CN115814170B - 一种引导牙周组织再生的跨尺度仿生复合修复体的制备方法及其应用 - Google Patents
一种引导牙周组织再生的跨尺度仿生复合修复体的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种引导牙周组织再生的跨尺度仿生复合修复体的制备方法及其应用，首先将聚合物溶液和纳米增强体溶液共混制备共混溶胶，通过组装构筑具有仿生结构的复合薄膜；然后在薄膜一侧沉积聚乙二醇/聚合物混合层，干燥后进行充分的化学修饰；用热水除去聚乙二醇以获得粗糙表面，在此粗糙表面上喷涂惰性聚合物溶液，经过矿化处理后得到异质仿生结构材料。该材料一侧为矿物作为支架结构，有利于诱导成骨，另一层为聚乳酸作为隔膜结构，能够防止牙龈上皮细胞和牙龈结缔组织细胞的根方迁移，有选择性的使一些细胞群体进入伤口空间并在牙根表面重建牙周附着，是引导牙周组织再生的理想材料。
Description
技术领域
本发明属于诱导牙周组织再生材料领域，具体涉及一种引导牙周组织再生的跨尺度仿生复合修复体的制备方法及其应用。本发明构筑具有异质结构的薄膜，其中一侧发挥隔膜材料作用，另一侧发挥支架材料作用；调控矿物在支架层(即可诱导矿化的聚合物一侧)上沉积生长，通过聚电解质等控制陶瓷基元的成核生长，控制材料的纳米尺度结构，从而实现跨尺度仿生复合修复体的制备并实现其力学与生物学功能。
背景技术
牙周炎是最常见的一种牙周疾病，它会造成牙龈软组织的炎症，牙槽骨的破坏和吸收，最终导致牙齿的松动、脱落。常规牙周治疗可以延缓或终止病程，但无法恢复牙周组织原有的结构和功能(参考《中国实用口腔科杂志》期刊2008年第一卷第399页文章)。牙周治疗的最终目的是使丧失的牙周组织再生，让牙周膜功能性地重新附着到新形成的牙骨质和牙槽骨上(参考《先进医疗材料》期刊2018年第七卷1800457号文章)。为使牙周组织再生，形成新的牙周附着，需进行牙周组织再生术。按临床治疗方案区分，目前已发展了多种牙周组织再生方法(参考《聚合物》期刊2016年第八卷第115页文章、《口腔疾病》期刊2018年第二十四卷第696页文章、《骨研究》期刊2016年第四卷第16036文章)；而从材料学角度区分，牙周组织再生涉及的材料可分为三大类，即隔膜材料(如胶原蛋白膜、聚四氟乙烯膜等)，支架材料(如骨替代材料、骨粉、水凝胶等)，及种子细胞与生长因子。
形成牙周新附着是牙周再生成功与否的标志之一。牙周手术后，细胞在暴露的牙根表面的增殖情况决定了修复后牙根与牙根外组织之间的附着情况。在常规治疗后，由于牙龈上皮细胞迁移到牙根面的速度要高于间充质细胞，牙根表面常与不具有附着力的牙龈上皮细胞接触，造成结合上皮难以形成，从而阻止牙根表面形成新的牙周附着。此外，牙龈结缔组织细胞也可以填充与裸露牙根表面相邻的空间，形成结缔组织附着，这可能导致牙根吸收(参考《北美牙科临床》期刊2010年第五十四卷第73页文章)。因此在牙周组织再生中，需要防止牙龈上皮细胞和牙龈结缔组织细胞的根方迁移，有选择性的使一些细胞群体进入伤口空间并在牙根表面重建牙周附着。隔膜材料正是一种能够实现此功能的生物活性膜材料。作为根面重建空间物理屏障，理想的隔膜材料需要满足一些基本要求，即良好的生物相容性、无免疫原性、适宜的强度、良好的稳定性、适宜的降解能力。隔膜材料分为不可降解和可生物降解两种。因其力学支撑性能不足且通常不具有骨诱导能力，隔膜材料通常不单独作为牙周组织再生材料，而是与支架材料配合使用，并在临床上取得了较好疗效(参考《临床牙周病学杂志》期刊2010年第三十七卷第200页和第534文章)。理想的支架材料需要有适宜的孔隙结构和连通性、一定的机械性能、亲水性和表面粗糙度、良好的生物安全、生物相容性和可吸收降解性、可控的担载活性分子和载药能力(参考《应用科学》期刊2019年第九卷第1046页文章)。支架材料按其类型可分为有机支架、无机支架和复合支架。
目前牙周组织再生术从简单材料修复向复杂组织工程修复发展的趋势已越来越明显，牙周组织工程的优势也越来越显著，但这也对牙周组织再生材料提出了新的要求，即需要全面考虑组织工程各要素的作用，使修复材料满足易获得、生物相容性高、抗菌、可控降解、药物及生长因子可控释放、病人痛苦少等多重优点。可以预见，用于隔膜和支架的新化合物、新种子细胞、新生长因子的出现速度不会太快，而且即使出现，也难以单独发挥理想的修复作用。因此如何通过改变材料的组合方式以及材料自纳米到宏观尺度的多级结构，将是实现理想的牙周组织再生效果的关键步骤。实际上牙周本身就为材料的组合方式及多级结构构建方式提供了最好的模型。
综上，通过对牙周组织结构的模拟，基于仿生矿化技术的最新发展，利用无机矿物、天然高分子等原料构建具有仿生跨尺度微纳结构的材料，在材料中负载自体牙槽骨细胞和自体生长因子，形成具有完整组织工程功能的复合修复体，使牙周治疗不仅能够减缓和终止牙周组织的继续破坏，更能重建新的牙周组织，解决天然牙因牙周破坏而丧失的难题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种引导牙周组织再生的跨尺度仿生复合修复体的制备方法及其应用，即通过组装双层异质薄膜控制微观结构再通过矿化生长调控纳米尺度结构，这种跨尺度仿生复合修复体具有优异的力学性能同时具有良好的生物相容性，能够诱导牙周组织的再生。本方法操作简便。
本发明引导牙周组织再生的跨尺度仿生复合修复体的制备方法，首先将聚合物溶液和纳米增强体溶液共混制备共混溶胶，通过自蒸发等组装方法构筑具有仿生结构的复合薄膜；然后在薄膜一侧沉积聚乙二醇/惰性聚合物混合层，干燥后进行充分的化学修饰；用热水除去聚乙二醇以获得粗糙表面，在此粗糙表面上喷涂聚乳酸溶液，经过矿化等步骤后得到异质仿生结构材料。具体包括如下步骤：
步骤1：配制可诱导矿化的聚合物溶液和纳米增强体溶液，按照一定比例共混制备共混溶胶，共混溶胶中纳米增强体的质量浓度为10-50wt％(比如10wt％、20wt％、30wt％、40wt％、50wt％)，共混溶胶中聚合物的浓度为2-40wt％(比如2wt％、4wt％、6wt％、8wt％、10wt％、20wt％、30wt％、40wt％)，超声、抽真空数次以除去气泡；
步骤2：将步骤1获得的共混溶胶通过特定的组装方法构筑具有仿生结构的复合薄膜，并进行初步的化学修饰；
步骤3：在适当条件下通过特定组装方法在步骤2获得的复合薄膜的一侧沉积聚乙二醇/聚合物混合层，干燥后进行充分的化学修饰，然后用热水去除聚乙二醇，使得沉积聚乙二醇/聚合物混合层的一侧粗糙化，随后在该粗糙表面喷涂惰性聚合物溶液；粗糙表面的控制是为了整体不会脱层。
步骤4：将步骤3获得的薄膜置于矿化前驱体溶液中矿化，最终得到跨尺度仿生复合修复体。在步骤4中，惰性聚合物一侧薄膜无法生长矿物，只有可诱导矿化的聚合物一侧生长了矿物。
步骤1中，所述可诱导矿化的聚合物选自蚕丝蛋白、海藻酸钠、壳聚糖、明胶或聚苯乙烯磺酸钠。所述聚合物溶液的浓度为0.5-4w/v％。
步骤1中，所述纳米增强体选自一维纳米纤维(包括几丁质纳米纤维、几丁质纳米晶、碳纳米管、碳酸钙纳米线等)、二维纳米片(蒙脱土纳米片、氧化石墨烯片、纳米粘土片、纳米云母片等)中的一种或多种。
步骤2中，所述特定的组装方法包括自蒸发、旋涂或抽滤等方法；所述仿生结构包括但不限于仿珍珠母(仿贝壳)结构、布利冈螺旋结构等。
步骤3中，通过特定组装方法在步骤2获得的复合薄膜的一侧沉积聚乙二醇/聚合物混合层，是指通过旋涂法(旋涂转速为500-5000rpm/min)或喷涂法(速率为1-100mL/min)在步骤2获得的复合薄膜的一侧旋涂或喷涂聚乙二醇/聚合物溶液。所述聚合物溶液为蚕丝蛋白溶液、海藻酸钠溶液、壳聚糖溶液、明胶溶液或聚苯乙烯磺酸钠溶液；所述聚合物溶液的浓度为0.5-4w/v％；所述聚乙二醇/聚合物溶液中聚乙二醇的浓度为10-50wt％(优选2-20wt％)。
步骤2和步骤3中的化学修饰包括乙酰化(其中甲醇与乙酸酐的比例为9-10：1，反应温度45℃，反应时间1-4h)或磷酸化(焦磷酸占甲醇的比例10-40wt/v％，反应温度60℃，反应时间1-4h)等。步骤2中初步的化学修饰是指乙酰化或磷酸化时间短，约1-2h左右，化学修饰程度较低；步骤3中充分的化学修饰是指乙酰化或磷酸化时间较初步修饰时间长，约4h左右，修饰程度高。
步骤3中，所述惰性聚合物包括聚乳酸、聚醚醚酮等生物相容性较好的高分子，但无法生长矿物。所述惰性聚合物使用氯仿和N,N-二甲基甲酰胺共同溶解(体积比4:1)。在该共同溶解的混合体系中，惰性聚合浓度范围1-30wt％。
步骤4中，所述矿化前驱体溶液包括各类生物矿物陶瓷，如碳酸钙陶瓷前驱体、羟基磷灰石前驱体(即模拟体液)、非晶磷酸钙、β-TCP前驱体、二氧化硅前驱体等，矿化前驱体溶液中生物矿物陶瓷的浓度为10-100mM。同时在矿化前驱体溶液中加入适量的聚电解质以调控其成核生长路径，聚电解质包括阴离子聚合物如聚丙烯酸PAA、聚天冬氨酸PASP等，或者阳离子聚合物如聚丙烯胺盐酸盐PAH等，浓度为6-50mM。
本发明中，各类生物矿物陶瓷可以自制获得，也可以市购获得。
其中：
(1)碳酸钙陶瓷前驱体：过量碳酸钙粉末加入到1L超纯水中，于25℃恒温水槽中搅拌1小时，期间并持续通入二氧化碳；反应结束后将溶液过滤，除去悬浮的碳酸钙，留取上清液，最终钙离子浓度10mM。取400mL上述上清液，向其中加入2mM六水和氯化镁4.8mL、0.2mM分子量为1800的聚丙烯酸1.2mL。
(2)羟基磷灰石前驱体：按照5倍SBF方案配置，量取450mL去离子水置于1L塑料容器中，将氯化钠、碳酸氢钠、十二水和磷酸氢二钠、六水和氯化镁依次加入溶解，再加入聚丙烯胺盐酸盐PAH(最终为20mM)，加入1M盐酸10mL，搅拌均匀后，滴加1M氯化钙溶液6.25mL，再用pH为9.0的tris缓冲液将pH调节至6.2，最终将溶液定容至500mL，使得最终的钠离子浓度为733mM，镁离子浓度为30mM，钙离子浓度为12.5mM，氯离子浓度为720mM，磷酸氢根离子浓度为5.0mM，碳酸氢根离子浓度为21mM。
(3)非晶磷酸钙：按照5倍SBF方案配制，量取450mL去离子水置于1L塑料容器中，将氯化钠、碳酸氢钠、十二水和磷酸氢二钠、六水和氯化镁依次加入溶解，再加入聚丙烯胺盐酸盐PASP(最终为100mM)，加入1M盐酸10mL，搅拌均匀后，滴加1M氯化钙溶液6.25mL，再用pH为9.0的tris缓冲液将pH调节至6.2，最终将溶液定容至500mL，使得最终的钠离子浓度为733mM，镁离子浓度为80mM，钙离子浓度为12.5mM，氯离子浓度为720mM，磷酸氢根离子浓度为5.0mM，碳酸氢根离子浓度为21mM。
(4)β-TCP前驱体：过量碳酸钙粉末加入到1L超纯水中，于25℃恒温水槽中搅拌1小时，期间并持续通入二氧化碳；反应结束后将溶液过滤，除去悬浮的碳酸钙，留取上清液，最终钙离子浓度10mM。随后在该溶液中溶解10mM磷酸氢钙，加入PAA(6mM)。
(5)二氧化硅前驱体：量取100mL硅酸四乙酯前驱体溶液，用1M氢氧化钠溶液将pH调制8.5；或者用1M盐酸将pH调节至5.5。
本发明制备的跨尺度仿生复合修复体能够有效的诱导牙周组织再生。
本发明的有益效果体现在：
1、本发明通过多种组装方式的结合调控了材料微米尺度结构，同时利用矿化生长的方法调控了材料纳米尺度结构，即最终实现了材料跨尺度结构的调控，从而优化了材料的力学性能，使之在手术中更具操作性；
2、本发明通过在薄膜两侧构建异质结构，形成了具有完整组织工程功能的复合修复体，即在薄膜的一侧生长了矿物作为支架结构，有利于诱导成骨，另一层为聚乳酸作为隔膜结构，能够防止牙龈上皮细胞和牙龈结缔组织细胞的根方迁移，有选择性的使一些细胞群体进入伤口空间并在牙根表面重建牙周附着；
3、本发明的制备方法简单易行，无需复杂的实验设备，节时省力，经济效益高。本方法制备的跨尺度仿生复合修复体在能够有效的诱导牙周组织再生。
附图说明
图1为本发明实施例1中聚乳酸-(壳聚糖-蒙脱土)羟基磷灰石仿生复合修复体矿物层表面扫描照片；从图1中可以看出，矿物层表面呈现小颗粒状堆叠结构而非聚合物原有的平整表面，且整个表面较为均匀，这表示矿化效果良好。
图2为本发明实施例1中聚乳酸-(壳聚糖-蒙脱土)羟基磷灰石仿生复合修复体聚乳酸表面(无矿物)扫描照片；从图2中可以看出，聚乳酸表面未发生矿化，维持了原有的平整结构。
图3为本发明实施例1中聚乳酸-(壳聚糖-蒙脱土)羟基磷灰石仿生复合修复体横截面扫描照片；从图3中可以看出，整个修复体由矿物层、壳聚糖-蒙脱土层以及聚乳酸层组成。
图4为本发明实施例1中聚乳酸-(壳聚糖-蒙脱土)羟基磷灰石仿生复合修复体原子力显微镜照片；从图4中可以看出，矿物层由纳米晶粒组成。
图5为本发明实施例1中聚乳酸-(壳聚糖-蒙脱土)羟基磷灰石仿生复合修复体拉伸强度图；从图5中可以看出，修复体具有良好的拉伸强度，能够保证手术使用。
图6为本发明实施例1中聚乳酸-(壳聚糖-蒙脱土)羟基磷灰石仿生复合修复体细胞毒性说明图(噻唑蓝比色法)；从图6中可以看出，修复体各组分均不呈现明显的细胞毒性，这表明其具有良好的生物安全性。
图7为本发明实施例1中聚乳酸-(壳聚糖-蒙脱土)羟基磷灰石仿生复合修复体上细胞黏附情况图；从图7中可以看出，细胞能较好的在修复体表面黏附。
图8为本发明实施例1中聚乳酸-(壳聚糖-蒙脱土)羟基磷灰石仿生复合修复体矿物面上的细胞；从图8中可以看出，细胞在矿物层表面黏附情况良好。
图9为本发明实施例1中聚乳酸-(壳聚糖-蒙脱土)羟基磷灰石仿生复合修复体诱导成骨能力展示图(碱性磷酸酶染色)；从图9中可以看出，修复体矿物层具有显著的成骨诱导能力。
图10为本发明实施例3中聚乳酸-(壳聚糖-几丁质纳米纤维)羟基磷灰石仿生复合修复体实物照片；从图10中可以看出，该配比条件下的修复体透明性良好。
图11为本发明实施例5中抽滤法-聚乳酸-(壳聚糖-纳米云母片)羟基磷灰石仿生复合修复体实物照片；从图11中可以看出，该配比条件下的修复体透明性良好，颜色偏深。
图12为本发明实施例5中抽滤法-聚乳酸-(壳聚糖-纳米云母片)羟基磷灰石仿生复合修复体实物在湿润状态下的照片。从图12中可以看出，该配比条件下的修复体在湿润状态下，仍能很好的维持其形态，证明其具有耐水能力，满足口腔内使用的条件。
具体实施方式
为便于理解，下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细的说明。
下面描述的实施例是实例性的，不限制本发明的保护范围。
本发明所采取的整体技术方案，包括以下步骤：
(1)配置可诱导矿化的聚合物溶液和纳米增强体溶液，并按照一定比例共混制备共混溶胶，超声、抽真空数次以除去气泡；
(2)通过自蒸发等组装方法构筑具有仿生结构的复合薄膜，并进行初步的化学修饰；
(3)在适当条件下通过特定组装方法在薄膜一侧沉积聚乙二醇/惰性聚合物混合层，干燥后进行充分的化学修饰，后用热水去除聚乙二醇，使得薄膜该侧变的粗糙，在此粗糙表面上喷涂聚乳酸溶液；
(4)将上述薄膜放入预先配置好的矿化前驱体溶液中矿化，最终得到跨尺度仿生复合修复体。
实施例1：聚乳酸-(壳聚糖-蒙脱土)羟基磷灰石仿生复合修复体的制备
单层蒙脱土纳米片剥离：取15克到1L烧杯，加1L水，超声剥离15分钟，搅拌半小时，重复四次。剥离后2000rpm离心3-10分钟去掉不溶物，用冷冻干燥法确定蒙脱土溶液质量分数为0.3-1.0wt％。
壳聚糖-蒙脱土溶胶的配制：称取壳聚糖粉末2克于200mL烧杯中，并加入去离子水98mL，剧烈搅拌条件下(500rpm)，缓慢地向混合体系中滴加2mL的醋酸，搅拌12小时，最终获得均匀的壳聚糖溶液。将单层蒙脱土纳米片溶液添加至上述壳聚糖溶液，体系中单层蒙脱土纳米片占比为20wt％，壳聚糖浓度2wt％，搅拌条件下，逐滴滴加，所得溶胶抽真空，再超声5min，循环三次脱气。
聚乳酸-(壳聚糖-蒙脱土)异质膜的制备：量取10-25mL上述壳聚糖-蒙脱土溶胶于圆形塑料培养皿模具中(直径10厘米)，模具置于40度烘箱干燥12小时，得到干燥的薄膜(图1为其扫描照片)。将上述薄膜浸泡于甲醇与醋酸酐9:1混合溶液中进行乙酰化反应，此反应需要密封并置于45℃条件2小时，反应后用超纯水清洗10次。选择任意一侧，喷涂PEG/壳聚糖溶液(PEG占比25wt％)，总共喷涂4-8mL溶液，干燥后再进行一次乙酰化(45℃条件4小时)。然后将薄膜至于90-100℃的热水中，超声去除PEG。再喷涂聚乳酸/(氯仿+N,N-二甲基甲酰胺)溶液(聚乳酸占比30％)。
矿化前驱体溶液的配制：按照5倍SBF方案配置，量取450mL去离子水置于1L塑料容器中，将氯化钠、碳酸氢钠、十二水和磷酸氢二钠、六水和氯化镁依次加入溶解，再加入聚丙烯胺盐酸盐PAH(最终为20mM)，加入1M盐酸10mL，搅拌均匀后，滴加1M氯化钙溶液6.25mL，再用pH为9.0的tris缓冲液将pH调节至6.2，最终将溶液定容至500mL，使得最终的钠离子浓度为733mM，镁离子浓度为30mM，钙离子浓度为12.5mM，氯离子浓度为720mM，磷酸氢根离子浓度为5.0mM，碳酸氢根离子浓度为21mM。
聚乳酸-(壳聚糖-蒙脱土)羟基磷灰石仿生复合修复体的制备：将上述获聚乳酸-(壳聚糖-蒙脱土)异质膜放入玻璃烧杯(200mL)，倒入150mL矿化前驱体溶液，置于37℃烘箱，反应时间为4天，最终获得聚乳酸-(壳聚糖-蒙脱土)羟基磷灰石仿生复合修复体。
利用原子力显微镜以及扫描电子显微镜技术，证明两侧结构具有明显的差异；通过对材料进行拉伸测试发现，此材料的拉伸强度高达70MPa；同时，材料在湿润状态下仍能维持原有形态，证明其具有湿态稳定性；体外细胞毒性实验表明该材料没有显著细胞毒性；与聚乳酸面相比，材料的矿物面展现出良好的细胞黏附能力和成骨诱导能力。
实施例2：聚乳酸-(壳聚糖-石墨烯)羟基磷灰石仿生复合修复体的制备
壳聚糖-石墨烯纳米片溶胶的配制：称取壳聚糖粉末2克于200mL烧杯中，并加入去离子水98mL，剧烈搅拌条件下(500rpm)，缓慢地向混合体系中滴加2mL的醋酸，搅拌12小时，最终获得均匀的壳聚糖溶液。将购置的石墨烯纳米片溶液添加至上述壳聚糖溶液，石墨烯纳米片占比为20wt％，壳聚糖浓度为2wt％，搅拌条件下，逐滴滴加，所得溶胶抽真空，再超声5min，循环三次脱气。
聚乳酸-(壳聚糖-石墨烯)异质膜的制备、矿化前驱体溶液的配制、聚乳酸-(壳聚糖-石墨烯)羟基磷灰石仿生复合修复体都与实施1相同。最终获得聚乳酸-(壳聚糖-石墨烯)羟基磷灰石仿生复合修复体。
实施例3：聚乳酸-(壳聚糖-几丁质纳米纤维)羟基磷灰石仿生复合修复体的制备
壳聚糖-几丁质纳米纤维溶胶的配制：称取壳聚糖粉末2克于200mL烧杯中，并加入去离子水98mL，剧烈搅拌条件下(500rpm)，缓慢地向混合体系中滴加2mL的醋酸，搅拌12小时，最终获得均匀的壳聚糖溶液。将购置的几丁质纳米纤维溶液添加至上述壳聚糖溶液，几丁质纳米纤维占比为20wt％，壳聚糖浓度为2wt％，搅拌条件下，逐滴滴加，所得溶胶抽真空，再超声5min，循环三次脱气。
聚乳酸-(壳聚糖-几丁质纳米纤维)异质膜的制备、矿化前驱体溶液的配制、聚乳酸-(壳聚糖-几丁质纳米纤维)羟基磷灰石仿生复合修复体都与实施1相同。最终获得聚乳酸-(壳聚糖-几丁质纳米纤维)羟基磷灰石仿生复合修复体。
实施例4：聚醚醚酮-(壳聚糖-纳米粘土片)碳酸钙仿生复合修复体的制备
壳聚糖-纳米粘土溶胶的配制：称取壳聚糖粉末2克于200mL烧杯中，并加入去离子水98mL，剧烈搅拌条件下(500rpm)，缓慢地向混合体系中滴加2mL的醋酸，搅拌12小时，最终获得均匀的壳聚糖溶液。将购置的纳米粘土片溶液添加至上述壳聚糖溶液，纳米粘土片占比为20wt％，聚醚醚酮浓度为2wt％，搅拌条件下，逐滴滴加，所得溶胶抽真空，再超声5min，循环三次脱气。
聚醚醚酮-(壳聚糖-纳米粘土片)异质膜的制备：量取10-25mL上述壳聚糖-纳米粘土片溶胶于圆形塑料培养皿模具中(直径10厘米)，模具置于40度烘箱干燥12小时，得到干燥的薄膜。将上述薄膜浸泡于甲醇与醋酸酐9:1混合溶液中进行乙酰化反应，此反应需要密封并置于45℃条件2小时，反应后用超纯水清洗10次。选择任意一侧，喷涂PEG/壳聚糖溶液(PEG占比25wt％)，总共喷涂4-8mL溶液，干燥后再进行一次乙酰化(45℃条件4小时)。然后将薄膜至于90-100℃的热水中，超声去除PEG。再喷涂聚醚醚酮/(氯仿+N,N-二甲基甲酰胺)溶液(聚醚醚酮占比30％)。
矿化前驱体溶液的配制：过量碳酸钙粉末加入到1L超纯水中，于25℃恒温水槽中搅拌1小时，期间并持续通入二氧化碳；反应结束后将溶液过滤，除去悬浮的碳酸钙，留取上清液，最终钙离子浓度10mM。取400mL上述上清液，向其中加入2mM六水和氯化镁4.8mL、0.2mM分子量为1800的聚丙烯酸1.2mL。
聚醚醚酮-(壳聚糖-纳米粘土片)异质膜的制备、聚醚醚酮-(壳聚糖-纳米粘土片)碳酸钙仿生复合修复体都与实施1相同，最终获得聚醚醚酮-(壳聚糖-纳米粘土片)碳酸钙仿生复合修复体。
实施例5：抽滤法-聚乳酸-(壳聚糖-纳米云母片)羟基磷灰石仿生复合修复体的制备
壳聚糖-纳米云母片溶胶的配制：称取壳聚糖粉末2克于200mL烧杯中，并加入去离子水98mL，剧烈搅拌条件下(500rpm)，缓慢地向混合体系中滴加2mL的醋酸，搅拌12小时，最终获得均匀的壳聚糖溶液。将购置的纳米云母片溶液添加至上述壳聚糖溶液，纳米云母片占比为20wt％，壳聚糖浓度为2wt％，搅拌条件下，逐滴滴加，所得溶胶抽真空，再超声5min，循环三次脱气。
抽滤法-聚乳酸-(壳聚糖-纳米云母片)异质膜的制备：量取10-25mL上述壳聚糖-纳米云母片溶胶置于抽滤瓶中，使用水泵抽滤过夜，得到干燥的薄膜。将上述薄膜浸泡甲醇与醋酸酐9:1混合溶液中进行乙酰化反应，此反应需要密封并置于45℃条件2小时，反应后用超纯水清洗10次。选择任意一侧，喷涂PEG/壳聚糖溶液(PEG占比25wt％)，总共喷涂4-8mL溶液，干燥后在进行一次乙酰化(45℃条件4小时)。然后将薄膜至于90-100℃的热水中，超声去除PEG。再喷涂聚乳酸/(氯仿+N,N-二甲基甲酰胺)溶液(聚乳酸占比30％)。
矿化前驱体溶液、抽滤法-聚乳酸-(壳聚糖-纳米云母片)羟基磷灰石仿生复合修复体都与实施1相同。最终获得抽滤法-聚乳酸-(壳聚糖-纳米云母片)羟基磷灰石仿生复合修复体。
实施例6：旋涂法-聚乳酸-(壳聚糖-纳米云母片)羟基磷灰石仿生复合修复体的制备
壳聚糖-纳米云母片溶胶的配制与实施例1相同。
旋涂法-聚乳酸-(壳聚糖-纳米云母片)异质膜的制备：将10cm直径的玻璃片置于旋涂机上，设置转速为1000rpm，量取100mL上述壳聚糖-纳米云母片溶胶，每隔30s滴加5mL至玻璃片中央，最终获得壳聚糖-纳米云母片膜。将上述薄膜浸泡甲醇与醋酸酐9:1混合溶液中进行乙酰化反应，此反应需要密封并置于45℃条件2小时，反应后用超纯水清洗10次。选择任意一侧，喷涂PEG/壳聚糖溶液(PEG占比25wt％)，总共喷涂4-8mL溶液，干燥后在进行一次乙酰化(45℃条件4小时)。然后将薄膜至于90-100℃的热水中，超声去除PEG。再喷涂聚乳酸/(氯仿+N,N-二甲基甲酰胺)溶液(聚乳酸占比30％)。
矿化前驱体溶液、旋涂法-聚乳酸-(壳聚糖-纳米云母片)羟基磷灰石仿生复合修复体都与实施1相同。最终获得旋涂法-聚乳酸-(壳聚糖-纳米云母片)羟基磷灰石仿生复合修复体。
实施例7：聚乳酸-(明胶-蒙脱土)羟基磷灰石仿生复合修复体的制备
单层蒙脱土纳米片剥离与实施例1相同。
明胶-蒙脱土纳米片溶胶的配制：称取明胶粉末2克于200mL烧杯中，并加入去离子水98mL，搅拌12小时，最终获得均匀的明胶溶液。将蒙脱土溶液添加至上述壳聚糖溶液，体系中蒙脱土纳米片占比为20wt％，明胶浓度为2wt％，搅拌条件下，逐滴滴加，所得溶胶抽真空，再超声5min，循环三次脱气。
其他步骤都与实施1相同。最终获得聚乳酸-(明胶-蒙脱土)羟基磷灰石仿生复合修复体。
Claims (5)
1.一种引导牙周组织再生的跨尺度仿生复合修复体的制备方法，其特征在于：
首先将聚合物溶液和纳米增强体溶液共混制备共混溶胶，通过组装构筑具有仿生结构的复合薄膜；然后在薄膜一侧沉积聚乙二醇/聚合物混合层，干燥后进行充分的化学修饰；用热水除去聚乙二醇以获得粗糙表面，在此粗糙表面上喷涂惰性聚合物溶液，经过矿化处理后得到异质仿生结构材料；包括如下步骤：
步骤1：配制可诱导矿化的聚合物溶液和纳米增强体溶液，按照一定比例共混制备共混溶胶，超声、抽真空数次以除去气泡；
步骤2：将步骤1获得的共混溶胶通过特定的组装方法构筑具有仿生结构的复合薄膜，并进行初步的化学修饰；
步骤3：通过特定组装方法在步骤2获得的复合薄膜的一侧沉积聚乙二醇/聚合物混合层，干燥后进行充分的化学修饰，然后用热水去除聚乙二醇，使得沉积聚乙二醇/聚合物混合层的一侧粗糙化，随后在该粗糙表面喷涂惰性聚合物溶液；粗糙表面的控制是为了整体不会脱层；
步骤4：将步骤3获得的薄膜置于矿化前驱体溶液中矿化，最终得到跨尺度仿生复合修复体；
在步骤4中，惰性聚合物一侧薄膜无法生长矿物，只有可诱导矿化的聚合物一侧生长了矿物；
步骤1中，所述可诱导矿化的聚合物选自蚕丝蛋白、海藻酸钠、壳聚糖、明胶或聚苯乙烯磺酸钠；
步骤1中，所述纳米增强体选自一维纳米纤维、二维纳米片中的一种或多种；所述一维纳米纤维选自几丁质纳米纤维、几丁质纳米晶、碳纳米管、碳酸钙纳米线，所述二维纳米片选自蒙脱土纳米片、氧化石墨烯片、纳米粘土片、纳米云母片；
步骤3中，所述惰性聚合物选自聚乳酸或聚醚醚酮；所述惰性聚合物使用氯仿和N,N-二甲基甲酰胺共同溶解，体积比4:1；
步骤2和步骤3中的化学修饰包括乙酰化或磷酸化；步骤2中初步的化学修饰是指乙酰化或磷酸化时间控制在1-2h，化学修饰程度较低；步骤3中充分的化学修饰是指乙酰化或磷酸化时间控制在4-5h，修饰程度高。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤1中，所述共混溶胶中纳米增强体的质量浓度为10-50 wt%，聚合物的浓度为2-40wt%。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤2中，所述特定的组装方法包括自蒸发、旋涂或抽滤；所述仿生结构包括但不限于仿珍珠母结构、布利冈螺旋结构。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤3中，通过特定组装方法在步骤2获得的复合薄膜的一侧沉积聚乙二醇/聚合物混合层，是指通过旋涂法或喷涂法在步骤2获得的复合薄膜的一侧旋涂或喷涂聚乙二醇/聚合物溶液；所述聚合物溶液为蚕丝蛋白溶液、海藻酸钠溶液、壳聚糖溶液、明胶溶液或聚苯乙烯磺酸钠溶液；所述聚合物溶液的浓度为0.5-4w/v%；所述聚乙二醇/聚合物溶液中聚乙二醇的浓度为10-50wt%。
5.权利要求1-4中任一项制备方法制备获得的跨尺度仿生复合修复体的应用，其特征在于：
以所述跨尺度仿生复合修复体作为牙周治疗的修复材料，能够有效诱导牙周组织再生。
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