JP5060772B2 - 生体組織再生用足場材料およびドラッグデリバリーシステム(dds)用担体 - Google Patents
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ブタ由来コラーゲン水溶液(0.6w/w%、塩酸溶液、pH3.1、新田ゼラチン社製)を凍結乾燥し、コラーゲンスポンジを得た。得られたスポンジを20mMおよび40mMのEGCG(teavigo、Roche社製)溶液(95%エタノール溶液もしくは水溶液)に4℃で16時間浸漬し、吸着させた。次にスポンジをPBSでよく洗浄した後さらに蒸留水で洗浄し、再び凍結乾燥し、EGCG処理コラーゲンスポンジを得た。
W0 =浸漬前の乾燥重量 W1 = 浸漬後の乾燥重量
図1より、比較例1の未架橋コラーゲンスポンジはゲル分率が0であることがわかり、EGCG処理コラーゲンスポンジは比較例2のEDCによる架橋コラーゲンスポンジに匹敵する架橋度を持つことがわかった。なお、図1中に示すように各条件の試行サンプル数nは3であり、未架橋品に対する有意差の棄却率は5%未満である。
EGCG処理したコラーゲンスポンジのコラーゲナーゼによる分解に対する耐性を調べた。EGCG20、40mM溶液(95%エタノール溶液または水溶液)で処理したコラーゲンスポンジおよびEDC25mMで処理したコラーゲンスポンジ、未架橋のコラーゲンスポンジ10mgを10mLのタイプIAコラーゲナーゼ(コラーゲナーゼ活性277U/mg、EC3.4.24.4 シグマ社製)100U/mLの溶液(0.04M CaCl含有0.05MトリスHClバッファー、pH7.4)にそれぞれ浸漬し、37℃で24時間、60rpmの振盪下で反応させた。上清を回収し反応により分解されたアミノ酸をニンヒドリン法により定量した。未架橋コラーゲンにおける分解生成アミノ酸量を100%としてそれぞれの架橋コラーゲンスポンジの分解度合いを比較した。
EGCG架橋コラーゲンスポンジが細胞親和性を持つかどうかをL929細胞の培養により調べた。直径10mm厚み1mmのEGCG架橋コラーゲンスポンジ、EDC架橋コラーゲンスポンジに、L929細胞を5×105 cells / 200μLの濃度で播種し、500μLのDMEM(1%ペニシリン/ストレプトマイシン、10%ウシ胎児血清含有)を添加し、37℃、95%CO2条件下で3日間培養した。細胞数は乳酸脱水素酵素(LDH)活性測定により行った。すなわち、スポンジをPBSで洗浄後、1mLの2%トライトンX溶液に浸漬し、抽出した上清にNADH(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)を加えることで上清中のLDH(乳酸脱水素酵素)がNADHを酸化してNAD(ニコチンアミドヌクレオチド)にする反応により紫外部の吸光度から細胞数を求めた。この時、細胞数と吸光度は比例する事を利用した。結果を図3に示す。EDCで架橋を行ったコラーゲンスポンジは3日後に約4倍に増殖したが、EGCG 25mMで架橋したコラーゲンスポンジは3倍に増殖した。また、EGCG 40mMで架橋したコラーゲンスポンジはEDC架橋スポンジと同じく4倍に増殖していた。この結果から、EGCGを架橋剤として作成したコラーゲンスポンジ上でも細胞増殖性は損なわれることなくEDC架橋スポンジと同等の細胞親和性を示すことがわかり、組織工学における細胞培養用足場として適していることが示唆された。
ブタ由来コラーゲン水溶液(0.6w/w%、塩酸溶液、pH3.1、新田ゼラチン社製)と等電点4.9のアルカリ処理ゼラチン(新田ゼラチン社製、重量平均分子量約99,000)10%水溶液を3対1の比率で混合した溶液を凍結乾燥し、コラーゲン・ゼラチン複合体スポンジを得た。得られたスポンジを20mMおよび40mMのEGCG(teavigo、Roche社製)溶液(95%エタノール溶液もしくは水溶液)に4℃で16時間浸漬し、吸着させた。次にスポンジをPBSでよく洗浄した後さらに蒸留水で洗浄し、再び凍結乾燥し、EGCG処理コラーゲン・ゼラチン複合体スポンジを得た。このスポンジ20mgにヒトb-FGF100μg含有水溶液を20mLを滴下しb-FGF静電気結合のスポンジを作成した。このスポンジを免疫不全マウスの皮膚欠損創に移植したところ、移植4日後には細胞の侵入が盛んでスポンジが良好に生着し、真皮、表皮組織の構築が起こり、2週間後には表皮組織が重層化し皮膚組織の再生が認められた。
1) ゼラチンのEGCG架橋に及ぼすPHの影響:燐酸バッファーを用いて酸性(pH4.2)、中性(pH7.4)及び塩基性(pH9.2)とした10%ゼラチン溶液(新田ゼラチン社製、重量平均分子量99,000)に1000ppmのEGCG溶液を攪拌下で添加した。
燐酸バッファーを用いて酸性、中性及び塩基性の1%アルブミン溶液(和光純薬工業、ウシ血清アルブミン、フラクションV)2〜10mLに1000〜5000ppmのEGCG溶液を0.5〜10mL攪拌下で添加した。
Claims (6)
- コラーゲン、ゼラチンまたはその他の蛋白質分子が、(-)-エピガロカテキンガレート(EGCG)またはその他のポリフェノールにより架橋された水不溶性の含水ゲル、またはこれを乾燥して得られるスポンジからなる組織再生用足場材料。
- コラーゲン、ゼラチン、アルブミンまたはその他の蛋白質分子が、(-)-エピガロカテキンガレート(EGCG)またはその他のポリフェノールにより架橋された水不溶性の含水ゲルであって、平均粒径が50nm〜50μmのゲル粒子からなるドラッグデリバリーシステム(DDS)用担体。
- コラーゲンまたはゼラチンからなる水可溶性のスポンジを、10〜100mMの(-)-エピガロカテキンガレート(EGCG)またはその他のポリフェノールの水溶液または含水エタノール溶液に1〜20℃にて1〜24時間浸漬して、水不溶性の含水ゲルとした後、過剰のカテキン類化合物を洗浄により除去することを特徴とする組織再生用足場材料の製造方法。
- 緩衝性の塩によりpH5〜9とした塩基性または中性のゼラチン水溶液に、(-)-エピガロカテキンガレート(EGCG)またはその他のポリフェノールを、10〜100mMとなり、かつ、ゼラチンに対するカテキン類化合物の重量比が0.5〜5重量%となるように添加した後、一旦乾燥させて水不溶性のスポンジを得ることを特徴とする組織再生用足場材料の製造方法。
- 緩衝性の塩によりpH5〜9とした塩基性または中性のゼラチン水溶液に、(-)-エピガロカテキンガレート(EGCG)またはその他のポリフェノールを、10〜100mMとなり、かつ、ゼラチンに対するカテキン類化合物の重量比が0.5〜5重量%となるように添加した後、40〜60℃に加温して平均粒径が500nm未満のゲル粒子を得るか、または、ゼラチン水溶液を非溶解性液体中に添加して攪拌することにより平均粒径が50μm以下のマイクロスフェアを得ることを特徴とするドラッグデリバリーシステム(DDS)用担体の製造方法。
- 酸性条件下でアルブミン水溶液に、(-)-エピガロカテキンガレート(EGCG)またはその他のポリフェノールを、アルブミンの濃度が0.1〜0.5wt%、ポリフェノールの濃度が1〜10mMとなるように添加して、平均粒径が500nm未満のゲル粒子を得ることを特徴とするドラッグデリバリーシステム(DDS)用担体の製造方法。
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