CN104587524B - 一种β‑TCP/PGS复合支架及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种β‑TCP/PGS复合支架及其制备方法和应用。所述β‑TCP/PGS复合支架由聚癸二酸甘油酯和β‑磷酸三钙多孔支架构成，具体地通过将β‑磷酸三钙多孔支架浸渍于聚癸二酸甘油酯预聚体溶液中，进一步热交联‑干燥制备而成。本发明还公开了包含该复合支架的药物组合物和组织工程骨修复材料。与单纯β‑磷酸三钙多孔支架相比，本发明制备的β‑TCP/PGS复合支架表现出优异的韧性和压缩强度，同时具有良好的生物相容性，可用作骨修复材料和药物载体材料。
Description
技术领域
本发明涉及一种骨组织修复用β-磷酸三钙/高分子材料复合支架体系及其制备方法和应用，具体涉及一种β-磷酸三钙/聚癸二酸甘油酯复合支架体系及制备方法和应用。
背景技术
β-磷酸三钙(β-TCP)与人类自然骨中的主要无机成分类似，具有良好的生物相容性和生物降解性及优异的骨结合能力，并且具有较高的硬度和刚性，便于加速修复骨组织，因而在骨组织修复工程中获得了广泛的应用，也是迄今应用最广泛的骨修复材料之一。其中，特别是便于细胞和长入的β-TCP多孔支架材料得到国内外研究者的广泛关注。但是单一的β-磷酸三钙多孔支架存在脆性大、机械强度差、稳定性不好等问题，这在一定程度上影响了其临床的应用效果，尤其是在应力承载骨修复方面。
为了解决这个问题，研究者发展了β-TCP/高分子复合支架。研究表明，与其他热塑性降解材料(如聚乳酸及其共聚物)以一定方式复合，可在一定程度上提高β-磷酸三钙的强度和稳定性(Oral Max Surg 2008,37,929-934)。然而，因为这些聚合物本身的韧性较差，对β-TCP的韧性和强度改进有限。同时过高的高分子材料的含量会对β-TCP的生物活性产生影响。
因此，本领域尚需深入研发β-TCP/高分子复合支架。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型的β-磷酸三钙/聚癸二酸甘油酯复合支架及制备方法和应用。
本发明的第一方面，提供一种β-磷酸三钙/聚癸二酸甘油酯复合支架，所述复合支架由聚癸二酸甘油酯和β-磷酸三钙多孔支架构成。
在另一优选例中，所述复合支架由聚癸二酸甘油酯复合在β-磷酸三钙多孔支架上构成。
在另一优选例中，所述复合支架包括：10～25wt％聚癸二酸甘油酯和75-90wt％β-磷酸三钙，以所述复合支架的总重量计。
在另一优选例中，所述β-磷酸三钙多孔支架孔隙率为70％-95％。
在另一优选例中，所述β-磷酸三钙多孔支架平均孔径为300-500微米。
在另一优选例中，所述复合支架具有以下一个或多个特征：
(1)孔隙率为70％-95％，较佳地为85-95％，更佳地为90-95％；
(2)平均孔径为300-500微米；
(3)支架结构破坏前能够承受的最大压缩强度为0.015-2MPa；
(4)支架结构破坏前能够发生的最大形变量为120％-750％；
(6)所述β-磷酸三钙与所述聚癸二酸甘油酯的质量比为1：0.1-0.35，较佳地为1：0.18。
在另一优选例中，所述β-磷酸三钙多孔支架由纳米级β-磷酸三钙制成，所述纳米级β-磷酸三钙的平均粒径为300-500纳米。
本发明的第二方面，提供第一方面所述的复合支架的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(a)将β-磷酸三钙多孔支架浸渍于聚癸二酸甘油酯预聚体溶液中获得β-磷酸三钙/聚癸二酸甘油酯复合支架；
(b)将步骤a)获得β-磷酸三钙/聚癸二酸甘油酯复合支架加热交联得到交联支架；
(c)将步骤b)获得的交联支架干燥得到所述复合支架。
在另一优选例中，所述聚癸二酸甘油酯预聚体溶液的浓度为10-35mg/ml，所述β-磷酸三钙与所述聚癸二酸甘油酯预聚体的质量比为1：0.1-0.35，较佳地为1：0.18。
在另一优选例中，所述聚癸二酸甘油酯预聚体溶液所用溶剂为醇类溶剂、二甲基亚砜、氯仿、二氯甲烷，所述醇类溶剂较佳地为乙醇。
在另一优选例中，所述β-磷酸三钙多孔支架由纳米级β-磷酸三钙制成，所述纳米级β-磷酸三钙的平均粒径为300-500纳米。
在另一优选例中，采用聚氨酯泡沫浸渍法制备β-磷酸三钙多孔支架。具体地，将β-磷酸三钙溶液与溶剂混合制成浆料，将聚氨酯泡沫浸渍在浆料中使浆料均匀灌注于泡沫，待溶剂从灌注好的泡沫中挥发完全后对泡沫进行烧结(较佳地，采用梯度温度烧结，烧结温度为200-800℃)，去除聚氨酯泡沫得到β-磷酸三钙多孔支架。
在另一优选例中，所述聚癸二酸甘油酯预聚体的制备包括以下步骤：
(i)氩气的氛围下，将摩尔比为1:1的癸二酸和甘油在120-140℃(较佳130℃)反应18-36小时(较佳24小时)；
(ii)将步骤i)的产物置于120-140℃(较佳130℃)、真空条件下18-36小时(较佳24小时)，得到粗PGS预聚体；
(iii)透析纯化步骤ii)获得的粗PGS预聚体得到纯化的所述聚癸二酸甘油酯预聚体。
在另一优选例中，所述聚癸二酸甘油酯预聚体的分子量为12000道尔顿。
在另一优选例中，所述聚癸二酸甘油酯预聚体的分散系数为1.19。
在另一优选例中，所述干燥是指：
(1)真空冷冻干燥；
(2)真空干燥；(包括二次真空干燥)
(3)真空干燥后真空冷冻干燥；
(4)真空干燥后冷冻。
在另一优选例中，在步骤b)干燥之前还包括挥发溶剂的步骤。
在另一优选例中，所述(1)真空冷冻干燥的条件如下：-40℃～-60℃真空冷冻干燥20-30小时。
在另一优选例中，所述(1)真空冷冻干燥的条件如下：-50℃真空冷冻干燥24小时。
在另一优选例中，所述(2)真空干燥的条件如下：120-140℃真空干燥40-55小时；或者所述(2)真空干燥的条件如下：120-140℃真空干燥40-55小时后，20-30℃真空干燥20-30小时。
在另一优选例中，所述(2)真空干燥的条件如下：130℃真空干燥48小时；或者所述(2)真空干燥的条件如下：130℃真空干燥48小时后，25℃真空干燥24小时。
在另一优选例中，所述(3)真空干燥后真空冷冻干燥的条件如下：120-140℃真空干燥40-55小时后，-10℃至-80℃真空冷冻干燥20-30小时。
在另一优选例中，所述(3)真空干燥后真空冷冻干燥的条件如下：130℃真空干燥48小时后，-20℃至-50℃真空冷冻干燥24小时。
在另一优选例中，所述(4)真空干燥后冷冻的条件如下：120-140℃真空干燥40-55小时后置于-80℃至-200℃冷冻24小时-2分钟。
在另一优选例中，所述(4)真空干燥后冷冻的条件如下：130℃真空干燥48小时后置于-80℃至-200℃冷冻24小时-2分钟。
本发明的第三方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物包含：
第一方面所述的复合支架；和
用于促进骨修复和/或生长的药物和/或生长因子。
在另一优选例中，所述药物选自地塞米松、庆大霉素、甲氨蝶呤、醋氯芬酸片、1，25-二羟基维生素D、洛伐他丁、辛伐他丁等。
在另一优选例中，所述生长因子选自：骨形态发生蛋白BMP(如BMP-2、BMP-4、BMP-7)、血管内皮生长因子、碱性成纤维生长因子、转化生长因子、缺氧诱导转录因子、BMP转化生长因子家族(TGFs)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)。
本发明的第四方面，提供一种组织工程骨修复材料，所述组织工程骨修复材料包含：
第一方面所述的复合支架；和
用于促进骨修复和/或生长的细胞。
在另一优选例中，所述细胞选自：骨髓间充质干细胞和内皮细胞。
在另一优选例中，所述组织工程骨修复材料还包括促进骨修复和/或生长的药物和/或生长因子。
本发明的第五方面，提供第一方面所述的复合支架的用途，选自下组：
(1)用于制备骨组织修复材料；
(2)用作药物载体材料；
(3)用作组织工程支架材料。
本发明的第六方面，提供第三方面所述的药物组合物的用途，用于制备骨组织修复材料或用作药物载体材料或用作组织工程支架材料。
本发明将聚癸二酸甘油酯复合在β-磷酸三钙支架的表面，使得本发明的β-磷酸三钙/聚癸二酸甘油酯复合支架体系不但具有优异的力学性能和生物相容性，并且具有促进血管化作用进而促进骨修复。这种新型的骨修复支架可应用于体内骨损伤的治疗，使得损伤骨能够快速被修复。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为实施例1制备的纯化PGS预聚体的1H-NMR和IR图。
图2为实施例1制备的纯化PGS预聚体的GPC图谱。
图3为支架形貌图。
图4为扫描电镜图。
图5为实施例10制备的复合支架的TGA和XRD图。
图6为对β-TCP多孔支架(实施例2)和β-TCP/15P-CFV(实施例10)进行 手动压缩的结果图。
图7为β-TCP多孔支架和复合支架的连通性测试结果和孔隙率图。
图8为力学性能测试结果。
图9为体外降解的pH值和重量随时间的变化图。
图10为β-TCP支架和复合支架在SBF溶液中矿化的SEM和EDS图。
图11为MTT测试结果图。
图12为共聚焦显微镜图。
具体实施方式
本申请的发明人经过广泛而深入地研究，首次研发出一种新型的β-磷酸三钙/聚癸二酸甘油酯复合支架，可有效改善单纯β-磷酸三钙多孔支架的脆性，同时具有良好的生物相容性。PGS的降解产物所产生的酸可用于调控β-TCP的降解速度，以使复合支架的降解速度与新骨形成速度相匹配，从而提高材料的骨修复能力和新骨生长能力，实现骨组织完全再生/修复。在此基础上，完成了本发明。
β-磷酸三钙/聚癸二酸甘油酯复合支架
在本发明中，复合支架、复合多孔支架、复合支架体系具有相同的含义。
本发明的复合支架，由聚癸二酸甘油酯和β-磷酸三钙多孔支架构成。
聚癸二酸甘油酯(PGS)是一种生物相容性好的弹性体，具有很好的韧性和生物降解性能，具有促进血管化的作用。同时，PGS的降解产物呈酸性，而早期β-TCP材料降解产物呈碱性，二者的复合可以降低材料因降解而导致的pH过度浮动造成的体内无菌性炎症发生的可能性。同时，PGS的降解产物所产生的酸可用于调控β-TCP的降解速度，以使复合支架的降解速度与新骨形成速度相匹配，从而提高材料的骨修复能力和新骨生长能力，实现骨组织完全再生/修复。
复合支架的平均孔径为300-500微米，孔隙率为70-95％。
发明人意外发现，与其他高分子材料如PCL、PLA等相比，聚癸二酸甘 油酯与β-磷酸三钙多孔支架复合得到的复合支架，可显著提高力学性能。
复合支架结构破坏前能够承受的最大压缩强度为0.015-2MPa，较佳地为0.1-2MPa，更佳地为0.3-2MPa，甚至0.5-2MPa，最佳为1.5-2或1-2MPa。
复合支架结构破坏前能够发生的最大形变量为120％-750％，较佳地为150％-650％，更佳地为200-500％或300-400％。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的有益之处在于：
(1)提供一种新型的β-磷酸三钙/聚癸二酸甘油酯复合支架，相对于单一β-磷酸三钙多孔支架，改善其韧性，复合材料具有较高的硬度和刚性。
(2)PGS的降解产物呈酸性，而早期β-TCP材料降解产物呈碱性，二者的复合有望降低材料因降解而导致的pH过度浮动造成的体内无菌性炎症发生的可能性。
(3)制备的β-磷酸三钙/聚癸二酸甘油酯复合支架具有良好的细胞相容性和生物矿化能力，有望用作骨修复支架材料。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
评价方法
(1)力学性能测试
将支架制成10mm×10mm×10mm的样品，然后用万能材料试验机(AG-2000，Shimadzu，Japan)进行压缩性能测试，压缩速度为1mm/min。
(2)其他性能表征表征
采用凝胶渗透色谱(GPC,SPD-M20A,Shimadzu Kyoto,Japan)分析PGS经纯化后分子量和分散性的变化。
采用扫描电子显微镜镜(SEM，JSM-6360LV-4800，JEOL，Japan)观察制备材料的宏观结构和沉积矿化的形貌变化。
采用X-Ray衍射分析(RINT2000多晶衍射仪)和TGA(TG 209,Netzch,Germany)热分析分析复合支架材料的复合情况，根据Barrett-Joyner-Helen(BJH)公式计算平均孔径。
采用激光共聚焦显微镜(CLSM，Leica Microsystems)观察材料表面的细胞形貌和渗透。
(3)体外细胞培养
鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)培养于含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的α-MEM培养液中，于37℃、5％CO2培养箱内传代培养。将大孔支架高温灭菌后置于24孔细胞培养板中，rBMSCs分别接种到材料表面，加入培养基；孵育至培养结束后使用MTT测定法检测细胞活性和细胞增殖，向每孔加入100μL的四甲基偶氮唑盐试剂，37℃继续孵育4h后，吸弃上清液，加入1mL DMSO，轻轻震荡20min，使结晶物溶解，使用连续光谱酶标仪在490nm处测定溶液的光吸收值。
内皮细胞(HUVEC)培养于含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL链霉素的DMEM培养液中，于37℃、5％CO2培养箱内传代培养。将大孔支架 高温灭菌后置于24孔细胞培养板中，HUVEC分别接种到材料表面，加入培养基；孵育至培养结束后使用MTT测定法检测细胞活性和细胞增殖，向每孔加入100μL的四甲基偶氮唑盐试剂，37℃继续孵育4h后，吸弃上清液，加入1mL DMSO，轻轻震荡20min，使结晶物溶解，使用连续光谱酶标仪在490nm处测定溶液的光吸收值。
通过激光共聚焦(confocal laser scanning microscopy)观察细胞在支架上的渗透和铺展：将2×104个/孔的细胞培养在材料上24h后PBS清洗三次，2.5％戊二醛固定15min后用异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽(FITC-Phalloidin)染色40min，PBS清洗5次、每次5min，再用DAPI染色10min后PBS清洗5次、每次5min，封片液封片后激光共聚焦下进行三维观察。
实施例1
PGS预聚体的合成及纯化
PGS预聚体通过两步法合成。
第一步：氩气的氛围下，摩尔比为1:1的癸二酸和甘油在130℃反应24小时；
第二步：第一步的产物在130℃、真空条件下继续反应24小时，得到PGS预聚体。
然后进行纯化，先将PGS预聚体溶解在乙醇中，将得到的乳状液静置一段时间，倾去上层液。将得到的PGS预聚体放置于透析袋中，进行透析，得到分子量为12000Da，分散性系数为1.19的纯化PGS预聚体。
纯化PGS预聚体的1H-NMR如图1中A所示。1.31、1.62和2.35ppm处出现的质子峰主要表明合成的高分子链中癸二酸单元的存在，在3.55-4.54ppm处的质子峰则说明在高分子链中有甘油单元的存在。对核磁图谱进一步的分析，可以得出在PGS预聚体中，甘油/癸二酸的摩尔比率为1:1。另外，在2.89ppm处的质子峰是甘油单元上的未反应的羟基。这也表明合成的高分子重复单元中存在一个羟基，同时说明合成得到的PGS预聚体是很好的线性结构的高分子。
纯化PGS预聚体的FTIR如图1中B所示，通过将癸二酸、甘油和PGS 预聚体的红外图谱归一化后，进行比较，能够看出癸二酸在1603和1416cm-1(羧酸盐基团的不对称和对称伸缩峰)有明显的吸收峰，在反应后，PGS预聚体的红外结果表明，峰的强度减弱在1603和1416cm-1处，在1740cm-1处出现了新的峰，即是反应后新生成的酯键(C═O)。通过以上结果表明，成功合成PGS预聚体。
纯化PGS预聚体的GPC谱图如图2所示。可以看出，预聚体在经纯化后，其分子量为12000Da，分散系数为1.19，得到适用的PGS预聚体。
实施例2
β-TCP纳米粒子的合成及β-TCP多孔支架的制备
将0.4mol Ca(NO3)2·4H2O和0.4mol(NH4)2HPO3分别溶于200ml超纯水中，快速搅拌30min，得到Ca盐和P盐溶液。将Ca溶液逐滴滴加到P溶液中(1-2滴/秒)，同时保持匀速搅拌和加入配好的氨水(2M)调节混合溶液的pH值稳定在7.0～7.5。滴加完成后，停止搅拌，将溶液静置2个小时，使溶液自然沉淀，倾去上层的清液。然后将所得到的沉淀装入离心瓶，进行离心(6000r/min，10min)，下一步用超纯水洗，超声(10min)，继续离心，然后重复水洗2遍，然后再用无水乙醇洗一遍，离心完成后将产物取出，烘干(80℃，24小时)。
烘干后，将产物用研钵磨碎，放入干锅高温烧结，高温炉设定程序：25℃～220℃，(195min，1℃/min)，220℃～220℃(120min，1℃/min)，220℃～600℃(380min，1℃/min)，600～600℃(120min，1℃/min)，600～800(200min，1℃/min)，800～800℃(120min，1℃/min)，结束。
合成的β-TCP纳米粒子的大小为300～500nm。
采用聚氨酯泡沫浸渍法制备β-TCP多孔支架。首先将制备好的β-TCP纳米粒子粉末和无水乙醇配制成合适的浆料(1gβ-TCP粉末/800微升)，将剪好的聚氨酯海绵(PU，10mm×10mm×3-10mm，形貌如图3中a所示)浸渍到浆料中，使得浆料均匀的灌注在海绵中，然后将灌注好的海绵(形貌如图3中b所示)放置在干燥箱中(60℃,大于48小时)烘干，直至无水乙醇挥发完全。然后将海绵支架用马弗炉进行烧结，温度设定程序为：25℃～220℃，(195min，1℃ /min)，220℃～220℃(120min，1℃/min)，220℃～600℃(380min，1℃/min)，600～600℃(120min，1℃/min)，结束。
得到β-TCP多孔支架的形貌如图3中c所示，SEM图如图4中A和B所示。
通过支架的形貌图和SEM图(图4中A)可以看出，制备的β-TCP多孔支架具有良好的孔连通性，孔的大小在300-500微米。从图4中B可以看出，烧结后的支架表面上的β-TCP仍然是以纳米状的颗粒存在，但只是简单的堆积在一起。孔隙率为93±2％。最大压缩强度为0.01±0.002MPa，断裂形变量为102±15％。
实施例3
β-TCP/10P-Unc多孔支架的制备
将制得的PGS预聚体(PGS-1:1，实施例1制备)配成以无水乙醇为溶剂的浓度为10mg/ml溶液。将β-TCP多孔支架(重量0.2g)放置在24孔板中，加入PGS溶液2ml，使支架完全浸没，然后将孔板置于通风橱中3～5小时去除乙醇。然后将支架在-50℃、真空条件下冻干24小时，得到产品β-TCP/10P-Unc多孔支架。孔的大小在300-500微米。孔隙率为90±2％。最大压缩强度为0.02±0.01MPa，断裂形变量为120±32％。
实施例4
β-TCP/15P-Unc多孔支架的制备
将制得的PGS预聚体(PGS-1:1，实施例1制备)配成以无水乙醇为溶剂的浓度为17.5mg/ml溶液。将β-TCP多孔支架(重量0.2g)放置在24孔板中，加入PGS溶液2ml，使支架完全浸没，然后将孔板置于通风橱中3～5小时，将乙醇挥发大部分。然后将支架在-30℃、真空条件下冻干24小时，得到产品β-TCP/15P-Unc多孔支架。孔的大小在300-500微米。孔隙率为85±2％。最大压缩强度为0.03±0.01MPa，断裂形变量为180±26％。
实施例5
β-TCP/25P-Unc多孔支架的制备
将制得的PGS预聚体(PGS-1:1，实施例1制备)配成以无水乙醇为溶剂的浓度为33.5mg/ml溶液。将β-TCP多孔支架(重量0.2g)放置在24孔板中，加入PGS溶液2ml，使支架浸没，然后将孔板置于通风橱中3～5小时，将乙醇挥发大部分。然后将支架在-30℃、真空条件下冻干24小时，得到产品β-TCP/25P-Unc多孔支架。孔的大小在300-500微米。孔隙率为75±5％。最大压缩强度为0.04±0.01MPa，断裂形变量为150±22％。
实施例6
β-TCP/10P-C多孔支架的制备
将制得的PGS预聚体(PGS-1:1，实施例1制备)配成以无水乙醇为溶剂的浓度为10.0mg/ml溶液。将β-TCP多孔支架(重量0.2g)放置在24孔板中，加入PGS溶液2ml，使支架浸没，然后将孔板置于通风橱中3～5小时，将乙醇挥发大部分。然后将支架放置在真空干燥箱中，130℃、真空、48小时的条件下，得到产品β-TCP/10P-C多孔支架。孔的大小在300-500微米。孔隙率为90±2％。最大压缩强度为0.18±0.02MPa，断裂形变量为144±13％。
实施例7
β-TCP/15P-C多孔支架的制备
将制得的PGS预聚体(PGS-1:1，实施例1制备)配成以无水乙醇为溶剂的浓度为17.5mg/ml溶液。将β-TCP多孔支架(重量0.2g)放置在24孔板中，加入PGS溶液2ml，使支架浸没，然后将孔板置于通风橱中3～5小时，将乙醇挥发大部分。然后将支架放置在真空干燥箱中，130℃、真空、48小时的条件下，得到产品β-TCP/15P-C多孔支架。孔的大小在300-500微米。孔隙率为88±3％。最大压缩强度为0.32±0.03MPa，断裂形变量为220±12％。
实施例8
β-TCP/25P-C多孔支架的制备
将制得的PGS预聚体(PGS-1:1，实施例1制备)配成以无水乙醇为溶剂的浓度为33.5mg/ml溶液。将β-TCP多孔支架(重量0.2g)放置在24孔板中，加入PGS溶液2ml，使支架浸没，然后将孔板置于通风橱中3～5小时，将乙醇挥发大部分。然后将支架放置在真空干燥箱中，130℃、真空、48小时的条件下，得到产品β-TCP/25P-C多孔支架。孔的大小在300-500微米。孔隙率为75±5％。最大压缩强度为0.25±0.02MPa，断裂形变量为257±30％。
实施例9
β-TCP/10P-CFV多孔支架的制备
将制得的PGS预聚体(PGS-1:1，按实施例1制备)配成以无水乙醇为溶剂的浓度为10.0mg/ml溶液。将β-TCP多孔支架(重量0.2g)放置在24孔板中，加入PGS溶液2ml，使支架浸没，然后将孔板置于通风橱中3～5小时，将乙醇挥发大部分。然后将支架放置在真空干燥箱中，130℃、真空、48小时的条件下，然后将支架再放置于真空冷冻干燥机中，-50℃、真空、24小时的条件下，得到产品β-TCP/10P-CFV多孔支架。孔的大小在300-500微米。孔隙率为90±2％。最大压缩强度为0.42±0.02MPa，断裂形变量为185±15％。
实施例10β-TCP/15P-CFV多孔支架的制备
10.1制备
将制得的PGS预聚体(PGS-1:1，按实施例1制备)配成以无水乙醇为溶剂的浓度为17.5mg/ml溶液。将β-TCP多孔支架(重量0.2g，形貌如图3所示)放置在24孔板中，加入PGS溶液2ml，使支架浸没，然后将孔板置于通风橱中3～5小时，将乙醇挥发大部分。然后将支架放置在真空干燥箱中，130℃、真空、48小时的条件下，然后将支架再放置于真空冷冻干燥机中，-50℃、真空、24小时的条件下，得到产品β-TCP/15P-CFV多孔支架，也可标记为β-TCP/15PGS-CFV/-50℃。
多孔支架形貌如图3中d所示。
SEM图如图4中C和D所示。
TGA和XRD图如图5所示。
结果表明PGS复合到β-TCP多孔支架表面，含量为15％，同时保持了良好的孔连通性及均匀尺寸的孔径，平均孔径为300-500微米。图4中的D图可以看到PGS是比较均匀的负载在β-TCP的表面，并且将β-TCP的颗粒更牢固的粘结在了一起。孔隙率为89±3％。
图6示出对单纯β-TCP多孔支架和实施例10制备的复合支架进行手动压缩的结果图，其中为A为对单纯β-TCP多孔支架的压缩结果，结果表明，经手动压缩后支架基本上已经不能保持原有的形貌，并且变成了粉末状；B为对复合支架进行手动压缩的结果图，结果表明，经手动压缩后支架基本上能够完全恢复到原有的形貌。这也能表明多孔复合支架相比单一的TCP多孔支架力学性能得到了非常大的提高，改善了TCP多孔支架的脆性。
此外，经检测最大压缩强度为1.73±0.1MPa，断裂形变量为375±25％。
10.2渗透性实验
用甲基胺蓝对实施例2和10所获得的支架进行渗透性实验，具体步骤：每个支架滴加2ml的溶液，在5s、30s后观察渗透情况，在60s后将支架从中间切开。
结果如图7中A所示，其中上图为单纯β-TCP多孔支架的测试图，下图为复合支架的测试图。表明采用PGS复合后支架同样具有很高的孔连通性。
实施例11
β-TCP/25P-CFV多孔支架的制备
将制得的PGS预聚体(PGS-1:1，按实施例1制备)配成以无水乙醇为溶剂的浓度为33.5mg/ml溶液。将β-TCP多孔支架(重量0.2g)放置在24孔板中，加入PGS溶液2ml，使支架浸没，然后将孔板置于通风橱中3～5小时，将乙醇挥发大部分。然后将支架放置在真空干燥箱中，130℃、真空、48小时的条件下，然后将支架再放置于真空冷冻干燥机中，-50℃、真空、24小时的 条件下，得到产品β-TCP/25P-CFV多孔支架。孔的大小在300-500微米。孔隙率为75±5％。
根据排水法测定多孔支架材料的孔隙率，计算公式如下：
孔隙率P＝(W2-W3+WS)/(W1-W3)
其中WS为样品质量，W1为称量充满无水乙醇的比重瓶的质量；W2为将样品放入比重瓶中的总质量；W3为将样品取出后，比重瓶的质量。
结果如图7中B所示，单纯β-TCP支架(按实施例2制得)的孔隙率90-95％；β-TCP/10P-CFV支架(按实施例9制得)的孔隙率90±2％；β-TCP/15P-CFV支架(按实施例10制得)的孔隙率89±3％；β-TCP/25P-CFV支架(按实施例11制得)的孔隙率75±5％。
经检测，最大压缩强度为0.94±0.1MPa，断裂形变量为640±70％。
实施例12
β-TCP/15P-CF/25℃多孔支架的制备
将制得的PGS预聚体(PGS-1:1，按实施例1制备)配成以无水乙醇为溶剂的浓度为17.5mg/ml溶液。将β-TCP多孔支架(重量0.2g)放置在24孔板中，加入PGS溶液2ml，使支架浸没，然后将孔板置于通风橱中3～5小时，将乙醇挥发大部分。然后将支架放置在真空干燥箱中，130℃、真空、48小时的条件下，然后将支架再放置于干燥机中，25℃、24小时的条件下，得到产品β-TCP/15P-CF/25℃多孔支架。孔的大小在300-500微米。孔隙率为90±2％。最大压缩强度为0.32±0.05MPa，断裂形变量为220±12％。
实施例13
β-TCP/15P-CF/-20℃多孔支架的制备
将制得的PGS预聚体(PGS-1:1，按实施例1制备)配成以无水乙醇为溶剂的浓度为17.5mg/ml溶液。将β-TCP多孔支架(重量0.2g)放置在24孔板中，加入PGS溶液2ml，使支架浸没，然后将孔板置于通风橱中3～5小时，将乙醇挥发大部分。然后将支架放置在真空干燥箱中，130℃、真空、48小时 的条件下，然后将支架再放置于冷冻干燥机中，-20℃、24小时的条件下，得到产品β-TCP/15P-CF/-20℃多孔支架。孔的大小在300-500微米。孔隙率为88±2％。最大压缩强度为0.04±0.05MPa，断裂形变量为250±15％。
实施例14
β-TCP/15P-CF/-50℃多孔支架的制备
将制得的PGS预聚体(PGS-1:1，按实施例1制备)配成以无水乙醇为溶剂的浓度为17.5mg/ml溶液。将β-TCP多孔支架(重量0.2g)放置在24孔板中，加入PGS溶液2ml，使支架浸没，然后将孔板置于通风橱中3～5小时，将乙醇挥发大部分。然后将支架放置在真空干燥箱中，130℃、真空、48小时的条件下，然后将支架再放置于冷冻干燥机中，-50℃、24小时的条件下，得到产品β-TCP/15P-CF/-50℃多孔支架。孔的大小在300-500微米。孔隙率为89±2％。最大压缩强度为0.78±0.05MPa，断裂形变量为280±22％。
实施例15
β-TCP/15P-CF/-80℃多孔支架的制备
将制得的PGS预聚体(PGS-1:1，按实施例1制备)配成以无水乙醇为溶剂的浓度为17.5mg/ml溶液。将单纯β-TCP多孔支架(重量0.2g)放置在24孔板中，加入PGS溶液2ml，使支架浸没，然后将孔板置于通风橱中3～5小时，将乙醇挥发大部分。然后将支架放置在真空干燥箱中，130℃、真空、48小时的条件下，然后将支架再放置于-80℃的冰箱中，-80℃、24小时的条件下，得到产品β-TCP/15P-CF/-80℃多孔支架。孔的大小在300-500微米。孔隙率为85±2％。最大压缩强度为0.32±0.03MPa，断裂形变量为268±20％。
实施例16
β-TCP/15P-CF/-190℃多孔支架的制备
将制得的PGS预聚体(PGS-1:1，按实施例1制备)配成以无水乙醇为溶剂的浓度为17.5mg/ml溶液。将单纯β-TCP多孔支架(重量0.2g)放置在24 孔板中，加入PGS溶液2ml，使支架浸没，然后将孔板置于通风橱中3～5小时，将乙醇挥发大部分。然后将支架放置在真空干燥箱中，130℃、真空、48小时的条件下，然后将支架再放置于-190℃的液氮中，-190℃、2分钟的条件下，得到产品β-TCP/15P-CF/-190℃多孔支架。孔的大小在300-500微米。孔隙率为87±3％。最大压缩强度为0.20±0.09MPa，断裂形变量为230±18％。
实施例17
β-TCP/15PCL-CFV/-50℃多孔支架的制备
将购买的PCL配成浓度为17.5mg/ml溶液。将单一纯β-TCP多孔支架(重量0.2g)放置在24孔板中，加入PCL溶液2ml，使支架浸没，然后将孔板置于通风橱中3～5小时，将乙醇挥发大部分。然后将支架放置在真空干燥箱中，130℃、真空、48小时的条件下，然后将支架再放置于-50℃的真空冷冻干燥器中，-50℃、真空、24小时的条件下，得到产品β-TCP/15PCL-CFV/-50℃多孔支架。孔的大小在300-500微米。孔隙率为80±5％。最大压缩强度为0.43±0.08MPa，断裂形变量为125±16％。
实施例18
β-TCP/15PLA-CFV/-50℃多孔支架的制备
将PLA配成浓度为17.5mg/ml溶液。将单一纯β-TCP多孔支架(重量0.2g)放置在24孔板中，加入PLA溶液2ml，使支架浸没，然后将孔板置于通风橱中3～5小时，将乙醇挥发大部分。然后将支架放置在真空干燥箱中，130℃、真空、48小时的条件下，然后将支架再放置于-50℃的真空冷冻干燥器中，-50℃、真空、24小时的条件下，得到产品β-TCP/15PLA-CFV/-50℃多孔支架。孔的大小在300-500微米。孔隙率为82±3％。最大压缩强度为0.58±0.1MPa，断裂形变量为187.5±12％。
实施例19
β-TCP/PGS复合支架材料力学性能
β-TCP/PGS复合支架材料制备成10mm×10mm×10mm的矩形样条，然后在万能材料试验机上(AG-2000A，Shimadzu，Japan)进行抗压测试，压缩速度为1mm/min。
结果如图8和表1所示。
表1 力学性能测试结果
结果表明，与单纯β-TCP支架(按实施例2制备)相比，经过热固化交联和-50℃真空冷冻干燥下两步获得的PGS/β-TCP支架(按实施例9、10和 11制备)、经过热固化交联得到的PGS/β-TCP支架(按实施例4、5和6制备)以及经过真空冷冻干燥的PGS/β-TCP支架(按实施例3、4和5制备)的力学性均显著提高。尤其是经过热固化交联和-50℃真空冷冻干燥下两步获得的PGS/β-TCP支架(按实施例9、10和11制备)，与经过热固化交联得到的PGS/β-TCP支架(按实施例4、5和6制备)和经过真空冷冻干燥的PGS/β-TCP支架(按实施例3、4和5制备)相比，力学性能也有明显的提高。
具体地，与β-TCP支架相比，β-TCP/15P-CFV支架(按实施例10制得)的最大压缩强度提高了约200倍(β-TCP/15P-CFV,1.730±0.100MPa；β-TCP,0.01±0.002MPa)，断裂形变量提高了3.7倍(β-TCP/15P-CFV,375±25％,β-TCP:102±1％)。
即使采用完全相同的制备工艺，用不同高分子PCL和PLA制备的复合支架(实施例17和实施例18)，与采用PGS制备的复合支架相比，最大压缩强度低4和3倍。断裂形变量的结果也表明，实施例10制备的β-TCP/15P-CFV支架的韧性远高于相应的PCL和PLA复合支架(实施例17和实施例18)。也就是说有机高分子PGS的引入，并且通过热固化交联和真空冷冻干燥后可以极其显著地提高β-TCP多孔支架材料的力学强度。
实施例20
β-TCP/PGS复合支架材料的体外生物活性
20.1pH稳定性测试
将β-TCP支架(实施例2制备)和β-TCP/PGS复合支架材料(实施例9、10、11制备)浸泡在Tris-HCl中，测试溶液在不同时间段1、3、7、14、21天的pH值和支架的重量。
结果如图9A所示，可以发现，在实验时间范围内，β-TCP/15P-CFV(实施例10)浸泡的Tris-HCl溶液pH值稳定在7.0～7.2之间，说明其具有良好的pH稳定性。而β-TCP(实施例2)和β-TCP/10P-CFV(实施例9)的浸泡的Tris-HCl溶液pH值随时间延长不断的增大，溶液呈偏碱性。β-TCP/25P-CFV(实施例11)浸泡的Tris-HCl溶液pH值随时间延长不断减小，溶液最后偏 酸性。
图9中B结果显示，PGS含量也会影响材料的降解。纯TCP支架的降解较慢，而PGS的复合可在一定程度上加速支架的降解。
20.2体外矿化能力测试
将β-TCP支架(实施例2制备)和β-TCP/PGS复合支架材料(实施例9、10、11制备)浸泡在人体模拟体液(SBF，采用电子分析天平准确称取试剂并严格按照以下顺序以及用量：7.996g NaCl，0.353g NaHCO3,0.224g KCl,0.228g K2HPO43H2O,0.305g MgCl26H2O,0.045gHCl,0.278g CaCl20.071g Na2SO4,6.057g CNH2(CH2OH)3)中。
结果如图10所示，其中A为单一β-TCP支架(按实施例2制备)；B为β-TCP/10P-CFV(实施例10获得)；C为β-TCP/15P-CFV(实施例10获得)；D为β-TCP/15P-CFV(实施例11获得)。通过SEM可以表征分析Ca/P在支架材料表面的沉积情况。
通过的3天的矿化后，单一β-TCP支架沉积出现了纳米颗粒分布的表面，然而加了PGS且含量为25％的复合支架β-TCP/25P-CFV变化较大，即表面呈现出类似含β-TCP/15P-CFV支架的纳米纤维的形貌。当随着PGS的含量的增加，支架表面的纳米纤维也变得更长。
EDS的结果表明，在同样的矿化条件下，所有的样品表面都沉积了相同Ca/P结构的化学组成。在复合支架中，β-TCP/15P-CFV支架相比其他的支架展现出了最好的矿化结果。PGS拥有较多的羟基和羰基，能够促进模拟液中的Ca2+沉积到支架上，这也促进了其矿化。
由于β-TCP/PGS复合支架材料的表面能迅速发生一系列的物理化学反应，导致其表面形成一层与人体骨骼无机相相似的碳羟基磷灰石(HAP)，从而能与人体硬、软组织如胶原蛋白和细胞进一步成键联结，因此与单纯β-TCP多孔支架相比，本发明制备的β-TCP/PGS复合支架材料具有更加优良的体外矿化能力和生物活性。
实施例21
β-TCP/PGS复合支架材料的细胞相容性
本实施例以鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)和内皮细胞(HUVEC)为模型，使用MTT法检测实施例2和10、11制备的支架材料的细胞活性。
鼠骨髓间充质干细胞制备步骤：1、大鼠100g左右，脱颈处死，75％酒精泡10min。2、无菌剥离股骨、胫骨，再用纱布剥尽骨头上的肌肉。3、剪断干骺端，用5ml注射器吸取含10％胎牛血清(没灭活)L-DMEM培养基冲洗骨髓腔，吹打制的单细胞悬液。4、离心1000r/min、离心5min。5、弃上清，培养基重悬细胞，吹打成细胞悬液，接种在培养瓶中培养
MTT法：将接种有细胞(2×104个/孔)的支架材料培养于24孔板内，每孔加入100μL的四甲基偶氮唑盐试剂，37℃继续孵育4h后，吸弃上清液，加入1mL DMSO，轻轻震荡20min，使结晶物溶解，离心后使用连续光谱酶标仪在490nm处测定溶液的光吸收值。
MTT法测得的细胞活性和细胞增殖如图11，可见随着时间的增加，细胞活性良好，具有良好的生物相容性。
通过激光共聚焦(confocal laser scanning microscopy)观察细胞在实施例10制备的复合支架材料上的渗透和铺展：将2*104个/孔的细胞培养在材料上24h后PBS清洗三次，2.5％戊二醛固定15min后用异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽(FITC-Phalloidin)染色40分钟，PBS清洗5次、每次5min，封片液封片后激光共聚焦下进行三维观察。
结果如图12，可见多孔支架材料有利于细胞的渗透和长入，并表现出良好的细胞粘附和相容性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (37)
1.一种β-磷酸三钙/聚癸二酸甘油酯复合支架，其特征在于，所述复合支架由聚癸二酸甘油酯和β-磷酸三钙多孔支架构成，所述复合支架由聚癸二酸甘油酯复合在β-磷酸三钙多孔支架上构成，所述复合支架包括：10～25wt％聚癸二酸甘油酯和75-90wt％β-磷酸三钙，以所述复合支架的总重量计，
并且，所述β-磷酸三钙多孔支架孔隙率为70％-95％，所述β-磷酸三钙多孔支架平均孔径为300-500微米。
2.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述复合支架的孔隙率为70％-95％。
3.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述复合支架的平均孔径为300-500微米。
4.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述复合支架结构破坏前能够承受的最大压缩强度为0.015-2MPa。
5.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述复合支架结构破坏前能够发生的最大形变量为120％-750％。
6.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述复合支架中，所述β-磷酸三钙与所述聚癸二酸甘油酯的质量比为1：0.1-0.35。
7.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，孔隙率为85-95％。
8.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，孔隙率为90-95％。
9.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述β-磷酸三钙与所述聚癸二酸甘油酯的质量比为1：0.18。
10.如权利要求1所述的复合支架，其特征在于，所述β-磷酸三钙多孔支架由纳米级β-磷酸三钙制成，所述纳米级β-磷酸三钙的平均粒径为300-500纳米。
11.如权利要求1所述的复合支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(a)将β-磷酸三钙多孔支架浸渍于聚癸二酸甘油酯预聚体溶液中获得β-磷酸三钙/聚癸二酸甘油酯复合支架；
(b)将步骤(a)获得β-磷酸三钙/聚癸二酸甘油酯复合支架加热交联得到交联支架；
(c)将步骤(b)获得的交联支架干燥得到所述复合支架。
12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述聚癸二酸甘油酯预聚体溶液的浓度为10-35mg/ml，所述β-磷酸三钙与所述聚癸二酸甘油酯预聚体的质量比为1：0.1-0.35。
13.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述β-磷酸三钙与所述聚癸二酸甘油酯预聚体的质量比为1：0.18。
14.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述聚癸二酸甘油酯预聚体溶液所用溶剂为醇类溶剂、二甲基亚砜、氯仿、二氯甲烷。
15.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述β-磷酸三钙多孔支架由纳米级β-磷酸三钙制成，所述纳米级β-磷酸三钙的平均粒径为300-500纳米。
16.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，采用聚氨酯泡沫浸渍法制备β-磷酸三钙多孔支架。
17.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，将β-磷酸三钙溶液与溶剂混合制成浆料，将聚氨酯泡沫浸渍在浆料中使浆料均匀灌注于泡沫，待溶剂从灌注好的泡沫中挥发完全后对泡沫进行烧结，去除聚氨酯泡沫得到β-磷酸三钙多孔支架。
18.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述聚癸二酸甘油酯预聚体的制备包括以下步骤：
(i)氩气的氛围下，将摩尔比为1:1的癸二酸和甘油在120-140℃反应18-36小时；
(ii)将步骤(i)的产物置于120-140℃、真空条件下18-36小时，得到粗PGS预聚体；
(iii)透析纯化步骤(ii)获得的粗PGS预聚体得到纯化的所述聚癸二酸甘油酯预聚体。
19.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述聚癸二酸甘油酯预聚体的分子量为12000道尔顿。
20.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述聚癸二酸甘油酯预聚体的分散系数为1.19。
21.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述干燥是指：
(1)真空冷冻干燥；
(2)真空干燥；
(3)真空干燥后真空冷冻干燥；
(4)真空干燥后冷冻。
22.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，在步骤(b)干燥之前还包括挥发溶剂的步骤。
23.如权利要求21所述的制备方法，其特征在于，所述(1)真空冷冻干燥的条件如下：-40℃～-60℃真空冷冻干燥20-30小时。
24.如权利要求21所述的制备方法，其特征在于，所述(1)真空冷冻干燥的条件如下：-50℃真空冷冻干燥24小时。
25.如权利要求21所述的制备方法，其特征在于，所述(2)真空干燥的条件如下：120-140℃真空干燥40-55小时；或者所述(2)真空干燥的条件如下：120-140℃真空干燥40-55小时后，20-30℃真空干燥20-30小时。
26.如权利要求21所述的制备方法，其特征在于，所述(2)真空干燥的条件如下：130℃真空干燥48小时；或者所述(2)真空干燥的条件如下：130℃真空干燥48小时后，25℃真空干燥24小时。
27.如权利要求21所述的制备方法，其特征在于，所述(3)真空干燥后真空冷冻干燥的条件如下：120-140℃真空干燥40-55小时后，-10℃至-80℃真空冷冻干燥20-30小时。
28.如权利要求21所述的制备方法，其特征在于，所述(3)真空干燥后真空冷冻干燥的条件如下：130℃真空干燥48小时后，-20℃至-50℃真空冷冻干燥24小时。
29.如权利要求21所述的制备方法，其特征在于，所述(4)真空干燥后冷冻的条件如下：120-140℃真空干燥40-55小时后置于-80℃至-200℃冷冻24小时-2分钟。
30.如权利要求21所述的制备方法，其特征在于，所述(4)真空干燥后冷冻的条件如下：130℃真空干燥48小时后置于-80℃至-200℃冷冻24小时-2分钟。
31.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含：
权利要求1或2所述的复合支架；和
用于促进骨修复和/或生长的药物和/或生长因子。
32.如权利要求31所述的药物组合物，其特征在于，所述药物选自地塞米松、庆大霉素、甲氨蝶呤、醋氯芬酸片、1，25-二羟基维生素D、洛伐他丁、辛伐他丁。
33.如权利要求31所述的药物组合物，其特征在于，所述生长因子选自：骨形态发生蛋白BMP、血管内皮生长因子、碱性成纤维生长因子、转化生长因子、缺氧诱导转录因子、BMP转化生长因子家族(TGFs)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)。
34.一种组织工程骨修复材料，其特征在于，所述组织工程骨修复材料包含：
权利要求1或2所述的复合支架；和
用于促进骨修复和/或生长的细胞。
35.如权利要求34所述的修复材料，其特征在于，所述细胞选自：骨髓间充质干细胞和内皮细胞。
36.如权利要求34所述的修复材料，其特征在于，所述组织工程骨修复材料还包括促进骨修复和/或生长的药物和/或生长因子。
37.如权利要求1所述的复合支架或权利要求31所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备骨组织修复材料、用作组织工程支架材料或用作药物载体材料。
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