CN116196477A - 一种脱细胞骨或软骨材料的制备方法 - Google Patents

一种脱细胞骨或软骨材料的制备方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及一种脱细胞骨或软骨材料的制备方法，其包括：(1)将骨或软骨材料放入含有氯化钙和氯化镁的Tris‑HCL溶液浸泡并震荡或搅拌处理；(2)将步骤(1)处理后得到的骨或软骨材料放入含有EDTA的Tris‑HCL溶液或者含有EDTA和SDS的Tris‑HCL溶液中并震荡或搅拌浸泡处理；(3)将步骤(2)处理后得到的骨或软骨材料放入蛋白酶溶液中并震荡或搅拌处理；(4)将步骤(3)处理后得到的骨或软骨材料放入CTAB溶液中浸泡并震荡、搅拌或超声处理；(5)将步骤(4)处理后得到的骨或软骨材料放入低渗溶液进行清洗，得到所述脱细胞骨或软骨材料；其中，步骤(1)至步骤(4)的顺序可以任意调换。

Description

一种脱细胞骨或软骨材料的制备方法
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种脱细胞骨或软骨材料的制备方法。
背景技术
生物骨或软骨材料作为一类生物医用材料，属于第三类医疗器械产品，是医疗器械行业的细分领域，产品主要用于治疗、修复和替换人体骨或软骨组织并增进其功能，涉及材料、生物和医学等相关学科。
近年来，由外伤或疾病造成的骨或软骨缺损在临床上十分常见，不仅严重影响患者的生活品质，而且给他们带来了沉重的经济负担。然而，由于骨自身修复能力有限，对其修复一直是外科临床上的一个难题，至今尚无特效的治疗方法。骨修复一直是临床上的难题，目前治疗骨缺损的方法以自体和异体骨组织，以及金属或合金材料为主，临床上自体骨移植存在取材难度大、创伤大等困难。异体骨修复存在抗原性强、免疫反应强、供体来源不足、操作复杂、周期长等问题。金属或合金材料会使躯体僵硬，邻椎或相邻骨骼退变加快，出现内固定并发症，会造成二次手术，使患者经济负担加重。寻找更好的骨修复材料变得更为重要。
目前，临床上多采用自体/异体骨移植、骨膜移植、骨细胞移植、微骨折等修复方法。但它们存在供体来源有限、免疫排斥、移植细胞流失或耐受应力差等不足之处，修复效果不佳。然而，作为最理想的异种骨材料来说也会带来一系列问题，如超急性免疫排斥反应、急性血管性排斥及慢性排斥反应等，所以寻求一种降低免疫排斥反应，去除血渍的安全异种材料至关重要。
我国生物再生材料的研究始于20世纪90年代中后期，以替代、修复或改善人体各种组织器官损伤的再生医学为主线，并以组织工程技术、干细胞技术、异种器官移植等为重点，形成了组织(器官)工程研究开发的技术体系，为生物再生材料的发展奠定了基础。这种新型生物医学材料，以动物组织为主要原材料，在保留动物组织结构的前提下，通过组织工程技术处理，具备良好的组织相容性和诱导性、力学顺应性及降解顺应性等。随着材料学的迅猛发展，伴随着免疫学和组织工程技术的进展，为进一步满足临床需求，生物再生材料逐渐发展成为一种新型的组织修复材料。
目前，我国生物再生材料的发展还主要集中在结构类产品，皮肤、骨、肌腱较为常见，其中骨产品仍是以同种异体骨为主要来源，还有人工合成骨和金属合金骨材料，其中脱细胞骨或软骨支架去筋膜后主要通过Dispase-Triton法和NaCl-SDS法结合核酸酶处理的方法制备。前者通过化学除垢剂联合其他辅助试剂去除皮肤组织内的细胞和抗原成分，如在含有EDTA和DispaseII酶的溶液中脱除细胞，后在TritonX-100中孵育制得；后者通过高渗氯化钠和SDS制备，但会残留较多抗原成分。除此之外，还有胰蛋白酶消化法、反复冻融法、NaOH销蚀法、平衡盐孵育法等制备方法，但较前两种应用较少。上述制备方法是制备脱细胞异体真皮基质的通用方法，均未考虑化学残留及核酸酶残留问题，而且对于骨或软骨材料，血渍处理和脱细胞不够完全。作为生物材料，除需要满足临床需求外，最主要的是安全性。国内目前已经有应用于骨或软修复的脱细胞异体材料的专利和产品，但都需要用核酸酶来处理外源DNA。
发明内容
本发明针对上述问题提出新的解决方案，本发明工艺简单，工艺所需辅料化学成分少，且在保留天然结构和天然胶原的情况下，将骨或软骨脱细胞并去除血渍及主要抗原成分。本发明的关键在于不使用核酸酶的情况下去除外源DNA，并能去除血渍和主要抗原成分，对于骨和软骨材料，采用温和脱矿方法，使得材料安全性更高。
本申请的目的之一在于提供一种在保留天然胶原情况下去除主要抗原成分，去除血渍，完成脱矿，主要解决工艺中不需要添加使用核酸酶就可以去除外源DNA，温和脱矿和去血渍的骨或软骨填充材料及植入性治疗、修复和替换人体骨或软骨组织，该材料安全无毒，工艺简单，能够满足临床需求。
本申请的另一个目的还在于提供上述脱细胞去DNA，去血渍的骨或软骨材料的制备方法。
本申请的另一个目的还在于提供上述脱细胞去DNA去血渍的骨或软骨材料的应用。
一方面，本申请提供了一种脱细胞骨或软骨材料的制备方法，其包括：
(1)将骨或软骨材料放入含有氯化钙和氯化镁的Tris-HCL溶液浸泡并震荡或搅拌处理；
(2)将步骤(1)处理后得到的骨或软骨材料放入含有EDTA的Tris-HCL溶液或者含有EDTA和SDS的Tris-HCL溶液中并震荡或搅拌浸泡处理；
(3)将步骤(2)处理后得到的骨或软骨材料放入蛋白酶溶液中并震荡或搅拌处理；
(4)将步骤(3)处理后得到的骨或软骨材料放入CTAB溶液中浸泡并震荡、搅拌或超声处理；
(5)将步骤(4)处理后得到的骨或软骨材料放入低渗溶液进行清洗，得到所述脱细胞骨或软骨材料；
其中，步骤(1)至步骤(4)的顺序可以任意调换。
在某些实施方式中，其中所述步骤(1)、(2)和(3)和/或(4)可以任意重复1～3次。
在某些实施方式中，其中所述步骤(1)和(2)中的Tris-HCL溶液为10mM～100mM，PH值为6.8～8.0。
在某些实施方式中，其中所述步骤(1)和(2)中的Tris-HCL溶液为50mM～100mM，PH值为7.0～7.6。
在某些实施方式中，其中所述步骤(2)中的Tris-HCL溶液中EDTA的浓度为0.1wt％～10wt％。
在某些实施方式中，其中所述步骤(1)中Tris-HCL溶液中的氯化镁的浓度为约0.2mM～1mM，所述的氯化钙的浓度为约0.2mM～4mM。
在某些实施方式中，其中所述步骤(3)中所述的蛋白酶包括胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、dispase酶中的一种或多种。
在某些实施方式中，其中所述步骤(3)中所述的蛋白酶的浓度为0.1wt％～0.35wt％。
在某些实施方式中，其中所述步骤(4)中所述CATB浓度为0.1wt％～1wt％。
在某些实施方式中，当待处理材料为骨材料时，所述步骤(2)中的Tris-HCL溶液含有SDS。
在某些实施方式中，当待处理材料为骨材料时，所述步骤(2)包括将骨材料放入含有SDS和EDTA的Tris-HCL溶液中并震荡或搅拌浸泡处理；其中含有SDS(十二烷基硫酸钠)和EDTA(乙二胺四乙酸)的Tris-HCL溶液中SDS的浓度为0.1wt％～0.5wt％，EDTA浓度为1wt％～10wt％，其中Tris-HCL溶液为10mM～100mM，PH值为6.8～8.0。
在某些实施方式中，当待处理的材料软骨材料时，所述步骤(2)中的Tris-HCL溶液包含或不包含SDS。
在某些实施方式中，当待处理材料为软骨材料时，所述步骤(2)包括将软骨材料放入含有EDTA的Tris-HCL溶液中并震荡或搅拌浸泡处理，其中Tris-HCL溶液中EDTA浓度为0.1wt％～1wt％，其中Tris-HCL溶液为10mM～100mM，PH值为6.8～8.0。
在某些实施方式中，其中所述步骤(1)-(4)中所述的震荡或搅拌条件为转速50～150rpm，时间为4～24h，所述的震荡或搅拌的温度为18～60℃。
在某些实施方式中，当待处理材料为骨材料时，其中所述步骤(2)和(3)中所述的震荡或搅拌的温度不超过37℃。
在某些实施方式中，当待处理材料为骨材料时，其中所述步骤(1)-(4)中所述震荡或搅拌温度为15～37℃。
在某些实施方式中，当待处理材料为软骨材料时，其中所述步骤(1)-(4)中所述震荡或搅拌温度为18～60℃。
在某些实施方式中，当待处理材料为软骨材料时，所述步骤(1)、(2)和(4)中所述震荡或搅拌温度为40～60℃，步骤(3)中所述震荡或搅拌温度为18～37℃。
在某些实施方式中，所述方法还包括：在所述步骤(1)之前使用低渗溶液清洗所述骨或软骨材料。
在某些实施方式中，其中所述的清洗都为低渗溶液超声清洗。
在某些实施方式中，其中所述的低渗溶液包括蒸馏水、去离子水或注射用水。
在某些实施方式中，其中所述的低渗溶液超声清洗为：频率为20kHz～60kHz，功率为180W～450W，温度为18℃～50℃，超声5～30分钟浸泡5～20分钟，再超声5～30分钟浸泡5～20分钟，低渗溶液浑浊时重新更换，重复1～3次。
在某些实施方式中，其中所述步骤(3)和(4)中所述超声处理条件为：频率为20kHz～60kHz，功率为180W～450W，温度为18℃～50℃，超声5～30分钟浸泡5～20分钟，再超声5～30分钟浸泡5～20分钟，重复1～3次。
另一方面，本申请提供了一种脱细胞骨材料的制备方法，所述方法包括：
(1)将骨材料放入含有氯化钙和氯化镁的Tris-HCL溶液浸泡并震荡或搅拌处理；
(2)将步骤(1)处理后得到的骨材料放入含有SDS和EDTA的Tris-HCL溶液中并震荡或搅拌浸泡处理；
(3)将步骤(2)处理后得到的骨材料放入蛋白酶溶液中并震荡或搅拌处理；
(4)将步骤(3)处理后得到的骨材料放入CTAB溶液中浸泡并震荡、搅拌或超声处理；
(5)将步骤(4)处理后得到的骨材料放入低渗溶液进行清洗，得到所述脱细胞骨材料；
其中，步骤(1)至步骤(4)的顺序可以任意调换。
另一方面，本申请提供了一种脱细胞软骨材料的制备方法，所述方法包括：
(1)将软骨材料放入含有EDTA的Tris-HCL溶液中并震荡或搅拌浸泡处理；
(2)将步骤(1)处理后得到的骨材料放入含有氯化钙和氯化镁的Tris-HCL溶液浸泡并震荡或搅拌处理；
(3)将步骤(2)处理后得到的软骨材料放入CTAB溶液中浸泡并震荡、搅拌或超声处理；
(4)将步骤(3)处理后得到的软骨材料放入蛋白酶溶液中并震荡或搅拌处理；
(5)将步骤(4)处理后得到的软骨材料放入低渗溶液进行清洗，得到所述脱细胞软骨材料；
其中，步骤(1)至步骤(4)的顺序可以任意调换。
在某些实施方式中，其中所述骨或软骨材料来源于非人哺乳动物。
在某些实施方式中，其中所述哺乳动物为野生型动物或转基因动物。
在某些实施方式中，其中所述转基因动物为通过基因改造或人源化改造实现低免疫源性的动物。
在某些实施方式中，其中所述转基因动物为敲除α-Gal抗原的动物。
在某些实施方式中，其中所述转基因动物敲除选自下组的一个或多个基因：Galα1，3Galβ1和4GlcNAc-R。例如，其中所述转基因动物可以是Galα1，3Galβ1和4GlcNAc-R三基因敲除动物。
在某些实施方式中，其中所述骨或软骨材料来源于猪。
在某些实施方式中，其中所述猪为野生型猪或转基因克隆猪。
在某些实施方式中，其中所述转基因克隆猪为通过基因改造或人源化改造实现低免疫源性的猪。
在某些实施方式中，其中所述转基因克隆猪包括敲除α-Gal抗原的猪。α-Gal表位抗原，(也是一个主要的异种抗原)，是猪与人组织器官异种移植的第一道屏障。
在某些实施方式中，其中所述转基因克隆猪除选自下组的一个或多个基因：Galα1，3Galβ1和4GlcNAc-R。
在某些实施方式中，其中所述转基因克隆猪包括Galα1，3Galβ1和4GlcNAc-R三基因敲除猪。
在某些实施方式中，其中所述骨来源于松质骨、密质骨或皮质骨。
在某些实施方式中，其中所述骨或软骨材料的DNA含量小于约100ng/mg。
在某些实施方式中，其中所述骨或软骨材料基本上不含α-1,3-半乳糖苷(α-Gal)。
另一方面，本申请提供前述方法制备的脱细胞骨或软骨材料。
另一方面，本申请提供前述骨或软骨材料在制备骨或软骨修复或填充材料中的应用。
在某些实施方式中，其中所述骨修复包括骨植入，骨条、骨颗粒、骨粉等骨缺损的修复和填充，以及骨支架和骨治疗中的应用。软骨修复包括软骨植入，生物医用材料和外科整形、塑形的填充植入。
另一方面，本申请提供一种治疗骨或软骨组织损伤的方法，可以包括向有需要的受试者施用前述的脱细胞骨或软骨材料。
另一方面，本申请提供一种用于骨或软骨填充修复的试剂盒，其包含前述脱细胞骨或软骨材料。
在某些实施方式中，所述试剂盒还包含手术刀、手术剪、止血钳、镊子、缝合针、可吸收手术线、含注射用水的安瓿瓶、注射器中的一种或几种。
本申请的脱细胞骨或软骨材料较之市场同类产品(例如国内某企业生产的来源于脱细胞软骨基质材料)以及类似中国发明专利CN108653814A和类似中国发明专利CN110075356A以及其他脱细胞异体骨或软骨发明专利更有优势，其展现出的有益效果包括：本发明的脱细胞骨或软骨材料工艺简单，化学试剂成分少，材料更安全，且不使用和添加除胰蛋白酶以外的其他酶类和核酸酶类就能够很好的去除外源DNA及其他引起排异反应的蛋白产品，并能温和脱矿，本发明的脱细胞骨或软骨材料与同类产品相比，最大的优势在于去除外源DNA时不使用DNA水解酶，本发明的脱细胞骨或软骨材料因不使用核酸酶，工艺简单辅料成分简单从而保证了材料的安全性。本发明工艺简单，条件温和，能够很好的去除免疫原及去除外源DNA的同时，不损伤或较小损伤天然组织结构，使骨和软骨基质保留天然胶原结构支架，具有较好的机械性能和硬度。
综上，本发明的脱细胞骨或软骨材料在骨或软骨植入或填充及骨或软骨修复治疗应用，以及外科整形、塑形的填充植入中具有以下优点：与现有技术相比，本发明的脱细胞骨或软骨材料，是一种工艺简单且工艺中不使用核酸酶就能去外源DNA、去免疫原性的特点，且维持天然的胶原结构，硬度及强度很好能够作为植入型生物组织材料用于骨修复包括骨植入，骨条、骨颗粒、骨粉等骨缺损的修复和填充，以及骨支架和骨治疗；用于软骨修复包括软骨植入，生物医用材料和外科整形、塑形的填充植入等领域，并可以用于整形重建外科等领域。制备方法简单，易于操作，成本低，具有很好的应用前景且具有良好的安全性，无排斥反应，成功率高。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明如下：
图1A-1B显示的是经本申请工艺处理骨和某企业市场所售同种异体骨条对比图；其中，A经本申请工艺处理骨条；B同种异体骨条。
图2A-2B显示的是未处理野生型骨和经本申请实施例3工艺处理骨的苏木精-伊红染色对比图；其中，A未经工艺处理；B经实施例3工艺处理；放大倍数：100倍。
图2C-2D显示的是未处理野生型骨和经本申请实施例3工艺处理骨的苏木精-伊红染色对比图；其中，C未经工艺处理；D经实施例1工艺处理；放大倍数：100倍。
图2E-2F显示的是未处理野生型软骨和经本申请实施例3工艺处理软骨的苏木精-伊红染色对比图；其中，E未经工艺处理；F经实施例7工艺处理；放大倍数：100倍。
图3A-3B显示的是未处理野生型骨和经本申请实施例3工艺处理骨的α-1,3-半乳糖苷免疫荧光染色对比图；其中，A未经工艺处理；B经实施例3工艺处理；放大倍数：200倍。
图3C-3D显示的是未处理野生型软骨和经本申请实施例7工艺处理软骨的α-1,3-半乳糖苷免疫荧光染色对比图；其中，C未经工艺处理；D经实施例7工艺处理；放大倍数：200倍。
图4A-4B显示的是未处理野生型骨和经本申请实施例3工艺处理骨的骨胶原蛋白Masson染色图；其中，A未经工艺处理；B经工艺处理；放大倍数：100倍。
图5A-5B显示的是DNA残留量检测中标准曲线数值及标准曲线图，其中A为标准曲线数值表，B为标准曲线图。
图6显示的是根据回收率样本浓度和检测数值得到的回收率曲线图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“脱细胞”，“脱细胞的”与“脱细胞化”可互换使用，通常是指消除或充分减少组织中的天然细胞和细胞材料以使得当这样的组织被植入时，它不会激发不利的免疫应答的过程。术语“脱细胞材料”通常是指细胞和细胞材料被充分减少而不会激发不利的免疫应答的组织。
在本申请中，术语“脱细胞基质”通常是指实质上不含细胞和/或细胞组分的任何组织基质。如本文所用的“脱细胞基质”可以是如下的基质：(a)它由广泛的基于胶原的组织中的任一种制成；(b)它是脱细胞的；以及(c)它保留产生它的天然组织或器官所具有的生物功能和结构功能。皮肤、皮肤部分(例如，真皮)和其他组织例如血管、心脏瓣膜、筋膜、软骨、骨、和神经结缔组织可以用来产生处于本申请范围内的脱细胞基质。可以按多个方式测试或评估脱细胞组织基质以确定它们是否实质上不含细胞和/或细胞组分。例如，可以使用光学显微镜检查处理的组织以确定是否残留有细胞(活的或死的)和/或细胞组分。另外，可以使用某些测定法来鉴定细胞或细胞组分的存在。例如，DNA或其他核酸测定法可以用来定量组织基质内的剩余细胞核材料。通常情况下，剩余DNA或其他核酸的缺失将指示完全去细胞化(即，细胞和/或细胞组分的去除)。鉴定细胞专一性(例如表面抗原)的其他检验可以用来确定组织基质是否脱细胞。
在本申请中，术语“异种”或“异种的”通常是指移植物来源于不同种类的动物。
在本申请中，术语“抗原”通常是指能够被免疫识别并能够诱发受体(例如人受体)有机体中的抗体/免疫介导的/炎症反应的动物来源的分子。在本申请中，术语“异种抗原(xenoantigen)”、“抗原”、“异种的抗原(xenogeneic antigen)”、“表位”和“关键抗原”可以具有相同的含义，并可以一起使用或彼此替换。
在本申请中，术语“α-半乳糖(α-Gal)”、“α-Gal表位”或“α-Gal抗原”通常是指广泛存在于猪、牛、鼠等非灵长类哺乳动物体内的一类碳水化合物表位。由于人体不能合成α-gal，但人体天然预存着大量针对α-gal的抗体，这些抗体能特异性识别并结合外源性α-gal表位。敲除α-Gal表位可以有效克服超急性免疫排斥反应。在一些实施方式中，真皮基质来源于α-Gal表位基因敲除猪(也称无α-Gal表位猪)，其是指在猪的基因组中敲除了Galα1，3Galβ1和4GlcNAc-R基因，从而使得猪体内α-Gal糖消失。在另一些实施方式中，真皮基质来源于α-Gal表位基因敲除猪(也称无α-Gal表位猪)，其是指在猪的基因组中敲除了α-1,3-半乳糖基转移酶基因(GGTA1基因)，从而使得猪体内α-Gal糖消失。
在本申请中，术语“核酸分子”、“核酸”和“多核苷酸”可互换地使用，通常包括DNA分子(如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(如mRNA)，和用核苷酸同类物产生的DNA或RNA同类物。核酸分子可以是单链或双链。这些核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解物中，或以部分纯化或基本上纯的形式存在。本申请所述的核酸可以DNA或RNA，并且可以含有或者可以不含内含子序列。
术语“核酸酶”通常是指可与至少一种底物结合并且对该至少一种底物的修饰(如连接或裂解)进行催化的一种DNA或含有DNA的分子或复合物或是一种RNA或含有RNA的分子或复合物、或者是它们的组合(即一种DNA-RNA杂交分子或复合物)。在催化性核酸中的核苷酸残基可包括碱基A、C、G、T和U及其衍生物和类似物。“核酸酶”可以包括单分子核酸酶，该单分子核酸酶可包括：可识别至少一种底物并且对该至少一种底物的修饰(如连接或裂解)进行催化的一种单一DNA或含有DNA的分子(在本领域中还称为“DNA酶”、“脱氧核酶”或“DNase”)或一种RNA或含有RNA的分子(在本领域中还称为“RNA酶”或“核酶”)或它们的一种组合(即一种DNA-RNA杂交分子)。
在本申请中，术语“DNase”通常是指脱氧核糖核酸酶，即DNA酶，即催化DNA主链中磷酸二酯连接键的水解切割的酶，从而降解DNA。脱氧核糖核酸酶是核酸酶的一种类型，是能够水解连接核苷酸的磷酸二酯键的酶的总称。DNase存在于许多物种中，任何能够切割DNA的任何DNAse都可以用于本申请。DNAse可以来自动物来源，诸如牛或猪来源，DNAse也可以是人源的。
在本申请中，术语“蛋白酶”与“肽酶”可以互换使用，通常包括两组酶：在蛋白内的位点切割肽键的内肽酶，和分别从N或C末端去除一个或多个氨基酸的外肽酶。
在本申请中，术语“生物植入材料”通常是指保持成功放置在哺乳动物体内的潜力的生物相容性装置(例如植入物)，是可经由手术、注射、或其它合适的手段植入的物体，它的主要功能一般是经由它的物理存在或机械特性来实现的。
在本申请中，术语“受试者”或“患者”通常是指期望对其进行诊断、预后或治疗的任何个体、患者或动物，特别地哺乳动物受试者。
在本申请中，术语“哺乳动物”通常包括任何哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于牛、马、绵羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴、人等。
在本申请中，术语“治疗”通常包括：(1)防止受治疗者发生不良症状和病理状态，所述受治疗者倾向于发生这些不良症状和病理状态，但是尚未确诊有这些症状和病理状态；(2)抑制不良症状和病理状态，即控制其发展；或(3)改善或缓解不良症状或病理状态，即使上述不良症状或病理状态消退。
在本申请中，术语“施用”通常是指通过任意引入或递送途径将所述生物植入材料引入受试者的身体中。
在本申请中，术语“基本上”通常是指作用、特性、性质、状态、结构、项目或结果的完全或几乎完全的范围或程度。术语“基本上”通常表示可归因于任何定量对比、值、测量或其他表述的固有不确定性程度。
在本申请中，术语“包含”和其变形形式，包括“含有”、“包括”等其它形式，通常是指包含其它组分、元素、数值、步骤等。术语“由...组成”不包括其它组分、元件、整数、步骤等。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下约0.5％、约1％、约1.5％、约2％、约2.5％、约3％、约3.5％、约4％、约4.5％、约5％、约5.5％、约6％、约6.5％、约7％、约7.5％、约8％、约8.5％、约9％、约9.5％、或约10％的范围内变动。
发明详述
用于本发明的方法的示例性骨
如本文所述将骨或软骨脱细胞化去除了大部分或所有的细胞成分，同时基本上保留细胞外基质(ECM)和其它结构，例如，血管结构、哈弗氏(Haversian)管、福克曼(Volkmann)管、陷窝(lacunae)、薄板、小管(canaliculi)、骨单位、骨膜、骨小梁(trabecluae)和其组合。然后，脱细胞化的骨或其部分可以被用作进行(例如离体或体内)再细胞化的支架。从其可以获得骨的哺乳动物包括但不限于：啮齿动物、猪、兔、牛、羊、狗和人。本文所述方法中所使用的骨可以是尸体的。
在某些实施方式中，其中所述哺乳动物为野生型动物或转基因动物。
在某些实施方式中，其中所述转基因动物为通过基因改造或人源化改造实现低免疫源性的动物。例如，所述骨或软骨材料来源于转基因克隆猪。
在某些实施方式中，其中所述转基因动物为敲除α-Gal抗原的动物。例如，所述转基因克隆猪可以包括敲除α-Gal抗原的猪。
在某些实施方式中，其中所述转基因动物敲除选自下组的一个或多个基因：Galα1，3Galβ1和4GlcNAc-R。例如，其中所述转基因动物可以是Galα1，3Galβ1和4GlcNAc-R三基因敲除动物。又例如，所述转基因动物可以是Galα1，3Galβ1和4GlcNAc-R三基因敲除猪。
在某些实施方式中，其中所述骨或软骨材料基本上不含α-1,3-半乳糖苷(α-Gal)。
脱细胞化后，骨可以被分离用于各种整形外科应用，包括采用完整骨、骨的部分或碎片(morsalized pieces)。由于骨保留其天然ECM和机械特性，骨还可以被再细胞化或用包括骨髓抽吸物、单核细胞、内皮细胞、干细胞、骨特异性细胞等的细胞接种。所述再细胞化的组织提供超过自体移植组织的优点，因为它能够给大的损伤、空隙(void)或切除部位提供功能性机械支持。脱细胞化的骨或其任何部分，再细胞化或没有再细胞化，均可以被用于移植入患者。
长骨、短骨、扁骨及其他不规则骨的内部，肋骨、脊柱骨等各种松质骨可以被用于本发明的方法，骨包括四种主要细胞类型(其由本发明的脱细胞化方法去除)，包括成骨细胞、骨细胞、骨衬细胞和破骨细胞。
在某些实施方式中，其中所述骨包括皮质骨或去筋膜的骨材料。
在某些实施方式中，其中所述骨来源于松质骨、密质骨或皮质骨。
在某些实施方式中，其中所述骨或软骨材料的DNA含量小于约100ng/mg。
脱细胞骨或软骨材料的制备方法
一方面，本申请提供了一种脱细胞骨或软骨材料的制备方法，其包括：
(1)将骨或软骨材料放入含有氯化钙和氯化镁的Tris-HCL溶液浸泡并震荡或搅拌处理；
(2)将步骤(1)处理后得到的骨或软骨材料放入含有EDTA的Tris-HCL溶液或者含有EDTA和SDS的Tris-HCL溶液中并震荡或搅拌浸泡处理；
(3)将步骤(2)处理后得到的骨或软骨材料放入蛋白酶溶液中并震荡或搅拌处理；
(4)将步骤(3)处理后得到的骨或软骨材料放入CTAB溶液中浸泡并震荡、搅拌或超声处理；
(5)将步骤(4)处理后得到的骨或软骨材料放入低渗溶液进行清洗，得到所述脱细胞骨或软骨材料；
其中，步骤(1)至步骤(4)的顺序可以任意调换。
在某些实施方式中，所述脱细胞骨或软骨材料的制备方法，其包括：
(1)将骨或软骨材料放入含有EDTA的Tris-HCL溶液或者含有EDTA和SDS的Tris-HCL溶液中并震荡或搅拌浸泡处理；
(2)将步骤(1)处理后得到的骨或软骨材料放入含有氯化钙和氯化镁的Tris-HCL溶液浸泡并震荡或搅拌处理；
(3)将步骤(2)处理后得到的骨或软骨材料放入蛋白酶溶液中并震荡或搅拌处理；
(4)将步骤(3)处理后得到的骨或软骨材料放入CTAB溶液中浸泡并震荡、搅拌或超声处理；
(5)将步骤(4)处理后得到的骨或软骨材料放入低渗溶液进行清洗，得到所述脱细胞骨或软骨材料。
在某些实施方式中，所述脱细胞骨或软骨材料的制备方法，其包括：
(1)将骨或软骨材料放入含有EDTA的Tris-HCL溶液或者含有EDTA和SDS的Tris-HCL溶液中并震荡或搅拌浸泡处理；
(2)将步骤(1)处理后得到的骨或软骨材料放入CTAB溶液中浸泡并震荡、搅拌或超声处理；
(3)将步骤(2)处理后得到的骨或软骨材料放入含有氯化钙和氯化镁的Tris-HCL溶液浸泡并震荡或搅拌处理；
(4)将步骤(3)处理后得到的骨或软骨材料放入蛋白酶溶液中并震荡或搅拌处理；
(5)将步骤(4)处理后得到的骨或软骨材料放入低渗溶液进行清洗，得到所述脱细胞骨或软骨材料。
在某些实施方式中，所述脱细胞骨或软骨材料的制备方法，其包括：
(1)将骨或软骨材料放入蛋白酶溶液中并震荡或搅拌处理；
(2)将步骤(1)处理后得到的骨或软骨材料放入含有EDTA的Tris-HCL溶液或者含有EDTA和SDS的Tris-HCL溶液中并震荡或搅拌浸泡处理；
(3)将步骤(2)处理后得到的骨或软骨材料放入CTAB溶液中浸泡并震荡、搅拌或超声处理；
(4)将步骤(3)处理后得到的骨或软骨材料放入含有氯化钙和氯化镁的Tris-HCL溶液浸泡并震荡或搅拌处理；
(5)将步骤(4)处理后得到的骨或软骨材料放入低渗溶液进行清洗，得到所述脱细胞骨或软骨材料。
在某些实施方式中，所述脱细胞骨或软骨材料的制备方法，其包括：
(1)将骨或软骨材料放入CTAB溶液中浸泡并震荡、搅拌或超声处理；
(2)将步骤(1)处理后得到的骨或软骨材料放入蛋白酶溶液中并震荡或搅拌处理；
(3)将步骤(2)处理后得到的骨或软骨材料放入含有EDTA的Tris-HCL溶液或者含有EDTA和SDS的Tris-HCL溶液中并震荡或搅拌浸泡处理；
(4)将步骤(3)处理后得到的骨或软骨材料放入含有氯化钙和氯化镁的Tris-HCL溶液浸泡并震荡或搅拌处理；
(5)将步骤(4)处理后得到的骨或软骨材料放入低渗溶液进行清洗，得到所述脱细胞骨或软骨材料。
在某些实施方式中，脱细胞骨或软骨材料的制备方法包括：
(1)将骨或软骨材料放入含有氯化钙和氯化镁的Tris-HCL溶液浸泡并震荡或搅拌处理；
(2)将步骤(1)处理后得到的骨或软骨材料放入含有EDTA和SDS的Tris-HCL溶液中并震荡或搅拌浸泡处理；
(3)将步骤(2)处理后得到的骨或软骨材料放入蛋白酶溶液中并震荡或搅拌处理；
(4)将步骤(3)处理后得到的骨或软骨材料放入CTAB溶液中浸泡并震荡、搅拌或超声处理；
(5)将步骤(4)处理后得到的骨或软骨材料放入低渗溶液进行清洗，得到所述脱细胞骨或软骨材料；
其中，步骤(1)至步骤(4)的顺序可以任意调换。
在某些实施方式中，脱细胞骨或软骨材料的制备方法包括：
(1)将骨或软骨材料放入含有氯化钙和氯化镁的Tris-HCL溶液浸泡并震荡或搅拌处理；
(2)将步骤(1)处理后得到的骨或软骨材料放入含有EDTA的Tris-HCL溶液中并震荡或搅拌浸泡处理；
(3)将步骤(2)处理后得到的骨或软骨材料放入蛋白酶溶液中并震荡或搅拌处理；
(4)将步骤(3)处理后得到的骨或软骨材料放入CTAB溶液中浸泡并震荡、搅拌或超声处理；
(5)将步骤(4)处理后得到的骨或软骨材料放入低渗溶液进行清洗，得到所述脱细胞骨或软骨材料；
其中，步骤(1)至步骤(4)的顺序可以任意调换。
在某些实施方式中，其中所述步骤(1)、(2)和(3)和/或(4)可以任意重复1～3次。
例如，所述方法包括：
(1)将哺乳动物骨或软骨材料用含有氯化钙和氯化镁的Tris-HCL溶液浸泡并震荡或搅拌处理；
(2)将步骤(1)处理后得到的骨或软骨材料放入蛋白酶溶液中并震荡或搅拌处理；
(3)将步骤(2)处理后得到的骨或软骨材料放入CTAB溶液中浸泡并震荡或搅拌或超声处理；
(4)将步骤(3)处理后得到的骨或软骨材料放入含有氯化钙和氯化镁的Tris-HCL溶液浸泡并震荡或搅拌处理；
(5)将步骤(4)处理后得到的骨或软骨材料放入装有含有SDS和EDTA的Tris-HCL溶液中并震荡或搅拌浸泡处理；
(6)将步骤(5)处理后得到的骨或软骨材料放入蛋白酶溶液中并震荡或搅拌过夜处理；
(7)将步骤(6)处理后得到的骨或软骨材料放入CTAB溶液中浸泡并震荡或搅拌处理；
(8)将步骤(7)处理后得到的骨或软骨材料放入低渗溶液中超声处理，得到所述脱细胞骨或软骨材料。
在某些实施方式中，其中所述步骤(1)和(2)中的Tris-HCL溶液为约10mM～约100mM，PH值为6.8～8.0。例如，所述步骤(1)和(2)中的Tris-HCL溶液为约10mM，约15mM，约20mM，约25mM，约30mM，约35mM，约40mM，约45mM，约50mM，约55mM，约60mM，约65mM，7约0mM，约75mM，约80mM，约85mM，约90mM，约95mM或约100mM。例如，所述步骤(1)和(2)中的Tris-HCL溶液为约10mM～约90mM，约10mM～约80mM，约10mM～约70mM，约10mM～约60mM，约10mM～约50mM，约10mM～约40mM，约10mM～约30mM，约10mM～约20mM，约20mM～约100mM，约20mM～约90mM，约20mM～约80mM，约20mM～约70mM，约20mM～约60mM，约20mM～约50mM，约20mM～约40mM，约20mM～约30mM，约30mM～约100mM，约30mM～约90mM，约30mM～约80mM，约30mM～约70mM，约30mM～约60mM，约30mM～约50mM，约30mM～约40mM，约40mM～约100mM，约40mM～约90mM，约40mM～约80mM，约40mM～约70mM，约40mM～约60mM，约40mM～约50mM，约50mM～约100mM，约50mM～约90mM，约50mM～约80mM，约50mM～约70mM或约50mM～约60mM。例如，所述步骤(1)和(2)中的Tris-HCL溶液PH值为约6.8，约6.9，约7.0，约7.1，约7.2，约7.3，约7.4，约7.5，约7.6，约7.7，约7.8，约7.9，约8.0。例如，所述步骤(1)和(2)中的Tris-HCL溶液PH值为约6.8～约7.9，约6.8～约7.8，约6.8～约7.7，约6.8～约7.6，约6.8～约7.5，约6.8～约7.4，约6.8～约7.3，约6.8～约7.2，约6.8～约7.1，约6.8～约7.0，约6.9～约7.9，约6.9～约7.8，约6.9～约7.7，约6.9～约7.6，约6.9～约7.5，约6.9～约7.4，约6.9～约7.3，约6.9～约7.2，约6.9～约7.1，约6.9～约7.0，约7.0～约7.9，约7.0～约7.8，约7.0～约7.7，约7.0～约7.6，约7.0～约7.5，约7.0～约7.4，约7.0～约7.3，约7.0～约7.2或约7.0～约7.1。
在某些实施方式中，其中所述步骤(1)和(2)中的Tris-HCL溶液为约50mM～约100mM，PH值为约7.0～约7.6。
在某些实施方式中，其中所述步骤(2)中的Tris-HCL溶液中EDTA的浓度为约0.1wt％～10wt％。例如，所述步骤(2)中的Tris-HCL溶液中EDTA的浓度为约0.1wt％～约10wt％，约0.1wt％～约9wt％，约0.1wt％～约8wt％，约0.1wt％～约7wt％，约0.1wt％～约6wt％，约0.1wt％～约5wt％，约0.1wt％～约4wt％，约0.1wt％～约3wt％，约0.1wt％～约2wt％，约0.1wt％～约1wt％，约0.2wt％～约10wt％，约0.2wt％～约9wt％，约0.2wt％～约8wt％，约0.2wt％～约7wt％，约0.2wt％～约6wt％，约0.2wt％～约5wt％，约0.2wt％～约4wt％，约0.2wt％～约3wt％，约0.2wt％～约2wt％，约0.2wt％～约1wt％，约0.3wt％～约10wt％，约0.3wt％～约9wt％，约0.3wt％～约8wt％，约0.3wt％～约7wt％，约0.3wt％～约6wt％，约0.3wt％～约5wt％，约0.3wt％～约4wt％，约0.3wt％～约3wt％，约0.3wt％～约2wt％，约0.3wt％～约1wt％，约0.4wt％～约10wt％，约0.4wt％～约9wt％，约0.4wt％～约8wt％，约0.4wt％～约7wt％，约0.4wt％～约6wt％，约0.4wt％～约5wt％，约0.4wt％～约4wt％，约0.4wt％～约3wt％，约0.4wt％～约2wt％，约0.4wt％～约1wt％，约0.5wt％～约10wt％，约0.5wt％～约9wt％，约0.5wt％～约8wt％，约0.5wt％～约7wt％，约0.5wt％～约6wt％，约0.5wt％～约5wt％，约0.5wt％～约4wt％，约0.5wt％～约3wt％，约0.5wt％～约2wt％或约0.5wt％～约1wt％。例如，所述步骤(2)中的Tris-HCL溶液中EDTA的浓度为约0.1wt％～约1wt％，约0.1wt％～约0.9wt％，约0.1wt％～约0.8wt％，约0.1wt％～约0.7wt％，约0.1wt％～约0.6wt％，约0.1wt％～约0.5wt％，约0.1wt％～约0.4wt％，约0.1wt％～约0.3wt％，约0.1wt％～约0.2wt％，约0.2wt％～约1wt％，约0.2wt％～约0.9wt％，约0.2wt％～约0.8wt％，约0.2wt％～约0.7wt％，约0.2wt％～约0.6wt％，约0.2wt％～约0.5wt％，约0.2wt％～约0.4wt％，约0.2wt％～约0.3wt％，约0.3wt％～约1wt％，约0.3wt％～约0.9wt％，约0.3wt％～约0.8wt％，约0.3wt％～约0.7wt％，约0.3wt％～约0.6wt％，约0.3wt％～约0.5wt％，约0.3wt％～约0.4wt％，约0.4wt％～约1wt％，约0.4wt％～约0.9wt％，约0.4wt％～约0.8wt％，约0.4wt％～约0.7wt％，约0.4wt％～约0.6wt％，约0.4wt％～约0.5wt％，约0.5wt％～约1wt％，约0.5wt％～约0.9wt％，约0.5wt％～约0.8wt％，约0.5wt％～约0.7wt％或约0.5wt％～约0.6wt％。例如，所述步骤(2)中的Tris-HCL溶液中EDTA的浓度为约1wt％～约10wt％，约1wt％～约9wt％，约1wt％～约8wt％，约1wt％～约7wt％，约1wt％～约6wt％，约1wt％～约5wt％，约1wt％～约4wt％，约1wt％～约3wt％，约1wt％～约2wt％，约2wt％～约10wt％，约2wt％～约9wt％，约2wt％～约8wt％，约2wt％～约7wt％，约2wt％～约6wt％，约2wt％～约5wt％，约2wt％～约4wt％，约2wt％～约3wt％，约3wt％～约10wt％，约3wt％～约9wt％，约3wt％～约8wt％，约3wt％～约7wt％，约3wt％～约6wt％，约3wt％～约5wt％，约3wt％～约4wt％，约4wt％～约10wt％，约4wt％～约9wt％，约4wt％～约8wt％，约4wt％～约7wt％，约4wt％～约6wt％，约4wt％～约5wt％，约5wt％～约10wt％，约5wt％～约9wt％，约5wt％～约8wt％，约5wt％～约7wt％或约5wt％～约6wt％。
在些实施方式中，其中所述步骤(1)中Tris-HCL溶液中的氯化镁的浓度为约0.2mM～约1mM，所述的氯化钙的浓度为约0.2mM～约4mM。
例如，所述步骤(1)中Tris-HCL溶液中的氯化镁的浓度为约0.2mM，约0.3mM，约0.4mM，约0.5mM，约0.6mM，约0.7mM，约0.8mM，约0.9mM，约1mM。例如，所述步骤(1)中Tris-HCL溶液中的氯化镁的浓度为约0.2mM～约1mM，约0.2mM～约0.9mM，约0.2mM～约0.8mM，约0.2mM～约0.7mM，约0.2mM～约0.6mM，约0.2mM～约0.5mM，约0.2mM～约0.4mM，约0.2mM～约0.3mM，约0.3mM～约1mM，约0.3mM～约0.9mM，约0.3mM～约0.8mM，约0.3mM～约0.7mM，约0.3mM～约0.6mM，约0.3mM～约0.5mM，约0.3mM～约0.4mM，约0.4mM～约1mM，约0.4mM～约0.9mM，约0.4mM～约0.8mM，约0.4mM～约0.7mM，约0.4mM～约0.6mM，约0.4mM～约0.5mM，约0.5mM～约1mM，约0.5mM～约0.9mM，约0.5mM～约0.8mM，约0.5mM～约0.7mM或约0.5mM～约0.6mM。
例如，所述步骤(1)中Tris-HCL溶液中的氯化钙的浓度为约0.2mM，约0.3mM，约0.4mM，约0.5mM，约0.6mM，约0.7mM，约0.8mM，约0.9mM，约1mM，约1.2mM，约1.4mM，约1.6mM，约1.8mM，约2.0mM，约2.2mM，约2.4mM，约2.6mM，约2.8mM，约3.0mM，约3.2mM，约3.4mM，约3.6mM，约3.8mM，约4.0mM，。例如，所述步骤(1)中Tris-HCL溶液中的氯化镁的浓度为约0.2mM～约4mM，约0.2mM～约3.5mM，约0.2mM～约3mM，约0.2mM～约2.5mM，约0.2mM～约2mM，约0.2mM～约1.5mM，约0.2mM～约1.4mM，约0.2mM～约1.3mM，约0.2mM～约1.2mM，约0.2mM～约1.1mM，约0.2mM～约1.0mM，约0.3mM～约4mM，约0.3mM～约3.5mM，约0.3mM～约3mM，约0.3mM～约2.5mM，约0.3mM～约2mM，约0.3mM～约1.5mM，约0.3mM～约1.4mM，约0.3mM～约1.3mM，约0.3mM～约1.2mM，约0.3mM～约1.1mM，约0.3mM～约1.0mM，约0.4mM～约4mM，约0.4mM～约3.5mM，约0.4mM～约3mM，约0.4mM～约2.5mM，约0.4mM～约2mM，约0.4mM～约1.5mM，约0.4mM～约1.4mM，约0.4mM～约1.3mM，约0.4mM～约1.2mM，约0.4mM～约1.1mM，约0.4mM～约1.0mM，约0.5mM～约4mM，约0.5mM～约3.5mM，约0.5mM～约3mM，约0.5mM～约2.5mM，约0.5mM～约2mM，约0.5mM～约1.5mM，约0.5mM～约1.4mM，约0.5mM～约1.3mM，约0.5mM～约1.2mM，约0.5mM～约1.1mM或约0.5mM～约1.0mM。
在某些实施方式中，其中所述步骤(3)中所述的蛋白酶包括胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、dispase酶中的一种或多种。
在某些实施方式中，其中所述步骤(3)中所述的蛋白酶的浓度为约0.1wt％～约0.35wt％。
例如，所述步骤(3)中所述的蛋白酶的浓度为约0.1wt％，约0.15wt％，约0.2wt％，约0.25wt％，约0.3wt％或约0.35wt％。例如，所述步骤(3)中所述的蛋白酶的浓度为约0.1wt％～约0.35wt％，约0.1wt％～约0.3wt％，约0.1wt％～约0.25wt％，约0.1wt％～约0.2wt％，约0.1wt％～约0.15wt％，约0.15wt％～约0.35wt％，约0.15wt％～约0.3wt％，约0.15wt％～约0.25wt％，约0.15wt％～约0.2wt％，约0.2wt％～约0.35wt％，约0.2wt％～约0.3wt％或约0.2wt％～约0.25wt％。
在某些实施方式中，其中所述步骤(4)中所述CATB浓度为约0.1wt％～约1wt％。
例如，所述所述步骤(4)中所述CATB浓度为约0.1wt％，约0.2wt％，约0.3wt％，约0.4wt％，约0.5wt％，约0.6wt％，约0.7wt％，约0.8wt％，约0.9wt％或约1.0wt％。例如，所述所述步骤(4)中所述CATB浓度为约0.1wt％～约1wt％，约0.1wt％～约0.9wt％，约0.1wt％～约0.8wt％，约0.1wt％～约0.7wt％，约0.1wt％～约0.6wt％，约0.1wt％～约0.5wt％，约0.1wt％～约0.4wt％，约0.1wt％～约0.3wt％，约0.1wt％～约0.2wt％，约0.2wt％～约1wt％，约0.2wt％～约0.9wt％，约0.2wt％～约0.8wt％，约0.2wt％～约0.7wt％，约0.2wt％～约0.6wt％，约0.2wt％～约0.5wt％，约0.2wt％～约0.4wt％，约0.2wt％～约0.3wt％，约0.3wt％～约1wt％，约0.3wt％～约0.9wt％，约0.3wt％～约0.8wt％，约0.3wt％～约0.7wt％，约0.3wt％～约0.6wt％，约0.3wt％～约0.5wt％，约0.3wt％～约0.4wt％，约0.4wt％～约1wt％，约0.4wt％～约0.9wt％，约0.4wt％～约0.8wt％，约0.4wt％～约0.7wt％，约0.4wt％～约0.6wt％，约0.4wt％～约0.5wt％，约0.5wt％～约1wt％，约0.5wt％～约0.9wt％，约0.5wt％～约0.8wt％，约0.5wt％～约0.7wt％或约0.5wt％～约0.6wt％。
在某些实施方式中，当待处理材料为骨材料时，所述步骤(2)中的Tris-HCL溶液含有SDS。
在某些实施方式中，当待处理材料为骨材料时，所述步骤(2)包括将骨材料放入含有SDS和EDTA的Tris-HCL溶液中并震荡或搅拌浸泡处理；其中含有SDS(十二烷基硫酸钠)和EDTA(乙二胺四乙酸)的Tris-HCL溶液中SDS的浓度为0.1wt％～0.5wt％，EDTA浓度为1wt％～10wt％，其中Tris-HCL溶液为10mM～100mM，PH值为6.8～8.0。
在某些实施方式中，当待处理的材料软骨材料时，所述步骤(2)中的Tris-HCL溶液包含或不包含SDS。
在某些实施方式中，当待处理材料为软骨材料时，所述步骤(2)包括将软骨材料放入含有EDTA的Tris-HCL溶液中并震荡或搅拌浸泡处理，其中Tris-HCL溶液中EDTA浓度为0.1wt％～1wt％，其中Tris-HCL溶液为10mM～100mM，PH值为6.8～8.0。
在某些实施方式中，其中所述步骤(1)-(4)中所述的震荡或搅拌条件为转速50～150rpm，时间为4～24h，所述的震荡或搅拌的温度为18～60℃。
在某些实施方式中，当待处理材料为骨材料时，其中所述步骤(2)和(3)中所述的震荡或搅拌的温度不超过37℃。
在某些实施方式中，当待处理材料为骨材料时，其中所述步骤(1)-(4)中所述震荡或搅拌温度为15～37℃。
例如，所述脱细胞骨材料的制备方法包括：
(1)将骨材料放入含有氯化钙和氯化镁的Tris-HCL溶液浸泡并震荡或搅拌处理；
(2)将步骤(1)处理后得到的骨材料放入含有SDS和EDTA的Tris-HCL溶液或者含有EDTA和SDS的Tris-HCL溶液中并震荡或搅拌浸泡处理；
(3)将步骤(2)处理后得到的骨材料放入蛋白酶溶液中并震荡或搅拌处理；
(4)将步骤(3)处理后得到的骨材料放入CTAB溶液中浸泡并震荡、搅拌或超声处理；
(5)将步骤(4)处理后得到的骨材料放入低渗溶液进行清洗，得到所述脱细胞骨材料；
其中，步骤(1)至步骤(4)的顺序可以任意调换，其中所述步骤(1)-(4)中所述震荡或搅拌温度为15～37℃。
在某些实施方式中，当待处理材料为软骨材料时，其中所述步骤(1)-(4)中所述震荡或搅拌温度为18～60℃。
在某些实施方式中，当待处理材料为软骨材料时，所述步骤(1)、(2)和(4)中所述震荡或搅拌温度为40～60℃，步骤(3)中所述震荡或搅拌温度为18～37℃。
例如，所述脱细胞软骨材料的制备方法包括：
(1)将软骨材料放入含有氯化钙和氯化镁的Tris-HCL溶液浸泡并震荡或搅拌处理；
(2)将步骤(1)处理后得到的软骨材料放入含有EDTA的Tris-HCL溶液或者含有EDTA和SDS的Tris-HCL溶液中并震荡或搅拌浸泡处理；
(3)将步骤(2)处理后得到的软骨材料放入蛋白酶溶液中并震荡或搅拌处理；
(4)将步骤(3)处理后得到的软骨材料放入CTAB溶液中浸泡并震荡、搅拌或超声处理；
(5)将步骤(4)处理后得到的软骨材料放入低渗溶液进行清洗，得到所述脱细胞软骨材料；
其中，步骤(1)至步骤(4)的顺序可以任意调换，其中所述步骤(1)、(2)和(4)中所述震荡或搅拌温度为40～60℃，步骤(3)中所述震荡或搅拌温度为18～37℃。
在某些实施方式中，所述方法还包括：在所述步骤(1)之前使用低渗溶液清洗所述骨或软骨材料。
在某些实施方式中，其中所述的清洗都为低渗溶液超声清洗。
在某些实施方式中，其中所述的低渗溶液包括蒸馏水、去离子水或注射用水。
在某些实施方式中，其中所述的低渗溶液超声清洗为：频率为20kHz～60kHz，功率为180W～450W，温度为18℃～50℃，超声5～30分钟浸泡5～20分钟，再超声5～30分钟浸泡5～20分钟，低渗溶液浑浊时重新更换，重复1～3次。
在某些实施方式中，其中所述步骤(3)和(4)中所述超声处理条件为：频率为20kHz～60kHz，功率为180W～450W，温度为18℃～50℃，超声5～30分钟浸泡5～20分钟，再超声5～30分钟浸泡5～20分钟，重复1～3次。
另一方面，本申请提供了一种脱细胞骨材料的制备方法，所述方法包括：
(1)将骨材料放入含有氯化钙和氯化镁的Tris-HCL溶液浸泡并震荡或搅拌处理；
(2)将步骤(1)处理后得到的骨材料放入含有SDS和EDTA的Tris-HCL溶液中并震荡或搅拌浸泡处理；
(3)将步骤(2)处理后得到的骨材料放入蛋白酶溶液中并震荡或搅拌处理；
(4)将步骤(3)处理后得到的骨材料放入CTAB溶液中浸泡并震荡、搅拌或超声处理；
(5)将步骤(4)处理后得到的骨材料放入低渗溶液进行清洗，得到所述脱细胞骨材料；
其中，步骤(1)至步骤(4)的顺序可以任意调换。
另一方面，本申请提供了一种脱细胞软骨材料的制备方法，所述方法包括：
(1)将软骨材料放入含有EDTA的Tris-HCL溶液中并震荡或搅拌浸泡处理；
(2)将步骤(1)处理后得到的骨材料放入含有氯化钙和氯化镁的Tris-HCL溶液浸泡并震荡或搅拌处理；
(3)将步骤(2)处理后得到的软骨材料放入CTAB溶液中浸泡并震荡、搅拌或超声处理；
(4)将步骤(3)处理后得到的软骨材料放入蛋白酶溶液中并震荡或搅拌处理；
(5)将步骤(4)处理后得到的软骨材料放入低渗溶液进行清洗，得到所述脱细胞软骨材料；
其中，步骤(1)至步骤(4)的顺序可以任意调换。
本申请还公开了以下实施方式：
1.一种脱细胞骨或软骨材料的制备方法，其包括：
(1)将骨或软骨材料放入含有氯化钙和氯化镁的Tris-HCL溶液浸泡并震荡或搅拌处理；
(2)将步骤(1)处理后得到的骨或软骨材料放入含有EDTA的Tris-HCL溶液或者含有EDTA和SDS的Tris-HCL溶液中并震荡或搅拌浸泡处理；
(3)将步骤(2)处理后得到的骨或软骨材料放入蛋白酶溶液中并震荡或搅拌处理；
(4)将步骤(3)处理后得到的骨或软骨材料放入CTAB溶液中浸泡并震荡、搅拌或超声处理；
(5)将步骤(4)处理后得到的骨或软骨材料放入低渗溶液进行清洗，得到所述脱细胞骨或软骨材料；
其中，步骤(1)至步骤(4)的顺序可以任意调换。
2.根据实施方式1所述的方法，其中所述步骤(1)、(2)和(3)和/或(4)可以任意重复1～3次。
3.根据实施方式1-2中任一项所述的方法，其中所述步骤(1)和(2)中的Tris-HCL溶液为10mM～100mM，PH值为6.8～8.0。
4.根据实施方式1-3中任一项所述的方法，其中所述步骤(1)和(2)中的Tris-HCL溶液为50mM～100mM，PH值为7.0～7.6。
5.根据实施方式1-4中任一项所述的方法，其中所述步骤(2)中的Tris-HCL溶液中EDTA的浓度为0.1wt％～10wt％。
6.根据实施方式1-5中任一项所述的方法，其中所述步骤(1)中Tris-HCL溶液中的氯化镁的浓度为约0.2mM～1mM，所述的氯化钙的浓度为约0.2mM～4mM。
7.根据实施方式1-6中任一项所述的方法，其中所述步骤(3)中所述的蛋白酶包括胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、dispase酶中的一种或多种。
8.根据实施方式1-7中任一项所述的方法，其中所述步骤(3)中所述的蛋白酶的浓度为0.1wt％～0.35wt％。
9.根据实施方式1-8中任一项所述的方法，其中所述步骤(4)中所述CATB浓度为0.1wt％～1wt％。
10.根据实施方式1-9中任一项所述的方法，当待处理材料为骨材料时，所述步骤(2)中的Tris-HCL溶液含有SDS。
11.根据实施方式1-10中任一项所述的方法，当待处理材料为骨材料时，所述步骤(2)包括将骨材料放入含有SDS和EDTA的Tris-HCL溶液中并震荡或搅拌浸泡处理；其中含有SDS(十二烷基硫酸钠)和EDTA(乙二胺四乙酸)的Tris-HCL溶液中SDS的浓度为0.1wt％～0.5wt％，EDTA浓度为1wt％～10wt％，其中Tris-HCL溶液为10mM～100mM，PH值为6.8～8.0。
12.根据实施方式1-11中任一项所述的方法，当待处理的材料软骨材料时，所述步骤(2)中的Tris-HCL溶液包含或不包含SDS。
13.根据实施方式1-12中任一项所述的方法，当待处理材料为软骨材料时，所述步骤(2)包括将软骨材料放入含有EDTA的Tris-HCL溶液中并震荡或搅拌浸泡处理，其中Tris-HCL溶液中EDTA浓度为0.1wt％～1wt％，其中Tris-HCL溶液为10mM～100mM，PH值为6.8～8.0。
14.根据实施方式1-13中任一项所述的方法，其中所述步骤(1)-(4)中所述的震荡或搅拌条件为转速50～150rpm，时间为4～24h，所述的震荡或搅拌的温度为18～60℃。
15.根据实施方式1-14中任一项所述的方法，当待处理材料为骨材料时，其中所述步骤(2)和(3)中所述的震荡或搅拌的温度不超过37℃。
16.根据实施方式1-15中任一项所述的方法，当待处理材料为骨材料时，其中所述步骤(1)-(4)中所述震荡或搅拌温度为15～37℃。
17.根据实施方式1-16中任一项所述的方法，当待处理材料为软骨材料时，其中所述步骤(1)-(4)中所述震荡或搅拌温度为18～60℃。
18.根据实施方式1-17中任一项所述的方法，当待处理材料为软骨材料时，所述步骤(1)、(2)和(4)中所述震荡或搅拌温度为40～60℃，步骤(3)中所述震荡或搅拌温度为18～37℃。
19.根据实施方式1-18所述的方法，所述方法还包括：在所述步骤(1)之前使用低渗溶液清洗所述骨或软骨材料。
20.根据实施方式1-19所述的方法，其中所述的清洗都为低渗溶液超声清洗。
21.根据实施方式1-20中任一项所述的方法，其中所述的低渗溶液包括蒸馏水、去离子水或注射用水。
22.根据实施方式1-21中任一项所述的方法，其中所述的低渗溶液超声清洗为：频率为20kHz～60kHz，功率为180W～450W，温度为18℃～50℃，超声5～30分钟浸泡5～20分钟，再超声5～30分钟浸泡5～20分钟，低渗溶液浑浊时重新更换，重复1～3次。
23.根据实施方式1-22中任一项所述的方法，其中所述步骤(3)和(4)中所述超声处理条件为：频率为20kHz～60kHz，功率为180W～450W，温度为18℃～50℃，超声5～30分钟浸泡5～20分钟，再超声5～30分钟浸泡5～20分钟，重复1～3次。
24.一种脱细胞骨材料的制备方法，所述方法包括：
(1)将骨材料放入含有氯化钙和氯化镁的Tris-HCL溶液浸泡并震荡或搅拌处理；
(2)将步骤(1)处理后得到的骨材料放入含有SDS和EDTA的Tris-HCL溶液中并震荡或搅拌浸泡处理；
(3)将步骤(2)处理后得到的骨材料放入蛋白酶溶液中并震荡或搅拌处理；
(4)将步骤(3)处理后得到的骨材料放入CTAB溶液中浸泡并震荡、搅拌或超声处理；
(5)将步骤(4)处理后得到的骨材料放入低渗溶液进行清洗，得到所述脱细胞骨材料；其中，步骤(1)至步骤(4)的顺序可以任意调换。
25.一种脱细胞软骨材料的制备方法，所述方法包括：
(1)将软骨材料放入含有EDTA的Tris-HCL溶液中并震荡或搅拌浸泡处理；
(2)将步骤(1)处理后得到的骨材料放入含有氯化钙和氯化镁的Tris-HCL溶液浸泡并震荡或搅拌处理；
(3)将步骤(2)处理后得到的软骨材料放入CTAB溶液中浸泡并震荡、搅拌或超声处理；
(4)将步骤(3)处理后得到的软骨材料放入蛋白酶溶液中并震荡或搅拌处理；
(5)将步骤(4)处理后得到的软骨材料放入低渗溶液进行清洗，得到所述脱细胞软骨材料；
其中，步骤(1)至步骤(4)的顺序可以任意调换。
26.根据实施方式1-25中任一项所述的方法，其中所述骨或软骨材料来源于哺乳动物。
27.根据实施方式1-26中任一项所述的方法，其中所述骨或软骨材料来源于非人哺乳动物。
28.根据实施方式1-27中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物为野生型动物或转基因动物。
29.根据实施方式1-28中任一项所述的方法，其中所述转基因动物为通过基因改造或人源化改造实现低免疫源性的动物。
30.根据实施方式1-29中任一项所述的方法，其中所述转基因动物为敲除α-Gal抗原的动物。
31.根据实施方式1-30中任一项所述的方法，其中所述转基因动物敲除选自下组的一个或多个基因：Galα1，3Galβ1和4GlcNAc-R。例如，其中所述转基因动物可以是Galα1，3Galβ1和4GlcNAc-R三基因敲除动物。
32.根据实施方式1-31中任一项所述的方法，其中所述骨或软骨材料来源于猪。
33.根据实施方式1-32中任一项所述的方法，其中所述猪为野生型猪或转基因克隆猪。
34.根据实施方式1-33中任一项所述的方法，其中所述转基因克隆猪为通过基因改造或人源化改造实现低免疫源性的猪。
35.根据实施方式1-34中任一项所述的方法，其中所述转基因克隆猪包括敲除α-Gal抗原的猪。
36.根据实施方式1-35中任一项所述的方法，其中所述转基因克隆猪除选自下组的一个或多个基因：Galα1，3Galβ1和4GlcNAc-R。
37.根据实施方式1-36中任一项所述的方法，其中所述转基因克隆猪包括Galα1，3Galβ1和4GlcNAc-R三基因敲除猪。
38.根据实施方式1-37中任一项所述的方法，其中所述骨来源于松质骨、密质骨或皮质骨。
39.根据实施方式1-38中任一项所述的方法，其中所述骨或软骨材料的DNA含量小于约100ng/mg。
40.根据实施方式1-39中任一项所述的方法，其中所述骨或软骨材料基本上不含α-1,3-半乳糖苷(α-Gal)。
41.根据实施方式1-40中任一项所述的方法制备的脱细胞骨或软骨材料。
42.实施方式41所述的脱细胞骨或软骨材料在制备骨或软骨修复或填充材料中的应用。
43.生物植入材料，其包含实施方式41所述的脱细胞骨或软骨材料。
44.一种用于骨或软骨修复或填充的试剂盒，其包含实施方式41所述的脱细胞骨或软骨材料。
45.一种治疗骨或软骨组织损伤的方法，包括向受试者施用实施方式41所述的脱细胞骨或软骨材料。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的融合蛋白、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1：脱细胞骨材料的制备
本实施例提供了脱细胞骨材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)取健康成年猪的松质骨，清洗后，手术刀剔除肌肉组织及筋膜，留取骨基质，消毒处理后用骨锯切割成适当大小，清洗，放入蒸馏水中过夜浸泡，中间更换2次液体，浸泡后取出骨材料清洗，放入70％乙醇溶液中浸泡6小时，清洗后，放入蒸馏水中超声处理，超声频率为20KHz，功率为180W，温度为40℃，超声15分钟，浸泡15分钟，重复2次；
(2)取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复3次，用PH值为7.2的50mM Tris-HCL溶液且加入0.2mM氯化镁和0.5mM氯化钙室温浸泡持续震荡处理4小时，取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复2次；
(3)将上述材料浸泡至含有质量分数为0.1wt％的胰蛋白酶的水溶液中室温持续震荡8小时，蒸馏水清洗，再用质量分数为0.1wt％的CTAB且PH为7.2的50mM Tris-HCL溶液室温持续震荡4小时，取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复3次；
(4)取出材料，用PH值为7.2的50mM Tris-HCL溶液且加入0.2mM氯化镁和0.5mM氯化钙室温浸泡持续震荡处理4小时，取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复2次；
(5)用含有质量分数为0.1wt％的SDS和质量分数为1wt％的EDTA且PH为7.2的50mMTris-HCL溶液室温持续震荡4小时。取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复3次；
(6)将上述材料浸泡至含有质量分数为0.1wt％的胰蛋白酶的水溶液中室温持续震荡8小时，蒸馏水清洗，再用质量分数为0.1wt％的CTAB且PH为7.2的50mM Tris-HCL溶液室温持续震荡4小时，取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复3次；
(7)将以上处理的材料浸入去离子水中，放入超声波清洗仪中，超声频率为20KHz，功率为180W，温度为25℃，超声10分钟，浸泡15分钟，重复3次清洗后即得所需脱细胞骨材料。
实施例2：脱细胞骨材料的制备
本实施例提供了一种脱细胞骨材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)取健康成年猪的松质骨，清洗后，手术刀剔除肌肉组织及筋膜，留取骨基质，消毒处理后用骨锯切割成适当大小，清洗，放入蒸馏水中过夜浸泡，中间更换2次液体，浸泡后取出骨材料清洗，放入70％乙醇溶液中浸泡8小时，清洗后，放入蒸馏水中超声处理，超声频率为40KHz，功率为180W，温度为45℃，超声15分钟，浸泡15分钟，重复2次；
(2)取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复3次，用PH值为7.2的50mM Tris-HCL溶液且加入0.5mM氯化镁和1mM氯化钙室温浸泡持续震荡处理4小时，取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复2次；
(3)将上述材料浸泡至含有质量分数为0.1wt％的胰蛋白酶的水溶液中室温持续震荡8小时，蒸馏水清洗，再用质量分数为0.1wt％的CTAB且PH为7.2的50mM Tris-HCL溶液室温持续震荡4小时，取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复3次；
(4)取出材料，用PH值为7.2的50mM Tris-HCL溶液且加入0.5mM氯化镁和1mM氯化钙室温浸泡持续震荡处理4小时，取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复2次；
(5)用含有质量分数为0.1wt％的SDS和质量分数为10wt％的EDTA且PH为7.2的50mM Tris-HCL溶液室温持续震荡4小时。取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复3次；
(6)将上述材料浸泡至含有质量分数为0.25wt％的胰蛋白酶的水溶液中室温持续震荡8小时，蒸馏水清洗，再用质量分数为0.1wt％的CTAB且PH为7.2的50mM Tris-HCL溶液室温持续震荡4小时，取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复3次；
(7)将以上处理的材料浸入去离子水中，放入超声波清洗仪中，超声频率为20KHz，功率为180W，温度为18℃，超声10分钟，浸泡15分钟，重复2次清洗后即得所需脱细胞骨材料。
实施例3：脱细胞骨材料的制备
(1)取健康成年猪的松质骨，清洗后，手术刀剔除肌肉组织及筋膜，留取骨基质，消毒处理后用骨锯切割成适当大小，清洗，放入蒸馏水中过夜浸泡，中间更换2次液体，浸泡后取出骨材料清洗，放入70％乙醇溶液中浸泡8小时，清洗后，放入蒸馏水中超声处理，超声频率为40KHz，功率为180W，温度为45℃，超声15分钟，浸泡15分钟，重复2次；
(2)取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复3次，用PH值为7.2的100mM Tris-HCL溶液且加入0.5mM氯化镁和1mM氯化钙室温浸泡持续震荡处理4小时，取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复2次；
(3)将上述材料浸泡至含有质量分数为0.1wt％的胰蛋白酶的水溶液中室温持续震荡8小时，蒸馏水清洗，再用质量分数为0.1wt％的CTAB且PH为7.2的100mM Tris-HCL溶液室温持续震荡4小时，取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复3次；
(4)取出材料，用PH值为7.2的100mM Tris-HCL溶液且加入0.5mM氯化镁和1mM氯化钙室温浸泡持续震荡处理4小时，取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复2次；
(5)用含有质量分数为0.1wt％的SDS和质量分数为10wt％的EDTA且PH为7.2的100mM Tris-HCL溶液室温持续震荡4小时。取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复3次；
(6)将上述材料浸泡至含有质量分数为0.25wt％的胰蛋白酶的水溶液中室温持续震荡8小时，蒸馏水清洗，再用质量分数为0.1wt％的CTAB且PH为7.2的100mM Tris-HCL溶液室温持续震荡4小时，取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复3次；
(7)将以上处理的材料浸入去离子水中，放入超声波清洗仪中，超声频率为20KHz，功率为180W，温度为18℃，超声10分钟，浸泡15分钟，重复2次清洗后即得所需脱细胞骨材料。
实施例4：脱细胞骨材料的制备
本实施例提供了一种脱细胞骨材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)取健康成年猪的松质骨，清洗后，手术刀剔除肌肉组织及筋膜，留取骨基质，消毒处理后用骨锯切割成适当大小，清洗，放入蒸馏水中过夜浸泡，中间更换2次液体，浸泡后取出骨材料清洗，放入70％乙醇溶液中浸泡8小时，清洗后，放入蒸馏水中超声处理，超声频率为40KHz，功率为180W，温度为45℃，超声30分钟，浸泡15分钟，重复2次；
(2)取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复3次，用PH值为7.2的100mM Tris-HCL溶液且加入0.5mM氯化镁和1mM氯化钙室温浸泡持续震荡处理4小时，取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复2次；
(3)将上述材料浸泡至含有质量分数为0.3wt％的胰蛋白酶的水溶液中室温持续震荡8小时，蒸馏水清洗，再用质量分数为0.1wt％的CTAB且PH为7.2的100mM Tris-HCL溶液室温持续震荡4小时，取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复3次；
(4)取出材料，用PH值为7.2的100mM Tris-HCL溶液且加入0.5mM氯化镁和1mM氯化钙室温浸泡持续震荡处理4小时，取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复2次；
(5)用含有质量分数为0.1wt％的SDS和质量分数为10wt％的EDTA且PH为7.2的100mM Tris-HCL溶液室温持续震荡4小时。取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复3次；
(6)将上述材料浸泡至含有质量分数为0.3wt％的胰蛋白酶的水溶液中室温持续震荡8小时，蒸馏水清洗，再用质量分数为0.1wt％的CTAB且PH为7.2的100mM Tris-HCL溶液室温持续震荡4小时，取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复3次；
(7)将以上处理的材料浸入去离子水中，放入超声波清洗仪中，超声频率为20KHz，功率为180W，温度为18℃，超声10分钟，浸泡15分钟，重复2次清洗后即得所需脱细胞骨材料。
实施例5：脱细胞骨材料的制备
本实施例提供了一种脱细胞骨材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)取健康成年猪的松质骨，清洗后，手术刀剔除肌肉组织及筋膜，留取骨基质，消毒处理后用骨锯切割成适当大小，清洗，放入蒸馏水中过夜浸泡，中间更换2次液体，浸泡后取出骨材料清洗，放入70％乙醇溶液中浸泡8小时，清洗后，放入蒸馏水中超声处理，超声频率为40KHz，功率为180W，温度为45℃，超声30分钟，浸泡15分钟，重复2次；
(2)取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复3次，用PH值为7.2的100mM Tris-HCL溶液且加入0.5mM氯化镁和1mM氯化钙室温浸泡持续震荡处理4小时，取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复2次；
(3)将上述材料浸泡至含有质量分数为0.3wt％的胰蛋白酶的水溶液中室温持续震荡8小时，蒸馏水清洗，再用质量分数为1wt％的CTAB且PH为7.2的100mM Tris-HCL溶液室温持续震荡4小时，取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复3次；
(4)取出材料，用PH值为7.2的100mM Tris-HCL溶液且加入0.5mM氯化镁和1mM氯化钙室温浸泡持续震荡处理4小时，取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复2次；
(5)用含有质量分数为0.1wt％的SDS和质量分数为10wt％的EDTA且PH为7.2的100mM Tris-HCL溶液室温持续震荡4小时。取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复3次；
(6)将上述材料浸泡至含有质量分数为0.3wt％的胰蛋白酶的水溶液中室温持续震荡8小时，蒸馏水清洗，再用质量分数为1wt％的CTAB且PH为7.2的100mM Tris-HCL溶液室温持续震荡4小时，取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复3次；
(7)将以上处理的材料浸入去离子水中，放入超声波清洗仪中，超声频率为40KHz，功率为180W，温度为20℃，超声15分钟，浸泡15分钟，重复3次清洗后即得所需脱细胞骨材料。
实施例6：脱细胞骨材料的制备
本实施例提供了一种脱细胞材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)取健康成年猪的松质骨，清洗后，手术刀剔除肌肉组织及筋膜，留取骨基质，消毒处理后用骨锯切割成适当大小，清洗，放入蒸馏水中过夜浸泡，中间更换2次液体，浸泡后取出骨材料清洗，放入70％乙醇溶液中浸泡8小时，清洗后，放入蒸馏水中超声处理，超声频率为40KHz，功率为180W，温度为50℃，超声20分钟，浸泡15分钟，重复2次；
(2)取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复3次，用PH值为7.2的100mM Tris-HCL溶液且加入0.5mM氯化镁和1mM氯化钙室温浸泡持续震荡处理4小时，取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复2次；
(3)将上述材料浸泡至含有质量分数为0.35wt％的胰蛋白酶的水溶液中室温持续震荡8小时，蒸馏水清洗，再用质量分数为1wt％的CTAB且PH为7.2的100mM Tris-HCL溶液室温持续震荡4小时，取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复3次；
(4)取出材料，用PH值为7.2的100mM Tris-HCL溶液且加入0.5mM氯化镁和1mM氯化钙室温浸泡持续震荡处理4小时，取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复2次；
(5)用含有质量分数为0.5wt％的SDS和质量分数为10wt％的EDTA且PH为7.2的100mM Tris-HCL溶液室温持续震荡4小时。取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复3次；
(6)将上述材料浸泡至含有质量分数为0.35wt％的胰蛋白酶的水溶液中室温持续震荡8小时，蒸馏水清洗，再用质量分数为1wt％的CTAB且PH为7.2的100mM Tris-HCL溶液室温持续震荡4小时，取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复3次；
(7)将以上处理的材料浸入去离子水中，放入超声波清洗仪中，超声频率为40KHz，功率为300W，温度为35℃，超声15分钟，浸泡15分钟，重复3次清洗后即得所需脱细胞骨材料。
实施例7：脱细胞软骨材料的制备
本实施例提供了一种脱细胞软骨材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)取健康成年猪的肋骨末端，蒸馏水清洗，手术刀削去其他组织及筋膜组织，用剪骨刀将其剪为1-2厘米长度的小段，低渗溶液浸泡完全融化，融化后加入低渗溶液至烧杯中，将放入材料的烧杯放入超声波清洗仪中，进行超声处理，超声频率为50KHz，功率为180W，温度为50℃，超声25分钟，浸泡15分钟，重复2次；
(2)取出材料，蒸馏水将组织清洗干净，放入装有含有0.2wt％的EDTA的PH为7.8浓度为10mM的Tris-Hcl溶液中，放摇床上震荡处理，45℃过夜震荡；
(3)将上述材料蒸馏水清洗后，浸泡至含有质量分数为0.25wt％的胰蛋白酶的水溶液中室温持续震荡8小时，蒸馏水清洗，用PH值为7.8的10mM Tris-HCL溶液且加入1mM氯化镁和2mM氯化钙室温浸泡持续震荡处理4小时，取出材料，室温条件蒸馏水浸泡震荡清洗，震荡条件为1分钟换水一次清洗，重复3次；
(4)将上述材料蒸馏水清洗后，用质量分数为2wt％的CTAB且PH为7.8的10mMTris-HCL溶液室温持续震荡6小时，取出材料，蒸馏水清洗，再用含有质量分数为0.25wt％的胰蛋白酶的水溶液中室温持续震荡8小时，蒸馏水清洗；
(5)将上述材料蒸馏水清洗后，用质量分数为0.1wt％的CTAB且PH为7.8的10mMTris-HCL溶液室温持续震荡6小时，取出材料，浸入低渗溶液中，放入超声波清洗仪中，超声频率为50KHz，功率为180W，温度为45℃，超声25分钟，浸泡15分钟，重复2次清洗后即得所需的脱细胞软骨材料。
实施例8：脱细胞效果外观观察试验
用实施案例1、2、3得到的脱细胞骨材料与市场同种异体骨条进行外观观察对比。肉眼观察：孔径大小，骨外观结构及颜色基本一致；用手去压并用剪骨刀剪取，硬度不变。
结果如图1所示，图1说明经实施例3的制备方法处理后，与同种异体骨外观和硬度几乎相同。
实施例9：脱细胞效果试验
用实施例1和实施例3得到的脱细胞骨材料和实施例7得到的脱细胞软骨材料进行脱细胞效果实验，脱细胞材料的脱细胞效果采用HE染色法进行鉴定。
HE染色法原理：HE染色法既是苏木精-伊红染色法，石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色，伊红为酸性，主要使细胞质和细胞外基质中成分着红色。
具体实施步骤包括：
(1)将组织经过固定，脱水，透明，浸蜡，包埋后制成石蜡切片；
(2)将石蜡切片进行HE染色：石蜡切片烤片后二甲苯Ⅰ中浸泡20min→二甲苯Ⅱ中浸泡20min→无水乙醇Ⅰ中浸泡5min→无水乙醇Ⅱ中浸泡3min→95％乙醇中浸泡3min→90％乙醇中浸泡3min→80％乙醇中浸泡3min→75％乙醇中浸泡3min→自来水浸洗3次控净→苏木素染色5min→自来水洗3-4次(可以在显微镜下观察一下是否清洗干净染液，不行继续清洗)→1％盐酸酒精分化3-5s(在里面摇晃两下)在显微镜下观察，可以自来水洗3次→45度温水2min→自来水洗3次(在显微镜下观察可以再进行下一步染色)→1％伊红水溶液3min→自来水洗3次(显微镜下观察一下)→90％乙醇→95％乙醇→100％乙醇泡一下(里面晃动几下)→二甲苯Ⅰ(2min)→二甲苯Ⅱ(2min)→二甲苯Ⅲ(搁置至封片)→通风厨一直吹风第二天进行拍照。
如图2A-2B所示，经实施例3的制备方法处理后，脱细胞骨材料中的细胞已去除。
如图2C-2D所示，经实施例1的制备方法处理后，脱细胞骨材料中的细胞已去除。
如图2E-2F所示，经实施例7的制备方法处理后，脱细胞软骨材料中的细胞已去除。
实施例9：免疫原效果试验
用实施例3得到的脱细胞骨材料和实施例7得到的脱细胞软骨材料进行去免疫原效果试验，骨材料的去免疫原效果采用免疫荧光染色法进行鉴定，具体实施步骤包括：
1蜡块切片
包埋好的标本用切片机切石蜡切片(5μm)，并将蜡片贴附于多聚赖氨酸处理过的载玻片上；将切片从四度冰箱放入烘箱中，烘干2小时(如果有水可以烘箱烘2-8小时)；
2.脱蜡/复水
二甲苯I(15min)→二甲苯II(10min)→无水乙醇Ⅱ(5min)→95％乙醇(5min)→90％乙醇(5min)→80％乙醇(5min)→75％乙醇(5min)→蒸馏水(2min)；
3.抗原修复
在脱水时提前配制修复液：0.1mol/L且pH＝6.0的枸橼酸液修复液，C6H8O7.H2O0.2g，Na3C6H5O7.2H2O 1.5g调pH6.0定容至500mL；
将切片置于微波炉中修复，高火至将要沸腾关火，保持温度95℃，修复20min，将修复过的切片室温缓慢降至室温，用PBS洗3次，每次5min；
4.封闭内源性过氧化物酶
在玻片上的组织周围用油性笔画圈，在圈中滴加3％过氧化氢(H2O2)室温浸30min；
5.染色：
(1)用PBS洗3次，每次5min，擦去PBS；
(2)即用型山羊血清封闭，常温封闭90min；
(3)加入一抗4度过夜，或按照一抗说明条件进行孵育。(对于植物凝集素直接一抗标记荧光湿盒中避光孵育1小时，用PBS 3分钟×3次洗去一抗，用滤纸擦去标本外的PBS；
(4)滴加DAPI避光孵育2分钟，可对标本进行显核，蓝色荧光，用PBS 1分钟×3次洗去DAPI，用滤纸擦去标本外的PBS；
(5)最后用含甘油封片，并在荧光显微镜下立即观察，如果组织含有α-1,3-半乳糖苷则荧光显微镜下观察呈红色荧光；滴加DAPI避光孵育2分钟，可对标本进行显核，蓝色荧光，效果极佳，封片，并在荧光显微镜下立即观察。
如图3A-3B所示，经实施例3制备方法处理后，脱细胞骨材料中已无α-1,3-半乳糖苷。
如图3C-3D所示，经实施例7制备方法处理后，脱细胞软骨材料中已无α-1,3-半乳糖苷。
实施例10：骨胶原蛋白检测
骨材料主要以骨胶原为主，采用Masson染色法进行鉴定骨材料是否保留天然的骨胶原，而去除其余可能引起免疫排斥反应的肌纤维及红细胞和其它成分，具体实施步骤包括：
1.蜡块切片
60度烤片2-8小时一般为2或3小时(切片时要用防脱片)或过夜烤片；
2.脱蜡
二甲苯I 20min二甲苯II 20min；
3.梯度酒精复水
二甲苯I(15min)→二甲苯II(10min)→无水乙醇Ⅱ(5min)→95％乙醇(5min)→90％乙醇(5min)→80％乙醇(5min)→75％乙醇(5min)→蒸馏水(2min)；
4.重铬酸钾染色
切片入重铬酸钾浸泡过夜，自来水洗；
5.铁苏木素染色
铁苏木素A液与B液等比混合成铁苏木素染液，切片入铁苏木素3min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水清洗；
6.丽春红酸性品红染色
(切片入丽春红酸性品红浸染5-10min，自来水漂洗；
7.磷钼酸染色
磷钼酸水溶液浸染1-3min。6、苯胺蓝染色：磷钼酸之后不用水洗，直接入苯胺蓝染液染3-6min；
8.分化
切片用1％冰醋酸分化，两缸无水乙醇脱水；
9.透明封片
切片放入第三缸无水乙醇5min，二甲苯5min透明，中性树胶封片。
10.显微镜镜检，图像采集分析
胶原纤维呈蓝色；肌纤维、纤维素和红细胞呈红色。
结果如图4所示，图4说明经实施例3制备方法处理后，组织材料保留天然骨胶原成分，去除了其余可能引起免疫排斥反应的肌纤维、纤维素和红细胞等。
实施例11：残留DNA含量检测
对实施例3得到的骨材料进行DNA含量检测(检测方法参照2015药典第三部，3407)，采用
Figure BDA0003968875290000331
Residual DNA Sample Preparation Kit进行DNA提取纯化，DNA含量测定采用Invitrogen Quant-IT PicoGreen dsDNAReagent and Kit采用荧光酶标仪进行检测鉴定。
具体实施步骤包括：
一、实验准备
1.试剂准备：
(1)配制3％的BSA；
(2)根据用量稀释20×TE至1×；
(3)Binding Solution结合液准备：30mL 100％异丙醇加入Binding Solution瓶，室温保存；
(4)Wash Buffer洗脱液准备：74mL 95％乙醇，加入Wash Buffer瓶中，室温保存；
(5)Lysis Solution Mix裂解缓冲液准备(成分见表1)：每100μL样品加360μL的裂解缓冲液；
表1 Lysis Solution Mix裂解缓冲液
Glycogen(5mg/mL) 180μL
tRNA(10mg/mL) 4μL
Lysis buffer 7600μL
(6)孵化磁性颗粒：37℃孵化，间歇涡旋混匀10min；
(7)回收率样品准备：取DNA检测试剂盒中DNA标准品用DEPC水依次逐级稀释为400ng、200ng、100ng、50ng、25ng、0ng各100μL(用时稀释)注：DNA标准品浓度为100μg/mL相当于100ng/μL，根据要求回收率浓度为400ng/100μL、200ng/100μL、100ng/100μL、50ng/100μL、25ng/100μL、0ng/100μL，配制两组8μL的DNA标准品加入到192μL的DEPC水中浓度为400ng/100μL，其余各管中加入100μL的DEPC水，从400ng/100μL管中吸取100μL至下一管中，浓度为200ng/100μL，依次逐级稀释配成相应浓度的溶液；
2.供试品材料样品准备：
供试品骨属于湿润型样品，需提前脱钙并烘干水分，取供试品少许，放入1.5mLDNase-free无菌离心管内，13000rpm/min离心10min，去除液体部分后以开盖状态放在安全柜内，令其自然干燥24小时，或将样品放在37℃干燥箱内直接烘干；将样品研磨碎，称其重量并记录，待用；供试品样品具体信息如表2所示。
表2供试品样品信息表
样品名称 野生型样本 实施例3样本 TKO猪样本
样品干重(mg) 80.0 98.4 104.0
3.仪器及器材准备：
(1)水浴锅提前预热37℃和56℃；
(2)烘箱；
(3)酶标仪；
(4)磁力架；
(5)冷冻离心机；
(6)天平
(7)96孔板(黑色)；
二、实验过程：
1.蛋白酶K消化：
(1)将上述准备好的样品称重并液氮研磨碎，加入缓冲液500μL进行组织匀浆，匀浆后取出珠子，加入缓冲液和蛋白酶K进行消化，终体积为1ml。记录数据，加蛋白酶K缓冲液100μL，蛋白酶K(20mg/mL)50μL，加DEPC水至终体积为1ml。各样品取210μL为供试品备用，水解；
(2)将上述准备的回收率样品100μL，加蛋白酶K缓冲液20μL，蛋白酶K(20mg/mL)10μL，3％BSA 80μL，至终体积为210μL(保证与供试品样品体系相同)；
(3)将上述供试品和回收率样品分别混匀后放在56℃水浴锅内过夜消化，直至检测样品完全消化，无肉眼可见颗粒物为止；
2.DNA提取纯化：
准备：配制Lysis Solution Mix裂解缓冲液准备，孵化磁珠，Binding Solution结合液准备：30mL 100％异丙醇加入Binding Solution瓶，室温保存；Wash Buffer洗脱液准备：74mL 95％乙醇，加入Wash Buffer瓶中，室温保存；
(1)配制Lysis Solution Mix裂解缓冲液(成分见表1)：各样品分别加入裂解液400μL需要配制7600μL＝7.6mL；
(2)以上处理好的样品各加入400μL裂解缓冲液，震荡10秒钟使样品充分混匀，室温静置10min，使样品完全溶解；
(3)取出装有磁珠的离心管，震荡10秒钟充分混匀，每个样中加入30μL孵育好的磁性颗粒(共需要630μL可以吸取650μL磁珠到1.5mLEP管先进行孵化，水浴锅37℃孵育，间歇涡旋混匀10min)低速震荡10秒钟混匀；
(4)加入400μL结合液立即翻转两次混合(异丙醇Binding Solution结合液准备：30mL100％异丙醇加入Binding Solution瓶，室温保存)，室温下涡旋震荡孵育10min；
(5)再次低速震荡10秒钟之后，将管子放在磁力架上，静置，直到溶液澄清，不扰乱磁珠，吸去上清液；
(6)清洗DNA：从磁力架上取下管子，然后向管中加入300μL洗涤溶液(washbuffer)，涡旋管子20秒钟，然后将管子放在磁力架上，静置，直到溶液澄清，不扰乱磁珠，吸去上清液，重复清洗一次；
(7)吸去溶液后，将结合有DNA的磁珠打开管盖室温下干燥5min；
(8)洗脱DNA：每管中加入40μL洗脱缓冲液(Elution buffer)，高速涡旋管10秒，然后将管在70℃下孵育7分钟。在孵化期间涡旋管两到三次帮助重新悬浮。
(9)将管置于磁性支架上静置2分钟。将含有洗脱的DNA的液体转移到新的1.5mL离心管中。重复步骤(8)和(9)最终获得纯化的DNA为150μL。可以取出10μL跑电泳，其余-20℃保存，便于后期检测。
3.检测：
(1)DNA标准曲线样品制备：
标准品溶液的配制：用1×TE缓冲液将DNA标准品配制成0ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL的标准品溶液各400μL。
配制过程：DNA标准品浓度为100μg/mL相当于100000ng/mL先稀释成80ng/mL，相当于稀释1250倍，即：吸取1μL标准品至1249μL的1×TE缓冲液的溶液中混匀即浓度为80ng/mL，吸取800μL进行逐级稀释，准备灭菌的1.5mL EP管，每管中加入400μL的1×TE缓冲液，然后如表4所示逐级稀释。
(2)回收率样品和供试品样品准备：
取回收率实验DNA纯化样品和供试品DNA纯化样品各10μL，加入1×TE缓冲液390μL得到40倍稀释液400μL。
(3)取上述(1)和(2)中的各样品加入96孔板，每个孔加入125μL，每份样品设3个复孔，并加入1×TE缓冲液，设3个复孔作为本底，96孔板上样顺序如表3所示。
表3DNA残留量检测加样顺序表
Figure BDA0003968875290000351
Figure BDA0003968875290000361
(4)分别于上述个样品中添加PicoGreen反应液125μL(与样品等体积混合)，PicoGreen反应液为PicoGreen原液用1X TE缓冲液稀释200倍配制。震荡混匀后室温避光反应5min后，(如果没有黑色96孔板添加PicoGreen反应液要避光)用荧光酶标仪测定。测定条件以480nm为激发波长，以520nm为发射波长，以530nm为载止波长进行测定，以所得数据作图分析并求得回归方程。以1X TE缓冲液为样品测得的荧光强度值为本底，测定和记录各测定孔的荧光度值，检测数据如表4所示；
表4测定和记录各测定孔的荧光度值的检测数据表
Figure BDA0003968875290000362
Figure BDA0003968875290000371
(5)根据检测数据进行分析，通过荧光度值及标准品的DNA含量绘制标准曲线图，如图5所示；
(6)根据标准曲线和回收率样本的荧光度值计算实际回收样本的值如表5所示，通过实际回收样本值与样本原始数据值的比值计算DNA的回收率如图6所示；
表5回收率样本的检测数值和实际数值表
Figure BDA0003968875290000372
(7)通过以上检测数据及标准曲线和回收率曲线的数值计算，得到表6的DNA含量数据表，通过表7中的数据说明经实施例3制备方法处理后的材料DNA含量极少，已达到含量要求标准，且符合国家标准，工艺简单且工艺不使用核酸酶处理即可去除外源DNA。
表6样品DNA含量数据计算表。
Figure BDA0003968875290000373
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Figure BDA0003968875290000381
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Claims (10)

1.一种脱细胞骨或软骨材料的制备方法，其包括：
(1)将骨或软骨材料放入含有氯化钙和氯化镁的Tris-HCL溶液浸泡并震荡或搅拌处理；
(2)将步骤(1)处理后得到的骨或软骨材料放入含有EDTA的Tris-HCL溶液或者含有EDTA和SDS的Tris-HCL溶液中并震荡或搅拌浸泡处理；
(3)将步骤(2)处理后得到的骨或软骨材料放入蛋白酶溶液中并震荡或搅拌处理；
(4)将步骤(3)处理后得到的骨或软骨材料放入CTAB溶液中浸泡并震荡、搅拌或超声处理；
(5)将步骤(4)处理后得到的骨或软骨材料放入低渗溶液进行清洗，得到所述脱细胞骨或软骨材料；
其中，步骤(1)至步骤(4)的顺序可以任意调换。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(1)和(2)中的Tris-HCL溶液为10mM～100mM，PH值为6.8～8.0。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述步骤(2)中的Tris-HCL溶液中EDTA的浓度为0.1wt％～10wt％。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述步骤(1)中Tris-HCL溶液中的氯化镁的浓度为约0.2mM～1mM，所述的氯化钙的浓度为约0.2mM～4mM。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述步骤(3)中所述的蛋白酶的浓度为0.1wt％～0.35wt％。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述步骤(4)中所述CATB浓度为0.1wt％～1wt％。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，当待处理材料为骨材料时，所述步骤(2)包括将骨材料放入含有SDS和EDTA的Tris-HCL溶液中并震荡或搅拌浸泡处理；其中含有SDS(十二烷基硫酸钠)和EDTA(乙二胺四乙酸)的Tris-HCL溶液中SDS的浓度为0.1wt％～0.5wt％，EDTA浓度为1wt％～10wt％，其中Tris-HCL溶液为10mM～100mM，
PH值为6.8～8.0。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，当待处理材料为软骨材料时，所述步骤(2)包括将软骨材料放入含有EDTA的Tris-HCL溶液中并震荡或搅拌浸泡处理，其中Tris-HCL溶液中EDTA浓度为0.1wt％～1wt％，其中Tris-HCL溶液为10mM～100mM，PH值为6.8～8.0。
9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，当待处理材料为软骨材料时，所述步骤(1)、(2)和(4)中所述震荡或搅拌温度为40～60℃，步骤(3)中所述震荡或搅拌温度为18～37℃。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法制备的脱细胞骨或软骨材料。
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