CN107041967A - 一种功能性自组装纳米多肽水凝胶材料及其在制备止血材料中的应用 - Google Patents

一种功能性自组装纳米多肽水凝胶材料及其在制备止血材料中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种短肽，所述短肽序列为：（精氨酸‑丙氨酸‑天冬氨酸‑丙氨酸）4‑精氨酸‑异亮氨酸‑赖氨酸‑缬氨酸‑丙氨酸‑缬氨酸、（精氨酸‑丙氨酸‑天冬氨酸‑丙氨酸）4‑赖氨酸‑异亮氨酸‑赖氨酸‑缬氨酸‑丙氨酸‑缬氨酸或（精氨酸‑丙氨酸‑天冬氨酸‑丙氨酸）4‑组氨酸‑异亮氨酸‑赖氨酸‑缬氨酸‑丙氨酸‑缬氨酸。本发明同时公开了由上述短肽制备得到的功能性自组装纳米多肽水凝胶材料，本发明提供的水凝胶材料具有剪切变稀特点，通过注射器注射至出血点瞬间形成水凝胶，可用于快速止血，尤其是出血点环境复杂的情况，上述短肽在常温中性pH条件下形成纳米纤维水凝胶，模仿了天然细胞外基质结构，具有良好的理化性能和生物相容性。

Description

一种功能性自组装纳米多肽水凝胶材料及其在制备止血材料 中的应用
技术领域
本发明属于止血材料技术领域，更具体地，涉及一种功能性自组装纳米多肽水凝胶材料及其在制备止血材料中的应用。
背景技术
日常生活中的突发性事故的急救治疗、在医院对病人的手术过程中的创伤止血、特别是战争中受伤战士的救护，病患者局部有效的快速止血非常重要，因为未受控制的出血是导致突发事故，医疗手术中大出血或战场死亡的主要原因。尽早的控制出血成为降低患者死亡的最佳策略。在伊拉克战役中，战场上有50%阵亡人员是由于出血过多所致。即使当伤员能够支撑到有医疗设备处进行治疗，但未受控出血仍然是威胁伤员生命的主导因素。此外，口腔、耳、鼻、肝、脾、肾等组织器官的损伤和手术都需要止血，以肝脏手术止血为例，其止血种类和方法虽层出不穷，但死亡率仍达2%-8%，其中出血为最常见的原因。
临床常用的止血材料如止血纱布、止血纤维、止血绷带在使用中都有局限性：止血时间较长，易与伤口粘连而不易换药，对伤口的感染和化脓无能为力。快速止血和功能性止血将是未来止血药物发展的方向。同时，优异的止血材料除了具有快速止血的作用，还应该具有生物相容性，使用方便，生物可降解性和价格便宜，以及快速愈合能力。
自组装短肽RADA16-I是4个重复的精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸序列，即（精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸）4，当其水溶液调节至pH=7时会形成由纳米纤维网络构成的水凝胶。将RADA16-I水溶液当覆于伤口时，在伤口表面形成屏障，阻止血液从血管中流出，起到止血效果。但是一个显著的缺点是该材料水溶液具有明显的酸性(pH=3～4)，将会对止血部位的组织产生潜在的危害。
因此，急需一种快速止血，且不会破坏止血部位的组织的自组装短肽材料以克服上述缺陷。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中的不足，提供了一种功能性自组装纳米多肽水凝胶材料及其在制备止血材料中的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种短肽，所述短肽为在RADA16-I序列上分别连接若干个酸性氨基酸和若干个碱性氨基酸，所述短肽序列为：
（精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸）4-精氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸、（精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸）4-赖氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸或（精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸）4-组氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸。
本发明同时提供一种功能性自组装纳米多肽水凝胶材料，包括所述短肽。
优选地，将所述短肽溶于水，调整pH至中性后获得。
优选地，将短肽配置成短肽水溶液，先与碱液混合，调节pH得到中性短肽溶液，然后再与缓冲液混合，自组装形成所述水凝胶材料；所述碱液为NaOH溶液或Trsi-base溶液；所述缓冲液为PBS溶液或DMEM溶液。
优选地，所述短肽水溶液的浓度为5~15 mg/mL。
优选地，所述碱液的浓度为0.1~1 mol/mL，所述pH为7~7.4。
优选地，所述短肽水溶液与缓冲液混合体积比为（1~5）：1。
更优选地，所述短肽水溶液与缓冲液混合体积比为2：1。
本发明还同时保护所述的短肽在制备止血材料中的应用。
本发明还另外保护所述的功能性自组装纳米多肽水凝胶材料在制备止血材料中的应用。
本发明提供的水凝胶材料制备成止血材料后，可直接使用在微创手术中或者局部注射条件下，操作简单，同时快速止血，不会对组织产生损害。
本发明短肽序列的合成是采用了现有的接枝方向获得，由于目前未有成型的理论支持何种改性（即接枝序列和接枝位置）能够获得真正在中性条件下合成的自组装多肽水凝胶，不同的序列排列方式不同，电荷分布也不同，同时结构内部自组装方式均会影响最终的接枝效果，因此，上述接枝物的具体接枝位点和接枝序列排布，对最终效果影响非常大。
本发明是以低分子量自组装短肽为基础的水凝胶，具有剪切变稀特点，通过注射器注射至出血点瞬间形成水凝胶，可用于快速止血，尤其是出血点环境复杂，需要微创止血的情况。本材料可在常温中性pH条件下形成纳米纤维水凝胶，模仿了天然细胞外基质结构，具有良好的理化性能和生物相容性。同时，本发明提供的短肽在制备成水凝胶材料后呈中性，不会对止血部位的组织产生潜在的危害。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
与现有多肽自组装水凝胶材料相比，本发明在生理条件下（pH为7-7.4）为可注射的水溶液，具有剪切变稀特点，易于注射条件下使用。在出血点与血液接触后瞬间形成三维多孔水凝胶，凝胶网络结构稳定，可快速止血。具有操作简便的特点，是非常理想的生物材料，可以用于突发性事故的急救治疗、手术过程中的创伤止血，特别是在病患者局部有效地快速注射止血。本发明所述的中性pH下自组装成的水凝胶材料，且使用过程都是中性的，不会对宿主组织产生危害。
附图说明
图1为本发明的短肽中性水溶液剪切变稀流变图。
图2为本发明的短肽在出血点与血液接触后瞬间形成三维多孔水凝胶的原子力显微镜图。
图3为所发明的短肽中性水溶液注射至大鼠脊髓出血点后快速止血示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1：水凝胶的多肽材料制备
将短肽（其序列为：（精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸）4-精氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸）溶于超纯水后，配置成浓度为5~15ml/mL的溶液，与Tris-base溶液混合，Trsi-base溶液的浓度为0.1~1 mol/mL，调节其pH值至7，再与PBS/DMEM溶液以体积比2：1混合，静置后迅速形成凝胶，待性状稳定后，即可投入使用。
如图1所示，应用流变仪检测上述短肽中性水溶液的剪切变稀性能，其具有剪切变稀特点，非常有利于注射使用，可将其注射至出血点瞬间形成水凝胶控制出血。
实施例2：水凝胶的多肽材料制备
将短肽（其序列为：（精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸）4-赖氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸溶于超纯水后，配置成浓度为5~15ml/mL的溶液，与Tris-base溶液混合，Trsi-base溶液的浓度为0.1~1 mol/mL，调节其pH值至7，再与PBS/DMEM溶液以体积比2：1混合，静置后迅速形成凝胶，待性状稳定后，即可投入使用。
实施例3：水凝胶的多肽材料制备
将短肽（其序列为：（精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸）4-组氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸溶于超纯水后，配置成浓度为5~15ml/mL的溶液，与Tris-base溶液混合，Trsi-base溶液的浓度为0.1~1 mol/mL，调节其pH值至7，再与PBS/DMEM溶液以体积比2：1混合，静置后迅速形成凝胶，待性状稳定后，即可投入使用。
实施例4：止血实验
用戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉，于手术显微镜下在大鼠胸椎T 8 ~T9的位置背侧椎板切除暴露对应段位脊髓，使用眼科手术剪剪断脊髓上最大血管，之后迅速将1 % 的短肽溶液20 μL 注射入创口，用于创口出血控制，记录完全止血时间。空白对照组以生理盐水、纱布和明胶海绵处理。实验动物每组6 只（n = 6）。
采用本发明实施例1~3提供的短肽溶液进行注射，同时分别采用相同的注射方法采用常见的止血材料：明胶海绵、纱布和生理盐水进行止血效果的对比，具体见表1所示。
如图2所示，本发明的短肽在出血点与血液接触后瞬间形成三维多孔水凝胶，显示由直径约20 nm的纳米纤维网络构成，图3中经过注射可明显看到其表面形成了一层凝胶。
表1
止血材料 止血时间（秒）
明胶海绵 50±4
纱布 110±30
生理盐水 >300
实施例1水凝胶材料 8±3
实施例2水凝胶材料 10±3
实施例3水凝胶材料 9±1.5
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种短肽，其特征在于，所述短肽为在RADA16-I序列上分别连接若干个酸性氨基酸和若干个碱性氨基酸，所述短肽序列为：
（精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸）4-精氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸、（精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸）4-赖氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸或（精氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-丙氨酸）4-组氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸。
2.一种功能性自组装纳米多肽水凝胶材料，其特征在于，包括权利要求1所述短肽。
3.根据权利要求2所述的功能性自组装纳米多肽水凝胶材料，其特征在于，将所述短肽溶于水，调整pH至中性后获得。
4.根据权利要求3所述的功能性自组装纳米多肽水凝胶材料，其特征在于，将短肽配置成短肽水溶液，先与碱液混合，调节pH得到中性短肽溶液，然后再与缓冲液混合，自组装形成所述水凝胶材料；所述碱液为NaOH溶液或Trsi-base溶液；所述缓冲液为PBS溶液或DMEM溶液。
5.根据权利要求4所述的水凝胶材料，其特征在于，所述短肽水溶液的浓度为5~15 mg/mL。
6.根据权利要求4所述的水凝胶材料，其特征在于，所述碱液的浓度为0.1~1 mol/mL，所述pH为7~7.4。
7.根据权利要求4所述的水凝胶材料，其特征在于，所述短肽水溶液与缓冲液混合体积比为（1~5）：1。
8.根据权利要求7所述的水凝胶材料，其特征在于，所述短肽水溶液与缓冲液混合体积比为2：1。
9.权利要求1所述的短肽在制备止血材料中的应用。
10.权利要求2至10任一所述的功能性自组装纳米多肽水凝胶材料在制备止血材料中的应用。
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