CN103961749B - 一种制备胶原蛋白/硅胶膜双层支架的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备胶原蛋白/硅胶膜双层支架的方法。本发明通过不同的交联方法,制备具有多孔网络结构的胶原蛋白海绵,再在胶原蛋白海绵上涂布一层不同厚度的硅胶膜,即可制备得到胶原蛋白/硅胶膜双层支架。本发明所得的胶原蛋白/硅胶膜双层支架在作为人工皮肤支架材料的应用中,具有良好的功效,两层材料发挥不同的作用:外层硅胶膜较高的力学强度能够支撑保护伤口,良好的气液通透性能有效防止体液流失,适度的致密性能防止细菌感染,能为伤口修复提供一个相对湿润的环境;内层胶原蛋白海绵能有效促进细胞的增殖分化、延迟伤口收缩、加速伤口愈合。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备胶原蛋白/硅胶膜双层支架的方法。本发明所制得的双层支架应用于组织伤口修复材料、组织工程皮肤支架材料、人工皮肤等领域。
背景技术
近年来,随着细胞生物学、分子生物学以及生物材料学的迅速发展,组织工程学也取得了巨大的进展,其中皮肤组织工程学的发展尤为引人注目,在体外构建组织工程化皮肤的过程中,种子细胞所赖以存在的支架材料一直是研究的热点之一。皮肤组织工程支架材料要为细胞提供黏附、增殖以及迁移的空间环境,在人工皮肤的构建中起着重要作用,是组织工程的三要素之一。胶原蛋白(Col)作为构建细胞外基质骨架的主要成分之一,一直以来是一种应用较广泛的人工皮肤支架材料,具有低免疫原性、良好的生物相容性和生物降解性。胶原蛋白基支架材料在创面修复过程中,能吸收伤口渗出液,在作为细胞生长基材的同时,能与宿主细胞外基质相互作用形成网状结构,该结构对上皮细胞的移行起锚定、网络作用,能促进细胞在新生组织上的粘附、生长、移动和沉积,并能促进细胞的诱导分化及成纤维细胞的趋化,延缓伤口收缩,加速创伤愈合。但在实际应用过程中,胶原蛋白基支架材料也暴露出了一些问题,如力学强度不够,对组织的支撑力度不足;由于过度溶胀会失去其固有的形态结构;抗酶降解能力差,降解速率过快等。所以,目前研究较为广泛的是将胶原蛋白和其他合成高分子或天然高分子材料复合制备得到胶原基复合材料,以弥补单独胶原蛋白材料在应用中存在的一些问题。
医用硅胶具有良好的生物相容性,对人体组织无刺激性、无毒性、无过敏反应、机体免疫排斥反应极少;具有良好的理化特性,透明性高、气液通透性好,与体液以及组织接触过程中能保持其原有的弹性和柔软度,不被降解,是一种相当稳定的惰性物质。用硅胶膜与胶原蛋白复合形成的双层支架,硅胶膜作为胶原蛋白材料的基底膜,其较好的力学强度能对局部组织起到一定的支撑作用,同时能保持支架固有的形态结构;致密的膜层结构,能防止细菌的侵入和感染;良好的气液通透性,能为创面修复提供一个相对湿润的环境。
基于胶原蛋白、医用硅胶的不同特性及其在创面修复上发挥的不同作用,国外有很多学者以此为基材制备了不同类型的人工皮肤材料应用于创面修复的不同领域。和是两个已经商品化的胶原蛋白基敷料, 是由胶原、硫酸软骨素-6共价交联制成的多孔结构海绵作为“真皮”层,硅橡胶薄膜作为“表皮”制成的双层结构敷料,是以纯胶原海绵为“真皮”层,硅橡胶薄膜为“表皮”层,硅橡胶薄膜作为临时性的“表皮”,为创面提供力学支撑,并能在创面愈合初期控制水分流失、防止细菌感染;多孔的胶原蛋白真皮替代物,能诱导成核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞的聚集,促进毛细血管的生长,进而形成新的血管网络,但是其机械强度还有待提高,“真皮”层的多孔网络结构有待改进。本发明在此基础上通过硅胶膜的复合和交联蛋白海绵的交联改性,进一步增强胶原蛋白/硅胶膜双层支架的力学性能,以满足其作为支架材料的强度要求;同时通过胶原蛋白浓度、冻干工艺和交联改性体系的调整,使胶原蛋白海绵具有排列有序的多孔网络结构,且孔径大小适合细胞的植入,胶原蛋白海绵的降解周期满足创面修复愈合全过程的要求。综上所述,本发明制备的胶原蛋白/硅胶膜双层支架具有作为理想的支架材料应用于创面修复的巨大潜能,同时能为组织工程化皮肤的制备提供良好的基材,开发出性能更为优越的人工皮肤。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备胶原蛋白/硅胶膜双层支架的方法。本发明制得的复合支架克服了现今皮肤支架材料在临床应用中机械性能差、抗降解性差、伤口愈合缓慢等问题。操作过程简单,制备得到的复合支架具有良好的机械性能、气液通透性和生物相容性,且材料孔径大小适合细胞的植入,降解周期符合伤口愈合全过程的要求,能为组织工程化皮肤的制备提供良好的基材,以制备出性能更加优越的人工皮肤。
本发明的技术方案为:
一种制备胶原蛋白/硅胶膜双层支架的方法,包括以下步骤:
A.将胶原蛋白水溶液通过冻干-固态交联-二次冻干技术,得到具有多孔网络结构的胶原蛋白海绵;
B.用胶枪将一定量的硅胶打在胶原蛋白海绵上,然后用不锈钢刮刀在胶原蛋白海绵上涂布一层均匀的硅胶膜,室温下固化,即得胶原蛋白/硅胶膜双层支架。
所述的胶原蛋白水溶液的浓度为0.5%~3%。
所述的步骤A制备胶原蛋白海绵采用热交联体系,或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)/N-羟基丁二酰亚胺(NHS)交联体系,或戊二醛交联体系进行胶原蛋白海绵的交联改性。
所述的热交联体系中交联温度为80~130oC,交联时间为48~120h。
所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)/N-羟基丁二 酰亚胺(NHS)交联体系中EDC的交联浓度为5~30mmol/L,NHS的浓度为1.25~7.5mmol/L,Lys的浓度为1~10mmol/L,交联温度为4~37℃,交联时间为1~24h。
所述的戊二醛交联体系中,戊二醛的浓度为0.1%~3%,交联温度为4~37oC,交联时间为1~24h。
所述的步骤B后在室温下固化12~24h。
所述的步骤A制备胶原蛋白海绵的厚度为1~5mm。
所述的步骤B涂布硅胶膜的厚度为0.1~0.5mm。
一种胶原蛋白/硅胶膜双层支架,由以上所述的方法制得。
本发明的有益效果:
(1)本发明制备得到的胶原蛋白/硅胶膜双层支架,具有良好的机械性能,对局部组织起一定的支撑作用,同时具有良好的阻菌性和气液通透性,能为伤口修复提供一个相对湿润的环境,促进伤口的快速愈合;
(2)本发明制备得到的胶原蛋白/硅胶膜双层支架,能有效促进细胞的增殖分化及血管化、延迟伤口收缩、加速伤口愈合。
(3)通过物理复合法制备得到的本发明制备得到的胶原蛋白/硅胶膜双层支架,硅胶具有很强的粘合性,与胶原蛋白海绵层结合牢固。同时,当胶原酶解释放后,硅胶膜还能保持良好的形状。
(4)本发明制备得到的胶原蛋白/硅胶膜双层支架,作为“真皮”层的胶原蛋白海绵具有适合细胞植入的孔径大小,且多孔网络结构规则有序;同时其降解周期符合创面修复愈合全过程的要求。
(5)本发明制备得到的胶原蛋白/硅胶膜双层支架,可用于组织修复、组织工程支架、人工皮肤等领域。
(6)本发明制备的制备得到的胶原蛋白/硅胶膜双层支架,材料的大小和厚度可控,同时其制备方法简单,工艺成熟,易于工业化。
具体实施方式
本发明涉及先通过冻干-固态交联-二次冻干的方法制备得到胶原蛋白海绵,然后在胶原蛋白海绵上涂布一层硅橡胶膜,室温下固化后,得到胶原蛋白/硅胶膜双层支架。
本发明所使用的胶原蛋白水溶液为冻干的胶原蛋白溶于水中配置的浓度为0.5%~3%的胶原蛋白水溶液,胶原蛋白海绵的厚度为1~5mm。
根据胶原蛋白分子结构的特点,本发明采用使用热交联、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)/N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、戊二醛交联体 系进行胶原蛋白海绵的交联改性,如热交联体系主要是通过脱水导致胶原蛋白分子间的交联;EDC/NHS体系主要是使胶原蛋白分子中或分子间的―NH2和―COOH发生缩合反应形成肽键,从而达到交联的目的;戊二醛体系只要是通过戊二醛分子中的―CHO与胶原蛋白分子中的―NH2反应形成席夫碱,从而达到交联的目的。所述热交联体系中,交联温度为80~130oC,交联时间为48~120h;EDC/NHS交联体系中EDC的交联浓度为5~30mmol/L,NHS的浓度为1.25~7.5mmol/L,Lys的浓度为1~10mmol/L,交联温度为4~37℃,交联时间为1~24h;戊二醛交联体系中,戊二醛的浓度为0.1%~3%,交联温度为4~37oC,交联时间为1~24h。
所述的硅胶膜的厚度为0.1~0.5mm。
以下通过具体实例对本发明的一种制备胶原蛋白/硅胶膜双层支架的方法做进一步说明。需要说明的是本发明的保护范围不受限于实施例所述的范围。
实施例1
将0.5%的胶原蛋白水溶液冷冻干燥成50×50×5mm大小的胶原蛋白海绵,采用热交联体系,将胶原蛋白海绵在80℃真空干燥箱内交联48h。交联完后,在胶原蛋白海绵上涂布一层硅胶膜,厚度为0.5mm,室温下固化24h。固化后即得胶原蛋白/硅胶膜双层支架。制得的双层支架的性能见表一。
实施例2
将1%的胶原蛋白水溶液冷冻干燥成50×50×4mm大小的胶原蛋白海绵,采用热交联体系,将胶原蛋白海绵在90℃真空干燥箱内交联60h。交联完后,在胶原蛋白海绵上涂布一层硅胶膜,厚度为0.4mm,室温下固化24h。固化后即得胶原蛋白/硅胶膜双层支架。制得的双层支架的性能见表一。
实施例3
将1.5%的胶原蛋白水溶液冷冻干燥成50×50×3.5mm大小的胶原蛋白海绵,采用热交联体系,将胶原蛋白海绵在100℃真空干燥箱内交联72h。交联完后,在胶原蛋白海绵上涂布一层硅胶膜,厚度为0.35mm,室温下固化24h。固化后即得胶原蛋白/硅胶膜双层支架。制得的双层支架的性能见表一。
实施例4
将2%的胶原蛋白水溶液冷冻干燥成50×50×3mm大小的胶原蛋白海绵,采用热交联体系,将胶原蛋白海绵在110℃真空干燥箱内交联84h。交联完后,在胶原蛋白海绵上涂布一层硅胶膜,厚度为0.3mm,室温下固化24h。固化后 即得胶原蛋白/硅胶膜双层支架。制得的双层支架的性能见表一。
实施例5
将2.5%的胶原蛋白水溶液冷冻干燥成50×50×2mm大小的胶原蛋白海绵,采用热交联体系,将胶原蛋白海绵在120℃真空干燥箱内交联96h。交联完后,在胶原蛋白海绵上涂布一层硅胶膜,厚度为0.2mm,室温下固化24h。固化后即得胶原蛋白/硅胶膜双层支架。制得的双层支架的性能见表一。
实施例6
将3%的胶原蛋白水溶液冷冻干燥成50×50×1mm大小的胶原蛋白海绵,采用热交联体系,将胶原蛋白海绵在130℃真空干燥箱内交联120h。交联完后,在胶原蛋白海绵上涂布一层硅胶膜,厚度为0.1mm,室温下固化24h。固化后即得胶原蛋白/硅胶膜双层支架。制得的双层支架的性能见表一。
实施例7
将0.5%的胶原蛋白水溶液冷冻干燥成50×50×5mm大小的胶原蛋白海绵,采用EDC/NHS交联体系,将胶原蛋白海绵浸泡在EDC浓度为5mmol/L、NHS浓度为1.25mmol/L、Lys浓度为1mmol/L的95%的乙醇溶液中,4℃下摇动反应1h。待反应结束,用去离子水清洗胶原海绵数次,以除去未反应的EDC和NHS,然后二次冻干。冻干后,在胶原蛋白海绵上涂布一层硅胶膜,厚度为0.1mm,室温下固化24h。固化后即得胶原蛋白/硅胶膜双层支架。制得的双层支架的性能见表一。
实施例8
将0.8%的胶原蛋白水溶液冷冻干燥成50×50×4mm大小的胶原蛋白海绵,采用EDC/NHS交联体系,将胶原蛋白海绵浸泡在EDC浓度为10mmol/L、NHS浓度为2.5mmol/L、Lys浓度为3mmol/L的95%的乙醇溶液中,10℃下摇动反应4h。待反应结束,用去离子水清洗胶原海绵数次,以除去未反应的EDC和NHS,然后二次冻干。冻干后,在胶原蛋白海绵上涂布一层硅胶膜,厚度为0.4mm,室温下固化24h。固化后即得胶原蛋白/硅胶膜双层支架。制得的双层支架的性能见表一。
实施例9
将1.2%的胶原蛋白水溶液冷冻干燥成50×50×3mm大小的胶原蛋白海绵,采用EDC/NHS交联体系,将胶原蛋白海绵浸泡在EDC浓度为15mmol/L、NHS 浓度为3.75mmol/L、Lys浓度为5mmol/L的95%的乙醇溶液中,15℃下摇动反应8h。待反应结束,用去离子水清洗胶原海绵数次,以除去未反应的EDC和NHS,然后二次冻干。冻干后,在胶原蛋白海绵上涂布一层硅胶膜,厚度为0.3mm,室温下固化24h。固化后即得胶原蛋白/硅胶膜双层支架。制得的双层支架的性能见表一。
实施例10
将1.5%的胶原蛋白水溶液冷冻干燥成50×50×2.5mm大小的胶原蛋白海绵,采用EDC/NHS交联体系,将胶原蛋白海绵浸泡在EDC浓度为20mmol/L、NHS浓度为5mmol/L、Lys浓度为7mmol/L的95%的乙醇溶液中,20℃下摇动反应12h。待反应结束,用去离子水清洗胶原海绵数次,以除去未反应的EDC和NHS,然后二次冻干。冻干后,在胶原蛋白海绵上涂布一层硅胶膜,厚度为0.25mm,室温下固化24h。固化后即得胶原蛋白/硅胶膜双层支架。制得的双层支架的性能见表一。
实施例11
将2%的胶原蛋白水溶液冷冻干燥成50×50×2mm大小的胶原蛋白海绵,采用EDC/NHS交联体系,将胶原蛋白海绵浸泡在EDC浓度为25mmol/L、NHS浓度为6.25mmol/L、Lys浓度为9mmol/L的95%的乙醇溶液中,25℃下摇动反应18h。待反应结束,用去离子水清洗胶原海绵数次,以除去未反应的EDC和NHS,然后二次冻干。冻干后,在胶原蛋白海绵上涂布一层硅胶膜,厚度为0.2mm,室温下固化24h。固化后即得胶原蛋白/硅胶膜双层支架。制得的双层支架的性能见表一。
实施例12
将2.5%的胶原蛋白水溶液冷冻干燥成50×50×1mm大小的胶原蛋白海绵,采用EDC/NHS交联体系,将胶原蛋白海绵浸泡在EDC浓度为30mmol/L、NHS浓度为7.5mmol/L、Lys浓度为10mmol/L的95%的乙醇溶液中,30℃下摇动反应24h。待反应结束,用去离子水清洗胶原海绵数次,以除去未反应的EDC和NHS,然后二次冻干。冻干后,在胶原蛋白海绵上涂布一层硅胶膜,厚度为0.1mm,室温下固化24h。固化后即得胶原蛋白/硅胶膜双层支架。制得的双层支架的性能见表一。
实施例13
将0.5%的胶原蛋白水溶液冷冻干燥成50×50×5mm大小的胶原蛋白海绵,采用戊二醛交联体系,将胶原蛋白海绵浸泡在浓度为0.1%的戊二醛溶液中,4℃下摇动反应1h。待反应结束,用去离子水清洗胶原海绵数次,以除去未反应的戊二醛,然后二次冻干。冻干后,在胶原蛋白海绵上涂布一层硅胶膜,厚度为0.5mm,室温下固化24h。固化后即得胶原蛋白/硅胶膜双层支架。制得的双层支架的性能见表一。
实施例14
将1%的胶原蛋白水溶液冷冻干燥成50×50×4mm大小的胶原蛋白海绵,采用戊二醛交联体系,将胶原蛋白海绵浸泡在浓度为0.5%的戊二醛溶液中,10℃下摇动反应4h。待反应结束,用去离子水清洗胶原海绵数次,以除去未反应的戊二醛,然后二次冻干。冻干后,在胶原蛋白海绵上涂布一层硅胶膜,厚度为0.4mm,室温下固化24h。固化后即得胶原蛋白/硅胶膜双层支架。制得的双层支架的性能见表一。
实施例15
将1.5%的胶原蛋白水溶液冷冻干燥成50×50×3mm大小的胶原蛋白海绵,采用戊二醛交联体系,将胶原蛋白海绵浸泡在浓度为1%的戊二醛溶液中,15℃下摇动反应8h。待反应结束,用去离子水清洗胶原海绵数次,以除去未反应的戊二醛,然后二次冻干。冻干后,在胶原蛋白海绵上涂布一层硅胶膜,厚度为0.3mm,室温下固化24h。固化后即得胶原蛋白/硅胶膜双层支架。制得的双层支架的性能见表一。
实施例16
将2%的胶原蛋白水溶液冷冻干燥成50×50×2mm大小的胶原蛋白海绵,采用戊二醛交联体系,将胶原蛋白海绵浸泡在浓度为1.5%的戊二醛溶液中,20℃下摇动反应12h。待反应结束,用去离子水清洗胶原海绵数次,以除去未反应的戊二醛,然后二次冻干。冻干后,在胶原蛋白海绵上涂布一层硅胶膜,厚度为0.2mm,室温下固化24h。固化后即得胶原蛋白/硅胶膜双层支架。制得的双层支架的性能见表一。
实施例17
将2.5%的胶原蛋白水溶液冷冻干燥成50×50×1.5mm大小的胶原蛋白海绵,采用戊二醛交联体系,将胶原蛋白海绵浸泡在浓度为2%的戊二醛溶液中,25℃下摇动反应18h。待反应结束,用去离子水清洗胶原海绵数次,以除去未反应 的戊二醛,然后二次冻干。冻干后,在胶原蛋白海绵上涂布一层硅胶膜,厚度为0.15mm,室温下固化24h。固化后即得胶原蛋白/硅胶膜双层支架。制得的双层支架的性能见表一。
实施例18
将3%的胶原蛋白水溶液冷冻干燥成50×50×1mm大小的胶原蛋白海绵,采用戊二醛交联体系,将胶原蛋白海绵浸泡在浓度为3%的戊二醛溶液中,37℃下摇动反应24h。待反应结束,用去离子水清洗胶原海绵数次,以除去未反应的戊二醛,然后二次冻干。冻干后,在胶原蛋白海绵上涂布一层硅胶膜,厚度为0.1mm,室温下固化24h。固化后即得胶原蛋白/硅胶膜双层支架。制得的双层支架的性能见表一。
实施例19
实施例1-18中制备的复合材料的性能见下表(表一):
(1)拉伸强度计算公式:
式中:F—断裂前试样承受的最大载荷,N;
S—试样的横截面积,m2。
(2)断裂伸长率计算公式:
式中:Δl—伸长量,mm;
l0—标距,mm。
(3)溶胀度计算公式:
溶胀度=(Wt-W0)/W0
式中:W0—支架干重,g;
Wt—支架吸收PBS溶胀饱和后的重量,g。
(4)体外降解率计算公式:
体外降角率(%)=100Wt/W0
式中:W0—胶原蛋白海绵中初始羟脯氨酸含量
Wt—t时刻降解液中羟脯氨酸含量。
Claims (2)
1.一种制备胶原蛋白/硅胶膜双层支架的方法,包括以下步骤:
A.将胶原蛋白水溶液,然后通过冻干-固态交联-二次冻干技术,得到具有多孔网络结构的胶原蛋白海绵;所述胶原蛋白水溶液的浓度为0.5%~3%;
所述制备胶原蛋白海绵采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)/N-羟基丁二酰亚胺(NHS)交联体系进行胶原蛋白海绵的交联改性;
所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)/N-羟基丁二酰亚胺(NHS)交联体系中EDC的交联浓度为5~30mmol/L,NHS的浓度为1.25~7.5mmol/L,Lys的浓度为1~10mmol/L,交联温度为4~37℃,交联时间为1~24h;
所述胶原蛋白海绵的厚度为1~5mm;
B.用胶枪将一定量的硅胶打在胶原蛋白海绵上,然后用不锈钢刮刀在胶原蛋白海绵上涂布一层均匀的硅胶膜,室温下固化12~24h,即得胶原蛋白/硅胶膜双层支架;
所述涂布硅胶膜的厚度为0.1~0.5mm。
2.一种胶原蛋白/硅胶膜双层支架,其特征在于,根据权利要求1所述的方法制得。
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