CN1205333C - 羊膜组织工程支架羊膜完全脱细胞方法 - Google Patents

羊膜组织工程支架羊膜完全脱细胞方法 Download PDF

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Abstract

本发明是用作组织工程支架的一种羊膜组织工程支架羊膜完全脱细胞方法。该方法包括：用0.2-5%的胰蛋白酶溶液，在37℃温度下浸泡羊膜20-30分钟；固定羊膜进行搅拌冲洗，将羊膜上皮细胞层的上皮细胞和纤维母细胞层的纤维母细胞冲掉等步骤。本发明提供的羊膜脱细胞方法简单，便于批量生产，成本低。为组织工程大规模产业化创造了前提条件，具有巨大的经济效益和良好的社会效益。

Description

羊膜组织工程支架羊膜完全脱细胞方法
技术领域
本发明涉及制造人体器官和组织的组织工程领域，特别是一种羊膜组织工程支架羊膜完全脱细胞方法。
背景技术
组织工程是用生物工程学方法制作人体组织和器官的科学，其中支架(供细胞生长的细胞外基质)是组织工程方法的一个重要方面。由于其广阔的应用前景和逐年以几何基数递增的产业效益，各国政府和产业界都投入巨资进行研究和产业建设。目前已经出现的组织工程支架包括有：1.化学合成支架(如：壳聚糖、氨基多糖、碳纤维等)；2.生物提取物(如：从牛跟腱提取的I型和II型胶原，纤维蛋白等)；3.自然衍发基质(如：用尸体的皮肤、阔筋膜、头发、羊膜制作支架)。近年来的研究发现：化学合成类支架和生物提取物支架不含有能与体外细胞表面整合素相结合的分子，因此细胞在这两种支架上的生存和行为与体内不同，被称为2D细胞外基质或2D支架。用这两种支架制作的组织工程产品是不合乎要求的。对于第三种：自然衍发基质(3D基质)，它含有细胞所需要的各种整合素生物信息，因此用自然衍发基质制作组织工程支架是最佳方案。
在已知的可以用来制作3D支架的原料中羊膜是公认的抗原性很低的材料，且来源广泛，成本几乎是零。但在现有技术中，在不使用氨水等可以破坏生物信息物质条件下，均不能将羊膜的细胞完全脱干净，特别是不能脱掉羊膜上的成纤维细胞。因此这种脱细胞羊膜只能用作角膜的替代物和起到防止粘连的作用。CN1332017A公开了一种ZQ生物膜制备方法，但是它在对羊膜脱细胞的过程中必须使用氨水。由于氨水会改变胶原和生物大分子的理化性状，使羊膜失去了自然衍发基质的优越性，不能正常发挥运载细胞的功能，因此也不能很好地满足作为组织工程支架的需要。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的问题，而提供一种羊膜组织工程支架羊膜完全脱细胞方法。该方法可以在不使用氨水等破坏生物信息物质的条件下，将羊膜上的所有细胞都脱掉，从而为生物工程学方法制作人体组织和器官提供合格的组织工程支架。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种羊膜组织工程支架羊膜完全脱细胞方法，其特征在于该方法由以下步骤组成：
(1)用0.2-5％的胰蛋白酶溶液，在37℃温度下浸泡羊膜20-30分钟；
(2)固定羊膜进行搅拌冲洗，将羊膜上皮细胞层的上皮细胞和纤维母细胞层的纤维母细胞冲掉；
(3)用5氟尿嘧啶和DNA酶细胞核毒性药物，浸泡毒杀埋在疏松纤维深层的纤维母细胞；
(4)用组织缓冲液反复冲洗脱细胞后的羊膜，去除化学药品。
另一种羊膜组织工程支架羊膜完全脱细胞方法，其特征在于该方法由以下步骤组成：
(1)用0.2-5％的胰蛋白酶溶液，在37℃温度下浸泡羊膜20-30分钟；
(2)固定羊膜进行搅拌冲洗，将羊膜上皮细胞层的上皮细胞和纤维母细胞层的纤维母细胞冲掉；
(3)用细胞刮子刮去羊膜剩余的表层细胞；
(4)用5氟尿嘧啶和DNA酶细胞核毒性药物，浸泡毒杀埋在疏松纤维深层的纤维母细胞；
(5)用组织缓冲液反复冲洗脱细胞后的羊膜，去除化学药品。
羊膜在脱细胞后光学显微镜下：上皮层、海面层脱落，纤维母细胞层部分脱落，基膜层、致密层保留。免疫组织化学显示：I型、II型、III型胶原染色阳性，Fibronectin，Laminin染色阳性。电镜显示：孔隙大小和孔隙率均适合细胞生长。
纤维软骨细胞、软骨细胞、成骨细胞、血管内皮细胞、肝细胞、胰岛细胞、雪旺氏细胞在羊膜上生长良好。
有益效果
本发明提供的羊膜组织工程支架羊膜完全脱细胞方法，其方法简单，便于批量生产，成本低。是组织工程支架研究中的一大进步，为组织工程大规模产业化创造了前提条件，具有巨大的经济效益和良好的社会效益。
具体实施方式
如何将羊膜的上皮细胞层和纤维母细胞脱掉，是羊膜作为组织工程支架材料的关键，也是本发明所解决的关键问题。
例如可以用以下方法给羊膜脱细胞：
(1)用0.2％的胰蛋白酶(trypsin)溶液，在37℃温度下浸泡羊膜25分钟，或是取在0.2-5％浓度胰蛋白酶溶液，浸泡20-30分钟的范围内的任何组合；
(2)固定羊膜，在浸泡过程中或浸泡后进行搅拌冲洗，将羊膜上皮细胞层的上皮细胞和纤维母细胞层的纤维母细胞冲掉，如果冲洗不完全可以用细胞刮子刮去剩余的表层细胞。
也可以用以下方法给羊膜脱细胞：
(1)用4.5％的胰蛋白酶(trypsin)溶液，在37℃温度下浸泡羊膜20分钟，或用0.2％的胰蛋白酶溶液，在37℃温度下浸泡羊膜25分钟，或是取在0.2-5％浓度胰蛋白酶溶液，浸泡20-30分钟的范围内的任何组合；
(2)固定羊膜，在浸泡过程中或浸泡后进行搅拌冲洗，将羊膜上皮细胞层的上皮细胞和纤维母细胞层的纤维母细胞冲掉，如果冲洗不完全可以用细胞刮子刮去剩余的表层细胞；
(3)用5氟尿嘧啶和DNA酶等细胞核毒性药物毒杀埋在疏松纤维深层的纤维母细胞达到完全脱细胞的目的；
(4)用组织缓冲液反复冲洗脱细胞后的羊膜去除化学药品。

Claims (6)

1一种羊膜组织工程支架羊膜完全脱细胞方法，其特征在于该方法由以下步骤组成：
(1)用0.2-5％的胰蛋白酶溶液，在37℃温度下浸泡羊膜20-30分钟；
(2)固定羊膜进行搅拌冲洗，将羊膜上皮细胞层的上皮细胞和纤维母细胞层的纤维母细胞冲掉；
(3)用5氟尿嘧啶和DNA酶细胞核毒性药物，浸泡毒杀埋在疏松纤维深层的纤维母细胞；
(4)用组织缓冲液反复冲洗脱细胞后的羊膜，去除化学药品。
2按照权利要求1所述的方法，其特征在于：在(1)步骤，用0.2％的胰蛋白酶溶液，在37℃温度下浸泡羊膜25分钟。
3按照权利要求1所述的方法，其特征在于：在(1)步骤，用4.5％的胰蛋白酶溶液，在37℃温度下浸泡羊膜20分钟。
4一种羊膜组织工程支架羊膜完全脱细胞方法，其特征在于该方法由以下步骤组成：
(1)用0.2-5％的胰蛋白酶溶液，在37℃温度下浸泡羊膜20-30分钟；
(2)固定羊膜进行搅拌冲洗，将羊膜上皮细胞层的上皮细胞和纤维母细胞层的纤维母细胞冲掉；
(3)用细胞刮子刮去羊膜剩余的表层细胞；
(4)用5氟尿嘧啶和DNA酶细胞核毒性药物，浸泡毒杀埋在疏松纤维深层的纤维母细胞；
(5)用组织缓冲液反复冲洗脱细胞后的羊膜，去除化学药品。
5按照权利要求4所述的方法，其特征在于：在(1)步骤，用0.2％的胰蛋白酶溶液，在37℃温度下浸泡羊膜25分钟。
6按照权利要求4所述的方法，其特征在于：在(1)步骤，用4.5％的胰蛋白酶溶液，在37℃温度下浸泡羊膜20分钟。
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