CN115996768A - 皮肤填充剂 - Google Patents

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R·希基
A·E·佩林
M·勒布朗·拉图尔
M·斯特罗巴奇
P·米尔曼
C·奥丁
P·C·德苏萨菲利亚蒂舍尔
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Abstract

本文提供了皮肤填充剂，包括从其中除去组织的细胞材料和核酸的去细胞化植物或真菌组织；及其用于化妆品和/或重建应用的方法和用途。还提供了用于制备这类皮肤填充剂的方法和皮肤填充剂试剂盒。

Description

皮肤填充剂
相关申请的交叉引用
本发明申请主张2020年6月8日提交的美国临时专利申请No.63/036,126的权益和优先权，该专利申请以其全部内容作为参考并入本文。
技术领域
本发明一般地涉及皮肤填充剂。更具体地，本发明涉及包含去细胞化的植物或真菌组织的皮肤填充剂。
背景技术
已开发了用于在皮肤下方注射，主要用于化妆品应用的多种皮肤填充剂产品。注射位置可以基于具体化妆品应用改变；用皮内注射处理浅表皱纹，而体积增大程序通常包括向深层真皮的注射。通常，一般避免向皮下脂肪注射。
皮肤填充剂产品通常可以分成两种不同类别：暂时性和永久性。暂时性皮肤填充剂通常由水凝胶，如胶原蛋白或透明质酸组成，其随时间缓慢吸收至体内。另一方面，目前唯一经FDA批准的永久性皮肤填充剂为BellaFillTM。BellafillTM由80％(v/v)的3.5％牛胶原蛋白I(w/v)和20％(v/v)30-40μm聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)微球组成。微球是由石化聚合物组成的坚硬、不可再吸收的颗粒。微球的目的是填充组织内的物理空间，并且提供细胞生长的永久性支持结构以及沉积逐渐替换吸收的牛胶原蛋白的天然天然胞外基质蛋白。BellafillTM已成为患者的普遍选择，因为它持久且通常仅需要1-2次治疗且很少或无需随访。
不幸地，在本领域中永久性皮肤填充剂通常包括可能永久性留在体内的合成材料，其可能具有某些风险，如潜在的过敏性反应，肉芽瘤和/或异物反应的可能。
替代性、其它和/或改善的皮肤填充剂、其方法和用途、及其生产方法是所期望的。
发明内容
本文提供了皮肤填充剂，其包含从中除去了组织的细胞材料和核酸的去细胞化的植物或真菌组织；及其用于化妆品和/或重建应用的方法和用途。还提供了用于制备这类皮肤填充剂的方法和皮肤填充剂试剂盒。
如本文所描述的，本发明人现已开发了包含去细胞化的植物或真菌组织的皮肤填充剂产品。本文所提供的数据表明皮肤填充剂具有优良的生物相容性，并且是显著不可再吸收的。描述了用于制备这类皮肤填充剂产品的方法，所述方法可以允许控制尺寸和多种其它有益性质，包括避免尺寸小于20μm的小的不期望的颗粒。通过小号针开发了具有优良可注射性/注射能力的制剂，以及与载体流体，如水凝胶相容且与麻醉剂相容的制剂。还描述了灭菌技术和灭菌产品。描述了具有所期望的形状和表面积/体积/装填性质，从而在受试者中促进细胞侵入/生长和/或提供优良的天然组织与皮肤填充剂的比例的皮肤填充剂产品颗粒。
在一个实施方式中，本文提供了不可再吸收的皮肤填充剂，其包含从中除去所述组织的细胞材料和核酸的去细胞化植物或真菌组织。
在上述皮肤填充剂的另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以是基于几丁质、基于壳聚糖、基于木质纤维素或者基于纤维素的。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以来源于植物的叶状结构、根、果肉、隐头花序或果浆结构。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以来源于莴苣、胡萝卜、苹果或梨或它们的任意组合。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以匀浆化。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以干燥，进行研磨，并任选地重建或再水化。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以拆散成具有单一结构细胞尺寸或更小尺寸的颗粒。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述皮肤填充剂还可以包含用于去细胞化的植物或真菌组织的水凝胶、基质或载体流体。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述水凝胶、基质或载体流体可以包括PBS、盐水、透明质酸(交联或非交联的)、海藻酸盐、胶原蛋白、普卢兰尼克酸(例如，pluronic F 127)、琼脂、琼脂糖、纤维蛋白、羟基磷灰石钙、聚-L-乳酸、自体脂肪、硅酮、葡聚糖、甲基纤维素、溶解的再生纤维素或它们的任意组合。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述皮肤填充剂可以干燥或水合。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述皮肤填充剂可以包括利多卡因或其它麻醉剂。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以拆散成具有不规则3D形状和/或非球形、薄的片状结构的颗粒。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述片状结构可以具有约0.01至约100μm，例如约0.1μm的厚度。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以拆散成具有足够大的尺寸，从而不被一个或多个细胞吞噬的颗粒；优选地，所述去细胞化的植物或真菌组织可以拆散成具有至少约20μm的尺寸、直径或最小费雷特直径的颗粒。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以拆散成具有约20μm至约1000μm的范围内的尺寸、直径或费雷特直径的颗粒。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以拆散成具有小于约200μm的尺寸、直径或最大费雷特直径的颗粒。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以拆散成具有约20μm至约200μm的范围内的尺寸、直径或费雷特直径的颗粒。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以拆散成颗粒，所述颗粒的粒径、直径或费雷特直径分布在约30μm至约100μm内具有峰值。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以拆散成具有约30μm至约100μm的范围内的平均粒径、直径或费雷特直径的颗粒。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以拆散成具有小于约300μm的尺寸、直径或最大费雷特直径的颗粒。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以拆散成具有约100μm至约300μm的范围内的尺寸、直径或费雷特直径分布的颗粒。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以拆散成颗粒，所述颗粒的粒径、直径或费雷特直径分布在约100μm至约300μm内具有峰值。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以拆散成具有约100μm至约300μm的范围内的平均粒径、直径或费雷特直径的颗粒。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以拆散成平均投影颗粒面积在约200至约3000μm2的范围内或者约200至约300μm2的范围内的颗粒；其中所述去细胞化的植物或真菌组织拆散成表面积与体积比为约0.1至100μm-1的颗粒；其中所述去细胞化的植物或真菌组织拆散成堆积密度约4×105个颗粒/mL至约7×109个颗粒/mL的颗粒；或其任意组合。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述一种或多种皮肤填充剂可以具有小于约500,000cp的粘度。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述一种或多种皮肤填充剂可以具有约100,000cp至约200,000cp的范围内的粘度。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以灭菌。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述皮肤填充剂可以灭菌。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述灭菌可以通过γ辐照灭菌。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述灭菌可以通过高压灭菌。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以碱化。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述碱化可以通过与氢氧化钠和过氧化氢一起加热。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述皮肤填充剂可以配制用于真皮下注射、真皮深层注射、皮下注射(例如，皮下脂肪注射)或它们的任意组合。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，在注射器或注射装置中提供所述皮肤填充剂。
在另一个实施方式中，本文提供了如本文所描述的一种或多种皮肤填充剂中的任一种作为软组织填充剂，用于重建外科的用途或两者。
在另一个实施方式中，本文提供了如本文所描述的一种或多种皮肤填充剂中的任一种用于改善对其有需要的受试者的美容外观的用途。
在另一个实施方式中，本文提供了如本文所描述的一种或多种皮肤填充剂中的任一种用于在对其有需要的受试者中提高组织体积、去皱的用途或两者。
在另一个实施方式中，本文提供了在对其有需要的受试者中用于改善美容外观、提高组织体积、去皱或它们的任意组合的方法，所述方法包括：
将如本文所描述的一种或多种皮肤填充剂中的任一种施用或注射至对其有需要的区域；
借此改善受试者的美容外观、提高组织体积、去皱或它们的任意组合。
在上述一种或多种用途或者一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，受试者的天然细胞可以浸润皮肤填充剂。
在上述一种或多种用途或者一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述皮肤填充剂可以是不可再吸收的，从而所述去细胞化的植物或真菌组织可以在所述受试者内保持基本完整。
在上述一种或多种用途或者一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，通过向其添加一种或多种酶，所述皮肤填充剂可以是可降解的。
在上述一种或多种用途或者一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述植物或真菌组织可以是基于纤维素的，并且所述一种或多种酶包括纤维素酶。
在上述一种或多种用途或者一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述纤维素酶可以是来自木霉属的种(Trichoderma sp.)的纤维素酶。
在另一个实施方式中，本文提供了制备不可再吸收的皮肤填充剂的方法，其包括：
提供植物或真菌组织；
将所述植物或真菌组织去细胞化并降低尺寸以提供从中除去了所述组织的细胞材料和核酸的颗粒；和
任选地，将所述颗粒灭菌；
借此提供不可再吸收的皮肤填充剂。
在上述方法的另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以是基于几丁质、基于壳聚糖、基于木质纤维素或者基于纤维素的。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以来源于植物的叶状结构、根、果肉、隐头花序或果浆结构。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以来源于莴苣、胡萝卜、苹果或梨或它们的任意组合。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，降低尺寸可以包括降低机械尺寸以提供颗粒，任选地其中对干燥、冻干或冷冻干燥的材料进行所述降低机械尺寸。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述降低机械尺寸可以包括在去细胞化之前或之后挤压、挤出、研磨、磨碎、超声、静电纺纱、化学溶解、酶分解或剪切所述植物或真菌组织以提供所述颗粒。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，降低尺寸可以包括在去细胞化之前或之后干燥所述植物或真菌组织；对干燥的植物或真菌组织进行降低机械尺寸以提供所述颗粒；和任选地，使所述颗粒重建、再悬浮或再水化。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述降低尺寸可以提供具有单一结构细胞尺寸或更小尺寸的颗粒。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述方法还可以包括用水凝胶、基质或载体流体配制所述颗粒的步骤。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述水凝胶、基质或载体流体可以包括PBS、盐水、透明质酸(交联或非交联的)、海藻酸盐、胶原蛋白、普卢兰尼克酸(例如，pluronic F 127)、琼脂、琼脂糖、纤维蛋白、羟基磷灰石钙、聚-L-乳酸、自体脂肪、硅酮、葡聚糖、甲基纤维素、溶解的再生纤维素或它们的任意组合。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述皮肤填充剂可以以干燥或水合形式提供。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述方法还可以包括用利多卡因或其它麻醉剂配制的步骤。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述降低尺寸可以提供具有不规则3D形状和/或非球形、薄的片状结构的颗粒。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述片状结构可以具有约0.01至约100μm，例如约0.1μm的厚度。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述降低尺寸还可以包括挤出、过滤、离心或其它尺寸分离以获得具有目标尺寸的颗粒，目标尺寸范围内的颗粒或者具有目标尺寸分布的颗粒。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述降低尺寸可以提供具有约20μm至约1000μm的范围内的尺寸、直径或费雷特直径的颗粒。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述降低尺寸可以提供具有足够大的尺寸，从而不被一个或多个细胞吞噬的颗粒；优选地，所述降低尺寸可以提供具有至少约20μm的尺寸、直径或最小费雷特直径的颗粒。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述降低尺寸可以提供具有小于约200μm的尺寸、直径或最大费雷特直径的颗粒。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述降低尺寸可以提供具有约20μm至约200μm的范围内的尺寸、直径或费雷特直径分布的颗粒。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述降低尺寸可以提供颗粒，所述颗粒的粒径、直径或费雷特直径分布在约30μm至约100μm内具有峰值。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述降低尺寸可以提供具有约30μm至约100μm的范围内的平均粒径、直径或费雷特直径的颗粒。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述降低尺寸可以提供具有小于约300μm的尺寸、直径或最大费雷特直径的颗粒。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述降低尺寸可以提供具有约100μm至约300μm的范围内的尺寸、直径或费雷特直径分布的颗粒。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述降低尺寸可以提供颗粒，所述颗粒的粒径、直径或费雷特直径分布在约100μm至约300μm内具有峰值。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述降低尺寸可以提供具有约100μm至约300μm的范围内的平均粒径、直径或费雷特直径的颗粒。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述降低尺寸可以提供平均投影颗粒面积在约200至约3000μm2的范围内或者约200至约300μm2的范围内的颗粒；其中所述去细胞化的植物或真菌组织拆散成表面积与体积比为约0.1至100μm-1的颗粒；其中所述去细胞化的植物或真菌组织拆散成堆积密度约4×105个颗粒/mL至约7×109个颗粒/mL的颗粒；或其任意组合。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述降低尺寸可以包括研磨，同时使所得颗粒通过过滤器以获得小于上阈值尺寸的颗粒。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述方法还可以包括过滤、差速离心或平衡离心或者筛分以除去小于下阈值尺寸的颗粒，从而获得大于小阈值尺寸的颗粒。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，可以使用自动湿筛进行过滤或筛分。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述降低尺寸可以包括实施差速离心或平衡离心以获得具有目标尺寸的颗粒，目标尺寸范围内的颗粒或者具有目标尺寸分布的颗粒。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述方法还可以包括通过用处于流体，如水或缓冲液(例如，盐水)中的颗粒加载第一注射器或容器并用水凝胶、基质或载体流体加载第二注射器或容器来用水凝胶、基质或载体流体配制所述颗粒；所述第一和第二注射器或容器流体连通；并通过将所述注射器或容器的内容物在所述第一和第二注射器或容器之间来回通过进行混合。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述方法还可以包括使用尺寸排阻混合器通过将所述颗粒与水凝胶、基质或载体流体混合来用水凝胶、基质或载体流体配制所述颗粒。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述尺寸排阻混合器可以是静态混合器。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述方法还可以包括在去细胞化之前或之后将所述植物或真菌组织灭菌。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述方法还可以包括将所述皮肤填充剂灭菌。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述灭菌可以通过γ辐照灭菌。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述灭菌可以通过高压灭菌。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述灭菌可以包括多个灭菌步骤。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，其中第一灭菌步骤包括热处理。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述方法还可以包括将所述植物或真菌组织碱化。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，可以在所述去细胞化之后进行碱化。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述碱化可以包括用碱和过氧化物处理所述去细胞化的植物或真菌组织。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述碱可以是氢氧化物碱。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述过氧化物可以是过氧化氢。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述碱化可以包括用氢氧化钠水溶液和过氧化氢，同时加热来处理所述去细胞化的植物或真菌组织。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，在将过氧化氢加入至所述反应之前，可以用氢氧化钠水溶液处理所述去细胞化的植物或真菌组织第一时间段。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述过氧化物可以是30％至50％的水性过氧化氢储液。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，可以以至少约每500g去细胞化的植物或真菌组织75mL的量使用所述水性过氧化氢储液。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，在添加所述水性过氧化氢储液后，所述去细胞化的植物或真菌组织、碱和水性过氧化氢储液的混合物的过氧化物的浓度可以为约1％至约5％。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述碱可以是1M氢氧化钠溶液。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，可以以约每500g去细胞化的植物或真菌组织2500mL的量使用所述1M氢氧化钠溶液。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述方法还可以包括用一种或多种中和处理来中和pH。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述一种或多种中和步骤可以包括用HCl水溶液处理。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，可以通过加热至约80℃进行碱化。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，可以实施碱化至少约30分钟。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述方法还可以包括配制用于真皮下注射、真皮深层注射、皮下注射(例如，皮下脂肪注射)或它们的任意组合的皮肤填充剂。
在另一个实施方式中，本文提供了通过本文所描述的一种或多种方法中的任一种所制备的皮肤填充剂。
在上述皮肤填充剂的另一个实施方式中，所述皮肤填充剂可以是如本文所描述的一种或多种皮肤填充剂中的任一种。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，约0.1％至约5％或者更少的所述皮肤填充剂的颗粒可以具有小于约20μm的费雷特直径或者最小费雷特直径。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，小于约0.5％的所述皮肤填充剂的颗粒可以具有小于20μm的费雷特直径或最小费雷特直径。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，小于约0.1％至约5％(如小于约0.5％)或更少的所述皮肤填充剂的颗粒可以具有足够小的尺寸，从而被受试者的一个或多个细胞吞噬。
在另一个实施方式中，本文提供了试剂盒，其包含以下中的任何一种或多种：
如本文所描述的一种或多种皮肤填充剂中的任一种；
水凝胶、基质或载体流体；
PBS、盐水、透明质酸(交联或非交联的)、海藻酸盐、胶原蛋白、普卢兰尼克酸(例如，pluronic F 127)、琼脂、琼脂糖、纤维蛋白、羟基磷灰石钙、聚-L-乳酸、自体脂肪、硅酮、葡聚糖、甲基纤维素、溶解的再生纤维素或它们的任意组合；
利多卡因或其它化妆品；
一个或多个注射器，或另一种注射装置；
用于两个或更多个注射器的鲁尔锁配合件或联接器；
用于实施如本文所描述的一种或多种用途或者一种或多种方法中任一种的说明书；
一种或多种去细胞化试剂；
一个或多个容器、包装或器皿；
用于注射的一种或多种缓冲剂、水或盐水；
用于在不希望的区域或位置溶解皮肤填充剂的试剂或酶(例如，纤维素酶)；
或它们的任意组合。
附图说明
参考以下附图，将进一步理解这些及其它特性，其中：
图1显示了如实施例1所述的挤出的去细胞化纤维素糊(左图)，并且还显示了在用18G针加载所述糊后的1mL注射器(右图)；
图2显示了如实施例1所述，皮下注射到3个不同位点的基于纤维素的皮肤填充剂糊，其中(A)显示侧视图和(B)显示特写图。4周时，在植入物周围出现血管化(C)，并且在切除后，植入物保持其形状(D)；
图3显示在动物内8周后观察细胞浸润和基质沉积，如实施例1所述。所述纤维素填充剂似乎是生物相容的并且通常随时间维持球状形状。显示了8周皮下注射和Masson三色染色((A)、(C)中显示)和苏木精&伊红染色((B)、(D)中显示)(对于(A、B)比例尺＝2mm；对于(C、D)，比例尺＝200μm)；
图4显示了使用卡尺，从动物外部对植入物位点的手动测量结果，如实施例1所述。在8周研究期间，观察到植入物面积降低。然而，长径比(其在x和y轴上的宽度之比)未显著变化；
图5显示在8周研究期间，植入物高度显著降低～75％，如使用卡尺在动物外部所测量的，如实施例1所述。这与以上所观察到的注射位点面积减少相关；
图6显示了碾碎的干燥生物材料(左图)，和再水化的挤出的皮肤填充剂(右图)，如实施例2所述；
图7显示使用实施例2中所述的针方法，将生物材料充分剪切以获得至少一些单一完整结构细胞(例如，分离的细胞壁口袋)，所述结构细胞似乎完整形成并且未挤毁；
图8显示了作为时间函数的植入物高度，如实施例2所述。在多种制剂之间未观察到统计学显著差异。然而，应注意就HA和胶原蛋白浓度来说，它们与商品化产品相差显著，相差约10倍。与胶原蛋白/HA水凝胶的低w/v浓度一致，结果似乎与基于盐水的填充剂的表现类似，其导致～50％的高度降低；
图9显示作为时间函数，使用卡尺从动物外部所测量的植入物物质的计算体积，如实施例2所述。使用高度，x和y宽度并假设为半椭球体，计算植入物体积。在多种制剂之间未观察到统计学显著差异，并且符合与高度降低一致的趋势；
图10显示了在植入后3个月，30-50μm的PMMA微球体(白色圆形)。尽管在植入物周围生长了天然组织，但是组织中PMMA的体积分数很高。这表明该组织主要由合成材料组成，而不是天然细胞和蛋白；
图11显示了无菌样品处理。如实施例3所述，使用无菌材料和无菌技术实施了去细胞化方法的GLP形式；
图12显示了苹果来源的去细胞化纤维素骨架的冻干过程，如实施例3所述。(A)收集去细胞化材料并置于Falcon管中，并将通道压入材料中以蒸发/升华水蒸汽以使其逃逸。(B)将材料附接至冷冻干燥器。(C)在-46℃，0.05mbar下实施冷冻干燥48h。(D)显示了冻干材料最终产品；
图13显示将干燥的纤维素生物材料以18000、12000和6000rpm研磨成粉末，同时通过80μm过滤器，如实施例3所述。显示了处理后的收集托盘。使用最高RPM设置以减少处理时间。未观察到研磨速度对颗粒尺寸分布的可观察的影响(实施例3中所示的数据)；
图14显示了如实施例3所述的过滤法。(A)将通过80μm过滤器的得自研磨材料的粉末(B)通过45μm和25μm筛网湿筛(B)以限制粉末的尺寸范围(C)。通过离心将颗粒的尺寸范围集中在狭窄的范围内(D)。自动湿筛显著改善了处理时间和效率并且目前正在使用；
图15显示了如实施例3所述用刚果红染色的颗粒。将颗粒用0.1％刚果红染色并以2.5×(A，B)和10×(C，D)成像。(A，C)未过滤的颗粒。(B，D)过滤的颗粒。收集如这些的图像以定量粒径分布。通常，2.5×的10幅图像获得～1000个颗粒，这是统计学显著的样品尺寸；
图16显示了如实施例3所述的粒径分析。使用Fiji(ImageJ)对颗粒设阈并分割。(A，B)过滤的颗粒。(C，D)未过滤的颗粒。(A，C)设阈的图象。(B，D)来自尺寸分析的颗粒轮廓；
图17显示了过滤和未过滤的去细胞化苹果颗粒的粒径分析。将费雷特直径用于定量粒径。对于每个条件，从刚果红染色的颗粒的荧光显微镜图象分析N＝15幅图象。N未过滤＝2292，N过滤＝1595。平均值是统计学显著不同的(P＝7.4×10-55)；
图18显示了如实施例3所述，在高放大倍数(A-D)下去细胞化苹果粉末的SEM显微照片；
图19显示了手动图像处理以确定薄片直径，如实施例3所述。所述薄片是不规则形状的并且单一长度描述符不能记录这种复杂性(来源：去细胞化苹果)；
图20显示了如实施例3所述，来自去细胞化苹果的SEM的粒径分布。分布显示出47.11±1.11μm的峰值(N＝133个薄片)。得自SEM图像分析的分布比光学法要窄得多。然而，这种方法存在缺陷，如手动方法每次测量一个颗粒，从而导致小N值、颗粒角度取向的影响以及确信检测边缘的能力。这些问题使得这种方法对于表征粒径是不期望的；
图21显示了在如实施例3所述，自动湿筛过滤之前，以不同速度研磨去细胞化苹果之后所测量的粒径分布。在筛分前，通过以6000RPM(黑色)和18000(灰色)研磨产生颗粒。两种分布类似。对于6000和18000RPM，平均颗粒尺寸分别为73.07±0.58μm和73.50±0.56μm。值为平均值和s.e.m.。对于6000RPM，N＝2579，并且对于18000RPM，N＝2354。据发现平均粒径无显著性差异(P＝0.58)；
图22显示如实施例3所述，在具有指示标签贴纸的用于γ辐照的密封Nalgene瓶子中颗粒混悬液样品；
图23显示了如实施例3所述，得自Keyence数字显微镜的样品图象。鲜红色叠加图表示用于分析的颗粒；
图24显示了如实施例3所述，γ辐照(N＝3800)和非辐照(N＝4692)颗粒的颗粒区域；
图25显示了如实施例3所述，γ辐照(N＝3800)和非辐照(N＝4692)颗粒的颗粒最大直径的柱状图；
图26显示了如实施例3所述，γ辐照(N＝3800)和非辐照(N＝4692)颗粒的颗粒最小直径的柱状图；
图27显示如实施例3所述，通过差速离心所获得的苹果来源的颗粒的粒径分布。(A)显示了在通过手动筛分(45μm)初始排除大粒径后，未过滤的颗粒的尺寸分布，和(B)显示在以1000rpm离心1分钟，重复5次后的分布。为了收集所有材料，使用以5000rpm离心7分钟；
图28显示了如实施例3所述，使用AA(苹果)颗粒的体外细胞培养测试。蓝色＝3T3细胞核。在一些情况下，由于Hoechst 33342染色，大颗粒薄片也是明显的。红色＝在清洗掉疏松颗粒后，用0.01％刚果红染料染色的颗粒。(A，B)显示了对照。(C，D)＝对照和染料。(E，F)＝过滤的：25-45μm。(G，H)＝过滤的：25-45μm和染料。(I，J)＝未过滤的。(K，L)＝未过滤的和染料。比例尺＝250μm；
图29显示了使用如实施例3所述的海藻酸盐的可注射皮肤填充剂制剂。所述颗粒占体积的20％。测试了两种混合方法。(A)显示将粉末混合到水和海藻酸盐溶液中。(B)显示首先将粉末混合到水组分中，然后缓慢添加海藻酸盐。第一种方法混合不良并且堵塞针。第二种方法混合良好，但是未过滤的颗粒堵塞针。当用过滤颗粒代替未过滤颗粒时，混合物易于挤出；
图30显示了如实施例3所述，用注射器鲁尔锁接头混合皮肤填充剂组分。(A)显示在单个注射器中加载两种组分。澄清液体为1％的海藻酸盐，并且红色液体为在0.9％盐水和利多卡因(最终浓度＝0.3％)中混悬的颗粒。添加刚果红(最终浓度0.1％)用于显象。(B)显示鲁尔锁接头。(C)显示组分混合(总计通过60次)。(D)显示断开鲁尔锁并用针替换它用于挤出。注意，溶液不堵塞27G针；
图31显示了如实施例3所述的胶原蛋白填充剂。(A)显示BellaFill中PMMA珠的粒径分布。(B)显示在本发明所开发的皮肤填充剂中使用的刚果红染色的胶原蛋白显示出极少的第二非特异性染色。(C)显示了BellaFill的PMMA珠。(D)显示了在用刚果红染色的胶原蛋白皮肤填充剂中所使用的本发明开发的纤维素颗粒。注意：胶原蛋白的背景染色比来自纤维素颗粒的信号低。比例尺＝250μm；
图32显示了如实施例3中所述的皮肤填充剂注射结果。(A)显示了具有所画的隆起边缘的注射前情况和(B)显示了注射后情况。
图33显示了如实施例3所述，与20％的去细胞化苹果来源的过滤颗粒和0.3％利多卡因组合的基于盐水、透明质酸(HA)和胶原蛋白的填充剂的切除；
图34显示了如实施例3所述的植入物尺寸。AAS(蓝色)、AAHA(红色)、AAC(黑色)和BellaFill(紫色)植入物的高度。由于载体流体/水凝胶的吸收，所有植入物随时间收缩。AAS制剂快速吸收；
图35显示了如实施例3所述的植入物体积。AAS(蓝色)、AAHA(红色)、AAC(黑色)和BellaFill(紫色)植入物的体积。由于载体流体/水凝胶的吸收，所有植入物随时间收缩。AAS制剂快速吸收；和
图36显示了如实施例6所述，所得的苹果来源的颗粒的粒径分布；
图37显示了使用20％v/v苹果来源的颗粒溶液和C1C12细胞的体外细胞培养测试的显微镜图象，其中图37A显示了对照的显微镜图象，图37B显示了20％过滤颗粒样品的细胞的显微镜图象，和图37C显示了20％未过滤颗粒样品的细胞的显微镜图象，如实施例7所述；
图38显示了如实施例7所述，20％v/v过滤和未过滤苹果来源的颗粒样品的细胞浓度(细胞/mm2)；
图39显示了如实施例7所述，对照以及过滤和未过滤低浓度样品的细胞的表面积覆盖度；
图40显示了使用实施例8中所述的样品所建立的标准吸光度-浓度曲线；
图41显示了实施例8中所述的样品在450nm、475nm、500nm和525nm的吸光度的吸光度-浓度曲线；
图42显示了如实施例8所述，20％梨来源的颗粒储液和2M蔗糖对照溶液的波长扫描；
图43显示了实施例8中所述的样品在320nm的吸光度-浓度曲线；
图44显示了如实施例10所述，具有苹果来源的颗粒(HAAA)样品的HyStem HA的作用力-位移曲线；
图45显示了如实施例10所述的BellaFIll皮肤填充剂的作用力-位移曲线；
图46显示了如实施例10所述的稀释的HAAA样品的作用力-位移曲线；
图47显示了如实施例10所述的明胶(GE；无颗粒)样品的作用力-位移曲线，其中图47A显示了通过27G针的GE挤出的作用力-位移曲线，并且图47B显示了通过30G针的GE挤出的作用力-位移曲线；
图48显示了如实施例10所述，明胶和苹果来源的颗粒(GEAA)样品的作用力-位移曲线；
图49显示了如实施例10所述的稀释的GE样品的作用力-位移曲线，其中图49A显示了挤出前加热的稀释的GE的作用力-位移曲线，并且图47B显示了挤出前保持在室温的稀释的GE样品的作用力-位移曲线；
图50显示了如实施例10所述的海藻酸盐(AL；无颗粒)样品的作用力-位移曲线；
图51显示了如实施例13所述，在水或PBS中离心后碱化的苹果(AA)样品的干重％；
图52显示了实施例14中所述的样品的显微镜图象，其中图52A是AA：NaOH样品，图52B是1：2AA：NaOH样品并且图52C是1：1AA：NaOH样品；
图53显示了在实施例14中所述并且在图52中设想的样品的粒径分布；
图54显示了如实施例15所述，碱化AA和梨粉末混合物(在离心前)的显微镜图象，其中图54A显示了比例尺为500μm的显微镜图象，并且图54B显示了比例尺为100μm的显微镜图象；
图55显示了如实施例15所述，在将碱化AA和梨粉末混合物离心后所收集的上清液的显微镜图象，其中图55A显示了比例尺为500μm的显微镜图象，并且图55B显示了比例尺为100μm的显微镜图象；
图56显示了如实施例15所述，在将碱化AA和梨粉末混合物离心后所形成的小粒的显微镜图象，其中图56A显示了比例尺为500μm的显微镜图象，并且图56B显示了比例尺为100μm的显微镜图象；
图57显示了如实施例15所述，在筛分后碱化AA和梨粉末小粒样品的显微镜图象，其中图57A显示了比例尺为500μm的显微镜图象，并且图57B显示了比例尺为100μm的显微镜图象；
图58显示了如实施例15所述，在最终离心后碱化AA和梨粉末小粒样品的显微镜图象，其中图58A显示了比例尺为500μm的显微镜图象，并且图58B显示了比例尺为100μm的显微镜图象；
图59显示了图54至图58中所示的以2.5×采集的每幅显微镜图象的某些粒径的相对频率；
图60显示了图54至图58中所示的以2.5×采集的每幅显微镜图象的颗粒分布，其中图60A显示了在最终离心后小粒的粒径分布，图60B显示了筛分小粒的粒径分布，图60C显示了在第一次离心后小粒的粒径分布，图60D显示了上清液的粒径分布，并且图60E显示了初始碱化AA和梨粉末混合物的粒径分布；
图61显示了图54至图58中所示的以10×采集的每幅显微镜图象的某些粒径的相对频率；
图62显示了图54至图58中所示的以10×采集的每幅显微镜图象的颗粒分布，其中图62A显示了在最终离心后小粒的粒径分布，图62B显示了筛分小粒的粒径分布，图62C显示了在第一次离心后小粒的粒径分布，图62D显示了上清液的粒径分布，并且图62E显示了初始碱化AA和梨粉末混合物的粒径分布；
图63显示了如实施例16所述，在挤出前后碱化AA样品的粒径分布；
图64显示了如实施例17所述，水样、在0.9％盐水中稀释的20％(v/v)碱化、去细胞化AA(Mer20Sal80)制剂和碱化AA(Mer100)制剂的挤出的作用力-位移曲线，其中图64A显示了水样的作用力-位移曲线，图64B显示了Mer20Sal80制剂的作用力-位移曲线，并且图64C显示了Mer100制剂的作用力-位移曲线；
图65显示了图64中所示的作用力-位移曲线的最大挤出力；
图66显示了图64中所示的作用力-位移曲线的平均(平台)挤出力；
图67显示了如实施例17所述，通过27G针和30G针挤出的Mer100制剂的作用力-位移曲线；
图68显示了从标准1cc注射器和BellaFill注射器，通过27G针挤出的Mer100制剂的作用力-位移曲线；
图69显示了图67和图68中所示的作用力-位移曲线的最大挤出力；
图70显示了如实施例17所述，以1mm/s、2.5mm/s和5.0mm/s的十字头速度通过27G针挤出的Mer100制剂的作用力-挤出曲线；
图71显示了图70中所示的作用力-位移曲线的最大挤出力；
图72显示了如实施例18所述的GE和碱化AA制剂的作用力-位移曲线，其中图72A显示了5％ GE制剂的作用力-位移曲线，图72B显示了2.5％ GE制剂的作用力-位移曲线，图72C显示了1％ GE制剂的作用力-位移曲线，图72D显示了0.5％ GE制剂的作用力-位移曲线，并且图72E显示了0.25％ GE制剂的作用力-位移曲线；
图73显示了图72中所示的作用力-位移曲线的最大挤出力；
图74显示了实施例19中所述的碱化AA样品的应力和应变对应时间的图，其中图74A显示了未稀释的碱化AA样品的应力和应变对应时间的图，并且图74B显示了稀释的碱化AA样品的应力和应变对应时间的图；
图75显示了实施例19中所述的碱化AA样品的储能模量、损耗模量和损耗因数曲线，其中图75A显示了未稀释的碱化AA样品的储能模量(E')和损耗模量(E”)，图75B显示了未稀释的碱化AA样品的损耗因数曲线，图75C显示了稀释的碱化AA样品的储能模量(E')和损耗模量(E”)，图75D显示了稀释的碱化AA样品的损耗因数曲线；
图76显示了实施例20中所述的碱化AA样品的显微镜图象，其中图76A显示了在4℃储存的碱化AA样品的显微镜图象，并且图76B显示了在振荡培育箱中维持的碱化AA样品的显微镜图象；
图77显示了在实施例20中所述并且在图76中成像的碱化AA样品的粒径分布；
图78显示了在实施例20中所述并且在图76中成像的碱化AA样品颗粒的圆形度(circularity)和圆度(roundness)分布，其中图78A显示了碱化AA样品的圆形度分布，并且图78B显示了碱化AA样品的圆度分布；
图79显示了如实施例26所述，在基于纤维素的皮肤填充剂上从酶活力所产生的D-葡萄糖在540nm和570nm波长下的标准吸光度-浓度曲线；
图80显示了如实施例26所述，在37℃，在不同缓冲剂中使用稀释的酶溶液产生的D-葡萄糖的浓度；
图81显示了如实施例26所述，在37℃，在不同缓冲剂中使用稀释的果胶酶：纤维素酶比所产生的D-葡萄糖的浓度；
图82显示了如实施例26所述，在37℃，使用不同的酶浓度所产生的D-葡萄糖的浓度；
图83显示了如实施例26所述，在培育48小时之后在不同的酶浓度中纤维素来源的颗粒的显微镜图象；
图84显示了如实施例26所述，在37℃，使用不同浓度的果胶酶：纤维素酶比所产生的D-葡萄糖的浓度；
图85显示了如实施例26所述，在培育48小时之后以不同的果胶酶：纤维素酶比的纤维素来源的颗粒的显微镜图象；
图86显示了如实施例26所述，使用不同浓度的新鲜酶溶液所产生的D-葡萄糖的浓度；
图87显示了如实施例26所述，在培育48小时之后在不同的新鲜的酶溶液中纤维素来源的颗粒的显微镜图象；
图88显示了如实施例26所述，使用不同浓度的预先制备的酶溶液所产生的D-葡萄糖的浓度；
图89显示了如实施例27所述，根据本发明公开的一些实施方式，采集自注射了皮肤填充剂的大鼠的切除的照片，其中图89B显示了注射透明质酸(HA)皮肤填充剂制剂的大鼠的切除，并且图89C显示了注射胶原蛋白皮肤填充剂制剂的大鼠的切除；
图90显示了如实施例27所述，在12周后所注射的盐水皮肤填充剂制剂的显微镜图象，其中图90A以1×放大倍数显示了使用Masson三色(MT)染色的注射盐水制剂的显微镜图象，图90B以10×放大倍数显示了MT染色的注射盐水制剂的显微镜图象，图90C以20×放大倍数显示了MT染色的注射盐水制剂的显微镜图象，图90D以1×放大倍数显示了用苏木精和伊红(HE)染色的注射盐水制剂的显微镜图象，图90E以10×放大倍数显示了HE染色的注射盐水制剂的显微镜图象，并且图90F以20×放大倍数显示了HE染色的注射盐水制剂的显微镜图象；
图91显示了如实施例27所述，在12周后所注射的HA皮肤填充剂制剂的显微镜图象，其中图91A以1×放大倍数显示了MT染色的注射HA制剂的显微镜图象，图91B以10×放大倍数显示了MT染色的注射HA制剂的显微镜图象，图91C以20×放大倍数显示了MT染色的注射HA制剂的显微镜图象，图91D以1×放大倍数显示了HE染色的注射HA制剂的显微镜图象，图91E以10×放大倍数显示了HE染色的注射HA制剂的显微镜图象，并且图91F以20×放大倍数显示了HE染色的注射HA制剂的显微镜图象；
图92显示了如实施例27所述，在12周后所注射的胶原蛋白皮肤填充剂制剂的显微镜图象，其中图92A以1×放大倍数显示了MT染色的注射胶原蛋白制剂的显微镜图象，图92B以10×放大倍数显示了MT染色的注射胶原蛋白制剂的显微镜图象，图92C以20×放大倍数显示了MT染色的注射胶原蛋白制剂的显微镜图象，图92D以1×放大倍数显示了HE染色的注射胶原蛋白制剂的显微镜图象，图92E以10×放大倍数显示了HE染色的注射胶原蛋白制剂的显微镜图象，并且图92F以20×放大倍数显示了HE染色的注射胶原蛋白制剂的显微镜图象；
图93显示了如实施例27所述，在12周后并以10×放大倍数用刚果红染色的注射皮肤填充剂制剂的显微镜图象，其中图93A显示了注射盐水制剂，图93B显示了注射HA制剂，并且图93C显示了注射胶原蛋白制剂；
图94显示了如实施例27所述，在12周后并用CD31、CD45或Verhoefff Van Gienson(Verhoeff)染色剂染色的注射皮肤填充剂制剂的显微镜图象；
图95显示了通过实施例27中所述的皮肤填充剂制剂注射所形成的隆起高度随时间的变化；
图96显示了通过实施例27和28中所述的皮肤填充剂制剂注射所形成的隆起高度随时间的变化；和
图97显示了如实施例28所述，在12周后并用CD31、CD45或Verhoefff染色剂染色的注射皮肤填充剂制剂的显微镜图象。
具体实施方式
本文描述了皮肤填充剂，其用于化妆品和/或重建应用的方法和用途，以及制备这类皮肤填充剂的方法和与之相关的皮肤填充剂试剂盒。将理解出于旨在对于本领域技术人员说明性的目的提供实施方式和实施例，并且这些实施方式和实施例不旨在以任何方式进行限制。
本文提供了皮肤填充剂，其包括从中除去了组织的细胞材料和核酸的去细胞化的植物或真菌组织；及其用于化妆品和/或重建应用的方法和用途。还提供了用于制备这类皮肤填充剂的方法和皮肤填充剂试剂盒。
如本文所描述的，本发明人现已开发了包含去细胞化的植物或真菌组织的皮肤填充剂产品。本文所提供的数据表明皮肤填充剂具有优良的生物相容性，并且是显著不可再吸收的——即“永久性的”。描述了用于制备这类皮肤填充剂产品的方法，所述方法可以允许控制尺寸和多种其它有益性质，包括避免尺寸小于20μm的小的不期望的颗粒。通过小号针开发了具有优良可注射性/注射能力的制剂，以及与载体流体，如水凝胶相容且与麻醉剂相容的制剂。还描述了灭菌技术和灭菌产品。描述了具有所期望的形状和表面积/体积/装填性质，从而在受试者中促进细胞侵入/生长和/或提供优良的天然组织与皮肤填充剂的比例的皮肤填充剂产品颗粒。
皮肤填充剂通常使用用于化妆品和/或美容应用，如皱纹填充、改变外表或解决由于疾病或损伤所造成的软组织破坏的材料。在某些实施方式中，如本文所描述的皮肤填充剂产品可以被认为是“永久性的”，其中它们为这类应用提供了长期、天然且生物相容的解决方案。本领域中的多种皮肤填充剂是暂时性的。在特定的一段时间后，身体吸收常规皮肤填充剂。其它填充剂可以使用合成颗粒，如PMMA，以提供更长期的解决方案。在某些实施方式中，本发明所描述的方法可以提供将加工至皮肤填充剂的目标尺寸范围的基于纤维素的材料。这些可以由天然植物聚合物产生，并且由于人不具有分解纤维素的酶而可以是永久性的。如本文详细描述的，已成功产生了这类颗粒，所述颗粒处于所期望的目标尺寸范围。已在不同的皮肤填充剂制剂中使用了颗粒，并且已将所述颗粒注入大鼠模型。所述颗粒具有所期望的SA：V比，可以促进维管化，可以是生物相容的，并且可以提供主要由患者自身组织，而不是合成材料组成的组织。
在一个实施方式中，本文提供了不可再吸收的皮肤填充剂，其包含从中除去所述组织的细胞材料和核酸的去细胞化植物或真菌组织。
如将理解的，当它包含至少一种在受试者中植入后显著不可再吸收或持久的(例如，耐受降解)填充剂或颗粒组分时，皮肤填充剂可以被认为是不可再吸收的。举例来说，在某些实施方式中，如本文所描述的皮肤填充剂可以包含处于基于纤维素或含有纤维素的颗粒的形式的去细胞化植物组织，这可以被认为是显著不可再吸收的，因为人体缺乏降解纤维素的酶。在某些实施方式中，不可再吸收的皮肤填充剂可以包括一种或多种填充剂或颗粒组分，例如，它们在注入或植入后，在体内是永久、半永久或持久的。
如将理解的，除非另外说明，否则本文所使用的植物和真菌界的含义/定义基于Cavalier-Smith分类(1998)。
在某些实施方式中，所述植物或真菌组织可以包含一般地任何适合的植物或真菌组织或者含有适合于特定应用的适合的支架结构的部分。
在某些实施方式中，所述植物或真菌组织可以包含苹果隐头花序(Malus pumila)组织、蕨(Monilophytes)组织、萝卜(Brassica rapa)根组织、银杏分枝组织、马尾草(equisetum)组织、萱草(hermocallis)杂交叶组织、羽衣甘蓝(Brassica oleracea)茎组织、针叶树花旗松(Pseudotsuga menziesii)组织、仙人掌果(pitaya)肉组织、斑状长春花(Maculata Vinca)组织、水生莲花(Nelumbo nucifera)组织、郁金香(Tulipa gesneriana)花瓣组织、车前草(Musa paradisiaca)组织、西兰花(Brassica oleracea)茎组织、枫叶(Acer psuedoplatanus)茎组织、甜菜(Beta vulgaris)初生根组织、葱(Allium cepa)组织、兰科(Orchidaceae)组织、萝卜(Brassica rapa)茎组织、韭葱(Allium ampeloprasum)组织、枫树(Acer)树枝组织、芹菜(Apium graveolens)组织、葱(Allium cepa)茎组织、松树组织、芦荟组织、西瓜(Citrullus lanatus var.lanatus)组织、草甸排草(Lysimachianummularia)组织、仙人掌(cactae)组织、北极剪秋罗(Lychnis Alpina)组织、大黄(Rheumrhabarbarum)组织、南瓜肉(Cucurbita pepo)组织、龙血树(Asparagaceae)茎组织、紫露草(Tradescantia virginiana)茎组织、芦笋(Asparagus officinalis)茎组织、蘑菇(Fungi)组织、茴香(Foeniculum vulgare)组织、玫瑰(Rosa)组织、胡萝卜(Daucus carota)组织或梨(Pomaceous)组织。在标题为“来自植物和真菌的去细胞化细胞壁结构及其作为支架材料的用途(Decellularised Cell Wall Structures from Plants and Fungus and UseThereof as Scaffold Materials)”的WO 2017/136950的实施例18中描述了植物和真菌组织的其它实例，该专利以其全部内容作为参考并入本文。
在某些实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以是基于纤维素、基于几丁质、基于壳聚糖、基于木质素、基于木酚素、基于半纤维素或者基于果胶的或它们的任意组合。在某些实施方式中，所述植物或真菌组织可以包括来自苹果隐头花序(Maluspumila)组织、蕨(Monilophytes)组织、萝卜(Brassica rapa)根组织、银杏分枝组织、马尾草(equisetum)组织、萱草(hermocallis)杂交叶组织、羽衣甘蓝(Brassica oleracea)茎组织、针叶树花旗松(Pseudotsuga menziesii)组织、仙人掌果(pitaya)肉组织、斑状长春花(Maculata Vinca)组织、水生莲花(Nelumbo nucifera)组织、郁金香(Tulipa gesneriana)花瓣组织、车前草(Musa paradisiaca)组织、西兰花(Brassica oleracea)茎组织、枫叶(Acer psuedoplatanus)茎组织、甜菜(Beta vulgaris)初生根组织、葱(Allium cepa)组织、兰科(Orchidaceae)组织、萝卜(Brassica rapa)茎组织、韭葱(Allium ampeloprasum)组织、枫树(Acer)树枝组织、芹菜(Apium graveolens)组织、葱(Allium cepa)茎组织、松树组织、芦荟组织、西瓜(Citrullus lanatus var.lanatus)组织、草甸排草(Lysimachianummularia)组织、仙人掌(cactae)组织、北极剪秋罗(Lychnis Alpina)组织、大黄(Rheumrhabarbarum)组织、南瓜肉(Cucurbita pepo)组织、龙血树(Asparagaceae)茎组织、紫露草(Tradescantia virginiana)茎组织、芦笋(Asparagus officinalis)茎组织、蘑菇(Fungi)组织、茴香(Foeniculum vulgare)组织、玫瑰(Rosa)组织、胡萝卜(Daucus carota)组织或梨(Pomaceous)组织的组织或者通过直接基因组修饰或通过选择育种产生的遗传改变的组织，或它们的任意组合。
如还将理解的，植物或真菌组织的细胞材料和核酸可以包括胞内内容物，如细胞的细胞器(例如，叶绿体、线粒体)、细胞核、细胞核酸和/或细胞蛋白。这些可以从植物或真菌组织和/或从支架生物材料基本除去、部分除去或完全除去。将认识到在本文所描述的去细胞化的植物或真菌组织中仍可以存在痕量的这些组分。如还将理解的，本文中对去细胞化的植物或真菌组织的提及旨在反映已基本除去了在所述组织的植物或真菌来源中存在的这些细胞材料——这不排除以下可能性：在某些实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可能含有或包含随后引入或再次引入的一般任何种类(如动物或人细胞)的细胞、细胞材料和/或核酸。
多种方法可以用于生产如本文所描述的去细胞化的植物或真菌组织。举例来说，在某些实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以包括通过以下方式去细胞化的植物或真菌组织：热冲击、用去污剂(例如，SDS、Triton X、EDA、碱处理、酸、离子型去污剂、非离子型去污剂和两性离子去污剂)处理、渗透性冲击、冻干、物理溶胞(例如，流体压力)、电学破裂(例如，非热不可逆电穿孔)或者酶促消化或其任意组合。在某些实施方式中，如本文所描述的生物材料可以通过使用去细胞化方法得自植物和/或真菌，所述去细胞化方法可以包括任何一些方法，其(单独或组合)包括(但不限于)热冲击(例如，快速冷冻融化)、化学处理(例如，去污剂)、渗透性冲击(例如，蒸馏水)、冻干、物理溶胞(例如，加压处理)、电学破裂和/或酶促消化。
在某些实施方式中，去细胞化的植物或真菌组织可以包括已通过用去污剂或表面活性剂处理的去细胞化的植物或真菌组织。去污剂的实例可以包括(但不限于)十二烷基硫酸钠(SDS)、Triton X、EDA、碱处理、酸、离子型去污剂、非离子型去污剂和两性离子去污剂。
在其它实施方式中，去细胞化的植物或真菌组织可以包括已通过用SDS处理去细胞化的植物或真菌组织。在另一个实施方式中，可以通过用二价盐水溶液清洗从植物或真菌组织除去残余的SDS。二价盐水溶液可以用于使含有SDS胶束的盐残余物从溶液/支架中沉淀/崩解，并且dH2O、乙酸或二甲亚砜(DMSO)处理或超声处理可以用于除去盐残余物或SDS胶束。在某些实施方式中，二价盐水溶液的二价盐可以包括(例如)MgCl2或CaCl2。
在另一个实施方式中，可以通过用0.01至10％，例如约0.1％至约1％，或者例如，约0.1％ SDS或约1％ SDS的SDS在溶剂，如水、乙醇或另一种适合的有机溶剂中的溶液处理使植物或真菌组织去细胞化，并且可以使用浓度约100mM的CaCl2水溶液除去残余SDS，然后在dH2O中培育。在某些实施方式中，SDS溶液可以处于高于0.1％的浓度，其可以帮助去细胞化，并且可以伴随着增加清洗以除去残余SDS。在具体的实施方式中，可以通过用约0.1％SDS的SDS水溶液处理对植物或真菌组织去细胞化，并且可以使用约100mM浓度的CaCl2水溶液除去残余SDS，然后在dH2O中培育。
可以适合于生产如本文所描述的去细胞化的植物或真菌组织的去细胞化规程的其它实例可见于标题为“来自植物和真菌的去细胞化细胞壁结构及其作为支架材料的用途(Decellularised Cell Wall Structures from Plants and Fungus and Use Thereofas Scaffold Materials)”的WO 2017/136950，该专利以其全部内容作为参考并入本文。
在另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以是基于几丁质、基于壳聚糖、基于木质纤维素或者基于纤维素的。在另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以来源于植物的叶状结构、根、果肉、隐头花序或果浆结构。在另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以来源于莴苣、胡萝卜、苹果或梨或它们的任意组合。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以匀浆化。在另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以干燥，进行研磨，并任选地重建或再水化。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以拆散成具有单一结构细胞尺寸或更小尺寸的颗粒。在某些实施方式中，所述单一结构细胞可以来源于植物或真菌组织的延伸的3D结构，并且可以包含分离的结构细胞，具有通常类似中空细胞或口袋的3维结构的结构细胞，如图7所示。如将理解的，这些结构通常可以包含木质纤维素材料，如基于纤维素和/或木质素的结构。将理解在某些实施方式中，这些结构可以包含其它构建模块，例如几丁质和/或果胶。在某些实施方式中，所述单一结构细胞可以拆散(例如，研磨)成小颗粒，如薄片，如图18和19中所示。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述皮肤填充剂还可以包含用于去细胞化的植物或真菌组织的水凝胶、基质或载体流体。在某些实施方式中，所述水凝胶、基质或载体流体可以包括PBS(盐水)、透明质酸(交联或非交联的)、海藻酸盐、胶原蛋白、普卢兰尼克酸(例如，pluronic F 127)、琼脂、琼脂糖、纤维蛋白、羟基磷灰石钙、聚-L-乳酸、自体脂肪、硅酮、葡聚糖、甲基纤维素、溶解的再生纤维素或它们的任意组合。
应注意，如本文所使用的，术语“溶解的再生纤维素”是指已溶解并随后通过溶剂交换和与植物或真菌组织混合“再生”的纤维素。任何适合的溶剂可以用于溶解纤维素。例如，在一个实施方式中，可以使用LiCl和二甲基乙酰胺(DMAc)溶液溶解纤维素。
在某些实施方式中，例如，这些水凝胶、基质或载体流体可以是生物学来源的(例如，天然蛋白)、合成聚合物或天然存在的聚合物的合成类似物。
水凝胶、基质和/或载体流体的进一步讨论和实例可见于Nguyen等人“CosmeticMedicine:Facial Resurfacing and Injectables”,Plast Reconstr Surg.129,142e(2012)；和Luebberding等人“Critical Appraisal of the Safety of Dermal Fillers:APrimer for Clinicians”,Curr Derm Rep.2,150(2013)，以上每篇文献以其全部内容作为参考并入本文。
在某些实施方式中，例如，水凝胶、基质或载体流体可以用于再混悬皮肤填充剂颗粒以提供显著均一的分散系，并且允许通过小号针注射。
在某些实施方式中，可以根据需要调整所述皮肤填充剂的粘度。在某些实施方式中，例如，低粘度可以允许更容易的注射，然而高粘度可以更长时间地维持均一的颗粒布置和/或可以维持体积。在某些实施方式中，粘度值可以在一定范围内变动或可以改变—例如，在某些实例中，盐水载体可以提供约1cP，然而更粘稠的载体流体可以提供更高的粘度，如约3×106cP(如商品化产品，如Bellafill)或以外。
在其它实施方式中，所述皮肤填充剂可以具有小于约500,000cp的粘度。在某些实施方式中，所述皮肤填充剂可以具有约100,000cp至约500,000cp的范围内的粘度。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述皮肤填充剂可以干燥或水合。在某些实施方式中，例如，所述皮肤填充剂可以作为干燥或冻干形式提供，其可以用于在使用前，在水、水凝胶或其它载体流体中重建。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述皮肤填充剂可以包括利多卡因或其它麻醉剂。
在本文所描述的皮肤填充剂的某些实施方式中，例如，所述去细胞化的植物或真菌组织可以拆散成通常可以具有任何适合的形状，如规则或不规则3D或2D形状，例如，可以具有不规则、正方形或圆形形状的片状结构的颗粒。给定形状通常可以具有最小和最大直径或费雷特直径，尽管在一些情况下(如对于圆形结构)，这些可以是相等或接近相等的。优选地，在某些实施方式中，所述颗粒或至少大部分所述颗粒可以调整尺寸/形状至足够大，以避免或防止细胞吸收或被细胞吞噬。因此，在某些实施方式中，可以避免直径(无论是规则直径、最小费雷特直径和/或最大费雷特直径)小于20μm的颗粒分布，其中细胞吸收和/或吞噬是不期望的。
在本文所描述的皮肤填充剂的某些实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以拆散成具有不规则3D形状和/或非球形、薄的片状结构的颗粒。在某些实施方式中，所述片状结构可以具有约0.01至约100μm，例如约0.1μm的厚度。
在本文所描述的皮肤填充剂的一些实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以拆散成具有约20μm至约500μm的范围内的尺寸、直径或费雷特直径的颗粒。
在某些实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以拆散成尺寸足够大，从而不被一个或多个细胞吞噬的颗粒(优选地，所述去细胞化的植物或真菌组织可以拆散成具有至少约20μm的尺寸、直径或最小费雷特直径的颗粒)；可以拆散成具有小于约200μm的尺寸、直径或最大费雷特直径的颗粒；可以拆散成在约20μm至约200μm的范围内具有尺寸、直径或费雷特直径的颗粒；可以拆散成颗粒，所述颗粒具有在约30μm至约100μm内具有峰值的粒径、直径或费雷特直径分布；可以拆散成具有在约30μm至约100μm的范围内的平均粒径、直径或费雷特直径的颗粒；或其任意组合。
在另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以拆散成具有小于约300μm的尺寸、直径或最大费雷特直径的颗粒；可以拆散成在约100μm至约300μm的范围内具有尺寸、直径或费雷特直径分布的颗粒；可以拆散成颗粒，所述颗粒具有在约100μm至约300μm内具有峰值的粒径、直径或费雷特直径分布；可以拆散成在约100μm至约300μm的范围内具有平均粒径、直径或费雷特直径的颗粒；或其任意组合。
在本文所描述的皮肤填充剂的另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以拆散成平均投影颗粒面积在约200至约3000μm2的范围内或者约200至约300μm2的范围内的颗粒；所述去细胞化的植物或真菌组织可以拆散成表面积与体积比为约0.1至100μm-1的颗粒；所述去细胞化的植物或真菌组织可以拆散成堆积密度约4×105个颗粒/mL至约7×109个颗粒/mL的颗粒；或其任意组合。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以灭菌。在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述皮肤填充剂可以灭菌。在某些实施方式中，所述灭菌可以通过辐照，如通过γ辐照灭菌。
在另一个实施方式中，所述植物或真菌组织可以碱化。如将理解的，植物或真菌组织的碱化将所述植物或真菌组织拆散成组织/细胞组分(包括单一结构细胞，结构细胞组或两者)。在某些实施方式中，所述碱化可以使用碱/碱溶液和过氧化物。在某些实施方式中，可以同时或顺序使用不止一种处理或溶液。
在某些实施方式中，碱化可以包括至少一种使用碱溶液的处理。如将理解的，所述碱溶液可以包括一般地任何适合的碱，如能够渗透性冲击和/或破坏氢键作用和/或聚合物晶体结构以提取完整组织结构的任何适合的碱。如将理解的，特别是对于皮肤填充剂应用，根据需要，可以将所述碱选择为(例如)生理学存在的、易于冲掉的、无害的或它们的组合。在某些实施方式中，所述碱可以包括NaOH、KOH或它们的组合。在一个实施方式中，所述碱可以在适合的溶剂中溶解/混合以形成碱溶液。通常，所述溶剂可以包含水，尽管还考虑了其它溶剂或者溶剂组合(如，例如，水和乙醇的混合物)。所述碱溶液可以包含约0.1至10M的碱浓度，或者它们之间的任何浓度(任选地四舍五入至最近的0.1)或者覆盖这些浓度中任何两个之间的任何子范围。在某些实施方式中，所述碱浓度可以为约0.5M至3M，或者它们之间的任何值(任选地四舍五入至最近的0.1)或者覆盖这些浓度中任何两个之间的任何子范围。举例来说，在某些实施方式中，所述碱溶液可以包含浓度约0.5M-3M的NaOH的水溶液。如将理解的，根据需要，可以调整所述碱溶液以及处理条件(即加热、搅拌)以适合所期望的要提取的结构、所使用的植物或真菌组织等。
在某些实施方式中，碱可以包括选自下列的碱：碳酸盐；硝酸盐；磷酸盐；硫酸盐；氨；氢氧化钠；氢氧化钙；氢氧化镁；氢氧化钾；氢氧化锂；氢氧化锌；碳酸钠；碳酸氢钠；丁基锂；叠氮化钠；氨基钠；氢化钠；硼氢化钠；或者二异丙基氨基锂。基于所述碱，可以实施中和和/或清洗以除去残余的碱及其它试剂以防止(例如)不希望的污染。
在优选的实施方式中，所述碱化可以包括使用氢氧化钠和过氧化氢并加热的植物或真菌组织(优选地，去细胞化的植物或真菌组织)的处理。
然而，应注意可以使用并考虑其它提取技术。例如，在另一个实施方式中，可以浸渍所述植物和/或真菌组织。如将理解的，像碱化一样，植物或真菌组织的浸渍将所述植物或真菌组织拆散成组织/细胞组分(包括单一结构细胞，结构细胞组或两者)。然而，不同于碱化，浸渍通常包括酸性溶液的使用，而不是碱性溶液。因此，浸渍可以除去某些酸溶性木质素组分，而不是碱溶性木质素组分，并因此(例如)提供具有不同木质素含量的结构细胞。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，所述皮肤填充剂可以配制用于真皮下注射、真皮深层注射、皮下注射(例如，皮下脂肪注射)或它们的任意组合。在另一个实施方式中，在注射器或注射装置中或使用注射器或注射装置提供所述皮肤填充剂。
在另一个实施方式中，本文提供了如本文所描述的一种或多种皮肤填充剂中的任一种作为软组织填充剂，用于重建外科或两者的用途；用于改善对其有需要的受试者的美容外观的用途；在对其有需要的受试者中用于提高组织体积、去皱或两者的用途；或其任意组合。
在另一个实施方式中，本文提供了在对其有需要的受试者中用于改善美容外观、提高组织体积、去皱或它们的任意组合的方法，所述方法包括：
将如本文所描述的一种或多种皮肤填充剂中的任一种施用或注射至对其有需要的区域；
借此改善受试者的美容外观、提高组织体积、去皱或它们的任意组合。
在某些实施方式中，在施用/注射/植入后，所述受试者的天然细胞可以浸润皮肤填充剂。
在另一个实施方式中，所述皮肤填充剂可以是不可再吸收的，从而所述去细胞化的植物或真菌组织可以在所述受试者内保持(例如)至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月或者至少约6个月基本完整。
在另一个实施方式中，通过向其添加一种或多种酶，所述皮肤填充剂可以是可降解的。如以上所描述的，本发明公开所述的皮肤填充剂可以是不可再吸收的，从而所述去细胞化的植物或真菌组织可以在受试者内在一段时间内保持基本完整，并且在一些情况下，可以认为是永久性的。然而，将理解在一些情况下，可以期望除去所述皮肤填充剂。因此，在这些实施方式中，所述皮肤填充剂可以是通过使用施用或注射所述皮肤填充剂的受试者不产生的一种或多种酶降解所述去细胞化的植物或其真菌组织可除去的。
在某些实施方式中，可以基于去细胞化的植物或其真菌组织选择用于降解所述皮肤填充剂的一种或多种酶。例如：如本文之前所述，所述皮肤填充剂可以包含基于几丁质、基于壳聚糖、基于木质纤维素或基于纤维素的去细胞化的植物或真菌组织。因此，可以选择一种或多种酶以降解几丁质、壳聚糖、木质纤维素或纤维素。作为其它实例，如果所述植物或真菌组织是基于纤维素的，则所述一种或多种酶可以包含纤维素酶。
在某些实施方式中，所述一种或多种酶可以是来自不同来源的相同类型的酶。例如，所述一种或多种酶可以包含来自黑曲霉(Aspergillus niger)的纤维素酶和来自木霉属的种(Trichoderma sp.)的纤维素酶。在某些实施方式中，所述一种或多种酶可以包含不同的酶。例如，所述一种或多种酶可以包含纤维素酶和果胶酶(例如，来自黑曲霉(Aspergillus niger))。可以基于皮肤填充剂中所使用的去细胞化的植物或真菌组织选择酶的不同类型。此外，所述皮肤填充剂中所使用的去细胞化的植物或真菌组织的类型可能影响用于其降解的来源于不同来源的酶和/或不同类型的酶的比例。例如，在某些实施方式中，当选择来源于不同来源的两种酶和/或不同类型的酶时，则可以以约25：75至约50：50的比例使用所述酶。
在某些实施方式中，所述一种或多种酶可以提供于溶液中，如缓冲溶液中。所述缓冲溶液可以是PBS缓冲溶液、乙酸钠缓冲溶液、柠檬酸钠缓冲溶液或者任何其它适合的缓冲溶液。可以以约25：75至约75：25的酶：缓冲液之比在缓冲溶液中提供所述酶。
可以使用任何适合的技术施用所述一种或多种酶以降解所述皮肤填充剂。例如，可以将所述一种或多种酶的溶液注入先前已施用于受试者的皮肤填充剂中。
在另一个实施方式中，本文提供了制备不可再吸收的皮肤填充剂的方法，其包括：
提供植物或真菌组织；
将所述植物或真菌组织去细胞化并降低尺寸以提供从中除去了所述组织的细胞材料和核酸的颗粒；和
任选地，将所述颗粒灭菌；
借此提供不可再吸收的皮肤填充剂。
在某些实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以是基于几丁质、基于壳聚糖、基于木质纤维素或者基于纤维素的。在另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以来源于植物的叶状结构、根、果肉、隐头花序或果浆结构。在另一个实施方式中，所述去细胞化的植物或真菌组织可以来源于莴苣、胡萝卜、苹果或梨或它们的任意组合。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，降低尺寸可以包括降低机械尺寸以提供颗粒，任选地其中可以对干燥、冻干或冷冻干燥的材料进行所述降低机械尺寸。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述降低机械尺寸可以包括在去细胞化之前或之后挤压、挤出、研磨、磨碎、超声、静电纺纱、化学溶解、酶分解或剪切所述植物或真菌组织以提供所述颗粒。
在某些实施方式中，所述降低机械尺寸可以包括来自溶解材料的模制和成形颗粒，其可以重建/再生(例如，球化和/或乳液)。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，降低尺寸可以包括在去细胞化之前或之后干燥所述植物或真菌组织；对干燥的植物或真菌组织进行降低机械尺寸以提供所述颗粒；和任选地，使所述颗粒重建、再悬浮或再水化。在某些实施方式中，重建、再混悬或再水化可以包括引入水、盐水、水凝胶或另一种载体流体或与之混合。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述降低尺寸可以提供具有单一结构细胞尺寸或更小尺寸的颗粒。
在某些实施方式中，降低尺寸可以包括浸渍，如化学浸渍，以提供颗粒，或提供单一结构细胞，其可以任选地经受进一步处理以提供颗粒。在2020年5月14日提交的标题为“复合生物材料(Composite Biomaterials)”的PCT专利申请No.PCT/CA2020/050655中描述了浸渍方法的实例，该专利申请以其全部内容作为参考并入本文。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述方法还可以包括用水凝胶、基质或载体流体配制所述颗粒的步骤。在某些实施方式中，所述水凝胶、基质或载体流体可以包括PBS、盐水、透明质酸(交联或非交联的)、海藻酸盐、胶原蛋白、普卢兰尼克酸(例如，pluronic F 127)、琼脂、琼脂糖、纤维蛋白、羟基磷灰石钙、聚-L-乳酸、自体脂肪、硅酮、葡聚糖、甲基纤维素、溶解的再生纤维素或它们的任意组合。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述皮肤填充剂可以以干燥或水合形式提供。在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述方法还可以包括用利多卡因或其它麻醉剂配制的步骤。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述降低尺寸可以提供具有不规则3D形状和/或非球形、薄的片状结构的颗粒。在另一个实施方式中，所述片状结构可以具有约0.01至约100μm，例如约0.1μm的厚度。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述降低尺寸还可以包括挤出、过滤、离心或其它尺寸分离以获得具有目标尺寸的颗粒，目标尺寸范围内的颗粒或者具有目标尺寸分布的颗粒。例如，在一些实施方式中，所述降低尺寸可以提供具有约20μm至约1000μm的范围内的尺寸、直径或费雷特直径的颗粒。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，降低尺寸可以提供尺寸足够大以不被一个或多个细胞吞噬的颗粒(优选地，降低尺寸可以提供具有至少约20μm的尺寸、直径或最小费雷特直径的颗粒)；可以提供具有小于约200μm的尺寸、直径或最大费雷特直径的颗粒；可以提供具有在约20μm至约200μm的范围内的尺寸、直径或费雷特直径分布的颗粒；可以提供粒径、直径或费雷特直径分布在约30μm至约100μm内具有峰值的颗粒；可以提供平均粒径、直径或费雷特直径在约30μm至约100μm的范围内的颗粒；或其任意组合。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，降低尺寸可以提供具有小于约300μm的尺寸、直径或最大费雷特直径的颗粒；可以提供在约100μm至约300μm的范围内具有尺寸、直径或费雷特直径分布的颗粒；可以提供粒径、直径或费雷特直径分布在约100μm至约300μm内具有峰值的颗粒；可以提供具有在约100μm至约300μm的范围内的平均粒径、直径或费雷特直径的颗粒；或其任意组合。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述降低尺寸可以提供平均投影颗粒面积在约200至约3000μm2的范围内或者约200至约300μm2的范围内的颗粒；其中所述去细胞化的植物或真菌组织拆散成表面积与体积比为约0.1至100μm-1的颗粒；其中所述去细胞化的植物或真菌组织拆散成堆积密度约4×105个颗粒/mL至约7×109个颗粒/mL的颗粒；或其任意组合。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述降低尺寸可以包括研磨，同时使所得颗粒通过过滤器以获得小于上阈值尺寸的颗粒。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述方法还可以包括过滤、差速离心或平衡离心或者筛分以除去小于下阈值尺寸的颗粒，从而获得大于小阈值尺寸的颗粒。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，可以使用自动湿筛进行过滤或筛分。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述降低尺寸可以包括实施差速离心或平衡离心以获得具有目标尺寸的颗粒，目标尺寸范围内的颗粒或者具有目标尺寸分布的颗粒。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述方法还可以包括通过用处于流体，如水或缓冲液(例如，盐水)中的颗粒加载第一注射器或容器并用水凝胶、基质或载体流体加载第二注射器或容器来用水凝胶、基质或载体流体配制所述颗粒；所述第一和第二注射器或容器流体连通；并通过将所述注射器或容器的内容物在所述第一和第二注射器或容器之间来回通过进行混合。
在另一个实施方式中，用水凝胶、基质或载体流体配制所述颗粒可以包括使用行星式混合器、分散器、高剪切混合器、捏和机、多轴混合器、螺带桨叶混合机、静态混合器、滚轧机、均质剂、结块等或它们的任意组合将所述颗粒与水凝胶、基质或载体流体混合。
在一些实施方式中，它可以是有用的以在与水凝胶、基质或载体流体混合之前、期间或之后除去结块材料。例如，在一个实施方式中，所述颗粒可以通过尺寸排阻混合器，如静态交叉影线混合器或筛与水凝胶、基质或载体流体混合。这些实施方式可以允许颗粒与水凝胶、基质或载体流体混合，同时除去、排除或破碎结块材料(例如，结块颗粒)。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述方法还可以包括在去细胞化之前或之后将所述植物或真菌组织灭菌。在另一个实施方式中，所述方法可以包括将所述皮肤填充剂灭菌。在某些实施方式中，所述灭菌可以通过γ辐照灭菌。在其它实施方式中，灭菌可以通过高压灭菌。
在一些实施方式中，可以实施多种灭菌。例如，所述灭菌可以包括第一灭菌和第二灭菌。所述第一灭菌可以是热处理(例如，高压灭菌)，并且所述第二灭菌可以是通过γ幅射、高压灭菌等的灭菌。多种灭菌可以用于减少材料的生物负荷水平。同样，使用作为热处理的第一灭菌可以调节材料的水合平台水平。如将理解的，水合平台水平的调节可以允许调节和/或稳定本发明公开所述的皮肤填充剂的颗粒所保持的溶剂的量。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述方法还可以包括将所述植物或真菌组织碱化。如本文所描述的，植物或真菌组织(优选地，去细胞化的植物或真菌组织)的碱化将所述植物或真菌组织拆散成组织/细胞组分(包括单一结构细胞，结构细胞组或两者)。在某些实施方式中，所述碱化可以使用碱/碱溶液和过氧化物。在某些实施方式中，可以同时或顺序使用不止一种处理或溶液。在某些实施方式中，据考虑可以对植物或真菌组织实施碱化，并可以之后实施去细胞化，或者对植物或真菌组织实施碱化并且可以选择碱化条件以同时提供去细胞化。然而，如本文所描述的，优选地，对先前已去细胞化的植物或真菌组织进行碱化。
在某些实施方式中，碱化可以包括至少一种使用碱溶液的处理。如将理解的，所述碱溶液可以包括一般地任何适合的碱，如能够渗透性冲击和/或破坏氢键作用和/或聚合物晶体结构以提取完整组织结构的任何适合的碱。如将理解的，特别是对于皮肤填充剂应用，根据需要，可以将所述碱选择为(例如)生理学存在的、易于冲掉的、无害的或它们的任意组合。在某些实施方式中，所述碱可以包括NaOH、KOH或它们的组合。在一个实施方式中，所述碱可以在适合的溶剂中溶解/混合以形成碱溶液。通常，所述溶剂可以包含水，尽管还考虑了其它溶剂或者溶剂组合(如，例如，水和乙醇的混合物)。通常，所述碱溶液可以包含约0.1至10M的碱浓度，或者它们之间的任何浓度(任选地四舍五入至最近的0.1)或者覆盖这些浓度中任何两个之间的任何子范围。在某些实施方式中，所述碱浓度可以为约0.5M至3M，或者它们之间的任何值(任选地四舍五入至最近的0.1)或者覆盖这些浓度中任何两个之间的任何子范围。举例来说，在某些实施方式中，所述碱溶液可以包含浓度约0.5M-3M的NaOH的水溶液。如将理解的，根据需要，可以调整所述碱溶液以及处理条件(即加热、搅拌)以适合特定应用、所期望的要提取的结构、所使用的植物或真菌组织等。
在某些实施方式中，碱可以包括选自下列的碱：碳酸盐；硝酸盐；磷酸盐；硫酸盐；氨；氢氧化钠；氢氧化钙；氢氧化镁；氢氧化钾；氢氧化锂；氢氧化锌；碳酸钠；碳酸氢钠；丁基锂；叠氮化钠；氨基钠；氢化钠；硼氢化钠；或者二异丙基氨基锂。基于所述碱、所述产品，可以实施中和和/或清洗以除去残余的碱及其它试剂以防止(例如)不希望的污染。
在优选的实施方式中，所述碱化可以包括使用氢氧化钠和过氧化氢并加热的植物或真菌组织(优选地，去细胞化的植物或真菌组织)的处理。
在上述方法的某些实施方式中，碱化可以包括用碱和过氧化物，优选地作为碱的氢氧化钠或另一种氢氧化物碱和作为过氧化物的过氧化氢，处理去细胞化的植物或真菌组织。碱化可以将所述去细胞化的植物或真菌组织化学拆散成单一结构细胞，结构细胞组或两者，无不会破坏其木质纤维素结构。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，碱化可以包括用氢氧化钠水溶液和过氧化氢，同时加热来处理所述去细胞化的植物或真菌组织。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，可以通过加热至约80℃进行碱化。在某些实施方式中，这种加热可以使反应时间缩短，例如，特别是当使用氢氧化钠时。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，在将过氧化氢加入至所述反应之前，可以用氢氧化钠水溶液处理所述去细胞化的植物或真菌组织第一时间段。在某些实施方式中，第一时间段可以为约1分钟至约24小时，或者它们之间的任何时间点，或者覆盖任何两个这些时间点之间的任何子范围。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，可以作为30％至50％的水性过氧化氢储液添加过氧化氢。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，可以以下列比例使用用于碱化的过氧化氢：
约20mL至约5mL的30％的过氧化氢溶液：约100g去细胞化的植物或真菌组织：约500mL的1M NaOH溶液；
如：
约20mL的30％的过氧化氢溶液：约100g去细胞化的植物或真菌组织：约500mL的1MNaOH溶液；
约10mL的30％的过氧化氢溶液：约100g去细胞化的植物或真菌组织：约500mL的1MNaOH溶液；或者
约5mL的30％的过氧化氢溶液：约100g去细胞化的植物或真菌组织：约500mL的1MNaOH溶液。
如将理解的，根据需要，这些比例可以放大或缩小以适合特定组分——提供所列的量以显示相对比，而不是绝对量。例如，在某些实施方式中，以至少约75mL每500g的去细胞化的植物或真菌组织的量使用所述30％的过氧化氢水溶液。在某些实施方式中，以约2500mL每500g的去细胞化的植物或真菌组织的量使用所述1M氢氧化钠溶液。通常，可以将所述过氧化氢水溶液添加至所述去细胞化的植物或真菌组织、所述氢氧化钠溶液和所述过氧化氢水溶液混合物的总体积的约1％至约5％的最终过氧化氢浓度。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述方法还可以包括用一种或多种中和处理来中和pH的步骤。在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述中和处理可以包括用酸溶液，优选地HCl水溶液处理。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，对于1M氢氧化钠水溶液，可以使用去细胞化的植物或真菌组织：氢氧化钠水溶液(m：v，以g：L为单位)约1：5的比例，或者对于另一种氢氧化钠水溶液浓度，使用相等比例进行碱化。如将理解的，根据需要，这些比例可以放大或缩小以适合特定组分——提供所列的量以显示相对比，而不是绝对量。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，可以实施碱化至少约30分钟，优选地约1小时。
在上述一种或多种方法中任一种的另一个实施方式中，所述方法还可以包括配制用于真皮下注射、真皮深层注射、皮下注射(例如，皮下脂肪注射)或它们的任意组合的皮肤填充剂。
在另一个实施方式中，本文提供了通过本文所描述的一种或多种方法中的任一种所制备的皮肤填充剂。
在本文所描述的一种或多种皮肤填充剂中的任一种的另一个实施方式中，约0.1％至约5％或者更小的所述皮肤填充剂的颗粒可以具有小于约20μm的费雷特直径或者最小费雷特直径。在本文所描述的一种或多种皮肤填充剂中的任一种的另一个实施方式中，小于约0.5％的所述皮肤填充剂的颗粒可以具有小于20μm的费雷特直径或最小费雷特直径。
在上述一种或多种皮肤填充剂中任一种的另一个实施方式中，小于约0.1％至约5％(如小于约0.5％)或更小的所述皮肤填充剂的颗粒可以具有足够小的尺寸，从而被受试者的一个或多个细胞吞噬。
在另一个实施方式中，本文提供了试剂盒，其包含以下中的任何一种或多种：
如本文所描述的一种或多种皮肤填充剂中的任一种；
水凝胶、基质或载体流体；
PBS、盐水、透明质酸(交联或非交联的)、海藻酸盐、胶原蛋白、普卢兰尼克酸(例如，pluronic F 127)、琼脂、琼脂糖、纤维蛋白、羟基磷灰石钙、聚-L-乳酸、自体脂肪、硅酮、葡聚糖、甲基纤维素、溶解的再生纤维素或它们的任意组合；
利多卡因或其它化妆品；
一个或多个注射器，或另一种注射装置；
用于两个或更多个注射器的鲁尔锁配合件或联接器；
用于实施如本文所描述的一种或多种用途或者一种或多种方法中任一种的说明书；
一种或多种去细胞化试剂；
一个或多个容器、包装或器皿；
用于注射的一种或多种缓冲剂、水或盐水；
用于在不希望的区域或位置溶解皮肤填充剂的试剂或酶(例如，纤维素酶)；
或它们的任意组合。
在某些实施方式中，据考虑如本文所描述的皮肤填充剂可以用于化妆品应用以改善皱纹、痤疮、疤痕或用于重建外科。
在某些实施方式中，例如，根据需要，可以将如本文所描述的皮肤填充剂成形(机械或化学，成形为球)、官能化和/或与递送媒介物(任选地，暂时性递送媒介物)，如纤维素来源的凝胶制剂或者基于纤维素的水凝胶混合。
在某些实施方式中，据考虑可以从重建的溶解材料将皮肤填充剂颗粒制备成球或特定尺寸/形状。举例来说，在某些实施方式中，据考虑(例如)基于纤维素的生物材料，如去细胞化的植物或真菌组织可以被DMAc和LiCl或者纤维素酶(和/或类似的这些酶，如内切葡聚糖酶(EG，内切-1,4-D-葡聚糖水解酶或者EC 3.2.1.4.)、外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(CBH，1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶或者EC 3.2.1.91.)、β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21))溶解，然后在纤维素再生期间进行球化。
在某些实施方式中，例如，据考虑如本文所描述的皮肤填充剂可以适合于用作用于骨重建的骨填充剂糊，或者在食品应用中用作填充剂材料(例如，用于食品工程，以提供质地和/或口感的骨架)或者用作泡沫(例如，用于骨、软骨、软组织重建、食品、保温、包装等)。
在某些实施方式中，据考虑可以提供纤维素或者纤维素可以用于植入后的颗粒溶解，例如，以降解不希望的材料，如无意间注入不期望的位置或血管的材料。
在以下实施例中，开发并测试了作为合成颗粒，如PMMA微球的有吸引力的替代的不可再吸收的天然来源的植物基聚合物。
实施例1——基于苹果的皮肤填充剂糊
在本实施例中，为了开发基于纤维素的皮肤填充剂，首先使用如标题为“来自植物和真菌的去细胞化细胞壁结构及其作为支架材料的用途(Decellularised Cell WallStructures from Plants and Fungus and Use Thereof as Scaffold Materials)”的WO2017/136950中所述的去细胞化规程将苹果隐头花序组织去细胞化，该专利以其全部内容作为参考并入本文。简要地，将苹果组织在曼陀林切片机上切片至1.2mm厚。通过使用10mm活检凿产生苹果组织的圆柱形圆盘。将圆盘在0.1％ SDS中去细胞化(如WO2017/136950中所述)。
在获得去细胞化的10mm苹果圆盘后，产生可注射的糊。将一些圆盘在50mL falcon管中旋转沉淀并且除去所有剩余的流体。在无菌条件下，然后使用1mL注射器的活塞将所述圆盘挤压并均质化为稠糊。然后，将所述糊吸入到新的1mL注射器中(无针)。在将无菌18G针置于注射器上后，发现可以挤出糊。当尝试通过更大号的针挤出糊时遇到困难，18G是所使用的最小内径的针。尽管18G的确对于某些皮肤填充剂应用可以是可接受的，但是，例如，对于化妆品领域中的某些应用，通常期望26-27G的尺寸。
图1显示了如该实施例中所述的挤出的去细胞化纤维素糊(左图)，并且还显示了在用18G针加载所述糊后的1mL注射器(右图)。
为了测试生物相容性，实施了实验动物研究。简要地，通过18G注射器将1mL皮肤填充剂糊在雌性斯普拉-道来氏大鼠(400-700g)背部皮下注射3个位点(3×1mL)。将纤维素皮下注射到3个不同位点(参见图2中的侧视图(A)和特写图(B))。4周时，在植入物周围出现血管化(参见图2(C))，并且在切除后，植入物保持其形状(参见图2(D))。
所述注射材料似乎与周围组织结合，从而显示了所述注射材料围绕的细胞浸润和基质沉积。注射位点易于可见并且使用卡尺每周测量(高度、x和y宽度)以获得植入物随时间保留其形状程度好坏的测量。监测动物并在注射后4和8周处死。图3显示了在动物内8周后观察细胞浸润和基质沉积。所述纤维素填充剂似乎是生物相容的并且通常随时间维持球状形状。显示了8周皮下注射和Masson三色染色(图3(A)、(C)中显示)和苏木精&伊红染色(图3(B)、(D)中显示)(对于(A、B)比例尺＝2mm；对于(C、D)，比例尺＝200μm)。图4显示了使用卡尺，从动物外部对植入物位点的手动测量结果。在8周研究期间，观察到植入物面积降低。然而，长径比(其在x和y轴上的宽度之比)未显著变化。图5显示在8周研究期间，植入物高度显著降低～75％，如使用卡尺在动物外部所测量的。这与以上所观察到的注射位点面积减少相关。
该研究显示了有前景的数据(可注射、生物相容的纤维素的产生)。然而，在本实施例中，由于其产生的性质，所述纤维素填充剂是无定形的并且可能由可变且不明确的颗粒和压碎的纤维素结构的集合组成。这可能导致通过26-27G针挤出的尝试具有困难，其特别是对于特定化妆品应用是所期望的。大部分商品化皮肤填充剂产品由载体水凝胶中的材料(HA或胶原蛋白最常见)组成，这在本实施例中未使用。以下进一步详细描述了具有可控尺寸特征的研磨纤维素的进一步精制颗粒的产生以及与载体水凝胶可控混合的能力。
实施例2—控制尺寸的皮肤填充剂
基于以上实施例1中的结果，在本实施例中开发了产生用作皮肤填充剂的纤维素颗粒的更可控的方法。使用去细胞化方法，测试了几种将生物材料压碎或碾碎的方法以开发与通过较小号针的注射相容的皮肤填充剂，和开发以高度可控且可重复的方式产生皮肤填充剂的方法。
在本实施例中，根据以下方法，开发并描述了用于产生干粉的规程。首先，如前所述(参见WO2017/136950，标题“来自植物和真菌的去细胞化细胞壁结构及其作为支架材料的用途(Decellularised Cell Wall Structures from Plants and Fungus and UseThereof as Scaffold Materials)”，将该专利以其全部内容作为参考并入本文)，将苹果纤维素生物材料去细胞化。在获得去细胞化的苹果生物材料后，使其在干燥架上在空气中干燥24小时。一旦干燥，使用可调节磨盘式磨碎机将所述材料破坏成细颗粒，将这些颗粒反复研磨几次以产生一系列颗粒，然后将其对于所期望的大小与形状进行筛分(参见图6，显示碾碎的干燥生物材料(左图)和再水化的挤出皮肤填充剂(右图))。一旦获得干粉，则将所述颗粒在干燥生物材料重量的10-15倍之间的体积的DPBS中再混悬以产生糊或填充剂材料(参见图6)。
已发现将研磨颗粒尺寸精制(并降低)的一种良好方法是将它们过度稀释并使其逐步通过较小的针尺寸多次。通过该方法，在本研究中可以用于挤出填充剂的较小号的针是22.5G针。这仍比某些应用所期望的大，例如，对于某些应用，期望皮肤填充剂是用26-31号尺寸的针可注射的。
在显微镜观察下，据发现用于产生这种粉末的方法导致产生了大的材料块以及单一完整的结构细胞。由于这些细胞直径通常>200μm，因此这成为填充剂材料通过小号针的限制因素。值得注意地，所使用的研磨方法还产生了似乎处于1-20μm区域内的极细颗粒。在某些应用中，具有这种尺寸的颗粒可以在植入后具有不利影响，从而潜在导致炎症、肉芽瘤和/或慢性/持续异物反应。
图7显示使用以上所描述的针方法，将生物材料充分剪切以获得至少一些单一完整结构细胞(例如，分离的细胞壁口袋)，所述结构细胞似乎完整形成并且未挤毁。
由于在本实施例中所制备的较小的粉末尺寸，因此产生了3种皮肤填充剂制剂。在任何情况下，皮肤填充剂含有在盐水、透明质酸或牛胶原蛋白的载体流体中的4％的纤维素颗粒(w/v)和0.3％的利多卡因(w/v)。如下产生了制剂：
在PBS皮肤填充剂中混悬的纤维素：
将0.2943mg纤维素粉末溶于下列物质：
●6.54mL dH2O
●0.73mL 10X PBS
●0.145mL 15％利多卡因(w/v，溶于dH2O)
在透明质酸皮肤填充剂中混悬的纤维素：
将0.2031mg纤维素粉末溶于下列物质：
●5.078mL 0.2％的非交联透明质酸(m/v，溶于PBS)
●0.102mL 15％利多卡因(w/v，溶于dH2O)
在胶原蛋白皮肤填充剂中混悬的纤维素：
将0.1835mg纤维素粉末溶于下列物质：
●3.6mL 0.3％(m/v)
Figure BDA0004113521020000451
牛胶原蛋白I
●0.45mL 10X PBS
●0.36mL 0.1N NaOH
●0.09mL 15％利多卡因(w/v，溶于dH2O)
如上，为了测试生物相容性，实施了小型动物研究。简要地，通过22.5G注射器将0.4mL的每种皮肤填充剂在雌性斯普拉-道来氏大鼠(300-700g)背部皮下注射到3个位点(3×0.4mL)。在任何情况下，将动物处死并在植入后4周收集组织切片。
在4周研究过程中，注射位点易于可见并且使用卡尺每周测量(高度、x和y宽度)(参见图8)以获得植入物随时间保留其形状程度好坏的测量。
图8显示了作为时间函数的植入物高度。在多种制剂之间未观察到统计学显著差异。然而，应注意就HA和胶原蛋白浓度来说，它们与商品化产品相差显著，相差约10倍。与胶原蛋白/HA水凝胶的低w/v浓度一致，结果似乎与基于盐水的填充剂的表现类似，其导致～50％的高度降低。
图9显示作为时间函数，使用卡尺从动物外部所测量的植入物物质的计算体积。使用高度，x和y宽度并假设为半椭球体，计算植入物体积。在多种制剂之间未观察到统计学显著差异，并且符合与高度降低一致的趋势。
类似于实施例1，这种方法提供了可以在大鼠动物模型中皮下注射的纤维素粉。然而，在不精确控制颗粒几何形状的情况下，可以获得尺寸的广泛分布，这可以包括可以产生不希望的影响的不希望的小颗粒(<20μm)，和/或可以包括可以导致针堵塞的大颗粒块(>200μm)。因此，如下所述，实施了用于增强粒径控制的进一步的研究和开发。
实施例3—具有高度可控粒径的皮肤填充剂
本实施例中所描述的开发和研究设法提供了以下情况：
1.从具有可控平均直径，如(例如)<100μm的平均直径的去细胞化植物制造纤维素粉；
2.确定所产生的颗粒是否可以以15kGy的水平通过γ幅射灭菌；
3.产生3种由20％的颗粒(v/v)、0.3％的利多卡因(v/v)和79.3％的载体流体(盐水、3.5％的牛胶原蛋白(w/v)或1％的交联透明质酸(w/v))组成的皮肤填充剂制剂以与其它皮肤填充剂产品制剂相比较；
4.在一些动物中实施动物生物相容性研究；和
5.实施体外细胞培养测定。
颗粒几何形状
PMMA颗粒已成为永久性皮肤填充剂中的金标准。它们易于生产并且它们的尺寸准确控制。然而，考虑到球是坚硬且不可渗透的，在体内整合后，与人组织相反，所得组织仍主要由合成微球组成。图10显示了在植入后3个月，30-50μm的PMMA微球体(白色圆形)。尽管在植入物周围生长了天然组织，但是组织中PMMA的体积分数很高。这表明该组织主要由合成材料组成，而不是天然细胞和蛋白。
考虑30μm直径的球，在这种情况下，所述球具有2827μm2的表面积和14137μm3的体积。该体积代表了天然组织的总已占体积，其可以在接受注射的区域中增加。表面积与体积(SA：V)之比为0.2。表明尽管细胞和基质蛋白可以沉积在球的表面上，但是与硬颗粒本身所占的总体积相比，它是很少量的。
另一方面，考虑薄的颗粒或薄片(～0.1μm)，它是直径60μm或半径30μm的大致圆形的。在这种情况下，表面积为2846μm2(与30μm的球几乎相同)并且已占体积为283μm3。因此，SA：V为～10。这表示可用表面积比已占体积增加50×。换言之，60μm直径薄片提供了类似的量的表面积以支持细胞生长和基质沉积，但是占据了少得多的用于天然组织生长的相对体积。
由于我们在大量研究中已观察到，薄壁(～0.1μm)植物组织提供了优良载体结构，在所述结构上细胞和组织可以生长和浸润，同时还为血管、基质沉积和组织整合留出了大量空间。
因此，本实施例设法产生与其它皮肤填充剂产品相比，具有优良的天然组织与永久性填充剂颗粒的SA：V比的永久性皮肤填充剂。因此，以下所描述的工作旨在开发天然、植物来源的薄片，而不是球形颗粒。此外，与以上所描述的之前的制剂相反，直径<100μm的薄片可以通过26-27G注射器可注射。因此，这可以提供益处——天然产品、不可再吸收的永久性结构，高生物相容性和显著提高的天然组织。在皮肤填充剂程序中，期望使患者自身身体能够用尽可能多的天然组织替换缺陷。已通过考虑这些目标设计了本发明的策略。
纤维素薄片的制造
在本实施例中，产生天然颗粒置换的第一步是将植物材料去细胞化。使用Hickey,R等人,Customizing the Shape and Microenvironment Biochemistry ofBiocompatible Macroscopic Plant-Derived Cellulose Scaffolds.ACSBiomater.Sci.Eng.,4,3726(2018)，该文献以其整体作为参考并入本文，中所列的已建立的规程完成该过程。由于最终产品旨在在患者中可用，因此重要的是建立标准化GLP和GMP方法。在本文中，以符合GLP的方式生产材料。图11显示了无菌样品处理，使用无菌材料和无菌技术实施了去细胞化方法的GLP形式。
为了处理软材料并产生纤维素薄片，将骨架在冷冻干燥器中冻干(48h，-46℃，0.05mbar)。一旦材料干燥，则立即将它们置于Retsch研磨机中。以18000rpm、12000rpm和6000rpm进行大块研磨。高速降低处理时间。使用80μm过滤器限制粉末尺寸小于80μm。当过滤器就位时，我们未观察到研磨速度对最终颗粒尺寸、几何形状或得率的任何依赖性。因此，使用高速研磨降低处理时间。
图12显示了如所述的苹果来源的去细胞化纤维素骨架的冻干过程。图12显示收集去细胞化材料并置于Falcon管中，并将通道压入材料中以蒸发/升华水蒸汽以使其逃逸。图12(B)显示将材料附接至冷冻干燥器，并且图12(C)显示在-46℃，0.05mbar下实施冷冻干燥48h。图12(D)显示了冻干材料的最终产品。图13显示将干燥的纤维素生物材料以18000、12000和6000rpm研磨成粉末，同时如所述的，通过80μm过滤器。显示了处理后的收集托盘。使用最高RPM设置以减少处理时间。未观察到研磨速度对颗粒尺寸分布的可观察的影响(数据如下所示)。
图14进一步详细显示了过滤过程。图14(A)显示将通过80μm过滤器的得自研磨材料的粉末(B)通过45μm和25μm筛网湿筛(B)以限制粉末的尺寸范围(C)。通过离心将颗粒的尺寸范围集中在狭窄的范围内(参见图14(D))。自动湿筛显著改善了处理时间和效率并随后常规使用。
首先如下实施该方法：将5mL松散装填的粉末在dH2O中再混悬至45mL的最终体积并倾倒至筛网上。将颗粒连续清洗3min。3min后，除去顶部筛网(45μm)，并将第二筛网(25μm)搅拌和清洗另外3分钟。在Falcon管中收集材料并离心：得率为约20％(从25mL体积干粉分离5mL体积湿粉)。
通过ISO 565BS 410，ISO 3310-1 25和50μm不锈钢8英寸筛网以及缺口收集桶，通过Gilson SS 23湿式/干式筛振动器进行自动湿筛。将5mL干粉在45mL dH2O中稀释。将筛网置于顶部具有较大筛网的振动器上。打开振动器并将颗粒倾倒至50μm筛上。在3分钟过程内，用150mL dH2O漂洗颗粒三次。然后，关闭振动器并除去顶部筛网。重新启动振动器，以50mL等份用dH2O清洗底部筛网3分钟。然后，通过以一定角度用dH2O清洗筛网表面，收集过滤材料。通过离心浓缩过筛材料。得率为约20％(5mL体积湿粉分离自25mL体积干粉)。
为了评价粉末得率，在该过程的关键阶段记录质量。在对苹果进行任何操作之前记录初始质量。由于苹果间的质量不同，苹果数不是起始材料含量的充分量度。总体上，苹果数和苹果组的总质量提供了得率确定的参考点。在去细胞化后，将材料冻干以获得如上所列的干燥的去细胞化物质。然后，将干燥材料研磨成颗粒形式。在处理期间，存在一些样品损失；因此，计算研磨质量以评价研磨过程期间的损失。下一步包括通过使用50μm和25μm筛网的自动筛，过滤颗粒以限制尺寸分布。为了定量最终得率，将筛分颗粒冻干以除去含水量。
表1：皮肤填充剂颗粒的得率
Figure BDA0004113521020000491
容易地，在通风橱中用匙(scoopula)将粉末从Retsch托盘转移至管中以避免与手套、管和空气的静电放电。市场上的某些现有产品已显示小于20μm的粒径导致吞噬和/或提高的免疫应答。因此，设法限制颗粒尺寸。在湿筛法中将颗粒通过两种筛(45和25μm)。
粒径表征
使用荧光显微镜和扫描电子显微术(SEM)完成粒径表征。对于荧光显微镜，用0.22μm过滤的0.1％刚果红染色剂对颗粒染色。将它们以2.5×和10×成像。使用冷冻干燥，将SEM样品作为干燥试样成像。为了使得能够发生导电，进行喷金以对颗粒涂覆5-10nm的金层。图15显示了用刚果红染色的颗粒。用0.1％刚果红染色颗粒并以2.5×(A，B)和10×(C，D)成像。(A，C)未过滤的颗粒。(B，D)过滤的颗粒。收集如这些的图像以定量粒径分布。通常，2.5×的10幅图象获得～1000个颗粒，这是统计学显著的样品尺寸。
将显微镜图象用于分析粒径分布。将Fiji(ImageJ)用于图像处理并且将Origin2020用于分析结果。为了分批处理图象，在Fiji(ImageJ)中将原始图象组装成图像栈(stack)。首先，将图象转化为灰阶，然后使用自动设阈功能对它们设阈。目视检查设阈以确保应用正确限制。然后，应用分析颗粒功能以计算面积、形状描述符、质心、拟合椭圆和费雷特直径。未对颗粒分析施加尺寸限制或形状限制。除了位于视野边缘的那些外，分析所有颗粒以避免扭曲分布。将所分析的颗粒轮廓的输出图象文件与原始图像相比较以确保正确分割。
图16显示了如所述的粒径分析。使用Fiji(ImageJ)对颗粒设阈并分割。图16(A，B)显示了过滤的颗粒，并且图16(C，D)显示了未过滤的颗粒。图16(A，C)显示了阈值图象，并且图16(B，D)显示了来自尺寸分析的颗粒轮廓。
光学和荧光显微镜显示研磨的纤维素粉似乎形成薄片而不是球形颗粒。存在多种不同的定量描述符，其可以计算以研究不规则形状的物体，如圆度、圆形度、长径比、最小和最大费雷特直径等。由于材料是一系列不规则薄片，因此确定最有用的形状描述符是最大和最小费雷特直径，厚度和投影2D面积以描述颗粒形态。
将这些分析法应用于粉末显示在筛分前，样品显示出非常大的粒径分布，然而在筛分后，样品具有更狭窄的粒径分布。值得注意地，过滤出小颗粒。未过滤颗粒的宽粒径分布在投影颗粒面积中也是明显的。未过滤样品的平均投影颗粒面积是2036.42±242.53μm2，而过滤颗粒的平均面积为236.92±38.18μm2。平均最大费雷特直径是显著不同的(P＝7.4×10-55)(未过滤＝47.34±1.04μm并且过滤＝68.84±0.63μm)。使用最大费雷特直径，对于过滤情况，<20μm的颗粒的百分比为1.6％，而对于未过滤情况为29.5％。同样地，平均最小费雷特直径也是显著不同的(P＝6.67×10-56)。未过滤颗粒的平均最小费雷特直径为31.73±0.72μm，而过滤颗粒的尺寸为46.51±0.37μm。所有值为平均值和s.e.m.。N未过滤＝2292，N过滤＝1595。
图17显示了过滤和未过滤去细胞化苹果颗粒的粒径分析。将费雷特直径用于定量粒径。对于每个条件，从用刚果红染色的颗粒的荧光显微镜图象分析了N＝15幅图象。N未过滤＝2292，N过滤＝1595。平均值是统计学显著不同的(P＝7.4×10-55)。
为了确认光学显微镜结果并且为了获得对纤维素粉末中颗粒形态的更好理解，使用了扫描电子显微术(SEM)。尽管成像技术强大，但是用于SEM的粉末制备需要进一步干燥、研磨和镀金。这可以导致相对于成像方向以多个角度取向的薄片、潜在的尺寸变化和潜在的假象引入。
图18以升高的放大倍数(A-D)显示了去细胞化苹果粉末的SEM显微照片。图19显示了手动图像处理以确定薄片直径。薄片是不规则形状并且单一长度描述符不能记录这种复杂性(来源：去细胞化苹果)。图20显示了来自去细胞化苹果的SEM的粒径分布。分布显示了在47.11±1.11μm的峰值(N＝133个薄片)。得自SEM图像分析的分布要比光学法窄的多。然而，该方法存在缺陷，如手动方法一次测量一个颗粒，从而导致N值较小、颗粒角度取向的影响和可靠检测边缘的能力。这些问题使得该方法对于粒径表征是不期望的。
研磨速度对不同颗粒制剂的影响
研磨速度是纤维素薄片制造期间的重要变量。以下提供了数据以显示在本研究中，速度不影响粒径特征(根据自动光学分析确定)，也不因植物物种类型(比较了苹果和梨)而改变。
图21显示了在自动湿筛过滤之前，在以所测量的不同速度研磨去细胞化苹果之后的粒径分布。在筛分前，通过以6000RPM(黑色)和18000(灰色)研磨产生颗粒。两种分布类似。对于6000和18000RPM，平均粒径分别为73.07±0.58μm和73.50±0.56μm。值为平均值和s.e.m.。对于6000RPM，N＝2579，并且对于18000RPM，N＝2354。据发现平均粒径无显著性差异(P＝0.58)。
表2：对于梨来源的粉末，来自不同研磨速度的粒径比较
Figure BDA0004113521020000511
Figure BDA0004113521020000521
表3：以18000RPM研磨的苹果和梨来源的粉末尺寸的比较。
Figure BDA0004113521020000522
γ辐照灭菌
γ辐照是在临床背景中使用的对生物材料灭菌的重要步骤。已确定15kGy水平的γ辐照足以产生无菌的植物-基生物材料。以下提供的发现显示γ辐照和未辐照的样品粒径未显示出显著变化。
如上，来自加拿大Fancy的麦金托什苹果购自当地超级市场并且在随后几天使用。为了制备去细胞化原材料，遵循SOP。简要地，将苹果削皮，然后在曼陀林切片机上切片至1mm厚度。然后，将切片转移到0.1％ SDS溶液中并在120RPM的振荡器上放置3天。每天更换一次溶液。然后，用无菌dH2O清洗切片3次，转移至100mM CaCl2溶液并返回振荡器上24h。然后，用无菌dH2O清洗生物材料3次，然后用70％乙醇灭菌30min。然后，用无菌dH2O清洗样品3次，并在无菌dH2O中储存直至第二天。然后，除去水，并将样品在-46℃和0.050mbar冻干2天。一旦干燥，将去细胞化材料在设置为速度18000RPM，具有80μm过滤器的Retsch研磨机中研磨。
使用湿筛，通过45和25μm筛进一步限制纤维素粉末的尺寸。以1000RPM的速度离心3分钟的持续时间来浓缩粉末。然后，以1mL颗粒在10mL无菌dH2O中的浓度在Nalgene瓶中储存颗粒。从来自单独起始材料批次的每个条件制备3种样品。
图22显示了在具有指示标签贴纸的用于γ辐照的密封的Nalgene瓶中的颗粒混悬液样品。
用收缩膜密封Nalgene瓶以提供无包装拆封(tamper-free)的环境。用彩色γ辐照指示标签标记瓶子；在暴露于γ辐照后，颜色从橙色变为红色。辐照样品至少15kGy。然后，将样品在4℃储存直至测试。
分析辐照和未辐照的样品。将Keyence数字显微镜用于评价粒径。所记录的参数为颗粒面积、最大面积、最小面积和圆周长。用刚果红染色颗粒以使颗粒能够显象。使用自动微量移液管将500μL样品和150μL 0.2％的三次过滤(0.22μm)的刚果红添加至1mL小瓶。将小瓶混合并在冰箱中储存过夜。将染色混悬液的小等份在载玻片和盖玻片之间沉积。在马上要成像前制备每个试样以避免蒸发的干扰。根据SGS PSI方法ID 27940修正版3，使用配备有Z20T透镜Keyence VHX-5000数字显微镜系统测试如以上所描述所制备的试样。以200×自然放大倍数，通过极化透射光实施成像。将二维拼接特性用于使从每个样品混悬液制备的试样成像。选择颗粒更均匀随机分散的试样区域，从而避免集中的截面或气泡。将Keyence软件的自动面积功能(auto-area function)用于测量每幅图像中“粒径”。在选择染色剂对颗粒优先结合的颜色后，在接触或重叠的颗粒块向个体转变时，检查所测量对象列表的大致最大直径。然后，将排除应用于较大颗粒和在图象边缘中断的那些颗粒。重复分析直至每个样品已测量了最少1,000个颗粒。图23显示了得自Keyence数字显微镜的样品图象。鲜红色重叠表示用于分析的颗粒。
对于γ辐照和未辐照颗粒，颗粒平均面积无显著不同(P＝0.91，N＝3个样品)。颗粒平均面积分别为1885.3±1144.6μm2和1705.4±984.9μm2。图24显示了面积的柱状图。对于辐照样品，所分析的颗粒总数为3800，对于未辐照样品为4692个颗粒。图24显示了γ辐照(N＝3800)和未辐照(N＝4692)颗粒的颗粒面积。
由于颗粒不是完全球形的，因此最大费雷特直径(或最大直径)是评价不规则形状颗粒尺寸的有用的量。这种测量是粉末和颗粒分析中的惯例。对于γ辐照和未辐照颗粒，颗粒最大直径无显著不同(P＝0.97，N＝3个样品)。平均粒径分别为62.0±20.1μm和61.0±18.4μm。图25显示了直径的柱状图。图25显示了γ辐照(N＝3800)和未辐照(N＝4692)颗粒的颗粒最大直径柱状图。
与最大直径相反，评价最小粒径也是有价值的。对于γ辐照和未辐照颗粒，最小直径也无显著不同(P＝0.90，N＝3个样品)。平均最小粒径分别为46.5±15.0μm和44.4±13.2μm。图26显示了直径的柱状图。对于辐照样品，所分析的颗粒总数为3800，对于未辐照样品为4692个颗粒。图24显示了γ辐照(N＝3800)和未辐照(N＝4692)颗粒的颗粒最小直径柱状图。
总的来说，结果表明γ辐照未显著改变粒径。进一步数据检查显示通过当前使用湿筛的生产方法，<0.32％的颗粒具有小于20μm的最大直径。该结果对于体内用途是特别关心的，因为小于20μm的颗粒可以被吞噬和/或可能引起免疫应答。相反，据报道市售的BellaFill皮肤填充剂颗粒其材料<1％具有<20μm的直径。
颗粒本质上不是球形的；因此，可以使用如以上所提供的几种形状描述符来描述它们的几何形状。重要地，这些特征在暴露于15kGy的γ辐照后均未变化。
尺寸限制的替代方法
除湿筛之外，可以使用差速离心来分离颗粒。差速离心也可以是可以降低处理时间和用水量的封闭的生产方法。差速离心是可以基于它们的尺寸用于分离颗粒的技术。离心用于加快沉降过程。分离速率取决于有效重力、流体粘度、路径长度和时间。以下方程总结了上述变量之间的关系。这些方程假设颗粒均一且为球形，本发明的颗粒的情况并非这样——尽管如此，这些考虑提供了变量配置的起点。
Figure BDA0004113521020000551
Figure BDA0004113521020000552
gc＝ω2r
Figure BDA0004113521020000553
Figure BDA0004113521020000554
图27显示了通过差速离心获得的苹果来源的颗粒的粒径分布。(A)显示了在通过手动筛分(45μm)初始排除大粒径后，未过滤的颗粒的尺寸分布，并且(B)显示了在5次重复以1000rpm离心1分钟后的分布。为了收集所有材料，使用以5000rpm离心7分钟。
体外生物相容性
为了评价粉末对细胞存活力的影响，实施了体外生物相容性测定。实施该测试以比较过滤和未过滤的颗粒对NIH3T3小鼠细胞的影响，NIH3T3小鼠细胞通常用作模型细胞系。将无菌粉末用于该测定。以下列条件，在DMEM培养基中使用含有3T3细胞的六个板：
●对照—无颗粒或染料，仅细胞
●用CR预染色的过滤的颗粒；
●过滤的颗粒—无染料；
●用CR预染色的未过滤的颗粒；
●未过滤的颗粒—无染料；
●染料对照—仅具有染料的细胞。
为了制备具有过滤的颗粒的样品，使用过滤的生物材料(如上所述通过研磨，然后湿筛产生的苹果颗粒)。将20mL体积(含有2mL颗粒)分成两个管并以5000RPM离心7分钟。将小粒在蒸馏水中再混悬至最终体积3.5mL。将175μL 0.2％ CR加入至样品之一(管中CR浓度0.01％)。将颗粒染色10分钟。将管中内容物移液到相应板中(每个板接收1mL湿颗粒当量)。
为了制备具有未过滤的颗粒的样品，使用未过滤的生物材料(如上所述通过研磨，然后湿筛产生的苹果颗粒)。将2mL粉末在蒸馏水中再混悬至最终体积7mL。将该溶液分成两个管并且将175μL 0.2％ CR加入至样品之一(管中CR浓度0.01％)。将管中内容物移液到相应板中(每个板接收1mL湿颗粒当量)。
为了制备染料对照，将175μL 0.2％ CR加入至含有3T3细胞且无颗粒的板中。
在观察前，将所有板在37℃，5％ CO2培育48小时。
图28显示了使用AA(苹果)颗粒的体外细胞培养测试。蓝色＝3T3细胞核。在一些情况下，由于Hoechst 33342染色，大颗粒薄片也是可见的。红色＝在将疏松颗粒洗掉后仍保留的用0.01％刚果红染料染色的颗粒。图28(A，B)显示了对照。图28(C，D)＝对照和染料。图28(E，F)＝过滤：25-45μm。图28(G，H)＝过滤：25-45μm和染料。图28(I，J)＝未过滤。图28(K，L)＝未过滤和染料。比例尺＝250μm。
结果表明未过滤的粉末对细胞存活力具有不利影响。在48小时后，在培养板中大量细胞死亡，并且明显坏死和/或漂浮。相反，在具有过滤的颗粒的板中，细胞密度高且与对照相当。细胞表现正常且存活。尽管尚未非常详细地研究粉末诱导的细胞死亡的确切机制，但是结果与具有细胞毒性的直径<20μm的颗粒一致。在这种情况下，未过滤的溶液含有一些小于20μm阈值的颗粒，并且可以是细胞死亡增加原因。未非常详细地研究细胞死亡的原因，然而，假设了由小颗粒吞噬所造成的渗透效应和细胞凋亡两者。低浓度颗粒混悬液改变渗透压冲击的严重程度的结果表明它是所观察到的细胞死亡的主要原因。与50×稀释的未过滤和过滤颗粒两者培养的细胞在初步研究中存活。
通过过滤颗粒获得了良好的结果，表明通过过滤颗粒，细胞密度高且与对照相当。细胞表现正常且存活。
皮肤填充剂制剂和制造
由于所述颗粒可以用于皮肤填充剂和皮肤填充剂应用，因此测试了它们对于注射器和针递送的可应用性。将海藻酸盐用于所述颗粒的粘稠混合。
所述制剂含有按体积计0.5％的海藻酸盐和20％的颗粒。在为了产生制剂的第一次尝试中，通过将5mL 1％海藻酸盐混合到5mL水中产生了液体组分。溶液稍粘稠；然而，它易于与常规移液技术混合。然后，将2mL未过滤的粉末加入至(如上所述制备的)液体组分。常规移液和搅拌未获得均一的颗粒溶液。同样，涡旋不产生均一混悬液。
在另一种方法中，起初将2mL未过滤的粉末与5mL水组合。以500μL等份，将这种混合物逐渐引入5mL 1％的海藻酸盐中。这种方法使得溶液更易混合并且获得了更均一的最终组合物。
然后，将这两种制剂用于针堵塞测试。使用了27G针。两种制剂堵塞针并且变得堵塞；第一方法立即堵塞。
所制备的第三种制剂与第二原型相同，除了使用25-45μm颗粒而不是未过滤的颗粒。应用相同的针堵塞测试并且颗粒混合物不堵塞针。
图29显示了具有海藻酸盐的可注射皮肤填充剂制剂。所述颗粒占体积的20％。测试了两种混合法。(A)显示将粉末混合到水和海藻酸盐溶液中。(B)显示先将粉末混合到水组分中，然后缓慢添加海藻酸盐。第一种方法未良好混合并且堵塞针。第二种方法良好混合，但是未过滤的颗粒堵塞针。当用过滤颗粒替代未过滤颗粒时，混合物易于挤出。
这些结果表明可以进一步优化用于原型的混合过程。将一种组分缓慢添加至另一种是费时的，并且更多涉及的物质传递提高了污染以及错误传播的风险。
因此，将鲁尔锁(F/F)注射器接头用于混合填充剂组分。一个注射器加载了在0.9％盐水和0.1％刚果红染料中混合的颗粒以使混合过程显象。第二个注射器加载了1％海藻酸盐。两个注射器通过鲁尔锁(F/F)连接。通过将材料从一个注射器通过至另一个60×来混合溶液。在混合完成后，将材料转移至注射器之一。去掉空注射器，并且将1cc注射器连接就位。将所期望的体积(在这种情况下，400μL)加载到注射器中。去掉1cc注射器，并且安装适当尺寸的针。
图30显示了通过注射器鲁尔锁接头的皮肤填充剂组分的混合。(A)显示了在各个注射器中加载的两种组分。澄清液体为1％海藻酸盐，并且红色液体为在0.9％盐水和利多卡因(最终浓度＝0.3％)中混悬的颗粒。添加刚果红(最终浓度0.1％)以用于显象。(B)显示了鲁尔锁接头。(c)显示组分混合(总计通过60次)。(D)显示去掉鲁尔锁并用用于挤出的针替换它。注意，该溶液不堵塞27G针。
在该实施例中所使用的皮肤填充剂制剂和用于其制备的方法/程序的其它实例如下所示：
具有盐水载体流体的皮肤填充剂制剂
关键设备
1.生物安全柜
2.离心机(50mL Falcon管和微量离心能力两者)
3.移液枪
4.微量移液管
溶液
1.70％乙醇。
2.无菌水
3.无菌盐水(0.9％)
4.利多卡因2％
程序
方案
1.打开生物安全柜(BSC)。
2.用Accel抹布沿BSC擦拭。
3.使用70％乙醇沿50mL Falcon管和管架喷雾并将它们置于BSC中。将一个Falcon管用于收集颗粒；其它用作废物容器。
4.使用Accel抹布，沿移液枪擦拭，并将其转移至BSC。
5.对在具有可见的辐射指示标签贴纸的它们的未打开、收缩膜包装的瓶子中的γ辐照的颗粒照相。
6.用Accel抹布沿颗粒瓶擦拭，并将它们放入BSC。
7.振荡容器以使颗粒再混悬。
8.沿无菌0.9％盐水的新的瓶子擦拭并将其转移至BSC。
颗粒制备
1.使用无菌技术在BSC中完成所有材料转移步骤。使用无菌手套。
2.将γ辐照瓶的全部内容物(20mL)倒入50mL Falcon管。
3.将颗粒以1000rpm在室温下离心3分钟。
4.用Accel抹布沿Falcon管擦拭并使其回到BSC中。
5.用移液枪弃去上清液。不要倾倒或挤压小瓶，因为一些颗粒可能在溶液中再混悬。
6.将小粒在6.8mL无菌0.9％盐水中再混悬。良好混合。
7.添加1.2mL 2％利多卡因。良好混合。
8.将所述溶液以500μL等份转移至无菌高压灭菌的微量离心管中。注意：在罩中打开无菌高压灭菌的微量离心管包装。外部包裹不接触所述罩的任何表面并且不从打开的容器上方通过。
注射器加载
1.在BSC内部，通过在BSC一侧放下无菌小花纹毛巾来产生无菌区。
2.使用开放戴手套技术(open gloving technique)，一位研究人员带上无菌手套。将该研究人员鉴别为无菌研究人员。
3.非无菌研究人员将无菌1cc注射器带入BSC。包装不接触任何表面。打开包装并放在无菌区上或放置在无菌研究人员附近。
4.对针重复步骤3。针号为26G。
5.非无菌研究人员以45度角握住含有皮肤填充剂的微量离心管，同时无菌研究人员将400μL吸入注射器。
6.将加载的注射器松开盖子。注意：将盖子靠在无菌区上并用一只手将针插入盖中。避免使用两只手，以防接触针或将针推入塑料盖。
7.将加载的注射器转移至邻近手术区上大鼠的无菌区。
具有透明质酸载体水凝胶的皮肤填充剂制剂
关键设备
1.生物安全柜
2.离心机(50mL Falcon管和微量离心能力两者)
3.移液枪
4.微量移液管
透明质酸试剂盒
1.HyStem试剂盒—Advanced BioMatrix-Cat GS311
溶液
1.70％乙醇。
2.无菌水
3.无菌盐水(0.9％)
4.利多卡因2％
程序
方案
1.打开生物安全柜(BSC)。
2.用Accel抹布沿BSC擦拭。
3.从冰箱/冰袋除去HyStem包装。打开HyStem包装并使小瓶加热至室温。
4.使用70％乙醇沿50mL Falcon管和管架喷雾并将它们置于BSC中。将一个Falcon管用于收集颗粒；其它用作废物容器。
5.使用Accel抹布，沿移液枪擦拭，并将其转移至BSC。
6.对在具有可见的辐射指示标签贴纸的它们的未打开、收缩膜包装的瓶子中的γ辐照的颗粒照相。
7.用Accel抹布沿颗粒瓶擦拭，并将它们放入BSC。
8.振荡容器以使颗粒再混悬。
9.沿无菌0.9％盐水的新的瓶子擦拭并将其转移至BSC。
颗粒制备
1.必须使用无菌技术在BSC中完成所有材料转移步骤。使用无菌手套。
2.将颗粒溶液的全部内容物(20mL)从γ辐照瓶倒入50mL Falcon管。
3.将颗粒以1000rpm在室温下离心3分钟。
4.用Accel抹布沿Falcon管擦拭并使其回到BSC中。
5.用移液枪弃去上清液。不要倾倒或挤压小瓶，因为一些颗粒可能在溶液中再混悬。
6.将小粒在10mL无菌0.9％盐水中再混悬。良好混合。
7.以500μL等份将该溶液转移至无菌高压灭菌的微量离心管。注意：在罩中打开无菌高压灭菌的微量离心管包装。外部包裹不接触所述罩的任何表面并且不从打开的容器上方通过。
8.将微量离心管以1000rpm在室温下离心3分钟。
9.用Accel抹布沿小瓶擦拭，并将它们放回到BSC中。
10.使用微量移液管弃去上清液。
透明质酸制备
1.用Accel抹布擦拭所有小瓶。在制备过程中使用无菌技术。
2.使用注射器和针，将1mL脱气(DG)水添加至Glycosil小瓶。注意：Glycosil在存在氧的情况下交联；不除去盖。
3.将小瓶以水平位置振荡直至固体完全溶解。
4.使用注射器和针，将0.5mL DG水添加至Extralink-Lite小瓶。反转几次进行溶解。
5.一旦Glycosil已溶解，使用注射器和针将颗粒小粒在260μL Glycosil溶液中再混悬。
6.将65μL Extralink-Lite溶液添加至颗粒-Glycosil混合物。
7.将75μL 2％的利多卡因溶液添加至混合物，并用无菌1mL移液管良好混合。
注射器加载
1.在BSC内部，通过在BSC一侧放下无菌小花纹毛巾来产生无菌区。
2.使用开放戴手套技术(open gloving technique)，一位研究人员带上无菌手套。将该研究人员鉴别为无菌研究人员。
3.非无菌研究人员将无菌1cc注射器带入BSC。包装不接触任何表面。打开包装并放在无菌区上或放置在无菌研究人员附近。
4.对针重复步骤3。针号为26G。
5.非无菌研究人员以45度角握住含有皮肤填充剂的微量离心管，同时无菌研究人员将400μL吸入注射器。
6.将加载的注射器松开盖子。注意：将盖子靠在无菌区上并用一只手将针插入盖中。避免使用两只手，以防接触针或将针推入塑料盖。
7.将加载的注射器转移至邻近手术区上大鼠的无菌区。
8.在添加Extralink-Lite溶液30分钟内进行注射。可以制备Glycosil并在添加Extralink-Lite前，在微量离心管中保持长达4h。
具有胶原蛋白载体水凝胶的皮肤填充剂制剂
关键设备
1.生物安全柜
2.离心机(50mL Falcon管和微量离心能力两者)
3.移液枪
4.微量移液管
5.鲁尔锁注射器接头
胶原蛋白
1.65mg/mL微纤维去端肽胶原
溶液
1.70％乙醇。
2.无菌水
3.无菌盐水(0.9％)
4.利多卡因2％—CDMV Cat：123683
程序
方案
1.打开生物安全柜(BSC)。
2.用Accel抹布沿BSC擦拭。
3.从冰箱/冰袋除去HyStem包装。打开HyStem包装并使小瓶加热至室温。
4.使用70％乙醇沿50mL Falcon管和管架喷雾并将它们置于BSC中。将一个Falcon管用于收集颗粒；其它用作废物容器。
5.使用Accel抹布，沿移液枪擦拭，并将其转移至BSC。
6.对在具有可见的辐射指示标签贴纸的它们的未打开、收缩膜包装的瓶子中的γ辐照的颗粒照相。
7.用Accel抹布沿颗粒瓶擦拭，并将它们放入BSC。
8.振荡容器以使颗粒再混悬。
9.沿无菌0.9％盐水的新的瓶子擦拭并将其转移至BSC。
颗粒制备
1.使用无菌技术在BSC中完成所有材料转移步骤。使用无菌手套。
2.将两个γ辐照瓶的全部内容物(20mL)倒入两个50mL Falcon管。
3.将颗粒以1000rpm在室温下离心3分钟。
4.用Accel抹布沿Falcon管擦拭并使其回到BSC中。
5.用移液枪弃去上清液。不要倾倒或挤压小瓶，因为一些颗粒可能在溶液中再混悬。
6.将小粒在8.5mL无菌0.9％盐水中再混悬并合并。良好混合。
7.以1000μL等份将该溶液转移至无菌高压灭菌的微量离心管。注意：在罩中打开无菌高压灭菌的微量离心管包装。外部包裹不接触所述罩的任何表面并且不从打开的容器上方通过。
8.将微量离心管以1000rpm在室温下离心3分钟。
9.用Accel抹布沿小瓶擦拭，并将它们放回到BSC中。
10.使用微量移液管弃去上清液。
颗粒和胶原蛋白混合
1.在BSC内部，通过在BSC一侧放下无菌小花纹毛巾来产生无菌区。
2.使用开放戴手套技术(open gloving technique)，一位研究人员带上无菌手套。将该研究人员鉴别为无菌研究人员。
3.非无菌研究人员将无菌3cc注射器带入BSC。包装不接触任何表面。打开包装并放在无菌区上或放置在无菌研究人员附近。
4.非无菌研究人员将无菌鲁尔锁F/F注射器接头带入BSC。包装不接触任何表面。打开包装并放在无菌区上或放置在无菌研究人员附近。
5.非无菌研究人员从冰箱除去胶原蛋白注射器并用Accel抹布擦拭它们。将胶原蛋白注射器转移至无菌区。
6.使用无菌注射器和针，将0.58mL盐水添加至含有颗粒的微量离心管。
7.使用无菌注射器和针，添加0.28mL 2％的利多卡因。
8.无菌研究人员用3cc注射器和针吸取颗粒溶液。
9.将颗粒溶液注射器连接至含有1mL 65mg/mL胶原蛋白的3cc胶原蛋白注射器。避免气泡形成。在与鲁尔锁连接前，排出尽可能多的空气。这由无菌研究人员完成。
10.通过将一个注射器的内容物注射到其它注射器中，将该内容物混合40次。通过将颗粒添加至胶原蛋白注射器起始。
注射器加载
1.非无菌研究人员将无菌1cc注射器带入BSC。包装不接触任何表面。打开包装并放在无菌区上或放置在无菌研究人员附近。这些注射器用于最终注射。
2.对针重复步骤1。针号为21G。
3.此时，仅由无菌研究人员处理所有材料。
4.在混合系统中，将所有2.33mL皮肤填充剂转移至一个注射器中。从鲁尔锁断开空注射器。
5.将1cc注射器连接至鲁尔锁。
6.将400μL皮肤填充剂加载到1cc注射器中。注意：1cc注射器未在鲁尔锁上锁定；当加载时，维持对鲁尔锁的压力，从而加载压力不顶出1cc注射器。
7.将加载的注射器松开盖子。注意：将盖子靠在无菌区上并用一只手将针插入盖中。避免使用两只手，以防接触针或将针推入塑料盖。
8.将加载的注射器转移至邻近手术区上大鼠的无菌区。
表4：皮肤填充剂
Figure BDA0004113521020000651
作为比较，购买可商购的BellaFill并与如以上所描述的在胶原蛋白中混悬的目前所开发的纤维素颗粒相比，用于评价其粒径分布。所测量的PMMA珠的粒径分布确认了BellaFill中所指明的平均粒径。在显微镜图象中易于识别PMMA球并且表现为球形。为了使目前所开发的纤维素颗粒显像，在与如以上所描述的胶原蛋白(确认刚果红对胶原蛋白无非特异性染色)混合前，将它们用刚果红(0.1％)染色。在本发明所开发的制剂中，发现纤维素颗粒在整个胶原蛋白凝胶中良好分布。
图31显示了如所述的胶原蛋白填充剂。图31(A)显示了BellaFill中PMMA珠的粒径分布。图31(B)显示本发明所开发的皮肤填充剂中所使用的刚果红染色的胶原蛋白显示出极少的第二非特异性染色。图31(C)显示了BellaFill的PMMA珠。图31(D)显示了在用刚果红染色的胶原蛋白皮肤填充剂中所使用的目前所开发的纤维素颗粒。注意：胶原蛋白的背景染色比来自纤维素颗粒的信号低。比例尺＝250μm。
体内生物相容性
可以通过皮下动物模型评价本发明所开发的皮肤填充剂制剂的重要性能特征。对于每种制剂(如上所产生的AAS、AAHA、AAC)，可以在N＝9只动物的背部注射4个位点。每周，可以测量植入位点(高度、x和y宽度)并且4周，可以将N＝3只动物处死并切除植入物。在12周期间，制剂组中3只动物中仅有2只可以处死并且剩余动物可以维持用于纵向研究(例如，6-12个月)。这表示可以在更长期时间点获得每种制剂(AAS、AAHA、AAC)数据以提供分别来自4种植入物的数据，每种制剂一只动物。可以在伴随研究(companion study)中使用可商购的BellaFill。可以在3只动物(每只注射2×400μL)的研究中收集数据。这些研究可以产生GLP数据，GLP数据可以(例如)用于通告使用类似制剂和更大量动物的研究。所考虑的手术程序如下所述：
植入手术
术前检查
1.在开始程序前，检查以确定所有原料及供应品可用。检查下列物品：
a.氧气罐水平
b.异氟烷水平
c.无菌包
d.缝合材料
e.无菌盐水
f.无菌水
g.眼泪凝胶
h.丁丙诺啡
i.用于麻醉站的加热器
2.确保动物已称重并施用相应量的丁丙诺啡：0.05mg/kg。
3.计算要施用的盐水的量：5mL/kg。
4.打开氧气供应。设置为水平2。
5.打开异氟烷。将供应源连接至麻醉箱。设置为水平3。
动物制备
1.将大鼠转移至麻醉箱。
2.一旦大鼠无意识，将其转移至准备站。将异氟烷连接至准备站。
3.将异氟烷水平降低至2。
4.将眼泪凝胶应用于大鼠眼中。
5.将大鼠背部一侧备皮。
6.对皮真空吸尘。
7.用水浸棉拭擦拭皮肤以除去任何脱落的毛发。
8.使用干棉拭，从皮肤除去水并刷掉任何残留的毛发。
9.向大鼠未备皮侧注射盐水以维持水合。
10.将大鼠转移至手术区。
11.通过在氯己定(4％)中浸泡的棉拭对皮肤消毒。单向擦拭。确保擦拭所有皮肤。
注射
1.一位研究人员穿上罩衣并带上无菌手套。基于研究人员是否穿上新的罩衣，使用适当的戴手套技术(封闭/开放)。
2.将4个400μL注射带到邻近于动物的无菌区。
3.非无菌研究人员对注射前的注射位点拍照。
4.无菌研究人员将注射器内容物注射到大鼠无菌、备皮背部上的4个单独的位置。
5.非无菌研究人员对注射位点拍照。
6.将大鼠转移到测量站。
7.然后，将大鼠转移至恢复站，并将动物ID卡放置在恢复笼上。
每周尺寸测量
为了评价植入物尺寸，可以从注射当天开始应用以下程序并此后每周对所有动物应用。
使动物麻醉
1.打开氧气罐。
2.将异氟烷管线连接至麻醉箱。
3.将异氟烷调高至3。
4.将动物转移至麻醉箱。
5.一旦动物无意识并且深呼吸(每3秒呼吸一次)，将大鼠转移至测量站。将测量站的异氟烷设置为2。
测量
1.为了使测量尽可能可靠，从植入位点对皮进行备皮。
2.使用游标卡尺，测量通过皮肤填充剂注射所引起的皮肤下方的隆起的尺寸。在开始每组测量前，应将卡尺调零。
3.采集并记录尺寸测量(例如，直径X、直径Y、高度)。
4.当结束时，在植入位点周围画圆。
5.位点顺序为从头部至尾部方向；例如，位点1最靠近大鼠头部。
6.X轴处于中间-外侧方向，然而Y轴处于尾部-头部方向。
7.可以通过卡尺前端进行直径X和直径Y测量。
8.通过卡尺底部尖头测量高度。
9.一旦采集并记录测量，则将动物返回笼和动物房中。
10.确保所有水瓶以正确取向放回。
处死和组织采集
1.将动物转移至安乐死箱中。
2.当一起处理两只大鼠时(两个箱相连)，将CO2的初始流速设置为6，然后当大鼠无意识时，升高至12。
3.监测动物呼吸模式。等待至少5分钟。
4.确保呼吸停止1分钟。
5.关闭CO2。
6.将大鼠从安乐死箱中移出并将大鼠仰卧放置。
7.定位剑突并切开皮肤。
8.刺穿隔膜。心脏应可见。
9.切下心脏并确保血液开始混合。
10.将动物翻转为俯卧以暴露背部。
11.沿脊柱中心至肩部，从臀部切下皮肤。将皮肤剥离并切下结缔组织。皮瓣应含有植入/注射材料。
12.对皮瓣中的材料拍照，以直尺作为比例尺。
13.各个切掉植入物。确保皮肤位于材料下方。这将帮助在组织学期间定位样品并提供与天然组织的直接比较。
14.将样品快速转移至福尔马林(4％)。
15.基于植入物尺寸和要进行的染色，在福尔马林固定48或72h后将样品转移至70％乙醇。
组织学
可以将样品送至组织学研究以用于在石蜡块中包埋并随后切片。可以垂直于皮肤平面对石蜡块切片以观察植入物的横截面。可以在第一水平：距其边缘～500μm，并且在第二水平：进一步向组织中～1.5mm对植入物切片。这可以允许检查外边缘和植入物大致中间两者。安排H&E和Masson三色染色以及几个未染色的载玻片。
已获得了以下体内生物相容性结果。
所收集的体内生物相容性结果
基于上文所述的包含过滤、γ灭菌的纤维素基颗粒的填充剂，所研究的皮肤填充剂为盐水(AAS)、透明质酸(AAHA)和胶原蛋白(AAC)。将所有3种皮肤填充剂注入大鼠模型。
图32显示了皮肤填充剂注射结果。图32(A)显示了注射前并且(B)显示了注射后所绘制的隆起边界轮廓。图33显示了与20％去细胞化苹果来源的过滤颗粒和0.3％利多卡因合并的基于盐水、透明质酸(HA)和胶原蛋白的填充剂的切除。
如以上所描述的，每周测量所有动物和所有制剂的植入位点。植入物的尺寸特征如图34和35所示。图34显示了植入物尺寸。AAS(蓝色)、AAHA(红色)、AAC(黑色)和BellaFill(紫色)植入物的高度。所有植入物由于载体流体/水凝胶的吸收而随时间收缩。AAS制剂快速吸收。图35显示了植入物体积。AAS(蓝色)、AAHA(红色)、AAC(黑色)和BellaFill(紫色)植入物的体积。所有植入物由于载体流体/水凝胶的吸收而随时间收缩。AAS制剂快速吸收。
数据支持AAS填充剂由于盐水向动物身体的吸收而快速收缩。就胶原蛋白、HA和bellafill而言，植入物尺寸缓慢收缩，但是在初始注射后几个月仍保持可见。尽管动物数目较少，但是定性地，BellaFill和本发明所开发的皮肤填充剂的植入物尺寸特性大致类似。可能地，本发明所开发的填充剂可能不如BellaFill产品收缩的快，然而它们似乎达到了类似的基线尺寸。
在4、8和12周后，将适当的动物处死，并收集植入物组织。就AAS来说，仅填充剂颗粒在皮肤下方时可见，因为盐水快速吸收至动物体内(与所测量的尺寸数据一致)。因此，尽管皮肤填充剂的确不可再吸收，但是皮肤填充剂制剂中所使用的载体流体的确吸收。
实施例4—修饰的皮肤填充剂
在本实施例中考虑了修饰的皮肤填充剂。为了赋予对材料形状和粒径分布更大的控制，据考虑基于纤维素的材料可以溶解以使其交联成特定几何形状和/或尺寸。在某些实施方式中，考虑了几种交联方法，如与琥珀酸化学交联、氢氧化钠和脲处理以及使用海藻酸盐和氯化钙的复合材料。所考虑的样品溶解规程如下所示：
比例：50g去细胞化苹果＝1.568g纤维素材料
溶剂制备：
●DMAc：115℃，15分钟
●LiCl：180℃，48小时
规程：
●称量50g去细胞化材料
●在丙酮中浸泡(超声波浴中15分钟)
●离心以除去丙酮
●再重复上述两步两次
●在DMAc中浸泡(超声波浴中15分钟)
●离心以除去丙酮
●再重复上述两步两次
●以6g每50mL DMAc的比例添加LiCl
●在100℃保持1小时
●将温度降低至50℃，72小时(同时搅拌)
●通过水交换使纤维素再生。
实施例5—纤维素颗粒生产效率
本实施例中所述的研究设法对于使用苹果作为起始材料的基于纤维素的颗粒生产的潜在得率提供理解。
苹果样品的去细胞化
将由加拿大Fancy所提供的麦金托什(McIntosh)苹果分成3个单独的批次，并且对3个批次中的每一个称重。每个批次的重量如下表5所示。
表5：批次重量
批次 每批中的苹果数 批次起始质量(g)
1(AA124) 16 1927.58
2(AA125) 15 1902.37
3(AA126) 15 1885.11
在削皮前，用70％乙醇和Accel TB清毒剂清洗每批苹果。在削皮后，将每批样品切片至1mm厚度。除去苹果核，并将切片四等分。
为了使样品去细胞化，然后将它们置于0.1％ SDS中72小时，每天更换一次溶液。然后，用蒸馏水清洗每批样品三次，随后在100M CaCl2溶液中浸没24小时。在去细胞化过程期间，以120RPM振荡样品。
然后，用蒸馏水进一步清洗每批样品三次，并在70％乙醇中灭菌30分钟。然后，将样品在4℃，在蒸馏水中保存直至进一步使用。
冷冻干燥的去细胞化样品
将去细胞化样品排液以尽可能多的除去蒸馏水，然后置于50mL Falcon试管中。然后，将样品在-20℃冷冻，随后在玻璃容器中固定在Labconco冷冻干燥器上，每个玻璃容器3-4个试管。将样品在55mbar和-47℃冻干48小时。干燥后，将样品称重，其结果如下表6所示。
干燥样品的研磨
用Retsch Mill ZM-200以18,000RPM，通过80μm筛网，研磨每批去细胞化、冻干样品。在50mL管中收集颗粒并称重，如下表6所示。然后，将样品在4℃储存直至进一步使用。
筛分研磨样品
用允许连续筛分的Gilson振动筛(SS-23)系统筛分每批研磨样品。顶部筛具有50μm筛，并且底部筛具有25μm筛。50μm筛保留>50μm的颗粒。<25μm的颗粒通过25μm筛。从25μm筛收集过滤的颗粒(尺寸25μm至50μm)并称重。
研磨后，将来自每批次的5mL研磨样品在蒸馏水中再混悬，最终体积45mL。将再混悬液倾倒至50μm筛并且在2分钟后，添加150mL蒸馏水。1分钟后，将另外150mL的水加入至顶部筛(该步骤重复两次)。然后，除去50μm筛并将50mL的蒸馏水加入至25μm筛。1分钟后，将另外50mL的水加入至筛(该步骤重复两次)。收集25μm筛上的研磨样品的湿颗粒并置于离心管中。重复该过程直至所有研磨样品已过滤。然后，以5000RPM将过滤样品离心7分钟以使颗粒成粒，然后将小粒在4℃储存。
然后，将过滤、成粒的样品在以上所描述的相同条件下冻干并随后称重，如下表6所示。
表6：处理的批次重量
Figure BDA0004113521020000731
应注意实施第二次冷冻干燥仅为了测量样品干重并且对于皮肤填充剂样品生产不是必需的。
颗粒得率的确定
在以上程序期间使用所收集的数据，计算了3种不同颗粒得率，即从起始批次质量(完整苹果)、从冻干批料质量和从研磨批次质量。结果如表7所示。
表7：颗粒产率
Figure BDA0004113521020000732
采集得率平均值并且如表8所示。
表7：颗粒产率的平均值、标准偏差和标准误差
Figure BDA0004113521020000733
Figure BDA0004113521020000741
结果
使用干燥的25-50μm颗粒质量和批次起始质量计算了来自批次起始质量的得率。来自批次起始质量的得率百分比为0.119％±0.018％，表示从100g起始材料获得0.119g干燥颗粒，或者生产100g干燥颗粒需要83,843.38g苹果。
使用干燥的25-50μm颗粒质量和冻干批次质量计算了来自冻干批次质量的得率。来自冻干批次质量的得率百分比为13.9％±1.6％，表示从100g冻干样品获得13.9g干燥颗粒，或者生产100g干燥颗粒需要721.7g冻干批次样品。
使用干燥的25-50μm颗粒质量和研磨批次质量计算了来自研磨批次质量的得率。来自研磨批次质量的得率百分比为15.2％±1.5％，表示从100g研磨样品获得15.2g干燥颗粒，或者生产100g干燥颗粒需要658.0g研磨样品。
批次间得率的变化可以部分是由于样品制备所造成的。不受任何具体理论的束缚，假定苹果的大小、苹果核上残留的果肉的量、研磨期间的粉末损失和筛分期间分离度的变化可以单独或共同影响得率。
无论如何，本研究为放大本发明公开所述的方法时可能需要的材料提供了理解。
实施例6—纤维素颗粒的密度
本实施例中所述的研究设法确定本发明公开的纤维素颗粒的数量密度(单位体积的颗粒数)。通常，标准行业实践将就质量/体积浓度来描述皮肤填充剂的颗粒浓度。然而，在一些情况下，就数量密度来描述填充剂的颗粒浓度可以是有用的。
密度确定
如以上在实施例5中所描述的，使用也如实施例5所述的Gilson振动筛过滤所产生的去细胞化、无菌(未过滤)苹果颗粒。在15mL Falcon管中收集过滤的颗粒并通过以5000RPM离心7分钟成粒。重复该过程直至获得2.5mL湿的25-50μm颗粒。
将颗粒在15mL水中再混悬，然后等量分成3管(每管0.833mL颗粒)。从每个管中移除将在198μL水中混悬的33μL颗粒当量(16.7％v/v再混悬液)以用于使用Multisizer 4的颗粒计数分析。
将每个管中剩余的0.800mL过滤的颗粒成粒、冷冻、在55mbar，-46℃用Labconco冷冻干燥器冻干4天，然后称重以计算颗粒质量密度，如表8所示。
表8：单位湿体积的干燥颗粒质量
Figure BDA0004113521020000751
然后，计算单位湿体积的平均干燥颗粒密度并如表9所示。
表9：颗粒质量密度的平均值、标准偏差和标准误差
单位湿体积的干燥颗粒密度(g/mL)
平均值 0.118
标准偏差 0.00291
标准误差 0.00168
干燥颗粒密度为0.118g/mL±0.00168g/mL，表示每1mL湿颗粒存在0.118g干燥颗粒，或者一旦干燥，8.47mL湿颗粒称重为1g。
颗粒占据20％体积的标准400μL皮肤填充剂注射体积导致每次注射80μL颗粒。因此，基于以上所提供的浓度和密度结果，每400μL注射的颗粒干重为9.4mg。
颗粒计数分析
从3种样品中的每一种制备了两种样品：(4)将10μL 16.7％v/v的颗粒再混悬液与10mL ISOTON混合和(5)将20μL 16.7％v/v的颗粒再混悬液与10mL ISOTON混合。使用100μm的孔和200μL的分析体积，使用Multisizer 4库尔特计数器对每个样品实施颗粒计数分析，这表示在样品(4)中分析了0.0336μL颗粒并且在样品(5)中分析了0.0673μL颗粒。第一轮分析了2-60μm颗粒，并且第二轮分析了10-60μm之间的颗粒。
每次运行之间，还以相同设置，通过仪器分析了ISOTON(空白)样品以定量库尔特计数器所计数的气泡数。将这些值用于调整对于样品(4)和(5)所获得的那些值。空白值如表10所示。
表10：ISOTON(空白)颗粒计数
粒径间隔(μm) 所计数的颗粒数(平均)
2-60 541
10-60 26
样品(4)和样品(5)中每一个的颗粒计数分析结果如下表11所示。
表11：样品颗粒计数
Figure BDA0004113521020000761
Figure BDA0004113521020000771
出于说明性的目的，样品(4)的粒径分布如图36所示。对来自样品1-3的每一个的样品(4)和样品(5)的颗粒计数取平均值，其结果如表12所示。
表12：来自10μL和20μL样品的取平均值的颗粒计数分析
Figure BDA0004113521020000772
如以上所讨论的，所使用的孔为100μm。该孔可以计数直径在2μm至60μm之间的颗粒。根据2-60μm分析，每mL湿颗粒存在123,834,101±2,919,049个颗粒，并且10-60μm分析显示每mL湿颗粒有76,302,909±1,279,872个颗粒。
这表示每400μL皮肤填充剂注射存在9,906,728个颗粒(2-60μm分析)或者6,104,233个颗粒(10-60μm分析)。
基于半径15μm且厚度1μm的圆柱形颗粒几何形状假定，对于颗粒数目浓度的简化理论估计如下所示。如果厚度假定为0.1μm，则颗粒数目将增大10倍。
Vflake＝π(15μm)2(1μｍ)
Vflake＝706.5um3
Number of partｉcles＝Vpaｒticles/Vfｌake
Number of particｌes＝(80μL(1x109μm3/μL))/(706.5um3)
Number of particles＝1.13x108
理论值和观察值之间的差异可能是由于以下一些因素，包括：库尔特计数器分析中的不准确(例如，气泡、颗粒从混悬液中的沉降)、粒径变化和堆积参数(计算中未考虑的空隙体积)。
尽管存在这些差异，但是约1×107个颗粒/400μL注射的数目密度与9.4mg/400μL注射的干燥颗粒质量密度以及706.5μm3的单个颗粒(或薄片)体积估计组合提供了1.33g/cm3的单个颗粒密度，这与纤维素密度的文献值(1.5g/cm3)大致相同。
实施例7—对纤维素颗粒的体外细胞反应
本研究设法评价对本发明公开所述的过滤和未过滤的纤维素颗粒的体外细胞反应。
颗粒制备
为了制备过滤的颗粒，使用以下程序，使用无菌水，用Gilson振动筛(SS-23)系统，对无菌未过滤的去细胞化研磨苹果颗粒筛分。
将5mL颗粒在无菌蒸馏水中再混悬至最终体积45mL。将再混悬液倒在50μm筛网上，并在2分钟后添加150mL蒸馏水。1分钟后，将另外150mL的水加入至顶部筛(该步骤重复两次)。除去50μm筛网，并将50mL蒸馏水加入至25μm筛网。1分钟后，将另外50mL的水加入至筛(该步骤重复两次)。收集25μm筛网上的湿颗粒并置于50mL Falcon管中。重复筛分过程直至收集到足够量的过滤的颗粒。
将过滤和未过滤的颗粒两者以5000RPM离心7分钟以使所述颗粒成粒。将成粒的过滤和未过滤的颗粒的体积用于计算不同试验期间添加至板的体积。
测定
在加入至板之前，将所述颗粒在预热的DMEM中再混悬至最终体积2.5mL。在实验前24小时，将50,000个C2C12细胞在6孔板的每个孔中铺板(9.6cm2)。将细胞在37℃，5％ CO2中与颗粒溶液培育48小时。然后，将2.5mL颗粒溶液加入至每个孔中。
用于研究的条件为颗粒相对于细胞培养基的体积：体积百分比。所使用的百分比为1％、2％、3％和20％。换言之，1％的浓度在总体积2.5mL的培养基中具有25μL的颗粒。
选择20％的浓度以重复先前在本文所使用的体内浓度。然而，如将理解的，体外和体内条件极为不同并且必须选择浓度以不破坏细胞形态。例如，体外系统缺少调节气体交换和维持等渗条件的能力，并因此可能需要降低的浓度，如约1％，以不影响细胞形态。因此，体外结果可能不能直接转化为体内毒性结果。
细胞培养、固定、染色和成像
从板除去培养基和其中所含的颗粒以用于成像。相对高的颗粒浓度使其难以观察到下层细胞，因此在固定前除去所述颗粒。
使用5mL PBS清洗细胞三次。将3mL 3.5％的PFA加入至每个板。培育10分钟后，用5mL PBS再次清洗细胞。然后，将5mL PBS加入至细胞并用封口膜密封板并在4℃储存。5μLHoechst 33342加入至含有5mL PBS的每个板。将板在室温下避光培育30分钟，然后用封口膜密封并在4℃储存。
然后，用Olympus SZX16显微镜对板成像。
结果
在37℃，5％ CO2培育48小时后，20％v/v颗粒向C2C12细胞的添加对板中的细胞密度具有清楚的影响。尽管对于过滤和未过滤的颗粒两者存在一些对板贴壁的细胞，但是细胞形态改变使得它们出现皱缩。含有颗粒的板具有比对照明显更少的细胞，并且对照细胞显示出正常的成肌细胞形态。在接受过滤颗粒的板中汇合比具有未过滤的颗粒的板中的更高。不受任何具体理论的束缚，假设在体外环境中，小颗粒可以由于渗透作用引起细胞死亡，由于化学淋溶引起坏死，和/或引起吞噬和细胞凋亡。
在20％样品中，皿中颗粒的高浓度使其难以观察与板附接的细胞，并因此仅悬浮细胞可见。无颗粒细胞的成像使得能够更准确地进行细胞密度定量，因此在成像的同时无颗粒阻挡信号。
图37显示了20％样品的显微镜图象，其中图37A显示了对照的显微镜图象，图37B显示了20％过滤颗粒样品的细胞的显微镜图象，并且图37C显示了20％未过滤颗粒样品的细胞的显微镜图象。放大倍数为10×并且比例尺为500μm。
图38显示了20％过滤和未过滤的颗粒样品的细胞浓度(细胞/mm2)。
如以上所描述的，预期20％样品可能在体外条件下影响细胞形态。还如以上所讨论的，体外和体内条件完全不同。因此，预期20％的颗粒浓度将不会导致在体内产生改变的细胞形态。
媒介物中高浓度的颗粒可以改变溶液的渗透性，并因此由于熵的因素，可以从细胞中抽出水。另外，细胞上方的颗粒层可以防止有效的气体交换，并且反过来导致细胞死亡。在体内条件下，存在调节气体交换并补偿溶质浓度和渗压梯度或压力变化的天然系统。
因此，选择以下所讨论的低浓度以评价观察到正常细胞形态时颗粒浓度的影响。对于1％、2％和3％的低颗粒浓度，将颗粒混悬液用于过滤和未过滤样品两者。
图39显示了对照以及过滤和未过滤的低浓度样品的细胞的表面积覆盖度。如所示的，对于2％浓度，在过滤和未过滤颗粒之间存在显著性差异。
结果表明颗粒浓度可能对细胞存活能力具有影响——媒介物中颗粒量的增加可以导致更高的细胞死亡率。此外，过滤似乎还影响贴壁细胞的量。未过滤的颗粒通常导致较少的细胞生长/细胞区域覆盖度和较大的细胞死亡。
再次，如以上所讨论的，由于渗透压调节、气体交换过程、免疫细胞等，不能将准确的颗粒浓度直接从体外系统转化到体内系统。
例如，体外和体内系统之间的氧扩散存在显著变化。更详细地，体外系统依赖于通过细胞培养基的氧扩散。氧气必须扩散通过的距离通常比哺乳动物组织中通常所需的距离大得多。另外，标准细胞培养条件中的氧消耗速率通常超过氧气通过细胞培养基的扩散速率并且纤维素颗粒的存在可以进一步降低扩散速率。
体外和体内系统之间不同的另一个变量是对于细胞的渗透压，具体地膨压(turgor pressure)的维持。流体静压力(HP)的生理学值在组织之间显著变化(例如，从约0.5kPa至约6MPa)。溶液中溶质的数目可以影响渗透压，并且反过来影响细胞体积。因此，在体外系统中，纤维素颗粒的加入可以影响渗透压并导致细胞死亡。
此外，细胞培养系统中的细胞类型不同于体内细胞。在具有免疫能力的动物中，引发免疫细胞对异物应答。然而，体外，存在可以发生的有限过程(例如，吞噬)。
无论如何，以上研究通常可以说明颗粒浓度升高对细胞的影响。
实施例8—使用UV-VIS光谱评价纤维素颗粒浓度
本研究设法确定UV-VIS光谱是否是用于测量纤维素颗粒浓度的量筒、有刻度的falcon管和微量离心管的可行的替代。
更详细地，本研究旨在确定通过样品的吸光度或透光度是否可以适合于更准确地确定其中纤维素颗粒的浓度。
不受任何具体理论的束缚，该实验背后的原理在于纤维素颗粒可以散射入射光并且散射的量可以指示样品中颗粒的浓度。吸光度是透光度的负对数，换句话说，是入射和透射辐射通量之比的对数，如下所示。
A＝-log10T
A＝log(Φi/Φt)
其中A＝吸光度，T＝透光度，Φi＝入射辐射通量，并且Φt＝透射辐射通量。
样品制备
将研磨、去细胞化的梨来源的颗粒在2M蔗糖溶液中混悬。使用蔗糖溶液，因为所述颗粒不会单独在水中保持混悬。下表12中列出了所制备的溶液。
表12：样品浓度
Figure BDA0004113521020000811
光谱学
使用了Cary 1E型和Synergy型UV-VIS分光光度计。对于Carey型，将波长设置为500nm，将平均时间设置为0.1s，并且将SBW设置为1.5nm。使用标准1cm比色皿。由于Carey型是双光束型；因此，将两个2M蔗糖溶液用作空白。将机器调零，然后改变最靠近用户的比色皿用于样品读数。
将样品用于产生标准吸光度-浓度曲线，如图40所示。然而，如所示的，高浓度范围(5-20％)的截距不接近于零，这表明测量不正确，或者所分析的曲线部分在低浓度发生非线性。
将Synergy型UV-VIS光谱仪用于测试低浓度范围。将20％储液依次稀释并在450nm、475nm、500nm和525nm测量吸光度。图41显示了结果。
还将Synergy型UV-VIS光谱仪用于对20％储液和2M蔗糖对照溶液实施波长扫描。结果如图42所示，其中黑线代表蔗糖并且红线代表梨来源的颗粒。如所示的，在测试范围中未发现峰值吸光度，并且颗粒和蔗糖两者在较短波长下具有更高的吸光度。
由于吸光度在320nm较高，因此用320nm的光分析以上所描述的连续稀释的吸光度。结果如图43所示。如所示的，发生了更平缓的非线性偏差。最高5％浓度的线性拟合获得了0.99的R2，0.2的斜率和0.05的y截距。
结论
这些初步结果显示最高5％的颗粒浓度可以用于建立标准曲线以确定样品中纤维素颗粒的浓度。
实施例9—含有纤维素颗粒的多种载体的挤出作用力
本研究设法检验载体以及其它变量对本发明公开的皮肤填充剂的挤出作用力的影响。
制备了4种用于测试的制剂并且在下表13中进行了详细描述。用Retsch研磨机和80μm过滤器，将在制剂中所使用的冻干的去细胞化苹果颗粒研磨成薄片。然后，使用45μm和25μm常规焊接的Gilson筛和Gilson测试振动器对薄片进行湿筛。通过以5000rpm离心7min浓缩过滤的颗粒。
表13：制剂总结
Figure BDA0004113521020000831
应注意在使用前通过在水浴中加热至37℃将明胶和海藻酸盐制剂熔化。
对于测试，选择5mm的挤出距离。对于所使用的注射器，将初始加载体积设置为0.3mL，这对于活塞十字头移位对应于5mm的距离。由于制剂为粘弹性流体，挤压或挤出速度影响所测量的挤出作用力。研究了1mm/s、2.5mm/s和5mm/s的挤出速度(也称为十字头速度)以及不同尺寸的针，即27G针和30G针的影响。
结果
在1mm/s的十字头速度测量HAAA制剂的挤出作用力。图44显示了N＝14次挤出的作用力-位移曲线。针号为27G。
由于挤出速度对惯性力有影响，因此它可以用于限定挤出速度以帮助比较本文所描述的皮肤填充剂和常规皮肤填充剂。下表14中包括了BellaFill挤出性质。
表14：1mm/s速度和26G针的BellaFill挤出性质
Figure BDA0004113521020000841
图45显示了以0.48mm/s通过26G的BellaFill挤出作用力的补充作用力-移位图。
对于HAAA制剂观察到了类似的结果。使用HAAA的另一轮测试如图46所示。在该轮中，HAAA不同于如上所述的情况，因为添加了额外的交联剂和颗粒，这导致了4.8％的HA浓度和28％的颗粒浓度。将十字头速度设置为1mm/s(实线)、2.5mm/s(短划线)和5mm/s(虚线)。如所示的，更高的速度导致更大的作用力，并且对于最高的速度，未观察到平台。此外，在中等速度下所观察到的初始峰值作用力在缓慢挤出中不存在。不受任何具体理论的束缚，峰值的缺少可能是由于在注射器和针中剪切期间的速度响应流体所造成的。
在1mm/s十字头速度测量GE样品的挤出作用力并比较27G针和30G针。图47显示了结果，其中图47A显示了通过27G针的GE挤出作用力，并且图47B显示了通过30G针的GE挤出作用力。所测量的最大挤出作用力如下表15所示。
表15：GE制剂最大挤出作用力
针号(G) N 平均值 SD SEM
27 10 5.8201 1.3500 0.1133
30 10 12.5858 2.4788 0.7838
较小的针导致了显著更大的最大挤出作用力。
通过27G针，以1mm/s的挤出速度测量GEAA样品的挤出作用力。结果如图48所示。所测量的最大挤出作用力如下表16所示。如所示的，颗粒的包含显著提高了GE制剂的挤出作用力。还应注意GEAA制剂结果不显著不同于HAAA结果。
为了直接比较GE和GEAA制剂的结果，将GE制剂稀释至20％(m/v)。在挤出前，通过将制剂维持在37℃水浴中使稀释的GE制剂保留温热。挤出期间的温度为约24.5℃。稀释的GE挤出的结果如图49A所示。如所示的，稀释的GE显示出“经典的”挤出-作用力曲线，其具有初始峰值以及随后的平台。
由于明胶胶凝随温度而变，因此还使用相同操作参数在室温(约21℃)下测量了稀释的GE制剂的挤出作用力。结果如图49B所示。如所示的，不含颗粒的室温稀释的GE制剂具有比温热的稀释的GE制剂和GEAA制剂两者更高的挤出作用力。最大挤出作用力的比较如表16所示。
表16：稀释的GE和GEAA制剂的最大挤出作用力
Figure BDA0004113521020000851
使用27G针和1mm/s的挤出速度测量了AL制剂的挤出作用力。结果如图50所示。
因此，本文所述的皮肤填充剂的挤出作用力可以受所使用的载体、载体的协调以及挤出速度的影响。
实施例10—碱化的去细胞化组织的湿重和干重之间的比较
通过将去细胞化的苹果以1：5(m/v)的比例增添至1M NaOH，产生了碱化的苹果(AA)。边搅拌，边在80℃碱化1小时，并加入过氧化氢(30％储液)以减轻颜色。反应完成后，从热源除去烧杯并用HCl中和溶液。通过在Sorvall ST 16R离心机或Avanti J-26XPI高性能离心机中离心浓缩材料。然后，除去上清液并将碱化的AA材料小粒在水中再混悬。重复中和和离心过程直至对于背靠背循环，pH保持在6.8至7.2之间。一旦中和，实施最终离心，并在50mL Falcon管中收集材料，并随后储存在冰箱中。
湿重和干重之间的比较
将约1g 3个不同批次的碱化AA材料称重。将称重样品在-20℃冷冻，然后使用LabConco冷冻干燥器在55mbar和-46℃冻干24小时。一旦干燥，对样品再次称重。下表17中总结了结果。
表17：碱化AA材料的湿重和干重
样品 湿重(g) 干重(g) 得率(干重/湿重)(％)
1 0.99 0.04 4.04
2 1.00 0.07 7.00
3 1.00 0.04 4.00
4 1.0059 0.0597 5.93
5 1.007 0.0398 3.95
6 1.0034 0.0570 5.68
7 1.0084 0.0558 5.53
尽管对于碱化AA材料湿重相同，但是最终的干重不同。平均干重为0.052±0.005g(平均值±平均标准误差)。干重得率的变化可能是由于起始材料湿度、不同离心机的使用和/或其中样品材料所采集自的小粒的变化所造成的。
实施例11—离心对碱化苹果密度的影响
除了使用Avanti离心机(8000rpm，15min)将两批次在具有0.75L体积的1L Avanti离心瓶中旋转沉淀外，使用以上实施例10中所列的相同方法制备了两批碱化AA。在离心期间，将体积保持不变以尽可能使压紧作用力标准化。然后，使用Sorvall台式离心机(5000rpm，15min)将一批次在具有50mL总体积的50mL管中离心。
制备后，进一步离心的批次(批次1)产生了约3.5个50mL管的材料，而未进一步离心的批次(批次2)产生了约2.5个50mL管的材料。因此，密度不同。
为了定量密度变化，将用1cc注射器所测量的0.5mL样品挤出到预先称量的15mLFalcon管中。随后记录质量(湿重)。然后，将管置于-20℃冰箱中。一旦冷冻，将样品固定至0.1mbar和-55℃的Buchi冷冻干燥器上并保持过夜。随后几天，记录具有干燥材料的管的质量。所记录和计算的质量如下表18所示。
表18：所测量和计算的碱化AA批次的质量
Figure BDA0004113521020000871
因此，改变离心参数可以影响所产生的碱化AA材料的密度。这些变化可以影响碱化AA材料的混合能力、流变性质和挤出作用力。
实施例12—在所设置的离心条件下碱化苹果的质量密度和干重百分比
根据实施例10中所列程序制备碱化AA样品。应注意仅在8000RPM使用Avanti离心机15min来浓缩碱化AA材料(成粒)。
对于每个样品记录碱化AA材料的湿重。然后，将材料转移至15mL Falcon管中。记录管、盖和碱化AA材料的重量。
然后，将样品在-20℃冷冻并固定在0.1mbar和-55℃的Buchi冷冻干燥器上。24小时后，除去样品。记录管、盖和样品质量，从而在从管除去干燥AA材料期间发生材料损耗的情况下，具有可以计算从所述干燥的碱化AA材料可减去的质量。
最后，除去干燥的碱化AA材料并称重。质量测量如下表19所示。
表19：冷冻干燥前后碱化AA样品的质量测量
Figure BDA0004113521020000881
使用干重，计算湿重的干重百分比。结果如表20所示。
表20：湿重(g)的干重百分比
样品 干重(％)
1 4.49
2 4.72
3 4.73
4 2.31
5 2.64
因此，平均干重百分比为3.78，标准偏差为1.20并且标准误差为0.54。
除干重百分比外，还计算了样品质量密度。为了计算质量密度，将来自每种样品的1mL湿碱化AA材料加载到注射器中并挤出。结果如表21所示。
表21：湿碱化AA材料的质量密度
Figure BDA0004113521020000882
Figure BDA0004113521020000891
因此，平均密度为0.92，标准偏差为0.03并且标准误差为0.02。
所计算的密度与碱化AA材料制备期间进行的半定量观察相匹配——即50mLFalcon管含有约50g材料。这表示湿碱化AA材料的质量密度类似于水。照此，单独的湿密度测量可能不足以计量碱化AA材料的浓度。可以使用冻干干重代替湿重(g)或与湿重(g)组合。
结论
当放大本发明公开所述的方法时，本实施例的结果可以用于质量保证目的。例如，数据可以用于使特定产品中存在的碱化材料的量标准化。
同样，当放大本文所描述的方法时，结果可以影响潜在标准操作程序(SOP)。例如，可以实施SOP以降低在整个程序期间由注射器中的“死”顶部空间或者通过将质量向管中，从管离开或在管间转移所引起的质量变化。
实施例13—碱化苹果的质量密度和稀释
本研究设法确定是否可以通过计算储料的质量密度并因此稀释来调整碱化AA的干重含量。
根据实施例10和实施例12中所列的程序制备了湿和干碱化AA样品。在样品制备后，将它们稀释。制备期间以及稀释前后的样品质量如下表22所示。
表22：稀释的碱化苹果(merAA)样品的质量
Figure BDA0004113521020000892
Figure BDA0004113521020000901
然后，将样品密度计算为原始湿重(g)的干重％，如上表22所示。因此，显然可以通过稀释调整本文所描述的碱化纤维素材料的密度。
此外，如上所示，通过提高水清洗的稀释以及在蒸馏水中的离心，在离心后产生了低密度碱化AA材料。然而，还发现在最终离心前，样品与PBS的培育可能恢复样品的最初观察到的密度。PBS对碱化AA样品密度的影响如图51所示。
定性地，似乎约4％至约5％或以上的密度适合于在皮肤填充剂中使用。
实施例14—碱化期间NaOH和苹果之间的关系
本研究设法研究用于AA碱化的AA材料与NaOH溶液的适合的质量与体积比。更详细地，通常将去细胞化AA与1M NaOH的1：5的比例用于碱化程序。本研究旨在确定将以足以适合于在皮肤填充剂中使用的足够小的颗粒尺寸获得碱化AA的AA材料与NaOH溶液的最小比例。
实验规程如下所述：
1.将3部分去细胞化AA称重：20g、50g和100g。挤压所有AA材料以除去过量水分。
2.将3个1L烧杯充入100mL 1M NaOH并置于磁力搅拌板上。
3.将所有溶液加热至80℃；然后，分别加入搅拌棒和去细胞化AA部分之一并适当标记，其对应于所添加的AA的重量。
4.将5mL 30％的过氧化氢(H2O2)加入至每个烧杯。
5.将全部3种溶液在80℃搅拌1小时。
6.碱化后，从它们各自的加热板除去所有烧杯并使其完全冷却至室温。
7.一旦冷却，将所有3种溶液中和并分别离心直至获得中性和稳定的pH(pH范围：6.8-7.2)。
8.将所测试的三种条件(即20g AA在100mL NaOH中，50g AA在100mL NaOH中和100g AA在100mL NaOH中)分别储存在冰箱中的50mL Falcon管中以用于后续显微镜观察。
9.对于颗粒分析，将3种AA比NaOH的条件中的每一种在蒸馏水中再混悬，用刚果红染色10分钟，并安装在显微镜用载玻片上。
10.使用SZX16 Olympus显微镜，使用荧光显微镜(BV滤光器)以2.5X放大倍数使载玻片成像。
图52中显示了显微镜图象，其中图52A是1：5AA：NaOH，图52B是1：2AA：NaOH并且图52C是1：1AA：NaOH。如所示的，使用AA与NaOH溶液1：1之比，可实现充分碱化。同样，尽管AA：NaOH的1：1和1：2之比具有一些较大的颗粒，但是在整个图像中较大的颗粒通常是不常见的。
使用Fiji ImageJ对显微镜图象设阈并分割。在将其转化为二进制后，将分水岭算法(watershed)应用于图象。使用Analyze Particles(分析颗粒)插件计算费雷特直径。结果如图53所示。如所示的，颗粒尺寸的柱状图在3种不同的AA：NaOH比例间类似。
还以0.05的显著性水平，通过Tukey事后分析实施ANOVA分析。结果如表23和24所示。
表23：粒径分布统计
Figure BDA0004113521020000921
表24：粒径分布的ANOVA
Figure BDA0004113521020000922
因此，尽管粒径分布在定性方面类似，但是3个分布的平均值彼此在统计学上不同。方差检验显示无显著性差异，并因此平均值的差异可以是由于真实差异、有限的样本量、更高浓度AA样品的结块或者所述苹果材料的变化所造成的。
考虑到以上情况，尽管AA：NaOH的1：1和1：2比例可以用于碱化，但是1：5的比例可以是最优的，这至少部分是由于溶液最不粘稠。应注意更高浓度的AA可以获得类似的结果，但是可能更难以混合。
实施例15—从碱化苹果移除小颗粒
本研究设法研究在碱化材料的颗粒过滤期间除去较小的颗粒(例如，小于20μm)。
在本研究中，将未过滤、研磨的去细胞化梨颗粒与碱化去细胞化AA材料混合，因为这些梨颗粒通常包含比苹果颗粒更多的具有小于20μm的尺寸的颗粒。
将10mL碱化AA与10mL未过滤的去细胞化梨粉末组合。用蒸馏水稀释样品至750mL的最终体积。
根据以下程序实施研究：
1.产生混合物。
2.收集用于染色和成像的等份。
3.将材料在Avanti离心机(8000RPM，15min)上离心以形成小粒。
4.从上清液收集用于染色和成像的等份。
5.除去所述上清液。
6.从小粒收集用于染色和成像的等份。
7.使用振荡筛，在45μm可高压灭菌的Gilson筛上筛分所述小粒以过滤材料并用150mL dH2O清洗3次。
8.收集用于染色和成像的筛分材料等份。
9.通过再次离心浓缩材料。
11.弃去上清液。
12.从最终材料收集用于染色和成像的样品。
通过向样品添加等体积的0.2％刚果红(0.5mL)完成染色。由于浓度变化，根据需要稀释样品。使用具有BV滤光器的SZX16立体显微镜，以2.5×和10×放大倍数使染色颗粒成像。使用Fiji ImageJ分析图像。
将每个条件N＝20幅图象组合成图像栈(stack)。将图像栈转化为二进制，并正确调整亮度和对比度设置。为了分割图像且无寄生噪声，应用高斯滤波器(对于2.5×，2px并且对于10×，5px)。使用分析颗粒(Analyze Particles)插件。由于单一像素尺寸较小，未对2.5×图像应用粒径限制。对于10×图像，将下限设置为单一像素噪音(0.8μm2)。将费雷特直径用作粒径的量度。
结果
图54显示了用刚果红染色的初始碱化AA和梨粉末混合物(在离心前)的显微镜图象，其中图54A显示了比例尺为500μm的显微镜图象，并且图54B显示了比例尺为100μm的显微镜图象。如所示的，观察到了尺寸小于20μm的颗粒。如以上所讨论的，由于梨粉末的添加，这是所预期的。
图55显示了在混合物第一次离心后收集的用刚果红染色的上清液的显微镜图象，其中图55A显示了比例尺为500μm的显微镜图象，并且图55B显示了比例尺为100μm的显微镜图象。如所示的，所述上清液具有未浓缩成小粒的小颗粒。
图56显示了在用刚果红染色的混合物的第一次离心后所形成的小粒的显微镜图象，其中图56A显示了比例尺为500μm的显微镜图象，并且图56B显示了比例尺为100μm的显微镜图象。如所示的，观察到了尺寸小于20μm的颗粒，其类似于初始混合物。
图57显示了在筛分后用刚果红染色的小粒样品的显微镜图象，其中图57A显示了比例尺为500μm的显微镜图象，并且图57B显示了比例尺为100μm的显微镜图象。如所示的，存在少数所观察到的尺寸小于20μm的颗粒。
图58显示了在最终离心后用刚果红染色的小粒样品的显微镜图象，其中图58A显示了比例尺为500μm的显微镜图象，并且图58B显示了比例尺为100μm的显微镜图象。如所示的，存在少数所观察到的尺寸小于20μm的颗粒。应注意由于混合物中存在两种类型的材料，因此颗粒尺寸分布较大。
图59显示了作为颗粒的费雷特直径的相对频率显示的以2.5×采集的每幅显微镜图象的颗粒分布。图60显示了以2.5×采集的每幅显微镜图象的颗粒分布，其中图60A显示了在最终离心后小粒的粒径分布，图60B显示了筛分小粒的粒径分布，图60C显示了在第一次离心后小粒的粒径分布，图60D显示了上清液的粒径分布，并且图60E显示了初始混合物的粒径分布。
图61显示了作为颗粒的费雷特直径的相对频率显示的以10×采集的每幅显微镜图象的颗粒分布。图62显示了以10×采集的每幅显微镜图象的颗粒分布，其中图62A显示了在最终离心后小粒的粒径分布，图62B显示了筛分小粒的粒径分布，图62C显示了在第一次离心后小粒的粒径分布，图62D显示了上清液的粒径分布，并且图62E显示了初始混合物的粒径分布。
如所示的，在筛分后尺寸小于20μm的颗粒的存在显著减少。似乎在筛分后离心不导致产生多个小颗粒。此外，上清液样品含有小颗粒。因此，离心可以通过差速离心帮助除去小颗粒。该结论至少部分受到10×图像的支持。2.5×图象具有更大的N值；然而，10×图象的补充是有用的，因为2.5×图象的单一像素尺寸为12.25μm2。
此外，应注意分布不匹配纯材料的那些分布。由于该测试涉及双组分混合物，因此预期双峰值分布。
还计算了尺寸小于20μm的颗粒百分比并且如表24所示。
表25：尺寸小于20μm的颗粒百分比
Figure BDA0004113521020000951
因此，显然本发明公开所述的方法对于除去可能不适合在皮肤填充剂中使用的较小尺寸的颗粒可以是有效的。
实施例16—挤出后碱化材料的粒径
本研究设法检验碱化的去细胞化植物组织在通过注射器挤出前后的粒径。
通过在除去活塞轴后将材料回填，将使用实施例10中所列程序所制备的未稀释的碱化AA材料加载到注射器中。一旦转移材料，则将活塞插入并将27G针固定至注射器。然后，从第二注射器除去活塞，并且将第一注射器用于通过27G针挤出材料。实施该步骤以除去可以堵塞针的任何大的材料。
用最终浓度0.1％的刚果红对AA材料染色。为了进行染色，通过F/F鲁尔锁接头，将1mL AA材料与1mL 0.2％0.22μm过滤的刚果红组合。将溶液前后混合30次。将染色溶液在室温下保持培育10min。所得溶液对于颗粒分析成像过浓，因此使用用于冲洗的无菌水1/64稀释。对于对照样品，在任何时间点不通过27G针挤出AA材料。
使用2-像素高斯模糊滤光器，以2.5×将SZX16立体显微镜用于样品成像。对于挤出之前(对照)和之后的样品采集代表性区域的10幅单独的图像。
对于颗粒分析，将图象导入Fiji ImageJ并组合成图像栈。调整基础亮度和对比度设置。将图象转化为8位文件，然后对它们设阈以确保捕获到颗粒。将图象转化为二进制并应用分水岭插件。用分析插件分析所得图像栈。将费雷特直径用作粒径参数。
图63显示了挤出前后AA材料的粒径分布。粒径分布的描述性统计学如表26所示。
表26：粒径分析的描述性统计学
Figure BDA0004113521020000961
因此，显然通过27G针挤出不引起尺寸小于20μm的颗粒增加。
还发现对于挤出前后群体，小于20μm的颗粒百分比分别为1％和0.85％，这与常规皮肤填充剂制剂一致。
实施例17—碱化颗粒浓度对挤出作用力的影响
本研究设法研究碱化颗粒浓度对皮肤填充剂的挤出作用力的影响。
测试了3个制剂。制剂由5mL注射器制成并将0.3ml体积转移至1cc注射器。使用联锁接头将制剂在注射器间充分混合。将制剂在注射器间前后混合30次。下表27中列出了所测试的制剂。
表27：用于挤出作用力研究所制备的制剂
Figure BDA0004113521020000971
将CellScale Univert装置用于测试制剂的挤出作用力。使用固定至两个相邻铁架上的两个夹子将含有制剂之一的1cc注射器之一定位在装置内。
还研究了针号、注射器类型和挤出速度的影响。相对于针号，1cc注射器配备了27G针和30G针并且在它们之间比较了结果。对于注射器类型之间的比较，使用标准1cc注射器和BellaFill注射器完成测试。对于挤出速度，以1mm/s、2.5mm/s和5mm/s的挤出速度从配备有27G针的1cc注射器挤出制剂。仅使用Mer100制剂完成这些测试。
结果
图64显示了挤出作用力测试结果，其中图64A显示了水从1cc注射器N＝10次挤出的作用力-位移曲线，图64B显示了Mer20Sal80制剂从1cc注射器N＝10次挤出的作用力-位移曲线，并且图64C显示了Mer100制剂从1cc注射器N＝10次挤出的作用力-位移曲线。
图65显示了对于每种制剂所记录的最大挤出作用力。最大挤出作用力的统计如表28所示。
表28：最大挤出作用力的统计
Figure BDA0004113521020000981
对所记录的最大挤出作用力进行ANOVA分析，其结果如下表29所示。
表29：最大挤出作用力的ANOVA分析
Figure BDA0004113521020000982
还分析了制剂的平台挤出作用力。平台挤出作用力表示制剂的平均挤出，并因此排除了挤出作用力的逐渐升高以及挤出完成后挤出作用力的释放。相对于所记录的作用力-位移曲线，平台挤出作用力对应于约1mm至约8mm的移位范围。
图66显示了平台挤出作用力的比较。平台挤出作用力的描述性统计学如表29所示，并且其ANOVA分析如表30所示。
表29：平台挤出作用力的描述性统计学
Figure BDA0004113521020000991
表30：平台挤出作用力的ANOVA分析
Figure BDA0004113521020000992
因此，根据以上内容，未稀释的碱化材料(即Mer100)具有比Mer20Sal80和水制剂显著更大的挤出作用力。同样，Mer20Sal80和水制剂的挤出作用力之间无显著性差异。这表示尽管Mer20Sal80和水制剂的粘度稍有不同，但是差异通过本实施例中所列实验不可辨别。
图67显示以1mm/s的十字头速度通过27G针(蓝线)和通过30G针(红线)挤出的Mer100制剂的作用力-位移曲线。
图68显示了来自标准1cc注射器(蓝线)和BellaFill注射器(黑线)的以1mm/s十字头速度通过27G针挤出的Mer100制剂的作用力-位移曲线。
图69显示了图67和图68中所实施的运行的最大挤出作用力，其中“BD注射器”是指标准1cc注射器并且“BF注射器”是指BellaFill注射器。表31显示了最大挤出作用力的描述性统计学并且其ANOVA分析如表32所示。
表31：不同针号和注射器类型的最大挤出作用力的描述性统计学
Figure BDA0004113521020001001
表32：不同针号和注射器类型的最大挤出作用力的ANOVA分析
Figure BDA0004113521020001002
单因素方差分析显示在两种注射器类型之间未观察到最大挤出作用力的显著性差异。然而，30G针具有显著高于27G针的挤出作用力。
图70显示了以1mm/s(黑线)、2.5mm/s(蓝线)和5.0mm/s(红线)的十字头速度通过27G针挤出的Mer100制剂的作用力-挤出曲线。图71显示了每个十字头速度的最大挤出作用力。每个十字头速度的最大挤出作用力的描述性统计学如表33所示，并且其ANOVA分析如表34所示。
表33：不同十字头速度的最大挤出作用力
Figure BDA0004113521020001011
表33：不同十字头速度的最大挤出作用力的ANOVA分析
Figure BDA0004113521020001012
如所示的，以5mm/s的十字头速度，挤出作用力显著高于1mm/s和2.5mm/s的作用力。
实施例18—载体对皮肤填充剂制剂的挤出作用力的影响
本研究设法研究明胶对皮肤填充剂制剂的挤出作用力的影响。
使用实施例10中所列程序制备碱化AA。然后，将碱化AA材料加载至3mL HSW注射器中并使用F/F鲁尔锁接头转移至1cc注射器。然后，通过30G针将碱化AA材料挤出至干净的3mL注射器，接着通过27G针。
将1g晶体明胶(GE)粉末加入至1.25mL非无菌水以制备40％(m/v)储液。将另外1.25mL水加入至储液。将溶液在室温下保持溶胀1小时。在使溶液溶胀后，将温度升高至60℃，并将明胶在几分钟内溶解。所得明胶在4℃仍是流体，而标准Knox明胶产生了在低于约30℃的温度下胶凝的粘稠溶液。
使用碱化AA和明胶制备多种制剂。下表34中列出了制剂。使用加载到3mL注射器中的明胶溶液(通过移液管制备)制备所述制剂。通过鲁尔锁接头将碱化AA材料转移到3mL注射器。一旦转移了碱化AA材料，则弃去注射器并将新的3mL注射器连接至鲁尔锁接头。然后，使溶液在3mL注射器之间通过30次以产生制剂。
表34：明胶(GE)和碱化AA(merAA)制剂的总结
Figure BDA0004113521020001021
将CellScale Univert装置用于测试1mm/s十字头速度时制剂的挤出作用力。装置与实施例17中所述相同，除了将支撑杆固定在两个架子之间。使用12mm挤压完成5次运行。使用15mm挤压完成第6次运行。
还作为对照测试了BellaFill皮肤填充剂。将对照通过目视和质构与所测试的明胶制剂相比较。通常，可以操纵BellaFill和本发明公开的制剂两者以形成保持它们形状的小球。同时，本发明公开的制剂触摸时感觉更水合并且更加透明。
结果
图72显示了以1mm/s的十字头速度通过27G针挤出的制剂的作用力-位移曲线，其中图72A显示了5％ GE制剂的作用力-位移曲线，图72B显示了2.5％ GE制剂的作用力-位移曲线，图72C显示了1％ GE制剂的作用力-位移曲线，图72D显示了0.5％ GE制剂的作用力-位移曲线，并且图72E显示了0.25％ GE制剂的作用力-位移曲线。图73显示了每种制剂的最大挤出作用力。应注意使用2.5％ GE制剂仅实施了4次运行。
所测试的BellaFill皮肤填充剂超过了UniVert装置的10N测力计。
结论
如所示的，明胶浓度对制剂的挤出作用力不具有显著影响。同样，制剂显示出低于用作对照的BellaFill皮肤填充剂的最大挤出作用力。
所观察的作用力-位移曲线通常比以上研究具有更多噪音。不受具体理论的束缚，假定更紧固的装置(由支撑杆的使用所产生)可能有助于噪音，因为支撑杆防止了可能使曲线平滑或阻抑曲线的装置的任何弯曲或折曲。
实施例19—本发明公开的皮肤填充剂的流变学
本研究设法研究本发明公开的皮肤填充剂的流变性质。
根据实施例10中所列程序制备碱化AA材料。一旦制备，用水50％稀释一部分碱化AA材料。
使用配备有1N测力计的CellScale UniVert装置进行振荡机械测试。将样品置于使用夹在UniVert装置中定位的烧杯中。
将循环挤压用于对碱化AA样品施加正弦应变(5％)。振荡运动使得能够计算应力和应变之间的相角。由于应变是振荡函数，因此测量了动态模量。使用杨氏模量以及相差计算材料的储能模量和损耗模量。
结果
图74显示了碱化AA样品的应力和应变对应时间的图，其中图74A显示了未稀释的碱化AA样品的应力和应变对应时间的图，并且图74B显示了稀释的碱化AA样品的应力和应变对应时间的图。黑色曲线代表应变测量并且红色曲线代表应力测量。
如所示的，对于稀释样品，应力和应变峰值偏移更大。同样，对于未稀释碱化AA样品，应力幅度更大。
通过峰值之间的时差除以每个循环的周期(其对应于2π弧度)计算相角。将复合动态模量值(每个频率的应力幅度)乘以cos(δ)或sin(δ)以分别获得真实(储能模量或弹性模量)和假想(损耗模量)分量。还作为tan(δ)从相移计算了损耗因数。
图75显示了每个样品的储能模量、损耗模量和损耗因数曲线，其中图75A显示了未稀释的碱化AA样品的储能模量(E'；黑线)和损耗模量(E”；灰线)，图75B显示了未稀释的碱化AA样品的损耗因数曲线，图75C显示了稀释的碱化AA样品的储能模量(E'；黑线)和损耗模量(E”；灰线)，图75D显示了稀释的碱化AA样品的损耗因数曲线。
如所示的，在未稀释样品中在低频区储能模量和损耗模量是线性的，这可以表示在线性粘弹性范围(LVR)进行测量并且材料可以被表征为主要是弹性固体。相对于稀释样品，当频率在低频区时，储能模量和损耗模量显示出轻微升高。
此外，尽管未稀释和稀释的碱化AA样品两者在所测试的频率和应变下主要是弹性的，但是稀释样品具有更大的流体贡献。
另外，使用螺旋路径T型杆纺锤体粘度计测试样品粘度。据发现每个样品具有约100,000cp至约200,000cp的范围内的粘度。
实施例20—碱化组织材料的稳定性
本研究设法研究碱化组织材料随时间的稳定性。
除了用3次150mL蒸馏水清洗，使用Gilson SS 23试验振动筛，在可高压灭菌的焊接的45μm筛上筛分前，通过27G针挤出材料外，根据以上实施例10中所列程序制备了碱化的去细胞化AA。将0.5mL碱化AA材料与0.5mL 0.2％刚果红在通过F/F鲁尔锁接头连接的两个3mL注射器之间混合30次。用7mL水稀释所得混合物并在相互连接的20mL注射器之间进一步混合30次。
然后，将混合物的内容物在两个15mL Falcon管中分成两个相等体积。将一个管保存在4℃的冰箱中(对照)，而将另一个管置于40℃、120RPM的Thermo Scientific振荡培育箱中以加速样品老化。两个管保持不搅动5天。
除去包含在每个管中的样品等份并将其用于以2.5×和10×的放大倍数在SZX16立体显微镜上成像。然后，在Fiji ImageJ上分析图像。在图像栈中，将2.5×图象分组，然后转化为8比特。调整图象的初始亮度和对比度设置，并将2px高斯模糊应用于图象。然后，对图象设阈并对其应用分水岭算法。使用分析颗粒插件且无尺寸限制，分析图象中的颗粒。
结果
图76显示了所分析的样品的显微镜图象，其中图76A显示了在4℃储存的样品的显微镜图象，并且图76B显示了在振荡培育箱中维持的样品的显微镜图象。确定样品粒径分布并如图77所示，其中灰色柱代表在4℃储存的样品的粒径分布，而黑色柱代表维持在振荡培育箱中的样品的粒径分布。
如所示的，分布类似。尽管对于维持在振荡培育箱中的样品观察到30-50μm颗粒的小肩峰，但是小于20μm的颗粒百分比仍较小(1.62％)。
还分析了颗粒的圆形度。圆形度参数C定义为：C＝4πA/P2，其中A是面积并且P是周长。C值为1代表完美圆形，而接近0的值代表形状拉伸增加。同样，将颗粒圆度评价为R＝4A/(πRm 2)，其中Rm是拟合椭圆的长轴。与圆形度类似，该值在0至1的范围内，其中值为1表示完美圆形。图78显示了结果，其中图78A显示了在4℃储存的样品(灰色柱)和维持在振荡培育箱中的样品(黑色柱)颗粒的圆形度分布，并且图78B显示了在4℃储存的样品(灰色柱)和维持在振荡培育箱中的样品(黑色柱)颗粒的圆度分布。
如所示的，两种样品颗粒均具有相当好的圆形度和相当好的圆度。
因此，两种样品颗粒具有类似的粒径和形状分布特征，这表示所述颗粒可能不随时间溶胀和改变形状。
实施例21—本发明公开的皮肤填充剂的微生物测试
本研究设法研究本发明公开的皮肤填充剂的制造方法的灭菌循环。
根据实施例10中所列程序制备了碱化的去细胞化AA材料。如本文之前所述，将碱化AA材料部分与利多卡因和明胶混合以形成皮肤填充剂并在脱气15min后使用鲁尔锁接头正面加载至可商购的1cc注射器。将注射器在130℃或135℃在湿循环中高压灭菌3min。
使用两个琼脂培养基，即沙氏葡萄糖琼脂(SDA)和胰酶大豆琼脂(TSA)。通过计算和调整对于100mm×16mm培养皿的必要体积(最终体积200ml)的培养基含量比例，为每种培养基制备5个板。每种培养基的组成如下表35所示。
表35：TSA和SDA培养基组成
Figure BDA0004113521020001061
Figure BDA0004113521020001071
将培养基在121℃高压灭菌1小时，然后在60℃水浴中冷却。在生物安全柜中，向板中倒入约15mL至约30mL培养基。将填充培养基的板保持在柜中，盖半开直至固化。一旦培养基固化，则用石蜡密封板并置于4℃的无菌冰箱。
然后，在5种不同条件下制备琼脂板：未打开的对照板、用在130℃高压灭菌的皮肤填充剂划线、用在135℃高压灭菌的皮肤填充剂划线、用碱化AA材料(未高压灭菌)划线和划线对照。所使用的划线图案是标准象限技术(standard quadrant technique)。
一旦制备，将TSA板在32.5℃培育5天，并将SDA板在22.5℃培育7天。
结果
仅对于用未高压灭菌的碱化AA材料划线的板观察到了集落和生长。
因此，在130℃和135℃的3分钟高压灭菌循环足以使注射器灭菌。还验证了倾倒技术无菌的未打开的对照。划线对照验证如果存在任何污染，则它可能是由于碱化AA材料或皮肤填充剂，而不是环境或倾倒技术所造成的。
还观察到碱化AA材料的高压灭菌引起材料轻微变黄。不受任何具体理论的束缚，假定这种变黄可能是由于碱化AA材料中存在的还原糖的焦糖化所造成的。
实施例22—本发明公开的皮肤填充剂中的SDS定量
本研究设法确定本发明公开的皮肤填充剂中残余的SDS的量。
使用Bio Basic Residual SDS检测试剂盒确定残余SDS含量。该试剂盒的工作范围为0.002％-0.014％ SDS。该测定是基于分光光度法的测定。
以下列出了实验规程。
标准曲线
SDS的实验值参考从已知浓度的SDS产生的标准曲线：
1.将0.1g SDS粉末称量至10mL dH2O以制备产生标准曲线的0.1％的溶液。
2.对于SDS估计，制备范围在0.002％至0.014％的SDS已知浓度的校正曲线，如表36所示。
表36：SDS稀释液
Figure BDA0004113521020001081
3.从每个SDS溶液转移50μL至8个新的2mL微量离心管。
4.将50μL溶液A(从试剂盒)添加至步骤3的管中。良好混合。
5.将1.5mL溶液B(从试剂盒)添加至步骤3的每个管中，并通过涡旋30s-1min剧烈混合。
6.使所述管在室温静置5分钟。以5000RPM(2000×g)旋转5min。
7.将150μL上清液转移至96-孔板。
8.将酶标仪调零，然后测量OD 499nm的光密度。
9.绘制标准曲线，其中x轴为SDS浓度％，并且y轴为OD 499nm读数。
样品中SDS的检测
1.因此稀释样品，从而估计的SDS在标准曲线范围内。
2.制备3个2mL微量离心管。将50μL稀释样品添加至管1和管2。作为空白对照，将50μL dH2O添加至管3。
3.将50μL溶液A添加至步骤2的管中。良好混合。
4.将1.5mL溶液B(从试剂盒)添加至每个管中，并通过涡旋30s-1min剧烈混合。
5.使所述管在室温静置5分钟。以5000RPM(2000×g)旋转5min。
6.将150μL上清液转移至96-孔板。
7.将酶标仪调零，然后测量OD 499nm的光密度。
8.使用标准曲线以获得稀释样品中SDS的％。使用以下公式计算样品中SDS浓度：
样品中SDS％＝(稀释样品％)(稀释因子)
去细胞化材料制备
不受任何具体理论的束缚，假定SDS定量可能最适合于去细胞化材料，而不是碱化、去细胞化材料。
根据实施例5中所列程序制备去细胞化AA材料。在整个程序中在多个时间点分析SDS含量。
结果
使用得自已知SDS溶液的下列数据建立标准曲线。
表37：SDS标准曲线
稀释液编号 0 1 2 3 4 5 6 7
读数1 0.073 0.111 0.150 0.196 0.246 0.288 0.343 0.393
读数2 0.059 0.1 0.147 0.194 0.240 0.280 0.339 0.402
读数3 0.052 0.097 0.145 0.198 0.246 0.280 0.344 0.404
平均值 0.061 0.103 0.147 0.196 0.244 0.283 0.342 0.400
空白修正 0.000 0.042 0.086 0.135 0.183 0.222 0.281 0.339
标准曲线的线性拟合具有R2＝0.997。线性拟合方程为y＝23.952x-0.0067。
将所述曲线用于检测去细胞化AA样品中的SDS含量：
·用于去细胞化的SDS溶液的1：10稀释＝0.10±0.01，N＝3个重复和3个样品。
·在CaCl2培育和连续清洗后，来自去细胞化AA材料的液相的1：10稀释，并且72小时培育＝不可检测。
·在CaCl2培育和连续清洗后，去细胞化材料的未稀释液相，并且72小时培育＝0.008％或80ppm。
因此，去细胞化样品的SDS含量足够低。同样，在碱化程序期间，由于多个离心和清洗步骤，SDS含量将进一步降低。
实施例23—本发明公开的皮肤填充剂中过氧化物的定量
本研究设法确定本发明公开的皮肤填充剂中保留的残余过氧化物的量。
为了测试过氧化物含量，将Bartovation测试条(0-100ppm)浸入根据实施例10中所列程序所产生的碱化苹果材料中。通常，将测试条在材料中浸入1秒并甩掉多余的材料。10秒后，将条的颜色与测试板相比较，测试板作为0ppm、1ppm、3ppm、10ppm、50ppm和100ppm的校准颜色标记。
产生并测试了4批碱化AA。第一批具有1ppm至3ppm之间的过氧化物含量，第二批具有约3ppm的过氧化物含量，第三批具有约0ppm的过氧化物含量，并且第四批具有约0ppm的过氧化物含量。通常，据发现过氧化物含量随清洗和离心循环而减少。
还实施了加标测试来验证上述结果。加标测试包括向碱化AA批次之一中加标约10ppm过氧化氢。据发现加标样品具有约10ppm的过氧化物含量，表明测试成功并且结果有效。
实施例24—适合漂白的过氧化物的浓度
本研究设法确定适合于漂白去细胞化材料的过氧化物浓度范围。
使用以上实施例10中所列程序使去细胞化AA材料碱化。对于本研究，过氧化氢体积相差25mL。
在第一次试验中，当产生碱化AA时，将50mL过氧化氢用于漂白。尽管AA材料颜色变浅，但是材料未完全漂白。
在第二次试验中，当产生碱化AA时，将75mL过氧化氢用于漂白，其使AA材料充分漂白。
在第三次试验中，当产生碱化AA时，将150mL过氧化氢用于漂白。尽管AA材料充分漂白，但是需要另外的离心循环以将AA材料的过氧化物含量降低至10ppm以下。
实施例25—皮肤填充剂的组分的pH
本研究设法确定本发明公开的皮肤填充剂的各个组分的pH以评价它们对皮肤填充剂的整体pH的影响。
表38显示了本发明公开的皮肤填充剂的组分的pH水平。
表38：皮肤填充剂的多种组分的pH水平
Figure BDA0004113521020001111
在一些实施方式中，皮肤填充剂的目标范围为约6.5至约7.5。不受任何具体理论的束缚，假定PBS可以将碱化AA的pH维持在该范围内。
实施例26—本发明公开的皮肤填充剂的酶促降解
本研究设法研究能够降解本发明公开的皮肤填充剂的酶。如以上所描述的，认为本发明公开的皮肤填充剂是永久性的，其中人体不天然产生能够降解所述填充剂的酶。然而，将理解在一些情况下，可能期望除去永久性皮肤填充剂。除去永久性皮肤填充剂的一种方式可以通过使用人体不产生的酶的酶促降解。
化学试剂和仪器
3,5-二硝基水杨酸(DNSA)和D-(+)-葡萄糖得自Alfa Aesar(加拿大)。亚硫酸钠得自ANKOM technologies(USA)。乙酸、刚果红、三水乙酸钠、氢氧化钠和磷酸盐缓冲盐水(PBS)得自Fisher Scientific(加拿大)。四水合酒石酸钾钠得自Acros Organics(加拿大)。所使用的酶为来自TCI America(USA)的来自黑曲霉(Aspergillus niger)的纤维素酶和果胶酶、来自Sigma(加拿大)的来自木霉属的种(Trichoderma sp.)的纤维素酶和来自Plantmedia(USA)的来自根霉属的种(Rhizopus sp.)的Macerozyme R-10。将台式pH计(Sartorius)、Synergy Mx光谱仪(BioTek)、MaxQ搅拌培育箱(Thermo Scientific)和具有荧光滤光器的SZX16立体显微镜(Olympus)用于实施研究。
试剂和溶液制备
通过将10g DNSA、500mg亚硫酸钠和10g氢氧化钠(NaOH)溶解在1L蒸馏水中制备1％二硝基水杨酸试剂(DNSA试剂)并在室温下储存。通过将40g四水合酒石酸钾钠溶解在100mL蒸馏水中制备40％酒石酸钾钠溶液(罗谢尔盐)并在室温下储存。通过将50mL 100mM柠檬酸钠在蒸馏水中稀释至最终体积100mL并将pH调整至6来制备柠檬酸钠缓冲液(50mM)并在室温下储存。通过将1.3g乙酸钠和5mg乙酸溶解在100mL蒸馏水中并将pH调整至6来制备乙酸钠缓冲液(100mM)并在室温下储存。通过将10mL 10×PBS在蒸馏水中稀释至最终体积100mL来制备PBS缓冲液1×并在室温下储存。以1mg/mL的相同酶浓度在多种缓冲液中制备酶储液并在4℃储存。通过在蒸馏水中溶解来制备0.1％的刚果红染色溶液；使用0.45μm注射器过滤器过滤溶液以除去任何沉淀，并将溶液储存在4℃。
葡萄糖标准曲线
DNSA法通过比色分析定量溶液中产生的葡萄糖的量。该方法用于识别由还原糖，如葡萄糖所造成的游离羧基(C＝O)的存在。存在于葡萄糖中的醛官能团的氧化导致与DNSA反应，其被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(ANSA)，并且反过来引起溶液变为红褐色。使用10mg/ml D-葡萄糖在蒸馏水中的储液，制备0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10mg/ml的标准曲线。使用来自HIMEDIA的DNSA试剂方法和规程，可以建立来自基于纤维素的皮肤填充剂的降解的葡萄糖产生的标准曲线。通过将D-葡萄糖储液稀释至0.1mg/mL至10mg/mL的浓度范围，将200μL标准品等分。将0.5mL DNSA试剂加入至标准品并将样品煮沸(95℃)15分钟。一旦完成，将0.5mL酒石酸钾钠(40％)加入至样品并通过涡旋混合。将150μL的每种标准品加入至96-孔板，并使用Synergy Mx光谱仪在540nm采集吸光度。
在多种缓冲液中稀释的酶促测定
该测定用于以较小规模确定哪些缓冲液和酶对于基于纤维素的皮肤填充剂的降解是最优的。在不同缓冲液(PBS、乙酸钠和柠檬酸钠)中制备了酶储液(1mg/mL)，然后将50μL储液在950μL相同缓冲液中稀释。将1mL基于纤维素的皮肤填充剂加入至24-孔板的孔中，然后将稀释的酶溶液加入至孔中。将板在无搅拌的情况下在37℃培育箱中放置3个不同的时间框：1小时、24小时和48小时。每个时间框采集200μL等份并在4℃储存以抑制酶活力直至DNSA分析。通过DNSA方法进行葡萄糖产生估计。
在多种缓冲液中稀释的果胶酶/纤维素酶的比例测定
该测定用于确定在使用不同比例的果胶酶和纤维素酶的情况下，哪些缓冲液对于基于纤维素的皮肤填充剂的降解是最优的。通过使用在不同缓冲液(PBS、乙酸钠和柠檬酸钠)中的果胶酶储液(1mg/mL)和纤维素酶储液(1mg/mL)，制备了最终体积50μL的100：0、75：25、50：50、25：75的果胶酶：纤维素酶比例。然后，用950μL相应缓冲液稀释该溶液。将1mL基于纤维素的皮肤填充剂加入至24-孔板的孔中，然后将稀释的果胶酶和纤维素酶的混合物加入至孔中。将板在无搅拌的情况下在37℃培育箱中放置1小时、24小时和48小时。每个时间框采集200μL等份并在4℃储存。通过DNSA方法进行葡萄糖产生估计。
不同的酶浓度测定
该测定用于确定在以上所测试的最优缓冲液中完全降解基于纤维素的皮肤填充剂的最优浓度。通过使用在乙酸钠或柠檬酸钠中的酶储液(1mg/mL)，通过用相应缓冲液稀释至最终体积1.2mL制备了100：0、75：25、50：50、25：75和0：100(酶：缓冲液)的比例。将0.5mL体积的基于纤维素的皮肤填充剂加入至24-孔板，并将不同酶浓度的溶液加入至适合的孔。将板在无搅拌的情况下在37℃培育箱中放置1小时、24小时和48小时。在指定培育时间后，从每个孔采集200μL等份并在4℃储存以抑制酶活力直至DNSA分析。通过DNSA法进行葡萄糖产生估计，并且通过刚果红染色，使用具有蓝-紫滤光器的SZX16立体显微镜以2.5×放大倍数通过荧光显微成像使皮肤填充剂颗粒降解显像。
不同的果胶酶和纤维素酶比例浓度测定
该测定用于确定完全降解基于纤维素的皮肤填充剂的果胶酶和纤维素酶混合物的最适比例，并且使由于果胶酶的加入所造成的变化(如果有的话)显象。该测定中所使用的缓冲液的选择基于使用来自2.4节的方法的实验结果。通过使用在乙酸钠或柠檬酸钠中的果胶酶储液(1mg/mL)和纤维素酶储液(1mg/mL)，通过合并对于1.2mL最终体积所必需的每种储液的量，制备了100：0、75：25、50：50、25：75和0：100(果胶酶：纤维素酶)的比例。将0.5mL体积的基于纤维素的皮肤填充剂加入至24-孔板的孔中，然后将果胶酶-纤维素酶溶液加入至适合的孔中。将板在无搅拌的情况下在37℃培育箱中放置1小时、24小时和48小时。在指定培育时间后，从每个孔采集200μL等份并在4℃储存以抑制酶活力直至DNSA分析。通过DNSA法进行葡萄糖产生估计，并且通过刚果红染色，使用具有蓝-紫滤光器的SZX16立体显微镜以2.5×放大倍数通过荧光显微成像使皮肤填充剂颗粒降解显像。
以不同时间和不同浓度的酶降解效力
该测定用于确定如果提前制备并在不同温度下储存，与新鲜制备的酶相比，酶溶液效率是否变化。还测试了更高的酶浓度：1、1.5、2、2.5和3mg/mL。在上述测定中，溶液在2小时的时间段内制备并置于冰浴中以保持酶溶液新鲜。相反地，用在4℃保持一周的溶液重复实验。所使用的酶为来自木霉属的种(Trichoderma sp.)的纤维素酶和来自木霉属的种(Trichoderma sp.)的纤维素酶和来自黑曲霉(Aspergillus niger)的果胶酶以25：75比例(果胶酶：纤维素酶)在乙酸钠缓冲液中的混合物。将1mL体积的基于纤维素的皮肤填充剂加入至24-孔板的孔中，并将酶溶液加入至适合的孔中。将板在无搅拌的情况下在37℃培育箱中放置1小时、24小时和48小时。在指定培育时间后，从每个孔采集200μL等份并在4℃储存以抑制酶活力直至DNSA分析。通过DNSA法进行葡萄糖产生估计，并且通过刚果红染色，使用具有蓝-紫滤光器的SZX16立体显微镜以2.5×放大倍数通过荧光显微成像使皮肤填充剂颗粒降解显像。
显微镜成像
在酶促消化后，将剩余样品用0.1％刚果红溶液染色，并用于评价颗粒是否降解。对于图像分析，实施1/64稀释以使单个颗粒显象。将1mL每种样品加入至24-孔板中并使用具有蓝-紫滤光器的SZX16立体显微镜以2.5×放大倍数成像。
统计分析
通过使用Origin 2021软件，以双向方差分析对所获得的值进行统计分析。所提供的所有值是平均值±标准误差(SE)。对于认为具有统计学显著差异的值，p<0.05。
结果
纤维素为直链多糖，其由通过β-1,4-糖苷键连接在一起的多个D-葡萄糖亚基组成。纤维素酶将使这种键断裂以释放D-葡萄糖亚基。为此，将DNSA法用于采集将从对于基于纤维素的皮肤填充剂的酶活力所产生的D-葡萄糖的标准曲线。将图79中所示的标准曲线用于定量基于纤维素的颗粒向D-葡萄糖的降解。通过得自线性曲线的方程，可以计算所产生的D-葡萄糖的浓度：对于540nm波长，[D-葡萄糖]＝(吸光度+0.05185)/0.36664，并且对于575nm波长，[D-葡萄糖]＝(吸光度+0.01969)/0.11256。
参考图80，可以观察到在37℃的培育温度下，与来自黑曲霉(Aspergillus niger)的纤维素酶(A)和混合酶R-10(M)相比，来自木霉属的种(Trichoderma sp.)的纤维素酶(T)具有更好的纤维素向葡萄糖的转化。这可以通过酶的最适温度解释，因为混合酶R-10具有40℃至50℃之间的最适温度；来自黑曲霉(Aspergillus niger)的纤维素酶具有30℃的最适温度，这可以显著降低其酶活力；并且来自木霉属的种(Trichoderma sp.)的纤维素酶具有40℃的最适温度，这可以表明为何木霉属的种(Trichoderma sp.)是唯一具有更大葡萄糖产生的酶。纤维素酶T在乙酸钠(ACE)和柠檬酸钠(CIT)缓冲液中的表现更好。图80中所示的对照值表明在单独的缓冲液中，存在少量来自基于纤维素的皮肤填充剂的D-葡萄糖。这可以是由于碱化过程所引起的，其可以将苹果细胞壁组分，如木质素、纤维素和半纤维素分解成葡萄糖。
然后，评价了多种果胶酶和纤维素酶的比例。图81显示了不同缓冲液中不同的果胶酶：纤维素酶比例的测定。如所示的，100：0的比例下单独的果胶酶不会导致颗粒很大程度的降解。当将果胶酶以与T ACE 25：75的比例加入至纤维素酶时，与其它样品相比，降解最优。不受任何具体理论的束缚，据认为果胶酶的加入可以帮助分解与纤维素微纤丝连接的半纤维素聚合物，其反过来可以引起更多纤维素释放并对于纤维素酶水解可用。
参考图82，已表明纤维素酶T即使在25％的浓度下具有高葡萄糖产生，并且最优缓冲液为ACE。对于其它酶(A和M)，当在不同培育时间之间比较时，几乎不存在任何所产生的葡萄糖。图83显示对于T CIT和T ACE两者，100％至50％的浓度完全降解纤维素颗粒，并且对于25％的浓度，存在不完全降解。这表示在100至50％的浓度范围内，1.2mL的酶溶液可以能够完全降解0.5mL基于纤维素的皮肤填充剂的纤维素颗粒。
图84显示了不同果胶酶：纤维素酶比例测定的结果。如所示的，基于所使用的缓冲液，纤维素酶T具有不同的最优比例。对于T ACE，果胶酶：纤维素酶的最优比例为25：75，并且对于T CIT，最优比例为75：25。图85中所示的染色显微镜图象显示了对于T ACE，50：50、25：75和0：100的果胶酶：纤维素酶比例的总降解。未解释使用果胶酶的T CIT的图象，因为未将纤维素酶添加至混合物。
如图86所示，不同浓度的新鲜酶溶液显示在使用和不使用果胶酶的情况下，在48小时之后，在对于所有不同的纤维素酶浓度所产生的12mg/mL和16mg/mL D-葡萄糖浓度之间形成平台。平台可以表示对于可用的底物的量，酶不足。观察到了在使用和不使用果胶酶的情况下，通过T ACE，对于2.5mg/mL和3mg/mL浓度的纤维素颗粒的总降解，并且将其示于图87。对于T ACE，在1.5和2mg/ml的浓度下，以及对于使用果胶酶的T ACE，在1、1.5和2mg/mL的浓度下，也存在不完全颗粒降解。
如图88所示，不同浓度的预先制备的酶溶液显示出平缓的峰值，因为浓度变得更高，这与显示出平台的新鲜酶溶液相反。仅使用T ACE的D-葡萄糖产生更高，从12.5至20mg/mL，相比之下添加果胶酶为12.5至15mg/mL。通过比较新鲜酶溶液结果，显然在4℃储存1周后，酶活力不受影响。由于纤维素酶可以在4℃储存7.5个月而无酶活力降低，因此预期该结果。
因此，在所测试的酶中，在本文所评价的不同组合中，降解本发明公开的基于纤维素的皮肤填充剂的最优的酶是使用或不使用果胶酶的情况下，来自木霉属的种(Trichoderma sp.)的纤维素酶。
实施例27—本发明公开的皮肤填充剂的体内注射
本研究设法详述实施例3中所得的结果。使用本发明公开的皮肤填充剂，预制了其它体内注射剂。
制备了3种皮肤填充剂制剂—使用盐水载体的制剂、使用透明质酸(HA)载体的制剂和使用胶原蛋白载体的制剂。使用实施例3中所列程序制备制剂。
将3种制剂中的每一种皮下注射到3只大鼠中。在本文中，再次按照实施例3中所列的注射程序进行。在4周和8周切除每只大鼠。12周后，将每种制剂的两只大鼠安乐死并从中收集组织。1年后，将剩余的大鼠安乐死并从中收集组织。
结果
图89显示了从来自每种制剂的大鼠之一所采集的切除的实例，其中图89A是从注射盐水制剂的大鼠所采集的切除，图89B是从注射HA制剂的大鼠所采集的切除，并且图89C是从注射胶原蛋白制剂的大鼠所采集的切除。
目视评价了切除后所注射的制剂。通常，盐水制剂为褐色。HA制剂的颜色与盐水制剂类似，然而，与盐水制剂相比，HA注射剂的形态似乎是“隆起的”或“断裂的”。胶原蛋白填充剂保持紧实的椭圆形并且在前4周是白色的，而在随后的时间点为褐色，这可以对应于胶原蛋白在大鼠体内吸收的时间框。
在多个时间点，从每个注射采集样品，用Masson三色(MT)或者苏木精和伊红(HE)染色并在显微镜成像。图90至图92显示了每个制剂在12周时间点的显微镜图象。
图90显示了在12周时盐水制剂注射的显微镜图象，其中图90A以1×放大倍数显示了MT染色的注射盐水制剂的显微镜图象，图90B以10×放大倍数显示了MT染色的注射盐水制剂的显微镜图象，图90C以20×放大倍数显示了MT染色的注射盐水制剂的显微镜图象，图90D以1×放大倍数显示了用HE染色的注射盐水制剂的显微镜图象，图90E以10×放大倍数显示了HE染色的注射盐水制剂的显微镜图象，并且图90F以20×放大倍数显示了HE染色的注射盐水制剂的显微镜图象。
图91显示了在12周时HA制剂注射的显微镜图象，其中图91A以1×放大倍数显示了MT染色的注射HA制剂的显微镜图象，图91B以10×放大倍数显示了MT染色的注射HA制剂的显微镜图象，图91C以20×放大倍数显示了MT染色的注射HA制剂的显微镜图象，图91D以1×放大倍数显示了用HE染色的注射HA制剂的显微镜图象，图91E以10×放大倍数显示了HE染色的注射HA制剂的显微镜图象，并且图91F以20×放大倍数显示了HE染色的注射HA制剂的显微镜图象。
图92显示了在12周时胶原蛋白制剂注射的显微镜图象，其中图92A以1×放大倍数显示了MT染色的注射胶原蛋白制剂的显微镜图象，图92B以10×放大倍数显示了MT染色的注射胶原蛋白制剂的显微镜图象，图92C以20×放大倍数显示了MT染色的注射胶原蛋白制剂的显微镜图象，图92D以1×放大倍数显示了用HE染色的注射胶原蛋白制剂的显微镜图象，图92E以10×放大倍数显示了HE染色的注射胶原蛋白制剂的显微镜图象，并且图92F以20×放大倍数显示了HE染色的注射胶原蛋白制剂的显微镜图象。
还用刚果红染色每种注射制剂样品，并在显微镜下研究以研究大鼠细胞侵袭皮肤填充剂的程度。用Hoechst 33342标记侵袭大鼠细胞。结果如图93所示，其中图93A以10×放大倍数显示了注射盐水制剂，图93B以10×放大倍数显示了注射HA制剂，并且图93C以10×放大倍数显示了注射胶原蛋白制剂。如所示的，3种制剂在12周时经历了相当的大鼠细胞侵袭。
据发现可以在每种注射制剂中观察到血管和红细胞。为了研究大鼠和皮肤填充剂制剂之间的血管原相互作用，在12周时对注射制剂实施CD31染色。同样，将CD45染色用于评价大鼠免疫应答，并且将Verhoefff Van Gienson(Verhoeff)染色用于弹性蛋白鉴定。每种染色的结果如图94所示。如所示的，CD31染色确认血管壁形成(褐色环状结构)并且CD45染色显示对注射的异物的预期免疫应答(褐色细胞质和蓝色核)。Verhoeff染色未显示出大量弹性蛋白纤维(黑色)，然而，的确如所期望的，显示出胶原纤维(红色/粉红色)的存在。
组织学分析
还对12周时的注射的皮肤填充剂制剂以及BellaFill皮肤填充剂实施了组织学分析。根据ISO 10993-6指南评价注射制剂，如下表39所示。
表39：ISO 10993-6评分指南
Figure BDA0004113521020001191
Figure BDA0004113521020001201
表40详细描述了选择用于在ISO 10993-6下进行评价的样品。
表40：注射皮肤填充剂制剂样品
Figure BDA0004113521020001202
Figure BDA0004113521020001211
Figure BDA0004113521020001221
对于表40中所识别的每组，在ISO 10993-6下的评价结果如下表41-43所示。
表41：注射的胶原蛋白制剂的ISO 10993-6分析(组1)
Figure BDA0004113521020001222
Figure BDA0004113521020001231
表42：注射的HA制剂的ISO 10993-6分析(组2)
Figure BDA0004113521020001232
表43：注射的盐水制剂的ISO 10993-6分析(组3)
Figure BDA0004113521020001241
表44：注射的BellaFill制剂的ISO 10993-6分析(组4)
Figure BDA0004113521020001242
Figure BDA0004113521020001251
每个样品组的多个参数的平均值的总结如下表45所示。
表45：基于ISO 10993-6打分的组平均值的总结
Figure BDA0004113521020001252
Figure BDA0004113521020001261
如所示的，在组1、2、3和4植入位点中的任一处未观察到多形核细胞、坏死、脂肪浸润、纤维蛋白渗出液、矿化、肉芽瘤、出血或外源碎片。
对组1、组2和组3测试植入物的组织反应的特征在于每个高倍视野中淋巴细胞和巨噬细胞的6至重浸润、1至5个浆细胞以及对压积巨细胞的重浸润和最小或轻微的胶原蛋白沉积/纤维结缔组织。
在测试组中，在巨细胞内或巨噬细胞周围观察到吸收/降解的测试制剂颗粒，而主要在植入物周边观察到淋巴细胞和浆细胞。
最小纤维包裹的特征在于纤维结缔组织窄带，其在组1、2和3的测试植入物位点周围观察到。
组4对照植入物位点中的组织反应的特征在于每个高倍视野中淋巴细胞的6至重浸润、1至5个浆细胞、6至10个巨噬细胞和3至5个巨细胞以及最小胶原蛋白沉积/纤维结缔组织。在对照组中，在对照制品微球周围观察到炎性细胞。
在组2测试和组4对照植入物位点中观察到以具有支持成纤维细胞结构的4-7个毛细管组为特征的新血管形成，而在组1和3测试植入物位点中观察到具有支持组织的宽毛细管带。
组1和3测试植入物中的炎症反应似乎比组2测试和组4对照植入物中的稍高。尽管基于ISO 10993-6打分，炎症反应是明显的，但是当与组4对照相比时，组2测试植入物被认为是非刺激性的并且组1和3测试植入物被认为是轻微刺激性的。制剂刺激性的总结如下表46所示。
表46：每组的刺激性总结
Figure BDA0004113521020001271
整体刺激性得分 刺激性/反应性状态
0.0至2.9 最小或无反应(非刺激性)
3.0至8.9 轻微反应(轻微刺激性)
9.0至15.0 中等反应(中等刺激性)
>15.0 严重反应(严重刺激性)
整体上，所有组导致产生炎症反应(包含大部分巨细胞、淋巴细胞和巨噬细胞)并且无坏死、脂肪浸润、纤维蛋白渗出液、矿化、肉芽瘤、出血或外源碎片。基于ISO 10993-6打分，当与组4对照植入物相比时，组2测试植入物被认为是非刺激性的，而组1和3测试植入物被认为是轻微刺激性的。
注射尺寸测量
对每个制剂以及对使用可商购的BellaFill皮肤填充剂的试验监测通过所注射的皮肤填充剂体积所形成的隆起尺寸。通过使用卡尺记录两个垂直直径和高度(垂直于皮肤)监测一般椭圆形的注射。将测量用于计算平面内面积以及估计椭球体积。
图95显示了表示为制剂随时间的归一化降低百分比的每个注射隆起的高度变化，其中胶原蛋白制剂为黑线，HA制剂为红线，盐水制剂为蓝线并且BellaFill制剂为紫线。
如所示的，胶原蛋白和HA制剂显示出尺寸逐渐降低，其最终达到平台，而盐水制剂显示出高度快速降低，如所期望的。BellaFill真皮填充剂注射的高度逐渐降低至平台，这与胶原蛋白和HA制剂类似。
应注意注射隆起的降低尺寸不表示颗粒降解。以上组织学评价显示颗粒保持完整。然而，降低尺寸可以归因于载体吸收、材料压紧、制剂横向膨胀和/或大鼠质量随时间增加。
实施例28—本发明公开的皮肤填充剂的其它体内试验
使用包含碱化的苹果材料的本发明公开的皮肤填充剂制剂进行其它体内试验。
测试了4种制剂，即仅包含碱化苹果的第一制剂(Mer100)、包含0.9％盐溶液中的20％碱化苹果的第二制剂(20Mer80Sal)、包含在3.5％胶原蛋白溶液中的20％碱化苹果的第三制剂(20Mer80Col)和包含在溶解再生纤维素中的20％碱化苹果的第四制剂(20Mer80Reg)。每种制剂还包含0.3％的利多卡因。
通过用LiCl和二甲基乙酰胺(DMAc)的溶液溶解去细胞化苹果材料的溶解的再生纤维素。然后，通过溶剂交换和与碱化苹果混合，使溶解的纤维素“再生”。
将每种制剂向两只大鼠注射四次。对于每种制剂，在12周后切除一只大鼠并且在1年后切除另一只。每个注射体积包含600μL制剂。每周测量制剂注射后所形成的隆起，测量12周，然后每月测量。如本文之前所述，使用卡尺测量隆起尺寸。
结果
根据观察，应注意20Mer80Sal和20Mer80Col注射隆起小于Mer100制剂的那些隆起。同样，20Mer80Reg注射隆起是所测试制剂中最硬的。
每种制剂的注射隆起高度随时间的变化如图96所示。为了比较，包括了实施例27的高度变化结果，其中DFAAC是指实施例27的胶原蛋白制剂，DFAAHA是指实施例27的HA制剂，DFAAS是指实施例27的盐水制剂并且DFBF是指BellaFill皮肤填充剂。
如所示的，包含碱化苹果的每种制剂通常显示出高度降低，直至最终平台。
还通过组织学分析了注射的制剂。如以上在实施例27中所描述的，用HE、MT、CD45、CD31和和Verhoeff染色对注射制剂进行染色，并在显微镜下分析。图97以200μm的比例尺显示了结果。组织学分析的实施者所记录的笔记如下表47所示。
表47：注射的碱化苹果制剂的组织学观察
Figure BDA0004113521020001291
Figure BDA0004113521020001301
Figure BDA0004113521020001311
通常，使用碱化苹果的制剂的组织学分析显示出与实施例27中研究的制剂相比降低的炎症反应。同样，使用碱化苹果的制剂被证明是生物相容的，提供了血管制剂并且具有胞外基质沉积。
此外，应注意20Mer80Reg制剂具有定位至其周边的细胞侵袭。不受具体理论的束缚，据信细胞侵袭向20Mer80Reg制剂周边的定位可以是由于缠绕的溶解和再生的纤维素聚合物的小孔径所造成的。
实施例29—本发明公开的皮肤填充剂的SDS含量的进一步定量
本研究设法基于实施例22的结果，进一步鉴定本发明公开的皮肤填充剂中残余SDS的量。
使用实施例22中所建立的标准曲线和所列方法，使用分光光度法分析了其它样品。所使用的样品具有相当于5个苹果的材料(5AA)、相当于10个苹果的材料(10AA)或者相当于15个苹果的材料(15AA)。
表48显示了在0.1％ SDS中培育72小时之后，来自5AA、10AA和15AA样品的烧杯溶液(1：10稀释)的SDS定量结果。
表48：在0.1％ SDS中培育72小时后5AA、10AA和15AA样品的烧杯溶液的SDS定量
Figure BDA0004113521020001312
Figure BDA0004113521020001321
表49显示了在去细胞化过程后，来自5AA、10AA和15AA样品的液相(未稀释)的SDS定量。
表49：去细胞化后5AA、10AA和15AA样品的液相的SDS定量
Figure BDA0004113521020001322
因此，如所示的，样品的SDS含量足够低，其支持实施例22的发现。同样，在碱化程序期间，由于多个离心和清洗步骤，SDS含量将进一步降低。
已通过举例说明描述了一种或多种说明性实施方式。本领域技术人员将理解可以在不背离如权利要求中所定义的本发明的范围的情况下做出一些改变和修改。
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本文以及在本说明书其它处所引用的所有参考文献以其全部内容作为参考并入本文。

Claims (104)

1.一种不可再吸收的皮肤填充剂，包含从其中除去组织的细胞材料和核酸的去细胞化植物或真菌组织。
2.根据权利要求1所述的皮肤填充剂，其中所述去细胞化植物或真菌组织是基于几丁质、基于壳聚糖、基于木质纤维素或者基于纤维素的。
3.根据权利要求1或2所述的皮肤填充剂，其中所述去细胞化植物或真菌组织来源于植物的叶状结构、根、果肉、隐头花序或果浆结构。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的皮肤填充剂，其中所述去细胞化植物或真菌组织来源于莴苣、胡萝卜、苹果或梨或它们的任意组合。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的皮肤填充剂，其中将所述去细胞化植物或真菌组织匀浆化。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的皮肤填充剂，其中将所述去细胞化植物或真菌组织干燥，进行研磨，并任选地重建或再水化。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的皮肤填充剂，其中将所述去细胞化植物或真菌组织拆散成具有单一结构细胞尺寸或更小尺寸的颗粒。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的皮肤填充剂，其中所述皮肤填充剂还包括用于所述去细胞化植物或真菌组织的水凝胶、基质或载体流体。
9.根据权利要求8所述的皮肤填充剂，其中所述水凝胶、基质或载体流体包括PBS、盐水、透明质酸(交联或非交联的)、海藻酸盐、胶原蛋白、普卢兰尼克酸(例如，pluronic F127)、琼脂、琼脂糖、纤维蛋白、羟基磷灰石钙、聚-L-乳酸、自体脂肪、硅酮、葡聚糖、甲基纤维素、溶解的再生纤维素或它们的任意组合。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的皮肤填充剂，其中将所述皮肤填充剂干燥或水合。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的皮肤填充剂，其中所述皮肤填充剂包括利多卡因或其它麻醉剂。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的皮肤填充剂，其中将所述去细胞化植物或真菌组织拆散成具有不规则3D形状和/或非球形、薄的片状结构的颗粒。
13.根据权利要求12所述的皮肤填充剂，其中所述片状结构具有约0.01至约100μm，例如约0.1μm的厚度。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的皮肤填充剂，其中将所述去细胞化植物或真菌组织拆散成具有足够大的尺寸，从而不被一个或多个细胞吞噬的颗粒；优选地，所述去细胞化植物或真菌组织可以拆散成具有至少约20μm的尺寸、直径或最小费雷特直径的颗粒。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的皮肤填充剂，其中将所述去细胞化植物或真菌组织拆散成具有约20μm至约1000μm的范围内的尺寸、直径或费雷特直径的颗粒。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的皮肤填充剂，其中将所述去细胞化植物或真菌组织拆散成具有小于约200μm的尺寸、直径或最大费雷特直径的颗粒。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的皮肤填充剂，其中将所述去细胞化植物或真菌组织拆散成具有约20μm至约200μm的范围内的尺寸、直径或费雷特直径分布的颗粒。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的皮肤填充剂，其中将所述去细胞化植物或真菌组织拆散成颗粒，所述颗粒的粒径、直径或费雷特直径分布在约30μm至约100μm内具有峰值。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的皮肤填充剂，其中将所述去细胞化植物或真菌组织拆散成具有约30μm至约100μm的范围内的平均粒径、直径或费雷特直径的颗粒。
20.根据权利要求1-15中任一项所述的皮肤填充剂，其中将所述去细胞化植物或真菌组织拆散成具有小于约300μm的尺寸、直径或最大费雷特直径的颗粒。
21.根据权利要求1-15和20中任一项所述的皮肤填充剂，其中将所述去细胞化植物或真菌组织拆散成具有约100μm至约300μm的范围内的尺寸、直径或费雷特直径分布的颗粒。
22.根据权利要求1-15、20和21中任一项所述的皮肤填充剂，其中将所述去细胞化植物或真菌组织拆散成颗粒，所述颗粒的粒径、直径或费雷特直径分布在约100μm至约300μm内具有峰值。
23.根据权利要求1-15和20-22中任一项所述的皮肤填充剂，其中将所述去细胞化植物或真菌组织拆散成具有约100μm至约300μm的范围内的平均粒径、直径或费雷特直径的颗粒。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的皮肤填充剂，其中将所述去细胞化植物或真菌组织拆散成平均投影颗粒面积在约200至约3000μm2的范围内或者约200至约300μm2的范围内的颗粒；其中将所述去细胞化植物或真菌组织拆散成表面积与体积比为约0.1至100μm-1的颗粒；其中将所述去细胞化植物或真菌组织拆散成堆积密度约4×105个颗粒/mL至约7×109个颗粒/mL的颗粒；或其任意组合。
25.根据权利要求1-23中任一项所述的皮肤填充剂，其具有小于约500,000cp的粘度。
26.根据权利要求25所述的皮肤填充剂，其具有约100,000cp至约200,000cp的范围内的粘度。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的皮肤填充剂，其中将所述去细胞化植物或真菌组织灭菌。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的皮肤填充剂，其中将所述皮肤填充剂灭菌。
29.根据权利要求27或权利要求28所述的皮肤填充剂，其中所述灭菌为通过γ辐照灭菌。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的皮肤填充剂，其中将所述去细胞化植物或真菌组织碱化。
31.根据权利要求30所述的皮肤填充剂，其中所述碱化为与用氢氧化钠和过氧化氢一起加热。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的皮肤填充剂，其中将所述皮肤填充剂配制用于真皮下注射、真皮深层注射、皮下注射(例如，皮下脂肪注射)或它们的任意组合。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的皮肤填充剂，提供于注射器或注射装置中。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的皮肤填充剂作为软组织填充剂、用于重建外科或两者的用途。
35.根据权利要求1-33中任一项所述的皮肤填充剂用于改善对其有需要的受试者的美容外观的用途。
36.根据权利要求1-33中任一项所述的皮肤填充剂在对其有需要的受试者中用于提高组织体积、去皱或两者的用途。
37.一种在对其有需要的受试者中用于改善美容外观、提高组织体积、去皱或它们的任意组合的方法，所述方法包括：
将根据权利要求1-33中任一项所定义的皮肤填充剂施用或注射至对其有需要的区域；
借此改善受试者的美容外观、提高组织体积、去皱或它们的任意组合。
38.根据权利要求34-36中任一项所述的用途或者根据权利要求37所述的方法，其中受试者的天然细胞浸润皮肤填充剂。
39.根据权利要求34-36或38中任一项所述的用途或者根据权利要求37或38所述的方法，其中所述皮肤填充剂是不可再吸收的，从而所述去细胞化植物或真菌组织在受试者内保持基本完整。
40.根据权利要求34-36、38或39中任一项所述的用途或者根据权利要求37-39中任一项所述的方法，其中通过向其添加一种或多种酶，所述皮肤填充剂是可降解的。
41.根据权利要求40所述的用途或者根据权利要求40所述的方法，其中所述植物或真菌组织是基于纤维素的，并且所述一种或多种酶包括纤维素酶。
42.根据权利要求41所述的用途或者根据权利要求41所述的方法，其中所述纤维素酶是来自木霉属的种的纤维素酶。
43.一种制备不可再吸收的皮肤填充剂的方法，其包括：
提供植物或真菌组织；
将所述植物或真菌组织去细胞化并降低尺寸以提供从其中除去所述组织的细胞材料和核酸的颗粒；和
任选地，将所述颗粒灭菌；
借此提供不可再吸收的皮肤填充剂。
44.根据权利要求43所述的方法，其中去细胞化植物或真菌组织是基于几丁质、基于壳聚糖、基于木质纤维素或者基于纤维素的。
45.根据权利要求43或44所述的方法，其中去细胞化植物或真菌组织来源于植物的叶状结构、根、果肉、隐头花序或果浆结构。
46.根据权利要求43-45中任一项所述的方法，其中去细胞化植物或真菌组织来源于莴苣、胡萝卜、苹果或梨或它们的任意组合。
47.根据权利要求43-46中任一项所述的方法，其中所述降低尺寸包括机械降低尺寸以提供颗粒，任选地其中对干燥、冻干或冷冻干燥的材料进行所述机械降低尺寸。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述机械降低尺寸包括在去细胞化之前或之后挤压、挤出、研磨、磨碎、超声、静电纺纱、化学溶解、酶分解或剪切植物或真菌组织以提供所述颗粒。
49.根据权利要求43-48中任一项所述的方法，其中所述降低尺寸包括在去细胞化之前或之后干燥植物或真菌组织；对干燥的植物或真菌组织进行机械降低尺寸以提供所述颗粒；和任选地，使所述颗粒重建、再悬浮或再水化。
50.根据权利要求43-49中任一项所述的方法，其中所述降低尺寸提供具有单一结构细胞尺寸或更小尺寸的颗粒。
51.根据权利要求43-50中任一项所述的方法，还包括用水凝胶、基质或载体流体配制所述颗粒的步骤。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述水凝胶、基质或载体流体包括PBS、盐水、透明质酸(交联或非交联的)、海藻酸盐、胶原蛋白、普卢兰尼克酸(例如，pluronic F 127)、琼脂、琼脂糖、纤维蛋白、羟基磷灰石钙、聚-L-乳酸、自体脂肪、硅酮、葡聚糖、甲基纤维素、再生纤维素或它们的任意组合。
53.根据权利要求43-52中任一项所述的方法，其中以干燥或水合形式提供所述皮肤填充剂。
54.根据权利要求43-53中任一项所述的方法，其中所述方法还包括用利多卡因或其它麻醉剂配制的步骤。
55.根据权利要求43-54中任一项所述的方法，其中所述降低尺寸提供具有不规则3D形状和/或非球形、薄的片状结构的颗粒。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述片状结构具有约0.01至约100μm，例如约0.1μm的厚度。
57.根据权利要求43-56中任一项所述的方法，其中所述降低尺寸还包括进行挤出、过滤、离心或其它尺寸分离以获得具有目标尺寸的颗粒，目标尺寸范围内的颗粒或者具有目标尺寸分布的颗粒。
58.根据权利要求43-57中任一项所述的方法，其中所述降低尺寸提供具有足够大的尺寸，从而不被一个或多个细胞吞噬的颗粒；优选地，其中所述降低尺寸提供具有至少约20μm的尺寸、直径或最小费雷特直径的颗粒。
59.根据权利要求43-58中任一项所述的方法，其中所述降低尺寸提供具有约20μm至约1000μm的范围内的尺寸、直径或费雷特直径的颗粒。
60.根据权利要求43-59中任一项所述的方法，其中所述降低尺寸提供具有小于约200μm的尺寸、直径或最大费雷特直径的颗粒。
61.根据权利要求43-60中任一项所述的方法，其中所述降低尺寸提供具有约20μm至约200μm的范围内的尺寸、直径或费雷特直径分布的颗粒。
62.根据权利要求43-61中任一项所述的方法，其中所述降低尺寸提供颗粒，所述颗粒的粒径、直径或费雷特直径分布在约30μm至约100μm内具有峰值。
63.根据权利要求43-62中任一项所述的方法，其中所述降低尺寸提供具有约30μm至约100μm的范围内的平均粒径、直径或费雷特直径的颗粒。
64.根据权利要求43-59中任一项所述的皮肤填充剂，其中所述降低尺寸提供具有小于约300μm的尺寸、直径或最大费雷特直径的颗粒。
65.根据权利要求43-59和64中任一项所述的皮肤填充剂，其中所述降低尺寸提供具有约100μm至约300μm的范围内的尺寸、直径或费雷特直径分布的颗粒。
66.根据权利要求43-59、64和65中任一项所述的皮肤填充剂，其中所述降低尺寸提供颗粒，所述颗粒的粒径、直径或费雷特直径分布在约100μm至约300μm内具有峰值。
67.根据权利要求43-59和64-66中任一项所述的皮肤填充剂，其中所述降低尺寸提供具有约100μm至约300μm的范围内的平均粒径、直径或费雷特直径的颗粒。
68.根据权利要求43-67中任一项所述的方法，其中所述降低尺寸提供平均投影颗粒面积在约200至约3000μm2的范围内或者约200至约300μm2的范围内的颗粒；其中将去细胞化植物或真菌组织拆散成表面积与体积比为约0.1至100μm-1的颗粒；其中将所述去细胞化植物或真菌组织拆散成堆积密度约4×105个颗粒/mL至约7×109个颗粒/mL的颗粒；或其任意组合。
69.根据权利要求43-68中任一项所述的方法，其中所述降低尺寸包括研磨，同时使所得颗粒通过过滤器以获得小于上阈值尺寸的颗粒。
70.根据权利要求69所述的方法，还包括过滤、差速离心或平衡离心或者筛分以除去小于下阈值尺寸的颗粒，从而获得大于下阈值尺寸的颗粒。
71.根据权利要求69或70所述的方法，其中使用自动湿筛进行所述过滤或筛分。
72.根据权利要求43-71中任一项所述的方法，其中所述降低尺寸包括实施差速离心或平衡离心以获得具有目标尺寸的颗粒、目标尺寸范围内的颗粒或者具有目标尺寸分布的颗粒。
73.根据权利要求43-72中任一项所述的方法，还包括通过用处于流体，如水或缓冲液(例如，盐水)中的颗粒加载第一注射器或容器并用水凝胶、基质或载体流体加载第二注射器或容器来用水凝胶、基质或载体流体配制所述颗粒；第一和第二注射器或容器流体连通；并通过将所述注射器或容器的内容物在所述第一和第二注射器或容器之间来回通过进行混合。
74.根据权利要求43-72中任一项所述的方法，还包括使用尺寸排阻混合器通过将所述颗粒与水凝胶、基质或载体流体混合来用水凝胶、基质或载体流体配制所述颗粒。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述尺寸排阻混合器是静态混合器。
76.根据权利要求43-75中任一项所述的方法，其中所述方法还包括在去细胞化之前或之后将植物或真菌组织灭菌。
77.根据权利要求43-76中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将所述皮肤填充剂灭菌。
78.根据权利要求76或权利要求77所述的方法，其中所述灭菌为通过γ辐照灭菌。
79.根据权利要求76或权利要求77所述的方法，其中所述灭菌为通过高压灭菌。
80.根据权利要求76或权利要求77所述的方法，其中所述灭菌包括多个灭菌步骤。
81.根据权利要求80所述的方法，其中第一灭菌步骤包括热处理。
82.根据权利要求43-81中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将所述植物或真菌组织碱化。
83.根据权利要求82所述的方法，其中在去细胞化之后进行碱化。
84.根据权利要求82或权利要求83所述的方法，其中所述碱化包括用碱和过氧化物处理去细胞化植物或真菌组织。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述碱是氢氧化物碱。
86.根据权利要求84或权利要求85所述的方法，其中所述过氧化物是过氧化氢。
87.根据权利要求84-86中任一项所述的方法，其中所述碱化包括用氢氧化钠水溶液和过氧化氢在加热的同时处理所述去细胞化植物或真菌组织。
88.根据权利要求87所述的方法，其中在将过氧化氢加入至反应之前，用氢氧化钠水溶液处理所述去细胞化植物或真菌组织第一时间段。
89.根据权利要求84-88中任一项所述的方法，其中所述过氧化物是30％至50％的水性过氧化氢储液。
90.根据权利要求89所述的方法，其中以至少约每500g去细胞化植物或真菌组织75mL的量使用所述水性过氧化氢储液。
91.根据权利要求89所述的方法，其中在添加所述水性过氧化氢储液后，所述去细胞化植物或真菌组织、所述碱和所述水性过氧化氢储液的混合物的过氧化物的浓度为约1％至约5％。
92.根据权利要求84-91中任一项所述的方法，其中所述碱是1M氢氧化钠溶液。
93.根据权利要求92所述的方法，其中以约每500g去细胞化植物或真菌组织2500mL的量使用所述1M氢氧化钠溶液。
94.根据权利要求84-93中任一项所述的方法，还包括用一种或多种中和处理来中和pH。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述一种或多种中和的步骤包括用HCl水溶液处理。
96.根据权利要求82-95中任一项所述的方法，其中通过加热至约80℃进行碱化。
97.根据权利要求82-96中任一项所述的方法，其中实施碱化至少约30分钟。
98.根据权利要求43-97中任一项所述的方法，其中所述方法还包括配制用于真皮下注射、真皮深层注射、皮下注射(例如，皮下脂肪注射)或它们的任意组合的皮肤填充剂。
99.通过根据权利要求43-98中任一项所述的方法制备的皮肤填充剂。
100.根据权利要求99所述的皮肤填充剂，其中所述皮肤填充剂是根据权利要求1-33中任一项所定义的皮肤填充剂。
101.根据权利要求99或100所述的皮肤填充剂，其中约0.1％至约5％或者更少的所述皮肤填充剂的颗粒具有小于约20μm的费雷特直径或者最小费雷特直径。
102.根据权利要求99至101中任一项所述的皮肤填充剂，其中小于约0.5％的所述皮肤填充剂的颗粒具有小于20μm的费雷特直径或最小费雷特直径。
103.根据权利要求99-102中任一项所述的皮肤填充剂，其中小于约0.1％至约5％(如小于约0.5％)或更少的所述皮肤填充剂的颗粒具有足够小的尺寸，从而被受试者的一个或多个细胞吞噬。
104.一种试剂盒，其包含以下中的任何一种或多种：
如根据权利要求1-33和94-103中任一项所定义的皮肤填充剂；
水凝胶、基质或载体流体；
PBS、盐水、透明质酸(交联或非交联的)、海藻酸盐、胶原蛋白、普卢兰尼克酸(例如，pluronic F 127)、琼脂、琼脂糖、纤维蛋白、羟基磷灰石钙、聚-L-乳酸、自体脂肪、硅酮、葡聚糖、甲基纤维素、溶解的再生纤维素或它们的任意组合；
利多卡因或其它美容剂；
一个或多个注射器，或另一种注射装置；
用于两个或更多个注射器的鲁尔锁配合件或联接器；
用于实施如根据权利要求34-42中任一项所定义的用途或方法的说明书；
一种或多种去细胞化试剂；
一个或多个容器、包装或器皿；
用于注射的一种或多种缓冲剂、水或盐水；
用于在不希望的区域或位置溶解皮肤填充剂的试剂或酶(例如，纤维素酶)；
或它们的任意组合。
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