CN112535766B - 基于人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液水凝胶及其制备方法 - Google Patents

基于人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液水凝胶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明实施例公开了一种基于人间充质干细胞细胞外基质复合胶原蛋白提取液水凝胶及其制备方法，所述方法包括：将人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液溶解于缓冲溶液中，获得质量浓度为0.1～100mg/mL的蛋白溶液；所述蛋白溶液加入天然分子和人工合成分子混匀，获得混合溶液；所述人工合成分子的使用终浓度为0～100mg/mL；所述天然分子的使用终浓度为0～100mg/mL；将所述混合溶液加入交联活化剂混匀，获得交联反应液；所述交联活化剂的使用终浓度为1～30mg/mL；将所述交联反应液进行纯化处理，获得的复合胶原蛋白提取液水凝胶，成胶时间短、生物相容性好、稳定性好，具有可注射性。

Description

基于人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液水 凝胶及其制备方法
技术领域
本发明实施例涉及医用生物材料技术领域，特别涉及一种基于人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液水凝胶及其制备方法。
背景技术
水凝胶具有高度亲水的三维网络结构，可以保持较高的含水量(70-90％)。此外，水凝胶不仅为细胞附着提供了结构上的支持，而且还提供了多种生化和生物物理因子来调节细胞行为。可注射水凝胶是最近的焦点之一，可以通过以微创的方式直接在期望的位置上应用，手术期间可能的感染风险可以最小化，同时伴随较少的疤痕和/或疼痛，而且允许在门诊而不是手术室中进行临床应用，从而在最大程度地提高实用性的同时将医疗成本降至最低。此外，可注入性赋予水凝胶容易修复不规则形状缺陷的能力，从而改善与周围组织的接触。上述优点使可注射水凝胶在再生医学的特殊应用——整容手术的软组织填充物中具有巨大的潜力。
到目前为止市场上应用的胶原多来自于动物，有过敏、组织排异等风险。到目前为止尚未有成熟的人源胶原蛋白生产技术，尤其是利用人源间充质干细胞作为生物反应器大量生产细胞外基质复合胶原蛋白等。细胞外基质是细胞生存的重要微环境，能够调控细胞增殖、分化等一系列行为和功能。细胞外基质主要由胶原、蛋白多糖和粘多糖(包括透明质酸)等组成。胶原是人体内含量最丰富的蛋白，占人体蛋白总量的30％以上，其中以细胞外基质中胶原蛋白含量最高。因具有高含量的胶原蛋白，结缔组织具有了一定的结构与机械力学性质，以达到支撑保护的功能。现有的人源胶原蛋白的水凝胶机械强度较差。
因此，如何开发一种机械强度好、生物活性高的基于人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液水凝胶及其制备方法，成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明实施例目的是提供一种基于人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液水凝胶及其制备方法，水凝胶的机械强度好且具有高生物活性。
将人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液溶解于缓冲溶液中，获得质量浓度为0～100mg/mL的蛋白溶液；
将所述蛋白溶液加入天然分子和人工合成分子混匀，获得混合溶液；所述人工合成分子的使用终浓度为0～100mg/mL；所述天然分子的使用终浓度为0～100mg/mL；
将所述混合溶液加入交联活化剂混匀以进行交联反应，获得交联反应液；所述交联活化剂的使用终浓度为1～30mg/mL；
将所述交联反应液进行纯化处理，获得基于人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液水凝胶。
进一步地，所述交联活化剂包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐、1-羟基苯并三氮唑和六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷中的至少一种。
进一步地，所述缓冲溶液包括磷酸盐缓冲液、2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液和硼酸盐缓冲液中的至少一种，所述缓冲溶液的pH为6～7。
进一步地，所述人工合成分子的使用终浓度为20～80mg/mL。
进一步地，所述人工合成分子包括聚乙二醇二胺、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚缩水甘油、聚碳酸酯和聚酰胺中的至少一种。
进一步地，所述天然分子的使用终浓度为10～80mg/mL。
进一步地，所述天然分子包括透明质酸、羧甲基壳聚糖、海藻酸钠、硫酸软骨素、明胶和丝素蛋白中的至少一种。
进一步地，所述天然分子与所述人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量比为(1～10)：(1～10)。
进一步地，所述人工合成分子包括1,4-丁二醇二缩水甘油醚、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚缩水甘油、聚碳酸酯和聚酰胺中的至少一种。
本发明实施例还提供了采用所述方法制备得到的基于人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液水凝胶。
本发明实施例还提供了所述的基于人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液水凝胶在制备全固态锂离子电池中的应用。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明实施例提供的一种基于人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液水凝胶，所采用的人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，具备成熟的生产技术，与目前为止市场上应用的来自动物的胶原蛋白相比，有效避免了过敏、组织排异等风险，而且能够有效调控细胞增殖、分化等一系列行为和功能，可以提高水凝胶机械强度，并对水凝胶的细胞粘附性和促细胞生长性具有积极影响；
添加的各种天然分子可为水凝胶提供附加功能，如添加透明质酸，具有保湿润滑功能；人工合成分子的引入，可有效调控水凝胶的理化性质，可有效改进水凝胶降解速度过快、力学性能差等问题，以满足应用要求。
所述的基于人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液水凝胶，生物相容性好、稳定性好，其可注射性能够填充任意形状的组织缺损部位，快速成胶可以防止细胞流失，使手术操作更加简便、可控性强，且制备方法成本低廉、工艺简单、反应条件温和，在软组织缺损修复领域和填充中具有重要的应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明实施例的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为实施例17-23基于人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液水凝胶的溶胀性能测试图；
图2为是实施例1-23基于人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液水凝胶的降解性能测试图；
图3为实施例20-23基于人间充质干细胞细胞外基质源胶原蛋白水凝胶的清洗液中残留副产物紫外吸收光谱图；
图4为实施例20-23基于人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液水凝胶/细胞复合物内细胞的核骨架染色图；
图5为实施例20-23基于人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液水凝胶/细胞复合物内细胞的细胞面积、长径比、圆度统计图；
图6为纯化过的间充质干细胞细胞外基质复合蛋白纯化后8％PAGE-SDS蛋白凝胶电泳图；
图7为本发明实施例提供的一种基于人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液水凝胶的制备方法的流程图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明实施例，本发明实施例的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明实施例，而非限制本发明实施例。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明实施例所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明实施例中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
本发明实施例提供一种基于人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液水凝胶，总体思路如下：
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种基于人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液水凝胶的制备方法，所述方法包括：
将人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液溶解于缓冲溶液中，获得质量浓度为0～100mg/mL的蛋白溶液；
将所述蛋白溶液加入天然分子和人工合成分子混匀，获得混合溶液；所述人工合成分子的使用终浓度为0～100mg/mL；所述天然分子的使用终浓度为0～100mg/mL；
将所述混合溶液加入交联活化剂混匀以进行交联反应，获得交联反应液；所述交联活化剂的使用终浓度为1～30mg/mL；
将所述交联反应液进行纯化处理，获得基于人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液水凝胶。
该实施方式中，人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液为利用人间充质干细胞生产细胞外基质采用常规方法获得的复合胶原蛋白提取液。
以上实施方式包括3种技术方案：
(1)该实施方式中，当所述天然分子和人工合成分子的浓度取0时，即不加天然分子和人工合成分子；
该实施方式中，所述交联活化剂包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(简称EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺，(简称NHS)、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(简称DMTMM)、1-羟基苯并三氮唑(简称HOBt)和六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷(简称BOP)中的至少一种。
所述缓冲溶液包括磷酸盐缓冲液、2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液和硼酸盐缓冲液中的至少一种，所述缓冲溶液的pH为6～7。
EDC可促发胶原发生交联，通过与胶原结构中冬氨酸和谷氨酸残基上的羧基进行反应形成一种促发剂：不稳定的脲衍生物；
NHS通过形成更稳定的酯而增强碳二亚胺交联产物的稳定性；
交联过程中EDC、NHS不进入胶原基质，而是转变成水溶性的脲衍生物，细胞毒性小。
该实施方式中，基本化学原理是：交联活化剂的活化基团与人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液实现交联，即得到人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液水凝胶。制备得到的人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液水凝胶，因采用了人间充质干细胞细胞外基质来源的胶原蛋白，水凝胶具有高生物活性，可调控细胞增殖、分化等一系列行为和功能，引导组织修复。成胶时间短、生物相容性好、稳定性好，具有可注射性，并且成本低廉、工艺简单、反应条件温和，在组织修复，尤其是软组织缺损填充方面具有很好的应用前景。
因采用了人间充质干细胞细胞外基质来源的胶原蛋白，水凝胶具有高生物活性；缓冲溶液的pH为6～7是为了保持生物活性控制所述交联活化剂的使用终浓度为1～30mg/mL是为了更好的产生交联反应；
具体选用不同的交联活化剂，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(简称EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺，(简称NHS)、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(简称DMTMM)、1-羟基苯并三氮唑(简称HOBt)和六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷(简称BOP)的优选使用终浓度范围均选用1～30mg/mL；
作为一种可选的实施方式，所述交联反应的温度为4～40℃，所述交联反应的时间为1～24h。
将蛋白溶液的浓度控制在浓度为0～100mg/mL；考虑到适宜的成胶浓度和凝胶的最终模量，制备模量在0.01-100kPa，与组织模量相匹配的凝胶；蛋白溶液的浓度0mg/mL时为纯凝胶；作为一种更为优选的实施方式，所述胶原蛋白的终浓度为10～30mg/mL；
(2)该实施方式中，所述人工合成分子的浓度取0时，即不加人工合成分子；
所述天然分子包括透明质酸、羧甲基壳聚糖、海藻酸钠、硫酸软骨素、明胶和丝素蛋白中的至少一种。所述天然分子具有调控凝胶降解速率，赋予保湿润滑等特定功能，并协同促进机体组织的修复。
优选地，所述天然分子的使用终浓度为10～80mg/mL。使用浓度过高，则造成凝胶模量过大，不能高效的模拟天然微环境对细胞的物理力学刺激，同时降低细胞外基质比例，不利于生物活性的发挥；
所述交联活化剂包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(简称EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺，(简称NHS)、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐(简称DMTMM)、1-羟基苯并三氮唑(简称HOBt)和六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷(简称BOP)中的至少一种。
所述缓冲溶液包括磷酸盐缓冲液、2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液和硼酸盐缓冲液中的至少一种，所述缓冲溶液的pH为6～7。
所述不同的天然分子分别与胶原蛋白连接时各基团的连接原理为：均使用分子之间羧基与氨基反应形成酰胺键，或羧基与羟基反应形成酯键；
所述交联活化剂中活化基团与所述天然分子中的参与交联反应的功能基团摩尔比例为(1～5)：1。所述天然分子或细胞外基质中被活化剂活化而参与交联反应，功能基团具体为羧基；采用该摩尔比的原因是控制羧基活化比例，让交联反应充分进行，而又不会因交联程度过高而造成凝胶模量过大，所述摩尔比过高造成凝胶模量过大，且增加活化剂的使用成本，过低则可能造成交联不充分，凝胶不稳定。
所述方案制备得到的为人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液与天然分子复合水凝胶，添加的各种天然分子可为水凝胶提供附加功能，如添加透明质酸，具有保湿润滑功能。
所述透明质酸与所述人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量比为(1～10)：(1～10)；优选为(1：1)～(3：1)；
所述羧甲基壳聚糖与所述人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量比为(1～10)：(1～10)；该质量比过大，容易导致水凝胶生物活性欠缺；过小，容易导致水凝胶降解过快；
所述海藻酸钠与所述人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量比为(1～10)：(1～10)；该质量比过大，容易导致水凝胶生物活性欠缺；过小，容易导致水凝胶降解过快；
所述硫酸软骨素与所述人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量比为(1～10)：(1～10)；该质量比过大，容易导致水凝胶生物活性欠缺；过小，容易导致水凝胶降解过快；
所述明胶与所述人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量比为(1～10)：(1～10)；该质量比过大，容易导致水凝胶生物活性欠缺；过小，容易导致水凝胶降解过快；
所述丝素蛋白与所述人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量比为
(1～10)：(1～10)。该质量比过大，容易导致水凝胶生物活性欠缺；过小，容易导致水凝胶降解过快；
(3)当人工合成分子的浓度不取0，即加入天然分子和人工合成分子；
所述人工合成分子包括聚乙二醇二胺(简称NH2-PEG-NH2)、1,4-丁二醇二缩水甘油醚(简称BDDE)、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚缩水甘油、聚碳酸酯和聚酰胺中的至少一种。
1,4-丁二醇二缩水甘油醚、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚缩水甘油、聚碳酸酯和聚酰胺的优选使用终浓度分别为30～70mg/mL、30～70mg/mL、30～70mg/mL、30～70mg/mL、30～70mg/mL、30～70mg/mL。所述人工合成分子的浓度过大，容易导致水凝胶生物活性欠缺，过小，容易导致水凝胶降解过快；
所述天然分子和人工合成分子同时加入，共同进行交联成胶反应，交联反应时均使用分子之间羧基与氨基反应形成酰胺键，或羧基与羟基反应形成酯键。
该方案制备得到的为人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液与天然分子及人工分子复合水凝胶，由于人工合成分子的引入，可有效调控水凝胶的理化性质，可有效改进水凝胶降解速度过快、力学性能差等问题，以满足应用要求；
下面将结合实施例、对比例及实验数据对本申请的一种基于人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液水凝胶进行详细说明。
实施例1
步骤S1、配制100mM的MES缓冲溶液，并用1M的NaOH调节pH至6-7。
步骤S2、加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度为50mg/mL，搅拌均匀；
步骤S3、加入EDC，使混合溶液中活化剂的质量浓度为1mg/mL搅拌均匀，室温反应4-6h，得到水凝胶ECM 50-EDC 1。
实施例2
步骤S1、配制100mM的MES缓冲溶液，并用1M的NaOH调节pH至6-7。
步骤S2、加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度为50mg/mL，搅拌均匀；
步骤S3、加入EDC，使混合溶液中活化剂的质量浓度为3mg/mL，搅拌均匀，室温反应4-6h，得到水凝胶ECM 50-EDC 3。
实施例3
步骤S1、配制100mM的MES缓冲溶液，并用1M的NaOH调节pH至6-7。
步骤S2、加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度为50mg/mL，搅拌均匀；
步骤S3、加入EDC，使混合溶液中活化剂的质量浓度为5mg/mL，搅拌均匀，室温反应4-6h，得到水凝胶ECM 50-EDC 5。
实施例4
步骤S1、配制100mM的MES缓冲溶液，并用1M的NaOH调节pH至6-7。
步骤S2、加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度为50mg/mL，搅拌均匀；
步骤S3、加入EDC，使混合溶液中活化剂的质量浓度为10mg/mL，搅拌均匀，室温反应4-6h，得到水凝胶ECM 50-EDC 10。
实施例5
步骤S1、配制50mM的MES缓冲溶液，并用1M的NaOH调节pH至6-7，将分子量为10万Da的透明质酸钠溶解于缓冲溶液中，超声使其完全溶解，使混合溶液中透明质酸钠的质量浓度为15mg/mL；
步骤S2、加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度为15mg/mL，搅拌均匀；
步骤S3、加入EDC，使混合溶液中活化剂的质量浓度为20mg/mL，搅拌均匀，室温反应4-6h，得到水凝胶E15 H15(0.1M)。
实施例6
步骤S1、配制50mM的MES缓冲溶液，并用1M的NaOH调节pH至6-7；加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度为20mg/mL，搅拌均匀；
步骤S2、将分子量为10万Da的透明质酸钠溶解于所述步骤S1所得溶液中，超声使其完全溶解，使混合溶液中透明质酸钠的质量浓度为20mg/mL；
步骤S3、加入EDC，使混合溶液中活化剂的质量浓度为20mg/mL，搅拌均匀，室温反应4-6h，得到水凝胶E20 H20(0.1M)。
实施例7
步骤S1、配制50mM的MES缓冲溶液，并用1M的NaOH调节pH至6-7，加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度为15mg/mL，搅拌均匀；
步骤S2、将分子量为80-100万Da的透明质酸钠溶解于所述步骤S1所得溶液中，超声使其完全溶解，使混合溶液中透明质酸钠的质量浓度分别为15mg/mL；
步骤S3、加入EDC，使混合溶液中活化剂的质量浓度为20mg/mL，搅拌均匀，室温反应4-6h，得到水凝胶E15 H15(0.8-1M)。
实施例8
步骤S1、配制50mM的MES缓冲溶液，并用1M的NaOH调节pH至6-7，加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度20mg/mL，搅拌均匀；
步骤S2、将分子量为80-100万Da的透明质酸钠溶解于步骤S1所得溶液中，超声使其完全溶解，使混合溶液中透明质酸钠的质量浓度为20mg/mL；
步骤S3、加入EDC，使混合溶液中活化剂的质量浓度为20mg/mL，搅拌均匀，室温反应4-6h，得到水凝胶E20 H20(0.8-1M)。
实施例9
步骤S1、配制100mM的MES缓冲溶液，并用1M的NaOH调节pH至6-7，加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度为15mg/mL，搅拌均匀；
步骤S2、将分子量为10万Da的透明质酸钠溶解于步骤S1所得溶液中，超声使其完全溶解，使混合溶液中透明质酸钠的质量浓度为15mg/mL；
步骤S3、加入分子量为1kDa的聚乙二醇二胺，使混合溶液中聚乙二醇二胺的质量浓度为5mg/mL，搅拌均匀；
步骤S4、加入EDC，使混合溶液中活化剂的质量浓度为20mg/mL，搅拌均匀，室温反应4-6h，得到水凝胶E15 H15(0.1M)P5。
实施例10
步骤S1、配制100mM的MES缓冲溶液，并用1M的NaOH调节pH至6-7，加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度为15mg/mL，搅拌均匀；
步骤S2、将分子量为10万Da的透明质酸钠溶解于步骤S1所得溶液中，超声使其完全溶解，使混合溶液中透明质酸钠的质量浓度为15mg/mL；
步骤S3、加入分子量为1kDa的聚乙二醇二胺，使混合溶液中聚乙二醇二胺的质量浓度为10mg/mL，搅拌均匀；
步骤S4、加入EDC，使混合溶液中活化剂的质量浓度为20mg/mL，搅拌均匀，室温反应4-6h，得到水凝胶E15 H15(0.1M)P10。
实施例11
步骤S1、配制100mM的MES缓冲溶液，并用1M的NaOH调节pH至6-7，加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度为15mg/mL，搅拌均匀；
步骤S2、将分子量为80-100万Da的透明质酸钠溶解于步骤S1所得溶液中，超声使其完全溶解，使混合溶液中透明质酸钠的质量浓度为15mg/mL；
步骤S3、加入分子量为1kDa的聚乙二醇二胺，使混合溶液中聚乙二醇二胺的质量浓度为5mg/mL，搅拌均匀；
步骤S4、加入EDC，使混合溶液中活化剂的质量浓度为20mg/mL，搅拌均匀，室温反应4-6h，得到水凝胶E15 H15(0.8-1M)P5。
实施例12
步骤S1、配制100mM的MES缓冲溶液，并用1M的NaOH调节pH至6-7，加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度为15mg/mL，搅拌均匀；
步骤S2、将分子量为80-100万Da的透明质酸钠溶解于步骤S1所得溶液中，超声使其完全溶解，使混合溶液中透明质酸钠的质量浓度为15mg/mL；
步骤S3、加入分子量为1kDa的聚乙二醇二胺，使混合溶液中聚乙二醇二胺的质量浓度分别为10mg/mL，搅拌均匀；
步骤S4、加入EDC，使混合溶液中活化剂的质量浓度为20mg/mL，搅拌均匀，室温反应4-6h，得到水凝胶E15 H15(0.8-1M)P10。
实施例13
步骤S1、配制100mM的MES缓冲溶液，并用1M的NaOH调节pH至6-7，加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度为15mg/mL，搅拌均匀；
步骤S2、将分子量为80-100万Da的透明质酸钠溶解于步骤S1所得溶液中，超声使其完全溶解，使混合溶液中透明质酸钠的质量浓度为15mg/mL；
步骤S3、加入分子量为1kDa的聚乙二醇二胺，使混合溶液中聚乙二醇二胺的质量浓度为15mg/mL，搅拌均匀；
步骤S4、加入EDC，使混合溶液中活化剂的质量浓度为20mg/mL，搅拌均匀，室温反应4-6h，得到水凝胶E15 H15(0.8-1M)P15。
实施例14
步骤S1、配制100mM的MES缓冲溶液，并用1M的NaOH调节pH至6-7，加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度为10mg/mL，搅拌均匀；
步骤S2、将分子量为80-100万Da的透明质酸钠溶解于步骤S1所得溶液中，超声使其完全溶解，使混合溶液中透明质酸钠的质量浓度为15mg/mL；
步骤S3、加入分子量为1kDa的聚乙二醇二胺，使混合溶液中聚乙二醇二胺的质量浓度为10mg/mL，搅拌均匀；
步骤S4、加入DMTMM，使混合溶液中活化剂的质量浓度为20mg/mL(DMTMM中氨基与步骤S1的透明质酸钠中羧基的摩尔比例为5:1)，搅拌均匀，室温反应3-4h，得到水凝胶E10H30(0.8-1M)P10 DMT5:1。
实施例15
步骤S1、配制100mM的MES缓冲溶液，并用1M的NaOH调节pH至6-7，加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度为20mg/mL，搅拌均匀；
步骤S2、将分子量为80-100万Da的透明质酸钠溶解于步骤S1所得溶液中，超声使其完全溶解，使混合溶液中透明质酸钠的质量浓度为15mg/mL；
步骤S3、加入分子量为1kDa的聚乙二醇二胺，使混合溶液中聚乙二醇二胺的质量浓度为10mg/mL，搅拌均匀；
步骤S4、加入DMTMM，使混合溶液中活化剂的质量浓度为20mg/mL(DMTMM中氨基与步骤S1的透明质酸钠中羧基的摩尔比例为5:1)，搅拌均匀，室温反应3-4h，得到水凝胶E20H30(0.8-1M)P10 DMT5:1。
实施例16
步骤S1、配制100mM的MES缓冲溶液，并用1M的NaOH调节pH至6-7，加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度为30mg/mL，搅拌均匀；
步骤S2、将分子量为80-100万Da的透明质酸钠溶解于步骤S1所得溶液中，超声使其完全溶解，使混合溶液中透明质酸钠的质量浓度为15mg/mL；
步骤S3、加入分子量为1kDa的聚乙二醇二胺，使混合溶液中聚乙二醇二胺的质量浓度为10mg/mL，搅拌均匀；
步骤S4、加入DMTMM，使混合溶液中活化剂的质量浓度为20mg/mL(DMTMM中氨基与步骤S1的透明质酸钠中羧基的摩尔比例为5:1)，搅拌均匀，室温反应3-4h，得到水凝胶E30H30(0.8-1M)P10 DMT5:1。
实施例17
步骤S1、配制200mM的MES缓冲溶液，并用1M的HCL调节pH至7-8，加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度为30mg/mL，搅拌均匀；
步骤S2、将分子量为80-100万Da的透明质酸钠溶解于步骤S1所得溶液中，超声使其完全溶解，使混合溶液中透明质酸钠的质量浓度为30mg/mL；
步骤S3、加入分子量为1kDa的聚乙二醇二胺，使混合溶液中聚乙二醇二胺的质量浓度为10mg/mL，搅拌均匀；
步骤S4、加入DMTMM，使混合溶液中活化剂的质量浓度分别为6mg/mL(DMTMM中氨基与步骤S1的透明质酸钠中羧基的摩尔比例为1:1)，搅拌均匀，室温反应1-3h，得到水凝胶E30 H30(0.8-1M)P10 DMT1:1。
实施例18
步骤S1、配制200mM的MES缓冲溶液，并用1M的HCL调节pH至7-8，加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度分别为30mg/mL，搅拌均匀；
步骤S2、将分子量为80-100万Da的透明质酸钠溶解于步骤S1所得溶液中，超声使其完全溶解，使混合溶液中透明质酸钠的质量浓度为30mg/mL；
步骤S3、加入分子量为1kDa的聚乙二醇二胺，使混合溶液中聚乙二醇二胺的质量浓度为10mg/mL，搅拌均匀；
步骤S4、加入DMTMM，使混合溶液中活化剂的质量浓度为18mg/mL(DMTMM中氨基与步骤S1的透明质酸钠中羧基的摩尔比例为3:1)，搅拌均匀，室温反应1-3h，得到水凝胶E30H30(0.8-1M)P10 DMT3:1。
实施例19
步骤S1、配制200mM的MES缓冲溶液，并用1M的HCL调节pH至7-8，加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度分别为30mg/mL，搅拌均匀；
步骤S2、将分子量为80-100万Da的透明质酸钠溶解于步骤S1所得溶液中，超声使其完全溶解，使混合溶液中透明质酸钠的质量浓度为30mg/mL；
步骤S3、加入分子量为1kDa的聚乙二醇二胺，使混合溶液中聚乙二醇二胺的质量浓度为10mg/mL，搅拌均匀；
步骤S4、加入DMTMM，使混合溶液中活化剂的质量浓度为30mg/mL(DMTMM中氨基与步骤S1的透明质酸钠中羧基的摩尔比例为5:1)，搅拌均匀，室温反应1-3h，得到水凝胶E30H30(0.8-1M)P10 DMT5:1。
实施例20
步骤S1、配制200mM的MES缓冲溶液，并用1M的HCL调节pH至7-8，加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度为10mg/mL，搅拌均匀；
步骤S2、将分子量为80-100万Da的透明质酸钠溶解于步骤S1所得溶液中，超声使其完全溶解，使混合溶液中透明质酸钠的质量浓度为30mg/mL；
步骤S3、加入分子量为1kDa的聚乙二醇二胺，使混合溶液中聚乙二醇二胺的质量浓度为10mg/mL，搅拌均匀；
步骤S4、加入DMTMM，使混合溶液中活化剂的质量浓度分别为18mg/mL(DMTMM中氨基与步骤S1的透明质酸钠中羧基的摩尔比例为3:1)，搅拌均匀，室温反应1-3h，得到水凝胶E10 H30(0.8-1M)P10 DMT3:1。
实施例21
步骤S1、配制200mM的MES缓冲溶液，并用1M的HCL调节pH至7-8，加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度为20mg/mL，搅拌均匀；
步骤S2、将分子量为80-100万Da的透明质酸钠溶解于步骤S1所得溶液中，超声使其完全溶解，使混合溶液中透明质酸钠的质量浓度为30mg/mL；
步骤S3、加入分子量为1kDa的聚乙二醇二胺，使混合溶液中聚乙二醇二胺的质量浓度为10mg/mL，搅拌均匀；
步骤S4、加入DMTMM，使混合溶液中活化剂的质量浓度分别为18mg/mL(DMTMM中氨基与步骤S1的透明质酸钠中羧基的摩尔比例为3:1)，搅拌均匀，室温反应1-3h，得到水凝胶E20 H30(0.8-1M)P10 DMT3:1。
实施例22
步骤S1、配制200mM的MES缓冲溶液，并用1M的HCL调节pH至7-8，分别加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度为30mg/mL，搅拌均匀；
步骤S2、将分子量为80-100万Da的透明质酸钠溶解于步骤S1所得溶液中，超声使其完全溶解，使混合溶液中透明质酸钠的质量浓度为30mg/mL；
步骤S3、分别加入分子量为1kDa的聚乙二醇二胺，使混合溶液中聚乙二醇二胺的质量浓度为10mg/mL，搅拌均匀；
步骤S4、分别加入DMTMM，使混合溶液中活化剂的质量浓度分别为18mg/mL(DMTMM中氨基与步骤S1的透明质酸钠中羧基的摩尔比例为3:1)，搅拌均匀，室温反应1-3h，得到水凝胶E30 H30(0.8-1M)P10 DMT3:1。
实施例23
步骤S1、配制200mM的MES缓冲溶液，并用1M的HCL调节pH至7-8，加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度为0mg/mL，搅拌均匀；
步骤S2、将分子量为80-100万Da的透明质酸钠溶解于步骤S1所得溶液中，超声使其完全溶解，使混合溶液中透明质酸钠的质量浓度为30mg/mL；
步骤S3、加入分子量为1kDa的聚乙二醇二胺，使混合溶液中聚乙二醇二胺的质量浓度为10mg/mL，搅拌均匀；
步骤S4、加入DMTMM，使混合溶液中活化剂的质量浓度分别为18mg/mL(DMTMM中氨基与步骤S1的透明质酸钠中羧基的摩尔比例为3:1)，搅拌均匀，室温反应1-3h，得到水凝胶E0 H30(0.8-1M)P10 DMT3:1。
实施例24
步骤S1、配制200mM的MES缓冲溶液，并用1M的HCL调节pH至7-8，加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度为10mg/mL，搅拌均匀；
步骤S2、将分子量为40w的羧甲基壳聚糖溶解于步骤S1所得溶液中，超声使其完全溶解，使混合溶液中羧甲基壳聚糖的质量浓度为30mg/mL；
步骤S3、加入分子量为1kDa的聚乙二醇二胺，使混合溶液中聚乙二醇二胺的质量浓度为10mg/mL，搅拌均匀；
步骤S4、加入交联活化剂DMTMM，使混合溶液中活化剂的质量浓度分别为18mg/mL(DMTMM中氨基与步骤S1的羧甲基壳聚糖中羧基的摩尔比例为3：1)，搅拌均匀，室温反应1-3h，得到水凝胶E10 H30(40w)P10 DMT3：1。
实施例25
步骤S1、配制200mM的MES缓冲溶液，并用1M的HCL调节pH至7-8，加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度为20mg/mL，搅拌均匀；
步骤S2、将分子量为40w的羧甲基壳聚糖溶解于缓冲溶液中，超声使其完全溶解，使混合溶液中羧甲基壳聚糖的质量浓度为20mg/mL；
步骤S3、加入分子量为1kDa的聚乙二醇二胺，使混合溶液中聚乙二醇二胺的质量浓度为10mg/mL，搅拌均匀；
步骤S4、加入交联活化剂DMTMM，使混合溶液中活化剂的质量浓度分别为18mg/mL(DMTMM中氨基与步骤S1的羧甲基壳聚糖中羧基的摩尔比例为3：1)，搅拌均匀，室温反应1-3h，得到水凝胶E20 H20(40w)P10 DMT3：1。
实施例26
步骤S1、配制200mM的MES缓冲溶液，并用1M的HCL调节pH至7-8，加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度为30mg/mL，搅拌均匀；
步骤S2、将分子量为40w的羧甲基壳聚糖溶解于缓冲溶液中，超声使其完全溶解，使混合溶液中羧甲基壳聚糖的质量浓度为10mg/mL；
步骤S3、加入分子量为1kDa的聚乙二醇二胺，使混合溶液中聚乙二醇二胺的质量浓度为10mg/mL，搅拌均匀；
步骤S4、加入交联活化剂DMTMM，使混合溶液中活化剂的质量浓度分别为18mg/mL(DMTMM中氨基与步骤S1的羧甲基壳聚糖中羧基的摩尔比例为3：1)，搅拌均匀，室温反应1-3h，得到水凝胶E30 H10(40w)P10 DMT3：1。
实施例27
步骤S1、配制50mM的MES缓冲溶液，并用1M的NaOH调节pH至6-7，加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度为15mg/mL，搅拌均匀；
步骤S2、将分子量为20w的海藻酸钠溶解于步骤S1所得溶液中，超声使其完全溶解，使混合溶液中海藻酸钠的质量浓度分别为15mg/mL；
步骤S3、加入交联活化剂EDC，使混合溶液中活化剂的质量浓度为20mg/mL，搅拌均匀，室温反应4-6h，得到水凝胶E15 H15(20w)。
实施例28
步骤S1、配制50mM的MES缓冲溶液，并用1M的NaOH调节pH至6-7，加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度20mg/mL，搅拌均匀；
步骤S2、将分子量为20w的海藻酸钠溶解于步骤S1所得溶液中，超声使其完全溶解，使混合溶液中海藻酸钠的质量浓度为20mg/mL；
步骤S3、加入交联活化剂EDC，使混合溶液中活化剂的质量浓度为20mg/mL，搅拌均匀，室温反应4-6h，得到水凝胶E20 H20(20w)。
对比例1
所述羧甲基壳聚糖与所述人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量比为15:1，其他均同实施例7；具体地：
步骤S1、配制50mM的MES缓冲溶液，并用1M的NaOH调节pH至6-7，加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度为75mg/mL，搅拌均匀；
步骤S2、将分子量为80-100万Da的透明质酸钠溶解于步骤S1所得溶液中，超声使其完全溶解，使混合溶液中羧甲基壳聚糖的质量浓度为5mg/mL；
步骤S3、加入交联活化剂EDC，使混合溶液中活化剂的质量浓度为20mg/mL，搅拌均匀，室温反应4-6h，得到水凝胶，由于所述羧甲基壳聚糖与所述人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量比过小，生物活性欠缺。
对比例2
所述羧甲基壳聚糖与所述人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量比为1:15，其他均同实施例7；具体地：
步骤S1、配制50mM的MES缓冲溶液，并用1M的NaOH调节pH至6-7，加入人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液，使混合溶液中人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量浓度为5mg/mL，搅拌均匀；
步骤S2、将分子量为80-100万Da的透明质酸钠溶解于步骤S1所得溶液中，超声使其完全溶解，使混合溶液中羧甲基壳聚糖的质量浓度为75mg/mL；
步骤S3、加入交联活化剂EDC，使混合溶液中活化剂的质量浓度为20mg/mL，搅拌均匀，室温反应4-6h，得到水凝胶，由于所述羧甲基壳聚糖与所述人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量比过小，降解时间过快。
将上述实施例1-实施例28和对比例的各参数列表如表1所示。
表1
Figure BDA0002831461340000171
Figure BDA0002831461340000181
Figure BDA0002831461340000191
Figure BDA0002831461340000201
实验例1
取实施例17-实施例19、实施例20-实施例23中的水凝胶，分别检测其在PBS溶液中的溶胀性能，检测方法如下：测试水凝胶在PBS溶液中浸泡一定时间后检测。
检测结果如图1所示。
由图1可知，两组水凝胶均在24h左右达到溶胀平衡，溶胀率最大的可达到215％，最小的可达到37％。该结果表明了此类水凝胶具有较好的溶胀性能。
实验例2
取实施例1-23中的水凝胶，分别检测其在0.1g/mL胶原蛋白酶中的降解性能，检测方法为：测试水凝胶在酶溶液中浸泡一定时间后的质量变化。
降解性能的检测结果如图2所示。
由图2可知，随着透明质酸钠分子量及比例的增加，交联活化剂比例的增加，水凝胶降解变慢；交联剂的引入，使水凝胶由16h完全酶解到80h仍稳定存在，有效改进了水凝胶的降解性能。该结果表明了天然分子和人工合成分子的引入，可有效调控水凝胶的理化性质，改进水凝胶降解速度过快等问题，以满足应用要求。
实验例3
取实施例20-实施例23中的水凝胶清洗液，用紫外分光光度计扫描紫外吸收光谱，通过比较不同清洗时间紫外吸收峰强度，反映水凝胶产物中交联活化剂、交联剂及中间产物残留情况。
由图3可知，12-48h，残留物吸收峰强度逐渐减弱；清洗48h左右，吸收峰强度接近于0，则水凝胶产物中残留物浓度已很低。即清洗48h左右可明显去除水凝胶中残留物，从而得到生物相容性较好，毒性较低，适用于软组织填充或组织修复的水凝胶材料。
实验例4
取实施例20-实施例23中水凝胶共培养24h，固定细胞，并用DAPI和Phalloadin568对细胞核和细胞骨架进行染色，激光共聚焦扫描显微镜观察其细胞核和细胞骨架，如图4、图5所示。其中，对照组是PS孔板。
由图4、5可知，细胞可在水凝胶表面实现正常的粘附铺展及生长，结果表明，该类水凝胶有利于应用于组织工程。
实验例5
将纯化过的间充质干细胞细胞外基质复合蛋白进行纯化后8％PAGE-SDS蛋白凝胶电泳，如图6所示。
由图6可知，经过和商品化colI做对比，经纯化的细胞外基质含有I型胶原的a1和a2链，且不含有溶解蛋白所用的猪胃蛋白酶。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明实施例的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明实施例范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种改动和变型而不脱离本发明实施例的精神和范围。这样，倘若本发明实施例的这些修改和变型属于本发明实施例权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明实施例也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (2)

1.一种基于人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液水凝胶的制备方法，其特征在于，所述水凝胶模量为0.01-100kPa，所述方法包括：
将人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液溶解于缓冲溶液中，获得质量浓度为10～30mg/mL的蛋白溶液，所述缓冲溶液的浓度为50～200mM；所述缓冲溶液的pH为6～7；
将所述蛋白溶液加入天然分子和人工合成分子混匀，获得混合溶液；所述人工合成分子的使用终浓度为20～80mg/mL；所述天然分子的使用终浓度为10～80mg/mL；
将所述混合溶液加入交联活化剂混匀以进行交联反应，获得交联反应液；所述交联活化剂的使用终浓度为1～30mg/mL，所述交联活化剂中的功能基团与所述天然分子的功能基团产生交联反应；所述交联活化剂中活化基团与所述天然分子中的参与交联反应的功能基团摩尔比例为（1～5）：1，所述功能基团为羧基；
将所述交联反应液进行纯化处理，获得基于人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液水凝胶；
所述交联活化剂包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、4-(4,6-二甲氧基三嗪-2-基)-4-甲基吗啉盐酸盐、1-羟基苯并三氮唑和六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷中的至少一种；
所述缓冲溶液包括磷酸盐缓冲液、2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲液和硼酸盐缓冲液中的至少一种；
所述人工合成分子包括聚乙二醇二胺、1,4-丁二醇二缩水甘油醚、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚缩水甘油、聚碳酸酯和聚酰胺中的至少一种；
所述天然分子包括透明质酸、羧甲基壳聚糖、海藻酸钠、硫酸软骨素、明胶和丝素蛋白中的至少一种；
所述天然分子与所述人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液的质量比为(1～10)：(1～10)。
2.一种采用权利要求1所述方法制备得到的基于人间充质干细胞细胞外基质来源复合胶原蛋白提取液水凝胶。
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