CN114191618A - 一种减缓纤维化和炎性巨噬细胞募集的改性骨修复材料 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种减缓纤维化和炎性巨噬细胞募集的改性骨修复材料，采用以下方法制备：A.制备0.64％w/v EGCG溶液；B.采用0.22μm滤菌器过滤步骤A中的EGCG溶液；C.避光、4℃低温浸泡骨修复材料24小时，采用磷酸盐缓冲液PBS冲洗骨修复材料；D.避光、4℃低温环境中静置24小时待骨修复材料表面干燥，制备得到所需的改性骨修复材料。本发明改性的骨修复材料具有提高细胞活性、促进管样结构生成、减缓炎症、降低纤维化程度等优势。

Description

一种减缓纤维化和炎性巨噬细胞募集的改性骨修复材料
技术领域
本发明属于生物材料领域，具体涉及一种减缓纤维化和炎性巨噬细胞募集的改性骨修复材料。
背景技术
当前医疗行业常用的骨修复材料主要分为两类：天然的移植物，以及人工合成的移植物，技术敏感性高。在引导骨再生应用中，前期研究已知，将骨缺损区受损的微环境恢复到受损之前的状态，有望逆转病理性的信号为正常生理的信号，脱细胞牛骨的组成与人体硬组织相近，具有良好的生物相容性和成骨诱导性，能够形成很好的支架供成骨相关细胞的迁移，作为异种移植物在市面上最广泛被使用，技术相对成熟，但有些病例仍然存在植入后过度纤维化的问题，使最终的成骨效果不尽理想，无法满足临床的需求。
随着近年对骨修复材料研究的深入，生物相容性、降解率和材料的机械支持等因素已经不能满足临床的需求，如何进一步指导细胞行为和刺激机体的成骨反应是关键。考虑到纤维化的发生取决于材料植入后机体免疫反应的强弱和时间，而材料和自身组织之间能否形成良好的骨结合，不仅决定了骨再生的最终效果，还与纤维化的程度息息相关。实际上纤维化具有两面性，适当的纤维化能够提供微环境利于暂时性胞外基质的沉积为血管生成提供框架，过度的纤维化将阻隔生物材料与宿主，使骨结合失败。
发明内容
本发明针对现有方法的不足，提供了一种减缓纤维化和炎性巨噬细胞募集的改性骨修复材料。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
一种减缓纤维化和炎性巨噬细胞募集的改性骨修复材料，采用以下方法制备：
A.制备0.6％-0.7％w/v EGCG溶液；
B.采用0.22μm滤菌器过滤步骤A中的EGCG溶液；
C.避光、4℃低温浸泡骨修复材料24小时，采用磷酸盐缓冲液PBS冲洗骨修复材料；
D.避光、4℃低温环境中静置24小时待骨修复材料表面干燥，制备得到所需的改性骨修复材料。
作为优先方式，所述步骤A中，EGCG溶液浓度0.64％w/v。
作为优先方式，所述步骤C、步骤D中，在4℃低温下浸泡骨修复材料。
作为优先方式，所述步骤C、步骤D中，采用铝箔纸包被实现避光。
要获得理想的骨再生，调节植入后的骨修复材料纤维包囊程度为本发明引导骨再生材料提供了思路。
EGCG(表没食子儿茶素-3-没食子酸酯)是茶中主要的儿茶素，具有良好的抗炎、抗癌、抗微生物和抗氧化的功能。在骨重塑领域中还被证实具有增加骨形态发生蛋白-2、runt相关转录因子-2、碱性磷酸酶、骨连接素、骨钙素的表达，促进新骨形成的潜力。此外，EGCG还可以指导巨噬细胞的募集和表型，其中促炎表型巨噬细胞长期存在能够促进纤维化，EGCG作为一种天然的萃取物，与骨修复材料的结合是否能够减轻异物反应、调节巨噬细胞表型、减缓纤维化，甚至促进骨再生是本发明的关注点。
本发明的有益效果在于：
(1)提供了一种减缓纤维化和炎性巨噬细胞募集的改性骨修复材料，相对于未改性的骨修复材料具有提高细胞活性、促进管样结构生成、减缓炎症、降低纤维化程度等优势，为构建组织工程化骨提供了新选择。
(2)本发明改性骨修复材料具有良好生物相容性，提高细胞的活性。
(3)本发明改性骨修复材料在小鼠背部皮下植入7天的结果显示，促炎型的巨噬细胞相关标记物减少。
(4)本发明改性骨修复材料，提高细胞活性、促进管样结构生成、减缓炎症、降低纤维化程度等优势不排除表面形态改变的影响。
附图说明
图1是本发明骨修复材料与未改性的骨修复材料肉眼图像对比图。
图2是本发明骨修复材料与未改性的骨修复材料电镜对比图。
图3是EGCG溶液在骨修复材料浸泡前后的浓度变化图。
图4是EGCG溶液在浓度7.8-500μg/ml之间的的标准曲线图。
图5是EGCG改性骨修复材料体外累积释放图。
图6是本发明骨修复材料与未改性的骨修复材料(RAW 264.7细胞)生物相容性检测图。
图7是实施例4中HE染色对比图。
图8是实施例4中免疫荧光对比图。
图9是是实施例4中不同表型的巨噬细胞募集对比图。
具体实施方式
实施例1：
一种减缓纤维化和炎性巨噬细胞募集的改性骨修复材料，采用以下步骤制备：
1.制备0.64％w/v EGCG溶液；
2. 0.22μm滤菌器过滤EGCG溶液；
3.避光(铝箔纸包被)、低温(4℃)浸泡
Figure BDA0003411951680000031
骨修复材料(烟台正海生物科技股份有限公司)或bio-guide胶原膜或bio-Oss，24小时，后PBS冲洗3次；
4.避光(铝箔纸包被)、低温(4℃)环境中静置24小时待材料表面干燥，完成改性骨修复材料的制备。
5.通过EGCG特异性的吸光值进行检测，后将获得的吸光值结果转换为浓度后，发现浸泡骨修复材料后EGCG溶液浓度的降低(如图3)，及累积释放曲线的绘制(如图4、5)，可知EGCG成功加载于骨修复材料，并有释放的功能。
实施例2：改性骨修复材料宏观和微观形貌
骨修复材料形貌检测：加载EGCG的骨修复材料在宏观上有颜色的改变，这与EGCG需避光和低温保存的特性相关(如图1)；微观上，EGCG改性后赋予骨修复材料定向、均匀、粗糙、密集的表面形态(如图2)。
实施例3：生物相容性检测
细胞在48孔板中培养，并将104个细胞分别接种于未改性的骨修复材料(
Figure BDA0003411951680000032
骨修复材料)和实施例1制备的骨修复材料上，未改性的骨修复材料在与RAW 264.7细胞共培养的7天间，细胞活性相对稳定、持平；EGCG改性后则提高了细胞活性，在最初的两个检测点组间无统计学差异，但在第3、5、7天时，组间有统计学差异(如图6)。
实施例4：皮下评估免疫反应的动物试验
1、宏观图评价纤维化
分别植入未改性骨修复材料和实施例1制备的骨修复材料后第7天，两组切口均愈合良好。肉眼下，未改性骨修复材料的纤维包囊厚度较改性骨修复材料厚而明显。
2、组织切片评价纤维化
未改性的骨修复材料表面有大量的胶原纤维沉积(如图7)。周围的免疫细胞会在骨修复材料周围迁移，形成炎症细胞浸润区。EGCG改性的骨修复材料植入后产生的炎症较轻。
3、组织切片评价血管化
HE染色结果中，植入EGCG改性的骨修复材料可见更丰富的管样结构(如图7箭头所示)，可能与血管新生有关。
4、组织切片评价巨噬细胞募集
未改性骨修复材料和实施例1制备的骨修复材料募集了不同表型的巨噬细胞。两组均可见巨噬细胞标记物CD68的募集，但却发现EGCG改性后下调了促炎性巨噬细胞表型标记物iNOS的表达，提示EGCG抗炎的效果与巨噬细胞的表型相关。

Claims (4)

1.一种减缓纤维化和炎性巨噬细胞募集的改性骨修复材料，其特征在于，采用以下方法制备：
A.制备0.64％w/v EGCG溶液；
B.采用0.22μm滤菌器过滤步骤A中的EGCG溶液；
C.避光、4±1℃低温浸泡骨修复材料24±2小时，采用磷酸盐缓冲液PBS冲洗骨修复材料；
D.避光、4±1℃低温环境中静置24±2小时待骨修复材料表面干燥，制备得到所需的改性骨修复材料。
2.根据权利要求1所述的一种减缓纤维化和炎性巨噬细胞募集的改性骨修复材料，其特征在于：所述步骤A中，EGCG溶液浓度0.64％w/v。
3.根据权利要求1所述的一种减缓纤维化和炎性巨噬细胞募集的改性骨修复材料，其特征在于：所述步骤C、步骤D中，在4℃低温下浸泡骨修复材料。
4.根据权利要求1所述的一种减缓纤维化和炎性巨噬细胞募集的改性骨修复材料，其特征在于：所述步骤C、步骤D中，采用铝箔纸包被实现避光。
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