CN103536962B

CN103536962B - 一种难溶于水的丝素蛋白膜及其制备与应用

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Publication number: CN103536962B
Application number: CN201310426226.3A
Authority: CN
Inventors: 陈隆坤; 张志红; 徐国伟; 其他发明人请求不公开姓名
Original assignee: ZHEJIANG XINGYUE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: ZHEJIANG XINGYUE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2012-09-17
Filing date: 2013-09-17
Publication date: 2016-04-06
Anticipated expiration: 2033-09-17
Also published as: CN103536962A; CN102847198A

Abstract

本发明公开了一种难溶于水的丝素蛋白膜及其制备与应用：将质量浓度0.3～30%丝素蛋白溶液倒入水平的模具内，将模具置于5～60℃，相对湿度10～70%条件下干燥，获得丝素蛋白膜；将丝素蛋白膜在50～100℃，相对湿度70～100%条件下放置20～200min，再依次用乙醇水溶液、去离子水充分浸洗，获得难溶于水的丝素蛋白膜；本发明以丝素蛋白为原料，膜及其降解产物生物相容性好；本发明制备工艺简单，环保无毒；所发明膜在湿润环境下，致密而柔软，能阻止细胞、微生物及生物大分子穿过；贴滑型膜的粗糙面有利于膜的固定、创面止血和引导组织再生；在防粘连膜、护创膜和人工膜补片领域具有广阔的市场。

Description

一种难溶于水的丝素蛋白膜及其制备与应用

（一）技术领域

本发明涉及一种丝素蛋白膜及其制备方法，特别涉及一种难溶于水的丝素蛋白膜及其制备和应用。

（二）背景技术

蚕丝是强度最好的天然纤维之一，由70～80%的丝素蛋白和20～30%的丝胶蛋白组成。丝素蛋白的氨基酸序列主要由“甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸--甘氨酸-丝氨酸”(GAGAGS)的重复单元构成，其中甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸占总氨基酸含量的85%以上。该重复序列绝大多数位于丝素蛋白的结晶区，并自组装成反向平行折叠链构象（anti-parallelβ-sheet）结构。这些结构赋予丝素蛋白具有良好力学和缓慢降解速率的特性。

丝胶蛋白在体内会引起炎症反应，在使用前需要进行脱胶处理（degummed）。丝素蛋白由分子量为325KD和25KD两种蛋白组成，其降解产物为氨基酸。大量的研究表明丝素蛋白具有良好的生物相容性，其体内炎症反应（inflammatoryresponses）要远低于胶原和聚乳酸等常用生物材料。丝素蛋白纤维作为外科缝线已有悠久的历史，经编织后作为人工韧带和组织补片已在研究领域应用。但在目前的生物材料研究领域应用更多的是再生型丝素蛋白，即丝素蛋白经过脱胶、溶解、提纯后，再通过物理、化学的方法，形成海绵状、膜状、凝胶状、微球状等形态。

在丝素蛋白膜的制备方面，中国发明专利“一种可溶—高弹性丝素蛋白膜的制备方法”（CN101234212A）中，将提纯后的丝素蛋白溶液在聚苯乙烯培养皿在恒温恒湿箱内（温度40～70℃，相对湿度60～80%）直接干燥形成厚度为30～50um可溶性膜。中国发明专利“再生丝素蛋白膜及其制备方法”（公开号CN101760027A）中，将提纯后的丝素蛋白溶液在PS皿内直接干燥成膜（未对干燥条件提出要求），再用极性溶剂（C1-C5醇和水混合物、水或水蒸汽）结合力学拉伸，进行溶胀变性处理，以改善丝素蛋白膜的脆性，即增加拉伸伸长率。中国发明专利“一种难溶于水的透明丝素蛋白膜及其制备方法”（CN101967282A）中，在提纯后的丝素蛋白溶液中加入多元醇作为交联剂，将两者混合物在模具中经鼓风干燥成膜，再在相对湿度为30～98%的环境中处理1～48小时（未对处理温度提出要求），获得所需要的膜。中国发明专利“柔韧丝素蛋白膜及其制备方法”（CN1316465）中，通过加入环氧树脂来交联丝素蛋白制备不溶于水的丝素蛋白膜。

现有丝素蛋白膜的制备方法，均是丝素蛋白溶液或其混合物灌注在模具内，通过溶剂挥发干燥，溶质沉积于模具底部，进而形成厚度约10～500um的可溶或难溶于水的膜。在该步骤的成膜过程中，模具底部上表面的平整性和水平性，模具是否处于振动环境，吹在溶液表面的风速，都将影响膜厚度的均一性和膜表面的微观结构；该步骤成膜过程中，干燥的温湿度条件，也将影响膜的透明性和膜均一性（如温度过高，会在膜内形成微气泡）；该步骤中膜的干燥程度，也影响膜的性能；该步骤膜的干燥时间约几小时到几天，模具所处环境的洁净程度，将影响膜的微生物和内毒素含量；该步骤形成的膜，再通过后续步骤的极性溶液或湿热条件等处理，处理温湿度也会对膜的结晶程度造成影响。

针对上述问题，本发明期望通过最简单和最经济的方法，获得一种难溶于水的丝素蛋白膜。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种难溶于水的丝素蛋白膜及其制备方法和应用，制备工艺中不接触有毒物质，未使用变性、促凝和交联等添加剂，制备工艺简单，利于大量生产；模具底面采用表面极其平整的浮法玻璃，并将模具存放于水平可精细调整的不锈钢平台；通过改变模具底部上表面的光滑或粗糙程度，将获得两种不同表面结构的丝素蛋白膜：底部光滑模具制备的双滑型膜，膜的两面均是光滑面，膜为半透明至近透明状，而底部毛糙模具制备的贴滑型膜，一面光滑，另一面粗糙，粗糙面有利于膜在创面的固定，利于止血、细胞粘附和增殖；通过控制该膜的厚度及其结晶程度，产生不同理化性能（如力学、柔韧度）和生物学性能（体内降解速率），满足不同用途的需要；该膜在湿润条件会吸收30～40%水分，膜会变的柔软（厚度10～100μm），大于150μm的柔韧性较差；膜降解产物为氨基酸，膜及其降解产物具有良好的生物相容性；膜能阻止细胞、微生物及生物大分子穿过，具有一定的水汽渗透性能；该膜在防粘连膜、护创膜或人工膜（引导骨再生膜、牙周膜、胸膜、硬脑膜或硬脊膜、鼓膜、眼角膜）等领域具有广阔的市场。

本发明采用的技术方案是：

一种难溶于水的丝素蛋白膜，所述丝素蛋白膜按如下方法制备：（1）以桑蚕蚕丝为原料，经脱胶、溶解、透析，获得截留液a，将截留液a或截留液a的浓缩液过滤或离心，取滤液或上层离心液得到丝素蛋白溶液；（2）取步骤（1）得到的丝素蛋白溶液，将丝素蛋白溶液的质量浓度用去离子水调整至0.3～30%（优选0.5～15%）（取部分丝素蛋白溶液在60℃烘干至恒重，计算丝素蛋白溶液的含水量，从而计算用去离子水调整丝素蛋白溶液所需的水量）倒入模具内，所述模具内丝素蛋白溶液加入量以丝素蛋白质量计为1～50mg/cm²模具（优选2～30mg/cm²，更优选3～20mg/cm²），在温度5～60℃（优选35～55℃，更优选45℃），相对湿度（RH）10～70%（优选20～50%，最优选40%）条件下干燥至无肉眼可见的水分，模具重量增加了所加入丝素蛋白溶液中丝素蛋白质量的1.2～1.8倍，在模具内形成丝素蛋白膜；（3）将模具在温度50～100℃（优选55～80℃，更优选60～70℃），RH70～100%（优选85～95%，最优选90%）条件下放置20～200min（优选60～150min，最优选120min）进行湿热交联，然后置于体积浓度50～90%（优选75%）的乙醇水溶液中浸洗10～60min（优选30min），去除模具，丝素蛋白膜再用去离子水充分浸洗30～150min（优选60～120min）至无醇，获得难溶于水的丝素蛋白膜，厚度为10～500μm（优选厚度20～200μm）。

进一步，步骤（1）所述截留液a的浓缩液的制备方法是将透析后的透析袋放入质量浓度20～60%的聚乙二醇水溶液中，静置1～10h进行浓缩，取截留液b即为截留液a的浓缩液；所述聚乙二醇平均分子量1000～10000。

进一步，步骤（1）所述截留液a或截留液a的浓缩液过滤或离心方法为下列之一：a）将截留液a或截留液a的浓缩液于4℃、3000～6000g条件下离心5～20min，弃去沉淀，取上层溶液即为所述的丝素蛋白溶液；b）将截留液a或截留液a的浓缩液用孔径为2～20μm的滤器过滤，去除不溶性颗粒，取滤液即为所述的丝素蛋白溶液。

进一步，步骤（2）所述模具为底部光滑平整且水平的模具，通常将模具存放于水平可精细调整的不锈钢平台进行调整。

进一步，本发明步骤（2）优选采用浮法玻璃制成的底部光滑平整且水平的模具（优选边长20cm的正方形模具），所述模具内质量浓度0.3～30%（优选0.5～15%）的丝素蛋白溶液的加入量以丝素蛋白质量计为1～50mg/cm²模具（优选2～30mg/cm²，更优选3～20mg/cm²），将模具在温度5～60℃，相对湿度（RH）10～70%条件下干燥至无肉眼可见的水分，在模具内形成两面光滑的丝素蛋白膜；将模具在温度50～100℃，RH为70～100%条件下放置20～200min进行湿热交联，然后置于体积浓度50～90%的乙醇水溶液中浸洗10～60min，去除模具，丝素蛋白膜再用去离子水充分浸洗30～150min，获得难溶于水的双滑型丝素蛋白膜。

更进一步，步骤（2）所述模具为底部表面毛糙且水平的模具。

更进一步，本发明优选采用底部为浮法玻璃经磨砂获得粗糙面的模具（优选边长20cm的正方形模具），所述模具内质量浓度0.3～30%（优选0.5～15%）的丝素蛋白溶液的加入量以丝素蛋白质量计为1～50mg/cm²模具（优选2～30mg/cm²，更优选3～20mg/cm²），将模具在温度5～60℃，RH为10～70%条件下干燥至无肉眼可见的水分，在模具内形成一面光滑、另一面粗糙的丝素蛋白膜（厚度为10～500μm）；将模具在温度50～100℃，RH为70～100%条件下放置20～200min进行湿热交联，然后置于体积浓度50～90%的乙醇水溶液中浸洗10～60min，去除模具，丝素蛋白膜再用去离子水充分浸洗30～150min，获得难溶于水的贴滑型丝素蛋白膜。

进一步，步骤（1）所述截留液a的浓缩液是指当所需丝素蛋白溶液质量浓度小于5%时不需要浓缩，直接将截留液a过滤或离心，获得丝素蛋白溶液；当所需丝素蛋白溶液质量浓度大于5%时，将所述截留液a进行浓缩，所述浓缩方法为：将透析后的透析袋放入质量浓度20～60%的聚乙二醇水溶液中，静置浓缩1～10h，取截留液b即为截留液a的浓缩液，将截留液a的浓缩液过滤或离心后制成丝素蛋白溶液，再用去离子水将丝素蛋白溶液调整为5～30%；所述聚乙二醇平均分子量1000～10000。

进一步，步骤（1）所述脱胶、溶解、透析方法为：a）脱胶：将100g桑蚕蚕丝放入4～8L的2M碳酸钠水溶液中，90～100℃水浴20～60min，纯水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白，将丝素蛋白在20～60℃烘干，获得干燥后的丝素蛋白，备用；b）溶解：将上述干燥后的丝素蛋白溶于9～11M的溴化锂水溶液中，55～65℃水浴30～300min至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白的混合液；所述干燥后的丝素蛋白质量用量以溴化锂水溶液的体积计为0.1～0.2g/ml；c）透析：将含丝素蛋白的混合液用截留分子量1000～20000道尔顿的透析袋进行透析，用10倍混合液体积的无菌去离子水作为透析液在3天透析10～12次，去除溶液中的溴化锂成分，获得截留液a。

本发明还提供所述的难溶于水的丝素蛋白膜在制备防粘连膜、护创膜或人工膜中的应用。

进一步，所述的人工膜为牙周膜、骨引导再生膜、胸膜、硬脑膜、硬脊膜、鼓膜或眼角膜。

本发明所模具可以使各种材质制作的平皿或盒体，优选浮法玻璃制作的方形皿。

本发明所述难溶于水的丝素蛋白膜制备中，在固定面积模具内加入丝素蛋白质量决定了最终丝素蛋白膜的厚度，即所述膜厚度与单位模具面积的丝素蛋白加入量和浓度相关。当模具面积一定时，调整丝素蛋白溶液质量浓度或加入体积来获得不同厚度的难溶于水的丝素蛋白膜。如果模具底部表面光滑则获得双面光滑的难溶于水的双滑型丝素蛋白膜，如果模具底部表面毛糙则获得一面光滑、另一面粗糙的难溶于水的贴滑型丝素蛋白膜。本发明所制备的难溶于水的丝素蛋白膜厚度为10～500μm，在37℃生理盐水中，24h丝素蛋白溶失率小于1%。

本发明所述聚乙二醇的平均分子量为1000～10000。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：（1）本发明所述的难溶于水的丝素蛋白膜制备工艺过程中不接触有毒物质，制备工艺简单，利于大量生产；（2）本发明难溶于水的丝素蛋白膜以丝素蛋白为原料，模具采用表面极其平整的浮法玻璃，并将模具存放于水平可精细调整的不锈钢平台，底部光滑模具制备的双滑型丝素蛋白膜的两面均是光滑面，底部粗糙模具制备的贴滑型丝素蛋白膜一面光滑，一面粗糙，所述膜为半透明至近透明状，现有研究已经证明丝素蛋白及其降解产物（氨基酸）拥有良好的生物相容性；（3）本发明难溶于水的丝素蛋白膜易于控制不同的厚度及其结晶程度，进而产生不同的物理（如力学、透光度、水汽渗透性）和生物学性能（如降解时间），满足不同用途的需求；（4）本发明难溶于水的双滑型丝素蛋白膜在湿润条件下柔软、光滑、致密，具有阻止细胞、微生物和生物大分子穿过的功能，并拥有高透光率，尤其适用于防粘连膜、眼角膜、护创膜领域；（5）本发明难溶于水的贴滑型丝素蛋白膜一面光滑，另一面粗糙，粗糙面有利于膜的固定，减少缝合针数或无需缝合固定，利于创面止血、细胞粘附和增殖，进而具有诱导组织再生作用，尤其适用于，在防粘连膜、人工膜（引导骨再生膜、牙周膜、胸膜、硬脑膜、硬脊膜、眼角膜或鼓膜）等领域具有广阔的市场。

（四）附图说明

图1丝素蛋白膜的红外吸收光谱（FTIR-ATR）。

图2实施例3制备的丝素蛋白膜（100μm）光滑面的扫描电镜图。

图3实施例7制备的丝素蛋白膜（200μm）粗糙面的扫描电镜图。

图4为实施例10丝素蛋白膜促进动物全层皮肤缺损的修复的动物试验图片，其中a为手术时创面图片，b为术后7天的创面图片，c为术后14天的创面图片，d为术后7天的创面组织学HE染色图片（放大40×），e为术后14天的创面组织学HE染色图片（放大40×），f为术后创面闭合指数。

图5为实施例11丝素蛋白膜促进肌腱缺损的修复的动物试验图片，其中a为术后图片，b为双滑型丝素蛋白膜术后8周的解剖图片，c为贴滑型丝素蛋白膜术后8周的解剖图片，d为双滑型丝素蛋白膜术后8周的组织学HE染色图片（放大40×），e为贴滑型丝素蛋白膜术后8周的组织学HE染色图片（放大40×）。

图6为实施例12丝素蛋白膜促进牙周组织再生修复的动物试验图片，a为术中缺损区图片，b为术后缺损区图片，c为术后8周缺损修复图片，d为术后8周缺损修复的X射线影像图片。

图7为实施例12丝素蛋白膜促进牙周组织再生修复的术后8周的组织学masson染色图片。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1（500μm）

（1）丝素蛋白溶液的制备：a）脱胶：将100g桑蚕蚕丝（浙江华芝丝绸有限责任公司，5A级）放入5L的2M碳酸钠水溶液中，96℃水浴30min，去离子水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白，将丝素蛋白在50℃烘干，获得70g干燥后的丝素蛋白，备用；b）溶解：将上述干燥后的丝素蛋白以质量体积比0.2：1（即干燥后的丝素蛋白质量用量以溴化锂水溶液的体积计为0.2g/ml）溶于9.3M的溴化锂（LiBr）水溶液中，60℃水浴90min至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白和少量不溶性颗粒组成的混合液；c）透析：将混合液用再生纤维素透析袋（截留分子量4000道尔顿）透析，用10倍混合液体积的无菌去离子水在3d透析12次，去除溶液中的LiBr离子，获得截留液a；d）浓缩：将透析后的透析袋放入4倍体积的质量浓度50%聚乙二醇（PEG，分子量7000）水溶液，室温静置浓缩5h，取截留液b，即获得截留液a的浓缩液；e）将截留液b在水平转子5000g，4℃，离心10min，除去底部的未溶解丝素蛋白和溴化锂中可能存在不溶性颗粒，取上清液，即获得提纯后的丝素蛋白溶液300ml；f）浓度测定：取提纯后的丝素蛋白溶液10ml，在平皿内烘干，质量差法测得丝素蛋白溶液质量浓度为20%。丝素蛋白溶液4℃保存备用。

（2）将模具（底部为浮法玻璃，边长20cm的正方形皿，其它实施例模具材质相同）存放于水平可精细调整的不锈钢平台上调整水平，加入质量浓度20%的丝素蛋白溶液100ml（20000mg丝素蛋白），在温度40℃，RH40%环境静置晾干至肉眼无可见液体，比空模具重量增加30g，在模具底部形成丝素蛋白膜。

（3）将模具置于温度70℃，RH92%的恒温恒湿箱内进行湿热交联120min，然后用体积浓度75%乙醇水溶液浸泡20min，去除模具，膜用去离子水洗涤3次，每次20min，切去丝素蛋白膜边缘因模具拐角处引起的不均一边缘膜，获得厚度为500μm难溶于水的双滑型丝素蛋白膜。红外吸收光谱采用傅立叶变换红外光谱仪（型号Nicolet6700），检测方法：全反射光谱，结果见图1所示。

实施例2（200μm）

（1）丝素蛋白溶液的制备：a）脱胶：将100g桑蚕蚕丝（浙江华芝丝绸有限责任公司，5A级）放入5L的2M碳酸钠水溶液中，95℃水浴30min，去离子水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白，将丝素蛋白在50℃烘干，获得70g干燥后的丝素蛋白，备用；b）溶解：将上述干燥后的丝素蛋白以质量体积比0.2：1溶于9.3M的溴化锂（LiBr）水溶液中，60℃水浴90min至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白和少量不溶性颗粒组成的混合液；c）透析：将上述混合液用再生纤维素透析袋（截留分子量8000道尔顿）透析，用10倍混合液体积的无菌去离子水在3d透析12次，去除溶液中的LiBr离子，获得截留液a；d）将截留液a在水平转子5000g，4℃，离心10min，除去底部的未溶解丝素蛋白和溴化锂中可能存在不溶性颗粒，取上清液即获得提纯后的丝素蛋白溶液1000ml；e）浓度测定：取提纯后的丝素蛋白溶液10ml，在平皿内烘干，质量差法测得丝素蛋白溶液的质量浓度为5%。丝素蛋白液4℃保存备用。

（2）将模具调整水平（同实施例1），加入上述制备的质量浓度5%丝素蛋白液160ml（8000mg丝素蛋白），去除内部产生的气泡。在温度45℃，RH40%环境静置晾干至肉眼无可见液体，比空模具重量增加12g，在模具底部形成丝素蛋白膜。

（3）将模具置于温度68℃，RH90%的湿热交联箱内放置120min，然后用体积浓度75%乙醇水溶液浸泡20min，去除模具，膜用去离子水洗涤3次，每次20min，切去丝素蛋白膜边缘因模具拐角处引起的不均一边缘膜，获得厚度为200μm难溶于水的双滑型丝素蛋白膜。红外吸收光谱采用傅立叶变换红外光谱仪（型号Nicolet6700），检测方法：全反射光谱，结果见图1所示。

实施例3（100μm）

（1）丝素蛋白溶液的制备：同实施例2。获得质量浓度为5%的丝素蛋白溶液。

（2）将模具调整水平（同实施例1），加入上述制备的质量浓度5%丝素蛋白液80ml（4000mg丝素蛋白），去除内部产生的气泡。在温度45℃，RH40%环境静置晾干至肉眼无可见液体，比空模具重量增加6g，在模具底部形成丝素蛋白膜。

（3）将模具置于温度68℃，RH90%的湿热交联箱内放置110min，然后用体积浓度75%乙醇水溶液浸泡20min，去除模具，膜用去离子水洗涤3次，每次20min，切去丝素蛋白膜边缘因模具拐角处引起的不均一边缘膜，获得厚度为100μm难溶于水的双滑型丝素蛋白膜。红外吸收光谱采用傅立叶变换红外光谱仪（型号Nicolet6700），检测方法：全反射光谱，结果见图1所示。扫描电镜型号为HitachiS-3000N，结果见图2所示，表明丝素蛋白膜为致密光滑的膜结构。

实施例4（50μm）

（1）丝素蛋白溶液的制备：a）脱胶：将100g桑蚕蚕丝（浙江华芝丝绸有限责任公司，5A级）放入5L的2M碳酸钠水溶液中，98℃水浴30min，去离子水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白，将丝素蛋白在50℃烘干，获得70g干燥后的丝素蛋白，备用；b）溶解：将丝素蛋白以质量体积比0.20：1溶于9.3M的溴化锂（LiBr）水溶液中，60℃水浴90min至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白和少量不溶性颗粒组成的混合液；c）透析：将混合液用再生纤维素透析袋（截留分子量2000道尔顿）透析，用10倍混合液体积的无菌去离子水在3d透析12次，去除溶液中的LiBr离子，获得截留液a；d）将截留液a用孔径10μm的滤器，除去底部的不溶性颗粒，取滤液即获得提纯后的丝素蛋白溶液1200ml；e）浓度测定：取提纯后的丝素蛋白溶液10ml，在平皿内烘干，质量差法测得丝素蛋白溶液的质量浓度为4%。丝素蛋白液4℃保存备用。

（2）用去离子水将丝素蛋白溶液浓度调整为2%，将模具调整水平（同实施例1），加入质量浓度2%丝素蛋白液100ml（2000mg丝素蛋白），去除内部产生的气泡。在温度50℃，RH50%环境静置晾干至肉眼无可见液体，比空模具重量增加3g，在模具底部形成丝素蛋白膜。

（3）将模具置于温度65℃，RH90%的湿热交联箱内放置100min，然后用体积浓度75%乙醇水溶液浸泡20min，去除模具，膜用去离子水洗涤3次，每次20min，切去丝素蛋白膜边缘因模具拐角处引起的不均一边缘膜，获得厚度为50μm难溶于水的双滑型丝素蛋白膜。红外吸收光谱采用傅立叶变换红外光谱仪（型号Nicolet6700），检测方法：全反射光谱，结果见图1所示。

实施例5（20μm）

（1）丝素蛋白溶液的制备：a）脱胶：将100g桑蚕蚕丝（浙江华芝丝绸有限责任公司，5A级）放入5L的2M碳酸钠水溶液中，98℃水浴30min，去离子水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白，丝素蛋白50℃烘干，获得70g丝素蛋白，备用；b）溶解：将丝素蛋白以质量体积比0.2：1溶于9.3M的溴化锂（LiBr）水溶液中，60℃水浴90min至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白和少量不溶性颗粒组成的混合液；c）透析：将混合液用再生纤维素透析袋（截留分子量8000道尔顿）透析，用10倍混合液体积的无菌去离子水在3d透析12次，去除溶液中的LiBr离子，获得截留液a；d）将截留液a用孔径10μm的滤器，除去底部的不溶性颗粒，获得提纯后的丝素蛋白溶液1200ml；e）浓度测定：取提纯后的丝素蛋白溶液10ml，在平皿内烘干，质量差法测得丝素蛋白溶液浓度的质量浓度为4%。丝素蛋白液4℃保存备用。

（2）将丝素蛋白溶液用无菌去离子水稀释成质量浓度1%，将模具调整水平（同实施例1），加入质量浓度1%丝素蛋白溶液80ml（800mg丝素蛋白），去除内部产生的气泡。在温度55℃，RH50%环境静置晾干至肉眼无可见液体，比空模具重量增加1.1g，在模具底部形成丝素蛋白膜。

（3）将模具置于温度65℃，RH88%的湿热交联箱内放置100min，然后用体积浓度75%乙醇水溶液浸泡20min，去除模具，膜用去离子水洗涤3次，每次20min，切去丝素蛋白膜边缘因模具拐角处引起的不均一边缘膜，获得厚度为20μm难溶于水的双滑型丝素蛋白膜。

实施例6（500μm）

（1）丝素蛋白溶液的制备：a）脱胶和b）溶解操作同实施例1，c）透析：将混合液用再生纤维素透析袋（截留分子量3000道尔顿）透析，用10倍混合液体积的无菌纯水在3d透析12次，去除溶液中的LiBr离子，获得截留液a；d）浓缩：将透析后的透析袋放入5倍体积的质量浓度30%聚乙二醇（PEG，分子量5000）水溶液，室温静置浓缩5h，取截留液b，即获得截留液a的浓缩液；e）将截留液b在水平转子5100g，4℃，离心10min，除去底部的未溶解丝素蛋白和溴化锂中可能存在不溶性颗粒，取上清液，即获得提纯后的丝素蛋白溶液300ml；f）浓度测定：同实施例1，质量差法测得丝素蛋白溶液的质量浓度为22%。

（2）将模具改为：边长20cm的正方形皿，底部为浮法玻璃一面经磨砂处理形成粗糙面，粗糙面朝向丝素蛋白膜面。加入质量浓度22%的丝素蛋白溶液91ml（20000mg丝素蛋白），其它操作同实施例1，获得厚度为500μm难溶于水的贴滑型丝素蛋白膜。

实施例7（200μm）

（1）丝素蛋白溶液的制备：将步骤d）水平转子改为5100g，4℃，离心10min，其它操作同实施例2，质量差法测得丝素蛋白溶液的质量浓度为5%。丝素蛋白液4℃保存备用。

（2）将模具改为：边长20cm的正方形皿，底部为浮法玻璃一面经磨砂处理形成粗糙面，粗糙面朝向丝素蛋白膜面。其它操作同实施例2，获得厚度为200μm的难溶于水的贴滑型丝素蛋白膜。扫描电镜型号为HitachiS-3000N，结果见图3所示，表明贴滑型丝素蛋白膜的粗糙面为波浪起伏状的粗糙结构。

实施例8（100μm）

（1）丝素蛋白溶液的制备：操作同实施例2，质量差法测得丝素蛋白溶液浓度的质量浓度为5%。丝素蛋白液4℃保存备用。

（2）将模具改为：边长20cm的正方形皿，底部为浮法玻璃一面经磨砂处理形成粗糙面，粗糙面朝向丝素蛋白膜面。加入上述制备的质量浓度5%丝素蛋白液80ml（4000mg丝素蛋白），其它操作同实施例3，获得厚度为100μm难溶于水的贴滑型丝素蛋白膜。

实施例9（50μm）

（1）丝素蛋白溶液的制备：将再生纤维素透析袋改为截留分子量8000道尔顿进行透析，其它操作同实施例3，质量差法测得丝素蛋白溶液的质量浓度为4%。丝素蛋白液4℃保存备用。

（2）将模具改为：边长20cm的正方形皿，底部为浮法玻璃一面经磨砂处理形成粗糙面，粗糙面朝向丝素蛋白膜面。其它操作同实施例4，获得厚度为50μm难溶于水的贴滑型丝素蛋白膜。

双滑型丝素蛋白膜的相关物理性能见表1。其中，厚度的检测工具为螺旋测微器。拉伸强度、拉伸断裂伸长率和缝合力学的检测设备为万能材料力学试验机，拉伸速度为100mm/min。溶失率的测试方法为，样品表面积：去离子水的体积为1cm:6ml，37℃水浴24小时。在样品溶失率试验前后分别将样品干燥至恒重，质量差法计算其溶失率。

表1双滑型丝素蛋白膜的主要性能参数

实施例10丝素蛋白膜促进动物全层皮肤缺损的修复）

（2）将模具调整水平（同实施例1），加入上述制备的质量浓度5%丝素蛋白液50ml（2500mg丝素蛋白），去除内部产生的气泡。在温度45℃，RH40%环境静置晾干至肉眼无可见液体，比空模具重量增加3.6g，在模具底部形成丝素蛋白膜。

（3）将模具置于温度65℃，RH90%的湿热交联箱内放置120min，然后用体积浓度75%乙醇水溶液浸泡20min，去除模具，膜用去离子水洗涤3次，每次20min，切去丝素蛋白膜边缘因模具拐角处引起的不均一边缘膜，获得厚度为60μm难溶于水的双滑型丝素蛋白膜。

（4）上述步骤（3）制备的膜剪切成4cm×4cm的方形，铝箔袋包装，钴60辐照灭菌，用于体内动物试验评估。

（5）丝素蛋白膜促进动物全层皮肤缺损的修复：临床上，由于烧伤、溃疡等原因引起的皮肤完整性破坏，往往需要皮肤移植来促进创面的修复。皮肤供区成为手术引起的皮肤缺损，需要妥善处理，以降低感染，缓解疼痛，减少疤痕形成和促进其愈合。皮肤最基本的功能是保护、透气舒适和阻止外部微生物入侵。在实施例的动物模型中，丝素蛋白膜覆盖在动物全层皮肤缺损区，起到暂时的皮肤替代功能，加速创面愈合。新西兰兔，雄性，体重2.2-2.4kg，清洁级动物饲养环境，每只单独饲养。水合氯醛腹腔注射麻醉，背部手术区域剃毛，医用碘伏消毒，按照无菌手术方式开展。背部脊柱两侧分别建立两个方形的全层皮肤缺损，缺损大小为3cm×3cm。上述方法制备的再生丝素蛋白膜，贴在创面缺损区。鉴于动物的好动性，膜边缘给予6针缝合固定，膜外侧包裹两层纱布给予保护。于术后7天和14天行创面拍照，测量未闭合的创面面积，计算创面闭合指数。其中创面闭合指数(%)=((A₀-A_t)/A₀)×100%，其中A₀为手术时的原始创面大小，A_t为术后第t天的创面大小。过量麻药注射安乐死后，创面修复区连同周围正常的组织一同切除，用多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色拍照观察(IX71invertedbiologicalmicroscope,Olympus)。结果见图4所示，表明，在丝素蛋白膜的创面保护和诱导再生作用下，新西兰兔背部全层皮肤缺损，在术后14天创面完全闭合，再生的表皮连续完整，真皮层胶原形成丰富，缺损区的周围区域毛囊发育，部分新生毛发长出。

实施例11（丝素蛋白膜促进肌腱缺损的修复）

（1）丝素蛋白溶液的制备：操作同实施例9，质量差法测得丝素蛋白溶液浓度的质量浓度为5%。丝素蛋白液4℃保存备用。

（2）双滑型丝素蛋白膜：将模具调整水平（同实施例1），加入上述制备的质量浓度5%丝素蛋白液40ml（2000mg丝素蛋白），去除内部产生的气泡。在温度45℃，RH40%环境静置晾干至肉眼无可见液体，比空模具重量增加3g，在模具底部形成双滑型丝素蛋白膜。

（3）贴滑型丝素蛋白膜：将步骤（2）模具改为边长20cm的正方形皿，底部为浮法玻璃一面经磨砂处理形成粗糙面，粗糙面朝向丝素蛋白膜面。加入上述步骤（1）制备的质量浓度5%丝素蛋白液40ml（2000mg丝素蛋白），去除内部产生的气泡。在温度45℃，RH40%环境静置晾干至肉眼无可见液体，比空模具重量增加3g，在模具底部形成贴滑型丝素蛋白膜。

（4）将上述步骤（2）和步骤（3）的两种模具分别置于温度56℃，RH90%的湿热交联箱内放置60min，然后用体积浓度75%乙醇水溶液浸泡10min，去除模具，膜用去离子水洗涤3次，每次20min，切去丝素蛋白膜边缘因模具拐角处引起的不均一边缘膜，分别获得厚度为50μm难溶于水的双滑型丝素蛋白膜和厚度为50μm的难溶于水的贴滑型丝素蛋白膜。

（5）上述步骤（4）制备的两种膜剪切成1cm×1cm的方形，铝箔袋包装，钴60辐照灭菌，用于体内动物试验评估。

（6）动物趾深屈肌腱横断术后修复：肌腱是以I型胶原为主的无血管组织，损伤后的再生修复能力差。在损伤肌腱的修复过程中，肌腱周围的纤维组织长入肌腱断端的缝合处或者肌腱组织缺损处，形成占位，最终导致以疤痕修复为主。肌腱修复的另外一个并并发症是肌腱与周围组织的粘连，导致肌腱的滑动功能障碍。本实施例所开展的试验，即采用贴滑型或者双滑型丝素蛋白膜，包绕于新西兰兔的肌腱缺损区，以达到纤维组织长入和减少肌腱粘连的预期作用，促进肌腱的再生修复。新西兰兔，雄性，体重2.2-2.4kg，清洁级动物饲养环境，每只单独饲养。水合氯醛腹腔注射麻醉，后脚足掌手术区域剃毛，医用碘伏消毒，按照无菌手术方式开展。足掌第二趾深屈肌腱在足掌测的延伸处，分离、横断趾深屈肌腱，Bunnell埋藏缝合法缝合肌腱断裂，分别在缝合处外周包裹步骤（4）制备的双滑型丝素蛋白膜和贴滑型丝素蛋白膜，包绕1.5圈，在两端的重叠处分别缝合1针辅助膜的包绕固定。再间断缝合皮肤。术后8周，过量麻药安乐处死兔后，解剖手术区域，观察肌腱和周围组织的粘连情况，并取下修复区的肌腱，进行固定、脱水，石蜡包埋、组织切片和HE染色等，评估肌腱的组织的修复质量。结果见图5所示，术后8w，横断后再缝合的肌腱，在贴滑型丝素蛋白膜或者双滑型丝素蛋白膜的保护作用下，断端处修复连续，与周围组织的粘连轻微。说明两种类型的丝素蛋白膜均具有阻止肌腱断端周围组织长入缺损区域，促进肌腱再生修复，减少肌腱和周围组织粘连发生的作用。

实施例12（丝素蛋白膜促进牙周组织再生修复）

（1）丝素蛋白溶液的制备：同实施例2，获得质量浓度为5%的丝素蛋白溶液。丝素蛋白液4℃保存备用。

（2）将模具改为：边长20cm的正方形皿，底部为浮法玻璃一面经磨砂处理形成粗糙面，粗糙面朝向丝素蛋白膜面。将模具调整水平，加入上述制备的质量浓度5%丝素蛋白液80ml（4000mg丝素蛋白），去除内部产生的气泡。在温度45℃，RH40%环境静置晾干至肉眼无可见液体，比空模具重量增加6g，在模具底部形成丝素蛋白膜。

（3）将模具置于温度60℃，RH90%的湿热交联箱内放置100min，然后用体积浓度75%乙醇水溶液浸泡20min，去除模具，膜用去离子水充分洗涤，切去丝素蛋白膜边缘因模具拐角处引起的不均一边缘膜，获得厚度为100μm难溶于水的贴滑型丝素蛋白膜。

（4）制备的贴滑型丝素蛋白膜，切割成8mm×10mm的方形，用铝箔袋包装，钴60辐照灭菌。用于引导牙周组织再生的动物试验评估。

（5）引导牙周组织再生的动物试验：牙周病等病因引起的牙槽骨吸收和牙周膜萎缩等，均会导致牙齿松动甚至脱落。牙周膜和牙槽骨的再生修复，常因为牙龈组织的瘢痕占位和口腔微生物的入侵，失去了局部的适宜环境，导致修复效果差。改善牙周组织再生的局部微环境，是促进牙周的再生的有效方法。故在本试验中采用贴滑型丝素蛋白膜作为牙周组织再生的引导膜，在犬第2-4三颗前磨牙的颊侧牙槽骨和牙周膜磨损后，牙周组织的再生修复能力。

本试验采用雄性Beagle狗，牙体、牙列完整，无龋坏，无明显磨耗，牙周情况良好，年龄为15个月左右，体重为10～12kg。毕格犬用肌肉注射戊巴比妥麻药，全麻后，医用碘伏消毒手术区域，在相对无菌的操作条件下沿下颌龈沟切开并翻起前磨牙P2～P4区颊侧面粘骨膜瓣，去除该区部分颊侧牙槽骨，至釉牙骨质界下3～4mm，刮净缺损区根面牙周韧带和牙槽骨，生理盐水冲洗。将步骤（4）制备的贴滑型丝素蛋白膜覆盖于缺损区域，膜的上端略低于龈缘，下端覆盖牙槽骨1～2mm，膜的粗糙面朝向牙槽骨，光滑面朝向牙龈，复位和间断缝合龈粘骨膜瓣。在术后8W大体拍照下颌骨颊侧面的牙周组织修复情况，过量麻药安乐处死犬后，分别取下两侧下颌骨，保留颊侧面牙周组织，行X射线影像学评估。并将样品进行组织固定、脱钙、石蜡包埋和组织学masson染色，评估牙周膜和牙槽骨的再生修复效果，结果如图6、图7所示。结果，术后8周，大体照片显示牙周组织修复与正常组织无差异。X射线图片（图7）表现为，牙槽骨的缺损区域边界已经模糊，难以辨认缺损区，说明牙槽骨已经大部分再生。组织学显示在牙根和牙槽骨之间的牙周膜，已经向上爬行再生，与之伴随着牙槽骨的再生修复。

Claims

1.一种难溶于水的丝素蛋白膜，其特征在于所述丝素蛋白膜按如下方法制备：

(1)以桑蚕丝为原料，经脱胶、溶解、透析，获得截留液a，将截留液a或截留液a的浓缩液过滤或离心，取滤液或上层离心液得到丝素蛋白溶液；

(2)取步骤(1)得到的丝素蛋白溶液，将丝素蛋白溶液的质量浓度用水调整至0.5～15％，倒入模具内，所述模具内丝素蛋白溶液加入量以丝素蛋白质量计为3～20mg/cm²模具，将模具在温度35～55℃，相对湿度20～50％条件下干燥至无肉眼可见的水分，在模具内形成表面光滑的丝素蛋白膜；

(3)将模具在温度60～70℃，相对湿度70～100％条件下放置60～150min进行湿热交联，然后置于体积浓度50～90％的乙醇水溶液中浸洗10～60min，去除模具，丝素蛋白膜再用去离子水充分浸洗60～120min至无醇，获得难溶于水的双滑型丝素蛋白膜；

其中，步骤(1)中，所述截留液a的浓缩液制备方法为：将透析后的透析袋放入质量浓度20～60％的聚乙二醇水溶液中，静置1～10h，取截留液b即为截留液a的浓缩液，所述聚乙二醇平均分子量1000～10000；

步骤(1)中，所述截留液a或截留液a的浓缩液过滤或离心方法为下列之一：a)将截留液a或截留液a的浓缩液于4℃、3000～6000g条件下离心5～20min，弃去沉淀，取上层溶液即为所述的丝素蛋白溶液；b)将截留液a或截留液a的浓缩液用孔径为2～20μm的滤器过滤，去除不溶性颗粒，滤液即为所述的丝素蛋白溶液；

步骤(1)中，所述脱胶、溶解、透析方法为：a)脱胶：将100g桑蚕蚕丝放入4～8L的2M碳酸钠水溶液中，90～100℃水浴20～60min，去离子水清洗，该过程重复3次，脱去丝胶蛋白，留下丝素蛋白，将丝素蛋白在20～60℃烘干，获得干燥后的丝素蛋白；b)溶解：将上述干燥后的丝素蛋白溶于9～11M的溴化锂水溶液中，55～65℃水浴30～300min至丝素蛋白充分溶解，获得含丝素蛋白的混合液；所述干燥后的丝素蛋白质量用量以溴化锂水溶液的体积计为0.1～0.2g/ml；c)透析：将含丝素蛋白的混合液用截留分子量1000～20000道尔顿的透析袋进行透析，用10倍混合液体积的无菌去离子水作为透析液在3天透析10～12次，去除溶液中的溴化锂成分，获得截留液a；

步骤(2)中，所述模具利用浮法玻璃制成的底部光滑平整且水平的模具。

2.如权利要求1所述的难溶于水的丝素蛋白膜在制备防粘连膜、护创膜或人工膜中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述人工膜为引导骨再生膜、胸膜、硬脑膜、硬脊膜、鼓膜或眼角膜。