CN102743791A - 一种组织修复材料及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种组织修复材料，它是由小肠黏膜下层(SIS)和神经生长因子(NGF)组成的。本发明中，NGF在单独使用或与SIS简单混合使用时，会很快失活，不利于对创面的修复；但将NGF与SIS按照本发明特定方法制备成复合材料后，不仅能够有效延长NGF的作用时间，同时，与单独使用SIS相比，NGF-SIS复合材料对细胞的增殖活性显著增强，表明本发明NGF-SIS复合材料发挥了协同增效作用。

Description

一种组织修复材料及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种组织修复材料及其制备方法和用途，属生物材料领域。

背景技术

创面是正常皮肤或组织在外界致伤因子以及机体内在因素下导致的损害。常伴有皮肤完整性的破坏以及一定量正常组织的丢失，同时，皮肤的正常功能也受损。创面主要分为急性创面、慢性创面。常见的急性创面有手术切口、皮肤擦伤、烧伤等；常见的慢性创面有褥疮、下肢血管性溃疡、糖尿病性足溃疡以及其他难愈合创面。创面一旦形成，机体就会迅速作出反应，启动愈合过程进行修复。普通的急性创面，可通过机体的自身修复进行创面愈合，而大多慢性创面，特别是对于糖尿病性足溃疡等难愈合创面，则需要药物辅助。

神经生长因子（nerve growth factor，NGF）是典型的神经营养因子，支持感觉神经和交感神经细胞的存活，促进其生长、分化，维持其功能。近年来，大量研究表明NGF可用于促进创面愈合，也有学者将NGF应用于糖尿病溃疡患者的临床治疗，发现NGF可促进溃疡愈合。但是神经生长因子半衰期短，体内平均滞留时间仅有约3.5小时，稳定性较差，局部一次性给药很快被代谢，限制了它在临床上的广泛应用。

小肠黏膜下层(small intestine submucosa,SIS)，为小肠的组成结构之一，是一种可降解的天然细胞外基质类生物衍生材料，含有多种生长因子：如转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）及血管内皮生长因子（vascularendothelial growth factor,VEGF）等，但经检测，SIS中不含有NGF。SIS具有低免疫原性，不影响受体对细菌和病毒的免疫反应；良好的生物力学性质、细胞相容性、组织相容性及体内降解能力；促进血管再生等优点。因此，已将SIS运用于肌腱、韧带、膀胱等创伤修复中。专利申请号：200710177285.6中，公开了SIS的制备方法：将小肠黏膜下层以任意顺序进行消毒、脱脂、脱细胞、去垢处理后，制备而成。

目前，还未见将SIS与NGF联合用于促进创面愈合的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种组织修复材料。本发明的另一目的在于提供这种组织修复材料的制备方法和用途。

本发明提供了一种组织修复材料，它是由小肠黏膜下层和神经生长因子组成的。

其中，它是由如下重量配比的原料制备而成的：

小肠黏膜下层（SIS）1~5份，神经生长因子（NGF）1×10^-5~5×10^-5份。

进一步地，它是由如下重量配比的原料制备而成的：小肠黏膜下层2份，神经生长因子1×10^-5份。

更进一步地，所述的小肠黏膜下层为小肠黏膜下层无细胞基质；神经生长因子为β-神经生长因子。

其中，其制备方法如下：

取小肠黏膜下层，按（1~3）:（80~120）W/V与0.3~0.7M乙酸混合，2~5℃下搅拌至凝胶状，再加入神经生长因子，混匀，冷冻干燥后，消毒，即得。

本发明还提供了上述的组织修复材料的制备方法，它具有如下操作步骤：

取小肠黏膜下层，按（1~3）:（80~120）W/V与0.3~0.7M乙酸混合，2~5℃下搅拌至凝胶状，再加入神经生长因子，混匀，冷冻干燥后，消毒，即得。

进一步地，它具有如下操作步骤：取小肠黏膜下层，按2:100W/V与0.5M乙酸混合，4℃下搅拌至凝胶状，再向凝胶状液体中加入神经生长因子至100ng/ml，混匀，冷冻干燥后，消毒，即得。

更进一步地，所述小肠黏膜下层是由如下方法制备的：

（1）取小肠，刮除空肠浆膜层、黏膜层及肌层，去离子水清洗后，剪断；

（2）加入三氯甲烷-甲醇溶液，浸泡脱脂后，去离子水冲洗；

（3）再用胰蛋白酶消化，去离子水冲洗；

（4）最终再以十二烷基硫酸钠水溶液浸泡，去离子水冲洗后，即得小肠黏膜下层。

本发明还提供了上述的组织修复材料在制备促进创面愈合的药物中的用途。

进一步地，所述的药物是治疗糖尿病足溃疡、促进成纤维细胞增殖、促进脐静脉内皮细胞增殖的药物。

本发明中，NGF在单独使用或与SIS简单混合使用时，会很快失活，不利于对创面的修复；但将NGF与SIS按照本发明特定方法制备成复合材料后，不仅能够有效延长NGF的作用时间，同时，与单独使用SIS相比，NGF-SIS复合材料对细胞的增殖活性显著增强，表明本发明NGF-SIS复合材料发挥了协同增效作用，为临床用药提供了一种新的选择。

附图说明

图1SIS扫描电镜观察（A：×500；B×1000）

图2NGF-SIS对人真皮成纤维细胞增殖的影响（**：与对照组比p<0.01）

图3NGF-SIS对人脐静脉内皮细胞增殖的影响（*：与对照组比p<0.05）

图4人真皮成纤维细胞接种于NGF-SIS（A-2h、B-4h、C-1d、D-5d电镜观察（×1000）

图5人真皮成纤维细胞接种于NGF-SISS(A-2h、B-4h、C-1d、D-3d、E-5d)HE染色（×100）

图6人脐静脉内皮细胞接种于NGF-SIS(A-2h、B-4h、C-1d、D-5d)电镜观察（×1000）

图7人脐静脉内皮细胞接种于NGF-SIS(A-2h、B-4h、C-1d、D-3d、E-5d)电镜观察（×100）

图8NGF对人真皮成纤维细胞增殖的影响

图9NGF对人真皮成纤维细胞hCOL1A1和hCOL3A1mRNA表达的影响

图10各组人真皮成纤维细胞的迁移（倒置显微镜×100）；其中，A划痕后0h，B对照组培养24h后，C50ng/ml浓度组培养24h后，D100ng/ml浓度组培养24h后，E200ng/ml浓度组培养24h后

图11NGF对人真皮成纤维细胞迁移的影响；其中，*：与对照组比p<0.05；**：与对照组比p<0.01；#：与100ng/ml和200ng/ml组比p<0.05

图12免疫荧光；其中，A,C:trkANGFR检测，A×100,C×200；B,D:p75NTR检测，B×100,D×200

图13NGF对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

图14NGF对VEGF mRNA表达的影响

图15NGF对Ang-2mRNA表达的影响

图16NGF对Tie-2mRNA表达的影响

图17NGF对人脐静脉内皮细胞迁移的影响；其中，**：与对照组比p<0.01；##：与50ng/ml和100ng/ml组比p<0.01

具体实施方式

实施例1  本发明组织修复材料的制备

取小肠黏膜下层（SIS），按2:100W/V与0.5M乙酸混合，4℃下组织匀浆机间歇搅拌1h至凝胶状，置于自制圆柱形模具中。再向凝胶状的SIS中添加NGF至100ng/ml，搅拌均匀。经过-20℃过夜预冻后，冷冻干燥，环氧乙烷消毒，即得本发明组织修复材料（NGF-SIS）。经测定，本发明组织修复材料中NGF含量为5ng/mg；使用时，取适量NGF-SIS加水膨胀后，敷贴于创口。

本发明中所述的小肠黏膜下层为小肠黏膜下层无细胞基质，目前主要的制备方法是取空小肠，水洗净后，去除浆膜层、肌层和黏膜层后，分别经脱脂、除蛋白、去垢后，冻干、消毒即得。本发明中采用以下方式：

取4h内市售新鲜猪空肠清洗后进行以下处理制备SIS，备用：

（1）机械处理：刮除空肠浆膜层、黏膜层及肌层，去离子水清洗后将其剪成长20～30cm；

（2）脱脂：加入等体积三氯甲烷-甲醇溶液，4℃过夜，去离子水冲洗；

（3）胰蛋白酶消化：4℃条件下用0.25%胰蛋白酶800ml消化过夜，去离子水冲洗；

（4）去垢剂处理：4℃条件下加入0.5%十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate，SDS）800ml过夜，去离子水冲洗，即得SIS。

本发明也可采用现已报道的方法制备SIS，如，罗静聪，等，小肠黏膜下层细胞相容性的研究，生物医学工程学杂志，2004年21卷5期；或者如，申请号：CN200710177285.6，发明名称：一种SIS组织修复材料的制备方法。实施例2本发明组织修复材料中NGF的浓度优选

1、主要试剂与仪器

1.1试剂

重组人β-NGF（Peprotech公司，美国）；β-NGF抗体（abcam公司，英国）；MTT（Sigma公司，美国）；DMEM/F12培养基（GIBCO公司，美国）；探针及引物（上海生工生物工程技术服务有限公司）；

1.2仪器

倒置相差显微镜（Olympus公司，日本）；荧光显微镜（Olympus公司，日本）；连续光谱微孔板光密度测读仪（Molecular Devices公司，美国）；实时荧光定量基因扩增仪（Bio-Rad公司，美国）；Gel Doc1000凝胶成像系统（Bio-Rad公司，美国）；

2实验方法

2.1细胞培养

2.1.1人真皮成纤维细胞培养

采用酶消化法进行人真皮成纤维细胞体外培养。取2～12岁儿童包皮（四川大学华西医院行包皮环切术者自愿捐赠），去除皮下脂肪及部分残留血迹后，0.25%透明质酸酶4℃过夜消化；次日剥离表皮，将真皮剪碎后，加入0.1%Ⅰ型胶原酶37℃振荡水浴摇床中消化45min；终止消化，1200r/min（离心半径：13.7cm）离心5min，以含10%FBS的DMEM/F12培养液重悬接种培养。每隔3d更换1次培养液，待细胞融合至80%～90%时，进行传代培养。

2.1.2人脐静脉内皮细胞培养

人脐静脉内皮细胞系购买于美国标准品收藏中心ATCC，以含5%FBS的L-DMEM正常培养，当细胞融合率达到80%～90%时传代培养。

2.2NGF对细胞增殖的影响

2.2.1NGF对人真皮成纤维细胞增殖的影响

取生长状态良好的第3代细胞，活细胞计数后以4×103个/孔密度接种于96孔板。在含10%FBS的DMEM/F12培养液中培养过夜，再用无血清的DMEM/F12培养液培养24h。之后分别加入NGF浓度为25、50、100、200、400ng/ml含0.5%FBS的DMEM/F12培养液，每浓度组设6个复孔。继续培养48h后，每孔加入20μl MTT，37℃孵育3.5h后吸弃，每孔加入50μl DMSO，振荡10min，于连续光谱测读仪490nm处测定吸光度（A）值。

2.2.2NGF对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

取生长状态良好的细胞，无血清培养基重悬细胞以2×103个/孔密度接种于96孔板。过夜培养后，分别加入NGF浓度为6.25、12.5、25、50、100、200ng/ml和NGF抗体（1μg/ml）无血清培养液，每浓度组设6个复孔。继续培养48h后，每孔加入20μl MTT，37℃孵育3.5h后吸弃；每孔加入50μl DMSO，振荡10min，于连续光谱测读仪490nm处测定吸光度（A）值。

2.3NGF对细胞功能的影响

2.3.1NGF对人真皮成纤维细胞胶原合成的影响

取生长状态良好的第3代细胞，以1×105个/孔密度接种于6孔板，含10%FBS的DMEM/F12培养液中培养过夜后，再用无血清的DMEM/F12培养液继续培养24h。之后分别加入NGF浓度为50、100、200ng/ml含0.5%FBS的DMEM/F12培养液，每浓度组设3个复孔。培养48h后，细胞进行实时荧光定量PCR分析：按Trizol试剂说明书方法提取细胞总RNA，使用逆转录试剂盒进行逆转录反应合成cDNA，以cDNA为模板采用TaqMan荧光探针技术进行ColⅠ和ColⅢ核酸定量。引物及TaqMan探针序列如表1。扩增条件：94℃、2min，94℃、20s，52～56℃、20s，60℃、30s，45个循环。

表1  hCOL1A1、hCOL3A1、β-actin实时荧光定量PCR引物

2.3.2NGF对人脐静脉内皮细胞血管新生基因的影响

取生长状态良好的细胞，以1×105个/孔密度接种于6孔板，分别加入NGF浓度为10、25、50、100ng/ml和NGF抗体（1μg/ml）无血清培养液。培养48小时后，按Trizol试剂说明书方法提取细胞总RNA，使用逆转录试剂盒进行逆转录反应合成cDNA，以cDNA为模板进行实时荧光定量聚合酶链式反应，检测VEGF，Ang-2，Tie-2三种基因的表达。各基因引物序列见表2，扩增条件：95℃、30s，95℃、3-5s，60℃、30-30s，45个循环。

表2  VEGF、Ang-2、Tie-2、β-actin实时荧光定量PCR引物

2.4NGF对细胞迁移的影响

2.4.1NGF对人真皮成纤维细胞迁移的影响

在6孔板每孔外底壁中央垂直划一道直径线，并在线上作3个标记点。取生长状态良好的第3代细胞，以1×105个/孔密度接种于已标记好的6孔板，用含10%FBS的DMEM/F12培养液培养至细胞融合后，沿瓶外的直径线用细胞刮在孔内对细胞进行划痕损伤。用无血清的DMEM/F12培养液轻轻吹打划痕附近3次以除净刮掉的细胞，继续培养。分别加入NGF浓度为50、100、200ng/ml含0.5%FBS的DMEM/F12培养液，每浓度组设3个复孔。培养0、24h后分别在倒置显微镜下用显微标尺测量每孔3个标记点划痕两侧的距离。按0h划痕两侧距离－24h划痕两侧距离计算迁移距离。

2.4.2NGF对人脐静脉内皮细胞迁移的影响

与2.3.1类似，在6孔板每孔外底壁中央垂直划一道直径线，并在线上作3个标记点。取生长状态良好的细胞，以1×105个/孔密度接种于已标记好的6孔板，用含5%FBS的L-DMEM培养液培养至细胞融合后，沿瓶外的直径线用细胞刮在孔内对细胞进行划痕损伤。用无血清L-DMEM培养液轻轻吹打划痕附近3次以除净刮掉的细胞，继续培养。分别加入NGF浓度为25、50、100ng/ml无血清L-DMEM培养液，每浓度组设3个复孔。培养0、48h后分别在倒置显微镜下用显微标尺测量每孔3个标记点划痕两侧的距离。按0h划痕两侧距离－48h划痕两侧距离计算迁移距离。

2.5统计学方法

采用SPSS17.0统计软件包进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD法，p值<0.05为有统计学意义。

3结果

3.1NGF对人真皮成纤维细胞的影响

3.1.1NGF对人真皮成纤维细胞增殖影响

对照组和浓度为25、50、100、200、400ng/ml NGF作用于人真皮成纤维细胞48h后，A490值分别为0.132±0.013、0.123±0.010、0.132±0.012、0.134±0.016、0.138±0.015和0.126±0.007，与对照组相比，各NGF浓度组差异无统计学意义（p>0.05）。见图8。

3.1.2NGF对人真皮成纤维细胞胶原合成的影响

50、100、200ng/ml NGF浓度组hCOL1A1表达量分别是对照组mRNA表达量的0.962±0.218、1.094±0.206和0.976±0.268倍，与对照组比较差异无统计学意义（p>0.05）。50、100、200ng/ml NGF浓度组hCOL3A1表达量分别是对照组mRNA表达量的1.017±0.113、0.900±0.154、0.984±0.165倍，与对照组比较差异无统计学意义（p>0.05）。见图9。

3.1.3NGF对人真皮成纤维细胞迁移的影响

培养24h后，对照组、50、100、200ng/ml浓度组迁移距离分别为416.96±52μm、645.36±65.2μm、530.64±28.64μm和489.52±77.6μm。与对照组比较，50、100ng/ml NGF可促进细胞迁移。与100ng/mlNGF相比，50ng/ml组促进效果更明显（p<0.05）。200ng/ml浓度组迁移率虽然在数值上大于对照组，但差异无统计学意义（p>0.05）。见图10、11。

3.2NGF对人脐静脉内皮细胞的影响

3.2.1人脐静脉内皮细胞NGF受体的表达

如图12所示，细胞荧光免疫细胞化学结果表明：脐静脉血管内皮细胞表达高亲和力受体trkANGFR和低亲和力受体p75NTR。

3.2.2NGF对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

浓度为6.25、12.5、25、50、100、200ng/ml NGF和NGF抗体作用于人脐静脉内皮细胞48h后，A490值分别为0.285±0.024、0.284±0.013、0.274±0.015、0.297±0.013、0.281±0.026、0.277±0.012和0.208±0.011，与对照组（0.233±0.020）比较差异有统计学意义（p<0.05），各浓度组间差异无统计学意义（p>0.05）。NGF促进人脐静脉内皮细胞增殖，NGF抗体抑制NGF的促进作用。见图13。

3.2.3NGF对人脐静脉内皮细胞血管新生基因的影响

如图14和图15所示，与对照组比较，NGF（10、25、50、100ng/ml）促进VEGF和Ang-2的mRNA表达（p<0.05），在100ng/ml浓度时促进作用最大，分别约为对照组的2倍和1.7倍。NGF也促进Tie-2mRNA的表达（图16），在50ng/ml浓度时促进作用最大，是对照组mRNA表达量的2.4倍。NGF抗体的添加抑制NGF的促进作用。

3.3.3NGF对人脐静脉内皮细胞迁移的影响

培养48h后，对照组、25、50、100ng/ml浓度组迁移距离分别为98.3±22.9μm、207.5±15.4μm、235.0±14.5μm和228.3±11.9μm。与对照组比较，25-100ng/ml NGF均可显著促进细胞迁移（p<0.01），其中，50ng/mlNGF促进作用最明显，与25ng/ml和100ng/mlNGF浓度组差异有统计学意义（p<0.01）。见图17。

4讨论

NGF的受体有两种类型，一种是高亲和力受体trkANGFR，介导细胞的存活和增殖；另一种是低亲和力受体p75NTR，可诱导细胞凋亡。研究表明，这两种受体在成纤维细胞中均有表达。本研究发现，高亲和力受体trkA和低亲和力受体p75也均能在人脐静脉内皮细胞上检测到，这为NGF对人真皮成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞的直接作用提供了可能。

本研究结果表明，NGF对人真皮成纤维细胞的增殖无促进作用，这可能是NGF与人成纤维细胞表面的trkA和p75两种受体同时结合作用的结果，这种机制可能有助于在炎性反应后期终止炎性反应，而进入组织修复的下一个阶段。

NGF具有趋化作用，可促进多核粒细胞、肥大细胞、雪旺细胞等多种细胞迁移。本研究结果表明，低浓度的NGF即可影响人真皮成纤维细胞的迁移，高浓度下促进作用反而没有低浓度明显或没有促进作用。在低浓度25、50ng/ml下，NGF也促进人脐静脉内皮细胞的迁移。当NGF浓度升高至100ng/ml时，NGF的促进作用也并没有随着浓度的升高而增强。这可能是因为高浓度NGF可诱导其他抑制细胞迁移的因子的表达，例如：前列环素，凝集素，过氧化物酶体增殖物激活受体等。

成纤维细胞是皮肤真皮层中主要细胞，能合成和分泌胶原蛋白、弹性蛋白、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等ECM。这些ECM不仅在细胞之间起机械支撑和连接作用，还是细胞间信号转导的桥梁，参与细胞的生理和病理过程。胶原蛋白是ECM中的主要结构蛋白，在皮肤内分布的胶原只有4种，ColI和ColⅢ主要分布在真皮层，ColⅣ和ColⅦ分布在基底膜。正常成年人皮肤Ⅰ型胶原含量约占70%，ColⅢ约占30%。为详细了解NGF对成纤维细胞合成分泌胶原蛋白的影响，本实验分别采用实时荧光定量PCR，分析了在50，100和200mg/ml NGF刺激的成纤维细胞ColI、Col IIImRNA表达及培养液中胶原含量，实验结果表明，NGF对人真皮成纤维细胞胶原分泌无影响。这与陈悦等对人巩膜成纤维细胞的研究结果相反，可能与人巩膜成纤维细胞是从神经外胚层分化而来的有关。

血管新生是一个复杂的过程，各种生长因子在其中不同阶段起着不同的作用。众所周知，VEGF是血管新生过程中最重要的驱动因子之一。VEGF几乎对整个血管新生过程具有调节作用，例如诱导内皮细胞增殖，促进细胞迁移，抑制细胞程序性死亡，诱导血管新生其他相关基因表达。当然，单单依靠VEGF的作用调节血管新生是不够的，促血管生成素（Angiopoietins,Ang）是另一类与血管新生密切相关的因子。Ang-1和Ang-2是其最主要的两个成员，两者相互竞争受体Tie-2。当Ang-2与Tie-2结合时，破坏血管的稳定性和血管成熟，在VEGF表达上调的情况下Ang-2/Tie-2诱导血管瓦解，引起血管新生。本研究表明，在NGF的作用下，VEGF和Ang-2/Tie-2基因的mRNA表达水平上升，为NGF促进血管新生提供了可能。我们的结果补充了GiuseppinaCantarella的结论，不仅VEGF，Ang-2/Tie-2也是NGF调节血管新生的第二调节因素。

5小结

NGF对人真皮成纤维细胞的增殖及胶原合成均无影响，但可促进其迁移，这可能是NGF促进创面修复的原因之一。NGF促进人脐静脉内皮细胞增殖和迁移，促进VEGF、Ang-2/Tie-2血管新生相关基因mRNA表达，间接和直接调节血管新生。NGF促进人真皮成纤维细胞迁移的有效浓度为：50-100ng/ml。NGF促进人脐静脉内皮细胞增殖的有效浓度为：6.25-200ng/ml，促进VEGF、Ang-2/Tie-2mRNA表达的有效浓度为：10-100ng/ml，促进迁移的有效浓度为：25-100ng/ml。综上，NGF调节人真皮成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞作用的有效浓度为：50-100ng/ml。

鉴于本发明组织修复材料使用时要吸水膨胀，因此，根据NGF的最佳有效浓度，将组织修复材料冻干前的浓度设定为100ng/ml，以便保证本发明组织修复材料使用时也能达到有效浓度。

以下通过试验例来具体说明本发明的有益效果。

试验例1  本发明组织修复材料对细胞增殖的影响

试剂与仪器

重组人β-NGF（Peprotech公司，美国）；NGF-SIS（实施例1制备的组织修复材料）;SIS（将制备好的SIS经实施例1修复材料的方法制备，但不加NGF）；MTT（Sigma公司，美国）；DMEM、F12培养基（GIBCO公司，美国）；乙酸（科龙，成都）；ELISA试剂盒（R&D，美国）；扫描电镜（HITACHI-S450，日本）；组织匀浆器（Biospec，美国）；真空冻干机（Heto-Drywinner，丹麦）；连续光谱微孔板光密度测读仪（Molecular Devices公司，美国）。

1、细胞培养

1.1人真皮成纤维细胞培养

采用酶消化法进行人真皮成纤维细胞体外培养。取2～12岁儿童包皮（四川大学华西医院行包皮环切术者自愿捐赠，也可通过购买市售商品得到），去除皮下脂肪及部分残留血迹后，0.25%透明质酸酶4℃过夜消化；次日剥离表皮，将真皮剪碎后，加入0.1%Ⅰ型胶原酶37℃振荡水浴摇床中消化45min；终止消化，1200r/min（离心半径：13.7cm）离心5min，以含10%FBS的DMEM/F12培养液重悬接种培养。每隔3d更换1次培养液，待细胞融合至80%～90%时，进行传代培养。

1.2人脐静脉内皮细胞培养

人脐静脉内皮细胞系购买于美国标准品收藏中心ATCC，以含5%FBS的L-DMEM正常培养，当细胞融合率达到80%～90%时传代培养。

2、NGF-SIS对细胞增殖的影响

（1）MTT法测定：取生长状态良好的人真皮成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞，活细胞计数后以4×10³个/孔密度接种于96孔板。待细胞贴壁后，吸弃培养液，取相同用量的NGF-SIS和SIS加入96孔板，分别加入新鲜的DMEM/F12和L-DMEM培养液继续培养。1、3、5、7、9d后，每孔加入20μlMTT，37℃孵育3.5h后吸弃；每孔加入50μl DMSO，振荡10min，于连续光谱测读仪490nm处测定吸光度（A)值。

（2）接种于材料上的细胞的增殖影响：将培养好的细胞，直接接种于NGF-SIS和SIS材料上，观察细胞接种于材料上后的增殖效果。

3、扫描电镜观察

将制备好的材料分别经PBS，无血清培养液，FBS润湿后，取生长状态良好的人真皮成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞，以3×10⁵个/样本的密度接种于材料上，继续培养。分别于2h，4h，1d，5d后，按一下步骤处理后行扫描电镜观察。

（1）PBS漂洗

（2）2.5%戊二醛固定30min-12h

（3）PBS漂洗

（4）70%酒精脱水30min

（5）80%酒精脱水20min

（6）90%酒精脱水10min

（7）95%酒精脱水5min

（8）100%酒精脱水5min

（9）乙酸异戊酯保存

4、HE染色

将制备好的材料分别经PBS，无血清培养液，FBS润湿后，取生长状态良好的人真皮成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞，以3×10⁵个/样本的密度接种于材料上，继续培养。分别于2h，4h，1d，5d后，按以下步骤进行HE染色：

（1）PBS漂洗

（2）70%酒精固定20min，水洗

（3）苏木素染色10min，水洗

（4）盐酸酒精5s，水洗

（5）氨水1min，水洗

（6）伊红15min，水洗

（7）95%-100%酒精梯度脱水各约10s

（8）TO透明5min

（9）封片

5、统计学方法

采用SPSS17.0统计软件包进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD法，p值<0.05为有统计学意义。

6、结果

6.1材料形态学观察

SIS呈白色多孔海绵状，质地均一，扫描电镜下观察，材料呈多层蜂巢样结构，支架孔径约为50-200μm，分布均匀，见图1。

6.2NGF-SIS对细胞增殖的影响

MTT实验中，以未加入材料组为对照组。与对照组相比，使用NGF-SIS和SIS的人真皮成纤维细胞吸光度值差异有统计学意义（p<0.01）。NGF-SIS组与SIS组比较差异无统计学意义（p>0.05）；（图2）

如图3所示，对于人脐静脉内皮细胞，三组培养条件下细胞吸光度值大小顺序为：NGF-SIS组>SIS组>对照组。与对照组相比，NGF-SIS组和SIS组细胞吸光度值差异有统计学意义：第3和第5天，p<0.05，第7天，p<0.01；NGF-SIS组与SIS组相比，在第5天和第7天差异有统计学意义，p<0.05。

6.3NGF-SIS上细胞生长状况

如图4所示，人真皮成纤维细胞接种于材料2h时，粘附细胞形态已经伸展，开始在材料上生长。4h后，细胞形态渐渐呈现为典型的长梭形。1d时，细胞数量明显增多，并有序生长。5d后，细胞数量进一步增多，分泌细胞外基质。从图5中可明显观察到细胞数量变化，与扫描电镜结果一致。

如图6和图7所示，人脐静脉内皮细胞接种于材料2h时，细胞已经粘附于材料表面，细胞多呈圆形。4h后，有少量细胞形态已伸展，呈多角形，细胞沿着材料支架生长。1d时，细胞明显增多，已呈多层生长。随着培养时间的延长，5d后细胞数量进一步增多，材料表面已完全被细胞覆盖。

7结论

由上述实验结果可知：

（1）本发明将NGF与SIS通过特定方法复合使用后，能够有效增加成纤维细胞和内皮细胞数量，具有良好的细胞增殖作用，可用于对糖尿病足溃疡的治疗。

（2）NGF的半衰期为3.5h，然而，由图3可知，本发明将NGF与SIS通过特定方法复合使用后，显著增强了SIS对内皮细胞的增殖作用，与SIS组相比，在第5天和第7天差异有统计学意义（p<0.05），这就说明NGF在5天以后仍然能够发挥生物活性。由此可知，本发明的NGF-SIS复合材料，能够将NGF的治疗有效期从3.5小时延长至7天以上，使得NGF的生物利用率显著提高。同时，两者联合使用后，能够明显增强单一材料的细胞增殖活性，表明两者联用后发挥了协同增效作用。

综上所述，NGF在单独使用或与SIS简单混合使用时，会很快失活，不利于对创面的修复；但将NGF与SIS按照本发明特定方法制备成复合材料后，不仅能够有效延长NGF的作用时间，同时，与单独使用SIS相比，NGF-SIS复合材料对细胞的增殖活性显著增强，表明本发明NGF-SIS复合材料发挥了协同增效作用，为临床用药提供了一种新的选择。

Claims (10)

1.一种组织修复材料，其特征在于：它是由小肠黏膜下层和神经生长因子组成的。

2.根据权利要求1所述的组织修复材料，其特征在于：它是由如下重量配比的原料制备而成的：

小肠黏膜下层1~5份，神经生长因子1×10^-5~5×10^-5份。

3.根据权利要求2所述的组织修复材料，其特征在于：它是由如下重量配比的原料制备而成的：

小肠黏膜下层2份，神经生长因子1×10^-5份。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的组织修复材料，其特征在于：所述的小肠黏膜下层为小肠黏膜下层无细胞基质；神经生长因子为β-神经生长因子。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的组织修复材料，其特征在于：其制备方法如下：

取小肠黏膜下层，按（1~3）:（80~120）W/V与0.3~0.7M乙酸混合，2~5℃下搅拌至凝胶状，再加入神经生长因子，混匀，冷冻干燥后，消毒，即得。

6.权利要求1-4任意一项所述的组织修复材料的制备方法，其特征在于：它具有如下操作步骤：

取小肠黏膜下层，按（1~3）:（80~120）W/V与0.3~0.7M乙酸混合，2~5℃下搅拌至凝胶状，再加入神经生长因子，混匀，冷冻干燥后，消毒，即得。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：它具有如下操作步骤：

取小肠黏膜下层，按2:100W/V与0.5M乙酸混合，4℃下搅拌至凝胶状，再向凝胶状液体中加入神经生长因子至100ng/ml，混匀，冷冻干燥后，消毒，即得。

8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于：所述小肠黏膜下层是由如下方法制备的：

（1）取小肠，刮除空肠浆膜层、黏膜层及肌层，去离子水清洗后，剪断；

（2）加入三氯甲烷-甲醇溶液，浸泡脱脂后，去离子水冲洗；

（3）再用胰蛋白酶消化，去离子水冲洗；

（4）最终再以十二烷基硫酸钠水溶液浸泡，去离子水冲洗后，即得小肠黏膜下层。

9.权利要求1-5任意一项所述的组织修复材料在制备促进创面愈合的药物中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述的药物是治疗糖尿病足溃疡、促进成纤维细胞增殖、促进脐静脉内皮细胞增殖的药物。

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