CN1369555A - 羊膜组织工程支架及羊膜脱细胞方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是用作组织工程支架的一种羊膜组织工程支架及羊膜脱细胞方法。该组织工程支架是去除了上皮细胞层的上皮细胞和纤维母细胞层的纤维母细胞的羊膜,或是去除了上皮细胞层的上皮细胞的羊膜。羊膜脱细胞方法的特征在于:(1)用0.2－5%的胰蛋白酶溶液,在37℃温度下浸泡羊膜20－25分钟;(2)固定羊膜,在浸泡过程中或浸泡后进行搅拌冲洗,将羊膜上皮细胞层的上皮细胞和纤维母细胞层的纤维母细胞冲掉。本发明羊膜组织工程支架及羊膜脱细胞方法,使用羊膜做组织工程支架来源充足,不会产生免疫反应;而本发明提供的羊膜脱细胞方法简单,便于批量生产,成本低。为组织工程大规模产业化创造了前提条件,具有巨大的经济效益和良好的社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及制造人体器官和组织的组织工程领域，特别是用作组织工程支架的一种羊膜组织工程支架及羊膜脱细胞方法。
背景技术
组织工程研究是制造人体器官和组织的科学，由于其广阔的应用前景和逐年以几何基数递增的产业效益，各国政府和产业界都投入巨资进行研究和产业建设。世界每年的研究经费都在几十亿美元以上。我国的863,973，攀登计划也投入几个亿人民币进行研究。组织工程研究包括两个主要方面：一方面是用来搭建成器官和组织形态的支架；再一方面是种植在支架上可以生长并发挥生理作用的细胞。而对于组织工程支架，它必须具备两个特点：(1)对细胞具有良好的亲和性；(2)对人体无毒害，可在人体内降解，人体对其无免疫排斥反应。
在现有技术中，组织工程在支架上的研究和生产主要包括两类：一类是人工合成有机物包括：PGA，GAG，壳聚糖等；另一类是利用动物和人的组织进行加工合成，例如，利用牛的肌腱提纯胶原纤维。然而现有技术中的所有组织工程支架普遍存在：缺乏有利于细胞贴附和生长的分子结构如：细胞粘附分子，层连蛋白，等；支架表面电荷数量和种类不适于细胞生长；抗原性强制入人体后，容易产生免疫排斥反应；在体内不容易降解；并且由于孔隙率和孔隙大小的问题，细胞不容易在支架内均匀分布；以及生产成本较高等问题。
羊膜是一种量大，价格低廉的人体组织，由上皮层、基膜层、致密层、纤维母细胞层和海面层组成。羊膜的抗原性低，可以无限制地使用。上世纪初就用来修复皮肤，上世纪后50年羊膜用来修复角膜缺损和制作人工阴道，在多年的临床实践中羊膜展现了良好的组织相容性。羊膜无血运，基膜层、致密层无细胞成分，延展性好、机械强度高是天然的组织工程支架，但是由于羊膜的一面被柱状上皮细胞覆盖，另一面有纤维母细胞嵌入无法种植其它细胞。Tseng等(2001)将纤维母细胞种于海面层，由于对侧仍然带有上皮层细胞，无法向体内移植，因此无法用来做组织工程支架。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的问题，而提供一种利用羊膜制作组织工程支架以及羊膜脱细胞的方法。该羊膜脱细胞方法能将羊膜的上皮细胞层的细胞和纤维母细胞层的细胞脱掉，而羊膜脱细胞后可以作为人体各个器官和各种组织的组织工程支架，也可以作为基因治疗和要物缓释治疗时包裹转基因细胞和分泌细胞因子细胞的半透膜材料。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
羊膜组织工程支架的特征在于，支架是去除了上皮细胞层的上皮细胞和纤维母细胞层的纤维母细胞的羊膜，或是去除了上皮细胞层的上皮细胞的羊膜。
一种专用于制造羊膜组织工程支架的羊膜脱细胞方法，其特征在于至少包括以下步骤：
(1)用0.2-5％的胰蛋白酶溶液，在37℃温度下浸泡羊膜20-30分钟；
(2)固定羊膜进行搅拌冲洗，将羊膜上皮细胞层的上皮细胞和纤维母细胞层的纤维母细胞冲掉。
羊膜在脱细胞后光学显微镜下：上皮层、海面层脱落，纤维母细胞层部分脱落，基膜层、致密层保留。免疫组织化学显示：I型、II型、III型胶原染色阳性，Fibronectin，Laminin染色阳性。电镜显示：孔隙大小和孔隙率均适合细胞生长。
纤维软骨细胞、软骨细胞、成骨细胞、血管内皮细胞、肝细胞、胰岛细胞、雪旺氏细胞在羊膜上生长良好。
有益效果
本发明羊膜组织工程支架及羊膜脱细胞方法，使用羊膜做组织工程支架来源充足，不会产生免疫反应；而本发明提供的羊膜脱细胞方法简单，便于批量生产，成本低。是组织工程支架研究中的一大进步，为组织工程大规模产业化创造了前提条件，具有巨大的经济效益和良好的社会效益。
具体实施方式
如何将羊膜的上皮细胞层和纤维母细胞脱掉，是羊膜作为组织工程支架材料的关键，也是本发明所解决的关键问题。
例如用以下方法给羊膜脱细胞，可以得到去除了上皮细胞层的上皮细胞的羊膜：
(1)用0.2％的胰蛋白酶(trypsin)溶液，在37℃温度下浸泡羊膜25分钟，或是取在0.2-5％浓度胰蛋白酶溶液，浸泡20-30分钟的范围内的任何组合；
(2)固定羊膜，在浸泡过程中或浸泡后进行搅拌冲洗，将羊膜上皮细胞层的上皮细胞和纤维母细胞层的纤维母细胞冲掉，如果冲洗不完全可以用细胞刮子刮去剩余的表层细胞。
用以下方法给羊膜脱细胞，可以得到去除了上皮细胞层的上皮细胞和纤维母细胞层的纤维母细胞的羊膜：
(1)用4.5％的胰蛋白酶(trypsin)溶液，在37℃温度下浸泡羊膜20分钟，或用0.2％的胰蛋白酶溶液，在37℃温度下浸泡羊膜25分钟，或是取在0.2-5％浓度胰蛋白酶溶液，浸泡20-30分钟的范围内的任何组合；
(2)固定羊膜，在浸泡过程中或浸泡后进行搅拌冲洗，将羊膜上皮细胞层的上皮细胞和纤维母细胞层的表浅纤维母细胞冲掉，如果冲洗不完全可以用细胞刮子刮去剩余的表层细胞；
(3)用5氟尿嘧啶和DNA酶等细胞核毒性药物毒杀埋在疏松纤维深层的纤维母细胞达到完全脱细胞的目的；
(4)用组织缓冲液反复冲洗脱细胞后的羊膜去除化学药品。
Claims (5)
1一种羊膜组织工程支架，其特征在于支架是去除了上皮细胞层的上皮细胞和纤维母细胞层的纤维母细胞的羊膜，或是去除了上皮细胞层的上皮细胞的羊膜。
2一种专用于制造羊膜组织工程支架的羊膜脱细胞方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)用0.2-5％的胰蛋白酶溶液，在37℃温度下浸泡羊膜20-30分钟；
(2)固定羊膜进行搅拌冲洗，将羊膜上皮细胞层的上皮细胞和纤维母细胞层的纤维母细胞冲掉。
3按照权利要求2所述的方法，其特征在于：
(1)用0.2％的胰蛋白酶溶液，在37℃温度下浸泡羊膜25分钟；
(2)固定羊膜进行搅拌冲洗，将羊膜上皮细胞层的上皮细胞和纤维母细胞层的表浅纤维母细胞冲掉；
(3)用5氟尿嘧啶和DNA酶细胞核毒性药物，浸泡毒杀埋在疏松纤维深层的纤维母细胞；
(4)用组织缓冲液反复冲洗脱细胞后的羊膜，去除化学药品。
4按照权利要求2所述的方法，其特征在于：
(1)用4.5％的胰蛋白酶溶液，在37℃温度下浸泡羊膜20分钟；
(2)固定羊膜进行搅拌冲洗，将羊膜上皮细胞层的上皮细胞和纤维母细胞层的表浅纤维母细胞冲掉；
(3)用5氟尿嘧啶和DNA酶细胞核毒性药物，浸泡毒杀埋在疏松纤维深层的纤维母细胞；
(4)用组织缓冲液反复冲洗脱细胞后的羊膜，去除化学药品。
5按照权利要求2或3或4所述的方法，其特征在于冲洗羊膜细胞不完全时，用细胞刮子刮去剩余的表层细胞。
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