CN101857729A - 一种难溶于水的丝素蛋白多孔材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种难溶于水的丝素蛋白多孔材料及其制备方法。在丝素蛋白溶液中加入一种或者几种盐溶液，混合均匀后注入金属模具中，在-10～-80℃的条件下冷冻处理1～24小时，进行冷冻干燥，再在4～120℃、30～98％湿度的环境中处理，形成难溶于水的丝素蛋白多孔材料。它在37℃的水中24小时的溶失率小于2％，并能完全降解为无毒性的氨基酸；该材料的孔隙、孔径较大，适合于细胞生长；同时，制备过程中不需要添加任何化学交联剂、发泡剂或变性剂等，保持了丝素蛋白良好的生物相容性，可用于细胞培养、皮肤、骨、软骨的修复创面材料以及暂时性覆盖、组织隔离、止血、药物控制释放材料等。

Description

一种难溶于水的丝素蛋白多孔材料及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种多孔材料及其制备方法，特别涉及一种以丝素蛋白为原料，制备水不溶性多孔材料的技术，所制备的材料可应用于生物医学、生物技术、组织工程等技术领域。

背景技术

用于组织工程支架的生物材料应具备良好的生物相容性以及一定的生物活性、生物可降解性和三维多孔结构。除此之外还应具备的重要条件是在生理环境下，一定时间内保持稳定，不易被体液溶解，否则难以起到支架的作用。用作创面暂时性覆盖、组织隔离、止血、药物控制释放等的生物材料，以及用作生物传感器、细胞培养载体等的生物材料，同样要求在生理环境下或者缓冲溶液中难溶。

蚕丝由约75％的丝素和约25％的丝胶所组成，是相当纯的天然蛋白纤维。研究表明丝素蛋白无毒、无刺激性，具有良好的生物相容性，并具有一定的生物可降解性。近年来，通过对多种生物材料的对比研究表明，丝素蛋白具有与胶原蛋白同等的体内、体外生物相容性(Biomaterials，2003，24(3)：401-416)。因此，丝素蛋白是较理想的制造生物医学材料的原料。

由于蚕丝是纤维状材料，为了制备多孔材料，一般的做法是脱胶后将丝素蛋白做成水溶液，再采用不同的方法制备多孔材料。从丝素蛋白水溶液制备多孔材料过程中，也是丝素蛋白从水溶性状态转变为难溶于水的状态过程。

目前，常用的制备丝素蛋白多孔材料的方法有冷冻干燥法、醇类变性法和静电纺丝法等。在本发明作出之前，公开号为CN1262579C的中国发明专利“丝素蛋白海绵装状三维多孔材料制备方法”中，采用了有机醇类作为变性剂，促使丝素蛋白的结构向丝素Ⅱ结晶即β-折叠结构转变，最终使丝素蛋白不溶于水。醇类变性法制备丝素蛋白多孔材料，有机溶剂有可能影响丝素蛋白材料的生物相容性，因此，在作为生物医用材料应用时可能会受到一定的限制。公开号为CN1844509A的中国发明专利“一种丝素蛋白多孔结构材料的制备方法”中，采用静电纺丝的方法，得到一种丝素蛋白多孔纤维材料，该材料仍然具有一定的水溶性，需要用有毒有机溶剂甲醇处理使之不溶，有可能影响丝素蛋白材料的生物相容性。公开号为CN1118518C的中国发明专利公开了一种多孔丝素膜及其制备方法，它采用了冷冻干燥的方法，其丝素蛋白的结构主要为非结晶结构，为了降低材料的水溶性，该方法在丝素蛋白溶液中加入了化学交联剂，这可能影响到丝素蛋白材料的生物相容性。

发明内容

本发明目的是提供一种生物相容性好，具有的孔隙和孔径适合于细胞生长，水溶性低于2％的丝素蛋白多孔材料及其制备方法。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：提供一种难溶于水的丝素蛋白多孔材料，具有孔径为10～500微米的相互贯通的孔隙，它在37℃的水中24小时的溶失率小于2％。

提供一种难溶于水的丝素蛋白多孔材料的制备方法，将家蚕丝经脱胶、溶解、透析和浓缩处理后，得到丝素蛋白溶液，再进行如下步骤的处理：

(1)在上述丝素蛋白溶液中加入盐溶液，使最终的丝素蛋白溶液中盐的浓度为0.001～10克/升，丝素的质量浓度为1～30％；将它们混合均匀后注入金属模具中，在-10～-80℃的温度条件下经0.1～24小时的冷冻，得到冷冻体；所述的盐为氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、氯化铁、氯化锌、溴化铁、溴化钠、溴化钾、溴化钙、硫酸铁、硫酸钠、硫酸钾、硫酸钙、硫酸镁、硝酸铁、硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙、硝酸镁和硝酸锌中的一种或其中2～5种的任意组合；

(2)对上述冷冻体进行冷冻干燥处理，得到丝素蛋白多孔材料；

(3)将上述丝素蛋白多孔材料在温度为4～120℃，相对湿度30～98％的条件下进行处理，得到一种难溶于水的丝素蛋白多孔材料。

当步骤(3)中所述的温度为4～50℃，相对湿度为50～98％时，处理时间为2小时或以上；当温度为50～120℃，相对湿度为30～98％时，处理时间可以缩短到0.1小时或以上。

发明人研究发现，蚕在吐丝的过程中通过调节体内盐的浓度来调节丝素蛋白的结构，从而，得到不溶化的蚕丝。在此过程中，钠、钾、镁、钙、锌、铁等离子发挥了重要的作用。蚕丝刚吐出时含水率很高，丝素蛋白周围局部潮湿环境是丝素蛋白自助装的重要推动力。

本发明的原理是：利用金属离子诱导丝素蛋白自助装来得到难溶于水的丝素蛋白材料。丝素蛋白在盐溶液中通过与金属离子的相互作用自组装成一定的纳米结构，在冷冻干燥过程中，随着水分的挥发，金属离子与丝素蛋白间的作用增强，协助丝素蛋白自组装成更加大的颗粒。在其后的潮湿环境处理过程中，盐类吸收水分，在水分不多的情况下，丝素蛋白得不到充足的水分溶解，但一定水分(湿度)的存在可促使丝素蛋白分子链段的运动，在盐类的离子相互作用下自组装形成难溶于水的结构。在此过程中，控制一定的盐浓度以及一定的温度和湿度，通过一定时间的处理过程以后，丝素蛋白分子相互连接，形成难溶于水的多孔三维材料。

采用本发明所提供的技术方案，具有以下明显的优点：

1、由于本发明得到的丝素蛋白多孔材料不溶于水，孔隙、孔径较大，适合于细胞生长，并能在一段时间内完全生物降解，最终降解产物为无毒性的氨基酸。

2、由于采用仿生法加入盐溶液以及高温多湿环境处理法制备不溶性丝素蛋白多孔三维材料，所以制备过程中不需要添加任何化学交联剂、化学发泡剂或者化学变性剂，添加的少量盐类不会引起丝素蛋白生物相容性的降低。

3、在制备过程中，可以通过调节盐的浓度和恒温恒湿处理的温度、湿度、时间等工艺参数，控制丝素蛋白自组装的过程，从而能较为方便地达到控制丝素蛋白多孔三维材料的结构的目的，以满足各种产品的功能需要。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：

本实施例提供的丝素蛋白多孔三维材料制备步骤如下：

1、将0.5公斤茧壳放入25升质量浓度为0.5％的中性皂溶液中，于温度为98～100℃的条件下处理2小时，使茧壳脱胶，充分洗涤后得到纯丝素(即丝素蛋白)。将晾干后的纯丝素，用2.5升9.2摩尔/升的溴化锂水溶液，在温度为60±2℃的条件下搅拌，溶解成丝素蛋白混合溶液；

2、用纤维素膜为透析材料，将所得的丝素蛋白混合溶液用去离子水透析，去除溴化锂等杂质，得到纯的丝素蛋白溶液；

3、在丝素蛋白溶液中加入盐溶液，调节丝素蛋白溶液中丝素的质量浓度为3％，并使最终的丝素蛋白溶液中的氯化钠浓度达到3克/升，氯化镁浓度达到0.002克/升，硝酸锌浓度达到0.001克/升；

4、将上述溶液注入不锈钢盒中，在温度为-30℃的条件下冷冻5小时，得到丝素溶液冷冻体；

5、将上述冷冻体放入冷冻干燥箱中冷冻干燥36小时，得到丝素蛋白多孔三维材料；

6、将该丝素蛋白多孔三维材料在温度为30℃，湿度为85％的恒温恒湿箱中处理20小时，得到难溶于水的丝素蛋白多孔材料。

将本实施例提供的丝素蛋白多孔材料置于温度为37℃的去离子水中，24小时后测得其溶失率为1.5％，表明该材料难溶于水。

实施例二：

将0.1公斤生丝放入3升质量浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃的条件下处理2小时，使生丝脱胶，充分洗涤后得到纯丝素(即丝素蛋白)。将晾干后的纯丝素，用1升摩尔比为1∶8∶2的氯化钙、水、乙醇溶液，在75±5℃下加热溶解得到丝素蛋白混合溶液。

用纤维素膜为透析材料，将所得的丝素蛋白混合溶液用去离子水透析，去除氯化钙等杂质，得到纯的丝素蛋白溶液。

在丝素蛋白溶液加入盐溶液，调节至最终的丝素蛋白溶液中丝素的质量浓度为2％，氯化钾浓度达到1克/升，氯化锌浓度达到0.001克/升，硝酸钙浓度达到0.002克/升。

将丝素蛋白溶液注入铝盒中，在-60℃冷冻20小时得到丝素溶液冷冻体。

将冷冻体放入冷冻干燥箱中冷冻干燥46小时得到丝素蛋白多孔三维材料。

将丝素蛋白多孔三维材料放入40℃，80％湿度的恒温恒湿箱中处理10小时，得到难溶于水的丝素蛋白三维材料。

该丝素蛋白三维材料在37℃去离子水中的溶失率为1％。

实施例三：

将200克废蚕丝放入8升质量浓度为0.05％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理0.5小时脱胶，重复处理3次，充分洗涤后得到纯丝素(即丝素蛋白)。将晾干后的纯丝素，用500毫升9摩尔/升的溴化锂水溶液，在65±2℃搅拌溶解成丝素蛋白混合溶液。

用纤维素膜为透析材料，将所得的丝素蛋白混合溶液用去离子水透析3天，得到纯的丝素蛋白溶液。

用10％聚乙二醇溶液浓缩得到丝素蛋白溶液，加入盐溶液，调节最终的丝素蛋白溶液中丝素的质量浓度为10％，硫酸钠浓度达到2克/升，硝酸钙浓度达到0.003克/升，氯化锌浓度达到0.002克/升。

将冷冻体放入冷冻干燥箱中冷冻干燥30小时得到丝素蛋白多孔三维材料。

将丝素蛋白多孔三维材料放入25℃，95％湿度的恒温恒湿箱中处理30小时，得到难溶于水的丝素蛋白三维材料。

该丝素蛋白三维材料在37℃去离子水中的溶失率为1.6％。

实施例四：

将200克茧壳放入10升质量浓度为0.3％的碳酸钠溶液中，于98～100℃处理2小时，使茧壳脱胶，充分洗涤后得到纯丝素(即丝素蛋白)。将晾干后的纯丝素，用200毫升9.1摩尔/升的溴化锂水溶液，在65±2℃搅拌溶解成丝素蛋白溶液。

用纤维素膜为透析材料，将所得的丝素蛋白混合溶液用去离子水透析，去除溴化锂等杂质，得到纯的丝素蛋白溶液。

在丝素蛋白溶液加入盐溶液，并调节最终的丝素蛋白溶液中丝素的质量浓度为4％，硫酸钾达到0.1克/升，溴化铁达到0.01克/升，氯化镁达到0.002克/升。

将冷冻体放入冷冻干燥箱中冷冻干燥40小时得到丝素蛋白多孔三维材料。

将丝素蛋白多孔三维材料放入35℃，90％湿度的恒温恒湿箱中处理5小时，得到难溶于水的丝素蛋白三维材料。

该丝素蛋白三维材料在37℃去离子水中的溶失率为1.8％。

实施例五：

将40克生丝放入5升质量浓度为0.2％的碳酸钠水溶液中，于98～100℃处理2小时，使蚕丝脱胶，充分洗涤干燥后得到纯丝素纤维。将纯丝素纤维300毫升9.3摩尔/升的溴化锂水溶液，在65±2℃搅拌溶解成丝素蛋白混合溶液。

将所得的丝素蛋白混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析3天，去除溴化锂等杂质，得到纯的丝素蛋白溶液。

在丝素蛋白溶液加入盐溶液，使最终的丝素蛋白溶液中丝素的质量浓度为5％，硝酸钙达到0.05克/升，硫酸镁达到0.01克/升，氯化达到锌0.002克/升。

将丝素蛋白溶液注入铝盒中，在-16℃冷冻15小时得到丝素溶液冷冻体。

将冷冻体放入冷冻干燥箱中冷冻干燥36小时得到丝素蛋白多孔三维材料。

将丝素蛋白多孔三维材料放入80℃，80％湿度的恒温恒湿箱中处理0.5小时，得到难溶于水的丝素蛋白三维材料。

该丝素蛋白三维材料在37℃去离子水中的溶失率为1.2％，表明该材料难溶于水。

Claims (4)

1.一种难溶于水的丝素蛋白多孔材料，具有孔径为10～500微米的相互贯通的孔隙，其特征在于：它在37℃的水中24小时的溶失率小于2％。

2.一种难溶于水的丝素蛋白多孔材料的制备方法，将家蚕丝经脱胶、溶解、透析和浓缩处理后，得到丝素蛋白溶液，其特征在于再进行如下步骤的处理：

(1)在上述丝素蛋白溶液中加入盐溶液，使最终的丝素蛋白溶液中盐的浓度为0.001～10克/升，丝素的质量浓度为1～30％；将它们混合均匀后注入金属模具中，在-10～-80℃的温度条件下经0.1～24小时的冷冻，得到冷冻体；所述的盐为氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、氯化铁、氯化锌、溴化铁、溴化钠、溴化钾、溴化钙、硫酸铁、硫酸钠、硫酸钾、硫酸钙、硫酸镁、硝酸铁、硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙、硝酸镁和硝酸锌中的一种或其中2～5种的任意组合；

(2)对上述冷冻体进行冷冻干燥处理，得到丝素蛋白多孔材料；

(3)将上述丝素蛋白多孔材料在温度为4～120℃，相对湿度为30～98％的条件下进行处理，得到一种难溶于水的丝素蛋白多孔材料。

3.根据权利要求2所述的一种难溶于水的丝素蛋白多孔材料的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的温度为4～50℃，相对湿度为50～98％时，处理时间为2小时或以上。

4.根据权利要求2所述的一种难溶于水的丝素蛋白多孔材料的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的温度为50～120℃，相对湿度为30～98％时，处理时间为0.1小时或以上。