CN103536963A

CN103536963A - 一种难溶于水的支架型丝素蛋白膜及其制备与应用

Info

Publication number: CN103536963A
Application number: CN201310426437.7A
Authority: CN
Inventors: 陈隆坤; 张志红; 其他发明人请求不公开姓名
Original assignee: ZHEJIANG XINGYUE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: ZHEJIANG XINGYUE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2012-09-17
Filing date: 2013-09-17
Publication date: 2014-01-29
Anticipated expiration: 2033-09-17
Also published as: CN103536963B; CN102847194A

Abstract

本发明公开了一种难溶于水的支架型丝素蛋白膜及其制备与应用，所述制备方法为：将丝素蛋白溶液置于光滑平整且水平的模具内，经湿热交联获得基底膜；再在基底膜表面平铺上述丝素蛋白溶液，经冷冻干燥、湿热交联，形成所述的难溶于水的支架型丝素蛋白膜；本发明以丝素蛋白为原料，生物相容性好；制备工艺无毒环保，易于控制膜的厚度和支架层孔径；所述膜在湿润环境下，质地柔软，基底膜致密，不利于细胞、微生物及生物大分子穿透；支架层多孔海绵状，利于膜的固定、创面止血和诱导组织再生；该膜在防粘连膜和人工膜补片领域，具有广阔的市场。

Description

一种难溶于水的支架型丝素蛋白膜及其制备与应用

（一）技术领域

本发明涉及一种丝素蛋白膜及其制备方法，特别涉及一种难溶于水的支架型丝素蛋白膜及其制备方法与应用。

（二）背景技术

蚕丝是强度最好的天然纤维之一，由70～80%的丝素蛋白和20～30%的丝胶蛋白组成。丝素蛋白的氨基酸序列主要由“甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸--甘氨酸-丝氨酸”(GAGAGS)的重复单元构成，其中甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸占总氨基酸含量的85%以上。该重复序列绝大多数位于丝素蛋白的结晶区，并自组装成反向平行折叠链构象（anti-parallelβ-sheet）结构。这些结构赋予丝素蛋白具有良好力学和缓慢降解速率的特性。

丝胶蛋白在体内会引起炎症反应，在使用前需要进行脱胶处理（degummed）。丝素蛋白由分子量为325KD和25KD两种蛋白组成，其降解产物为氨基酸。大量的研究表明丝素蛋白具有良好的生物相容性，其体内炎症反应（inflammatory responses）要远低于胶原和聚乳酸等常用生物材料。丝素蛋白纤维作为外科缝线已有悠久的历史，经编织后作为人工韧带和组织补片已在研究领域应用。但在目前的生物材料研究领域应用更多的是再生型丝素蛋白。即丝素蛋白经过脱胶、溶解、提纯后，再通过物理、化学的方法，形成海绵状、膜状、凝胶状、微球状等形态。

在丝素蛋白膜制备方面，如中国发明专利“一种可溶—高弹性丝素蛋白膜的制备方法”（CN101234212A）中，将提纯后的丝素蛋白溶液在聚苯乙烯培养皿在恒温恒湿箱内（温度40～70℃，相对湿度60～80%）直接干燥形成厚度为30～50um可溶性膜。中国发明专利“再生丝素蛋白膜及其制备方法”（公开号CN101760027A）中，将提纯后的丝素蛋白溶液在PS皿内直接干燥成膜（未对干燥条件提出要求），再用极性溶剂（C1-C5醇和水混合物、水或水蒸汽）结合力学拉伸，进行溶胀变性处理，以改善丝素蛋白膜的脆性，即增加拉伸伸长率。中国发明专利“一种难溶于水的透明丝素蛋白膜及其制备方法”（CN101967282A）中，在提纯后的丝素蛋白溶液中加入多元醇作为交联剂，将两者混合物在模具中经鼓风干燥成膜，再在相对湿度为30～98%的环境中处理1～48小时（未对处理温度提出要求），获得所需要的膜。中国发明专利“柔韧丝素蛋白膜及其制备方法”（CN1316465）中，通过加入环氧树脂来交联丝素蛋白制备不溶于水的丝素蛋白膜。

在丝素蛋白多孔支架制备方面，中国发明专利“丝素蛋白海绵状三维多孔材料制备方法”（CN1262579C）中，在丝素蛋白溶液中加入醇类有机溶剂作为变性剂，经冷冻和解冻获得乳白色多孔材料，材料经醇类溶液浸洗，再冷冻、干燥获得所需材料。中国发明专利“一种丝素蛋白微孔支架的制备方法”（CN102133432A）中，将丝素蛋白溶液与有机溶剂混合，注入模具内，获得丝素蛋白凝胶，用热水洗去凝胶中的有机溶剂，再冷冻干燥获得所述支架。中国发明专利“一种多孔蚕丝丝素蛋白材料的制备方法”（CN101864177A）中，将丝素蛋白溶液与促凝胶剂（羧酸、聚乙二醇）混合，获得凝胶，在热干燥法获得支架。中国发明专利“一种难溶于水的丝素蛋白多孔材料及其制备方法”（CN101857729A）中，将丝素蛋白溶液与盐溶液混合，经冷冻干燥、湿热蒸汽处理、水洗等步骤获得所需的支架。中国发明专利“一种医用微孔海绵及其制备方法”（CN101967254A）中，将丝素蛋白溶液与PVA溶液混合，在缓慢加热过程中加入甲醛水溶液，固化成型、脱模洗涤、冷冻干燥得所述支架。中国发明专利“一种三维丝素蛋白多孔支架材料的制备方法”（CN101596327A）中，在搅拌状态的丝素蛋白溶液中加入氯化钠颗粒，静置后取沉淀部分，经模具内压缩成型、烘干、浸洗步骤获得所述支架。

现有丝素蛋白膜的制备方法，均是丝素蛋白溶液或其混合物灌注在模具内，通过溶剂挥发干燥，溶质沉积于模具底部，进而形成厚度约10～500μm的可溶或难溶于水的膜。在该步骤的成膜过程中，模具底部上表面的平整性和水平性，模具是否处于振动环境，吹在溶液表面的风速，都将影响膜厚度的均一性和膜表面的微观结构；该步骤成膜过程中，干燥的温湿度条件，也将影响膜的透明性和膜均一性（如温度过高，会在膜内形成微气泡）；该步骤中膜的干燥程度，也影响膜的性能；该步骤膜的干燥时间约几小时到几天，模具所处环境的洁净程度，将影响膜的微生物和内毒素含量；该步骤形成的膜，再通过后续步骤的极性溶液或湿热条件等处理，处理温湿度也会对膜的结晶程度造成影响。

现有丝素蛋白海绵状支架的制备方法，基本使用了变性、促凝、交联剂等，这些添加剂在后续的步骤中洗去，或者成为支架的一部分。以氯化钠颗粒作为变性和成孔方式为例，形成的丝素蛋白凝胶沉积在氯化钠颗粒的间隙，由于间隙的不均一性，导致多孔支架孔壁厚度的不均一性，从几微米到几百微米不等，形成的丝素蛋白支架力学较高，降解速率缓慢，但完全洗去支架中少许被丝素蛋白完全包裹的氯化钠微粒并不容易。那么制备厚度为纳米级孔壁、微米级孔径、分布均匀的丝素蛋白海绵，将有良好的应用前景。

针对上述问题，本发明期望通过最简单和最经济的方法，在基底膜和支架层制备方法上，获得一种难溶于水的支架型丝素蛋白膜，并稳定其制备工艺。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种难溶于水的支架型丝素蛋白膜及其制备方法与应用，制备工艺过程中不接触有毒物质，制备工艺简单，利于大量生产，容易控制膜的厚度和支架层的孔隙率、孔径，进而产生不同的物理和生物学性能，满足不同用途的需要；该膜一面光滑而致密，不利于细胞和生物大分子物质穿透，另一面支架层，为多孔海绵状，贴于创伤处，利于止血和膜在该部位的固定，多孔海绵状支架层还具有为引导组织再生作用。

本发明采用的技术方案是：

一种难溶于水的支架型丝素蛋白膜，所述支架型丝素蛋白膜按如下方法制备：（1）以桑蚕蚕丝为原料，经脱胶、溶解、透析，获得截留液a，将截留液a或截留液a的浓缩液过滤或离心，取滤液或上层离心液得到丝素蛋白溶液；（2）将步骤（1）得到的丝素蛋白溶液的质量浓度用水调整至0.3～30%（优选0.5～20%）（首先取少量步骤（1）得到的丝素蛋白溶液在60℃干燥至恒重，计算出丝素蛋白溶液含水量，进而确定用水调整浓度时水的用量），倒入模具（本发明所述模具优选光滑平整的底部为浮法玻璃制作而成，模具边长20cm的正方形模具）内（模具存放于水平可精细调整的不锈钢平台上调整水平），所述模具内丝素蛋白溶液加入量以丝素蛋白质量计为2～50mg/cm²，将模具在温度10～60℃（优选35～55℃），相对湿度10～70%（优选40%）条件下干燥至无肉眼可见的水分，模具重量增加了所加入丝素蛋白溶质重量的1.2～1.8倍，在模具内形成丝素蛋白膜；然后将模具（连同丝素蛋白膜一起）于温度50～100℃（优选65～70℃），相对湿度70～100%（优选88～92%）条件下放置20～200min（优选120min）进行湿热交联，在模具内加入去离子水（覆盖模具内膜的表面即可），冷却至室温，倾去去离子水，在模具内形成难溶于水的丝素蛋白膜，即厚度为20～500μm的基底膜；（3）在步骤（2）所述的基底膜表面加入步骤（1）获得的质量浓度0.3～30%（优选0.5～20%）丝素蛋白溶液，所述丝素蛋白溶液体积加入量为100～10000ml/m²模具，将模具在水平状态下于-10～-80℃冷冻2～30h（优选-40℃下冷冻8～20h），再在-40～-110℃条件下真空冷冻干燥（优选-80℃下真空干燥16～48h），在模具内形成双层膜（即在基底膜表面形成一层支架膜，所述基底膜为光滑膜，支架膜为海绵状膜），去除模具，将双层膜在温度50～100℃（优选65～70℃），相对湿度70～100%（优选88～92%）条件下放置20～200min（优选100～120min），然后再置于体积浓度50～90%（优选75%）的乙醇水溶液中浸泡10～60min（优选20～30min），再用去离子水充分浸洗，获得难溶于水的支架型丝素蛋白膜。

进一步，步骤（2）所述丝素蛋白溶液加入量以丝素蛋白质量计优选为3～20mg/cm²模具，使基底膜厚度为20～500μm。

进一步，步骤（3）所述丝素蛋白溶液的体积用量优选200～4000ml/m²模具，使支架层的厚度为100～10000μm。

进一步，步骤（3）所述模具在-20～-80℃下冷冻5～30h，再在-60～-110℃条件下真空冷冻干燥，形成丝素蛋白膜支架层。

进一步，步骤（1）所述截留液a的浓缩液制备方法为：将透析后的透析袋放入质量浓度20～60%的聚乙二醇水溶液中，静置1～10h进行浓缩，取截留液b即为截留液a的浓缩液；所述聚乙二醇平均分子量1000～10000。

进一步，步骤（1）所述截留液a或截留液a的浓缩液过滤或离心方法为下列之一：a）将截留液a或截留液a的浓缩液于4℃、3000～6000g条件下离心5～20min，弃去沉淀，取上层溶液即为所述的丝素蛋白溶液；b）将截留液a或截留液a的浓缩液用孔径为2～20μm的滤器过滤，去除不溶性颗粒，滤液即为所述的丝素蛋白溶液。

进一步，步骤（1）所述脱胶、溶解、透析方法为：a）脱胶：将100g桑蚕蚕丝放入4～8L的2M碳酸钠水溶液中，90～100℃水浴20～60min，去离子水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白，将丝素蛋白在20～60℃烘干，获得干燥后的丝素蛋白；b）溶解：将上述干燥后的丝素蛋白溶于9～11M的溴化锂水溶液中，55～65℃水浴30～300min至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白的混合液；所述干燥后的丝素蛋白的质量用量以溴化锂水溶液的体积计为0.1～0.2g/ml；c）透析：将含丝素蛋白的混合液用截留分子量1000～20000道尔顿的透析袋进行透析，用10倍混合液体积的无菌去离子水作为透析液在3天透析10～12次，去除溶液中的溴化锂成分，获得截留液a。

本发明还提供所述的难溶于水的丝素蛋白膜在制备防粘连膜、护创膜或人工膜中的应用。

进一步，所述的人工膜为牙周膜、引导骨再生膜、胸膜、硬脑膜或硬脊膜。

本发明所模具可以使各种材质制作的平皿或盒体，由于底部要求极其平整，优选浮法玻璃作为模具的底面。

本发明所述支架型丝素蛋白膜为双层膜，膜的光滑面为基底层，其制备过程中，在固定面积模具内加入丝素蛋白溶液中丝素蛋白的质量，决定了最终丝素蛋白膜的厚度，即所述厚度与模具的面积和丝素蛋白溶液质量浓度及加入量相关，当模具面积一定时，调整丝素蛋白溶液质量浓度或加入体积来获得不同厚度的难溶于水的丝素蛋白基底膜。然后在基底膜的表面再加入丝素蛋白溶液，经冷冻干燥处理形成多孔支架层。多孔支架层的孔径和孔隙率等参数和所用丝素蛋白溶液的浓度及其冷冻的温度有关，一般是浓度越大，冷冻温度越低，孔径越小。支架层的厚度与加入丝素蛋白溶液的体积和浓度有关，一般是基底膜上面的溶液厚度与支架层厚度相近。基底膜与支架层的具体厚度，是根据实际需要调整的，比较通用的厚度会是基底膜30～200μm，支架层的厚度为200～4000μm。光滑层为致密膜，能阻止细胞、微生物及生物大分子通过，支架层孔径分布为20-500μm，利于细胞和血管的长入。

本发明所述截留液a和截留液a的浓缩液均为不同浓度的丝素蛋白同溶液，为便于表述而命名，字母本身没有含义。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：（1）本发明目的是提供一种难溶于水的支架型丝素蛋白膜的制备方法，制备工艺中不接触有毒物质，未使用变性、促凝和交联等添加剂，制备工艺简单，利于大量生产；（2）模具底面采用表面极其平整的浮法玻璃，并将模具存放于水平可精细调整的不锈钢平台；（3）该膜以丝素蛋白为原料，现有的研究表明丝素蛋白及其降解产物（氨基酸）拥有良好的生物相容性；（4）该膜在湿润环境下，质地柔软，能顺从体表及其体内的曲度，有效减少体内的异物感；（5）该膜容易控制基底膜和支架层的厚度，进而产生不同的物理和生物学性能，满足不同用途的需要；（6）基底膜面光滑致密，能阻止细胞、微生物和生物大分子穿过，具有隔菌和防粘连作用；支架层，为多孔海绵状，贴于创伤处利于止血、膜的固定，也有利于细胞血管长入，引导组织在支架层生长；（7）该膜在制备防粘连膜、护创膜或人工膜领域具有广阔的市场。

（四）附图说明

图1实施例3制备的难溶于水的支架型丝素蛋白膜基底膜面的电镜扫描图；

图2实施例3制备的难溶于水的支架型丝素蛋白膜支架层面的电镜扫描图。

图3为实施例5丝素蛋白膜促进牙周组织再生修复的动物试验照片，a为术中缺损区图片，b为术后缺损区图片，c为术后8周缺损修复图片，d为术后8周缺损修复的X射线影像图片。

图4为实施例5丝素蛋白膜促进牙周组织再生修复的术后8周的组织学masson染色图片。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1（基底膜300μm，支架层4000μm）

（1）丝素蛋白溶液的制备：a）脱胶：将100g桑蚕蚕丝（浙江华芝丝绸有限责任公司，5A级）放入5L的2M碳酸钠水溶液中，98℃水浴30min，去离子水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白，将丝素蛋白在50℃烘干，获得70g干燥后的丝素蛋白，备用；b）溶解：将上述干燥后的丝素蛋白以质量体积比0.2：1（即每ml溴化锂水溶液中加入0.2g干燥后的丝素蛋白）溶于9.3M的溴化锂（LiBr）水溶液中，60℃水浴90min至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白和少量不溶性颗粒组成的混合液；c）透析：将混合液用再生纤维素透析袋（截留分子量4000道尔顿）透析，用10倍混合液体积的无菌去离子水在3d透析12次，去除溶液中的LiBr离子，获得截留液a；d）浓缩：将透析后的透析袋放入4倍体积的质量浓度50%聚乙二醇（PEG，分子量7000）水溶液，室温静置浓缩5h，取截留液b，即获得截留液a的浓缩液；e）将截留液b在水平转子5000g，4℃，离心10min，除去底部的未溶解丝素蛋白和溴化锂中可能存在不溶性颗粒，取上清液，即获得提纯后的丝素蛋白溶液300ml；f）浓度测定：取提纯后的丝素蛋白溶液10ml，在平皿内烘干，质量差法测得丝素蛋白溶液质量浓度为20%。丝素蛋白溶液4℃保存备用。

（2）将模具（底部为浮法玻璃，边长20cm的正方形皿，其它实施例模具材质相同）存放于水平可精细调整的不锈钢平台上精密调整水平，加入质量浓度20%的丝素蛋白溶液60ml（30mg/cm²），在温度35℃，相对湿度50%环境静置晾干至肉眼无可见液体，比空模具重量增加18g，在模具底部形成丝素蛋白膜；

（3）将模具置于温度70℃，相对湿度92%的湿热交联箱内放置120min，将模具置于室温（25℃），在膜表面覆盖一层去离子水的情况下，冷却至室温，倾去去离子水，在模具内形成难溶于水的丝素蛋白膜，即获得基底膜；

（4）将上述模具调整为水平，将步骤（1）获得的质量浓度20%丝素蛋白溶液用去离子水调整质量浓度为15%，取160ml加入步骤（3）模具内，将模具水平置于-80℃冷冻30h，在-80℃冷阱的条件下真空冷冻干燥48h，在模具内形成双层膜，即在基底膜的表面形成支架层。

（5）去除模具，将双层膜在温度70℃，相对湿度92%条件下放置120min，然后再置于体积浓度75%的乙醇水溶液中浸泡20min，再用去离子水充分浸洗，获得难溶于水的支架型丝素蛋白膜，基底膜厚约300μm，支架层厚约4000μm。

实施例2（基底膜200μm，支架层1000μm）

（1）丝素蛋白溶液的制备：a）脱胶：将100g桑蚕蚕丝（浙江华芝丝绸有限责任公司，5A级）放入5L的2M碳酸钠水溶液中，98℃水浴30min，去离子水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白，将丝素蛋白在50℃烘干，获得70g干燥后的丝素蛋白，备用；b）溶解：将上述干燥后的丝素蛋白以质量体积比0.2：1溶于9.3M的溴化锂（LiBr）水溶液中，60℃水浴90min至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白和少量不溶性颗粒组成的混合液；c）透析：将上述混合液用再生纤维素透析袋（截留分子量8000道尔顿）透析，用10倍混合液体积的无菌去离子水在3d透析12次，去除溶液中的LiBr离子，获得截留液a；d）将截留液a在水平转子5100g，4℃，离心10min，除去底部的未溶解丝素蛋白和溴化锂中可能存在不溶性颗粒，取上清液即获得提纯后的丝素蛋白溶液1000ml；e）浓度测定：取提纯后的丝素蛋白溶液10ml，在平皿内烘干，质量差法测得丝素蛋白溶液的质量浓度为5%。丝素蛋白液4℃保存备用。

（2）将模具（同实施例1）调整水平，加入上述制备的质量浓度5%丝素蛋白液140ml，去除内部产生的气泡。在温度10℃，相对湿度40%环境静置晾干至肉眼无可见液体，比空模具重量增加10.7g，在模具底部形成丝素蛋白膜。

（3）将模具置于温度70℃，相对湿度90%的湿热交联箱内放置100min，再将模具置于室温，在膜表面覆盖一层去离子水的情况下，冷却至室温，倾去去离子水，在模具内形成难溶于水的丝素蛋白膜，即获得基底膜；

（4）在模具内加入步骤（1）获得的质量浓度5%丝素蛋白溶液40ml，水平放置模具，将模具水平置于-40℃冷冻10h，在-80℃冷阱的条件下真空冷冻干燥20h，在模具内形成双层膜，去除模具，获得双层膜，即在基底膜表面形成支架层。

（5）将双层膜在温度65℃，相对湿度90%条件下放置100min，然后再置于体积浓度75%的乙醇水溶液中浸泡20min，再用去离子水充分浸洗，获得难溶于水的支架型丝素蛋白膜，基底膜厚约200μm，支架层厚约1000μm。

实施例3（基底膜100μm，支架层2000μm）

（1）丝素蛋白溶液的制备：a）脱胶：将100g桑蚕蚕丝（浙江华芝丝绸有限责任公司，5A级）放入5L的2M碳酸钠水溶液中，98℃水浴30min，去离子水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白，将丝素蛋白在50℃烘干，获得70g干燥后的丝素蛋白，备用；b）溶解：将丝素蛋白以质量体积比0.20：1溶于9.3M的溴化锂（LiBr）水溶液中，60℃水浴90min至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白和少量不溶性颗粒组成的混合液；c）透析：将混合液用再生纤维素透析袋（截留分子量2000道尔顿）透析，用10倍混合液体积的无菌去离子水在3d透析12次，去除溶液中的LiBr离子，获得截留液a；d）将截留液a用孔径10μm的滤器，除去底部的不溶性颗粒，取滤液即获得提纯后的丝素蛋白溶液1200ml；e）浓度测定：取提纯后的丝素蛋白溶液10ml，在平皿内烘干，质量差法测得丝素蛋白溶液的质量浓度为4%。丝素蛋白液4℃保存备用。

（2）将模具（同实施例1）调整水平，将步骤（1）获得的质量浓度为4%丝素蛋白溶液88ml加入模具内，去除内部产生的气泡。在温度45℃，相对湿度50%环境静置晾干至肉眼无可见液体，比空模具重量增加5.4g，在模具底部形成丝素蛋白膜。

（3）将模具置于温度65℃，相对湿度90%的湿热交联箱内放置100min，将模具置于室温，在膜表面覆盖一层去离子水的情况下，冷却至室温，倾去去离子水，在模具内形成难溶于水的丝素蛋白膜，即获得基底膜；

（4）在模具内加入步骤（1）获得的质量浓度4%丝素蛋白溶液80ml，水平放置模具，将模具水平置于-40℃冷冻10h，在-80℃冷阱的条件下真空冷冻干燥20h，在模具内形成双层膜，去除模具，获得双层膜，即在基底膜表面形成支架层。

（5）将步骤（4）的双层膜在温度65℃，相对湿度88%条件下放置120min，然后再置于体积浓度75%的乙醇水溶液中浸泡30min，再用去离子水充分浸洗，获得难溶于水的支架型丝素蛋白膜，基底膜厚约100μm，支架层厚约2000μm。扫描电镜型号为Hitachi S-3000N，结果见图1、2所示，表明支架型丝素蛋白膜的基底层为致密光滑的膜结构，支架层为多孔海绵状结构。

实施例4（基底层30μm，支架层100μm）

（1）丝素蛋白溶液的制备：a）脱胶：将100g桑蚕蚕丝（浙江华芝丝绸有限责任公司，5A级）放入5L的2M碳酸钠水溶液中，98℃水浴30min，去离子水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白，丝素蛋白50℃烘干，获得70g丝素蛋白，备用；b）溶解：将丝素蛋白以质量体积比0.2：1溶于9.3M的溴化锂（LiBr）水溶液中，60℃水浴90min至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白和少量不溶性颗粒组成的混合液；c）透析：将混合液用再生纤维素透析袋（截留分子量8000道尔顿）透析，用10倍混合液体积的无菌去离子水在3d透析12次，去除溶液中的LiBr离子，获得截留液a；d）将截留液a用孔径10μm的滤器，除去底部的不溶性颗粒，获得提纯后的丝素蛋白溶液1200ml；e）浓度测定：取提纯后的丝素蛋白溶液10ml，在平皿内烘干，质量差法测得丝素蛋白溶液浓度的质量浓度为4%。丝素蛋白液4℃保存备用。

（2）将丝素蛋白溶液用去离子水稀释成质量浓度0.5%，将模具（同实施例1）调整水平，将质量浓度为0.5%丝素蛋白溶液210ml加入模具内，去除内部产生的气泡。在温度25℃，相对湿度50%环境静置晾干至肉眼无可见液体，比空模具重量增加1.6g，在模具底部形成丝素蛋白膜。

（3）将模具置于温度63℃，相对湿度90%的湿热交联箱内放置100min，将模具置于室温，在膜表面覆盖一层去离子水的情况下，冷却至室温，倾去去离子水，在模具内形成难溶于水的丝素蛋白膜，即获得基底膜；

（4）在步骤（3）模具内加入步骤（1）获得的质量浓度4%丝素蛋白溶液30ml，平铺模具表面后再将模具内的丝素蛋白溶液倒掉，在基底膜表面粘附一薄层丝素蛋白溶液，将模具水平置于-40℃冷冻8h，在-80℃冷阱的条件下真空冷冻干燥16h，在模具内形成双层膜，去除模具，获得双层膜，即在基底膜表面形成支架层。

（5）将步骤（4）的双层膜在温度65℃，相对湿度88%条件下放置100min，然后再置于体积浓度75%的乙醇水溶液中浸泡20min，再用去离子水充分浸洗，获得难溶于水的支架型丝素蛋白膜，基底膜厚约30μm，支架层厚约100μm。

实施例5（支架型丝素蛋白膜引导牙周组织再生修复）

（4）在步骤（3）的模具内加入步骤（1）获得的质量浓度4%丝素蛋白溶液42ml，水平放置模具，将模具水平置于-40℃冷冻10h，在-80℃冷阱的条件下真空冷冻干燥20h，在模具内形成双层膜，去除模具，获得双层膜，即在基底膜表面形成支架层。

（5）将双层膜在温度65℃，相对湿度88%条件下放置100min，然后再置于体积浓度75%的乙醇水溶液中浸泡20min，再用去离子水充分浸洗，获得难溶于水的支架型丝素蛋白膜，基底膜厚约100μm，支架层厚约1000μm。

（6）制备的支架型丝素蛋白膜，切割成8mm×10mm的方形，用铝箔袋包装，钴60辐照灭菌。用于引导牙周组织再生的动物试验评估。

（7）引导牙周组织再生的动物试验：牙周病等病因引起的牙槽骨吸收和牙周膜萎缩等，均会导致牙齿松动甚至脱落。牙周膜和牙槽骨的再生修复，常因为牙龈组织的瘢痕占位和口腔微生物的入侵，失去了局部的适宜环境，导致修复效果差。改善牙周组织再生的局部微环境，是促进牙周的再生的有效方法。故在本试验中采用支架型丝素蛋白膜作为牙周组织再生的引导膜，在犬第2-4三颗前磨牙的颊侧牙槽骨和牙周膜磨损后，牙周组织的再生修复能力。本试验采用雄性Beagle狗，牙体、牙列完整，无龋坏，无明显磨耗，牙周情况良好，年龄为15个月左右，体重为10～12kg。毕格犬用肌肉注射戊巴比妥麻药，全麻后，医用碘伏消毒手术区域，在相对无菌的操作先，沿下颌龈沟切开并翻起前磨牙P2～P4区颊侧面粘骨膜瓣，去除该区部分颊侧牙槽骨，至釉牙骨质界下3～4mm，刮净缺损区根面牙周韧带和牙槽骨，生理盐水冲洗。将支架型丝素蛋白膜覆盖于缺损区域，支架层朝向牙槽骨或者牙体侧，基底层朝向牙龈组织侧，膜的上端略低于龈缘，下端覆盖牙槽骨1～2mm，复位和间断缝合龈粘骨膜瓣。在术后8W大体拍照下颌骨颊侧面的牙周组织修复情况，过量麻药安乐处死犬后，分别取下两侧下颌骨，保留颊侧面牙周组织，行X射线影像学评估。并将样品进行组织固定、脱钙、石蜡包埋和组织学masson染色，评估牙周膜和牙槽骨的再生修复效果。结果如图3、图4所示。结果，术后8周，大体照片显示牙周组织修复与正常组织无差异。X射线图片表现为，牙槽骨的缺损区域边界已经模糊，难以辨认缺损区，说明牙槽骨已经大部分再生。组织学显示在牙根和牙槽骨之间的牙周膜，已经向上爬行再生，与之伴随着牙槽骨的再生修复。

Claims

1.一种难溶于水的支架型丝素蛋白膜，其特征在于所述支架型丝素蛋白膜按如下方法制备：（1）以桑蚕蚕丝为原料，经脱胶、溶解、透析，获得截留液a，将截留液a或截留液a的浓缩液过滤或离心，取滤液或上层离心液得到丝素蛋白溶液；（2）将步骤（1）得到的丝素蛋白溶液的质量浓度用水调整至0.3～30%，倒入模具内，所述模具内丝素蛋白溶液加入量以丝素蛋白质量计为2～50mg/cm²模具，将模具在温度10～60℃，相对湿度10～70%条件下干燥至无肉眼可见的水分，在模具内形成丝素蛋白膜；然后将模具于温度50～100℃，相对湿度70～100%条件下放置20～200min，在模具内加入去离子水，冷却至室温，倾去去离子水，在模具内形成难溶于水的丝素蛋白膜，即基底膜；（3）在步骤（2）所述的基底膜表面加入步骤（1）获得的质量浓度0.3～30%丝素蛋白溶液，所述丝素蛋白溶液体积加入量为100～10000ml/m²模具，将模具在水平状态下于-10～-80℃冷冻2～30h，再在-40～-110℃条件下真空冷冻干燥，在模具内形成双层膜，去除模具，将双层膜在温度50～100℃，相对湿度70～100%条件下放置20～200min，然后再置于体积浓度50～90%的乙醇水溶液中浸泡10～60min，再用去离子水充分浸洗，获得难溶于水的支架型丝素蛋白膜。

2.如权利要求1所述的难溶于水的支架型丝素蛋白膜，其特征在于步骤（2）所述丝素蛋白溶液加入量以丝素蛋白质量计为3～20mg/cm²模具。

3.如权利要求1所述的难溶于水的支架型丝素蛋白膜，其特征在于步骤（3）所述丝素蛋白溶液的体积用量为200～4000ml/m²模具。

4.如权利要求1所述的难溶于水的支架型丝素蛋白膜，其特征在于步骤（3）所述模具在-20～-80℃下冷冻5～30h，再在-60～-110℃条件下真空冷冻干燥，形成丝素蛋白膜支架层。

5.如权利要求1所述的难溶于水的支架型丝素蛋白膜，其特征在于步骤（1）所述截留液a的浓缩液制备方法为：将透析后的透析袋放入质量浓度20～60%的聚乙二醇水溶液中，静置1～10h，取截留液b即为截留液a的浓缩液；所述聚乙二醇平均分子量1000～10000。

6.如权利要求1所述的难溶于水的支架型丝素蛋白膜，其特征在于步骤（1）所述截留液a或截留液a的浓缩液过滤或离心方法为下列之一：a）将截留液a或截留液a的浓缩液于4℃、3000～6000g条件下离心5～20min，弃去沉淀，取上层溶液即为所述的丝素蛋白溶液；b）将截留液a或截留液a的浓缩液用孔径为2～20μm的滤器过滤，去除不溶性颗粒，滤液即为所述的丝素蛋白溶液。

7.如权利要求1所述的难溶于水的支架型丝素蛋白膜，其特征在于步骤（1）所述脱胶、溶解、透析方法为：a）脱胶：将100g桑蚕蚕丝放入4～8L的2M碳酸钠水溶液中，90～100℃水浴20～60min，去离子水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白，将丝素蛋白在20～60℃烘干，获得干燥后的丝素蛋白；b）溶解：将上述干燥后的丝素蛋白溶于9～11M的溴化锂水溶液中，55～65℃水浴30～300min至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白的混合液；所述干燥后的丝素蛋白质量用量以溴化锂水溶液的体积计为0.1～0.2g/ml；c）透析：将含丝素蛋白的混合液用截留分子量1000～20000道尔顿的透析袋进行透析，用10倍混合液体积的无菌去离子水作为透析液在3天透析10～12次，去除溶液中的溴化锂成分，获得截留液a。

8.如权利要求1～7之一所述的难溶于水的支架型丝素蛋白膜在制备防粘连膜、护创膜或人工膜中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的人工膜为牙周膜、引导骨再生膜、胸膜、硬脑膜或硬脊膜。