CN104399123A - 一种真皮的制备方法及真皮 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物领域，尤其涉及一种真皮的制备方法及真皮。该真皮保质期较长，且能够有效保护真皮基质层和避免创面感染。克服了现有技术组织工程皮肤保质期短，且生产和保存成本较高，以及使用时容易导致创面感染的缺陷。本发明实施例提供的真皮的制备方法，包括：将含活细胞的真皮层与胶原膜复合后进行冷冻干燥，以获得脱细胞后的真皮。

Description

一种真皮的制备方法及真皮

技术领域

本发明涉及生物领域，尤其是组织工程领域，具体涉及一种真皮的制备方法及真皮。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，它具有屏障、感觉、调节体温、分泌与排泄、参与免疫反应、维持内外环境稳定等功能。随着经济、科技和社会的发展及人类平均寿命的延长，各种外伤特别是烧伤、老年性疾病等引起的皮肤缺损越来越多。自体皮肤移植作为这类皮肤缺损治疗的金标准，在临床应用中取得很大的成效。但是，自体皮肤移植需要把患者身上完好的皮肤通过手术切割下来，再覆盖到患者的皮肤缺损区，相应加大了对患者的打击，且在供皮区有可能形成疤痕及色素沉淀等，对患者造成二次伤害。

为了克服自体皮肤移植的缺陷，出现了多种替代自体皮肤的组织工程皮肤。例如，一种为包含双层活细胞的组织工程皮肤，该组织工程皮肤由表皮活细胞和真皮活细胞构成，虽然非常接近人体皮肤，但是由于活细胞生长及保存条件苛刻，使得该组织工程皮肤保质期短，且生产和保存成本较高，极大的限制了各种皮肤疾病治疗的应用；另一种为只包含真皮层的组织工程皮肤，其中真皮层由成纤维细胞和支架构成，例如可以通过将成纤维细胞接种于支架上培养，成纤维细胞在支架内增殖而形成。该组织工程皮肤虽然成分接近人体真皮，但是在使用时非常容易导致创面感染，也极大的限制了各种皮肤疾病治疗的应用。

发明内容

本发明的主要目的在于，提供一种真皮的制备方法及真皮，所得真皮保质期较长，且能够有效保护真皮基质层和避免创面感染。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明实施例提供一种真皮的制备方法，包括：

将含活细胞的真皮层与胶原膜复合后进行冷冻干燥，所述冷冻干燥可使真皮层中的活细胞失活，以获得脱细胞后的真皮。

优选的，所述将含活细胞的真皮层与胶原膜复合，包括：

用胶原蛋白溶液将所述含活细胞的真皮层和所述胶原膜粘合在一起。

优选的，所述用胶原蛋白溶液将所述含活细胞的真皮层和所述胶原膜粘合在一起，包括：

在培养皿中平铺一层胶原蛋白溶液；

将所述胶原膜平铺于所述胶原蛋白溶液上；

在胶原膜的上表面再平铺一层胶原蛋白溶液；

将所述含活细胞的真皮层平铺于最上层的胶原蛋白溶液上；

在所述含活细胞的真皮层上表面覆盖一层胶原蛋白溶液即可。

优选的，所述冷冻干燥依次包括：预冻、升华干燥和解析干燥；

其中，所述预冻的目标温度为-40—-50℃，时长为2-5小时；

所述升华干燥包含三个阶段，其中，

第一阶段的目标温度为-20℃—-10℃，时长为8-20小时，真空度为0.25-0.35mbar；

第二阶段的目标温度为-5℃—5℃，时长为8-12小时，真空度为0.15-0.25mbar；

第三阶段的目标温度为5℃—15℃，时长为2-8小时，真空度为0.10-0.20mbar；

所述解析干燥的目标温度为15℃—25℃，时长为2-8小时，真空度小于等于0.01mbar。

优选的，在经过冷冻干燥进行脱细胞处理之后，所述方法还包括：

在所得真皮上均匀打孔，且所述孔为通孔。

优选的，在将含活细胞的真皮层与胶原膜复合之前，所述方法还包括：

制备含活细胞的真皮层以及制备胶原膜。

优选的，所述制备含活细胞的真皮层包括：

对真皮成纤维细胞进行原代和传代培养，获取真皮成纤维细胞；

制备胶原蛋白溶液，所得胶原蛋白溶液包含新生牛血清和DMEM培养基，且所述胶原蛋白溶液为中性；

在膜状支架的表面上凝固一层所述胶原蛋白溶液；

将所述真皮成纤维细胞加入所述胶原蛋白溶液中，然后在所述膜状支架的表面上进行培养，得到所述含活细胞的真皮层。

优选的，所述制备胶原膜包括：

配置胶原蛋白溶液，所述胶原蛋白溶液的pH值为6-8；

将所述胶原蛋白溶液在37℃下凝胶，得到胶块；

将所述胶块在交联剂作用下震荡交联并清洗；

将所述震荡交联并清洗后的胶块进行压膜，得到胶原膜。

第二方面，本发明实施例提供一种真皮，该真皮由权利要求1-8任一项所述的真皮的制备方法所得。

第三方面，本发明实施例提供一种如第二方面所述的真皮作为化妆品的应用或作为皮肤移植的应用。

本发明实施例所述的真皮为利用组织工程技术得到的脱细胞真皮。

本发明实施例提供的一种真皮的制备方法，将含活细胞的真皮层与胶原膜复合后进行冷冻干燥，以获得脱细胞后的真皮。所得真皮为双层结构，即包括真皮基质层以及胶原膜，真皮基质层能够有效修复皮肤缺损，而胶原膜能够保护真皮基质层，使其充分发挥修复作用；并且可以保护伤口创面免受感染，而且，因为真皮基质层不含成纤维活细胞，降低了保存条件以及保存成本，延长了保存时间。克服了现有技术组织工程皮肤保质期短，且生产和保存成本较高，以及使用时容易导致创面感染的缺陷。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例提供的一种真皮的制备方法流程图；

图2为本发明实施例提供的另一种真皮的制备方法流程图；

图3为本发明实施例提供的再一种真皮的制备方法流程图；

图4为本发明实施例中一种真皮的结构示意图；

图5为本发明实施例中另一种真皮的结构示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

本发明实施例提供的一种真皮的制备方法，参见图1，包括：

步骤1、将含活细胞的真皮层与胶原膜复合；

步骤2、进行冷冻干燥，获得脱细胞后的真皮。

通过上述步骤1，所得真皮为双层结构，即包括真皮基质层以及胶原膜，真皮基质层能够有效修复皮肤缺损，而胶原膜能够保护真皮基质层，使其充分发挥修复作用；并且可以保护创面免受感染，而且，因为真皮基质层不含成纤维活细胞，降低了保存条件以及保存成本，延长了保存时间。克服了现有技术组织工程皮肤保质期短，且生产和保存成本较高，以及使用时容易导致创面感染的缺陷。

下面对本发明实施例的具体实现方式进行说明。

步骤1中，含活细胞的真皮层包含人源成纤维活细胞及其自分泌、旁分泌的各种生物活性因子。生物活性因子能够调节细胞的生长、分化和免疫等功能，尤其是能够有效的与皮肤细胞发生作用，参与创伤愈合。例如：生物活性因子能够促进上皮细胞的营养代谢，预防皮肤受到紫外线、自由基等侵害；生物活性因子还能促使真皮层胶原细胞的增生，加速术后皮肤的修复。

优选的，所述生物活性因子包含下述一种或任意几种的组合：hEGF(中文：人表皮生长因子，英文：human epidermal growth factor)、VEGF(中文：血管内皮生长因子，英文：vascular endothelial growthfactor)、bFGF(中文：碱性成纤维细胞生长因子，英文：alkaline fibroblastgrowth factor)、TGF-β(中文：转化生长因子-β，英文：transforminggrowth factors-β包括：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-α)、IGF-1(中文：类胰岛素一号增长因子，英文：insulin-like growth factors-1)和IGF-2(中文：类胰岛素二号增长因子，英文：insulin-like growth factors-2)。

步骤1中，优选的，所述胶原膜的厚度小于或等于3mm，表面平整均匀，呈透明状，该胶原膜应与活细胞真皮大小形状一致，但是具体形状在此不限制，可根据需要进行设定，例如，可以为圆形，方形等。所述胶原膜的pH为6.0至8.0之间。优选的，所述胶原膜为牛源性胶原蛋白膜，该胶原膜生物相容性好，可缓慢降解。

其中，胶原膜可以通过购买得到，也可以通过预设的工艺制备得到，本发明实施例对此不进行具体限制，并且下文具体介绍了通过预设工艺制备胶原膜的过程，在此不进行详述。

步骤1中，优选的，可以用胶原蛋白溶液将所述含活细胞的真皮层和所述胶原膜粘合在一起。

具体可以通过下述步骤实现：

步骤11、在培养皿中平铺一层胶原蛋白溶液；

其中，胶原蛋白溶液可以通过对灭菌后的胶原蛋白，用0.05-0.5％的乙酸进行溶解而得到，并且可用NaOH调节该胶原蛋白溶液的pH值至6-8。

步骤12、将所述胶原膜平铺于所述胶原蛋白溶液上；

步骤13、在胶原膜的上表面再平铺一层胶原蛋白溶液；

步骤14、将所述含活细胞的真皮层平铺于最上层的胶原蛋白溶液上；

步骤15、在所述含活细胞的真皮层上表面覆盖一层胶原蛋白溶液即可。

通过上述过程，使得含活细胞的真皮层和胶原膜都浸于胶原蛋白溶液中，胶原蛋白溶液将含活细胞的真皮层和胶原膜粘合在一起。

再通过步骤2的冷冻干燥，去除其中的水分，使含活细胞的真皮层中的成纤维活细胞失活，但生物活性因子仍然保持活性，并且形成包含真皮基质层以及胶原膜的双层结构。在将该真皮基质结构置于皮肤创面处后，真皮基质层的生物活性因子能够持续释放于创面处及其周围，促进机体创周及创基的细胞增殖与血管新生，缩短愈合时间。而胶原膜具有良好的生物相容性，应用后可临时性封闭、保护创面，阻挡异物和病原体的侵入，同时可以延缓降解，保护真皮基质层的生物活性因子，为组织的再生修复提供了保障，并且在这个过程中胶原膜进行缓慢降解，最后在创面愈合后自行脱落。经过步骤2的冷冻干燥，真皮基质层不含成纤维活细胞，可以在2-10℃条件下保存1-2年，降低了保存条件以及保存成本，延长了保存时间。

优选的，所述冷冻干燥依次包括：预冻、升华干燥和解析干燥；

其中，所述预冻的目标温度为-40—-50℃，时长为2-5小时；

所述升华干燥包含三个阶段，其中，

第一阶段的目标温度为-20℃—-10℃，时长为8-20小时，真空度为0.25-0.35mbar；

第二阶段的目标温度为-5℃—5℃，时长为8-12小时，真空度为0.15-0.25mbar；

第三阶段的目标温度为5℃—15℃，时长为2-8小时，真空度为0.10-0.20mbar；

所述解析干燥的目标温度为15℃—25℃，时长为2-8小时，真空度小于等于0.01mbar。

进一步优选的，参见图2，在经过冷冻干燥之后，所述方法还包括：

步骤3、在所得真皮上均匀打孔，且所述孔为通孔。

通过在所得真皮上进行打孔，可在该真皮表面形成均匀的通孔，该通孔有利于气液面的交换，并且使得组织的液体渗出，进而加快组织的修复。

进一步的，优选的，参见图3，在将含活细胞的真皮层与胶原膜复合之前，所述方法还可以包括：步骤a、制备含活细胞的真皮层；以及步骤b、制备胶原膜。

其中，所述步骤a包括：

步骤a1、对真皮成纤维细胞进行原代和传代培养，获取真皮成纤维细胞；

示例性的，可以通过对皮肤样本进行消毒后，通过消化分离出成纤维细胞，然后将成纤维细胞于37℃，5％CO2下培养，获得足够数量的真皮成纤维细胞。

步骤a2、制备胶原蛋白溶液，所得胶原蛋白溶液包含新生牛血清和DMEM培养基，且所述胶原蛋白溶液为中性；

示例性的，所述胶原蛋白溶液可以下述过程获得：

将胶原蛋白和0.05-0.5％的乙酸混合，在2-10℃冰箱内避光静置36-72小时，胶原蛋白溶解；将溶解的胶原蛋白溶液用紫外线消毒，并以每0.8毫升胶原蛋白溶液加0.1毫升10xDMEM(可购买)、0.1毫升新生牛血清的比例加入10xDMEM和新生牛血清，并混合均匀，然后用NaOH调节pH值至6-8。

步骤a3、在膜状支架的表面上凝固一层所述胶原蛋白溶液；

示例性的，该膜状支架可以为无菌尼龙膜，将该无菌尼龙膜的表面粘上一层胶原蛋白溶液后在37℃条件下进行凝固即可。

步骤a4、将所述真皮成纤维细胞加入所述胶原蛋白溶液中，然后在所述膜状支架的表面上进行培养，在所述真皮成纤维细胞覆盖所述膜状支架的整个表面后，得到所述含活细胞的真皮层。

示例性的，将上述步骤a1所得的真皮成纤维细胞放入步骤a2所得胶原蛋白溶液中，并混合均匀，然后将混合液置于步骤a3所得的膜状支架的表面，加入成纤维细胞培养液于37℃进行培养，得到所述含活细胞的真皮层。

其中，步骤b包括：

步骤b1、配置胶原蛋白溶液，所述胶原蛋白溶液的pH值为6-8；

示例性的，将胶原蛋白和0.05％-0.5％的乙酸混合，在2-10℃冰箱内避光静置36-72小时，胶原蛋白溶解，将在溶解的胶原蛋白溶液以每毫升胶原加0.01毫升0.15mg/ml的加入酚红溶液，且胶原蛋白溶液和酚红溶液的体积比为100:0.5-100:2。然后用NaOH调节pH值至中性6-8。加入的酚红溶液，具有指示pH值的作用，可以通过颜色变化指示pH值，从而节省了配置胶原蛋白溶液的时间。

步骤b2、将所述胶原蛋白溶液在37℃下凝胶，得到胶块；

步骤b3、将所述胶块在交联剂作用下震荡交联并清洗；

示例性的，交联剂可以为EDC，EDC的浓度可以为10-50mM，优选的，EDC的浓度为30mM或者50mM。

经过交联，所得胶块更致密，强度更高。可以延缓其降解速度。

步骤b4、将所述震荡交联并清洗后的胶块进行压膜，得到胶原膜。

示例性的，清洗的目的是为了去除胶块中残存的交联剂。

其中，通过对步骤b3所得胶块进行压膜，可以得到致密的胶原膜，其中所述胶原膜的厚度小于或等于3mm。

需要说明的是，可以对步骤b3所得胶块进行一次压膜得到所述胶原膜，也可以进行两次及两次以上压膜，得到所述胶原膜，本实施例对此不进行具体限制。

其中，压膜的方式可以为：在洁净的玻璃板上平铺一层尼龙膜，然后将步骤b3所得胶块放在所述尼龙膜上，然后在该胶块上表面再平铺一层尼龙膜，然后在尼龙膜上表面放置一层玻璃，玻璃上再缓慢增加重物，重物放置完成后静置预设时间即可。其中，放置重物的时间可以根据需要进行设置，例如可以为3-5分钟，本发明对此不进行限制，增加的重物的质量可以根据胶块确定，例如，可以为每块胶块承重2kg-5kg。

本发明另一实施例提供一种真皮，该真皮由上述实施例的真皮的制备方法所得。

参见图4，为本发明实施例提供的真皮的一个具体实施例，该真皮包括真皮基质层31以及胶原膜32，所述真皮基质层31包含生物活性因子和失活的人源成纤维细胞。

其中，真皮基质层31和胶原膜32均为片状结构，优选的，真皮基质层31和胶原膜32的大小和形状相同，两者之间呈粘接状态，但真皮基质层和胶原膜的具体形状在此不限定，例如，可以为方形，圆形，或其他任意形状，可根据实际需要设定。

在将该真皮移植至皮肤创面处后，真皮基质层31的生物活性因子能够持续释放于创面处及其周围，促进机体创周及创基的细胞增殖与血管新生，缩短愈合时间。而胶原膜32具有良好的生物相容性，应用后可临时性封闭、保护创面，阻挡异物和病原体的侵入，同时可以延缓降解，保护真皮基质层31的生物活性因子，为组织的再生修复提供了保障，并且在这个过程中胶原膜32进行缓慢降解，最后在创面愈合后自行脱落。

进一步优选的，参见图5，所述胶原膜32以及真皮基质层31上均匀分布有通孔33。通孔33的设置，能够保证气液面交换，并且有利于创面愈合过程中的组织废液，通过该通孔渗出。

本发明实施例提供的一种真皮，包括真皮基质层31以及胶原膜32，真皮基质层31包含生物活性因子和失活的人源成纤维细胞，能够有效修复皮肤缺损，而胶原膜32能够保护真皮基质层，使其充分发挥修复作用；并且可以保护创面免受感染，而且，因为真皮基质层31不含成纤维活细胞，降低了保存条件以及保存成本，延长了保存时间。克服了现有技术组织工程皮肤保质期短，且生产和保存成本较高，以及使用时容易导致创面感染的缺陷。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种真皮的制备方法，其特征在于，包括：

将含活细胞的真皮层与胶原膜复合后进行冷冻干燥，以获得脱细胞后的真皮。

2.根据权利要求1所述的真皮的制备方法，其特征在于，所述将含活细胞的真皮层与胶原膜复合，包括：

用胶原蛋白溶液将所述含活细胞的真皮层和所述胶原膜粘合在一起。

3.根据权利要求2所述的真皮的制备方法，其特征在于，所述用胶原蛋白溶液将所述含活细胞的真皮层和所述胶原膜粘合在一起，包括：

在培养皿中平铺一层胶原蛋白溶液；

将所述胶原膜平铺于所述胶原蛋白溶液上；

在胶原膜的上表面再平铺一层胶原蛋白溶液；

将所述含活细胞的真皮层平铺于最上层的胶原蛋白溶液上；

在所述含活细胞的真皮层上表面覆盖一层胶原蛋白溶液即可。

4.根据权利要求1-3任一项所述真皮的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥依次包括：预冻、升华干燥和解析干燥；

其中，所述预冻的目标温度为-40—-50℃，时长为2-5小时；

所述升华干燥包含三个阶段，其中，

第一阶段的目标温度为-20℃—-10℃，时长为8-20小时，真空度为0.25-0.35mbar；

第二阶段的目标温度为-5℃—5℃，时长为8-12小时，真空度为0.15-0.25mbar；

第三阶段的目标温度为5℃—15℃，时长为2-8小时，真空度为0.10-0.20mbar；

所述解析干燥的目标温度为15℃—25℃，时长为2-8小时，真空度小于等于0.01mbar。

5.根据权利要求1-4任一项所述的真皮的制备方法，其特征在于，在进行冷冻干燥之后，所述方法还包括：

在所得真皮上均匀打孔，且所述孔为通孔。

6.根据权利要求1-4任一项所述的真皮的制备方法，其特征在于，在将含活细胞的真皮层与胶原膜复合之前，所述方法还包括：

制备含活细胞的真皮层以及制备胶原膜。

7.根据权利要求6所述的真皮的制备方法，其特征在于，所述制备含活细胞的真皮层包括：

对真皮成纤维细胞进行原代和传代培养，获取真皮成纤维细胞；

制备胶原蛋白溶液，所得胶原蛋白溶液包含新生牛血清和DMEM培养基，且所述胶原蛋白溶液的pH值为6-8；

在膜状支架的表面上凝固一层所述胶原蛋白溶液；

将所述真皮成纤维细胞加入所述胶原蛋白溶液中，然后在所述膜状支架的表面上进行培养，得到所述含活细胞的真皮层。

8.根据权利要求6所述的真皮的制备方法，其特征在于，所述制备胶原膜包括：

配置胶原蛋白溶液，所述胶原蛋白溶液的pH值为6-8；

将所述胶原蛋白溶液在37℃下凝胶，得到胶块；

将所述胶块在交联剂作用下震荡交联并清洗；

将所述震荡交联并清洗后的胶块进行压膜，得到胶原膜。

9.一种真皮，其特征在于，由权利要求1-8任一项所述的真皮的制备方法所得。

10.如权利要求9所述的真皮，其特征在于，其作为化妆品或作为皮肤移植的应用。