血的，并支持NIH3T3细胞的附着[24，25]。然而，MAX1水凝胶由于其缓慢的胶凝动力学，对于3D细胞封装并不理想[26]。
最近，Hauser等人报道了新的一系列具有3-7个天然脂肪族氨基酸的超短线性肽，其自组装成超分子结构的螺旋纤维[27，28]。肽基序包含具有降低疏水性的脂肪族氨基酸尾部和亲水极性头部。随着浓度增加到其临界胶凝浓度，肽经历了从无规卷曲到α-螺旋到β片层的二级构型转变。肽通过α-螺旋中间体自组装成纤维，并随后缩合成原纤维以形成水凝胶[27]。所得肽截留了最高至99.9％的水并类似于胶原纤维。机械刚度范围为103至105Pa，这可通过肽浓度和使用盐进行调节[28]。这些肽显示对人间充质干细胞(hMSC)和兔视网膜上皮细胞具有生物相容性[28]。评估了前导肽Ac-ILVAGK-NH2(SEQ ID No.5)用于伤口愈合的应用[29]。与商业伤口敷料
相比，该肽水凝胶促进了部分厚度烧伤伤口的愈合。然而，当浸泡在大量水中时，纤维被稀释，导致肽水凝胶失去其完整性[30]。
最近，报道了水凝胶用于对抗与医疗器械和伤口愈合相关的感染的用途。糖尿病足溃疡(DFU)感染是发病、住院的主要原因以及截肢的主导原因[31]。慢性CFU极难治疗，因为它涉及多种多样的细菌(包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，尤其是多药耐药细菌)和生物膜[32]。大多数现有的抗生素对治疗这样的感染无效。银离子或银纳米粒子已被引入伤口敷料中以预防DFU感染[33，34]。长期使用这样的产品会导致皮肤中的银堆积，导致皮肤的蓝色或灰色变色病症(银沉着病)。因此，对于DFU感染的预防和治疗，迫切需要一种具有抗多药耐药微生物的广谱活性且能够分散生物膜而不产生耐药性的可生物降解抗微生物水凝胶。
发明内容
在本发明的第一方面，提供了一种肽，所述肽包括交替的疏水氨基酸(X)和亲水氨基酸(Y)的氨基酸序列，其中，每个疏水氨基酸独立地选自异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)，每个亲水氨基酸独立地选自精氨酸(R)、赖氨酸(K)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)，至少一种亲水氨基酸选自精氨酸和赖氨酸，至少一种亲水氨基酸选自谷氨酸和天冬氨酸，并且所述氨基酸序列包含至少8个氨基酸。
氨基酸通常是指L-氨基酸，但也可以使用D-氨基酸。特别地，本文所述的肽可以由全部L-氨基酸或全部D-氨基酸产生。除非另有说明，否则本文所述的肽序列包括全L-氨基酸序列和全D-氨基酸对映异构体，已知它们除了旋转平面偏振光的能力之外具有相同的特性。
肽还包括通过接头连接的两个或更多个氨基酸序列。这样的肽也可能在水中形成β-片层并在较低的肽浓度下自组装成水凝胶。接头可以是任何常规的有机化合物接头并且可以连接到各自的C末端和N末端。
优选地，氨基酸序列不是IRVEIEVK。
优选地，氨基酸序列具有偶数个氨基酸。有利地，这允许肽保持化学互补性，换句话说，数目相等的亲水和疏水氨基酸残基。例如，氨基酸序列可以具有8个或12个氨基酸。后者被认为在较低浓度下更容易形成水凝胶。
优选地，氨基酸序列中有至少一个精氨酸和至少一个赖氨酸。
在实例中，所述交替的疏水氨基酸(X)和亲水氨基酸(Y)的氨基酸序列中的四个顺序排列的亲水氨基酸(Y1、Y2、Y3和Y4)选择为使得Y1和Y2各自独立地选自谷氨酸和天冬氨酸，并且Y3和Y4各自独立地选自精氨酸和赖氨酸。有利地，这提供了具有亲水氨基酸残基的(--++)排列的肽。
如本文所用，短语“顺序排列的亲水氨基酸”是指亲水氨基酸(Y)和疏水氨基酸(X)的交替序列中的连续的亲水氨基酸。例如，肽中的四个顺序排列的(亲水)氨基酸意指该肽包含Y1X1Y2X2Y3X3Y4序列。具有8个氨基酸的肽将具有序列Y1X1Y2X2Y3X3Y4X4，而该序列包含在具有8个或更多个氨基酸的肽中。术语Y1、Y2、Y3和Y4表示亲水氨基酸的顺序次序。这同样适用于任何数目的顺序排列的氨基酸。
在约7(或7.4)的pH或生理条件下，精氨酸和赖氨酸带正电荷，而谷氨酸和天冬氨酸带负电荷。因此，亲水氨基酸的选择提供了具有局部带电特性的肽，其允许调节肽的特性并且可以改善由肽形成的水凝胶的所得特性。
在实例中，所述交替的疏水氨基酸(X)和亲水氨基酸(Y)的氨基酸序列中的四个顺序排列的亲水氨基酸(Y1、Y2、Y3和Y4)选择为使得Y1和Y3各自独立地选自精氨酸和赖氨酸，并且Y2和Y4各自独立地选自谷氨酸和天冬氨酸。有利地，这提供了具有亲水氨基酸残基的(+-+-)排列的肽。
在实例中，所述交替的疏水氨基酸(X)和亲水氨基酸(Y)的氨基酸序列中的六个顺序排列的亲水氨基酸(Y1、Y2、Y3、Y4、Y5和Y6)选择为使得Y1、Y3和Y5各自独立地选自精氨酸和赖氨酸，并且Y2、Y4和Y6各自独立地选自谷氨酸和天冬氨酸。有利地，这提供了具有亲水氨基酸残基的(+-+-+-)排列的肽，并且可以被视为具有拥有相同交替带电荷的物质排列的四个顺序排列的氨基酸的实例的延伸。
在实例中，所述交替的疏水氨基酸(X)和亲水氨基酸(Y)的氨基酸序列中的六个顺序排列的亲水氨基酸(Y1、Y2、Y3、Y4、Y5和Y6)选择为使得Y1、Y2和Y3各自独立地选自谷氨酸和天冬氨酸，并且Y4、Y5和Y6各自独立地选自精氨酸和赖氨酸。有利地，这提供了具有(---+++)排列的肽。
在实例中，所述交替的疏水氨基酸(X)和亲水氨基酸(Y)的氨基酸序列中的六个顺序排列的亲水氨基酸(Y1、Y2、Y3、Y4、Y5和Y6)选择为使得Y1、Y2、Y5和Y6各自独立地选自精氨酸和赖氨酸，并且Y3和Y4各自独立地选自谷氨酸和天冬氨酸。有利地，这提供了具有(++--++)排列的肽。
此外，上述实例中亲水氨基酸残基的反向序列也被描述并包含在本文中。
优选地，亲水氨基酸选择为使得所述肽具有净中性电荷或净正电荷。例如，所述肽可以具有+2的净正电荷。有利地，具有净正电荷的肽可以更容易地形成水凝胶，而不需要盐来减少胶凝时间并且在较低浓度下，从而导致制备水凝胶的成本降低。这可能是由于具有净正电荷的肽中增强的β片层氢键。
优选地，所述氨基酸序列中至少一半的疏水氨基酸是异亮氨酸或亮氨酸。
优选地，所述氨基酸序列中有12个氨基酸，并且疏水氨基酸残基各自独立地选自异亮氨酸和缬氨酸。
在实例中，所述氨基酸序列为以下任一个：SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ IDNo.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24、SEQ IDNo.25和SEQ ID No.26。此外，肽可以由通过接头连接的2个或更多个这些序列组成，特别地序列具有相同的SEQ ID No。
优选地，所述肽在氨基酸序列的C末端被酰胺化和/或在氨基酸序列的N末端被乙酰化。C末端优选在所有肽中被酰胺化。N末端的亲水氨基酸残基可以被乙酰化，而N末端的疏水氨基酸可能不需要N末端的官能化。也可以使用肽末端的其他官能化。有利地，这使肽末端的电荷排斥最小化。
在本发明的第二方面，提供了一种组合物，其包括由β-片层构型的多个根据第一方面的肽和水形成的水凝胶或水凝胶的干燥形式。有利地，β-片层的形成形成具有刚性粘弹特性的超分子结构，其能够充当可以包含水和其他化合物的水凝胶，并且可用于不同的应用。
水凝胶的干燥形式可以通过冷冻干燥获得，以增加稳定性和储存时间，并且可以通过添加水重构回到水凝胶。如果干燥的水凝胶包含治疗剂，例如SEQ ID No.17或SEQ IDNo.18的第二肽，则干燥的水凝胶可以在使用时由例如患者或医疗专业人员重构。
优选地，多种肽的浓度为至少0.6％w/v。水凝胶的其余部分将是水，并形成水凝胶的主体。
优选地，浓度为至多10％w/v，至多5％w/v。更优选地，浓度为至多4％w/v，或小于4％w/v，或至多3％w/v。
优选地，所述组合物进一步包括盐。盐可以是磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)或基本必需培养基(MEM)。也可以使用盐如钠盐或钾盐，并且优选为中性或弱酸性或碱性盐，例如氯化钠和乙酸钠。
在实例中，肽具有SEQ ID No.12、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.22、SEQ ID No.25或SEQ ID No.26的氨基序列。
优选地，组合物或水凝胶包括治疗剂。更优选地，组合物或水凝胶包括SEQ IDNo.17或SEQ ID No.18的第二肽(其用作治疗剂)。肽与第二肽的摩尔比可以在3:1至1:3(或者替代地3至0.33)的范围内。有利地，该组合物或水凝胶可以用作药物。特别是作为用于细菌感染和/或真菌感染的药物。此外，该组合物或水凝胶可以用于制造用于治疗细菌感染和/或真菌感染的药物。在实例中，真菌感染可能是由酵母引起的。
在第三方面，提供了一种治疗细菌和/或真菌感染的方法，所述方法包括向患有细菌和/或真菌感染的受试者给药治疗有效量的组合物或水凝胶，所述组合物或水凝胶包含多个根据第一方面的肽和SEQ ID No.17或SEQ ID No.18的第二肽。
在第四方面，提供了一种形成水凝胶的方法，所述方法包括将根据第一方面的肽在水中混合以形成水凝胶；以及分离所述水凝胶。
优选地，搅拌步骤在盐的存在下进行。
优选地，搅拌步骤在20℃至40℃的温度下进行。
优选地，所述方法进一步包括干燥所述水凝胶以形成适合重构为水凝胶的干燥水凝胶。
优选地，多种肽的浓度为至少0.6％w/v。水凝胶的其余部分将是水，其形成水凝胶的主体。
优选地，浓度为至多10％w/v，至多5％w/v。更优选地，浓度为至多4％w/v，或小于4％w/v，或至多3％w/v，或至多2％w/v，
优选地，所述组合物进一步包括盐。盐可以是磷酸盐缓冲盐水(PBS)、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)或基本必需培养基(MEM)。也可以使用盐如钠盐或钾盐，并且优选为中性或弱酸性或碱性盐，例如氯化钠和乙酸钠。
在第五方面，提供了一种生长细胞的体外方法，所述方法包括提供根据第一方面的肽、细胞培养基和细胞群的混合物以形成包含所述细胞群的凝胶；以及在合适的条件下孵育所述凝胶以生长所述细胞群。
优选地，所述细胞是选自以下中的任一种：健康细胞、用于治疗或生长组织的干细胞和用于生长肿瘤以进行体外和体内研究的癌细胞。在实例中，干细胞可以是人干细胞，并且形成的水凝胶可以用作培养基来培养(或生长)干细胞以供使用。干细胞优选是成体干细胞，如人间充质干细胞(hMSC)。水凝胶也可以用于培养癌细胞，该癌细胞用于针对癌细胞的治疗剂的体外和/或体内测试。许多癌细胞系可用于并且可与水凝胶一起用于培养细胞系以供进一步使用，并且包括乳腺癌细胞系，如MCF-7和BT-474。
在图中：
图1示出了由8个氨基酸组成的肽两亲物的CD光谱。图1A对应IVK8；图1B对应ILK8，以及图1C对应IIK8。在室温(～23-24℃)下在水或PBS(pH7.4)中以1.0mg/mL进行测量。
图2示出了由12个氨基酸组成的肽两亲物的CD光谱。图2A对应IRVKIEVEIRVK(IVK12)；图2B对应IRVEIRVEIRVE(IRV12)，以及图2C对应IEVEIEVKIRVK(IEV12)。在室温(～23-24℃)下在水或PBS(pH 7.4)中以1.0mg/mL进行测量。
图3示出了由8个氨基酸组成的肽两亲物，其自组装成超分子水凝胶。图3A示出了当疏水氨基酸残基Val被置换为Ile时，肽疏水性如何增加，从而导致更快的胶凝。将肽溶解在水中，在室温(～23-24℃)下孵育30min；图3B示出了添加DMEM引发的肽水凝胶形成；图3C示出了IVK8水凝胶的SEM图像，该水凝胶在水中以1.5％的浓度制备，并在37℃下孵育过夜。
图4示出了在1.5(w/v)％的浓度下IVK8在水中的流变行为。图4A示出了储能模量(G')和损耗模量(G”)的频率扫描效果；图4B示出了黏度随剪切速率变化的流动扫描；图4C示出了动态阶跃应变幅度测试(应变＝0.5％或100％)。在室温(～23-24℃)下制备水凝胶。
图5示出了在1.5(w/v)％的浓度下IVK8在DMEM中的流变行为。图5A示出了储能模量(G')和损耗模量(G”)的频率扫描；图5B示出了黏度随剪切速率变化的流动扫描；图5C示出了动态阶跃应变幅度测试(应变＝0.5％或100％)；图5D示出了DMEM含量对肽水凝胶刚度的影响(对于0、20和30％的DMEM，肽浓度分别为1.5％、1.2％和1.0％)。在37℃下制备水凝胶。
图6示出了IIK12(2.0(w/v)％)在水中的流变行为。图6A示出了储能模量(G')和损耗模量(G”)的频率扫描；图6B示出了黏度随剪切速率变化的流动扫描；图6C示出了动态阶跃应变幅度测试(应变＝0.5％或100％)。在37℃下制备水凝胶。
图7A-7C示出了IVK8水凝胶表面上的hMSC和hMSC在肽水凝胶中封装的共聚焦图像，其中在共聚焦室中生长的细胞用作对照。在图7A-7C中，看到活细胞作为黑色背景上的白点。
图8A示出了IVK8水凝胶表面上MCF-7细胞的增殖，图8B示出了IVK8水凝胶(3D)内BT-474细胞的增殖。
图9示出了IIK12和IIK12/IK8D杂化水凝胶的SEM图像，它们是在有和没有IK8D的水中以1.0％的IIK12浓度制备的(IIK12:IK8D的摩尔比＝1:1)并在37℃下孵育过夜。
图10示出了IIK12/IK8L杂化水凝胶在0.8(w/v)％IIK12和0.8(w/v)％IK8L的水中的流变行为。图10A示出了储能模量(G')和损耗模量(G”)的频率扫描；图10B示出了黏度随剪切速率变化的流动扫描；图10C示出了动态阶跃应变幅度测试(应变＝0.5％或100％)。在37℃下制备凝胶。
图11示出了IIK12/IK8L杂化水凝胶对各种微生物的抗微生物活性，包括图11A中的革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(S.aureus)、图11B中的革兰氏阴性菌大肠杆菌(E.coli)和图11C中的酵母白色念珠菌(C.albicans)。在实验结束时计算CFU。·表示没有发现菌落。
图12示出了在与IIK12/IK8L杂化水凝胶接触时存活的金黄色葡萄球菌细胞计数随时间的变化。使用浓度为2.56mg/mL(即0.256％)的IK8L制备水凝胶。x表示没有观察到菌落。
图13示出了通过圆盘扩散测定(DDA)评估IK8L、IIK12/IK8L和IIK12/IK8D杂化水凝胶的抗微生物活性。图13A示出了包含不同浓度IK8L的无菌圆盘，其中水用作对照；图13B示出了IIK8/IK8L杂化水凝胶。IIK12_1％/IK8L_0.5％表示水凝胶制剂中1％的IIK12和0.5％的IK8L。IIK12水凝胶用作对照；图13C示出了IIK8/IK8D杂化水凝胶，IIK12_1％/IK8D_0.8％表示水凝胶制剂中1％的IIK12和0.8％的IK8D。将40μL的金黄色葡萄球菌悬浮液以106CFU/mL铺在琼脂板上。将板在37℃下孵育24h。线条表示应用凝胶的区域。
图14示出了IIK12/IK8D杂化水凝胶的溶血活性，其中水凝胶用不同浓度的IK8D制备。试验重复三次，并且数据以平均值±标准偏差表示。
图15示出了用多种制剂处理24h后人真皮成纤维细胞的生存力，这是通过MTT测定法测量的。图15A示出了利用IK8L的肽溶液的生存力；图15B示出了利用IIK12/IK8L杂化水凝胶的生存力；图15C示出了利用莫匹罗星乳膏的生存力；图15D示出了利用多粘菌素B的生存力。
图16示出了用多种制剂处理24h后人原代角质形成细胞的生存力，这是通过MTT测定法测量的。图16A示出了利用IK8L的肽溶液的生存力；图16B示出了利用IIK12/IK8L杂化水凝胶的生存力；图16C示出了利用莫匹罗星乳膏的生存力。
在以下描述中，阐述了许多具体细节以便提供对本发明的各种说明性实施方式的透彻理解。然而，本领域技术人员将理解，本发明的实施方式可以在没有这些具体细节中的一些或全部的情况下实施。在方法或设备之一的上下文中描述的实施方式类似地适用于其他方法或设备。类似地，在方法的上下文中描述的实施方式对设备同样有效，并且反之亦然。
在实施方式的上下文中描述的特征可以相应地适用于其他实施方式中相同或相似的特征。在实施方式的上下文中描述的特征可以相应地适用于其他实施方式，即使在这些其他实施方式中没有明确描述。此外，在实施方式的上下文中针对特征描述的添加和/或组合和/或替代可以相应地适用于其他实施方式中的相同或相似特征。
出于说明书和权利要求的目的，本文使用的术语“剂”和“药物”意指怀疑具有治疗特性的化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子或由生物材料诸如细菌、植物、真菌或动物(尤其是哺乳动物)细胞或组织制成的提取物。剂或药物可以是纯化的、基本纯化的或部分纯化的。
术语“生理上可接受的”定义了不会消除化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。本文所述的药物组合物可以本身给药于人患者，或在药物组合物中，在后者中它们与其他活性成分(如在联合治疗中)或合适的载体或一种或多种赋形剂混合。本申请化合物的配制和给药技术可以在"Remington's Pharmaceutical Sciences,"Mack Publishing Co.,Easton,PA,18th edition,1990中找到。术语“生理条件”是指通常存在于生物体和细胞中的条件，并且通常指温度范围为20-40℃、大气压为1、pH为6-8、葡萄糖浓度为1-20mM和大气氧浓度的条件。
在另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包括生理上可接受的表面活性剂、载体、稀释剂、赋形剂、平滑剂、悬浮剂、成膜物质和包衣助剂，或它们的组合；以及本文公开的化合物。药物组合物有助于将化合物给药于生物体。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂在制药领域是众所周知的，并且描述在例如Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA(1990)中，其全部内容通过援引并入本文。药物组合物中可以提供防腐剂、稳定剂、染料、甜味剂、芳香剂、调味剂等。例如，可以添加苯甲酸钠、抗坏血酸和对羟基苯甲酸酯作为防腐剂。此外，可以使用抗氧化剂和悬浮剂。在各种实施方式中，醇、酯、硫酸化脂肪醇等可用作表面活性剂；蔗糖、葡萄糖、乳糖、淀粉、结晶纤维素、甘露醇、轻质无水硅酸盐、铝酸镁、偏硅酸镁铝酸盐、合成硅酸铝、碳酸钙、酸式碳酸钠、磷酸氢钙、羧甲基纤维素钙等可用作赋形剂；硬脂酸镁、滑石、硬化油等可用作平滑剂；椰子油、橄榄油、芝麻油、花生油、大豆可用作悬浮剂或润滑剂；作为碳水化合物诸如纤维素或糖的衍生物的邻苯二甲酸乙酸纤维素，或作为聚乙烯的衍生物的乙酸甲酯-甲基丙烯酸酯共聚物可以用作悬浮剂；以及增塑剂诸如邻苯二甲酸酯等可用作悬浮剂。
可以将另外的治疗剂或诊断剂引入药物组合物中。替代地或另外地，药物组合物可与包含其他治疗剂或诊断剂的其他组合物组合。
应当理解，本文提供的组合物可以是允许将组合物给药于患者的任何形式。例如，该组合物可以是固体、液体或气体(例如气溶胶)的形式。合适的给药途径包括但不限于肠内(例如口服或直肠)、局部、肠胃外(例如舌下、口腔、舌下、阴道或鼻内)。如本文所用的术语肠胃外包括皮下注射、静脉内、动脉内、真皮内、肌肉内、胸骨内、海绵体内、鞘内、腹膜内、眼内注射或输注技术。将药物组合物配制为使得在将组合物给药于患者时，其中所含的活性成分是可生物利用的。将给药于患者的组合物采取一个或多个剂量单位的形式，其中例如片剂可以是单一剂量单位，并且气雾剂形式的一种或多种本发明化合物的容器可以容纳多个剂量单位。化合物还可以以持续释放或受控释放剂型给药，包括积存注射剂、渗透泵、丸剂、透皮(包括电迁移)贴剂等，用于以预定速率延长和/或定时、脉冲给药。
可以单独调整剂量量和间隔以提供足以维持调节作用或最小有效浓度(MEC)的活性部分的血浆水平。每种化合物的MEC会有所不同，但是可以根据体外数据进行估算。达到MEC所需的剂量将取决于个体特征和给药途径。然而，HPLC测定或生物测定可用于确定血浆浓度。
本发明的药物组合物可以以本身已知的方式制造，例如，通过常规的混合、溶解、制粒、糖衣丸制造、磨细、乳化、包封、包埋或压片工艺。
适合给药的药物组合物包括其中以有效实现其预期目的的量包含活性成分的组合物。作为剂量所需的本文公开的化合物的治疗有效量将取决于给药途径、被治疗的动物(包括人)的类型以及所考虑的特定动物的身体特征。可以调整剂量以达到期望的效果，但将取决于诸如体重、饮食、同时用药和医学领域技术人员将认识到的其他因素等因素。更具体地，治疗有效量是指有效预防、减轻或改善疾病症状或延长被治疗的受试者存活的化合物的量。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是根据本文提供的详细公开内容。通常，产品的人体临床应用以较低的剂量水平开始，随着剂量水平的增加，直到达到所需的效果。替代地，可接受的体外研究可用于使用已确立的药理学方法确定通过本方法鉴定的组合物的有用剂量和给药途径。
在非人动物研究中，潜在产品的应用以较高的剂量水平开始，剂量逐渐减少，直到不再实现预期效果或不良副作用消失。剂量范围可能广泛，这取决于所需的效果和治疗适应症。通常，剂量可以在约10微克/kg至100mg/kg体重之间，优选地在约100微克/kg至10mg/kg体重之间。或者，如本领域技术人员所理解的，剂量可以基于患者的表面积或由患者的表面积计算。
本发明的药物组合物的确切制剂、给药途径和剂量可以由个体医师根据患者的状况来选择。(参见例如"Goodman&Gilman’s The Pharmacological Basis ofTherapeutics"13th Edition 2017，其整体内容通过引用并入本文)通常，给药于患者的组合物的剂量范围可以是约0.5至1000mg/kg患者体重。根据患者的需要，剂量可以是在一天或多天的过程中给予的单个或一系列两个或更多个。在其中针对至少一些病症已确定化合物的人剂量的情况下，本发明将使用那些相同的剂量，或在确定的人剂量的约0.1％至500％之间，更优选在约25％和250％之间的剂量。在其中没有确定人体剂量的情况下，如新发现的药物化合物的情况，可以从ED50或ID50值或从体外或体内研究得出的其他适当值推断出合适的人剂量，这些值经动物毒性研究和功效研究合格。
应当注意，主治医师知道由于毒性或器官功能障碍如何以及何时终止、中断或调整给药。相反，如果临床反应不充分(排除毒性)，主治医师也会知道将治疗调整到更高的水平。治疗目标疾病的给药剂量的量级将随着待治疗的疾病的严重程度和给药途径而变化。例如，可以部分地通过标准预后评估方法来评估病症的严重程度。此外，剂量和可能的剂量频率也将根据个体患者的年龄、体重和反应而变化。与上面讨论的程序相当的程序可用于兽医学。
如本文所用，术语“给药(administering)”和“给药(administration)”是指向受试者提供药物制剂的任何方法。这样的方法为本领域技术人员所熟知，并且包括但不限于口服给药、透皮给药、吸入给药、鼻腔给药、局部给药、阴道内给药、眼部给药、耳内给药、脑内给药、直肠给药和肠胃外给药，包括注射剂，诸如静脉内给药、动脉内给药、肌肉内给药和皮下给药。给药可以是连续的或间歇的。在各个方面，可以治疗性地给药制剂；即，给药以治疗现有疾病或病症。在另外各个方面，可以预防性地给药制剂；即，给药以预防疾病或病症。在一个方面，片剂的给药是指口服给药。
如本文所用，术语“立即释放”是指指示期望物质相对立即地释放到其目标环境的属性。在一个方面，“立即释放”片剂在给药后小时内释放超过约40％的期望物质，如在片剂溶出度测试(Tablet Dissolution Test)下测量的。
如本文所用，术语“受控释放”是指指示期望物质诸如药物(例如镁盐)以受控方式而不是立即释放到其目标环境(例如受试者)的属性。因此，“受控释放”制剂在给药后1小时内释放不超过约40％的期望物质，如在片剂溶出度测试下测量的。“受控释放”包括“延迟释放”和“持续释放”制剂二者。在一个方面，“受控释放”不包括“立即释放”制剂；然而，设想某些“受控释放”制剂可以包括立即释放方面。例如，具有立即释放控制核心和肠溶衣的制剂不会被称为“立即释放”制剂；这样的制剂可以称为“受控释放”制剂和“延迟释放”制剂，但不能称为“持续释放”制剂。“受控释放”片剂的实例包括“延迟释放”片剂、“持续释放”片剂和“延迟/持续释放”片剂。
如本文所用，术语“延迟释放”是指指示期望物质诸如药物(例如镁盐)在给药后并非立即的时间释放到其目标环境(例如受试者)的属性。在一个方面，剂型控制药物释放到胃肠道中的速率，在远离十二指肠的胃肠道的一部分中释放大部分药物。这可以降低胃肠道副作用的发生率或严重程度。此外，这可以增加吸收到血液中的药物量。在另一个方面，“延迟释放”制剂在给药后2小时内释放不超过约5％的期望物质。在又再一个方面，“延迟释放”制剂在给药后2小时内释放不超过约5％的期望物质，并在给药后3小时内释放不超过约40％的期望物质。在更进一步的方面，“延迟释放”制剂在给药后2小时内释放不超过约5％的期望物质，在给药后3小时内释放不超过约40％的期望物质，并且在给药后8小时内释放不超过约80％的期望物质。在更进一步的方面，“延迟释放”制剂在给药后2小时内释放不超过约5％的期望物质，在给药后4小时内释放不超过约40％的期望物质，并且在给药后8小时内释放约50至约80％的期望物质。在另一个方面，基本上全部药物在12小时内释放。“延迟释放”是“受控释放”的一个子集。FDA指南还将“延迟释放”片剂称为在给药后并非立即的时间释放药物(或多种药物)的固体剂型。肠溶衣制品是延迟释放剂型。该术语包括“延迟释放”片剂和“延迟/持续释放”片剂二者。
如本文所用，术语“延迟/持续释放”是指指示期望物质诸如药物(例如镁盐)在给药后并非立即的时间释放到其目标环境(例如受试者)，并且在期望的时间间隔保持以期望剂量释放到其目标环境的属性。在一个方面，剂型控制药物释放到胃肠道中的速率，在远离十二指肠的胃肠道的一部分中释放大部分药物。这可以降低胃肠道副作用的发生率或严重程度。此外，这可以增加吸收到血液中的药物量。在另一个方面，剂型控制药物释放速率以靶向远侧小肠。在又另外方面，剂型控制药物释放速率以靶向远侧小肠，从而增加可用于与TRPM6和/或TRPM7阳离子通道相互作用的镁量。在一个方面，剂型控制药物释放速率以降低给药频率。这可以保持药物的期望血液水平，而不依赖于给药频率。这也可以增加患者对给定治疗方案的依从性。在另一个方面，“延迟/持续释放”制剂在给药后2小时内释放不超过约5％的期望物质，并在给药后3小时内释放不超过约40％的期望物质。在更进一步的方面，“延迟/持续释放”制剂在给药后2小时内释放不超过约5％的期望物质，在给药后3小时内释放不超过约40％的期望物质，并且在给药后8小时内释放不超过约80％的期望物质。在更进一步的方面，“延迟/持续释放”制剂在给药后2小时内释放不超过约5％的期望物质，在给药后3小时内释放不超过约40％的期望物质，并且在给药后8小时内释放约50％至约80％的期望物质。在另一个方面，基本上全部的整个药物在12小时内释放。“延迟/持续释放”是“受控释放”的一个子集。“延迟/持续释放”是“延迟释放”的一个子集。“延迟/持续释放”是“持续释放”的一个子集。
如本文所用，术语“有效量”是指足以实现期望结果或对不良病症产生影响的量。例如，“治疗有效量”是指足以实现期望治疗结果或对不良症状产生影响但通常不足以引起不良副作用的量。对于任何特定患者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的疾患和疾患的严重程度；采用的特定组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药时间；给药途径；所用特定化合物的排泄率；治疗的持续时间；与所使用的特定化合物组合或同时使用的药物以及医学领域众所周知的类似因素。例如，以低于实现期望治疗效果所需的水平开始化合物的剂量并逐渐增加剂量直至实现期望效果，这完全在本领域的技术范围内。如果需要，可以将有效日剂量分成多个剂量用于给药目的。因此，单剂量组合物可以包含这样的量或其约数以构成每日剂量。如果有任何禁忌症，个体医生可以调整剂量。剂量可以变化，并且可以以每天一剂或多剂给药，持续一或几天。对于给定类型的药品，可以在文献中找到适当剂量的指导。在另外多个方面，制剂可以以“预防有效量”给药，即，有效预防疾病或病症的量。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指无菌水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳液，以及用于在临用前重构为无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。合适的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或运载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、羧甲基纤维素及其合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)和可注射的有机酯，诸如油酸乙酯。例如，可以通过使用包衣材料诸如卵磷脂、在分散体的情况下通过保持期望的粒度和通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。这些组合物还可以包含佐剂，诸如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂，诸如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，可以确保微生物的作用的预防。还可能需要包括等渗剂，诸如糖、氯化钠等。可以通过包含延迟吸收的试剂(诸如单硬脂酸铝和明胶)带来可注射药物形式的延长吸收。通过在可生物降解的聚合物诸如聚丙交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐)中形成药物的微囊基质来制备可注射的积存形式。根据药物与聚合物的比率和所用特定聚合物的性质，可以控制药物的释放速率。也可以通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备积存可注射制剂。可注射制剂可以被灭菌，例如，通过细菌截留过滤器过滤或通过引入无菌固体组合物形式的灭菌剂，其可在使用前溶解或分散在无菌水或其他无菌可注射介质中。合适的惰性载体可以包括糖，诸如乳糖。
如本文所用，术语“永生化细胞”是指无限繁殖的细胞。细胞从有限数目的分裂周期的正常生长限制中逃脱。该术语不包括恶性细胞。
如本文所用，术语“正常细胞”是指具有生长限制，即有限数目的分裂周期(Hayflick限制)的细胞；因此，是非致瘤细胞。正常细胞包括原代细胞，即直接取自活生物体的非永生化的细胞或细胞系。
如本文所用，术语“细胞生长”是指细胞群体大小的增加。
如本文所用，术语“细胞分裂”是指有丝分裂，即细胞繁殖的过程。
如本文所用，术语“增殖”意指细胞的生长和分裂。“活跃增殖”意指活跃生长和分裂的细胞。
如本文所用，术语“抑制细胞增殖”是指减缓和/或阻止细胞的生长和分裂。可以进一步将细胞指定为在以下特定细胞周期阶段停滞：G1(间期1)、S期(DNA合成)、G2(间期2)或M期(有丝分裂)。
如本文所用，术语“优先抑制细胞增殖”是指与正常细胞相比减缓和/或阻止细胞的生长和分裂。
术语“纯化的”不需要绝对的纯度；相反，其旨在作为一个相对定义。明确考虑将起始材料或天然材料纯化至至少一个数量级，优选两个或三个数量级，更优选四个或五个数量级。术语“纯化的”在本文中进一步用于描述已经与其他化合物(包括但不限于多肽或多核苷酸、碳水化合物、脂质等)分离的本发明的多肽或多核苷酸。可以使用术语“纯化的”以指定本发明的单体多肽与寡聚物形式(诸如同或异二聚体、三聚体等)的分离。术语“纯化的”也可用于指定共价闭合(即环状)多核苷酸与线性多核苷酸的分离。基本上纯的多肽或多核苷酸通常分别占多肽或多核苷酸样品的约50％，优选60至90％重量/重量，更通常约95％，并且优选的是超过约99％纯的，但可以指定为50至100之间的任何百分比整数。多肽和多核苷酸纯度或同质性由本领域公知的多种方法指示，诸如样品的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后在凝胶染色后观察单个条带。对于某些目的，可以通过使用HPLC或本领域众所周知的其他手段来提供更高的分辨率。作为替代实施方式，本发明的多肽和多核苷酸的纯化可以表示为相对于异源多肽和多核苷酸(DNA、RNA或两者)的“至少”百分比纯度。作为优选的实施方式，本发明的多肽和多核苷酸分别为相对于异源多肽和多核苷酸是至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、96％、98％、99％或100％纯的。作为进一步优选的实施方式，多肽和多核苷酸分别具有相对于异源多肽或多核苷酸范围为90％至100％之间的到千分之一位的任意数字的纯度(例如，至少99.995％纯的多肽或多核苷酸)，或作为相对于除载体中存在的那些以外的所有化合物和分子的重量/重量比。表示到千分之一位的百分比纯度的每个数字可以声称为单一物质纯度。
在本文中可互换使用的术语“多肽”和“蛋白质”是指氨基酸的聚合物，而无论聚合物的长度如何；因此，肽、寡肽和蛋白质包括在多肽的定义内。该术语也没有明确指出或排除本发明多肽的化学或表达后修饰，尽管如此，这些多肽的化学或表达后修饰可以被包括或排除作为特定实施方式。因此，例如，对多肽的修饰(包括糖基基团、乙酰基基团、磷酸酯基团、脂质基团等的共价连接)明确地包含在术语多肽中。此外，具有这些修饰的多肽可以被指定为在本发明中包括或排除的单个物质。天然或其他化学修饰(诸如上面实例中列出的那些)可以出现在多肽的任何地方，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应当理解，相同类型的修饰可以相同或不同程度地存在于给定多肽的若干个位点。此外，给定多肽可以包含多种类型的修饰。多肽可以是分支的，例如，由于泛素化，并且它们可以是有或没有分支的环状的。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒酰化、硫酸化、转移RNA介导的向蛋白质添加氨基酸诸如精氨酸化(arginylation)和泛素化。[参见例如Creighton,(1993),Posttranslational Covalent Modification of Proteins,W.H.Freeman andCompany,New York B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York 1-12；Seifter,et al.,(1990)Meth Enzymol 182:626-646；Rattan et al.,(1992)Ann NY AcadSci 663:48-62]。定义中还包括包含一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然存在的氨基酸、仅在不相关的生物系统中天然存在的氨基酸、来自哺乳动物系统的修饰氨基酸等)的多肽、具有置换的联接以及本领域已知的其他修饰的多肽，包括天然存在的和非天然存在的二者。
在这项研究中，我们旨在产生一类新的短肽(X1Y1X2Y2)n，其中X1和X2是疏水残基(Ile、Val或Leu)，Y1和Y2是亲水残基(Arg、Lys Glu或Asp)，n是重复单元，但不必选择相同的氨基酸，如从本文实例中显而易见的。肽两亲物自组装成具有可调机械强度和可持续稳定性的水凝胶，用于一系列生物医学应用。据我们所知，这些肽序列尚未在文献中报道。这些肽的主要特征包括疏水氨基酸和亲水氨基酸(包括精氨酸(R)和赖氨酸(K))的规则交替，其中电荷以模式(--++)排列。选择R是因为它具有较高的胶凝倾向，而K与R结合使用是因为它具有较低的细胞毒性，以在生理条件下在肽中提供带正电荷的部分。由8个氨基酸残基组成的肽两亲物在水中以无规卷曲构型存在，并在高浓度下形成肽水凝胶(～99％水)。有趣的是，这些肽在盐或生理条件下自组装成β片层构型并形成更强的水凝胶。系统地调整疏水残基以研究它们对肽水凝胶机械强度的影响。评估了肽水凝胶的生物相容性。此外，另一类型由12个天然氨基酸组成的短肽两亲物IRIKIEIEIRIK(IIK12)和IRVKIEVEIRVK(IVK12)已被设计为具有交替的疏水和亲水氨基酸。电荷排列遵循模式(++--++)，其中中心肽IEIE两侧是IRIK。IIK12自组装成β片层构型并在水性溶液中以非常低的肽浓度(0.6(w/v)％)形成水凝胶。其通过静电相互作用进一步与形成β片层的抗微生物肽(IRIKIRIK(IK8))复合，形成杂化抗微生物水凝胶。这种杂化抗微生物水凝胶被设计用于预防和治疗DFU感染。研究了肽浓度对水凝胶物理化学特性的影响。对杂化水凝胶针对多种病原微生物的抗微生物活性进行了评估。使用圆盘扩散测定法分析从杂合肽水凝胶中释放的抗微生物肽。
此外，具有与实例中描述的顺序相反的序列的肽也可以具有相似或相同的特性，并且这些肽的末端可以被官能化以避免形成离子，并从而减少或消除末端的静电相互作用(尤其是排斥)，例如N末端可以被乙酰化并且C末端可以被酰胺化。本文所述的肽包含8个和12个氨基酸，并且这些肽中的两个或更多个可以通过接头连接并且能够形成如本文所述的β-片层和水凝胶。接头可以是任何合适的组分、长度或部分，并且可以通过本领域已知的方法连接到肽的C或N末端以合成更长长度的肽。此外，具有较长氨基酸序列的肽，例如在具有交替的疏水氨基酸和亲水氨基酸的四个氨基酸的额外嵌段中，可能仍然能够形成如本文所述的β-片层和水凝胶。
方法
材料
设计的肽由GL Biochem(中国上海)合成，并使用分析型反相高效液相色谱(RP-HPLC)纯化至达到95％纯度。合成肽的分子量通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)(Autoflex II,Bruker Daltonics Inc.，美国)使用乙腈/水混合物(1:1体积比)中的饱和α-氰基-4-羟基肉桂酸(4-HCCA)(Sigma-Aldrich，新加坡)作为基质进行测定。3-[4,5-二甲基噻唑基-2]-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)和乙腈购自Sigma-Aldrich，并且原样使用。人骨髓间充质干细胞(hMSC)和间充质干细胞培养基(MSCGM)购自Lonza(美国)。人乳腺癌BT-474细胞系、MCF-7、4T1细胞购自ATCC，美国，并且按照ATCC的推荐培养。细胞在富含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(HyClone，美国)的Roswell ParkMemorial Institute(RPMI1640)培养基中在37℃和5％CO2下培养。人真皮成纤维细胞和人表皮角质形成细胞获自Cordlabs Singapore并根据制造商的说明进行培养。使用MullerHinton Broth(MHB)粉末(BD Diagnostics)制备微生物生长培养基。金黄色葡萄球菌(ATCCNo.6538)、大肠杆菌(ATCC No.25922)、铜绿假单胞菌(ATCC No.9027)和白色念珠菌(ATCCNo.10231)获自ATCC，美国。
生物物理学研究
CD测量使用Jasco Model J-810分光偏振计(Jasco,Great Dunmow,Essex，英国)使用具有1mm光程的石英比色皿(Hellma，德国)进行。以50nm/min的扫描速度记录从240到190nm的光谱(平均3次扫描)。椭圆率由公式推导出：[θ]λ＝(M/(N-1)×θλ)/(d×c)，其中θλ代表在波长λ处观察到的椭圆率(度)，d代表路径长度(cm)，c代表浓度(g/mL)，并且[θ]λ代表残基椭圆率(deg cm2 dmol-1)。用配备珀尔帖温度控制器的Jasco J-810型分光偏振计测量热扫描。在测试之前，使溶液在室温下达到平衡10分钟。
水凝胶的制备
将肽粉末以期望浓度溶解在水或其他水性溶液中。替代地，可以在制备肽水性溶液之后添加所需的盐。通过将肽水性溶液和盐(如果需要的话)混合形成水凝胶。例如，将溶液涡旋，以及然后孵育以形成水凝胶。形成的水凝胶可以按形成的储存，或者可以干燥，例如通过冷冻干燥。替代地，可以根据需要形成水凝胶。
本文中的溶质(例如肽和盐)的浓度可以按重量/体积百分比提供(并且可以在本文中缩写为(％w/v)、(w/v％)或(％)，并且等同于溶解在100mL溶剂中的溶质质量(以克为单位)。替代地，可以使用wt％(或wt.％)，因为溶剂是水并假设密度为1g/cm3。
水凝胶的流变学研究
胶凝时间由小瓶倾斜法测定。当样品显示没有流动时，其被认为是凝胶。使用控制应变流变仪(ARES G2，TA仪)在室温下进行流变实验。流变仪配备两个灵敏的力转换器，扭矩范围为0.05μN.m至200mN.m。将肽粉末以1.0至2.0(w/v)％的浓度溶解在水中。将溶液涡旋，以及然后孵育以形成水凝胶。将凝胶置于平行板几何结构(直径8mm)上。检查动态储能模量(G′)和损耗模量(G″)随1至100rad/s频率变化而变化。在应变幅(γ)下进行测量，以确保粘弹性的线性。还进行了流动扫描(黏度随剪切速率变化而变化)以研究水凝胶的剪切稀化特性。
扫描电子显微镜(SEM)
将水凝胶切割并在液氮中冷冻。然后将样品冷冻干燥，并使用在10.0kV的加速电压和8.0mm的工作距离下操作的场发射SEM(JEOL JSM-7400F)观察水凝胶的形态。
hMSC的培养
hMSC在MSCGM培养基(Lonza，美国)中培养，并在37℃、5％CO2下孵育。每三天更换培养基。用含有0.025(w/v)％胰蛋白酶和0.01％EDTA的PBS收获细胞，离心并在MSCGM中传代培养至第4代，用于如下所述的水凝胶表面上的2D培养或3D水凝胶封装。
肽水凝胶表面上的细胞培养
将IEVEIRVK(IVK8)粉末以1.5(W/V)％的肽浓度溶解在300mM蔗糖溶液中。应该提到的是，蔗糖是用来维持生理渗透压的。将35μL肽溶液转移到96孔板中。形成软凝胶，然后添加15μL DMEM完全培养基。将凝胶在37℃下孵育进一步固化10min。对于水凝胶表面的2D细胞增殖，将RPMI培养基中的100μL MCF-7细胞接种到肽水凝胶表面。每2-3天更换培养基。使用MTT测定法定量水凝胶上的细胞增殖。
3D肽水凝胶中的细胞培养
将IVK8粉末以1.5(w/v)％的肽浓度溶解在300mM蔗糖溶液中，并保持在4℃。将70μL肽溶液转移到1mL注射器的开口端部。应注意，注射器的开口端部应在溶液转移之前切开。将BT-474细胞以300万/mL悬浮在DMEM中。将30μL细胞悬浮液添加到肽溶液中。将注射器转移到培养箱中，并且在37℃下孵育20min。之后，将肽凝胶转移到24孔板中进行长期培养。每2-3天更换培养基。通过MTT测定法定量水凝胶中细胞的生存力。以预定的时间间隔收集凝胶并用组织破裂器(Qiagen，美国)均质化。结果表示为第1天吸光度的百分比。
共焦激光扫描显微研究
通过倒置共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)(CLSM,Carl Zeiss，德国)观察水凝胶表面和3D肽水凝胶环境内部hMSC的形态和生存力。使用活/死细胞染色测定(Invitrogen)。简单地说，将在腔室盖玻片(NUNC，丹麦)中的水凝胶表面上培养的细胞用PBS洗涤并在含有染料的0.5mL的PBS中孵育10min，然后通过CLSM在488nm和532nm的激发波长下可视化。所有观察均在相同条件下进行。对于在3D水凝胶中生长的细胞，切割构建体，然后添加染色剂。将凝胶转移到盖玻片上，以及然后使用与对水凝胶表面上的细胞所述相同的方法通过CLSM可视化。
抗微生物活性
1.肽的MIC测量
将细菌和真菌样品分别在37℃和室温下在MHB中摇动(100rpm)下生长。随后将它们孵育过夜以进入对数生长期。使用肉汤微量稀释法测定每种肽的各自MIC。将每种微生物悬浮液(100μL)接种到96孔板的每个孔中(3×105CFU ml-1)，向其中添加100μL含有不同浓度肽的肉汤。然后将板在摇动(100rpm)下在37℃下孵育18h。MIC被认为是通过用酶标仪(TECAN,瑞士)观察到完全抑制微生物生长的最低肽浓度。使用阴性对照(仅含有微生物且未经肽处理的肉汤)。对于每个实验重复六次重复。注意到白色念珠菌细胞在室温下在酵母培养基肉汤(YMB，BD)中生长。
2.肽水凝胶的抗微生物活性
用于抗微生物测定的水凝胶在96孔组织培养板(NUNC)中制备。简单地说，将具有不同含量抗微生物肽的IIK12(1％)溶解在水中并涡旋。将50μL溶液转移到孔中。在37℃下过夜发生胶凝。使用肉汤稀释法测量水凝胶上的微生物生长。简单地说，将30μL微生物悬浮液(3.5×105CFU/mL)引入水凝胶中，并使用不含抗微生物肽的96孔板和肽水凝胶作为对照。通过测量OD 600nm监测细菌溶液的光密度读数。该测定对每个样品进行四次重复，并且实验重复至少三次。通过扩散板法进一步测试抗微生物活性。简单来说，用微生物溶液对水凝胶进行攻击，在处理结束时，将水凝胶表面的微生物悬浮液取出并依次稀释，以及然后铺在1.5％LB琼脂板上。将板在37℃下孵育24小时(白色念珠菌在室温下孵育48小时)。形成微生物菌落并进行计数。实验一式三份进行并重复三次。
3.杀伤动力学测试
如上所述用肽水凝胶处理微生物。在处理的不同时间段，将微生物样品稀释用于铺板(LB Agar,1st Base)。孵育条件：细菌为37℃下18h。孵育期之后对菌落形成单位进行计数。该实验在独立设置中重复了3次。
4.圆盘扩散测定
通过圆盘扩散测定进一步测试抗微生物活性。简单来说，将3.5×106CFU/mL(40μL)的微生物悬浮液(金黄色葡萄球菌,ATCC No.6538)铺在1.5％LB琼脂板上。通过将50μL肽溶液滴到无菌圆盘上，制备圆盘(Sigma)以包含50μL不同浓度的肽。将圆盘风干若干分钟，然后放置到琼脂板的不同区域。将水凝胶(100μL)置于LB琼脂板上。将板在37℃下孵育24h。
5.溶血测定
将新鲜的大鼠红细胞用PBS洗涤3次。将100μL PBS中的红细胞悬浮液(体积为4％)置于96孔板的每个孔中的水凝胶表面，以及然后将100μL PBS添加到孔中。将板在37℃下孵育一小时。将96孔板以2000rpm离心5min。将上清液的等分试样(100μL)转移到新的96孔板中。使用酶标仪(TECAN)在576nm处测量血红蛋白释放。PBS中的红细胞用作阴性对照。具有用0.2％triton X-100裂解的红细胞的孔的吸光取作100％溶血。使用以下公式计算溶血百分比：溶血(％)＝[(样品中的OD576nm-PBS中的OD576nm)/(0.2％triton X-100中的OD576nm-PBS中的OD576nm)×100。数据表示为四次重复的平均值和标准偏差并且测试重复3次。
6.抗微生物肽水凝胶的体外细胞毒性研究
将1000μL HDF或角质形成细胞(每mL 105个细胞)接种到12孔Transwell板(Corning)上。将具有不同含量抗微生物肽的IIK12(1％)溶解在水中，并在37℃下孵育过夜，以及将100μL凝胶转移到Transwell板的插入物上。将1mL新鲜培养基添加到插入物中。在进行MTT测定之前，将板孵育24h。值得注意的是，未经任何处理的细胞和莫匹罗星(GSK)用作对照。数据表示为三次重复的平均值和标准偏差并且测试重复3次。
结果和讨论
肽设计和表征
在这项研究中，设计了由4-12个天然氨基酸残基组成的短两亲肽。优选地肽具有偶数个氨基酸残基以保持肽的化学互补性。这些肽序列的特征在于带电荷的亲水和疏水氨基酸的周期性重复，其中疏水残基是异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)，并且亲水残基是精氨酸(R)、赖氨酸(K)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)。精氨酸和赖氨酸在生理条件下或在25℃ pH 7至7.4时带正电荷，而谷氨酸和天冬氨酸带负电荷。选择异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)为疏水残基，因为它们具有很强的β-片层折叠倾向。值得注意的是，选择精氨酸(R)是因为其更快和更强的胶凝特性，而赖氨酸(K)与R结合使用是因为其较低的细胞毒性。为了使电荷排斥最小化，肽在C末端被酰胺化。当N末端具有疏水残基时，不必将N末端乙酰化，但可以通过已知方法进行。如果N末端具有亲水残基，则可以通过已知方法例如乙酰化来官能化以最小化电荷排斥。RP-HPLC显示肽的纯度大于95％。MS用于验证肽的分子量。如表1所示，通过MS测量的分子量与肽的理论计算的分子量一致，表明成功合成了肽。
此外，具有与SEQ ID No.9-16相反的序列的肽很可能能够与相应的水凝胶具有相似、基本相似或相同的功能。这些肽在表1中分别标识为SEQ ID No.19-26，并且可以通过本领域已知的方法制备。这些具有相反序列的肽应优选在N末端乙酰化并在C末端酰胺化。这使肽两端的电荷排斥最小化。
含有带正电荷和带负电荷的氨基酸二者的肽可能能够以比仅带正电荷的氨基酸的肽更低的浓度形成水凝胶。例如，仅带正电荷的氨基酸的肽通常在8％w/v或更高浓度下形成凝胶，而具有带正电荷和带负电荷氨基酸二者的肽在0.6％w/v和更高浓度下形成水凝胶。此外，仅带负电荷的氨基酸的肽不会进行自组装形成水凝胶。
肽的CD研究
如图1A所示，IVK8在水性溶液中的CD光谱在198nm处显示出最小值，表明其采用了无规卷曲结构。这归因于质子化的R和K残基之间的分子间静电排斥。然而，在盐诸如PBS的存在下，IVK8折叠并自组装成β-片层构型，其特征是在～197nm处的最大值，以及在～219nm处的强负椭圆率。盐触发肽的自组装，因为它会筛选和中和电荷，其中亲水残基E、R和K位于同一侧，具有来自带正电荷和带负电荷的离子基团的互补离子相互作用。Zhang等人也报道了类似的观察结果，其中EAK16和EAK12在添加盐后自组装成β-片层二级结构[17，35]。然而，EAK8(AEAEAKAK)在相同条件下没有形成β-片层二级结构[35]。与EAK8不同，我们的肽IEVEIRVK(IVK8)在添加盐后自组装成β-片层二级构型。一种可能的解释是在疏水肽面上使用疏水异亮氨酸和缬氨酸会增加肽的疏水性，进而通过增强异亮氨酸和缬氨酸之间的疏水相互作用来稳定IVK8的β-片层构型。基于上述研究，IVK8被确定为具有理想长度和序列的肽，并因此进一步改变其疏水性以研究其对生物物理特性的影响。在IVK8中用Leu或Ile置换Val分别产生肽序列ILK8和IIK8。与IVK8类似，ILK8和IIK8在水性溶液中采用无规构型，但在添加盐后折叠成β-片层结构(图1A和B)。有趣的是，用Leu或Ile置换Val导致更大程度的β-片层折叠，这由最小点处的分子椭圆率(θM)的负值指示。可以看出，IVK8、ILK8和IIK8的θM分别为-11.2、-21.4和-28.9deg.cm2dmol-1，表明与ILK8和IVK8相比，IIK8具有最大的β-片层构型。这是因为与Val相比，Ile和Leu更具疏水性，这增加了非极性侧的肽疏水性并导致β-片层更加稳定，并增加了肽β-片层构型[28，36]。一般认为，具有更多重复单元的交替亲水和疏水氨基酸残基的肽倾向于具有高的形成β-片层构型的倾向。因此，设计了一类新的由(X1Y1X2Y2)3构成的具有12个氨基酸的肽两亲物，其中X1和X2为疏水残基(Ile或Val)，YI和Y2为亲水残基(Arg、Lys或Glu)(表1)。有趣的是，这些肽两亲物在水中折叠并组装成β-片层结构，如218nm处的强负椭圆率所示(图2)。在盐的存在下进一步研究了由12个氨基酸组成的肽两亲物的CD光谱。具有150mM PBS的肽溶液在218nm处的最小负椭圆率表明它们也采用了富含β-片层的二级结构。值得注意的是，在盐的存在下肽两亲物IVK12的β-片层含量与在没有盐的情况下相似(图2A)。这是因为IVK12在PBS中具有净正电荷(+2)。静电排斥导致肽两亲物IVK12的β-片层构型程度较低。对于IRV12和IEV12也观察到类似的现象(图2)。尽管IRV12和IEV12具有不同的带电物质排列，但它们具有相似的净电荷并表现出相似的胶凝行为，因此净电荷可能比亲水残基的特定排列发挥更重要的作用。有利地，具有净正电荷的肽即使在不存在盐的情况下也可以更容易地形成β片层和水凝胶，这对于水凝胶的某些应用可能是必需的并且还导致成本降低。
肽水凝胶的流变特性
通常认为肽两亲物具有形成α-螺旋或β-片层结构的强烈趋势。在适当的条件下，由此产生的α-螺旋或β-片层可以进一步自组装成超分子结构，诸如包埋大量水的水凝胶(图3A和3B)[16]。水凝胶的典型SEM图像如图3C所示。可以清楚地看到水凝胶是高度多孔的。肽胶凝可以通过调节内在因素诸如氨基酸序列、重复单元数目、肽浓度和外部环境诸如温度、pH和盐浓度来调节[23]。
肽长度和肽结构的影响
由4-6个氨基酸残基组成的肽两亲物在浓度最高至2％时不能形成水凝胶(表2)。这些结果与先前的发现一致，即肽长度决定分子间和分子内相互作用的强度。包含8个氨基酸残基的肽两亲物的设计如表2所示。首先，亲水离子残基的位置已经过系统调整，以评估它们对肽胶凝的影响。对于IRK8没有凝胶形成(最高至2％)，其中亲水氨基酸残基以(+--+)的方式排列。可能的是，IRK8可以在更高的温度(例如37℃)和/或浓度下形成凝胶。然而，对于IRE8，观察到胶凝，其中亲水氨基酸残基以(+-+-)的模式排列。需要说明的是，胶凝动力学缓慢，例如，IRE8在室温下需要3天才能形成浓度为2％的凝胶。当温度升高至37℃时，胶凝时间显著缩短至1天。类似地，预计12个氨基酸的肽可在室温下形成水凝胶，具有延长的胶凝时间和/或更高的浓度。
值得注意的是，IVK8实现了快速胶凝，其中亲水氨基酸残基以(--++)模式排列。例如，在2％时，IVK8在室温(23-24℃)下在60分钟内发生胶凝，而在37℃下其在30min内形成凝胶。使用IVK8作为基本肽序列，将其疏水氨基酸残基Val替换为Ile或Leu，而亲水氨基酸残基和排列保持不变。在相同条件下，用Ile或Leu置换Val导致更快的胶凝(表2)。例如，当在37℃下孵育时，IIK8在1.5％下在15min内发生胶凝。还观察到肽长度增加到12个氨基酸会导致凝胶浓度降低。值得注意的是，IIK12和IVK12是性能最好的肽，这是因为易于胶凝，它们在低至0.6(w/v)％的浓度下自组装成水凝胶。这些发现表明肽链长度和肽结构在胶凝中起重要作用。在图3A中，示出了由1.5％w/v IVK8和1.5和2.0％w/v IIK8形成的水凝胶，其中白色条是小瓶中凝胶的表面10。
凝胶形成的速度可以通过调整以下至少一项来增加：肽浓度、盐的存在和升高温度。与具有8个氨基酸的肽相比，具有12个氨基酸残基的肽通常更容易形成凝胶。此外，具有净正电荷(但含有带负电荷的亲水氨基酸)的肽由于增强的β片层氢键而倾向于在较低浓度下形成水凝胶。
肽浓度和肽疏水性对机械性能的影响
使用动态力学分析研究了肽浓度对流变特性的影响。肽两亲物自组装成表现出刚性粘弹性的超分子水凝胶。典型的频率扫描测量如图4A和图5A所示，其中储能模量(G’)远大于损耗模量(G”)值。此外，G’值与0.1至50rad/s的频率无关。1Hz(6.28rad/s)时的G'值列出在表3中，并且用于凝胶刚度比较。发现将肽IVK8浓度从1.0％增加到1.75％显著增加了刚度。例如，1.75％时的G'值是1.0％时的10倍(表3)。结果表明肽凝胶刚度受肽浓度(即水性溶液中肽的量)的强烈影响。这是因为在更高浓度下更多的肽分子参与了物理交联。为了研究氨基酸残基的疏水性对凝胶强度的影响，将IVK8中的所有Val都置换为Ile或Leu。这种修饰产生肽IIK8和ILK8。IVK8、IIK8和ILK8的G'值分别为84、125和332Pa(表3)，表明肽结构中非极性氨基酸残基的疏水性增加导致凝胶更硬。据报道，Ile和Leu具有相似的疏水性。然而，与IIK8相比，ILK8形成的凝胶强度更大。这是因为在自组装和胶凝过程中，Leu可能比Ile更有效地堆叠。最大肽浓度可能为约3-5w/v％、至多5w/v％、至多4w/v％或至多3w/v％。过量肽的存在可能使水凝胶对于某些应用来说太硬，并且最佳肽浓度将部分取决于肽结构和肽的用途。这可以通过如下所示的盐的存在来进一步调整。
盐的影响
在水性溶液中，由8个氨基酸组成的肽两亲物以无规卷曲构型存在。然而，在添加盐后其自组装成β-片层结构并形成刚性水凝胶。例如，在PBS的存在下，IVK8在1.5％时具有的G'为～900Pa，几乎是没有盐时的2倍。在DMEM中也观察到了类似的现象。当将DMEM细胞培养基添加到肽水溶液中时，肽会形成刚性水凝胶。例如，在DMEM中，IVK8在1.5％时的G’为～2400Pa，几乎是没有DMEM时的5倍。值得注意的是，在PBS中，IVK8在2.5％时获得了10kPa的极硬的水凝胶。特别是在37℃下实现了快速胶凝。这对于组织工程应用至关重要，因为凝胶动力学必须足够快以确保基质内的细胞分布均匀。此外，在37℃下形成比室温更硬的凝胶(表3)。
此外，在最佳条件下(通过调整肽浓度和DMEM体积)获得了在细胞培养环境中具有高稳定性的凝胶(表4)。表4显示了所用IVK8的初始浓度(1.0、1.2和1.5％w/v)，通过添加DMEM进行调整以实现表4中所示的比例。可以观察到，对于大多数水凝胶，制备的水凝胶稳定至少7天，而对于较高浓度的肽水凝胶稳定至少15天。
在盐的存在下肽水凝胶强度的显著增加归因于以下事实：盐屏蔽电荷并促进分子内和分子间相互作用(氢键和范德华相互作用)，从而形成高度交联的网络。如果可以将含有药物和/或细胞的水凝胶构建体注射到体内并在给药时保持完整，那将是理想的。对于具有8个氨基酸的肽，溶液中盐的存在增加水凝胶的刚度并降低形成凝胶所需的肽浓度。在不存在盐的情况下，已发现IVK8、IIK8和ILK8在1.0％w/v的最小浓度下形成凝胶。在盐的存在下，这些肽的浓度可以降低到0.6％w/v，从而降低制备凝胶的成本。此外，无论是在室温下还是在更高温度(例如37℃)下，盐都极大减少胶凝时间。
进行流动扫描以研究肽水凝胶是否是可注射的。图4B显示IVK8的黏度随着剪切速率的增加而显著降低，表明水凝胶的剪切稀化特性。在存在DMEM的情况下，对于IVK8也观察到了类似的现象(图5B)。IVK8肽溶液的胶凝是通过添加DMEM触发的，其中DMEM位于肽水凝胶网络中。
黏度的降低归因于在施加剪切应力时肽分子之间的物理交联的破坏。为了通过注射器递送含有药物和/或细胞的肽凝胶构建体，当剪切应力终止时，具有低黏度的破裂凝胶能够迅速恢复为坚硬的凝胶是至关重要的[26]。使用动态阶跃应变幅度测试研究肽水凝胶的恢复能力，其中将0.5％和100％的应变周期性地施加在肽水凝胶上。如图4C所示，当施加0.5％的应变时，IVK8的初始G'值为～50Pa。然而，当受到高应变(100％)时，G'值迅速下降～250倍至0.2Pa，进一步证明了剪切稀化特性。经过30s的连续高应变后，应变降低到0.5％。有趣的是，发现G'值立即恢复，表明流变行为可逆。在相同条件下进一步评估了在DMEM的存在下肽水凝胶的这种可逆性。图5C显示当施加0.5％的应变时，初始G'值为～2000Pa。当受到100％的高应变时，G'值显著降低了～2000倍至～1Pa。值得注意的是，当应变降低到0.5％时，G'值立即恢复。对于IIK12水凝胶也观察到类似的现象，其中IIK12水凝胶的储存模量随着肽浓度的增加而增加(表5)。此外，IIK12水凝胶响应于动态阶跃应变幅度测量表现出可逆的流变行为(图6)。肽水凝胶的这种流变行为为用作可注射基质以递送治疗剂，诸如药物和细胞提供了巨大的优势。快速恢复动力学可以通过凝胶网络的物理交联在高应变终止后立即恢复的事实来解释。
肽水凝胶的体外生物相容性
使用不同的细胞类型研究了肽水凝胶的生物相容性及其对细胞增殖的影响。首先，将hMSC接种在肽水凝胶的表面。如图7所示，大多数细胞在肽水凝胶表面附着24小时后仍然存活(看到活细胞为黑色背景上的白点)，表明肽水凝胶具有生物相容性。接下来，我们分析了IVK8水凝胶上MCF-7细胞的增殖率。如图8A所示，增殖率取决于细胞接种密度。在细胞密度较低的肽水凝胶上培养的MCF-7比细胞密度较高的肽水凝胶生长得快得多。这是因为细胞生长受到二维培养的有限空间的限制。幸运的是，这可以通过3D环境中的细胞培养来克服。由于能够捕获高含水量，水凝胶是3D环境中细胞生长的有吸引力的基质。此外，水凝胶通过其高含水量基质具有对氧气和营养物质的高渗透性，这对于细胞生长和组织工程来说是理想的。将肽溶解在含有300mM蔗糖的水性溶液中，并在4℃下形成恶性溶液。通过添加含有hMSC的细胞培养基触发胶凝。评估封装的hMSC的细胞生存力以评估肽水凝胶的细胞毒性。在封装后1天，使用共聚焦显微镜通过活/死染色评估生存力。发现大多数封装的hMSC在IVK8水凝胶中仍然存活。BT-474细胞也被封装在IVK8水凝胶中，并使用MTT测定法定量细胞生长。图8B显示第4天水凝胶中的细胞数几乎比第1天高一倍，表明肽水凝胶是细胞3D培养的合适基质。总之，具有可调机械性能的可注射肽水凝胶为细胞生长和组织工程提供了一个有前途的生物相容性系统。
含有β-片层的肽水凝胶形成合成抗微生物寡肽，用于预防和治疗细菌感染。
我们之前开发了一系列形成β-片层的合成阳离子寡肽，这些肽表现出广谱抗微生物活性和对各种微生物的高选择性，包括革兰氏阳性金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性大肠杆菌和铜绿假单胞菌以及酵母白色念珠菌[37，38]。由D-氨基酸形成的肽表现出更强的抗微生物活性。前导抗微生物肽IK8L(IRIKIRIK SEQ ID No.17)和IK8D(D-异构体,SEQ IDNo.18)有效杀伤多种临床分离的多药耐药性(MDR)微生物，包括MRSA、VRE、多药耐药鲍曼不动杆菌(A.baumannii)、铜绿假单胞菌和酵母新型隐球菌(C.neoformans)[37]。例如，IK8L对MRSA、鲍曼不动杆菌、VRE、铜绿假单胞菌和新型隐球菌的MIC分别为31.3、12.5、15.6、7.8和7.8mg/L。IK8D对MRSA、鲍曼不动杆菌、VRE、铜绿假单胞菌和新型隐球菌的MIC分别为3.9、31.3、3.9、15.6和7.8mg/L。特别地，用肽重复处理大肠杆菌和金黄色葡萄球菌减轻了耐药性发展。IK8L也表现出很强的抗真菌活性，并且可以有效去除体外和真菌生物膜诱导的角膜炎小鼠模型中形成的真菌生物膜，而不会对眼睛造成显著毒性[39]。然而，IK8D/IK8L在较高的肽浓度(例如8w/v％)下形成水凝胶，这将在胶凝浓度下诱导细胞毒性，使其不适合单独用于治疗用途。然而，通过静电相互作用将这些抗微生物肽添加到IIK12水凝胶中会形成杂化抗微生物肽水凝胶。我们系统地评估了杂化水凝胶对病原微生物的抗微生物活性。
抗微生物杂化水凝胶的流变行为
表6显示了在37℃下在水中0.5％IIK12和IK8L或IK8D的胶凝。单独IIK12无法形成水凝胶。然而，添加IK8D或IK8L促进了胶凝(表7)。SEM图像显示，与IIK12凝胶相比，IIK12/IK8D凝胶具有的孔数更多且尺寸更小(图9)。为了研究IIK12浓度对杂化水凝胶强度的影响，我们对具有不同IIK12浓度的杂化水凝胶进行了动态频率扫描。观察到IIK12/IK8L的刚度随着IIK12浓度的增加而增加(表8)。发现在较低的IIK12浓度下，杂化水凝胶的刚度与不存在IK8L的肽水凝胶的刚度相当(表5)，表明IK8L的存在不会影响较低浓度的凝胶机械强度。然而，IIK12/IK8L的G'值略低于1.0％IIK12的IIK12水凝胶。值得注意的是，将IIK12保持在1％的浓度下，即使在0.8％IK8L下也观察到杂化水凝胶的胶凝。这进一步证明了IK8L的引入不会显著影响IIK12的胶凝。与IIK12水凝胶类似，IIK12/IK8L杂化水凝胶表现出剪切稀化和恢复流变行为(图10)。当施加剪切应力时，IIK12/IK8L的黏度迅速降低，表明其是可注射的。通过动态阶跃应变幅度测试进一步评估IIK12/IK8L的流变行为。在0.5％的应变下，IIK12/IK8L的G'值为～200Pa。当对凝胶施加100％应变时，刚度显著降低。当应变降低到0.5％时，杂化水凝胶迅速自我修复并恢复其初始刚度。该特性允许通过注射器递送水凝胶，而凝胶强度不受注射过程的影响。流变行为的可逆性对于局部应用也非常有用。
IIK12/IK8杂化水凝胶的抗微生物活性
研究了杂化水凝胶对一组具有代表性的临床相关微生物的抗微生物活性，包括革兰氏阳性金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性大肠杆菌和酵母白色念珠菌。据报道，与DFU感染相关的常见细菌病原体是革兰氏阳性金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性大肠杆菌和铜绿假单胞菌。金黄色葡萄球菌是主要病原体，并且在约10-20％的患者中出现大肠杆菌和铜绿假单胞菌[32]。用1％的IIK12制备杂化水凝胶。同时，改变IK8L的浓度以研究其对杂化水凝胶抗微生物活性的影响。每个水凝胶表面用细胞密度为105CFU/mL的三种病原体攻击。通过光密度(OD)测量评估微生物增殖，并通过琼脂板对处理后水凝胶表面上的活细胞进行定量。如图11所示，对照凝胶IIK12在杀伤微生物方面无效，如OD测量和琼脂板结果所示。抗微生物肽IK8L的掺入赋予了抗微生物活性。含有0.128％(1.28mg/mL)或0.256％(2.56mg/mL)IK8L的杂化水凝胶能够杀伤金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌。重要的是，杂化水凝胶在与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌接触时表现出100％的杀伤力。阳离子抗微生物肽从水凝胶中释放出来，并通过静电相互作用被吸引到微生物的阴离子细胞膜上并与之相互作用。在微生物细胞膜存在的情况下，IK8L很容易折叠成通过静电相互作用稳定的二级β-片层结构，然后将其疏水残基插入微生物的脂质双层，导致微生物细胞膜的物理破坏。
通过分析在不同暴露时间下与IIK12/IK8L接触的活微生物，进一步研究了杂化水凝胶杀伤金黄色葡萄球菌的能力。如图12所示，在2.56mg/mL的IK8L(即0.256％)下，在混合凝胶表面暴露半小时后，金黄色葡萄球菌细胞被完全杀死，表明快速杀伤动力学。值得注意的是，对于对照培养基和对照凝胶IIK12，孵育24小时的Log(CFU)值分别为8.76和9.28。然而，在杂化水凝胶表面没有观察到CFU，表明与杂化水凝胶接触后100％的微生物被杀死。这一发现进一步证明了IK8L在杂化水凝胶的有效抗微生物作用中发挥了关键作用。
使用圆盘扩散测定技术进一步研究了肽和肽水凝胶在防止微生物菌落形成中的抗微生物活性。首先，将含有不同浓度IK8L的无菌滤盘置于新鲜金黄色葡萄球菌接种的琼脂板上。如图13A所示，IK8L有效抑制琼脂板上的金黄色葡萄球菌菌落形成，在含有肽的滤盘周围显示出抑制区。值得注意的是，抑菌圈面积随着肽浓度的增加而增加。然后将IIK12/IK8L杂化水凝胶浇注在已接种金黄色葡萄球菌的琼脂板上，并在37℃下孵育一天。在与IIK12凝胶接触的琼脂和周围区域上观察到细菌过度生长，表明其在防止金黄色葡萄球菌菌落形成方面无效(图13B)。相比之下，在IIK12/IK8L的情况下，与凝胶接触的底层琼脂保持透明，证明了其防止金黄色葡萄球菌菌落形成的能力(图13B)。还观察到混合水凝胶的抑制区。由于IK8D的抗微生物活性比IK8L更强，IIK12/IK8D杂化水凝胶的抑制区面积更大(图13C)。这些发现表明抗微生物肽可以从杂化水凝胶中释放出来。
IIK12/IK8杂化水凝胶的体外生物相容性
溶血是许多阳离子肽和聚合物引起的主要副作用之一。在与大鼠红细胞孵育后评估杂化水凝胶的溶血行为。我们之前发现IK8L和IK8D表现出低溶血活性，其中HC10值(诱导10％或更多溶血的最低浓度)分别为2000和1750μg/mL。与先前关于IK8L和IK8D的发现相似，即使在高至10.24mg/mL(1.024％)的IK8D浓度下，它们相应的杂化水凝胶对大鼠红细胞的溶血作用也很小(图14)。
使用人原代真皮成纤维细胞(HDF)和角质形成细胞进一步评估了肽凝胶的体外生物相容性。我们首先评估了肽IK8L在HDF中的细胞毒性。在最高至500μg/mL下细胞生存力超过85％(图15A)。然而，当IK8L的浓度增加到1000μg/mL时，细胞生存力降低到22％。值得注意的是，暴露于IIK12/IK8L水凝胶的HDF在1000μg/mL的IK8L下显示出超过95％的细胞生存力，表明杂化水凝胶在测试浓度下没有细胞毒性(图15B)。在相同的测试条件下，比较了常用于抗微生物乳膏的莫匹罗星和多粘菌素B与IIK12/IK8L相比的体外生物相容性(图15C和D)。莫匹罗星对HDF表现出良好的生物相容性，如通过即使在2000μg/mL下细胞生存力也超过80％证明的。多粘菌素B在HDF中具有与IK8L相似的细胞毒性特征。在角质形成细胞的情况下，IK8L表现出剂量依赖性细胞毒性。当暴露于125μg/mL的IK8L时，超过70％的角质形成细胞仍然存活(图16A)。在125μg/mL的IK8L下，IIK12/IK8L显示出比IK8L更高的细胞生存力(接近100％)(图16B)。角质形成细胞在暴露于莫匹罗星后的生存力为80-90％(图16C)。
有利地，本文所述的短肽以比先前制备的水凝胶低的浓度自组装成水凝胶。此外，肽水凝胶是生物相容的，并且在测试和使用的浓度下没有细胞毒性。肽水凝胶可用于多种生物医学应用，例如作为用于2D和/或3D细胞培养的支架、细胞递送和用于受控释放治疗剂的基质。
虽然单独的短肽水凝胶没有抗微生物活性，但它们可以与先前报道的IK8L/IK8D结合形成结合了两种肽的理想特性的杂化水凝胶。特别地，本文描述了肽水凝胶的生物相容性、无细胞毒性以及它们的流变行为(性质)的可逆性。因此，这些新的肽水凝胶可以作为载体来递送治疗剂(例如药物)。另一个方面，IK8L/IK8D肽有助于抗微生物活性，同时在比以前报道的低得多(例如8(w/v)％)的浓度下形成杂化水凝胶，从而减轻了使用单独IK8L/IK8D时的细胞毒性问题(例如2(w/v)％)。
特别地，杂化抗微生物水凝胶(即IIK12/IK8L)被设计用于预防和治疗感染，其中IIK12作为药物载体，并且IK8L作为抗微生物剂。有利地，IIK12以较低浓度形成水凝胶。此外，它具有生物相容性并且没有细胞毒性。此外，IIK12/IK8L杂化水凝胶将IK8L递送至DFU部位，以有效浓度消除感染，从而杀伤微生物，同时最大限度地减少对哺乳动物细胞和组织的细胞毒性。类似地，本文所述的其他水凝胶预计将类似地形成具有类似治疗特性同时最小化细胞毒性的杂化水凝胶。
结论
在本研究中，设计了一系列具有交替疏水残基(X)和亲水残基(Y)的短合成肽。疏水残基(X)选自Ile、Val和Leu，并且亲水残基(Y)选自来自Arg、Lys、Glu和Asp。肽两亲物自组装成具有可调机械强度、可逆流变行为和可持续稳定性的水凝胶。由具有8个氨基酸的肽自组装而成的肽水凝胶已被证明与包括hMSC在内的一系列细胞具有生物相容性，并显示出用作支持细胞增殖的细胞递送载体的巨大潜力。包括12个氨基酸的肽两亲物自组装成β片层构型，并在低肽浓度(0.6％w/v)的水性溶液中形成肽水凝胶。通过静电相互作用将形成β片层的抗微生物肽引入水凝胶中，形成杂化抗微生物肽水凝胶。杂化水凝胶表现出剪切稀化和恢复流变行为。杂化水凝胶表现出对各种临床相关微生物的广谱抗微生物活性。此外，它们证明了体外生物相容性。这些抗微生物杂化肽水凝胶在预防和治疗细菌和真菌感染(包括DFU感染)中显示出巨大的潜力。
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表
表1.肽设计和分子量表征。
SEQ ID No.6至16的肽在C末端被酰胺化。SEQ ID No.19至26的肽在C末端被酰胺化并且在N末端被N-乙酰化。
表2.不同电荷分布和疏水性对凝胶特性的影响。
表3.在1Hz频率下由IVK8、IIK8和ILK8自组装的肽水凝胶的G′(储能模量)和G″(损耗模量)值。
表4.在DMEM的存在下由IVK8自组装的肽水凝胶的稳定性。水凝胶在37℃下形成。对于初始肽浓度为1.0(w/v)％的条目，最终肽浓度：对于80:20、70:30、60:40和50:50的比率分别为0.8％、0.7％、0.6％和0.5％。这同样适用于其他初始浓度。
表5.在1Hz频率下由IIK12自组装的肽水凝胶的G′(储能模量)和G″(损耗模量)值。
水凝胶在37℃下孵育过夜。
表6.抗微生物肽杂化水凝胶在水中的胶凝。
表7.抗微生物肽杂化水凝胶的胶凝。
水凝胶中的最终盐浓度：150mM
表8.在1Hz频率下由抗微生物肽水凝胶自组装的肽水凝胶的G′(储能模量)和G″(损耗模量)值。
水凝胶在37℃下孵育过夜。
序列表
<110> 新加坡科技研究局 (Agency for Science, Technology and Research)
<120> 一系列用于各种生物医学应用的由短肽自组装的可注射水凝胶
<130> 20200868
<150> SG 11201906759W
<151> 2019-07-22
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 1
Ala Glu Ala Glu Ala Lys Ala Lys Ala Glu Ala Glu Ala Lys Ala Lys
1 5 10 15
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-乙酰化羧酰胺
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> 酰胺化
<400> 2
Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala Arg Ala Asp Ala
1 5 10 15
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-乙酰化羧酰胺
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> 酰胺化
<400> 3
Arg Ala Arg Ala Asp Ala Asp Ala Arg Ala Arg Ala Asp Ala Asp Ala
1 5 10 15
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 中心四肽II'型β转角，两侧为交替的缬氨酸(疏水)和赖氨酸(亲水)残基
<220>
<221> SITE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa (X)是D-vakube
<220>
<221> TURN
<222> (9)..(12)
<223> II'型β转角
<400> 4
Val Lys Val Lys Val Lys Val Lys Xaa Pro Pro Thr Val Lys Val Lys
1 5 10 15
Val Lys Val Lys
20
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-乙酰化羧酰胺
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 酰胺化
<400> 5
Ile Leu Val Ala Gly Lys
1 5
<210> 6
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 4氨基酸肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (4)..(4)
<223> 酰胺化
<400> 6
Ile Arg Val Glu
1
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 6氨基酸肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 酰胺化
<400> 7
Ile Arg Val Glu Ile Lys
1 5
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IRK8
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 8
Ile Arg Val Glu Ile Glu Val Lys
1 5
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IRE8
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 9
Ile Arg Val Glu Ile Lys Val Glu
1 5
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IVK8
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 10
Ile Glu Val Glu Ile Arg Val Lys
1 5
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IIK8
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 11
Ile Glu Ile Glu Ile Arg Ile Lys
1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ILK8
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 12
Ile Glu Leu Glu Ile Arg Leu Lys
1 5
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IRV12
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 酰胺化
<400> 13
Ile Arg Val Glu Ile Arg Val Glu Ile Arg Val Glu
1 5 10
<210> 14
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IEV12
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 酰胺化
<400> 14
Ile Glu Val Glu Ile Glu Val Lys Ile Arg Val Lys
1 5 10
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IVK12
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 酰胺化
<400> 15
Ile Arg Val Lys Ile Glu Val Glu Ile Arg Val Lys
1 5 10
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IIK12
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 酰胺化
<400> 16
Ile Arg Ile Lys Ile Glu Ile Glu Ile Arg Ile Lys
1 5 10
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IK8L
<400> 17
Ile Arg Ile Lys Ile Arg Ile Lys
1 5
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IK8D, 全D-氨基酸
<220>
<221> SITE
<222> (1)..(8)
<223> 全D-氨基酸
<400> 18
Ile Arg Ile Lys Ile Arg Ile Lys
1 5
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向 IRE8
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 19
Glu Val Lys Ile Glu Val Arg Ile
1 5
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向IVK8
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 20
Lys Val Arg Ile Glu Val Glu Ile
1 5
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向IIK8
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 21
Lys Ile Arg Ile Glu Ile Glu Ile
1 5
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向ILK8
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> 酰胺化
<400> 22
Lys Leu Arg Ile Glu Leu Glu Ile
1 5
<210> 23
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向IRV12
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 酰胺化
<400> 23
Glu Val Arg Ile Glu Val Arg Ile Glu Val Arg Ile
1 5 10
<210> 24
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向IEV12
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 酰胺化
<400> 24
Lys Val Arg Ile Lys Val Glu Ile Glu Val Glu Ile
1 5 10
<210> 25
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向IVK12
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 酰胺化
<400> 25
Lys Val Arg Ile Glu Val Glu Ile Lys Val Arg Ile
1 5 10
<210> 26
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向IIK12
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 酰胺化
<400> 26
Lys Ile Arg Ile Glu Ile Glu Ile Lys Ile Arg Ile
1 5 10
Claims (32)
1.一种肽，包括交替的疏水氨基酸(X)和亲水氨基酸(Y)的氨基酸序列，其中，每个疏水氨基酸独立地选自异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)，每个亲水氨基酸独立地选自精氨酸(R)、赖氨酸(K)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)，至少一个亲水氨基酸选自精氨酸和赖氨酸，至少一个亲水氨基酸选自谷氨酸和天冬氨酸，并且所述氨基酸序列包含至少8个氨基酸。
2.根据权利要求1所述的肽，其中，所述氨基酸序列不是IRVEIEVK。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的肽，其中，所述氨基酸序列具有偶数个氨基酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的肽，其中，所述氨基酸序列具有8或12个氨基酸。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的肽，其中，在所述氨基酸序列中有至少一个精氨酸和至少一个赖氨酸。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的肽，其中，所述交替的疏水氨基酸(X)和亲水氨基酸(Y)的氨基酸序列中的四个顺序排列的亲水氨基酸(Y1、Y2、Y3和Y4)选择为使得Y1和Y2各自独立地选自谷氨酸和天冬氨酸，并且Y3和Y4各自独立地选自精氨酸和赖氨酸。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的肽，其中所述交替的疏水氨基酸(X)和亲水氨基酸(Y)的氨基酸序列中的四个顺序排列的亲水氨基酸(Y1、Y2、Y3和Y4)选择为使得Y1和Y3各自独立地选自精氨酸和赖氨酸，并且Y2和Y4各自独立地选自谷氨酸和天冬氨酸。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的肽，其中，所述交替的疏水氨基酸(X)和亲水氨基酸(Y)的氨基酸序列中的六个顺序排列的亲水氨基酸(Y1、Y2、Y3、Y4、Y5和Y6)选择为使得Y1、Y3和Y5各自独立地选自精氨酸和赖氨酸，并且Y2、Y4和Y6各自独立地选自谷氨酸和天冬氨酸。
9.根据权利要求1至5中任一项所述的肽，其中，所述交替的疏水氨基酸(X)和亲水氨基酸(Y)的氨基酸序列中的六个顺序排列的亲水氨基酸(Y1、Y2、Y3、Y4、Y5和Y6)选择为使得Y1、Y2和Y3各自独立地选自谷氨酸和天冬氨酸，并且Y4、Y5和Y6各自独立地选自精氨酸和赖氨酸。
10.根据权利要求1至5中任一项所述的肽，其中，所述交替的疏水氨基酸(X)和亲水氨基酸(Y)的氨基酸序列中的六个顺序排列的亲水氨基酸(Y1、Y2、Y3、Y4、Y5和Y6)选择为使得Y1、Y2、Y5和Y6各自独立地选自精氨酸和赖氨酸，并且Y3和Y4各自独立地选自谷氨酸和天冬氨酸。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的肽，其中，所述亲水氨基酸选择为使得所述肽具有净中性电荷或净正电荷。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的肽，其中，所述氨基酸序列中至少一半的疏水氨基酸是异亮氨酸或亮氨酸。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的肽，其中，所述氨基酸序列中有12个氨基酸，并且疏水氨基酸残基各自独立地选自异亮氨酸和缬氨酸。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的肽，其中，所述氨基酸序列为以下任一个：SEQID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQID No.23、SEQ ID No.24、SEQ ID No.25和SEQ ID No.26。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的肽，其中，所述肽在所述氨基酸序列的C末端被酰胺化和/或在所述氨基酸序列的N末端被乙酰化。
16.一种组合物，包括由β-片层构型的多个根据权利要求1至15中任一项所述的肽和水形成的水凝胶或所述水凝胶的干燥形式。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中，所述多个肽的浓度为至少0.6％w/v。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中，所述浓度为至多5％w/v。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的组合物，包括盐。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中，所述盐是选自PBS、DMEM、MEM、钾盐和钠盐中的任一种。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的组合物，其中，所述肽具有SEQ ID No.12、SEQID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.22、SEQ ID No.25或SEQ ID No.26的氨基序列。
22.根据权利要求16至21中任一项所述的组合物，包括治疗剂。
23.根据权利要求16至22中任一项所述的组合物，包括SED ID No.17或SEQ ID No.18的第二肽。
24.根据权利要求22至23中任一项所述的组合物，其用作药物用途。
25.根据权利要求23所述的组合物在制备用于治疗细菌感染和/或真菌感染的药物中的用途。
26.一种治疗细菌和/或真菌感染的方法，所述方法包括向患有细菌和/或真菌感染的受试者给药治疗有效量的根据权利要求23所述的水凝胶。
27.一种形成水凝胶的方法，所述方法包括将根据权利要求1至15中任一项所述的肽混合在水中以形成水凝胶；以及分离所述水凝胶。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述搅拌步骤在盐的存在下进行。
29.根据权利要求27至28中任一项所述的方法，其中，所述搅拌步骤在20℃至40℃的温度下进行。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的方法，包括干燥所述水凝胶以形成适合重构为所述水凝胶的干燥水凝胶。
31.一种生长细胞的体外方法，所述方法包括提供根据权利要求1至15中任一项所述的肽、细胞培养基和细胞群的混合物以形成包含所述细胞群的凝胶；以及在合适的条件下孵育所述凝胶以生长所述细胞群。
32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述细胞是选自以下中的任一种：健康细胞、用于治疗或生长组织的干细胞和用于生长肿瘤以进行体外和体内研究的癌细胞。
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