CN113144294B - 三维多孔胶原支架的制备方法及三维多孔胶原支架、双层胶原支架及制备方法和应用 - Google Patents

三维多孔胶原支架的制备方法及三维多孔胶原支架、双层胶原支架及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种三维多孔胶原支架的制备方法及三维多孔胶原支架、双层胶原支架及制备方法和应用，涉及生物医用材料技术领域，所述三维多孔胶原支架按照以下步骤制备得到：将胶原溶液进行冷冻干燥处理后，依次进行压合处理和热处理，得到三维多孔胶原支架。本发明提供的三维多孔胶原支架的制备方法通过在冷冻干燥和热处理之间设置压合处理，在不引用交联剂的情况下，制备得到的三维多孔胶原支架不仅具有优异的力学性能、耐降解性能和生物相容性，而且具有良好的尺寸稳定性(尤其在润湿状态)和热稳定性，同时能够在保证力学性能的前提下，依然保持胶原的三维多孔结构，使其具有优异的诱导组织再生性。

Description

三维多孔胶原支架的制备方法及三维多孔胶原支架、双层胶 原支架及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其是涉及一种三维多孔胶原支架的制备方法及三维多孔胶原支架、双层胶原支架及制备方法和应用。
背景技术
胶原是细胞外基质的一种结构蛋白质，起着支撑器官、保护机体的功能。胶原分子具有独特的三级结构，其一级结构是甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸等氨基酸以肽键相链接；二级结构指肽链在空间上形成左手螺旋；三级结构指三条左手螺旋的多肽链依靠离子键、氢键等作用力，形成右手超螺旋结构。这个超螺旋结构使胶原的性质十分稳定，具有其他合成材料无法比拟的组织相容性、低免疫原性、吸水性能等。优良的生物学性质使胶原蛋白材料成为生物材料等领域的研究热点，具有极大的市场发展空间及潜力，尤其是作为生物支架材料，理想的生物支架材料需要合适的降解速率和一定的力学性能，但传统胶原基支架材料存在的缺点如：耐降解性能不足，机械性能较弱，在应用过程中难以维持其固有形态，因此限制了其应用。
现有一般采用高温、紫外线、γ射线等物理改性、加入戊二醛等交联剂进行化学交联或调整工艺参数的方法来提高胶原支架的力学强度，但是上述物理改性方法只能小幅改善胶原支架的力学性能，无法满足应用需求，而化学交联容易有交联剂残留，导致生物毒性，而调整工艺参数容易造成胶原多孔支架材料的孔径减小，不利于细胞增殖，影响胶原支架的诱导组织再生性。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种三维多孔胶原支架的制备方法，以通过对胶原溶液依次进行冷冻干燥处理、压合处理和热处理，在不引入化学交联剂的情况下，达到提高力学性能的目的。
本发明的目的之二在于提供采用上述制备方法制备得到的三维多孔胶原支架。
本发明的目的之三在于提供一种双层胶原支架，包括基层及设置于基层上的三维多孔胶原支架。
本发明的目的之四在于提供双层胶原支架的制备方法。
本发明的目的之五在于提供上述三维多孔胶原支架或双层胶原支架在制备组织再生修复产品、组织工程产品、止血材料、医用辅料和药物载体中的应用。
第一方面，本发明提供的三维多孔胶原支架的制备方法，按照以下步骤制备得到：将胶原溶液进行冷冻干燥处理后，依次进行压合处理和热处理，得到三维多孔胶原支架。
进一步的，进行压合处理的压合力为0.1-1MPa，压合时间为5-60min；
优选地，进行压合处理的压合力为0.4-0.8MPa，压合时间为40-60min。
进一步的，所述热处理的温度为110-130℃，保持时间为24-36h；
优选地，热处理的温度为110-120℃，保持时间为24-36h。
进一步的，所述冷冻干燥处理包括依次进行的第一冷冻阶段、第二冷冻阶段和室温阶段，其中，第一冷冻阶段的温度为-40～-10℃，保持时间为1-6h，第二冷冻阶段的温度为-10～0℃，保持时间为12-48h，室温阶段保持时间为1-2h；
优选地，第一冷冻阶段的温度为-30～-20℃；
优选地，第二冷冻阶段的保持时间为24-36h。
进一步的，所述胶原溶液的质量浓度为0.1-2％，优选为0.5-1.5％；
优选地，所述胶原溶液由胶原溶解于醋酸溶液中制备而成，所述醋酸溶液的浓度为0.01-1mol/L，优选为0.02-0.5mol/L；
优选地，所述胶原为Ⅰ型胶原，胶原纯度为95-99.9％，优选为98-99.5％。
第二方面，本发明提供了一种三维多孔胶原支架，主要由本发明第一方面提供的三维多孔胶原支架的制备方法制备而成。
优选地，所述三维多孔胶原支架的孔径为10-500μm，孔隙率≥95％。
第三方面，本发明提供了一种双层胶原支架，包括基层，所述基层上设置有本发明第二方面提供的三维多孔胶原支架。
进一步的，所述双层胶原支架的厚度为1-5mm，其中，所述基层的厚度为0.1-1mm，所述三维多孔胶原支架的厚度为1-4mm；
优选地，所述基层的孔隙率＜25％，孔径为1-50μm；
优选地，所述基层的含水量为1-10％，优选为2-5％；
优选地，所述基层主要由胶原和/或天然高分子制备而成；
优选地，所述天然高分子包括纤维素、壳聚糖、透明质酸、明胶、丝素蛋白和淀粉中的至少一种。
第四方面，本发明提供了上述双层胶原支架的制备方法，按照以下步骤制备得到：先制备基层，然后在基层上倒入胶原溶液，依次进行冷冻干燥、压合处理和热处理，得到双层胶原支架；
优选地，基层按照以下方法制备得到：将含有基层物质的溶液依次进行冷冻干燥和压合处理，得到基层；
优选地，所述基层的含水量为1-10％，优选为2-5％；
优选地，制备基层时，冷冻干燥包括以下步骤：先将含有基层物质的溶液在-40～-10℃冷冻1-6h，然后升高温度，在-10～0℃保持12-48h，再在室温放置5-10min；
优选地，制备基层时，进行压合处理的压合力为0.1-1MPa,压合时间为5-60min；
优选地，制备基层时，进行压合处理的压合力为0.2-0.5MPa，压合时间为40-60min。
第五方面，本发明提供了第二方面提供的三维多孔胶原支架或第三方面提供的双层胶原支架在制备组织再生修复产品、组织工程产品、止血材料、医用辅料和药物载体中的应用；
优选地，所述组织再生修复产品包括硬脑膜补片、硬脊膜补片、肩袖补片、疝补片、乳房补片、眼科补片、外科补片、口腔修复膜、骨科修复材料和医美产品中的至少一种。
本发明提供的三维多孔胶原支架的制备方法通过在冷干燥和热处理之间设置压合处理，在不引用交联剂的情况下，制备得到的三维多孔胶原支架不仅具有优异的力学性能、耐降解性能和生物相容性，而且具有良好的尺寸稳定性(尤其在润湿状态)和热稳定性，同时能够在保证力学性能的前提下，依然保持胶原的三维多孔结构，使其具有优异的诱导组织再生性。
本发明提供的双层胶原支架通过在三维多孔支架底部设置基层，使得双层胶原支架在将保持良好的组织再生性的同时，具有更为优异的力学性能、尺寸稳定性和耐降解性能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例1-1提供的胶原支架的SEM图；
图2为分别利用伪狂犬病毒(PRV)和水泡性口炎病毒(VSV)对实施例1-1提供的胶原支架样品处理后，进行热处理灭活的时间效果图；
图3为实施例1-1提供的胶原支架植入新西兰白兔伤口内1个月、3个月和6个月时的组织标本染色图；
图4为实施例2-1提供的双层胶原支架中基层的SEM图；
图5为实施例2-1提供的双层胶原支架中上层三维多孔胶原支架的SEM图；
图6为分别利用伪狂犬病毒(PRV)和水泡性口炎病毒(VSV)对实施例2-1提供的双层胶原支架样品处理后，进行热处理灭活的时间效果图；
图7为实施例2-1提供的双层胶原支架植入新西兰白兔伤口内1个月、3个月和6个月时的组织标本染色图；
图8为实施例2-1提供的双层胶原支架浸入生理盐水润湿后贴附在人脑模型上的照片。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
第一方面，本发明提供了一种三维多孔胶原支架的制备方法，按照以下步骤制备得到：将胶原溶液进行冷冻干燥处理后，依次进行压合处理和热处理，得到三维多孔胶原支架。
本发明提供的三维多孔胶原支架的制备方法通过在冷干燥和热处理之间设置压合处理，在不引用交联剂的情况下，制备得到的三维多孔胶原支架不仅具有优异的力学性能、耐降解性能和生物相容性，而且具有良好的尺寸稳定性(尤其在润湿状态)和热稳定性，不会产生塌陷等不良现象，同时能够在保证力学性能的前提下，依然保持胶原的三维多孔结构，使其具有优异的诱导组织再生性。
另外，本发明提供的三维多孔胶原支架的制备方法工艺简单，条件可控，操作方便，能够适用于规模化生产。
在本发明的一种优选方案中，进行压合处理的压合力为0.1-1MPa，压合时间为5-60min，以增强胶原支架内部的物理交联，提高胶原支架的力学性能和尺寸稳定性。
典型但非限制性的，压合处理的压合力如为0.1、0.2、0.5、0.8或1MPa，压合时间如为5、10、20、30、40、50或60min。
当进行压合处理的压合力为0.4-0.8MPa，压合时间为40-60min时，制备得到的胶原支架内部交联度更高，力学性能和尺寸稳定性更优异。
在本发明的一种优选方案中，热处理的温度为110-130℃，保持时间为24-36h，以进一步增强胶原支架内部的交联度，提高力学性能和尺寸稳定性，同时通过热处理对病毒进行灭活，增强胶原支架的生物相容性。
上述的交联是指将胶原支架脱水增加解螺旋结构温度(变性温度)，胶原脱水后导致分子间交联，这是酯化或氨形成的浓缩反应的结果，处理后胶原中的游离羧基和氨基减少。
典型但非限制性的，热处理的温度如为110、115、120、125或130℃，保持时间如为24、28、30、32、35或36h。
当热处理的温度为110-120℃，保持时间为24-36h时，更能有效提高胶原支架内部的交联度，提高力学稳定性和尺寸稳定性。
在本发明的一种优选方案中，冷冻干燥处理包括依次进行的第一冷冻阶段、第二冷冻阶段和室温阶段，其中，第一冷冻阶段的温度为-40～-10℃，保持时间为1-6h，第二冷冻阶段的温度为-10～0℃，保持时间为12-48h，室温阶段保持时间为1-2h，以获得较高的孔隙率、孔连通率和适宜孔径的三维多孔胶原支架材料，从而调控胶原支架材料的耐降解性能和力学性能，有利于其在组织再生修复、组织工程产品、止血材料、医用敷料以及药物载体等方面的应用，尤其是在软组织补片(硬脑膜补片、硬脊膜补片、肩袖补片、疝补片、乳房补片、眼科补片或外科补片)、口腔修复膜、骨修复材料方面的应用。
在本发明中，室温指的是25±5℃。
典型但非限制性的，第一冷冻阶段的温度如为-40、-30、-20或-10℃，保持时间如为1、2、3、4、5或6h；第二冷冻阶段的温度如为-10、-8、-6、-4、-2或0℃，保持时间如为12、15、18、20、25、30、35、40、42、45或48h；室温阶段保持时间如为1、1.5或2h。
当第一冷冻阶段的温度为-30～-20℃时，有利于得到孔隙率高，孔径分布更为均匀的胶原支架材料。
当第二冷冻阶段的保持时间为24-36h时，更有利于得到孔隙结构更加稳定的胶原支架。
在本发明的一种方案中，胶原溶液的质量浓度为0.1-2％，优选为0.5-1.5％，以通过选用特定浓度的胶原溶液制备得到孔隙结构更为稳定的三维多孔胶原支架。
典型但非限制性的，胶原溶液的质量浓度如为0.1％、0.2％、0.5％、0.8％、1％、1.5％或2％。
在本发明的一种优选方案中，胶原溶液由胶原溶解于醋酸溶液中制备而成，以更利于得到均匀性更好、浓度适中的胶原溶液，其中，醋酸溶液的浓度为0.01-1moL/L，优选为0.02-0.5mol/L。
典型但非限制性的，醋酸溶液的浓度如为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或1mol/L。
在本发明的一种优选方案中，胶原为Ⅰ型胶原，所述胶原纯度为95-99.9％，优选为98-99.5％，以避免胶原中杂质影响胶原支架的性能。
第二方面，本发明提供了一种三维多孔胶原支架，主要由本发明第一方面提供的三维多孔胶原支架的制备方法制备而成。
本发明提供的三维多孔胶原支架通过胶原溶液依次进行冷冻干燥、压合处理和热处理制备而成，不仅具有适宜的孔隙率和孔径分布，而且具有优异的力学性能、尺寸稳定性和耐降解性能，同时具有优异的生物相容性和组织诱导再生性，具有广阔的应用前景。
在本发明的一种方案中，三维多孔胶原支架的孔径为10-500μm，孔隙率≥95％，以更利于诱导组织再生，具备更为优良的生物修复功能。
典型但非限制性的，三维多孔胶原支架的孔径如为10、20、50、100、200、300、400或500μm，孔隙率如为95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％。
第三方面，本发明提供了一种双层胶原支架，包括基层，基层上设置由本发明第二方面提供的三维多孔胶原支架。
本发明提供的双层胶原支架通过在三维多孔胶原支架的底部设置基层，以通过基层与三维多孔胶原支架相配合，更有效提高支架的力学性能、尺寸稳定性和耐降解性能。
在本发明的一种方案中，双层胶原支架的厚度为1-5mm，其中，基层的厚度为0.1-1mm，三维多孔胶原支架的厚度为1-4mm。
典型但非限制性的，双层胶原支架的厚度如为1、2、3、4或5mm，基层的厚度如为0.1、0.2、0.5、0.8或1mm，三维多孔胶原支架的厚度如为1、2、3或4mm。
在本发明的一种方案中，基层的孔隙率＜25％，孔径为1-50μm，以使得基层更为致密，与三维多孔胶原支架配合后形成的双层胶原支架具备更为优异的力学性能。
典型但非限制性的，基层的孔隙率如为5％、10％、15％、20％或24％，孔径如为1、2、5、8、10、20、30、40或50μm。
在本发明的一种方案中，基层既可以主要由胶原或天然高分子制备而成，也可以由胶原和天然高分子共同制备而成，优选采用胶原制备而成。
天然高分子包括但不限于纤维素、壳聚糖、透明质酸、明胶、丝素蛋白和淀粉中的任意一种。
第四方面，本发明提供了上述三层胶原支架的制备方法，按照以下步骤制备得到：先制备基层，然后在基层上倒入胶原溶液，依次进行冷冻干燥、压合处理和热处理，得到双层胶原支架。
在本发明的一种方案中，基层按照以下方法制备得到，将含有基层物质的溶液进行冷冻干燥和压合处理，得到基层，以利于后续通过将胶原溶液倒在基层上制备双层胶原支架。
在本发明的一种方案中，基层的含水率为1-10％，优选为2-5％，以使得基层具有致密的多孔仿生结构。
典型但非限制性的，基层的含水率如为1％、2％、3％、5％、8％或10％。
在本发明的一种方案中，制备基层时，包括以下步骤：将含有基层物质(胶原和/或天然高分子)的溶液在-40～-10℃冷冻1-6h，然后升高温度，在-10～0℃保持12-48h，再在室温放置5-10min后立即进行压合处理，以利于制备得到孔隙致密，结构稳定的基层。
典型但非限制性的，制备基层时，含有基层物质的溶液先冷冻的温度如为-40、-30、-20或-10℃，冷冻时间如为1、2、3、4、5或6h，然后升高温度后冷冻的温度如为-10、-8、-6、-5、-3、-2或0℃，保持的时间如为12、18、20、25、30、35或40h，再在室温下放置的时间如为5、6、7、8或10min。
在本发明的一种方案中，制备基层时，进行压合处理的压合力为0.1-1MPa，压合时间为5-60min，以利于制备得到薄片状的基层。
典型但非限制性的，制备基层时进行压合处理的压合力如为0.1、0.2、0.5、0.8或1MPa，压合时间如为5、10、20、30、40、50或60min。
在本发明的一种优选方案中，制备双层胶原支架时，将胶原溶液倒入基层表面后，进行冷冻干燥时，先在温度为-40℃～-10℃，进行冷冻1-6h，随后升高温度，使其温度保持在-10～0℃之间，再升温至室温放置1-2h后再进行热处理，以利于在基层上形成具有仿生结构的三维多孔胶原支架。
在本发明的一种优选方案中，制备双层胶原支架时，进行热处理的温度为110-130℃，保持时间为24-36h，以进一步增强双层胶原支架内部的交联度，提高力学性能和尺寸稳定性，同时通过热处理对病毒进行灭活，增强双层胶原支架的生物相容性，尤其是当热处理的温度为110-120℃，保持时间为24-36h时，更能有效提高胶原支架内部的交联度，提高力学稳定性和尺寸稳定性。
典型但非限制性的，热处理的温度如为110、115、120、125或130℃，保持时间如为24、28、30、32、35或36h。
第五方面，本发明提供了双层胶原支架或三维多孔胶原制剂在制备组织再生修复产品、组织工程产品、止血材料、医用辅料和药物载体中的应用。
本发明中的组织再生产品包括但不限于硬脑膜补片、硬脊膜补片、肩袖补片、疝补片、乳房补片、眼科补片、外科补片、口腔修复膜、骨科修复材料或医美产品。
下面结合实施例和对比例对本发明提供的技术方案做进一步的描述。
实施例1-1
本实施例提供了一种胶原支架，按照以下步骤制备而成：
(1)制备胶原溶液：将高纯度的I型胶原溶于0.5mol/L的醋酸溶液，强力搅拌24h，得到质量浓度为1％的胶原溶液；
(2)冷冻干燥：将胶原溶液放入冷冻室，在-30～-20℃冷冻4-5h，随后升高冷冻室温度，使其温度保持在-10～0℃之间，保持24-36h，然后升高冷冻室温度逐渐达到室温，保持1-2h，取出，得到具有仿生结构的胶原支架；
(3)压合处理：将冷冻干燥后的胶原支架放置于压合装置之间，在0.5MPa的压合力下，保持40min；
(4)热处理，将压合处理后的胶原支架放入温度为110-120℃之间的真空烘箱中进行干热处理，保持24-36h，取出，得到三维多孔胶原支架。
实施例1-2
本实施例提供了一种胶原支架，其制备方法与实施例1-1的不同之处在于，在步骤(3)中，压合力为0.4MPa，保持时间为50min。
实施例1-3
本实施例提供了一种胶原支架，其制备方法与实施例1-1的不同之处在于，在步骤(3)中，压合力为0.6MPa，保持时间为30min。
实施例1-4
本实施例提供了一种胶原支架，其制备方法与实施例1-1的不同之处在于，在步骤(3)中，压合力为0.1MPa，保持时间为60min。
实施例1-5
本实施例提供了一种三维多孔胶原支架，其制备方法与实施例1-1的不同之处在于，在步骤(3)中，压合力为1MPa，保持时间为5min。
实施例1-6
本实施例提供了一种胶原支架，其制备方法与实施例1-1的不同之处在于，在步骤(3)中，压合力为2MPa，保持时间为60min。
实施例1-7
本实施例提供了一种胶原支架，其制备方法与实施例1-1的不同之处在于，在步骤(3)中，压合力为0.05MPa，保持时间为20min。
实施例1-8
本实施例提供了一种胶原支架，其制备方法与实施例1-1的不同之处在于，步骤(4)中，真空烘箱中的温度为120-130℃，保持时间为24h。
实施例1-9
本实施例提供了一种胶原支架，其制备方法与实施例1-1的不同之处在于，步骤(4)中，真空烘箱中的温度为95-105℃，保持时间为20h。
实施例1-10
本实施例提供了一种胶原支架，其制备方法与实施例1-1的不同之处在于，步骤(2)中，将胶原溶液放入冷冻室，在-40～-30℃冷冻1-2h，随后升高温度在-10～0℃之间，保持12-20h，然后升高温度到室温保持1-2h，取出。
实施例1-11
本实施例提供了一种三维多孔胶原支架，其制备方法与实施例1-1的不同之处在于，步骤(2)中，将胶原溶液放入冷冻室，在-20～-10℃冷冻5-6h，随后升高温度在-10～0℃之间，保持40-48h，然后升高温度到室温保持1-2h，取出。
对比例1-1
本对比例提供了一种胶原支架，其制备方法与实施例1-1的不同之处在于，未进行步骤(3)，进行步骤(2)之后，直接进行步骤(4)进行热处理。
对比例1-2
本对比例提供了一种胶原支架，其制备方法与实施例1-1的不同之处在于，未进行步骤(4)，进行步骤(3)压合处理后，即得到三维多孔胶原支架。
试验例1-1
将实施例1-1～1-11以及对比例1-1～1-2提供的胶原支架分别进行SEM表征，发现实施例1-1～1-11和对比例1-1～1-2提供的胶原支架内部均具有仿生三维多孔结构，孔径均在10-500μm之间，有利于细胞进行粘附和生长。
图1为实施例1-1提供的胶原支架的SEM图，从图1可以看出，实施例1-1提供的胶原支架材料具有仿生三维多孔结构，各孔之间相互连通，孔径在250μm左右，并且通过孔隙率测试测定实施例1-1提供的胶原支架的孔隙率在98％左右，利于细胞的粘附和生长。
其中，孔隙率的测定方法为：先用电子天平称量样品质量为m，再用游标卡尺测试样品的实际尺寸并计算其体积为V视。根据测试结果计算样品密度为ρ视＝m/V视。然后采用真密度仪测定样品的真实密度为ρ真。根据以下公式计算孔隙率ε：
ε＝[(1-ρ视)-(1-ρ真)]/(1/ρ视)
试验例1-2
将实施例1-1～1-11以及对比例1-1～1-2提供的胶原支架分别进行吸水性和拉伸强度测试，测试结果如表1所示。
其中，吸水性的测试方法为：将干燥的样品称重，然后将其放入盛有生理盐水的烧杯中，在生理盐水中浸泡10min，取出称重，根据样品吸水前后的差值与吸水前样品的质量比计算吸水量。
拉伸强度的测试方法参照GBT 3923.1-2013中的方法，将样品裁剪成20mm宽的样品，以10mm/min的速度进行样品的拉伸试验。
表1
Figure GDA0003015558610000131
Figure GDA0003015558610000141
根据表1数据看出，热处理温度为110-130℃，保持时间为24-36h内，热处理温度和时间对样品的交联度影响较小，因此各样品之间的吸水量和拉伸强度没有明显差异；若热处理温度低于110℃或没有经过热处理，那么样品没有经过交联或交联度过低，从而造成吸水量增加，拉伸强度有所降低；若热处理温度高于130℃，那么交联程度和力学性能有所提高，但是孔径变小，不利于细胞的粘附和再生；
压合强度和压合时间主要对样品的拉伸强度有所影响，随着压合强度提高，压合时间延长，样品的拉伸强度提高。若压合强度低于0.1MPa或未进行压合，胶原支架依然保持多孔结构，虽有利于细胞的粘附和生长，但是造成样品的力学性能下降。若压合强度高于1MPa，造成孔隙率更低，不利于细胞的粘附和再生。
试验例1-3
分别利用伪狂犬病毒(PRV)和水泡性口炎病毒(VSV)对实施例1-1提供的胶原支架样品处理后，进行热处理灭活效果的检测，结果如图2所示。
从图2可以看出，当进行热处理3h后，样品中残留病毒滴度降低了5个log，说明病毒灭活效果好，热处理工艺可明显灭活样品中的病毒。
试验例1-4
以新西兰白兔为模型，在硬膜缺损部位切开长为4cm伤口，然后植入实施例1-1提供的胶原支架，在1个月、3个月和6个月分别取相应的组织标本进行HE染色，观察组织再生情况，结果如图3所示，其中1M代表的是1个月时的组织标本，3M代表的是3个月时的组织标本，6M代表的是6个月时的组织标本。
从图3可以看出，在植入1个月后，胶原支架部分降解，胶原支架内有成纤维长入，形成于新生组织交织在一起的修复体，3个月后胶原支架基本降解，新生的组织基本已替代了胶原支架，6个月后胶原支架已完全降解，自体的硬膜组织已完全再生，达到了组织修复的效果。
实施例2-1
本实施例提供了一种双层胶原支架，按照以下步骤制备而成：
(1)制备胶原溶液：将高纯度的I型胶原溶于0.5mol/L的醋酸溶液，强力搅拌24h，得到质量浓度为1％的胶原溶液，然后将胶原溶液分成两批，分别为第一胶原溶液和第二胶原溶液。
(2)第一冷冻干燥：将第一胶原溶液放入冷冻室，在-30～-20℃冷冻4-5h，随后升高冷冻室温度，使其温度保持在-10～0℃之间，保持20-30h，获得含率量为5％的胶原多孔材料；
(3)第一压合处理：将冷冻干燥后的胶原多孔材料从冷冻室取出，室温放置5-10min后，放置于压合装置之间，在0.35MPa的压合力下，保持40min，获得基层；
(4)第二冷冻干燥：将基层在模具固定，并在其表面缓慢倒入第二胶原溶液，将模具放入冷冻室在-30～-20℃冷冻4-5h，随后升高冷冻室温度，使其温度保持在-10～0℃之间，保持24-36h，逐渐升温至室温放置1-2h，取出，得到双层结构的胶原支架；
(5)第二压合处理：将第二冷冻干燥后的双层结构的胶原支架放置于压合装置之间，在0.5MPa的压合力下，保持40min；
(6)热处理，将压合处理后的胶原支架放入温度为110-120℃之间的真空烘箱中进行干热处理，保持24-36h，取出，得到双层胶原支架。
实施例2-2
本实施例提供了一种双层胶原支架，其与实施例2-1不同之处在于，步骤(1)-(2)将第一胶原溶液替换为质量浓度为1％的纤维素溶液。
实施例2-3
本实施例提供了一种双层胶原支架，其与实施例2-1不同之处在于，步骤(1)-(2)将第一胶原溶液替换为质量浓度为1％的明胶溶液。
实施例2-4
本实施例提供了一种双层胶原支架，其与实施例2-1不同之处在于，步骤(3)中，第一压合处理时的压合力为0.2MPa，保持时间为50min。
实施例2-5
本实施例提供了一种双层胶原支架，其与实施例2-1不同之处在于，步骤(3)中，第一压合处理时的压合力为0.5MPa，保持时间为20min。
实施例2-6
本实施例提供了一种双层胶原支架，其与实施例2-1不同之处在于，步骤(3)中，第一压合处理时的压合力为0.1MPa，保持时间为60min。
实施例2-7
本实施例提供了一种双层胶原支架，其与实施例2-1不同之处在于，步骤(3)中，第一压合处理时的压合力为1MPa，保持时间为5min。
实施例2-8
本实施例提供了一种双层胶原支架，其与实施例2-1不同之处在于，步骤(3)中，第一压合处理时的压合力为0.05MPa，保持时间为60min。
实施例2-9
本实施例提供了一种双层胶原支架，其与实施例2-1不同之处在于，步骤(3)中，第一压合处理时的压合力为2MPa，保持时间为5min。
实施例2-10
本实施例提供了一种双层胶原支架，其与实施例2-1不同之处在于，步骤(5)中，第二压合处理时的压合力为0.4MPa，保持时间为45min。
实施例2-11
本实施例提供了一种双层胶原支架，其与实施例2-1不同之处在于，步骤(5)中，第二压合处理时的压合力为0.6MPa，保持时间为30min。
实施例2-12
本实施例提供了一种双层胶原支架，其与实施例2-1不同之处在于，步骤(5)中，第二压合处理时的压合力为0.1MPa，保持时间为60min。
实施例2-13
本实施例提供了一种双层胶原支架，其与实施例2-1不同之处在于，步骤(5)中，第二压合处理时的压合力为1MPa，保持时间为5min。
实施例2-14
本实施例提供了一种双层胶原支架，其与实施例2-1不同之处在于，步骤(5)中，第二压合处理时的压合力为0.05MPa，保持时间为60min。
实施例2-15
本实施例提供了一种双层胶原支架，其与实施例2-1不同之处在于，步骤(5)中，第二压合处理时的压合力为2MPa，保持时间为5min。
实施例2-16
本实施例提供了一种双层胶原支架，其制备方法与实施例2-1的不同之处在于，步骤(5)中，真空烘箱中的温度为120-130℃，保持时间为24h。
实施例2-17
本实施例提供了一种双层胶原支架，其制备方法与实施例2-1的不同之处在于，步骤(5)中，真空烘箱中的温度为95-105℃，保持时间为20h。
实施例2-18
本实施例提供了一种双层胶原支架，其与实施例2-1的不同之处在于，未进行步骤(3)第一压合处理，直接在步骤(2)第一冷冻干燥后直接进行步骤(4)第二冷冻干燥。
对比例2-1
本对比例提供了一种单层胶原支架，其制备方法同实施例1-1，在此不再赘述。
对比例2-2
本对比例提供了一种单层戊二醛胶原支架，其按照以下步骤制备得到：
(1)制备胶原溶液：将高纯度的I型胶原溶于0.5mol/L的醋酸溶液，强力搅拌24h，得到质量浓度为1％的胶原溶液；
(2)冷冻干燥：将胶原溶液放入冷冻室，在-30～-20℃冷冻4-5h，随后升高冷冻室温度，使其温度保持在-10～0℃之间，保持24-36h，然后升高冷冻室温度逐渐达到室温，保持1-2h，取出，得到具有仿生结构的胶原支架；
(3)将冷冻干燥后的胶原支架浸没在去离子水中，然后放入质量浓度为0.25％的戊二醛的水溶液中预交联10min后，取出，再将其浸泡于质量浓度为0.25％戊二醛的0.05mol/L醋酸溶液，于4℃交联24h后用PBS缓冲液清洗三次，再用蒸馏水清洗三次，得到单层戊二醛交联胶原支架。
试验例2-1
将实施例2-1～2-18提供的胶原支架分别进行检测，发现实施例2-1～2-18提供的双层支架的厚度均为1-5mm，基层为0.1-1mm，其中基层的孔隙率小于25％，孔径在1-50μm之间，基层上形成的三维多孔胶原支架孔隙率在98％以上，孔径在500-500μm之间，有利于细胞的粘附和再生。
图4为实施例2-1提供的双层胶原支架中基层的SEM图，图5为实施例2-1提供的双层胶原支架中上层三维多孔胶原支架的SEM图，从图4和图5可以看出，基层为致密的多孔材料，孔结构多为扁平，孔隙率在20％左右，孔径在25μm左右，能够为双层支架提供力学强度和尺寸稳定性。上层的三维多孔胶原支架具有仿生三维多孔结构，孔隙率为98％左右，孔径在250μm左右，利于细胞的粘附和再生。
试验例2-2
将实施例2-1～2-18以及对比例2-1和对比例2-2提供的胶原支架分别根据标准GB/T3923.1、YY0500和GB/T19976进行抗拉强度、缝合力和顶破强度测试，结果如表2所示。
表2
Figure GDA0003015558610000191
Figure GDA0003015558610000201
根据表2的测试数据可以看出，与单层胶原支架和戊二醛交联支架相比，双层胶原支架的力学性能明显提高，说明高纯胶原、均匀的胶原分布、多孔结构的有序排列以及致密层的添加可以明显提高胶原支架的力学强度，同时提高胶原支架的耐降解性能。
试验例2-3
分别利用伪狂犬病毒(PRV)和水泡性口炎病毒(VSV)对实施例2-1提供的双层胶原支架样品处理后，进行热处理灭活效果的检测，结果如图6所示。
从图6可以看出，当进行热处理3h后，样品中残留病毒滴度降低了5个log，说明病毒灭活效果好，说明热处理工艺可明显灭活样品中的病毒。
试验例2-4
以新西兰白兔为模型，在硬膜缺损部位切开长4cm的伤口，然后植入实施例2-1提供的双层胶原支架，在1个月、3个月和6个月分别取相应的组织标本进行HE染色，观察组织再生情况，结果如图7所示，其中1M代表的是1个月时的组织标本，3M代表的是3个月时的组织标本，6M代表的是6个月时的组织标本。
从图7可以看出，在植入1个月后，胶原支架部分降解，胶原支架内有成纤维长入，形成于新生组织交织在一起的修复体，3个月后胶原支架基本降解，新生的组织基本已替代了胶原支架，6个月后胶原支架已完全降解，自体的硬膜组织已完全再生，达到了组织修复的效果。
试验例2-5
将实施例2-1提供的双层胶原支架放入生理盐水中，发现此双层胶原支架的吸水性很好，在5min左右即可完全润湿，吸水倍数为自身重量的25-30倍。图8为实施例2-1提供的双层胶原支架浸入生理盐水润湿后贴附于人脑模型上的照片，从图8可以看出，润湿后的双层胶原支架贴附性良好，并且在润湿状态下依然具有良好的尺寸稳定性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (9)

1.一种双层胶原支架的制备方法，其特征在于，按照以下步骤制备得到：
先制备基层，然后在基层上倒入胶原溶液，依次进行冷冻干燥、压合处理和热处理形成三维多孔胶原支架，得到双层胶原支架，其中，冷冻干燥为在-30~-20℃下保持4-5h，再在-10~0℃下保持24-36h，之后在室温下保持1-2h，压合处理为在0.5MPa的压合力下保持40min；
热处理为在110-120℃之间的真空烘箱中保持24-36h；
所述基层按照以下方法制备得到：将含有基层物质的溶液依次进行冷冻干燥和压合处理，得到基层，其中，制备基层时，先将含有基层物质的溶液在-30~-20℃冷冻4-5h，然后在-10~0℃保持12-48h，再在室温下保持5-10min；
制备基层时，进行压合处理的压合力为1MPa , 压合时间为5min；
所述含有基层物质的溶液为胶原溶液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述胶原溶液由胶原溶解于醋酸溶液中制备而成，所述醋酸溶液的浓度为0.01-1mol/L。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述醋酸溶液的浓度为0.02-0.5mol/L。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述胶原为Ⅰ型胶原，所述胶原纯度为95-99.9%。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述胶原纯度为98-99.5%。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述双层胶原支架的厚度为1-5mm，其中，所述基层的厚度为0.1-1mm，所述三维多孔胶原支架的厚度为1-4mm；
所述基层的孔隙率＜25%，孔径为1-50μm。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述基层的含水量为1-10%。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述基层的含水量为2-5%。
9.权利要求1-8任一项所述的制备方法制备得到的双层胶原支架在制备组织再生修复产品、止血材料、医用辅料和药物载体中的应用；
所述组织再生修复产品包括硬脑膜补片、硬脊膜补片、肩袖补片、疝补片、乳房补片、眼科补片、口腔修复膜、骨科修复材料和医美产品中的至少一种。
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