CN110055178B - 细胞培养方法及细胞培养系统 - Google Patents

细胞培养方法及细胞培养系统 Download PDF

Info

Publication number
CN110055178B
CN110055178B CN201910357214.7A CN201910357214A CN110055178B CN 110055178 B CN110055178 B CN 110055178B CN 201910357214 A CN201910357214 A CN 201910357214A CN 110055178 B CN110055178 B CN 110055178B
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
cell
printing
layer
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910357214.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110055178A (zh
Inventor
刘利彪
邓坤学
袁玉宇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Medprin Regenerative Medical Technologies Co Ltd
Original Assignee
Medprin Regenerative Medical Technologies Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Medprin Regenerative Medical Technologies Co Ltd filed Critical Medprin Regenerative Medical Technologies Co Ltd
Priority to CN201910357214.7A priority Critical patent/CN110055178B/zh
Publication of CN110055178A publication Critical patent/CN110055178A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110055178B publication Critical patent/CN110055178B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/06—Plates; Walls; Drawers; Multilayer plates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/06—Nozzles; Sprayers; Spargers; Diffusers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/26—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of pH
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/32—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of substances in solution
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D01—NATURAL OR MAN-MADE THREADS OR FIBRES; SPINNING
    • D01D—MECHANICAL METHODS OR APPARATUS IN THE MANUFACTURE OF ARTIFICIAL FILAMENTS, THREADS, FIBRES, BRISTLES OR RIBBONS
    • D01D5/00—Formation of filaments, threads, or the like
    • D01D5/0007—Electro-spinning
    • D01D5/0061—Electro-spinning characterised by the electro-spinning apparatus
    • D01D5/0069—Electro-spinning characterised by the electro-spinning apparatus characterised by the spinning section, e.g. capillary tube, protrusion or pin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Textile Engineering (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种新的细胞培养方法及细胞培养系统，该细胞培养方法在密闭的无菌环境中交替进行静电纺丝和细胞打印，使得在每两层静电纺丝层之间通过细胞打印成型打印结构体，然后使得培养液从最顶层的静电纺丝层流入并持续流经打印结构体来培养细胞。这样，通过具有多级微孔的三维结构的打印结构体能够模拟三维的生长环境，有利于细胞的粘附和增殖。在细胞的培养过程中，培养液持续进行动态循环，可以提高细胞的增殖效率。从最顶层的静电纺丝层提供培养液，能够大幅降低培养液的剪切力对细胞的刺激。根据本发明的细胞培养方法能够全自动化地在密闭的无菌环境中进行，减小了污染的风险，同时减轻了工作负担。

Description

细胞培养方法及细胞培养系统
技术领域
本发明涉及生物技术领域，且特别涉及细胞培养方法及细胞培养系统。
背景技术
干细胞在现代生物与科研领域中有着重要的应用，但是干细胞的高效、高质量增殖却一直是一个难题。
传统的干细胞增殖方法是将干细胞种植在培养瓶、培养皿等培养器材中，待干细胞增殖至一定的密度就需要进行干细胞消化、离心收集然后再分散至多个培养瓶中继续培养。此种方法简单可靠，但是，也有以下不足之处。
第一，在培养瓶、培养皿等培养器材中，干细胞在这些培养器材的表面生长，因此这些器材仅为干细胞提供了二维生长环境。由于培养环境与生物体内的三维环境迥异，在实际应用中，随着培养代数的增加，干细胞的生长特性会有改变，特别是干细胞的干性会随着培养代数的增加明显损失。
第二，干细胞在二维平面增殖至一定密度后就会出现接触抑制，从而不能实现高效率的干细胞增殖，产出率不高。而且干细胞浓度过高会导致干细胞容易分化，丢失可分化的潜能。
第三，现有的增殖方法是静态培养方法或普通的动态培养方法。如果采用静态培养方法，干细胞在培养过程中代谢产物溶液堆积影响干细胞的生长。如果采用普通的动态培养方法，流动的培养液直接冲刷细胞，培养液的剪切力非常容易刺激干细胞的分化从而造成干细胞增殖失败。
第四，在长时间的培养过程中，需要反复打开培养瓶进行换液、传代操作，这既需要大量的人力和时间还大大增加了干细胞受到污染的风险。
发明内容
鉴于上述现有技术的状态而做出了本发明。本发明的目的在于提供一种细胞培养方法，其能够在尽量不影响例如干细胞的细胞特性的前提下对细胞进行安全、高效、低成本的动态培养。本发明的另一目的在于提供一种执行上述细胞培养方法的细胞培养系统。
为了实现上述发明目的，本发明采用如下的技术方案。
本发明提供了一种如下的细胞培养方法，所述培养方法包括在密闭的无菌环境中执行如下步骤：
S1：通过静电纺丝在培养池内成型底层静电纺丝层；
S2：通过细胞打印在所述底层静电纺丝层上打印具有多级微孔的三维结构的打印结构体；
S3：通过静电纺丝在所述打印结构体的上方成型附加静电纺丝层；以及
S4：使培养液从最顶层的附加静电纺丝层的上方持续流入，在流经所述打印结构体之后，再从所述培养池流出，使得在所述培养液持续流经所述打印结构体的情况下在所述打印结构体上培养细胞。
优选地，在执行所述步骤S1之后，反复执行所述步骤S2和所述步骤S3，使得在所述底层静电纺丝层上成型所述打印结构体和所述附加静电纺丝层交替排列的多层结构，之后再执行所述步骤S4。
优选地，所述步骤S1还包括：在成型所述底层静电纺丝层之前，在所述培养池内设置具有多孔结构的第一支撑件，以用于支撑所述底层静电纺丝层，并且所述步骤S3还包括：在成型所述附加静电纺丝层之前，在所述打印结构体的上方设置具有多孔结构的第二支撑件，以用于支撑所述附加静电纺丝层。
更优选地，所述第一支撑件和所述第二支撑件为支撑板，所述支撑板形成有均匀地分布的多个通孔。
优选地，通过3D细胞打印使打印材料成型为具有多层结构的所述打印结构体。
更优选地，在所述打印结构体中，各层中的所述打印材料形成为彼此大致平行且间隔开的多个条状，各所述条状的打印材料自身形成有多个第一级微孔，并且每相邻两层的所述条状的打印材料的延伸方向彼此正交，使得各层的所述条状的打印材料形成多个第二级微孔，通过所述多个第一级微孔和所述多个第二级微孔使得所述打印结构体形成具有多级微孔的三维结构。
更优选地，使所述细胞与水凝胶材料均匀混合后形成所述打印材料，使得在所述打印材料中所述细胞的密度为1×105个/毫升至1×106个/毫升。
更优选地，所述细胞为胚胎干细胞、骨髓充间质干细胞或脂肪充间质干细胞；和/或所述水凝胶能够通过如下材料中的一种或多种形成：浓度为5％至20％的明胶溶液、浓度为0.2％至6％的海藻酸钠溶液、浓度为0.1％至6％的纤维蛋白原溶液、浓度为0.1％至10％的壳聚糖溶液和浓度为0.1％至10％的透明质酸溶液，其中所述浓度为溶质的质量与溶剂的预定体积的百分比，该质量的单位为克，该预定体积为100ml。
优选地，用于所述静电纺丝的静电纺丝材料为聚羟基乙酸、聚乳酸和/或丝素蛋白。
优选地，所述底层静电纺丝层的厚度为100μm至300μm；和/或所述附加静电纺丝层的厚度为100μm至300μm；和/或所述打印结构体的厚度为3000μm至8000μm。
本发明提供了一种用于执行以上技术方案中任意一项技术方案所述的细胞培养方法的细胞培养系统，所述细胞培养系统包括所述培养池、用于进行所述细胞打印的细胞打印头以及用于进行所述静电纺丝的静电纺丝头，其中所述细胞打印头和所述静电纺丝头能够相对于所述培养池在三维坐标系中进行预定范围的运动，并且所述细胞打印头用于成型所述打印结构体且所述静电纺丝头用于成型所述静电纺丝层。
优选地，所述细胞培养系统还包括：
培养舱，所述培养舱收纳有培养盒，所述培养池设置于所述培养盒内，所述培养池单独能够从所述培养舱伸出或所述培养池能够随着所述培养盒从所述培养舱伸出，并且所述培养盒设置有与所述培养池连通的培养盒进液口和培养盒出液口，所述培养盒进液口设置于所述培养池的上方，所述培养液能够从所述培养盒进液口流入所述培养池并从所述培养盒出液口流出所述培养池；
驱动机构，所述细胞打印头和所述静电纺丝头安装于所述驱动机构，所述驱动机构用于驱动所述细胞打印头和所述静电纺丝头相对于伸出的所述培养池在三维坐标系中进行预定范围的运动；以及
箱体，所述箱体形成密闭的无菌环境，并且所述箱体收纳所述培养舱、所述驱动机构、所述细胞打印头和所述静电纺丝头。
更优选地，所述培养系统包括多个所述培养盒，当所述多个培养盒收纳于所述培养舱时所述多个培养盒在上下方向上大致均匀地排列。
更优选地，所述细胞培养系统包括用于使所述培养液循环流动的闭环循环系统，并且所述闭环循环系统包括：
储液部，所述储液部用于存储所述培养液，并且所述储液部与各所述培养盒的所述培养盒进液口和所述培养盒出液口相连，使得所述储液部和所述培养池之间能够双向流体连通；
驱动源，所述驱动源与所述储液部和所述培养盒相连，用于使得所述培养液在所述闭环循环系统内循环流动并持续流经所述培养池；
监测组件，所述监测组件设置于所述储液部与所述培养盒进液口之间并且用于监测从所述储液部流入所述培养池的所述培养液的预定参数；以及
空气交换器，所述空气交换器设置于所述储液部与所述培养盒进液口之间且用于对经由所述培养盒进液口流入所述培养池的所述培养液进行氧气和二氧化碳的交换，
其中在所述闭环循环系统中，所述储液部、所述驱动源、所述监测组件、所述空气交换器和所述培养盒串联在一起。
更优选地，所述储液部、所述驱动源、所述监测组件、所述空气交换器和所述培养盒均设置于所述培养舱的内部。
更优选地，所述驱动源包括：
负压泵，所述负压泵设置于所述储液部与所述培养盒出液口之间，用于将所述培养池内的培养液泵送到所述储液部；以及
蠕动泵，所述蠕动泵设置于所述储液部和所述培养盒进液口之间，用于将所述储液部内的培养液泵送到所述培养池。
更优选地，所述监测组件包括：
PH计，所述PH计用于监测从所述储液部流入所述培养池的所述培养液的PH值；以及
氧浓度计，所述氧浓度计用于监测从所述储液部流入所述培养池的所述培养液的氧气浓度。
通过采用上述技术方案，本发明提供了一种新的细胞培养方法及细胞培养系统，该细胞培养方法在密闭的无菌环境中交替进行静电纺丝和细胞打印，使得在每两层静电纺丝层之间通过细胞打印成型打印结构体，然后使得培养液从最顶层的静电纺丝层流入并持续流经打印结构体来培养细胞。
这样，首先，通过具有多级微孔的三维结构的打印结构体能够模拟三维的生长环境，例如干细胞的细胞在这种更加接近生物体内环境的三维环境内培养与生长，有利于细胞的粘附和增殖。其次，在细胞的培养过程中，培养液持续进行动态循环，可以实现较高密度的细胞生长，提高细胞的增殖效率。再次，从最顶层的静电纺丝层提供培养液，能够大幅降低培养液的剪切力对细胞的刺激，既能保证例如干细胞干性的保留又能实现动态培养。最后，根据本发明的细胞培养方法能够全自动化地在密闭的无菌环境中进行，减小了污染的风险，同时减轻了工作负担。
附图说明
图1是示出了采用根据本发明的细胞培养方法获得的多层结构的整体结构、放大的局部结构以及单条打印材料在显微条件下的微观结构的示意图。
图2示出了根据本发明的培养系统的立体结构透视图。
图3示出了图2中的培养系统中的培养盒的立体结构透视图。
图4示出了图2中细胞培养系统的培养舱内部的闭环循环系统的示意图。
附图标记说明
1培养舱 11培养盒 111培养池 112培养盒进液口 113培养盒出液口 12负压泵13储液罐 14 PH计 15氧浓度计 16蠕动泵 17空气交换器 18硅胶管 2驱动机构 21竖梁22横梁 3箱体 4细胞打印头 5静电纺丝头
L1下支撑板 L2底层静电纺丝层 L3打印结构体 L4上支撑板 L41通孔 L5顶层静电纺丝层。
具体实施方式
下面参照附图描述本发明的示例性实施方式。应当理解，这些具体的说明仅用于示教本领域技术人员如何实施本发明，而不用于穷举本发明的所有可行的方式，也不用于限制本发明的范围。
以下将首先结合说明书附图说明根据本发明的细胞培养方法。
(根据本发明的细胞培养方法)
概括来说，根据本发明的细胞培养方法在密闭的无菌环境中交替进行静电纺丝和细胞打印，使得在每两层静电纺丝层之间通过细胞打印成型打印结构体，并且进一步使得培养液从最顶层的静电纺丝层流入并持续流经打印结构体来培养细胞。
具体地，以图1所示的采用根据本发明的细胞培养方法获得的多层结构为例来说明根据本发明的细胞培养方法的具体步骤。具体地，根据本发明的细胞培养方法在密闭的无菌环境中顺序执行如下步骤。
S1：利用静电纺丝材料通过静电纺丝技术在培养池内成型底层静电纺丝层L2。该静电纺丝层L2是通过静电纺丝技术形成的纳米纤维丝层层覆盖形成的薄膜，因此也可以称为底层静电纺丝膜。该静电纺丝层具有大量微小的孔，使得培养液能够流动穿过静电纺丝层。
S2：利用打印材料通过细胞打印技术(例如3D打印技术)在底层静电纺丝层L2上成型打印结构体L3。该打印结构体L3用于细胞培养且形成为具有多级微孔的三维结构。在图1所示的实施方式中该打印结构体L3包括层叠在一起的四层打印材料，各层打印材料交错排列以形成上述具有多级微孔的三维结构。
S3：利用静电纺丝材料通过静电纺丝技术在上述打印结构体L3的上方成型顶层静电纺丝层L5。该顶层静电纺丝层L5与底层静电纺丝层L2具有类似的结构和特性。
S4：使培养液从顶层静电纺丝层L5的上方持续流入，流经打印结构体L3之后，再从培养池流出，使得在新鲜的培养液持续流经打印结构体L3的情况下在打印结构体L3上动态培养细胞，以使细胞有效地增殖。
这样，一方面，在底层静电纺丝层L2和顶层静电纺丝层L5之间的打印结构体L3形成了用于培养细胞的三维培养环境，在细胞培养过程中尽可能地保存了细胞特性不受影响；另一方面，使得新鲜的培养液从顶层静电纺丝层L5持续流入并流经打印结构体L3，这极大地降低了流动的培养液的剪切力对细胞产生的刺激作用，从而降低了对细胞培养的影响而且还实现了动态培养。
另外，在步骤S1中，在成型底层静电纺丝层L2之前，可以在培养池内设置下支撑板L1，以用于支撑底层静电纺丝层L2；在步骤S3中，在成型顶层静电纺丝层L5之前，可以在打印结构体L3的上方设置上支撑板L4，以用于支撑顶层静电纺丝层L5。优选地，如图1所示，上支撑板L4形成有均匀地分布的大量通孔L41，这些通孔L41以矩阵阵列的方式分布于整个上支撑板L4，使得来自顶层静电纺丝层L5的培养液能够流经上支撑板L4进入打印结构体L3。下支撑板L1具有与上支撑板L4类似的结构，培养液在流经打印结构体L3之后经由底层静电纺丝层L2和下支撑板L1流入培养池的底部。
进一步地，如图1所示，根据本发明的细胞培养方法在执行步骤S2时通过作为细胞打印的3D打印技术使打印材料成型为包括四层结构的打印结构体L3，各层中的打印材料形成为彼此大致平行且间隔开的多个条状。
一方面，各条状的打印材料本身形成了大量的第一级微孔，使得各条状的打印材料形成为多孔结构(如图1所示的微观结构)。该第一级微孔为最大孔径d1在100μm左右的不规则孔。这种第一级微孔是由于打印材料本身的性质所形成的。
另一方面，每相邻两层的打印材料的延伸方向彼此正交(如图1所示的局部结构)，并且在同一层打印材料中两条相邻的打印材料之间的在排列方向上具有一定间隔d2，该间隔d2为500μm左右。这样，在该打印结构体L3的上方(沿与静电纺丝层L2、L5所在的平面正交的方向)观察以及在该打印结构体L3的侧方(沿同一层打印材料的排列方向)观察时，整个打印结构体L3都形成了具有大量的第二级微孔的格栅结构，该第二级微孔为该栅格结构中的边长在500μm左右的栅格孔。这种第二级微孔是由于条状的打印材料所形成的三维架构所形成的。
如上所述，打印材料本身的性质使得条状的打印材料自身形成了大量的第一级微孔(不规则孔)，这样打印材料能够为细胞提供较为适宜的粘附、迁徙和生长所需的环境。条状的打印材料相互之间存在间隔，打印结构体内的打印材料层层累积使得打印结构体的三维架构形成了大量的第二级微孔(栅格孔)。这样，通过上述第一级微孔和第二级微孔使得打印机构体L3形成为具有多级微孔的三维结构，从而能够保证营养和氧气的良好渗入，使得能够更好地培养打印结构体内部的细胞。经过实践证明，这种结构更有利于细胞的培养和增殖。
以上说明了根据本发明的细胞培养方法及采用该细胞培养方法所形成的多层结构。以下说明根据本发明的细胞培养方法在进行静电纺丝和细胞打印时所采用的材料。
关于静电纺丝材料，静电纺丝材料可以是聚羟基乙酸、聚乳酸和丝素蛋白等。
关于打印材料，通过细胞与水凝胶材料均匀混合后形成打印材料，使得在打印材料中细胞的密度为1×105至1×106个/毫升。细胞优选为胚胎干细胞、骨髓充间质干细胞或脂肪充间质干细胞等。水凝胶材料优选可以通过如下溶液中的一种或多种形成：浓度为5％至20％的明胶溶液、浓度为0.2％至6％的海藻酸钠溶液、浓度为0.1％至6％的纤维蛋白原溶液、浓度为0.1％至10％的壳聚糖溶液和浓度为0.1％至10％的透明质酸溶液等，其中浓度为溶质的质量与溶剂的预定体积的百分比，该质量的单位为克，该预定体积为100ml
另外，还需要说明的是：
i.采用根据本发明的细胞培养方法获得的多层结构不限于图1所示的结构，而是可以在底层静电纺丝层L2上交替成型预定数量的打印结构体L3和附加静电纺丝层。
例如，在执行步骤S1之后，可以反复执行步骤S2和步骤S3，使得在底层静电纺丝层上成型打印结构体和附加静电纺丝层交替排列的多层结构。此后，在步骤S4中，可以使培养液从最顶层的附加静电纺丝层的上方持续流入，流经所有的打印结构体之后，再从培养池流出，使得在培养液持续流经所有打印结构体的情况下在所有打印结构体上动态培养细胞，以使细胞增殖。
ii.为了保证动态培养效果，采用根据本发明的细胞培养方法获得的多层结构的整体厚度以及该多层结构中所包含的静电纺丝层的单层厚度和打印结构体的结构体厚度均应当保证在预定范围内。优选地，该静电纺丝层的单层厚度为100μm至300μm，该打印结构体的结构体厚度为3000μm至8000μm，采用根据本发明的细胞培养方法获得的多层结构的整体厚度应保证培养液能够充分地流过每一个打印结构体。
以上已经结合说明书附图说明了根据本发明的细胞培养方法及通过该细胞培养方法所获得多层结构，以下将结合说明书附图说明执行根据本发明的细胞培养方法的细胞培养系统。
(根据本发明的细胞培养系统)
如图2所示，根据本发明的细胞培养系统包括组装在一起的培养舱1、驱动机构2、箱体3、细胞打印头4和静电纺丝头5，培养舱1设置于箱体3的靠一侧的位置处，驱动机构2、细胞打印头4和静电纺丝头5设置于箱体3的内部的除了用于安放培养舱1之外的剩余空间。这样，可以实现细胞打印、细胞培养的全自动化，不需要反复进行换液、传代等操作，减小污染的风险，同时减轻人力负担。
具体地，在本实施方式中，如图4所示，培养舱1包括彼此串联在一起的培养盒11、负压泵12、储液罐13、PH计14、氧浓度计15、蠕动泵16和空气交换器17，上述各组件通过医用硅胶管18顺次相连，使得根据本发明的培养舱1内形成用于培养液循环流动的闭环循环系统。在闭环循环系统中，一方面，经由蠕动泵16将培养液从储液罐13中泵出，顺次流过PH计14、氧浓度计15以及空气交换器17到达培养盒11；另一方面，经由负压泵12将培养液从培养盒11中泵出再返回储液罐13中，从而实现了培养液的循环流动。
在本实施方式中，培养舱1形成有用于收纳培养盒11的多个收纳槽，多个收纳槽在上下方向(图2所示的z轴方向)上均匀排列。该培养舱12能够为细胞的培养提供合适的温度与洁净环境。
各培养盒11均能够收纳于上述收纳槽内以及从收纳槽伸出。在培养盒11收纳于收纳槽时培养盒11处于收纳状态，在各培养盒11处于收纳状态时多个培养盒11以在上下方向上均匀排列的方式配置；在培养盒11从收纳槽伸出时培养盒11处于非收纳状态，此时细胞打印头4和静电纺丝头5能够在培养盒11的培养池111内进行细胞打印和静电纺丝。
如图3所示，各培养盒11的内部设置有培养池111，细胞打印头4和静电纺丝头5能够在培养池111内成型打印结构体L3和静电纺丝层L2、L5。各培养盒11还设置有与培养池111连通的培养盒进液口112和培养盒出液口113。培养盒进液口112设置于培养池111的上部，培养盒出液口113设置于培养盒11的侧部，使得培养液能够从培养盒进液口112流入培养池111并从培养盒出液口113流出培养池111。
在本实施方式中，储液罐13用于存储培养液，并且储液罐13与各培养盒11的培养盒进液口112和培养盒出液口113相连，使得储液罐13和培养池111能够实现双向流体连通。在本实施方式中，负压泵12和蠕动泵16作为培养液循环流动的动力源。负压泵12设置于闭环循环系统中的在储液罐13与培养盒出液口113之间的部分，该负压泵12用于将培养池111内的培养液泵送到储液罐13。蠕动泵16设置于闭环循环系统中的在储液罐13和培养盒进液口112之间的部分，该蠕动泵16用于将储液罐13内的培养液泵送到培养池111。
在本实施方式中，PH计14和氧浓度计15作为监测组件均设置于闭环循环系统中的在储液罐13与培养盒进液口112之间的部分并且用于监测从储液罐13流入培养池111的培养液的预定参数。具体地，PH计14用于监测从储液罐13流入培养池111的培养液的PH值，氧浓度计15用于监测从储液罐13流入培养池111的培养液的氧气浓度。
在本实施方式中，空气交换器17设置于储液罐13与培养盒进液口112之间且用于基于氧浓度计15的测量结果来对经由培养盒进液口112流入培养池111的培养液进行氧气和二氧化碳的交换，从而保证培养液中的氧气浓度。
更具体地，在培养液的流动方向上，氧浓度计15设置于PH计14的下游位置，蠕动泵16设置于氧浓度计15的下游位置，空气交换器17设置于氧浓度计15的下游位置。
进一步地，在本实施方式中，如图2所示，驱动机构2用于使得细胞打印头4和静电纺丝头5能够相对于培养盒11在三维坐标系(如图2所示，包括彼此正交的x轴、y轴和z轴的坐标系)中在预定范围内进行直线运动，该驱动机构2的动力源可以是伺服电机(图中未示出)。
具体地，在本实施方式中，驱动机构2包括竖梁21和横梁22。竖梁21的长度方向与z轴方向一致，细胞打印头4和静电纺丝头5均安装于竖梁21并且细胞打印头4和静电纺丝头5能够相对于竖梁21在z轴方向上运动。横梁22的长度方向与x轴方向一致，竖梁21的一端安装于横梁22并且竖梁21能够带动细胞打印头4和静电纺丝头5一起相对于横梁22在x轴方向上运动。横梁22的两端搭接于箱体3的侧壁和培养舱12的顶部，并且横梁22能够带动竖梁21一起相对于箱体3在y轴方向上运动。这样，通过上述驱动机构2能够实现细胞打印头4和静电纺丝头5相对于培养盒11在三维坐标系中进行预定范围的直线运动，从而使得细胞打印头4和静电纺丝头5能够位于培养盒11的上方的适当位置处进行细胞打印和静电纺丝。
细胞打印头4和静电纺丝头5以细胞打印头4的针头和静电纺丝头5的针头均朝向下方的方式安装于竖梁21。在驱动机构2的驱动下，细胞打印头4的针头和静电纺丝头5的针头能够面对培养池111的任意部位并且也能够调节细胞打印头4的针头和静电纺丝头5的针头与培养池111在上下方向上的距离。
进一步地，在本实施方式中，如图2所示，箱体3呈长方体形状，在箱体3的内部形成密闭的无菌环境，从而避免在细胞培养过程中细胞受到污染。另外，根据需要，箱体3还能够提供稳定的温度环境。
应当理解，上述实施方式仅是示例性的，不用于限制本发明。本领域技术人员可以在本发明的教导下对上述实施方式做出各种变型和改变，而不脱离本发明的范围。
i.本发明提供的细胞培养方法及细胞培养系统还可以用于培养除干细胞以外的普通细胞。
ii.上述驱动机构2还可以采用例如机械臂来驱动培养盒11相对于细胞打印头4和静电纺丝头5移动的技术方案。
iii.根据本发明的细胞培养系统还可以包括控制单元，该控制单元优选地设置于培养舱1内且用于控制整个细胞培养系统的作业。
iv.虽然在以上的具体实施方式中没有明确说明，但是应当理解，除了能够使得培养池111随着培养盒11从培养舱1伸出以外，还可以使培养池111单独地从培养舱1伸出而不必使整个培养盒11从培养舱1伸出。具体地，当需要将培养池111单独地从培养舱1伸出时，需要将培养池111从培养盒11内取出，这时可以先从培养盒111的前方将培养盒111的盒盖/端堵取出，然后将培养池111从培养盒11内取出；当需要将培养池111装入培养盒11内时，作业顺序与取出时的作业顺序相反。

Claims (17)

1.一种细胞培养方法，其特征在于，所述培养方法包括在密闭的无菌环境中执行如下步骤：
S1：通过静电纺丝在培养池(111)内成型底层静电纺丝层(L2)；
S2：通过细胞打印在所述底层静电纺丝层(L2)上打印具有多级微孔的三维结构的打印结构体(L3)；
S3：通过静电纺丝在所述打印结构体(L3)的上方成型附加静电纺丝层(L5)；以及
S4：使培养液从最顶层的附加静电纺丝层(L5)的上方持续流入，在流经所述打印结构体(L3)之后，再从所述培养池(111)流出，使得在所述培养液持续流经所述打印结构体(L3)的情况下在所述打印结构体(L3)上培养细胞。
2.根据权利要求1所述的细胞培养方法，其特征在于，在执行所述步骤S1之后，反复执行所述步骤S2和所述步骤S3，使得在所述底层静电纺丝层(L2)上成型所述打印结构体(L3)和所述附加静电纺丝层(L5)交替排列的多层结构，之后再执行所述步骤S4。
3.根据权利要求1或2所述的细胞培养方法，其特征在于，
所述步骤S1还包括：在成型所述底层静电纺丝层(L2)之前，在所述培养池(111)内设置具有多孔结构的第一支撑件(L1)，以用于支撑所述底层静电纺丝层(L2)，并且
所述步骤S3还包括：在成型所述附加静电纺丝层(L5)之前，在所述打印结构体(L3)的上方设置具有多孔结构的第二支撑件(L4)，以用于支撑所述附加静电纺丝层(L5)。
4.根据权利要求3所述的细胞培养方法，其特征在于，所述第一支撑件和所述第二支撑件为支撑板(L1、L4)，所述支撑板(L1、L4)形成有均匀地分布的多个通孔(L41)。
5.根据权利要求1或2所述的细胞培养方法，其特征在于，通过3D细胞打印使打印材料成型为具有多层结构的所述打印结构体(L3)。
6.根据权利要求5所述的细胞培养方法，其特征在于，在所述打印结构体(L3)中，各层中的所述打印材料形成为彼此大致平行且间隔开的多个条状，
各所述条状的打印材料自身形成有多个第一级微孔，并且
每相邻两层的所述条状的打印材料的延伸方向彼此正交，使得各层的所述条状的打印材料形成多个第二级微孔，
通过所述多个第一级微孔和所述多个第二级微孔使得所述打印结构体(L3)形成具有多级微孔的三维结构。
7.根据权利要求5所述的细胞培养方法，其特征在于，使所述细胞与水凝胶材料均匀混合后形成所述打印材料，使得在所述打印材料中所述细胞的密度为1×105个/毫升至1×106个/毫升。
8.根据权利要求7所述的细胞培养方法，其特征在于，
所述细胞为胚胎干细胞、骨髓充间质干细胞或脂肪充间质干细胞；和/或
所述水凝胶能够通过如下材料中的一种或多种形成：浓度为5％至20％的明胶溶液、浓度为0.2％至6％的海藻酸钠溶液、浓度为0.1％至6％的纤维蛋白原溶液、浓度为0.1％至10％的壳聚糖溶液和浓度为0.1％至10％的透明质酸溶液，其中所述浓度为溶质的质量与溶剂的预定体积的百分比，该质量的单位为克，该预定体积为100ml。
9.根据权利要求1或2所述的细胞培养方法，其特征在于，用于所述静电纺丝的静电纺丝材料为聚羟基乙酸、聚乳酸和/或丝素蛋白。
10.根据权利要求1或2所述的细胞培养方法，其特征在于，
所述底层静电纺丝层(L2)的厚度为100μm至300μm；和/或
所述附加静电纺丝层(L5)的厚度为100μm至300μm；和/或
所述打印结构体(L3)的厚度为3000μm至8000μm。
11.一种用于执行权利要求1至10中任一项所述的细胞培养方法的细胞培养系统，其特征在于，所述细胞培养系统包括所述培养池(111)、用于进行所述细胞打印的细胞打印头(4)以及用于进行所述静电纺丝的静电纺丝头(5)，其中所述细胞打印头(4)和所述静电纺丝头(5)能够相对于所述培养池(111)在三维坐标系中进行预定范围的运动，并且所述细胞打印头(4)用于成型所述打印结构体(L3)且所述静电纺丝头(5)用于成型所述静电纺丝层(L2、L5)。
12.根据权利要求11所述的细胞培养系统，其特征在于，所述细胞培养系统还包括：
培养舱(1)，所述培养舱(1)收纳有培养盒(11)，所述培养池(111)设置于所述培养盒(11)内，所述培养池(111)单独能够从所述培养舱(1)伸出或所述培养池(111)能够随着所述培养盒(11)从所述培养舱(1)伸出，并且所述培养盒(11)设置有与所述培养池(111)连通的培养盒进液口(112)和培养盒出液口(113)，所述培养盒进液口(112)设置于所述培养池(111)的上方，所述培养液能够从所述培养盒进液口(112)流入所述培养池(111)并从所述培养盒出液口(113)流出所述培养池(111)；
驱动机构(2)，所述细胞打印头(4)和所述静电纺丝头(5)安装于所述驱动机构(2)，所述驱动机构(2)用于驱动所述细胞打印头(4)和所述静电纺丝头(5)相对于伸出的所述培养池(111)在三维坐标系中进行预定范围的运动；以及
箱体(3)，所述箱体(3)形成密闭的无菌环境，并且所述箱体(3)收纳所述培养舱(1)、所述驱动机构(2)、所述细胞打印头(4)和所述静电纺丝头(5)。
13.根据权利要求12所述的细胞培养系统，其特征在于，所述培养系统包括多个所述培养盒(11)，当多个所述培养盒(11)收纳于所述培养舱(1)时多个所述培养盒(11)在上下方向上大致均匀地排列。
14.根据权利要求12或13所述的细胞培养系统，其特征在于，所述细胞培养系统包括用于使所述培养液循环流动的闭环循环系统，并且所述闭环循环系统包括：
储液部(13)，所述储液部(13)用于存储所述培养液，并且所述储液部(13)与各所述培养盒(11)的所述培养盒进液口(112)和所述培养盒出液口(113)相连，使得所述储液部(13)和所述培养池(111)之间能够双向流体连通；
驱动源(12、16)，所述驱动源(12、16)与所述储液部(13)和所述培养盒(11)相连，用于使得所述培养液在所述闭环循环系统内循环流动并持续流经所述培养池(111)；
监测组件(14、15)，所述监测组件(14、15)设置于所述储液部(13)与所述培养盒进液口(112)之间并且用于监测从所述储液部(13)流入所述培养池(111)的所述培养液的预定参数；以及
空气交换器(17)，所述空气交换器(17)设置于所述储液部(13)与所述培养盒进液口(112)之间且用于对经由所述培养盒进液口(112)流入所述培养池(111)的所述培养液进行氧气和二氧化碳的交换，
其中在所述闭环循环系统中，所述储液部(13)、所述驱动源(12、16)、所述监测组件(14、15)、所述空气交换器(17)和所述培养盒(11)串联在一起。
15.根据权利要求14所述的细胞培养系统，其特征在于，所述储液部(13)、所述驱动源(12、16)、所述监测组件(14、15)、所述空气交换器(17)和所述培养盒(11)均设置于所述培养舱(1)的内部。
16.根据权利要求14所述的细胞培养系统，其特征在于，所述驱动源(12、16)包括：
负压泵(12)，所述负压泵(12)设置于所述储液部(13)与所述培养盒出液口(113)之间，用于将所述培养池(111)内的培养液泵送到所述储液部(13)；以及
蠕动泵(16)，所述蠕动泵(16)设置于所述储液部(13)和所述培养盒进液口(112)之间，用于将所述储液部(13)内的培养液泵送到所述培养池(111)。
17.根据权利要求14所述的细胞培养系统，其特征在于，所述监测组件(14、15)包括：
PH计(14)，所述PH计(14)用于监测从所述储液部(13)流入所述培养池(111)的所述培养液的PH值；以及
氧浓度计(15)，所述氧浓度计(15)用于监测从所述储液部(13)流入所述培养池(111)的所述培养液的氧气浓度。
CN201910357214.7A 2019-04-29 2019-04-29 细胞培养方法及细胞培养系统 Active CN110055178B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910357214.7A CN110055178B (zh) 2019-04-29 2019-04-29 细胞培养方法及细胞培养系统

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910357214.7A CN110055178B (zh) 2019-04-29 2019-04-29 细胞培养方法及细胞培养系统

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110055178A CN110055178A (zh) 2019-07-26
CN110055178B true CN110055178B (zh) 2020-06-05

Family

ID=67321566

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910357214.7A Active CN110055178B (zh) 2019-04-29 2019-04-29 细胞培养方法及细胞培养系统

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110055178B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110564613A (zh) * 2019-08-15 2019-12-13 广州迈普再生医学科技股份有限公司 一种培养单元及具有其的生物培养系统及其工作方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101574543B (zh) * 2009-06-09 2014-10-29 广州迈普再生医学科技有限公司 一种基于自体细胞的人工关节软骨及其制备方法
CN104419659A (zh) * 2013-08-30 2015-03-18 翔宇生医科技股份有限公司 脂肪干细胞及其干细胞分泌物的培养与量产方法
CN103877622B (zh) * 2014-03-26 2016-04-20 中山大学 一种静电纺丝纳米纤维-细胞外基质复合材料及其制备方法和应用
KR101486734B1 (ko) * 2014-06-30 2015-01-29 경북대학교 산학협력단 고분자 보강대를 가진 나노섬유 매트와 이의 제작 방법 및 제작 장치
WO2017136786A1 (en) * 2016-02-05 2017-08-10 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Rigionally specific tissua-derived extracellular metrix
CN205398649U (zh) * 2016-03-08 2016-07-27 兰青 3d打印含细胞水凝胶支架的灌流培养装置
CN106012052A (zh) * 2016-08-03 2016-10-12 苏州大学附属第二医院 结合生物打印和静电纺丝技术制造人工血管的装置
CN106827496A (zh) * 2016-11-30 2017-06-13 广州迈普再生医学科技有限公司 复合生物3d打印装置及其打印方法
CN109646715A (zh) * 2019-01-25 2019-04-19 上海交通大学医学院附属第九人民医院 电纺3d打印制备含细胞因子微球的多层软骨复合体

Also Published As

Publication number Publication date
CN110055178A (zh) 2019-07-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220389362A1 (en) Cell culture apparatus
KR102318115B1 (ko) 세포 대량배양 시스템
JP3420615B2 (ja) 微生物を培養しおよびその代謝を利用し及び／又は維持するためのモジュール、モジュールの作動方法、肝臓維持システム、バイオリアクター、及び生物細胞生成物を製造する方法
EP3068867B1 (en) Expanding cells in a bioreactor
CN106754356B (zh) 三维灌流培养系统及3d打印的组织器官
CN104840272B (zh) 一种具有内置营养通道的三维生物结构的打印方法
US20040029265A1 (en) Cell culture case
EP3177708B1 (en) Fluid circulation systems incorporating fluid leveling devices
CN110029061B (zh) 干细胞扩增培养系统和干细胞扩增培养方法
EP3498822B1 (en) Method for producing three-dimensional structure of cells and system for producing three-dimensional structure
CN110055178B (zh) 细胞培养方法及细胞培养系统
US10344257B2 (en) Horizontally rocked bioreactor system
CN107723236B (zh) 动态灌流培养系统
JP2014132869A (ja) 細胞培養容器
CN117229918B (zh) 一种无泵驱动液体灌注装置及方法
WO2016093321A1 (ja) 細胞培養方法及び細胞培養装置
CN110066726B (zh) 用于细胞连续三维培养的全自动化系统及其细胞培养方法
JPS62130683A (ja) 哺乳動物細胞を培養する方法および装置
CN114585724A (zh) 细胞培养装置
CN110734858A (zh) 一种多模式三维灌流式细胞培养仪
WO2013103306A1 (en) Bioreactor composed of watertight chamber and internal matrix for the generation of cellularized medical implants
CN215828801U (zh) 胚胎长时程培养系统
DE10326749B4 (de) Hybrides Kreislaufsystem
WO2024044348A1 (en) System and method for perfusion bioreactor for 3d cell culture
CN2514001Y (zh) 一种生物反应器

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant