KR20210005562A - 탈세포화된 세포외 골 기질을 함유한 하이드로겔로 보강된 탈세포화된 골 생체재료 - Google Patents

탈세포화된 세포외 골 기질을 함유한 하이드로겔로 보강된 탈세포화된 골 생체재료 Download PDF

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브레노 발렌팀 노게이라
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카를로스 마그노 다 코스타 마란두바
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데 올리베이라 자이로 핀토
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Abstract

본 발명은, 효과적인 기계적 및 생물학적 지원을 제공할 수 있으며; 아울러 다른 생체재료의 개발, 치료 및 연구에서 골 이식편, 생물반응기 또는 벡터로 사용할 경우, 세포주, 나노화합물 또는 약물로 보강될 수 있는, 탈세포화된 동물 골 조직으로부터 개발되고 겔 형태의 세포외 골 기질로 코팅된 생체재료에 관한 것으로; 즉, 미립자 형태 또는 블록으로서 제공/사용되는, 골 조직을 특이적으로 자극하는 물질로 코팅 및 보강된, 조작가능하며 안전하고 비-면역원성인 탈세포화된, 동결건조된, 다공성의, 견고한 골 재료로부터 개발된 것이며, 따라서, 생물반응기로서 사용시 시험관내 성숙한 또는 전구 세포주의 발생을 촉진할 수 있으며, 생체내 이식편으로 사용시 골결손부를 채우고 골절의 반흔화 (cicatrization) 과정을 통합 및 가속화할 수 있는 입증된 능력을 가지며; 본 생체재료는 또한 골 조직의 세포외 유기 기질의 온전성이 유지된다는 점에 기반하여 세포 발생을 촉진하고, 반흔화 시간을 개선하고, 비용을 절감하고, 생체재료의 탈세포화된 유기 기질의 생물공학적 중요성, 연구 필요성 및 이용가능성을 입증하는 기초 연구에 과학적으로 기여할 수 있다.

Description

탈세포화된 세포외 골 기질을 함유한 하이드로겔로 보강된 탈세포화된 골 생체재료
본 발명은 세포외 골 기질 하이드로겔로 보강된 탈세포화된 골 생체재료에 관한 것이며, 보다 상세하게는 미립자 또는 블록 형태로 제공/사용되는, 골 조직에 특이적인 자극 물질로 코팅 및 보강된, 탈세포화된, 동결건조된, 다공성의 견고한, 조작가능한, 안전한, 비-면역원성 골 생체재료로부터 독점적으로 개발된, 천연 생체재료에 관한 것이다. 즉, 이 물질은 생물반응기로서 사용되는 경우 시험관내 성숙한 세포주 또는 전구 세포주의 개발을 촉구할 수 있으며, 생체내 골 이식편으로서 사용되는 경우 골절 치유 및 골결손 충진에 있어 우수한 통합 능력과 빠른 속도를 달성한다.
지금까지, 골 조직의 재생에 있어, 자신의 골 이식 (자가이식)에 이어, 인간 사체의 뼈 (동종이식) 또는 동물의 뼈를 이용하는 방식은, 뼈의 결함을 치료 및 교정하는 있어 최상의 결과를 거두고 있는, 가장 일반적으로 사용되는 대안이다. 동종이식 및 이종이식의 임상적인 효과를 능가하기 위한 새로운 방법을 탐색하는 것 역시 여전히 조직 생물공학의 도전 과제로 남아있다 (SHRIVATS; MCDERMOTT; HOLLINGER, 2014).
이상적인 골 조직 프래임워크를 제조하기 위해, 가장 중요한 기준들 중 한가지는, 생산물이 세포 이동, 유체 교환 및 궁극적으로 조직 증식과 혈관형성에 충분한 큰 크기를 가진 고도로 상호연결된 다공성 네트워크로 구성되어야 한다는 점이다. 그러나, 세포 발생에 유리한 것만으로는 충분하진 않으며, 면역 반응을 유발하지 않을 뿐만 아니라, 골 조직의 생리학적 역할 측면에서, 결함 부위에 이식된 생체재료는 뼈의 기능적인 압박 자극과 관련있는 기계적 하중을 견딜 수 있어야 한다 (GRUSKIN et al., 2012).
탈단백질화되거나 (deproteinized) 및/또는 동결건조된 생체재료는 천연 뼈 및 산호로부터 제조되며, 대규모로 이용되어 왔다. 이는 다공성 구조로서 본래 물질의 특성을 이어받는 이점이 있지만, 점진적인 어닐링 (최대 300℃) 및 후속적인 동결건조에 의해 모든 유기 물질이 제거되어, 조직 재생에 있어 다수의 중요 물질들과 자극 인자들이 없어지게 된다. 이러한 유형의 다공성 무기 물질은 여러가지 치과 및 정형외과적 활용에서 광범위한 허용성을 획득하였지만, 순수한 미네랄 및 골전도성 프래임워크 (osteoconductive framework)임에도 불구하고 관련한 골유도 특성이 없어 골 재생을 개선하지 못한다. 이러한 맥락에서, 탈세포화된 뼈 재생 물질, 예를 들어, Bio-oss®는 "잠행성 치환 (creeping substitution)" 세포 과정에 의해 상대적으로 약한 임상 효과를 나타내어, 넓은 골 결함부에서의 이용은 제한적이다 (LEI et al., 2015). 하지만, 미국에서만도 이러한 통상적인 뼈 이식 제품의 사용에 한하여 연간 10억 달러 이상이 시장에서 거래되고 있다 (GRUSKIN et al., 2012).
현재, 뼈 대체재로서 사용되는 다양한 생체재료들이 개발되고 있으며, 보다 광의적으로는 천연적으로 유래되거나 또는 합성된 구성성분을 포함하는 무기 및 유기 물질로 분류되고 있다. 베타-포스페이트 트리칼슘 (0-TCP), 하이드록시아파티트 (HA) 및 생활성 유리 세라믹 (Bioglass®, BonAlive®)과 같은 무기 물질은, 뼈 자체의 무기 원소들과의 구조 및 조성 측면에서의 유사성으로 인해, 골 조직 공학의 목적으로 사용되어 왔다. 이들 무기 생체재료는 심지어, 골 조직과 비슷하거나 또는 이를 능가하는, 골전도성 및 압축성 (compression capacity) 잠재성 측면에서도 유용하지만, 본질적으로 취약한 구조를 가지고 있어, 높은 하중을 견뎌야 하는 생물학적 용도에 대해 항상 큰 관심을 받아왔다 (FERNANDEZ- YAGUE et al., 2015).
무기 물질의 대안은 유기-천연 폴리머 또는 화학적 합성 물질이다. 이러한 대안 물질은 조직 공학에서의 이용을 촉구하는 특징들을 가지고 있다. 천연 소스로부터 유래된 생체재료, 예를 들어 콜라겐, 히알루론산, 셀룰로스, 실크, 알기네이트 및 키토산은 일반적으로 생체적합성이 특징적이며, 자체 구조 내부에서의 세포 이동 및 부착이 가능하다. 콜라겐 스폰지는 특히 성장인자를 제공하고 골 재생을 촉진하기 위해 사용되고 있다. 천연 폴리머는 굉장한 다양성에도 불구하고, 주된 한계로 가공 및 정제 문제가 있으며, 면역원성 우려도 존재한다. 또한, 생산물 및 물질 배치의 변동 가능성 역시 클리닉에서 결과 예측가능성을 떨어뜨린다. 마지막으로, 천연 유래 유기 생체재료는 유기 및 무기 성분들을 모두 함유한 골 조직의 기계적 특성들을 겸비하지 못한다 (SHRIVATS; MCDERMOTT; HOLLINGER, 2014).
조직 공학 용도로 의도된 유기 폴리머의 합성 분야는 배치 편차를 최소화하기 위해 주로 프래임워크의 중합 기법과 관련하여 상당히 성장하였다. 특정 마이크로 및 마크로 규모의 특징을 가진 합성 생체재료들이 개발 중에 있다. 마이크로 규모의 특징으로는 조성, 아키텍처 및 연결 기 등이 있으며, 마크로 규모의 특징으로는 다공성, 강성 및 탄성 등이 있다. 조성과 관련하여, 골 조직의 생체재료를 재생하기 위해 흔히 합성되는 폴리머로는 특히 폴리락트산 (PLA), 폴리글리콜산 (PGA), PLGA, 폴리카프로락톤 (PCL), 폴리에틸렌 (PE), 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 및 메틸 폴리메타크릴레이트 (PMMA) 등이 있다. 합성 폴리머는 생물학에서 영감을 받았으며 매우 다재다능함에도 불구하고, 조직 재생의 모델로서 결함도 가지고 있다. 생활성의 결여는, 조직 세포외 기질 (ECM)에 대한 결합 도메인을 본래 가지고 있는 천연 유래 폴리머에서 관찰되는 바와는 반하는 방식으로, 생체재료와 숙주 간의 긍정적인 상호작용을 제한한다. 또한, 합성 폴리머의 분해 산물은 일반적으로 재생 공정을 방해할 수 있는 PLA 또는 PGA과 같은 산 부산물을 포함한다 (SHRIVATS; MCDERMOTT; HOLLINGER, 2014).
최근 들어, 골 재생용 프래임워크 개발을 기반으로 한 몇가지 연구들의 임상적인 성공은 무기 및 유기 생체재료의 상승적인 조합물 개발을 통해 단일상 생체재료에 의해 제기된 한계를 극복하는 것과 관련있는 것으로 보인다. 이런 의미에서, 이미 하이브리드 제품 연구에 흥미로운 진전이 이루어졌다. 유망한 스캐폴드의 제조는 유기 물질과 무기 물질을 조합함으로써 달성되었으며, 이로써 기존의 단순 골전도성 물질에 일부 골유도 능력을 골결손 부위에서 요구되는 압축 강도와 함께 부여하는, 생체적합한 모델이 구축가능하게 되었다. 예를 들어, 콜라겐 나노섬유와 폴리카프로락톤 미세섬유 (PCL)의 조합이, 콜라겐의 부착 특성 또는 PCL의 기계적 저항성의 손상없이, 달성되었다. 생체재료와 성장인자의 성공적인 조합인 InFuse® 제품에서 볼 수 있는 바와 같이, 바이오몰더 (biomolder)에서 키토산 및 하이드록시아파티트의 혼합물로, 세포 증식 및 새로운 골 형성을 지원하기 위한 기계적 특성, 다공성 및 생활성을 갖춘 재료가 개발되었다. 콜라겐, 성장인자 또는 골 형태형성 단백질 (BMP), 특히 골 분화 (osteogenic differentiation)를 촉진하는 BMP-2 소스로 보강된 미네랄 소재도 이미 존재한다. 그러나, BMP의 입증된 효능에도 불구하고, 낮은 생물 반감기, 전신 부작용 및 손상부에서의 빠른 소거로 인해 임상적인 적용은 여전히 어렵다. 최근, 연구는, 골 형성을 개선할 뿐 아니라 원치않은 반응을 제한하기 위해, BMP의 치료 타겟으로부터 원거리 확산을 최소화하는 전달 시스템에 대해 집중되고 있다. 산물들이 조합된 생체재료에 대한 다른 예는 콜라겐 및 HA, PGA 및 βTCP를 포함하며, 특히 PEG, PCL, 콜라겐 및 나노-HA의 조합이 특히 흥미롭다 (SHRIVATS; MCDERMOTT; HOLLINGER, 2014).
조직 재생용 생체재료를 제조하는 주요 목적 중 하나는 손상부에 필요한 생리학적 기능을 지원 및 촉진하는 것이다. 일반적으로, 이는 재생 세포 집단의 이동 및 특수화를 위한 이상적인 프래임워크를 제공하는 것뿐 아니라 세포외 기질 성분 (ECM) 및 국소 성장인자의 격리 (sequestration)도 제공해준다. 이러한 다차원적인 지원은 고착 (fixation), 고정 (anchorage), 분화, 증식 및 세포 기능적인 역량에 우호적으로 작용한다. 포유류 조직의 세포외 기질을 단리하여, 탈세포화하고, 이를 스캐폴드로서 사용할 수 있다는 것은 공지되어 있으며, 여러가지 조직들의 기능적인 복구를 촉진하는 것으로 이미 입증된 바 있다. ECM의 구조 리모델링 기전 (constructive remodeling mechanism)은 숙주 조직 계면과 생물학적 스캐폴드에서 전구 세포의 모집, 세포 이동 및 증식의 촉진, 국지적인 혈관신생 및 우호적인 M2 대식세포 표현형의 촉진을 포함한다. ECM은 비-상동성 부위 (non-homologous site)에서 성공적으로 사용된 바 있지만, 최근 연구에서 특이성, 즉 생물학적 기질이 특정 조직으로부터 유래된 것일 경우 부가적인 기능 및 복합 조직 형성이 달성되는 것으로 입증되었다 (Sawkins et al., 2013). 또한, 다른 조직과 마찬가지로, 제조, 가공 및 입수 부위의 차이 외에도, 기능자의 연령 역시 ECM의 특성 및 이의 임상적인 성능에 상당한 영향을 미친다는 것도, 잘 알려져 있다 (BENDERS et al., 2013; SAWKINS et al., 2013; WILLIAMS et al., 2014).
이러한 맥락에서, 탈세포화된 골 기질 (DBM)이 기존 이식편의 한계를 극복하고 이식 부위에서 더욱 우수한 조직 특이성을 제공하기 위한 골 대체제로서 개발되었다. 전도성 소골편 (conductive ossicle) DBM은 동종이계 또는 이종의 뼈에서 미네랄 성분을 산 추출함으로써 제조되며, 이는 성장인자, 비-콜라겐성 단백질 및 1형 콜라겐을 함유한다 (SAWKINS et al., 2013). DBM의 골유도 효과는, 가변적이긴 하지만, 동물 실험들에서 충분히 입증되었으며, 다만 인간을 대상으로 하는 임상 실험에서는 이와 같은 정보가 부족한 편이다. 탈미네랄 공정의 최종 산물은 일반적으로 점성의 담체가 조합된 DBM 분말로서, 이것은 결함 부위의 교정시 연속성과 필수적인 물리적 지지를 제공하는데 효과적이지 않기 때문에, 취급, 제형화 및 최소한의 임상 사용을 도모하기 위한 것이다. 점성의 담체는 일반적으로 소듐 히알루로네이트 또는 카르복시메틸셀룰로스와 같은 수용성 폴리머, 또는 글리세롤과 같은 무수 혼화성 용매이며, 이는 신독성 효과를 가질 수도 있다. 비히클의 사용이 DBM의 효능에 미치는 효과를 조사하기 위한 실험은 제한적이다. 지금까지 알려진 사실은, 여러가지 비히클의 사용뿐 아니라 현탁물내 DBM의 양과 관련있을 수 있는 골형성 활성 (osteogenic activity) 측면에서 차이가 있으며, 골 재생을 촉진하기에 충분한 기간 동안 골결손 부위에서 DBM 입자를 전달하는 비히클의 능력 측면에서도 차이가 있는 것으로 보인다는 것이다. 최근 연구에서 4가지 시판 골 이식 대체제에 대해 염증 반응이 규명되었으며, DBM 재료 3종이 합성 하이드록시아파티트 화합물에 비해 염증을 더 많이 유발하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, DBM 재료 또는 비히클이 염증성 반응을 유발한 것인지는 확정되지 않았다 (GRUSKIN et al., 2012; CHENG; SOLORIO; ALSBERG, 2014).
점점 증가하는 특수 스캐폴드의 개발이 조직 공학의 치료학적 성공에 핵심인 것으로 보이는 것처럼, 시간, 공간 및 생물학적 자극 투여 매개변수 (biologically stimulating dosing parameter)를 갖춘 복수의 성장인자들의 이용가능성 역시 성공적인 재생 요법의 개발에 중요하다는 것은 분명해 보인다. 적절한 투여시 약물 전달 및 순차적인 성장인자 전달을 가능하게 할 수 있는 증가하고 있는 보강된 생체재료들의 개선이 배아발생시 자연적으로 이루어지는 골 재생 과정을 재현하고 골절을 치유하는데 핵심일 수 있다 (SHRIVATS; MCDERMOTT; HOLLINGER, 2014).
현재까지, 조직 생물공학에서 골 조직 재생을 위한 확실한 요법은 확립되지 않았으며, 생체재료를 세포 사용과 통합한 제품도 없는 실정이다 (SHRIVATS; MCDERMOTT; HOLLINGER, 2014). 골 재생을 위한 새로운 효과적인 대체물에 대한 임상 연구에서, 세밀하게 보존된 탈세포화된 골 세포외 기질의 사용, 및/또는 조직 재생의 치료학적 가능성 및 잠재적인 부산물로서의 세포를 보강하는 방법이 우선시된 바 없지만, 임상적으로 작용할 수 있는 몇가지 가능성이 제기되었다 (LI et al., 2015). 차세대 골 재생용 생체재료는 골결손을 물리적으로 지원할뿐 아니라 성장인자 및 세포 존재를 화학적으로 생화학적으로 지원할 수 있어야 한다 (PAUL et al., 2016).
통제된 환경에서 조작되는 3가지 요소, 즉 줄기 세포, 성장 인자 및 스캐폴드가 추가되는, 생물반응기와 같은 기법의 개발이, 생체외 조직 구축을 실제 가능케 하는데 기여하였다. 3D 배양시 제공되는 자극은 세포 분화 및 거동을 지시하여, 생체내 이식용 특수 조직을 생산할 수 있다. 기법 및 제품 품질의 표준화와 관련해 여전히 문제들이 있지만, 이러한 기법에 의해 제공되는 이점, 특히 이식편의 혈관화에 대한 지식이 더 유망한 제품 및 요법을 구축하는데 핵심일 수 있으므로, 생물반응기의 임상 사용에 진전이 있을 것으로 기대된다. (BARTNIKOWSKI et al., 2014).
생물반응기 기법을 넘어선, 차세대 생체외 조직 생산 기법은, 천연 및 합성 폴리머뿐 아니라 무기 재료를 조합하여 열가소성 플라스틱, 하이드로겔 및 더 복잡한 컴포지트 프래임워크를 포함한 생체재료를 제조할 수 있는 컴퓨터-제작 패브릭 기법 (computer-fabricated fabric technology)의 진전을 통해 이루어질 수 있으며, 배분 기법의 해상도 (resolution)에 의해서만 제한되는 이의 아키텍처 및 조성을 정확하게 제어할 수 있을 것이다. 이는 현행 방법으로는 접근할 수 없는 성과로, 각 환자에게 특이적인 기하학적 매개변수를 갖춘 스캐폴드 및 조직을 생산할 기회를 열어줄 수 있다. 제작되는 크기 및 조직 공학 3요소의 기능적인 융합을 위해서는 기초 연구들이 지속적으로 진행되어야 한다 (FERNANDEZ-YAGUE et al., 2015).
마지막으로, 골 증식을 촉진하는 생체재료 개발에 대한 끊임없는 연구에서, 필요성에도 불구하고 현재까지 연구에서 일부 임상 성공을 거둔 주목할만한 제품들이 존재하더라도, 어떤 것도 임계 크기 결함을 치료하는 능력 측면에서 자가, 상동적인 또는 이종의 이식편의 효과를 능가하진 못한다. 일부 생체적합성을 가진 수종의 생체재료들이 개발되었지만, 천연 골 세포외 기질의 다공성 네트워크를 가능한 비슷하게 모방하도록 고안되더라도, 여전히 구조 및 기능 측면에서 천연 뼈와는 비교되지 않는다 (SHRIVATS; MCDERMOTT; HOLLINGER, 2014).
전술한 사용 기법들을 감안하여, 다음과 같은 주요 한계 및 단점을 파악할 수 있다:
- 자가이식 기증자에 대한 제한적인 이용가능성 및 높은 이환율;
- 골 은행 재료의 낮은 이용성 및 품질;
- 냉동/동결건조된 동종이계이식편 및 이종이식편에 의한 면역 거부 가능성 및 질환 전파 위험 가능성;
- 기존 요법에서 만족스럽지 못한 불리한 임상 결과 가능성;
- 무기 생체재료의 상대적으로 낮은 임상 효과 및 낮은 골유도성;
- 일부 재료들의 기계적 압축을 지탱하는 능력 부족 및 취약성;
- 제품의 배치 품질 및 제조 기법의 표준화 부족;
- 성장인자의 적절한 품질 및 이용가능성을 보장하는 제품의 부족;
- 세포 함유를 허용하는 기술이 통합된 제품 부족;
- 복수의 성장인자가 포함된 화합물 제품의 부족;
- 특정 기원의 골 조직으로 된 안전한 제품의 부족;
- 특정 기원의 골 조직으로부터 제조된 안전한 제품의 부족;
- 특정 연령의 골 조직으로부터 제조된 안전한 제품의 부족;
- 탈세포화된 골 기질로 된 안전한 제품의 부족;
- 환자, 손상 또는 생물학적 목적 각각의 타입에 따른 맞춤형 제품의 부족;
- 검증된 기존 생물반응기의 낮은 효율성;
- 시험관내 연구 목적을 가진 제품의 부족;
- 특히 성장인자가 조합된 하이브리드 제품의 비싼 가격.
이런 의미에서, 파악된 문제들을 해결하거나 또는 심지어 극복하기 위해, 골 세포외 기질 하이드로겔로 보강된 탈세포화된 골 생체재료가 개발되었다. 이것은, 탈세포화된 동물 골 조직으로부터 개발되고, 효과적인 기계적 및 생물학적 지원을 부여할 수 있는 겔 형태의 골 세포외 기질로 코팅되며, 기타 생체재료의 처치, 연구 및 개발에서 골 이식편, 생물반응기 또는 비히클로서 사용되는 경우에, 세포주, 나노복합재료 또는 약물로 추가적으로 보강된, 생체재료이다. 본 발명의 생산물은, 기타 기법과는 다르게, 처음부터 골 조직의 유기 세포외 기질의 온전성 (integrity)을 유지함으로써 세포 발달을 촉진하기 위해 개발되었으며, 치유 시간을 개선하고, 단가를 줄이고, 생체재료에서 탈세포화된 유기 매트릭스의 생물공학적 중요성, 조사 필요성 및 적용가능성을 입증하는 기초 연구에 과학적으로 기여할 수 있다.
세포외 골 기질 하이드로겔로 보강된 탈세포화된 골 생체재료 (decellularized bone biomaterial enriched with bone extracellular matrix hydrogel)는 첨부된 하기 도면에 따른 상세한 설명을 통해 더 잘 이해될 수 있다.
도 1은 세포외 골 기질을 함유한 하이드로겔로 보강된 탈세포화된 골 생체재료의 탈세포화 공정에서, 용액내 액침 전 (좌) 및 액침 후 (우) 골 조직 단편의 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 세포외 골 기질을 함유한 하이드로겔로 보강된 탈세포화된 골 생체재료의 동결건조된 입자 (좌) 및 탈세포화된 골 기질의 하이드로겔 (우) 사진을 나타낸 것이다.
도 3은 세포외 골 기질을 함유한 하이드로겔로 보강된 탈세포화된 골 생체재료에서, 탈세포화된 골 생체재료의 8x (a), 12.5x (b) 및 20x (c) 배율의 입체현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 4는 세포외 골 기질을 함유한 하이드로겔로 보강된 탈세포화된 골 생체재료에서, 50x (A), 100x (b), 200x (c) 및 350x (d) 배율의, 탈세포화된 골 생체재료의 주사 현미경 사진을 나타낸 것이다.
도면에서, 탈세포화된 세포외 기질 하이드로겔로 보강된 탈세포화된 골 생체재료는, 탈세포화된, 동결건조된, 다공성의 견고한, 조작가능한, 안전하고 비-면역원성의, 골 조직에 특이적인 자극 물질로 코팅 및 보강된, 미립자 또는 벌크 형태로 제공/사용되는, 뼈로부터 독점적으로 개발된 천연 생체재료에 해당하며, 이는 건강 과학 (Medicine, Veterinary Medicine and Dentistry) 및 생물공학에서 산업적인 생산 및 기초 과학에서 활용 잠재성을 가진다. 이것은 생물반응기로서 사용될 경우 시험관내 성숙한 또는 전구 세포주의 발생을 촉진할 수 있으며, 생체내 이식편으로서 사용될 경우 골절 치유 및 골결손부를 채우는 데 있어 우수한 통합력 및 더욱 빠른 속도를 나타낸다.
본원에서, 수집되는 동물 뼈는 원산지 규제/인증 (연방 농림 축산 자원부 검사청 - SIF / MAPA / 브라질)된 것이며, 도축장에서 수집되어 실험실로 이송된 것이다. 수집한 뼈를 클리닝 및 해체한 후, 골 조직의 특정 영역을 선택하여, 유기 세포외 기질과 존재하는 조직의 물리적, 생물학적 및 형태기능적 특징을 최대한으로 보존하기 위해 처리한다. 선택 조직은 샘플 DNA의 양이 50 ng 미만이 될 때까지 24-96시간 동안 200-500 rpm으로 교반하면서 디터전트 용액 (트리톤 1-3%, 소듐 도데실 설페이트-SDS 0.1-2.5% 또는 기타)에 액침 처리한다. 탈세포화 후, 수득되는 고체 기질을 완충액 (PBS pH 7.4-7.8 또는 기타)으로 반복 세척하고, 25-50℃의 온도 제어 하에 적어도 12-48시간 오븐 건조한 후, 동결건조, 에틸렌 옥사이드에서의 살균 처리 및 겔 코팅을 위한 보존 처리를 진행한다.
동일한 수집 재료로부터 탈세포화된 골 세포외 기질 겔을 제조한다. 골 조직을 선별한 후, 액체 질소에서 냉동한 재료를 작은 단편으로 분쇄하거나 또는 분말이 될 때까지 분쇄한다. 그런 후, 200-500 rpm로 실온에서 24-96시간 동안 산 용액 (0.1-2.5 N HCl 또는 기타) 중에 교반하여 탈미네랄화를 수행한 다음, 증류수로 잘 헹군다. 이를 건조한 후, 클로로포름/메탄올 용액에서 200-500 rpm으로 실온에서 1-3시간 교반하면서 탈기 처리한 다음 증류수로 잘 헹군다. 이를 건조한 후, 200-500rpm으로 37℃에서 12-48시간 교반하면서, 샘플 DNA가 50 ng 미만이 될 때까지, 효소 용액 (0.01%-0.5% 트립신 및0.01-0.2% EDTA 또는 기타)에 액침한다. 그 후, 1% 항생제 및 항진균 용액 (스트렙토마이신/페니실린, 젠타마이신 또는 기타)을 첨가하여 200-500rpm으로 4℃에서 12-48시간 교반한다.
그 후, 내용물을 배양하여 오염 검사를 수행하고, 동결건조한 다음 냉동시설에서 -80℃에서 보관한다. 무균 동결건조물에 대해, 펩신의 산성 용액 (HCl 0.01-0.1 N) 0.5-2.5mg/mL을 이용한 효소 분해를, 실온에서 48-120시간 동안 자기 교반하에 수행한다. 그런 다음, 분해된 물질로 지칭되는 물질을 냉동시설에 넣어 -80℃에서 보관한다. 분해된 물질에 대해, 0.05-0.5N NaOH 용액 및 완충액 (PBS pH 7.4-7.8 또는 기타)을 4℃에서 첨가하여, 중화한다. 이를, 하이드로겔 형성을 위해, 37℃에서 적어도 1-6시간 둔다.
탈세포화된 물질, 고체 기질 및 겔이 제조되면, 하이드로겔이 내부에 존재하는 구멍을 채워 물질 전체를 코팅할 수 있도록, 탈세포화된 기질 자체로부터 만들어진 겔에 고체 기질을 침지함으로써, 생체재료를 제조한다. 그 후, 생체재료를 동결건조한 후 -80℃의 냉동시설에서 넣어 사용시까지 보존할 수 있다.
전술한 기술 설명과 바람직한 구현예 및 특허 출원 이후의 가능한 실현예들을 감안하여, 제한하지 않는 방식을 따르며, 본 발명의 보호 범위를 벗어나지 않는 한에서 등가의 건설적인 변형이 있을 수 있다.

Claims (11)

  1. 탈세포화된 세포외 골 기질을 함유한 하이드로겔로 보강된 탈세포화된 골 생체재료 (decellularized bone biomaterial enriched with a hydrogel containing decellularized extracellular bone matrix)로서,
    천연 동물 또는 인간의 뼈, 성체, 어린이, 신생아 또는 태아의 뼈로부터 수득되며, 클리닝 (cleaning), 분류 (sorting), 분쇄 (grinding), 액침 (immersion), 세척 (washing), 건조 (drying), 동결-건조 (freeze-drying) 및 동결 (freezing)로 된 여러가지 단계 이후에, 화학적 및 효소적 탈세포화 공정을 거치는 것을 특징으로 하는, 탈세포화된 세포외 골 기질을 함유한 하이드로겔로 보강된 탈세포화된 골 생체재료.
  2. 제1항에 있어서,
    특정 연령의 공여자로부터 수집된 물질을 이용한 탈세포화 공정으로부터 수득되는 것을 특징으로 하는, 탈세포화된 세포외 골 기질을 함유한 하이드로겔로 보강된 탈세포화된 골 생체재료.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    골막 (periosteum), 골내막 (endosteum), 성장대 (growth zone), 다양한 골화 (ossification) 영역, 관절면 (articular surface)과 같은 골 조직, 치밀골, 해면골 (spongy bone), 뼈속질 공간 (medullary canal) 또는 다른 부위와 같은 특정 영역으로부터 수집된 물질을 이용한 탈세포화 공정으로부터 수득되는 것을 특징으로 하는, 탈세포화된 세포외 골 기질을 함유한 하이드로겔로 보강된 탈세포화된 골 생체재료.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    조직의 세포외 기질을 보존하기 위한, 트리톤, 소듐 도데실 설페이트 (SDS), 아비에트아미도메틸-다이에틸암모늄 아세테이트 (Abietamidomethyl-diethylammonium Acetate) 또는 유사 물질과 같은 디터전트를 여러가지 농도로 단독으로 또는 조합 사용한 탈세포화 공정으로부터 수득되는 것을 특징으로 하는, 탈세포화된 세포외 골 기질을 함유한 하이드로겔로 보강된 탈세포화된 골 생체재료.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    겔화된 또는 건조된 탈세포화된 세포외 기질 하이드로겔 코팅으로부터 수득되는 것을 특징으로 하는, 탈세포화된 세포외 골 기질을 함유한 하이드로겔로 보강된 탈세포화된 골 생체재료.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    분말 형태의 골 이식편으로서, 다양한 입도 분포를 가진 과립물로서, 블록 또는 겔 형태의 제시물로서 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는, 탈세포화된 세포외 골 기질을 함유한 하이드로겔로 보강된 탈세포화된 골 생체재료.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    동물 및/또는 인간의 치과 시술, 발치, 절제술 (rhizectomy), 3벽성 골 결함 (three-wall bone defect), 골 분화구 (bone craters), 깊고 좁은 헤미-셉틱스 (deep and narrow hemi-septics), 치근간 결함 (inter-root defect)에 사용하기 위한, 및 추출 (extract), 골 증대술 (bone augmentation) 또는 이식술 (implantology)에 대한 기타 기법과 조합하여 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는, 탈세포화된 세포외 골 기질을 함유한 하이드로겔로 보강된 탈세포화된 골 생체재료.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    여러가지 골격 부위에서의 동물 및/또는 인간의 정형외과 시술, 골 증대, 골절 교정 및/또는 골결손 (bone defects)에 사용되는 것임을 특징으로 하는, 탈세포화된 세포외 골 기질을 함유한 하이드로겔로 보강된 탈세포화된 골 생체재료.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    지정된 적응증 (indicated indication)에 사용하기 적합한 나노복합재료(들), 합성 약물(들) 및/또는 기타 부형제(들)와 조합되는 것을 특징으로 하는, 탈세포화된 세포외 골 기질을 함유한 하이드로겔로 보강된 탈세포화된 골 생체재료.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    간엽 (mesenchymal), 전구 세포 (progenitor) 또는 성숙 세포의 배양물 또는 계통 (lineage)을 개발/확립하는데 있어 조직 조작 어플리케이션을 위한 프래임워크 또는 생물반응기로서 사용하기 위한 것임을 특징으로 하는, 탈세포화된 세포외 골 기질을 함유한 하이드로겔로 보강된 탈세포화된 골 생체재료.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    3D 프린팅에 공급원료 (feedstock)로서 사용되는 것을 특징으로 하는, 탈세포화된 세포외 골 기질을 함유한 하이드로겔로 보강된 탈세포화된 골 생체재료.
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