CN110591143A - 一种丝素蛋白冷冻海绵的制备及应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种丝素蛋白冷冻海绵的制备及应用方法，将丝素蛋白海绵的制备工艺大幅简化，同传统方法需要使用有机溶剂和各种交联剂进行化学交联相比，本方案通过无毒性添加成分，制备多孔海绵结构的设施要求低，仅需要低温恒温箱一个设备，交联时间同目前已有的方案相比大幅缩减，整个实施方案从时间和经济上都实现了工艺上的显著提升。本技术方案从丝素蛋白溶液的制备到最终获得多孔海绵，即通过差式热实验寻找玻璃化转变温度—低温冷冻保存—解冻，实现丝素蛋白无添加剂的低温冷冻海绵制备。

Description

一种丝素蛋白冷冻海绵的制备及应用方法

技术领域

本发明属于医用组织修复技术领域，特别是指一种绿色无添加剂的丝素蛋白冷冻海绵的制备及应用方法。

背景技术

丝素蛋白是由节肢动物(桑蚕、蜘蛛、蜜蜂、蝎子等)腺体所分泌的丝中提炼而来。和其他用作生物材料的蛋白相比，蚕丝有许多优势。生物源蛋白多从同种异体或异种动物中提取，因此有较高的感染风险，丝素蛋白通过提炼，可以最大程度避免感染和免疫原性的问题。此外蛋白的提取分离和提纯所需的操作价格非常昂贵。相比之下丝素蛋白的获得来源简单易行，提纯方式也更为廉价，仅通过碱热的方式脱去蚕丝中的丝胶蛋白即可。

丝素蛋白的分子量较大(200～350kDa)，且拥有较多的疏水分子链段。丝素蛋白根据获得蚕的种类不同分为桑蚕类和非桑蚕类。前者结构上由一个重链(H)和一个轻链(L)通过二硫键交联在一起。在H链的疏水段有一类Gly-X(X包括Ala、Ser、Thr和Val)重复单元，这一结构有助于重链形成反向平行的β折叠。L链亲水性更好，并且具有一定的弹性。除此之外还有一种25kDa的糖蛋白，P25，也通过非共价键的形式参与到稳定链段的过程中。非桑蚕类的丝素蛋白并没有L链和P25分子，这类丝素蛋白由H链的二聚体组成，通过H链中较高的Ala/Gly比例和聚丙氨酸区域来实现β折叠。两种丝素蛋白由于结构的不同，其力学、生物活性以及降解性也有明显的区别。当丝素蛋白溶解在水中时，其中的亲水链段会形成无规链段，使得蚕丝具有弹性。而当丝素蛋白形成二级结构时，亲水链段会组成链段中的无定形的自由结构。

诱导丝素蛋白进行交联的主要方法是增加链段的运动，降低分子间的电荷排斥，提高分子间形成二级结构的概率。常见的手段包括超声处理、电场刺激、添加金属离子、加入酸调整pH至4.1(丝素蛋白等电点)。丝素蛋白的氨基酸组成中包含5％的酪氨酸，因此也可以利用过氧化氢酶和过氧化氢对其进行酶交联反应，形成强度较弱的透明水凝胶。尽管目前已经拥有多种诱导丝素蛋白进行交联的方法，但是这些方法操作复杂，需要对pH、离子浓度、电场、有机溶剂等多方面进行调控，提高了丝素蛋白向临床转化的难度。

目前已有许多方案利用低温温度调控的方式实现丝素蛋白海绵的制备。Ak在《Macroporous silk fibroin cryogels》一文中，通过添加交联剂乙二醇二缩水甘油醚和催化剂四甲基乙二胺，通过冷冻后再解冻，形成高回弹性水凝胶。Tamada在《New processto form a silk fibroin porous 3-D structure》一文中利用有机溶剂和水混合作为溶剂，在-20℃下冷冻12小时，解冻后获得多孔泡沫结构。刘海峰等人在公开号为CN105749343A的中国发明专利《一种无需有机溶剂且二级结构可控的丝素蛋白多孔材料的制备方法》中，利用温度控制实现了丝素蛋白海绵的制备。

除上述方案外，目前最为常见的丝素蛋白海绵制备方是通过利用甲醇和乙醇对蛋白进行诱导变性，形成以β折叠为主的二级蛋白结构。在《Novel silk fibroin/elastinwound dressings》一文中，Andreia等人通过将弹性蛋白与丝素蛋白共混冻干并用90％甲醇溶液浸泡，实现皮肤敷料的制备。

尽管上述工作均可以实现低温调控丝素蛋白海绵的制备，但是前两篇工作分别加入了有毒的有机溶剂和有机试剂。这些毒性试剂的残留严重影响了丝素蛋白支架在体内的使用前景。刘海峰的专利对反应条件具有严苛的要求，温度仅限于0到-7摄氏度，不利于丝素蛋白温度控制海绵的工业推广与转化。而Andreia的工作虽然可以实现丝素蛋白的变性，获得高强度支架的制备，但是实验过程繁琐，需要花费大量的时间进行冻干，并且消耗甲醇等有机试剂，制备成本高昂。

发明内容

本发明的目的是提供一种丝素蛋白冷冻海绵的制备方法及应用，以解决现有技术的丝素蛋白存在有机溶液或试剂残留，制备过程繁琐及成本高的问题。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种丝素蛋白冷冻海绵的制备方法，包括以下步骤：

1)将蚕茧加入到煮沸之后的0.01-0.03mol/L碳酸钠溶液中，保持煮沸状态并搅拌溶解20-60min；

2)将步骤1)中的固体物质取出，水洗并在室温下烘干，得到丝素蛋白；

3)按丝素蛋白与溴化锂的质量比为1：4称取溴化锂，并配备9.3mol/L的溴化锂水溶液；

4)将溴化锂水溶液加入到放置有丝素蛋白的容器内，令溴化锂水溶液完全覆盖所述丝素蛋白，在50-70℃下搅拌3-5h；

5)将获得的黄褐色粘稠溶液进行透析，将收集液离心处理，保留上清液；

6)将上清液利用液氮速冻并进行冷冻干燥，得到可溶于水的海绵状丝素蛋白。

步骤1)中9.3mol/L溴化锂溶液的配制为，先计算好溴化锂溶液的体积，称取60％的水冰浴，边搅拌边将溴化锂缓慢加入水中，待溴化锂完全溶解后将水补充至计算值。

步骤1)中透析的方法为，每12h换一次水，三天后收集透析液在4℃离心转速为9000rpm离心两次，收集上清液。

一种丝素蛋白冷冻海绵的应用方法，利用上述任一项的丝素蛋白冷冻海绵，包括以下步骤：

1)将丝素蛋白海绵溶解成需要的丝素蛋白水溶液或丝素蛋白盐溶液；

2)通过差式热实验对所述丝素蛋白水溶液或所述丝素蛋白盐溶液的玻璃化转变温度进行测量，得到相变温度区间，温度区间通常从0度到-20度不等；

3)将所述丝素蛋白水溶液或所述丝素蛋白盐溶液导入模具中，放入低温恒温箱中，在步骤2)测定的相变温度区间中进行冷冻保存12-72小时，使其充分变性；

4)取出解冻即可应用。

本发明的有益效果是：

本技术方案将丝素蛋白海绵的制备工艺大幅简化，同传统方法需要使用有机溶剂和各种交联剂进行化学交联相比，本方案通过无毒性添加成分，制备多孔海绵结构的设施要求低，仅需要低温恒温箱一个设备，交联时间同目前已有的方案相比大幅缩减，整个实施方案从时间和经济上都实现了工艺上的显著提升。

本技术方案从丝素蛋白溶液的制备到最终获得多孔海绵，即通过差式热实验寻找玻璃化转变温度—低温冷冻保存—解冻，实现丝素蛋白无添加剂的低温冷冻海绵制备。

附图说明

图1为本实施例的差式热实验结果曲线图；

图2为10％浓度的丝素蛋白冷冻时间对解冻后的蛋白形态的影响，从左至右依次为冷冻3小时、6小时和24小时；

图3为丝素蛋白冷冻海绵与普通酒精处理的海绵的拉伸应力-应变曲线对比图；

图4为丝素蛋白冷冻海绵与普通酒精处理的海绵的压缩应力-应变曲线对比图；

图5为％丝素蛋白溶液在-9度冷冻时二级结构随时间的变化曲线图。

具体实施方式

以下通过实施例来详细说明本发明的技术方案，以下的实施例仅是示例性的，仅能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为是对本发明技术方案的限制。

实施例1

本申请提供一种丝素蛋白冷冻海绵的制备方法，包括以下步骤：

将10g蚕茧用剪刀剪成小块，并当0.02mol/L的无水碳酸钠溶液(2L)煮沸之后投入，保持煮沸状态下搅拌溶解30min。将得到的白色棉花状固体取出，多次水洗，并在室温下烘干。干燥充分后，称重，并以丝素蛋白：溴化锂＝1：4的质量比例称取相应的溴化锂。配备9.3mol/L的溴化锂水溶液(先计算好液体体积，之后称取60％左右的水，冰浴，同时将溴化锂缓慢加入正在搅拌的水中，完全溶解后补足体积至计算值)，并将溶液灌入装有丝素蛋白的烧杯中，令溴化锂溶液完全覆盖蛋白。之后在60℃下搅拌4h。随后将黄褐色粘稠溶液进行透析，每12h换一次水，3天之后收集并进行离心。离心转速为9000rpm，保持温度在4℃，离心两次，弃去杂质，只保留上清液。将收获的上清液分装后利用液氮速冻并进行冷冻干燥，得到的可溶于水的海绵状丝素蛋白可在室温干燥环境下长期保存。

实施例2

本申请提供一种丝素蛋白冷冻海绵的制备方法，包括以下步骤：

将10g蚕茧用剪刀剪成小块，并当0.03mol/L的无水碳酸钠溶液(2L)煮沸之后投入，保持煮沸状态下搅拌溶解40min。将得到的白色棉花状固体取出，多次水洗，并在室温下烘干。干燥充分后，称重，并以丝素蛋白：溴化锂＝1：4的质量比例称取相应的溴化锂。配备9.3mol/L的溴化锂水溶液(先计算好液体体积，之后称取60％左右的水，冰浴，同时将溴化锂缓慢加入正在搅拌的水中，完全溶解后补足体积至计算值)，并将溶液灌入装有丝素蛋白的烧杯中，令溴化锂溶液完全覆盖蛋白。之后在70℃下搅拌5h。随后将黄褐色粘稠溶液进行透析，每12h换一次水，3天之后收集并进行离心。离心转速为9000rpm，保持温度在4℃，离心两次，弃去杂质，只保留上清液。将收获的上清液分装后利用液氮速冻并进行冷冻干燥，得到的可溶于水的海绵状丝素蛋白可在室温干燥环境下长期保存。

实施例3

将10g蚕茧用剪刀剪成小块，并当0.031mol/L的无水碳酸钠溶液(2L)煮沸之后投入，保持煮沸状态下搅拌溶解30min。将得到的白色棉花状固体取出，多次水洗，并在室温下烘干。干燥充分后，称重，并以丝素蛋白：溴化锂＝1：4的质量比例称取相应的溴化锂。配备9.3mol/L的溴化锂水溶液(先计算好液体体积，之后称取60％左右的水，冰浴，同时将溴化锂缓慢加入正在搅拌的水中，完全溶解后补足体积至计算值)，并将溶液灌入装有丝素蛋白的烧杯中，令溴化锂溶液完全覆盖蛋白。之后在50℃下搅拌5h。随后将黄褐色粘稠溶液进行透析，每12h换一次水，3天之后收集并进行离心。离心转速为9000rpm，保持温度在4℃，离心两次，弃去杂质，只保留上清液。将收获的上清液分装后利用液氮速冻并进行冷冻干燥，得到的可溶于水的海绵状丝素蛋白可在室温干燥环境下长期保存。

本申请还提供一种丝素蛋白冷冻海绵的应用方法，利用上述实施例1至3中的丝素蛋白冷冻海绵，包括以下步骤：

1)将丝素蛋白海绵溶解成需要的丝素蛋白水溶液或丝素蛋白盐溶液；

2)通过差式热实验对所述丝素蛋白水溶液或所述丝素蛋白盐溶液的玻璃化转变温度进行测量，得到相变温度区间；

3)将所述丝素蛋白水溶液或所述丝素蛋白盐溶液导入模具中，放入低温恒温箱中，在步骤2)测定的相变温度区间中进行冷冻保存12-72小时，使其充分变性；

4)取出解冻即可应用。

实验结果

在本申请的以后实施例中，均选用实施例1制备的丝素蛋白冷冻海绵进行测试，至于其它实施例所制备的丝素蛋白冷冻海绵，区别仅是碳酸钠溶液的浓度不同导致冷冻温度的改变，并不影响最终丝素蛋白冷冻海绵的品质或结构等。

差式热实验结果

差式热实验可以用来表征蛋白溶液的低温的玻璃化转变温度情况。在本实施例中，我们将实施例1所属的可溶解丝素蛋白海绵以10％的浓度进行配置水溶液，并进行差式热实验。实验结果表明，对于这一浓度的丝素蛋白冷冻海绵溶液，-7.0到-12.5度是玻璃化转变温度区间，其中越靠近-7.0度越容易实现相变，如图1所示。

丝素蛋白冷冻海绵大体观

当反应温度在-7度到-12度时，丝素蛋白冷冻海绵溶液的结构随着冷冻时间不断变化。以10％为例，在前三个小时，丝素蛋白冷冻海绵溶液虽然已经冷冻，但是解冻之后依旧是澄清溶液。从6h起收集的样品，解冻后都是以凝胶的形式出现，且凝胶的强度逐渐加强，颜色加深。这些凝胶即便在4℃下密封保存，随着时间变化也会逐渐变硬，具有更高的力学强度。当冷冻时间足够长后(12h以上)，稳定的海绵结构才会出现，并且长时间保存也不会出现进一步变化，如图2所示。

丝素蛋白冷冻海绵的力学表征

图3所示为丝素蛋白冷冻海绵的拉伸应力-应变曲线，图4所示为丝素蛋白冷冻海绵的压缩应力-应变曲线。浓度的提高对丝素蛋白冷冻海绵支架的影响很大。当丝素蛋白冷冻海绵溶液浓度达到10％时，丝素蛋白冷冻海绵支架的压缩模量达到37kPa，比5％组提高了近4倍。而在拉伸实验中，10％组的模量达到250kPa，远高于5％组的60kPa。和传统的冻干处理方法相比，传统冷冻海绵的力学特性更差。5％丝素蛋白冷冻海绵溶液经过冻干并用酒精处理后得到的支架力学特性和10％组的支架相差不多。但是传统方法得到的海绵具有更短的断裂伸长率以及弹性区间。同样浓度的丝素蛋白冷冻海绵支架的拉伸实验对比中，丝素蛋白冷冻海绵组的弹性形变在40％以内，而传统海绵的形变仅15％左右。另外对比海绵的断裂伸长率时，传统海绵的伸长率只有60％左右，而丝素蛋白冷冻海绵组的伸长率均超过120％。具体的力学性质对比见表1。

表1不同浓度的冷冻海绵与传统丝素蛋白海绵的力学性质对比

	压缩模量(kPa)	拉伸模量(kPa)
			CSF 2.5	2.13±0.65	22.1±8.12
CSF 5	7.52±3.39	58.0±5.56
			CSF 10	37.1±10.2	250±23.7
SF 5	36.8±11.0	221±33.6

丝素蛋白冷冻海绵在冷冻过程中的结构变化

为探究丝素蛋白冷冻海绵随冷冻时间的变化而产生的结构变化，我们每隔3小时取一个样品进行红外表征，如图5所示。当3h取出的时候，丝素蛋白冷冻海绵溶液解冻依旧保持液态，在1650cm^-1左右有一个主峰。而随着冷冻的时间越长，产物在1658和1628两个波数处的峰越来越明显。当24h后取出解冻后已经变为海绵的样品时，可以看到该样品在1658cm^-1处有一强峰。红外光谱的结果清晰表明，随着冷冻时间的延长，丝素蛋白冷冻海绵从无规排布的分子构象逐渐向silk I和silk II结构转变。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变形，本发明的范围由所附权利要求极其等同限定。

Claims (4)

1.一种丝素蛋白冷冻海绵的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将蚕茧加入到煮沸之后的0.01-0.03mol/L碳酸钠溶液中，保持煮沸状态并搅拌溶解20-60min；

2)将步骤1)中的固体物质取出，水洗并在室温下烘干，得到丝素蛋白；

3)按丝素蛋白与溴化锂的质量比为1：4称取溴化锂，并配备9.3mol/L的溴化锂水溶液；

4)将溴化锂水溶液加入到放置有丝素蛋白的容器内，令溴化锂水溶液完全覆盖所述丝素蛋白，在50-70℃下搅拌3-5h；

5)将获得的黄褐色粘稠溶液进行透析，将收集液离心处理，保留上清液；

6)将上清液利用液氮速冻并进行冷冻干燥，得到可溶于水的海绵状丝素蛋白。

2.根据权利要求1所述的丝素蛋白冷冻海绵的制备方法，其特征在于，步骤1)中9.3mol/L溴化锂溶液的配制为，先计算好溴化锂溶液的体积，称取60％的水冰浴，边搅拌边将溴化锂缓慢加入水中，待溴化锂完全溶解后将水补充至计算值。

3.根据权利要求1所述的丝素蛋白冷冻海绵的制备方法，其特征在于，步骤1)中透析的方法为，每12h换一次水，三天后收集透析液在4℃离心转速为9000rpm离心两次，收集上清液。

4.一种丝素蛋白冷冻海绵的应用方法，其特征在于，利用上述权利要求1至3中任一项的丝素蛋白冷冻海绵，包括以下步骤：

1)将丝素蛋白海绵溶解成需要的丝素蛋白水溶液或丝素蛋白盐溶液；

2)通过差式热实验对所述丝素蛋白水溶液或所述丝素蛋白冷盐溶液的玻璃化转变温度进行测量，得到相变温度区间，温度区间通常从0度到-20度不等；

3)将所述丝素蛋白水溶液或所述丝素蛋白盐溶液导入模具中，放入低温恒温箱中，在步骤2)测定的相变温度区间中进行冷冻保存12-72小时，使其充分变性；

4)取出解冻即可应用。