CN117836309A - 作为普通基底膜基质的经济替代品的肽与明胶的杂化水凝胶 - Google Patents

作为普通基底膜基质的经济替代品的肽与明胶的杂化水凝胶 Download PDF

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Abstract

本文中描述了包含肽和明胶的水凝胶。所述肽包含具有至少8个氨基酸的序列，所述序列具有交替的疏水性氨基酸(X)和亲水性氨基酸(Y)，其中每个疏水性氨基酸独立地选自异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)，每个亲水性氨基酸独立地选自精氨酸(R)、赖氨酸(K)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)，其中所述亲水性氨基酸被选择成使得存在至少一个精氨酸和至少一个赖氨酸。还描述了用于制备所述水凝胶的试剂盒和方法。所述水凝胶可用于培养细胞和确定化合物对所述水凝胶中培养的细胞的作用。

Description

作为普通基底膜基质的经济替代品的肽与明胶的杂化水凝胶
本申请要求2021年8月19日提交的标题为“Peptide/Gelatin Hybrid Hydrogelsas Economical Alternatives to Common Basement-Membrane Matrices”的新加坡专利申请号10202109074X的优先权，该申请通过引用整体并入本文。
技术领域
本申请涉及包含肽与明胶的水凝胶以及所述水凝胶的体外和体内用途。
背景技术
水凝胶是溶胀的3D黏弹性聚合物网络，其物理特性类似于天然机体组织。水凝胶在生物医学应用中的首次使用追溯到20世纪60年代，并且由于它们的具有吸引力的特性例如生物相容性、优异的保水能力和用于适应目的组织的可调节的机械强度，因此自那时起它们就开始流行。重要的是，随着化学和生物学的进步，水凝胶的工程潜力不断扩大。
基于水凝胶的材料用于为体外3D肿瘤球状体培养物和体内肿瘤移植物二者创建可支持并促进细胞扩增的环境。由于其固有的生物活性和与胞外基质的结构相似性，因此用于这些目的的最广泛使用的材料之一是MatrigelTM。然而，这样的动物来源的支架的使用受到批次间的不一致性和异种杂质的存在以及对持续难以捉摸和变化的详细组分缺乏了解的限制。
Matrigel的主要组成包括四种关键的基底膜ECM蛋白：层黏连蛋白(约60％)、IV型胶原(约30％)、巢蛋白(约8％)和硫酸肝素蛋白聚糖perlecan(约2至3％)。除这些之外，其还包含来源于肿瘤的蛋白质，包括生长因子(例如转化生长因子(transforming growthfactor，TGF)家族肽和成纤维细胞生长因子)，以及酶(例如基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMP))。通过多种蛋白质组学研究发现了超过14,000种肽和约2,000种蛋白质序列，所有这些肽和序列均以不同的水平存在，或者在一些情况下，其在不同批次的Matrigel中均未被检测到。更具挑战性的是，Matrigel不容易用物理或生化处理进行操作，这在技术上要求调整基质以指导预期的细胞行为并获得期望的生物学结局。异种污染物(包括多种具有生物活性的组分)的存在导致了复杂性并且在Matrigel上培养时需要谨慎解释细胞活性。此外，还存在包含病毒污染物特别是乳酸脱氢酶升高病毒(lactatedehydrogenase-elevating virus，LDHV)的Matrigel的报道。LDHV是小鼠体内天然存在的病毒，并且当Matrigel用于动物模型实验时，其可影响免疫系统和肿瘤行为。尽管使用Matrigel有缺点，但其仍可广泛用于体外和体内细胞培养，这主要是由于其的可获得性、使用的简单性和对不同细胞类型的适应性。重要的是，这也可能是由于缺乏与作为用于细胞培养的3D支架的Matrigel的性能相等或比其更好的合成替代品。然而，最近已经存在关于经合成制备的并且可为细胞生长提供更具化学限定以及不含动物组分的基质的材料的报道。此外，合成基质更有可能在批次之间保持一致，并且它们具有化学修饰的可能性以更好地适应不同的细胞类型和应用。
已用作细胞培养支架的合成材料可根据两种主要类型进行分类：基于聚合物的和基于肽的。用于创建3D支架的聚合物包括聚(乙二醇)、聚己内酯(polycaprolactone，PCL)、聚L-丙交酯(poly(L-lactide)，PLLA)、聚(丙交酯-co-乙交酯)(poly(lactide-co-glycolide)，PLGA)和聚(N-异丙基丙烯酰胺)聚NIPAM。尽管上述合成聚合物是生物相容的、稳定的且无毒的，但它们在生物活性方面存在固有缺陷并且不能为基质内的细胞增殖提供有益的环境。为了抵消这一点并促进合成支架的生物识别，已经通过并入细胞黏附蛋白(例如，胶原和纤维蛋白原)或肽(例如Arg-Gly-Asp(RGD))对这样的聚合物进行修饰。然而，这样的聚合物-肽缀合物水凝胶内的细胞生长受到限制。报道了由肽制备的水凝胶。两亲肽例如n-AEAEAKAKAEAEAKAK-c(SEQ ID NO：1，EAK16)可自组装成水凝胶。
发明内容
在第一方面中，提供了包含肽和明胶的水凝胶，所述肽包含具有至少8个氨基酸的序列，所述序列具有交替的疏水性氨基酸(X)和亲水性氨基酸(Y)，其中每个疏水性氨基酸独立地选自异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)，每个亲水性氨基酸独立地选自精氨酸(R)、赖氨酸(K)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)，其中亲水性氨基酸被选择成使得存在至少一个精氨酸和至少一个赖氨酸。
优选地，亲水性氨基酸被选择成使得存在至少两个选自谷氨酸和天冬氨酸的亲水性氨基酸。
优选地，所述肽包含8或12个氨基酸。
在一个实施方案中，所述序列中依次四个亲水性氨基酸(Y1、Y2、Y3和Y4)被选择成使得Y1和Y2各自独立地选自谷氨酸和天冬氨酸，并且Y3和Y4各自独立地选自精氨酸和赖氨酸。在一个实施方案中，Y1和Y2是谷氨酸，Y3是精氨酸，以及Y4是赖氨酸。
在一个实施方案中，所述序列中依次六个亲水性氨基酸(Y5、Y6、Y1、Y2、Y3和Y4)被选择成使得Y1和Y2各自独立地选自谷氨酸和天冬氨酸，以及Y5、Y6、Y3和Y＝各自独立地选自精氨酸和赖氨酸。在一个实施方案中，Y1和Y2是谷氨酸，Y5和Y3是精氨酸，以及Y6和Y4是赖氨酸。
在一个实施方案中，所述序列包含选自以下的SEQ ID：SEQ ID No:2、SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5、SEQ ID No:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16。优选地，所述序列基本上由SEQ ID NO组成，更优选所述序列由SEQ ID NO组成。
优选地，所述肽以所述水凝胶的0.1重量百分比至2重量百分比存在。优选地，所述肽以所述水凝胶的0.2重量百分比至1重量百分比存在，更优选地，所述肽以所述水凝胶的0.2重量百分比至0.4重量百分比存在。
优选地，明胶以所述水凝胶的1重量百分比至10重量百分比存在。更优选地，明胶以所述水凝胶的1重量百分比至6重量百分比存在，甚至更优选地所述明胶以所述水凝胶的2重量百分比至3重量百分比存在。
在第二方面中，提供了制备水凝胶的方法，所述方法包括在合适的条件下混合肽与明胶以形成水凝胶，所述肽包含具有至少8个氨基酸的序列，所述序列具有交替的疏水性氨基酸和亲水性氨基酸，其中每个疏水性氨基酸独立地选自异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)，每个亲水性氨基酸独立地选自精氨酸(R)、赖氨酸(K)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)，其中所述亲水性氨基酸被选择成使得存在至少一个精氨酸和至少一个赖氨酸。
优选地，所述合适的条件包括至少一种下列条件：(a)盐；和(b)20℃至40℃的温度。
在第三方面中，提供了用于制备水凝胶的试剂盒，所述试剂盒包含肽和明胶，所述肽包含具有至少8个氨基酸的序列，所述序列具有交替的疏水性氨基酸和亲水性氨基酸，其中每个疏水性氨基酸独立地选自异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)，每个亲水性氨基酸独立地选自精氨酸(R)、赖氨酸(K)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)，其中所述亲水性氨基酸被选择成使得存在至少一个精氨酸和至少一个赖氨酸。
在第四方面中，提供了培养细胞的方法，所述方法包括提供根据上述第一方面的水凝胶；以及在合适的条件下孵育细胞与水凝胶以培养细胞。
在一个实施方案中，所述细胞是肿瘤细胞，优选肿瘤球状体。
在一个实施方案中，所述细胞是干细胞。
在第五方面中，提供了确定一种或更多种化合物对多种细胞的作用的方法，所述方法包括根据权利要求16至17中任一项所述培养多种细胞；向多种细胞添加一种或更多种化合物；以及确定一种或更多种化合物对多种细胞的作用。
有利地，本文中所述的水凝胶可替代用于细胞培养应用的动物来源的基底膜产品，在细胞增殖、球状体特征、生物相容性和体内肿瘤生长方面具有与目前可用产品相当的性能。当水凝胶用作用于肿瘤球状体体外3D培养的支架时，其提供了相似的癌细胞生长和生存力，所述水凝胶具有与目前可用产品相似的低氧、增殖和凋亡特征。本文中所述的杂化水凝胶可用于3D细胞培养、干细胞培养、体外肿瘤球状体产生和体内实体瘤发育。
有利地，水凝胶的化学组成是简单的并且明确限定的，不具有异种组分，并且低的生产成本赋予了与目前可用的基底膜产品相比的许多技术优势。
附图说明
图1示出了肽两亲物IVK8的圆二色(circular dichroism，CD)谱。测量在室温(23至24℃)下，以1.0mg/mL在水或PBS(pH 7.4)中进行。
图2A示出了IVK8/明胶I_0.25％/G_3％杂化水凝胶的黏度随剪切速率的变化。图2B示出了IVK8/明胶I_0.25％/G_3％杂化水凝胶的动态阶跃应变幅度测试。
图3示出了在37℃下，水凝胶在含0.01wt％胶原酶的PBS缓冲液中的体外降解谱。
图4示出了在IVK8/明胶杂化水凝胶中培养的HepG2肿瘤球状体的结果。图A、B和C分别示出了在7天时间段内HepG2肿瘤球状体的尺寸测量值(图A)，由490nm处吸光度所表示的HepG2肿瘤球状体的细胞生存力(图B)，以及第7天在IVK8/明胶杂化水凝胶中培养的HepG2肿瘤球状体的显微术图像(图C))。在图A中，针对每天的肿瘤球状体的尺寸在条形图中按照以下顺序从左至右示出：Geltrex、I_1.0％、I_0.5％、I_0.67％/G_2％、I_0.5％/G_3％、I_0.33％/G_2％和I_0.25％/G_3％。比例尺表示200μm。
图5示出了在IVK8/明胶杂化水凝胶中培养的SW480肿瘤球状体的结果。图A、B和C分别示出了在7天时间段内SW480肿瘤球状体的尺寸测量值(图A)，由490nm处吸光度所表示的细胞生存力(图B)，以及在第7天在IVK8/明胶杂化水凝胶中培养的SW480肿瘤球状体的显微术图像(图C)。在图A中，在条形图中针对每天的肿瘤球状体的尺寸按照以下顺序从左至右示出：Geltrex、I_0.33％/G_2％、I_0.25％/G_3％、I_0.33％和I_0.25％。比例尺表示200μm。
图6A示出了在多种水凝胶样品中培养7天的SW480球状体的活/死染色。有生存力的细胞的区域显示为绿色，而无生存力的细胞的区域显示为红色。比例尺表示200μm。图6B示出了在多种水凝胶样品中培养7天的SW480球状体的缺氧检测。Image It缺氧试剂在不缺氧条件下是非荧光的，而在缺氧条件下发出红色荧光。当检测到低氧水平时，球状体的核心显示为红色，而周界不缺氧并且不发出红色荧光。用发出蓝色荧光的NucBlue LiveReadyProbes试剂(Hoechst 33342)对细胞进行复染。比例尺表示200μm。图6C示出了在第7天在IVK8/明胶杂化水凝胶中培养并随后用多柔比星(Doxorubicin)处理24小时的SW480肿瘤球状体的尺寸测量值。对于对照和水凝胶中的每一种，将结果按照以下顺序从左至右示出：t＝0小时(在添加Dox之前；以及在24小时之后，在不添加Dox、添加0.8μM Dox、添加4μMDox、添加20μM Dox和添加100μM Dox的情况下)。图6D示出了在多种水凝胶样品中培养7天的SW480球状体的免疫组织化学染色(Ki67和经切割的胱天蛋白酶3)和H&E染色。比例尺表示100μm。
图7A和7B分别示出了在施用肿瘤细胞之后18天时SW480肿瘤的体积和重量测量值。图7C示出了在balb/c裸鼠中形成的实体瘤的图像。实体瘤在I_0.25％/G_3％中的生长与在Geltrex中相似(P>0.05)。IVK8肽I_0.33％水凝胶不导致肿瘤形成。
图8A和8B分别示出了在施用肿瘤细胞之后14天时SW480肿瘤的体积和重量测量值。图8C示出了在balb/c裸鼠中形成的实体瘤的图像。实体瘤在I_0.25％/G_3％和I_0.25％/G_6％中的生长与在Geltrex中相似(P>0.05)。图8D示出了在施用负载细胞的水凝胶之后第0天(在注射之后<1分钟)和第14天时的小鼠的体重。图8E示出了SW480肿瘤周围的皮肤切片的H&E染色。比例尺表示200μm。
图9示出了在多种水凝胶样品中培养7天的HepG2球状体的活/死染色。有生存力的细胞的区域显示为绿色，而无生存力的细胞的区域显示为红色。比例尺表示200μm。
图10A至10E示出了不同组成的水凝胶，而图10F示出了没有样品的管。
图11A至11E示出了显示出多种水凝胶之透明性和清澈性的光显微术图像。
图12A和12B示出了使用另一些肽/明胶水凝胶的SW480肿瘤球状体的生长。在图12A中，针对每天的肿瘤球状体的尺寸在条形图中按照以下顺序从左至右示出：Geltrex、IVK8_0.25％/G_3％、IIK8_0.25％/G_3％、ILK8_0.25％/G_3％、IIK12_0.25％/G_3％和IVK12_0.25％/G_3％。
图13A至13F示出了在第7天时在肽/明胶水凝胶的不同制剂的情况下的SW480肿瘤球状体的光显微术图像。
图14A和14B示出了显示为透明且澄清的IVK8_0.25％/PEI(25k)_3％的图像，表明IVK8能够与其他带电荷的大分子例如PEI(25k)形成合适的凝胶。
一些图包含一幅或更多幅图，以及指代图中之图的图号和字母的附图标记。
具体实施方式
在以下描述中，阐述了许多具体细节以提供对本发明多个举例说明性实施方案的全面理解。然而，本领域技术人员将理解，可以在不具有这些特定细节中的一些或全部的情况下实践本发明的实施方案。在一种方法或装置的背景下所描述的实施方案对于其他方法或装置类似地有效。类似地，在方法的背景下所描述的实施方案对装置类似地有效，反之亦然。
在一个实施方案的背景下所描述的特征可相应地适用于其他实施方案中相同或相似的特征。在一个实施方案的背景下所描述的特征可相应地适用于其他实施方案，即使在这些其他实施方案中没有明确描述。此外，在一个实施例的背景下对特征所描述的添加和/或组合和/或替代可相应地适用于其他实施方案中的相同或相似特征。
用于本说明书和权利要求书的目的的本文中所用的术语“药剂”和“药物”意指被怀疑具有治疗特性的化合物、化合物的混合物、生物大分子或者由生物材料例如细菌、植物、真菌或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织制成的提取物。药剂或药物可以是纯化的、基本上纯化的或部分纯化的。
术语“生理学上可接受”限定了不消除化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。本文中所述的药物组合物可以以其本身或在药物组合物中施用于人患者，在药物组合物中它们与另外的活性成分(如在组合治疗中)或者合适的载体或赋形剂混合。用于本申请化合物的制备和施用的技术可见于“Remington’s Pharmaceutical Sciences,”MackPublishing Co.,Easton,PA,第18版,1990。术语“生理条件”是指通常在生物体和细胞中存在的条件，并且通常是指其中温度范围为20至40℃、1个大气压、pH为6至8、葡萄糖浓度为1至20mM且具有大气氧浓度的条件。
本文中可互换使用的术语“多肽”和“蛋白质”是指氨基酸的聚合物，其中不考虑聚合物的长度；因此，肽、寡肽和蛋白质被包括在多肽的定义内。该术语也不指定或排除对本发明多肽的化学修饰或表达后修饰，但作为一些具体实施方案可包括或排除对这些多肽的化学修饰或表达后修饰。因此，例如，术语多肽明确地涵盖了针对多肽的修饰，包括糖基基团、乙酰基基团、磷酸基团、脂质基团等的共价连接。此外，具有这些修饰的多肽可以被指定作为包括在本发明中或排除在本发明之外的个体物质。天然或其他化学修饰，例如以上实例中所列出的那些化学修饰可发生在多肽中的任何地方，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基端或羧基端。应当理解，相同类型的修饰可以以相同或不同的程度存在于给定多肽中的数个位点处。此外，给定的多肽可包含许多类型的修饰。多肽可以是支化的，例如由于泛素化，并且它们可以是环状的，具有或不具有分支。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇(phosphotidylinositol)的共价连接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚定形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒酰化(selenoylation)、硫酸盐化、转运RNA介导的将氨基酸向蛋白质的添加例如精氨酰化(arginylation)和泛素化。[参见，例如Creighton,(1993),Posttranslational Covalent Modification of Proteins,W.H.Freeman andCompany,New York B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York 1-12；Seifter,et al.,(1990)Meth Enzymol 182:626-646；Rattan et al.,(1992)Ann NY AcadSci 663:48-62]。定义中还包括含有一种或多种氨基酸类似物(包括，例如，非天然存在的氨基酸、仅在无关生物系统中天然存在的氨基酸、来自哺乳动物系统的经修饰氨基酸等)的多肽、具有经取代键联的多肽、以及本领域中已知的天然存在的和非天然存在的其他修饰。本文中以其全名以及本领域中已知的常规的1个字母和3个字母的缩写来描述多种氨基酸。
明胶(gelatin或gelatine)是由胶原的水解而获得的肽的混合物，该胶原通常来自动物(牛、鸡、猪和鱼)的皮肤骨和结缔组织。本文中所用的明胶可来自任何合适的来源。
描述了对于肽/明胶杂化水凝胶作为基底膜基质(例如MatrigelTM(BD，U.S.A.)和GeltrexTM(Thermofisher，U.S.A.))之替代物的开发。尽管通常用于多种细胞培养应用，但仍然存在与其使用相关的问题，包括存在异种污染物、其组成复杂以及批次不一致。这些问题可以用本文中所述的肽/明胶杂化水凝胶来容易地克服，因为其组成简单且其组成可被精确控制。该材料中不存在动物组分，这提供了与基底膜基质相比的另外的优势以及对实验结局的最小干扰。另外，该水凝胶中仅存在两种组分：1)短的8或12个氨基酸的自组装肽和2)明胶，并且这将使得材料能够以低生产成本制造。当肽/明胶杂化水凝胶用作用于肿瘤球状体体外3D培养的支架时，它们提供了相似的癌症细胞生长和生存力。肿瘤球状体的缺氧、增殖和凋亡特征在肽/明胶杂化水凝胶与Geltrex之间也是相似的。此外，还评价了用肽/明胶杂化水凝胶作为支持基质的实体瘤的体内扩增，并且在小鼠模型中，在肽/明胶杂化水凝胶与Geltrex之间肿瘤生长相似。重要的是，肽/明胶杂化水凝胶显示出了优异的体内生物相容性，并且在动物的体重和健康方面与用Geltrex处理的动物相比没有可观察到的差异。
描述了开发基于水凝胶的材料的可行性，该材料能够为体外3D肿瘤球状体培养物和体内肿瘤移植物二者提供可支持和促进细胞扩增的环境，还描述了对于使用明胶和自组装肽IEVEIRVK(IVK8，SEQ ID NO：2)所制备的支架的开发。这些肽的关键特征包括疏水性和亲水性氨基酸(其涵盖精氨酸(R)和赖氨酸(K)二者)的规则交替，其中电荷以模式(--++)来布置。该布置使得肽能够自组装成具有可调机械强度和可持续稳定性的基质，以用于多种生物医学应用。精氨酸和赖氨酸在生理条件下或在25℃下pH为7至7.4时带正电荷，而谷氨酸和天冬氨酸带负电荷。选择异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)作为疏水性残基，因为它们具有强的β片(β-sheet)折叠倾向。为了使电荷排斥最小化，将肽在C端处进行酰胺化。由于N端具有疏水性残基，因此对N端进行乙酰化并不必要，但也可以通过已知方法进行。如果N端具有亲水性残基，则可通过已知方法(例如乙酰化)将其官能化以使电荷排斥最小化。
在IVK8中，选择R是由于其高凝胶化倾向，而将K与R组合使用是由于其相对较低的细胞毒性。在水中，IVK8以随机卷曲构型存在并且在高浓度下形成肽水凝胶(保水性约99％)。在存在盐的情况下或在生理条件下，肽自组装成β片构型并形成具有更高机械强度的水凝胶。值得注意的是，对于IVK8观察到了快速凝胶化，并且凝胶形成的速率是温度依赖性的。例如，在2％wt/vol.(重量/体积)的浓度下，IVK8在室温(23至24℃)下60分钟(min)内形成水凝胶，并且在37℃下凝胶化可加速至小于30分钟。
由于IVK8中不存在细胞黏附部分，所以肽水凝胶不太可能足以作为用于细胞增殖的3D支架。因此，将明胶(通过受控的水解而从胶原得到的蛋白质)与IVK8一起并入以形成杂化水凝胶，以促进细胞黏附和生长。明胶可通过化学交联形成水凝胶。鉴于明胶中存在的多种组分，因此化学修饰的可重复性可能具有挑战性。通过开发具有自组装肽IVK8和明胶的互穿网络的3D支架，避免了任何添加的试剂和交联剂的使用。水凝胶通过以下形成：将两种组分即IVK8和明胶进行简单的物理混合，并将其在37℃下静置15分钟。该过程兼具了节省时间和节省成本二者，而且水凝胶的组成明确且一致。在体外和体内二者中对于水凝胶在支持细胞生长和建立肿瘤模型中的能力进行了研究。通过将肿瘤球状体包封在水凝胶中来进行3D细胞培养，并且细胞生存力测定和尺寸测量结果显示，肿瘤球状体中的细胞能够随时间增殖。重要的是，IVK8/明胶水凝胶中的肿瘤球状体和体内肿瘤的生长等同于市售的基底膜产品Geltrex(Thermofisher，U.S.A.)。小分子模型药物多柔比星的渗透性在IVK8/明胶杂化水凝胶与Geltrex之间也是相似的。鉴于IVK8/明胶水凝胶的低生产成本和明确的组成，该水凝胶作为商业细胞培养基质(例如Matrigel和Geltrex)的有前途的替代物而脱颖而出。还可使用其他自组装肽代替IVK8，所述其他自组装肽例如
IEIEIRIK(IIK8，SEQ ID NO：3)，IELEIRLK(ILK8，SEQ ID NO：4)，IRVKIEVEIRVK(IVK12，SEQ ID NO：5)，IRIKIEIEIRIK(IIK12，SEQ ID NO：6)，IRVEIRVEIRVE(IRV12，SEQ IDNO：7)，IEVEIEVKIRVK(IEV12，SEQ ID NO：8)和具有相反序列的肽。可使用的肽的序列在表2中示出。通过这些肽进行的水凝胶的形成先前已经在WO2021015675中报道，其通过引用以其整体并入本文。
方法
材料
肽IVK8、IIK8、ILK8、IVK12和IIK12由GL Biochem(Shanghai，China)合成，其中使用分析型反相高效液相色谱(reverse phase high-performance liquidchromatography，RP-HPLC)测定纯度≥95％。明胶购自Sigma Aldrich(U.S.A.)，以及CellTiter水性单溶液细胞增殖测定(MTS)购自Promega，并根据制造商的说明使用。人肝细胞癌HepG2和人结直肠腺癌SW480细胞系购自ATCC U.S.A.，以及抗癌药物多柔比星(DOX)购自MedChemExpress U.S.A.。
水凝胶的制备
IVK8在肽浓度为1.0％重量/体积的300mM蔗糖无菌溶液中溶解，并在4℃下储存，直至需要时为止。肽在寒冷条件下(4℃或冰浴)保持溶液状态。在60℃下，以60mg/mL使用无菌DI水将明胶溶解。为了形成水凝胶，从温水浴中除去明胶，并将冷的IVK8溶液添加至明胶。然后将DMEM以3：7的DMEM：混合物的体积比添加至该混合物，并在37℃下静置10分钟以发生凝胶化。制备IVK8水凝胶的步骤是相同的。一旦形成，凝胶在25至37℃的温度下保持稳定。类似地，其他肽/明胶水凝胶可以通过与针对IVK8所述的相同的方法制备，一般程序的进一步细节和修改可以见于WO2021015675。例如，可以使用IIK8、ILK8、IVK12和IIK12代替IVK8来制备肽/明胶水凝胶。从图10A至图10可以观察到，较短的肽产生更清晰的水凝胶。IVK8_0.25％/明胶_3％(图10A)和IIK8_0.25％/明胶_3％(图10B)是最清晰和最透明的，其次是ILK8_0.25％/明胶_3％(图10C)。IVK12_0.25％/明胶_3％(图10D)是所示的五种水凝胶中最不透明和不清晰的。IVK8_0.25％/明胶_3％(图11A)和ILK8_0.25％/明胶_3％(图11C)示出了水凝胶的最大透明度和清晰度。在IIK8_0.25％/明胶_3％(图11B)中观察到一些微簇/聚集体。IVK12_0.25％/明胶_3％(图11D)和IIK12_0.25％/明胶_3％(图11E)的高不透明度可能由于难以观察球体而使其不太适合肿瘤球体的3D培养。
图14A和14B示出了IVK8_0.25％/PEI(25k)_3％的图像，其显示出透明且清晰，表明IVK8能够与另一些带电荷大分子如聚乙烯亚胺(PEI，分子量25k)形成合适的凝胶。PEI在7.4的pH下是部分带电荷的。IVK8_0.25％/PEI(25k)_3％水凝胶的G’(储能模量)和G”(损耗模量)值在图14C中示出。
本文中的溶质(例如肽和盐)的浓度可以按重量计的体积百分比提供(并且在本文中可以缩写为(％w/v)、(w/v％)或(％)，并且等同于溶解在100mL溶剂中的溶质的质量(以克计)。或者，重量％(或重量.％)可用于意指与溶剂为水并且假定密度为1g/cm3相同的含义。
水凝胶的流变学研究
使用小瓶倾斜法确定水凝胶的凝胶化时间。当样品在5秒内没有表现出流动时，其将被认为是完全形成的水凝胶。如前所述，流变学实验在控制应变流变仪(ARES G2，TA仪器)上进行。简言之，平行板测量的几何形状(直径8mm，间隙1mm)具有1％的振荡应变，以及动态储能模量(G’)和损耗模量(G”)按照频率(1至100rad/秒)的函数进行了检测。另外，还进行了流动扫描以研究水凝胶样品的黏度变化与剪切速率的函数。
水凝胶的酶降解
首先制备水凝胶样品(400μL)，并将其转移至4mL玻璃小瓶中。在此之后，添加2mL含有IV型胶原酶(Gibco，U.S.A.)(0.01重量％)在37℃下孵育的PBS。以固定间隔从水凝胶中除去含有酶的PBS介质，并确定已降解的水凝胶(Wd)的重量。在称重之后，将新鲜的含有酶的PBS介质添加至样品。使用以下等式计算小瓶中剩余的水凝胶的相对量：
剩余的水凝胶的相对量＝Wd/Wi，其中Wd和Wi分别是已降解的水凝胶和原始的水凝胶的重量。
水凝胶中肿瘤球体的体外培养
将人肝细胞癌HepG2和人结直肠腺癌SW480在补充有10％胎牛血清和1％青霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，DMEM)中培养，在37℃、5％ CO2下孵育。为了制备肿瘤球体，将200μL的细胞悬液(3500个细胞/mL)/孔接种至96孔超低黏附圆底板(Corning，U.S.A.)上。在此之后，将板以1500rpm离心5分钟)，并在37℃下孵育2至3天，用于细胞组装成肿瘤球体。然后根据第2.2节中的步骤制备IVK8/明胶水凝胶，并在将肽和明胶混合在一起之后立即使用。使用基底膜产品GeltrexTM(Thermofisher，U.S.A.)建立阳性对照组。在实验期间，将Geltrex保存在冰浴中。通过首先除去150μL的消耗的培养基将水凝胶转移至肿瘤球体。随后，每个孔添加70μL的水凝胶和样品，在37℃下孵育30分钟，然后向每个孔添加100μL。通过除去80μL培养基并添加80μL新鲜培养基，每2至3天一次更换消耗的培养基。使用DMil倒置光学显微镜(Leica，U.S.A.)随时间监测肿瘤球体的生长。
细胞生存力测定
通过CellTiter 96AQueous One Solution细胞增殖测定(MTS)(Promega，U.S.A.)来确定在水凝胶中培养7天的肿瘤球体的生存力。简言之，从含有肿瘤球体的每个孔中除去80μL的消耗的培养基。接下来，然后将以1:1体积比含有DMEM:MTS的80μL添加回孔中。然后将板在37℃下孵育4.5小时。在此之后，将培养基移液数次以使可能存在的任何聚集体破碎，并将100μL的该溶液转移到新鲜的96孔板中。使用微板读取仪(Tecan，Switzerland)在波长490nm处测量样品的吸光度。
活细胞和死细胞在肿瘤球体中的分布
对在水凝胶中培养7天的球体中活细胞和死细胞的分布进行分析。在成像当天，除去100μL的消耗的培养基，并将来自活/死细胞成像试剂盒(488/570)(Thermofisher，U.S.A.)的125μL的活/死染色添加至样品中。接下来，将样品在37℃下孵育4小时，通过除去80μl培养基并添加80μl新鲜PBS用PBS洗涤5次。然后使用IX81 HCS显微镜(Olympus，Japan)对球体进行成像。
肿瘤球体缺氧检测
使用Image-It缺氧红试剂(Thermofisher，U.S.A.)在水凝胶中培养7天的球体中检测缺氧。简言之，首先制备含有Image-It缺氧试剂(10μM)和NucBlue活细胞染色剂(4滴/毫升DMEM)(Thermofisher，U.S.A.)的DMEM。在此之后，从样品中除去80μL的消耗的培养基，并添加已制备的染色溶液。接下来，将样品在37℃下孵育3小时，通过除去80μl培养基并重复添加80μl新鲜PBS洗涤样品4次。然后使用IX81 HCS显微镜(Olympus，Japan)对球体进行成像。
通过免疫组织化学分析肿瘤球体中增殖和凋亡细胞的分布
对在水凝胶中培养7天的球体中增殖和凋亡细胞的分布进行分析。首先，通过除去80μL培养基并重复添加80μL新鲜PBS洗涤样品3次。在最后一次洗涤时，不添加新鲜的PBS，而是再除去50μL的PBS。接下来，将10％中性缓冲福尔马林(neutral buffered formalin，NBF)(200μL)添加至样品中，并随后在室温下孵育4小时。在此过程中，将琼脂糖溶解在95℃的蒸馏水中，并在65℃下保温。此后，通过将球体从每个孔转移到包埋模具来进行琼脂糖包埋。然后将250μL的琼脂糖溶液添加至模具中，并在4℃下孵育30分钟。然后将琼脂糖块转移到组织处理盒，并保存在10％NBF中，随后进行石蜡包埋程序。使用抗Ki-67兔多克隆抗体(Abcam.U.S.A.)和抗裂解的兔胱天蛋白酶-3多克隆抗体(Abcam.U.S.A.)检测细胞的增殖和凋亡状态。对于组织学检验，将样品在4％中性缓冲福尔马林中固定，并随后用苏木精-伊红(H&E)使用标准技术染色。使用Axio Imager显微镜(Carl Zeiss，Germany)对切片进行成像。
使用模型抗癌药物多柔比星治疗肿瘤球体
为了研究常用的抗癌治疗剂在3D肿瘤球体中的作用，使用了癌症治疗常用的模型药物多柔比星(DOX)。
球体尺寸变化和细胞生存力：首先将多柔比星溶解在无菌蒸馏水中，以形成1mg/mL的储备溶液。然后使用DMEM培养基将该溶液稀释至DOX浓度为0.8、4、20、100μM。接下来，从在水凝胶中培养7天的肿瘤球体中除去80μL消耗的培养基，并添加80μL含有DOX的DMEM。然后将样品在37℃下孵育24小时。使用DMil倒置光学显微镜(Leica，U.S.A.)监测肿瘤球体的尺寸差异，并如第2.5节中所述进行细胞生存力测定。
使用IVK8/明胶杂化水凝胶作为支持基质的体内肿瘤生长
所有动物实验均根据新加坡生物资源中心机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)批准的方案进行。使用23G注射器针头向体重18至22g的雌性balb/c裸鼠皮下注射200μL的含有1.0×107个SW480细胞的IVK8/明胶水凝胶(在DMEM:IVK8/明胶水凝胶中的细胞的体积比为3:7)或Geltrex(在DMEM:Geltrex中的细胞体积比为1:1)(Thermofisher，U.S.A.)的细胞悬液。进行了两项研究。在第一项研究中，在每组4只小鼠上对三组凝胶制剂：1)Geltrex，2)I_0.25％/G_3％和3)I_0.33％进行了测试。在第二项研究中，在每组5只小鼠上对1)Geltrex，2)I_0.25％/G_3％和3)I_0.25％/G_6％进行了测试。使用卡尺以两个正交直径测量肿瘤尺寸，并将体积计算为L×W2/2，其中L和W分别为大直径和小直径。使用双尾Student T检验对数据进行分析，以在统计学上评价肿瘤体积的差异。统计学显著值定义为P≤0.05。另外，将来自第二项研究的小鼠处死，并且切除肿瘤周围区域的皮肤组织并进行组织学切片。使用H&E对样品进行染色，并使用Axio Imager显微镜(Carl Zeiss，Germany)成像。
统计学分析
所有测量值均表示为平均值±标准偏差。使用双尾Student T检验评价不同组之间的比较。统计学显著值定义为P≤0.05。
结果和讨论
肽设计和表征
本文中描述了使用明胶和新的自组装肽IEVEIRVK(IVK8，SEQ ID NO:2)制备的支架的开发。IVK8由8个天然氨基酸残基组成，其具有带电荷的亲水性(异亮氨酸(I)和缬氨酸(V))和疏水性(精氨酸(R)和赖氨酸(K))氨基酸的周期性重复。选择异亮氨酸(I)和缬氨酸(V)作为疏水性残基是因为它们具有较强的β折叠(β-sheet)折叠倾向，而选择精氨酸(R)是因为其具有更快和更强的凝胶化行为，而K与R组合使用是因为其相对较低的细胞毒性。如图1中所示，IVK8在水中的CD光谱在198nm处示出最小值，表明其为随机卷曲确认(confirmation)。这可能归因于质子化的R与K残基之间的分子间静电排斥。然而，在盐(例如PBS)存在的情况下，IVK8折叠并自组装成β折叠构象，其特征在于在约197nm处的最大吸收和在约219nm处的强负椭圆度。缓冲液中盐的存在通过屏蔽和中和电荷来触发肽的自组装，并使亲水性残基E、R和K位于同一侧，与带正电荷和负电荷的离子基团产生互补的离子相互作用。
IVK8/明胶杂化水凝胶的流变特性
对具有不同浓度肽和明胶的IVK8/明胶杂化水凝胶在37℃下的机械强度和凝胶化时间进行了评价(表1)。对于仅用IVK8制备的水凝胶来说，凝胶强度对应于I_0.25％(G’＝210Pa)、I_0.33％(G’＝382Pa)和I_1.0％(G’＝423Pa)的肽浓度。类似地，对于IVK8/明胶杂化水凝胶来说，在相同明胶浓度下肽浓度的提高导致更高的凝胶强度，例如：I_0.33％/G_2％(G’＝226Pa，凝胶时间10分钟)与I_0.67％/G_2％(G’＝562Pa，凝胶化时间5分钟)。这可能是由于更多的肽分子在更高浓度下参与物理交联。相比之下，Geltrex在G’＝40pa时显示出最低的机械强度。ILK8_0.25％/G_3％与相应的IVK8水凝胶具有相似的凝胶强度。使用其他肽制备的水凝胶具有较低的凝胶强度，这可以通过提高用于形成水凝胶的肽的浓度来提高。表2示出了本文中所用肽的氨基酸序列。
表1.由IVK8和明胶在1Hz的频率、1％应变下自组装的肽-明胶杂化水凝胶的G’(储能模量)和G”(损耗模量)值。
较高的tan(δ)值表明水凝胶具有较低的机械强度。
名称 SEQ ID NO： 肽序列
IVK8 2 IEVEIRVK
IIK8 3 IEIEIRIK
ILK8 4 1ELEIRLK
IVK12 5 IRVKIEVEIRVK
IIK12 6 IRIKIEIEIRIK
IRV12 7 IRVEIRVEIRVE
IEV12 8 IEVEIEVKIRVK
Reverse IVK8 9 KVRIEVEI
Reverse IIK8 10 KIRIEIEI
Reverse ILK8 11 KLRIELEI
Reverse IVK12 12 KVRIEVEIKVRI
Reverse IIK12 13 KIRIEIEIKIRI
Reverse IRV 12 14 EVRIEVRIEVRI
Reverse IEV12 15 KVRIKVEIEVEI
SEQ ID No.2至8的肽在C端被酰胺化。SEQ ID No.9至15的肽在C端被酰胺化，在N端被N-乙酰化。
剪切稀化特性对于IVK8/明胶杂化水凝胶至关重要，使其能够作为可注射基质以支持体内细胞生长。图2A示出了I_0.25％/G_3％的黏度随着剪切速率的提高而显著降低，从而证明了杂化水凝胶的剪切稀化行为。具有较大剪切速率的黏度的下降是由于在施加剪切应力之后肽与明胶分子之间的物理交联被破坏。在递送至注射部位之后，已破坏的水凝胶恢复其机械性能至关重要。使用动态阶跃应变幅度测试模拟已破坏水凝胶的恢复。将杂化水凝胶与DMEM以7：3的体积比混合以模拟细胞悬液的并入。如图2B中所示，当在25℃下施加2％的低应变时，I_0.25％/G_3％的水凝胶具有约80Pa的初始G’。然而，当受到高应变(100％)时，G’值快速降低至40分至一至约2Pa，而G’/G”提高至＞1，表明水凝胶的液体样行为占主导地位。在持续受到高应变3分钟之后，将应变降低至2％，并将温度提高至37℃，以模拟注射之后的体内条件。值得注意的是，储能模量G’立即恢复，从而显示出流变行为的可逆性。快速恢复动力学可归因于在除去高应变条件之后肽和明胶网络内快速形成物理交联(例如氢键、静电相互作用和疏水相互作用)。
IVK8/明胶杂化水凝胶的酶促降解
在IV型胶原酶(明胶酶)存在的情况下研究了水凝胶的酶促降解。这种酶能够切割明胶中的肽键，并且作为免疫防御系统控制的一部分在体内普遍存在。观察到与Geltrex相比，IVK8/明胶杂化水凝胶的降解快得多。如图3中所示，与I_0.33％_G2％水凝胶相比，I_0.25％/G_3％水凝胶显示出更快的降解，从而表明更高的明胶含量导致杂化水凝胶更快的蛋白水解降解。在前24小时内，I_0.25％/G_3％水凝胶损失了其重量的35％，而I_0.33％_G2％水凝胶损失了其重量的20％。IVK8水凝胶I_0.33％的降解低于IVK8/明胶杂化水凝胶，其中在前24小时仅损失了其重量的7％。在整个4天的孵育中，约3％的Geltrex几乎没有降解。
IVK8/明胶杂化水凝胶中肿瘤球体的体外培养
使用HepG2和SW480肿瘤球状体培养物检查了使用IVK8/明胶杂化水凝胶作为3D支架的潜力。从图4中可以看出，在I_0.5％/G_3％水凝胶、I_0.25％/G_3％水凝胶和I_0.33％/G_2％水凝胶中培养7天的HepG2肿瘤球状体与在Geltrex中培养的HepG2肿瘤球状体相比具有相似的尺寸(P>0.05)。然而，与在Geltrex中培养的球状体相比，在具有更高IVK8和明胶浓度(I_0.67％/G_2％水凝胶)的杂化水凝胶中培养的球状体显著更小。值得注意的是，IVK8/明胶杂化水凝胶高度适合用于培养肿瘤球状体，因为与Geltrex相比，在所有四种杂化水凝胶制剂中培养的肿瘤球状体的细胞生存力方面没有显著差异(P>0.05)。单独使用IVK8制备的肽水凝胶不适合支持肿瘤球状体的生长，因为与在Geltrex中培养的球状体相比，球状体的尺寸显著更小并且细胞的生存力显著更低。
根据这一评估，就细胞生存力、球状体的生长而言，确定了最适合肿瘤球状体的培养的两种IVK8/明胶杂化水凝胶，并同时考虑到所需物质的量：1)I_0.25％/G_3％和2)I_0.33％/G_2％。
为了评价肿瘤球状体上的杂化水凝胶是否可以扩展到其他癌细胞类型；使用上述两种IVK8/明胶水凝胶来培养结直肠癌细胞SW480。重要的是，在两种杂化水凝胶I_0.25％/G_3％和I_0.33％/G_2％中培养7天的SW480肿瘤球状体与Geltrex培养的SW480肿瘤球状体相比具有相似的尺寸(P>0.05)(图5A至C)。同样，在IVK8水凝胶I_0.33％和I_0.25％中培养的肿瘤球状体的生长与在Geltrex中培养的肿瘤球状体的生长相比显著更慢(P<0.05)。
图13示出了第7天SW480肿瘤球状体的光学显微术图像。可观察到使用IVK8(图13B)和IIK8(图13C)形成的肽/明胶杂化水凝胶是最不透明的。使用ILK8(图13D)和IIK12(图13E)形成的肽/明胶杂化水凝胶比使用IVK8和IIK8形成的肽/明胶水凝胶更不透明。IVK12(图13F)是所有制剂中最不透明的，这可能是由于凝胶成分的沉淀所致。
图12A和12B中显示了使用由不同肽制成的水凝胶的比较。从图12A中，在多种制剂的水凝胶与Geltrex之间没有观察到SW480肿瘤球状体的尺寸中的显著差异。
在IVK8/明胶杂化水凝胶中培养的体外3D肿瘤模型
肿瘤球状体的不同径向区域中在pH、营养物、代谢物和氧含量中的变化导致球状体内细胞生存力中可观察到的差异。对于HepG2和SW480二者，死亡或垂死细胞主要存在于球状体的核心中，而活细胞存在于整个球状体中(图6A和9)。在外围区，活细胞比死亡/垂死细胞多，如由比红色荧光相对更高强度的绿色荧光所示。IVK8/明胶水凝胶和Geltrex的观察结果相似。对于IVK8肽水凝胶I_0.33％，死亡/垂死细胞的区域存在于整个球状体中，而不仅仅是在核心区中。这可能是由于肽水凝胶更高的机械强度，降低了营养物、氧和代谢物穿过水凝胶屏障的转运，从而降低了肿瘤细胞的生存力。
已经报道了随着肿瘤球状体的生长直径超过400μm，它们将形成缺氧核心并激活存活信号传导途径并诱导缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)的表达以维持肿瘤细胞生存力。在体内，HIF蛋白转录地促进血管生成以获得营养物和氧气并调节微环境的pH。使用Image It缺氧试剂检测在多种水凝胶样品中培养7天的SW480球状体的缺氧。该试剂在非缺氧条件下不发出荧光，而在缺氧条件下发出红色荧光。从图6B中，当检测到低氧水平时，球状体的核心呈现红色，而外围是非缺氧的并且不发出红色荧光。将细胞用发出蓝色荧光的NucBlue Live ReadyProbes试剂(Hoechst 33342)复染。缺氧区出现在球状体的核心并且在Geltrex、IVK8/明胶杂化水凝胶以及IVK8肽水凝胶之间没有差异。
为了验证在IVK8/明胶杂化水凝胶中培养肿瘤球状体作为药物测试的体外模型，对典型小分子药物多柔比星(Doxorubicin，Dox)的渗透进行研究。图6C示出了在Geltrex和IVK8/明胶杂化水凝胶中培养的肿瘤球状体的尺寸有减小的趋势。然而，对于IVK8肽水凝胶I_0.33％中培养的肿瘤球状体的尺寸没有可观察到的减小。这可能是由于肽水凝胶中的网络导致的药物渗透阻抗或者与其他水凝胶相比肿瘤球状体的细胞状态差异(即如图6A中所示更多的死亡/垂死细胞)。
为了确定肿瘤球状体内不同细胞活性的区域，对分别作为增殖和凋亡指标的Ki67和切割的胱天蛋白酶3进行了免疫组织化学染色。重要的是，Ki67的大多数检测发生在球状体的外围，而大多数切割的胱天蛋白酶3发现于球状体的核心。Geltrex、IVK8/明胶杂化水凝胶和IVK8肽水凝胶之间的增殖区和凋亡区看起来相似(图6D)。肿瘤球状体的H&E染色显示就不同区域的细胞密度存在巨大差异；其中在外围较高而在核心低得多。对于所有多种凝胶制剂都观察到相似的趋势。
以IVK8/明胶杂化水凝胶作为支持基质的肿瘤体内扩增
使用IVK8/明胶杂化水凝胶和IVK8肽水凝胶对SW480肿瘤的生长进行了测试，并在小鼠模型中与Geltrex进行了比较。图7A至C示出了I_0.25％/G_3％水凝胶与Geltrex之间的肿瘤生长相似，因为肿瘤体积和重量测量二者显示没有显著差异(P>0.05)。使用IVK8肽水凝胶I_0.33％时，肿瘤细胞没有形成实体瘤，并且这证明了将明胶并入杂化水凝胶中对于促进体内环境中细胞生长的重要性。在第二项研究中，IVK8/明胶杂化水凝胶中明胶的浓度从3重量％提高至6重量％，但这没有进一步促进肿瘤生长(图8A至C)。就肿瘤生长而言，I_0.25％/G_3％、I_0.25％/G_6％水凝胶与Geltrex之间也没有显著差异。值得注意的是，水凝胶在动物中没有引起任何体重减轻，这表明IVK8/明胶杂化水凝胶对于体内应用是生物相容性的(图8D)。此外，肿瘤周围皮肤切片的H&E染色显示真皮组织的结构和形态没有可观察到的差异，从而证明IVK8/明胶杂化水凝胶是生物相容性的和非炎性的。
从图12A中，与Geltrex相比，在多种肽-明胶水凝胶制剂之间的肿瘤球状体的尺寸中没有观察到显著差异。从图12B中可观察到使用由采用较短肽IVK8、IIK8和ILK8形成的杂化水凝胶的肿瘤球状体培养物的细胞生存力(在第7天)没有显著差异，但对于使用较长肽IIK12和IVK12培养的那些可观察到显著更低的生存力。
IVK8/明胶杂化水凝胶的物理性质
细胞培养支架的机械特性可对细胞行为的改变提供强烈的影响。这样的应用包括指导干细胞分化和模拟与胞外基质的硬度相关的癌细胞活性。从表1中表明了IVK8/明胶杂化水凝胶的机械强度可以很容易地通过肽和明胶浓度的改变来调节。因此，应用这些物质对研究细胞活性对物质硬度的依赖性是可行的选择。
对IVK8/明胶杂化水凝胶的蛋白水解降解的研究表明更高的明胶含量导致杂化水凝胶更快的蛋白水解降解(图3)。通过细胞间相互作用，肿瘤细胞可引起黏附因子表达水平的变化和/或由于分泌的蛋白水解酶(包括胶原酶)水平的升高。所述酶分解胞外基质并使肿瘤能够改变形状、分离并蜿蜒穿过间质空间，从而导致正常组织结构紊乱。令人感兴趣的是，胶原酶没有引起Geltrex的实质性降解，这可能是由于使用的胶原酶浓度低引起。
肿瘤球状体在IVK8/明胶杂化水凝胶中的生长和表征
肿瘤球状体是癌细胞簇，代表最简单的实体瘤体外模型。这些球状体是基于上皮癌细胞的固有性质制备的，以在细胞之间形成黏附连接并从而在非黏附表面或3D支架上自组装成致密聚集体。就以下而言，肿瘤球状体的性质与体内无血管肿瘤的性质非常相似：近端细胞-细胞相互作用、与胞外基质(extracellular matrix，ECM)的相互作用、3D集群环境中细胞对pH、营养物、氧气和代谢物浓度梯度的反应。这样的3D模型提供了模拟体内肿瘤行为的能力，产生不同的增殖区(外围)以减缓循环、静止和凋亡细胞(内核)，同时避免了动物研究的成本和复杂性。
用于培养HepG2(图4)和SW480(图5)肿瘤球状体的IVK8/明胶杂化水凝胶导致与使用Geltrex培养的那些相似的生长和生存力(P>0.05)。值得注意的是，单独使用IVK8制备的水凝胶肿瘤球状体的生长显著受损，从而说明了将明胶并入基质中对于支持细胞生长的重要性。
为了确认球状体培养物是否表现出在Geltrex中培养的球状体培养物的典型细胞活性，进行了活/死染色、缺氧检测以及Ki67和切割的胱天蛋白酶3的免疫组织化学染色。活/死染色显示，在球状体外围有比死亡/垂死细胞更多的活细胞，而更多的死亡/垂死细胞存在于核心中。IVK8/明胶水凝胶和Geltrex二者的观察结果相似。从图6B中观察到缺氧发生在球状体的核心，并且这在Geltrex、IVK8/明胶杂化水凝胶以及IVK8肽水凝胶之间没有差异。用Dox处理在Geltrex和IVK8/明胶杂化水凝胶中培养的肿瘤球状体在尺寸测量中显示出相似的减小趋势(图6C)，从而表明杂化水凝胶可用作体外药物筛选研究的支架。至于增殖(Ki67)和凋亡(切割的胱天蛋白酶3))标志物的检测，图6D显示Ki67主要在球状体的外围发现，而大多数切割的胱天蛋白酶3在球状体的核心处检测到。Geltrex、IVK8/明胶杂化水凝胶和IVK8肽水凝胶之间的增殖区和凋亡区看起来相似。
以IVK8/明胶杂化水凝胶作为支持基质的肿瘤体内扩增
基底膜产品(例如Matrigel和Geltrex)已被广泛用作动物模型中支持肿瘤细胞生长的基质。为了提供这样的商业基质的合成替代品，测试IVK8/明胶水凝胶的实用性和性能以提供与这些产品在体内应用的比较是很重要的。在进行的两项研究中，IVK8/明胶杂化水凝胶与Geltrex之间的肿瘤生长相似，因为肿瘤体积和重量测量二者显示没有显著差异(P>0.05)。同样重要的是要注意到，对于单独用IVK8制备的水凝胶I_0.33％，肿瘤细胞没有形成实体瘤，并再次表明了将明胶并入杂化水凝胶对于促进细胞生长的重要性，这次是用于体内应用。此外，水凝胶在动物中没有引起任何体重减轻，从而表明IVK8/明胶杂化水凝胶对于体内使用是生物相容性的。
总之，肽和明胶杂化水凝胶已被开发为用于细胞培养应用的动物来源基底膜产品的潜在替代品。与Geltrex相比，该杂化水凝胶在细胞增殖、球状体特征、生物相容性以及体内肿瘤生长方面表现出等同的性能。此外，其物质组成的简单性、不含异种组分以及低生产成本给予了巨大的激励以利用该水凝胶用于体外和体内二者的细胞/组织培养。
当肽/明胶杂化水凝胶用作用于肿瘤球状体体外3D培养的支架时，它们提供了相似的癌细胞生长和生存力。肽/明胶杂化水凝胶与Geltrex之间的肿瘤球状体的缺氧、增殖和凋亡特征也相似。在小鼠模型中，肽/明胶杂化水凝胶与Geltrex之间的实体肿瘤的体内扩增相似。总之，其物质组成的简单性、不含异种组分给予了巨大的激励以利用该水凝胶用于体外和体内二者的细胞/组织培养。
与常见的基底膜产品(例如Matrigel)不同，肽/明胶杂化水凝胶的化学组分是明确限定的并且不含动物组分。肽/明胶杂化水凝胶的细胞扩增性能与市售产品Geltrex(Thermofisher)是等同的。
本文中所述的杂化水凝胶可用于3D细胞培养、干细胞培养、体外肿瘤球状体产生以及体内实体瘤发育。

Claims (19)

1.包含肽和明胶的水凝胶，所述肽包含具有至少8个氨基酸的序列，所述序列具有交替的疏水性氨基酸(X)和亲水性氨基酸(Y)，其中每个疏水性氨基酸独立地选自异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)，每个亲水性氨基酸独立地选自精氨酸(R)、赖氨酸(K)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)，其中所述亲水性氨基酸被选择成使得存在至少一个精氨酸和至少一个赖氨酸。
2.根据权利要求1所述的水凝胶，其中所述亲水性氨基酸被选择成使得存在至少两个选自谷氨酸和天冬氨酸的亲水性氨基酸。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的水凝胶，其中所述肽包含8或12个氨基酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的水凝胶，其中所述序列中依次四个亲水性氨基酸(Y1、Y2、Y3和Y4)被选择成使得Y1和Y2各自独立地选自谷氨酸和天冬氨酸，并且Y3和Y4各自独立地选自精氨酸和赖氨酸。
5.根据权利要求4所述的水凝胶，其中Y1和Y2是谷氨酸，Y3是精氨酸，以及Y4是赖氨酸。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的水凝胶，其中所述序列中依次六个亲水性氨基酸(Y5、Y6、Y1、Y2、Y3和Y4)被选择成使得Y1和Y2各自独立地选自谷氨酸和天冬氨酸，以及Y5、Y6、Y3和Y4各自独立地选自精氨酸和赖氨酸。
7.根据权利要求6所述的水凝胶，其中Y1和Y2是谷氨酸，Y5和Y3是精氨酸，以及Y6和Y4是赖氨酸。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的水凝胶，其中所述序列包含选自以下的SEQ ID：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的水凝胶，其中所述肽以所述水凝胶的0.1重量百分比至2重量百分比存在。
10.根据权利要求9所述的水凝胶，其中所述肽以所述水凝胶的0.2重量百分比至1重量百分比存在，优选所述肽以所述水凝胶的0.2重量百分比至0.4重量百分比存在。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的水凝胶，其中明胶以所述水凝胶的1重量百分比至10重量百分比存在。
12.根据权利要求11所述的水凝胶，其中明胶以所述水凝胶的1重量百分比至6重量百分比存在，优选所述明胶以所述水凝胶的2重量百分比至3重量百分比存在。
13.制备水凝胶的方法，所述方法包括在合适的条件下混合肽与明胶以形成所述水凝胶，所述肽包含具有至少8个氨基酸的序列，所述序列具有交替的疏水性氨基酸和亲水性氨基酸，其中每个疏水性氨基酸独立地选自异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)，每个亲水性氨基酸独立地选自精氨酸(R)、赖氨酸(K)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)，其中所述亲水性氨基酸被选择成使得存在至少一个精氨酸和至少一个赖氨酸。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述合适的条件包括至少一种下列条件：(a)盐；和(b)20℃至40℃的温度。
15.用于制备水凝胶的试剂盒，所述试剂盒包含肽和明胶，所述肽包含具有至少8个氨基酸的序列，所述序列具有交替的疏水性氨基酸和亲水性氨基酸，其中每个疏水性氨基酸独立地选自异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)，每个亲水性氨基酸独立地选自精氨酸(R)、赖氨酸(K)、谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)，其中所述亲水性氨基酸被选择成使得存在至少一个精氨酸和至少一个赖氨酸。
16.培养细胞的方法，所述方法包括提供根据权利要求1至12中任一项所述的水凝胶；以及在合适的条件下孵育细胞与所述水凝胶以培养所述细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞是肿瘤细胞，优选肿瘤球状体。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞是干细胞。
19.确定一种或更多种化合物对多种细胞的作用的方法，所述方法包括根据权利要求16至17中任一项所述培养多种细胞；向所述多种细胞添加所述一种或更多种化合物；以及确定所述一种或更多种化合物对多种细胞的作用。
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