CN114127261A - 高密度微通道 - Google Patents

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C·柯里尔
M·勒布朗·拉图尔
S·汉森
D·莫杜里维斯基
A·E·佩林
K·奥雷塞夫斯基
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Abstract

本文提供了包括至少一个微通道束的支架生物材料，所述微通道束具有分离自植物或真菌组织的多个去细胞化微通道，所述去细胞化微通道在所述束内彼此基本平行布置。还提供了这些支架生物材料和束的方法和使用，以及用于产生这些支架生物材料和束的方法。

Description

高密度微通道
技术领域
本发明一般地涉及支架生物材料。更具体地，本发明涉及来源于植物组织的高密度去细胞化微通道束及其作为支架生物材料的用途。
背景技术
据估计生物材料行业具有$900亿美元的市场价值并且受到来源于天然来源、合成聚合物、金属和陶瓷的新型材料的推动。这些材料可以形成生物相容且促进活细胞生长的具有纳米级/微米级结构的立体高孔隙度支架。例如，出于组织工程和再生医学中的潜在应用，非常关注支持活细胞侵袭和增殖的新型生物材料。
生物材料支架在多个部分中具有应用，包括牙科和整容外科、临床和医学疗法(如再生医学、创伤愈合、组织工程和修复等)以及研究和开发(包括生物医学科学中的工业和学术研究)。
商品化生物材料通常需要复杂且费时的生产方法，这导致了最终用户的高成本，即使它们不是批准用于人使用的。另外，大部分商品化生物材料来源于人/动物来源，从而导致身体的潜在排斥和/或不利的免疫应答和/或疾病传播的风险。来源材料还可以具有不利的环境影响，并且还可以导致不道德获取(unethical sourcing)的问题。另外，一些商品化生物材料在植入后失去了它们的形状，这可以导致组织修复/置换的成功降低。
在本领域中，普遍缺乏可行的商品化生物材料解决方案来替换用于促进组织修复和/或再生的定向、通道-样组织和器官。例如，在脊髓损伤(SCI)领域中，目前大部分学术研究关注含有旨在调节和促进神经元生长的多种因子的可注射水凝胶。然而，水凝胶通常缺乏方向性和神经元引导能力。
替代性、其它和/或改善的支架生物材料及其生产方法是所期望的。
发明内容
本文提供了可以用于模拟人、植物和动物中的某些组织的定向、通道-样微观结构的材料(生物材料)。这些定向组织的实例可以包括脊髓、脉管通道、淋巴组织、神经组织和多种其它组织的胞外基质(ECM)。本发明的目标是提供具有方向性和/或通道-样结构的生物相容性材料，以及生产方法及其方法和用途。
在一个实施方式中，本文提供了包含至少一个微通道束的支架生物材料，所述微通道束包含分离自植物或真菌组织的多个去细胞化微通道，所述去细胞化微通道在所述束内彼此基本平行布置。
在上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述去细胞化微通道可以包含去细胞化木质部和/或韧皮部通道。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述去细胞化木质部和/或韧皮部通道可以单独分离自植物或真菌组织，可以在分离自植物或真菌组织的一个或多个维管束中聚集，或它们的任意组合。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述去细胞化微通道是基本不使用胶水物理成束的，例如，通过缠结。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述多个去细胞化微通道可以在所述束内胶粘在一起。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述多个去细胞化微通道可以在所述束内通过生物相容性的，任选地生物可降解的，任选地小体积膨胀的胶水胶粘在一起。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述生物相容性的胶水可以包含PEG基、聚氨脂基、明胶基或者纤维蛋白基胶水。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述生物相容性的胶水可以包括纤维蛋白基胶水。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述去细胞化微通道可以是纤维素基、几丁质基、木质素基、半纤维素基或者果胶基的，或它们的任意组合。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述束内的去细胞化微通道的密度可以大于所述植物或真菌组织内的微通道密度。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述植物或真菌组织可以包括来自以下各项的含有微通道的组织：苹果隐头花序(Malus pumila)组织、蕨(Monilophytes)组织、萝卜(Brassica rapa)根组织、银杏分枝组织、马尾草(equisetum)组织、萱草(hermocallis)杂交叶组织、羽衣甘蓝(Brassica oleracea)茎组织、针叶树花旗松(Pseudotsuga menziesii)组织、仙人掌果(pitaya)肉组织、斑状长春花(Maculata Vinca)组织、水生莲花(Nelumbo nucifera)组织、郁金香(Tulipa gesneriana)花瓣组织、车前草(Musa paradisiaca)组织、西兰花(Brassica oleracea)茎组织、枫叶(Acerpsuedoplatanus)茎组织、甜菜(Beta vulgaris)初生根组织、葱(Allium cepa)组织、兰科(Orchidaceae)组织、萝卜(Brassica rapa)茎组织、韭葱(Allium ampeloprasum)组织、枫树(Acer)树枝组织、芹菜(Apium graveolens)组织、葱(Allium cepa)茎组织、松树组织、芦荟组织、西瓜(Citrullus lanatus var.lanatus)组织、草甸排草(Lysimachianummularia)组织、仙人掌(cactae)组织、北极剪秋罗(Lychnis Alpina)组织、大黄(Rheumrhabarbarum)组织、南瓜果肉(Cucurbita pepo)组织、龙血树(Asparagaceae)茎组织、紫露草(Tradescantia virginiana)茎组织、芦笋(Asparagus officinalis)茎组织、蘑菇(Fungi)组织、茴香(Foeniculum vulgare)组织、玫瑰(Rosa)组织、胡萝卜(Daucus carota)组织或梨(Pomaceous)组织，或者通过直接基因组修饰或者通过选择育种产生的遗传改变的组织，或它们的任意组合。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述植物或真菌组织可以包括芹菜、芦笋或两者。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述支架生物材料还可以包括位于所述去细胞化微通道中的至少一种上和/或内的活细胞，具体地非天然细胞。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述活细胞可以是动物细胞。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述活细胞可以是哺乳动物细胞。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述活细胞可以是人细胞。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述去细胞化微通道可以通过液基提取分离自植物或真菌物质。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，分离可以通过微通道从植物或真菌组织的液基提取。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，液基提取可以包括酸提取、酸和过氧化物提取、盐提取或碱提取中的至少一种。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，酸和过氧化物提取可以包括在酸和过氧化物溶液中加热植物或真菌组织。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述酸和过氧化物溶液可以包括5:1至1:5，如3:1至1:3的比值的冰醋酸和30％的过氧化氢。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述酸和过氧化物溶液可以包括1:1的冰乙酸：过氧化氢溶液(30％v/v)。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，加热可以包括加热达30分钟或以上的一段时间。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，加热可以包括加热30分钟。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，加热可以包括使酸和过氧化物溶液沸腾。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述酸和过氧化物溶液可以包括1:1的冰乙酸：过氧化氢溶液(30％v/v)并将所述溶液加热至沸腾30分钟。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述液基提取还可以包括将植物或真菌组织在酸和过氧化物溶液中机械搅动，例如，搅拌。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，盐提取可以包括在盐溶液中加热植物或真菌组织。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述盐溶液可以包括LiCl或NaCl。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述盐溶液可以包括约0.5M-10M，如0.5M-3M的盐浓度。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述盐溶液可以包括约3M盐浓度的LiCl或NaCl。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，加热可以包括加热达30分钟或以上的一段时间。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，加热可以包括加热30分钟。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，加热可以包括使盐溶液沸腾。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述盐溶液可以包括约3M LiCl并且可以将所述溶液加热至沸腾30分钟。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述盐溶液可以包括约3M NaCl并且可以将所述溶液加热至沸腾15分钟。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，液基提取还可以包括将植物或真菌组织在盐溶液中机械搅动，例如，搅拌。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，碱提取可以包括在碱溶液中加热植物或真菌组织。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述碱溶液可以包括氢氧化钠(NaOH)。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述碱溶液可以包括约0.5-10M，如0.5-3M的碱浓度。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述碱溶液可以包括约0.5-1M的碱浓度的氢氧化钠。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，加热可以包括加热达30分钟。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，加热可以包括加热30分钟。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，加热可以包括使碱溶液沸腾。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述碱溶液可以包括约0.5MNaOH并且可以将所述溶液加热至沸腾5分钟。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，液基提取还可以包括将植物或真菌组织在碱溶液中机械搅动，例如，搅拌。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，酸提取可以包括在包含酸的酸溶液中加热植物或真菌组织。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述酸溶液可以包含酸性酸或盐酸。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述酸溶液可以包含50％的乙酸。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，加热可以包括加热达30分钟或以上的一段时间。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，加热可以包括加热30分钟。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，加热可以包括使酸溶液沸腾。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述酸溶液可以包含50％的乙酸并且将所述溶液加热至沸腾30分钟。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，液基提取还可以包括将植物或真菌组织在酸溶液中机械搅动，例如，搅拌。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，去细胞化步骤可以发生在分离步骤之前。
在另一个实施方式中，本文提供了如本文所描述的任何支架生物材料用于以下各项的用途：支持动物或植物细胞生长；促进组织再生；促进血管生成；脊髓损伤治疗和/或修复；植物或动物组织的修复或重建或置换；溶液或材料过滤和/或分离；植物修饰或生长调节；材料输送；模拟所期望的形状或对象的组装件；和/或微流体；或者其中生物相容的微米级通道可以是有用的任何适合的应用。
在上述用途的另一个实施方式中，所述支架生物材料可以用于植物或动物组织的修复或重建或置换，其中所述植物或动物组织可以包括受损的微维管系统，或者通过维管疾病(如萎蔫病)破坏的植物组织或者昆虫(如白蜡树蛀虫)感染的树的受损的维管结构。
在任何上述用途的另一个实施方式中，所述支架生物材料可以用于植物或动物组织的修复或重建，其中所述植物或动物组织可以包括受损的微脉管系统，其中血管生成受损或被损坏。
在任何上述用途的另一个实施方式中，所述支架生物材料可以用于动物组织的修复或重建，其中所述动物是人。
在任何上述用途的另一个实施方式中，所述支架生物材料可以用于植物修饰或生长调节，其中所述修饰可以是用于加速生长的嫁接过程的修饰。
在任何上述用途的另一个实施方式中，所述支架生物材料可以用于材料输送，其中所述材料输送是药物递送应用。
在任何上述用途的另一个实施方式中，所述支架生物材料可以用于热传递或热交换微流体。
在另一个实施方式中，本文提供了用于支持细胞生长的方法，所述方法包括：
提供如本文所描述的任何支架生物材料；和
将一个或多个细胞引入至所述支架生物材料。
在另一个实施方式中，本文提供了用于促进组织再生；促进血管生成；脊髓损伤的治疗和/或修复；或者植物或动物组织的修复或重建或置换的方法，所述方法包括：
提供如本文所描述的任何支架生物材料；和
将所述支架生物材料植入对其有需要的位点。
在另一个实施方式中，本文提供了用于溶液或材料过滤和/或分离的方法，所述方法包括：
提供如本文所描述的任何支架生物材料；和
使溶液或材料流动通过所述支架生物材料，从而基于尺寸排阻从所述溶液过滤和/或分离组分。
在另一个实施方式中，本文提供了用于植物修饰或生长调节的方法，所述方法包括：
提供如本文所描述的任何支架生物材料；和
将所述支架生物材料移植到所述植物中以提供加速生长。
在另一个实施方式中，本文提供了用于材料输送的方法，所述方法包括：
提供如本文所描述的任何支架生物材料；和
使用所述支架生物材料将材料输送至对其有需要的位点。
在上述方法的另一个实施方式中，所述材料可以是药物并且所述支架生物材料可以用于药物递送。
在另一个实施方式中，本文提供了用于制备模拟所期望的形状或对象的结构的方法，所述方法包括：
提供如本文所描述的任何支架生物材料；
雕刻或布置所述支架生物材料以模拟所期望的形状或对象；和
任选地，将所述支架生物材料胶粘以用于结构加固。
在另一个实施方式中，本文提供了用于在微流体过程中交换或传递热的方法，所述方法包括：
提供如本文所描述的任何支架生物材料；和
使用所述支架生物材料的微通道以携带一个或多个流体，其中所述一个或多个流体紧密邻近以允许热交换或热传递。
在另一个实施方式中，本文提供了来自植物或真菌组织的微通道的分离和去细胞化的方法，所述方法包括：
从所述植物或真菌组织分离微通道；和
使所述微通道去细胞化；和
任选地，将所述微通道灭菌。
在上述方法的另一个实施方式中，分离微通道的步骤可以包括微通道或含有微通道的维管束或两者从周围植物或真菌组织的机械分离。
在上述方法的另一个实施方式中，可以通过温和剥离或者通过切割实施分离步骤。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述去细胞化微通道可以通过液基提取分离自植物或真菌物质。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，可以通过微通道的液基提取从植物或真菌组织进行分离。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，液基提取可以包括酸提取、酸和过氧化物提取、盐提取或碱提取中的至少一种。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，酸和过氧化物提取可以包括在酸和过氧化物溶液中加热植物或真菌组织。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述酸和过氧化物溶液可以包括5:1至1:5，如3:1至1:3的比值的冰醋酸和30％的过氧化氢。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述酸和过氧化物溶液可以包括1:1的冰乙酸：过氧化氢溶液(30％)。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，加热可以包括加热达30分钟或以上，如达45分钟或者达1小时的一段时间。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，加热可以包括加热30分钟。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，加热可以包括使酸和过氧化物溶液沸腾。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述酸和过氧化物溶液可以包括1:1的冰乙酸：过氧化氢溶液(30％v/v)并将所述溶液加热至沸腾30分钟。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述液基提取还可以包括将植物或真菌组织在酸和过氧化物溶液中机械搅动，例如，搅拌。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，盐提取可以包括在盐溶液中加热植物或真菌组织。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述盐溶液可以包括LiCl或NaCl。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述盐溶液可以包括约0.5M-10M，如0.5M-3M的盐浓度。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述盐溶液可以包括约3M盐浓度的LiCl或NaCl。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，加热可以包括加热达30分钟或以上，如达45分钟或者达1小时的一段时间。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，加热可以包括加热30分钟。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，加热可以包括使盐溶液沸腾。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述盐溶液可以包括约3MLiCl并且可以将所述溶液加热至沸腾30分钟。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述盐溶液可以包括约3MNaCl并且可以将所述溶液加热至沸腾15分钟。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，液基提取还可以包括将植物或真菌组织在盐溶液中机械搅动，例如，搅拌。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，碱提取可以包括在碱溶液中加热植物或真菌组织。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述碱溶液可以包括氢氧化钠(NaOH)。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述碱溶液可以包括约0.5-10M，如0.5M-3M的碱浓度。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述碱溶液可以包括约0.5M-1M的碱浓度的氢氧化钠。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，加热可以包括加热达30分钟或以上，如达45分钟或者达1小时。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，加热可以包括加热30分钟或以上，如达45分钟或者达1小时。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，加热可以包括使碱溶液沸腾。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述碱溶液可以包括约0.5MNaOH并且可以将所述溶液加热至沸腾5分钟。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，液基提取还可以包括将植物或真菌组织在碱溶液中机械搅动，例如，搅拌。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，酸提取可以包括在包含酸的酸溶液中加热植物或真菌组织。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述酸溶液可以包含酸性酸或盐酸。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述酸溶液可以包含50％的乙酸。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，加热可以包括加热达30分钟或以上的一段时间。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，加热可以包括加热30分钟。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，加热可以包括使酸溶液沸腾。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述酸溶液可以包含50％的乙酸并且将所述溶液加热至沸腾30分钟。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，液基提取还可以包括将植物或真菌组织在酸溶液中机械搅动，例如，搅拌。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，去细胞化步骤可以发生在分离步骤之前。
在另一个实施方式中，本文提供了用于制备支架生物材料的方法，所述方法包括：
从植物或真菌组织分离微通道，或者提供已从植物或真菌组织分离的微通道；
使所述微通道去细胞化；
将所述微通道束在一起，所述微通道彼此基本平行布置；
借此提供包含成束的微通道的支架生物材料。
在上述方法的另一个实施方式中，分离微通道的步骤可以包括微通道或含有微通道的维管束或两者从周围植物或真菌组织的机械分离。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，可以通过温和剥离或者通过切割实施分离步骤。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述去细胞化微通道可以通过液基提取分离自植物或真菌物质。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，可以通过微通道的液基提取从植物或真菌组织进行分离。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，液基提取可以包括酸提取、酸和过氧化物提取、盐提取或碱提取中的至少一种。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，酸和过氧化物提取可以包括在酸和过氧化物溶液中加热植物或真菌组织。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述酸和过氧化物溶液可以包括5:1至1:5，如3:1至1:3的比值的冰醋酸和30％的过氧化氢。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述酸和过氧化物溶液可以包括1:1的冰乙酸：过氧化氢溶液(30％)。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，加热可以包括加热达30分钟或以上，如达45分钟或者达1小时的一段时间。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，加热可以包括加热30分钟。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，加热可以包括使酸和过氧化物溶液沸腾。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述酸和过氧化物溶液可以包括1:1的冰乙酸：过氧化氢溶液(30％v/v)并将所述溶液加热至沸腾30分钟。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述液基提取还可以包括将植物或真菌组织在酸和过氧化物溶液中机械搅动，例如，搅拌。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，盐提取可以包括在盐溶液中加热植物或真菌组织。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述盐溶液可以包含LiCl或NaCl。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述盐溶液可以包括约0.5M-10M，如0.5M-3M的盐浓度。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述盐溶液可以包括约3M盐浓度的LiCl或NaCl。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，加热可以包括加热达30分钟或以上，如达45分钟或者达1小时的一段时间。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，加热可以包括加热30分钟。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，加热可以包括使盐溶液沸腾。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述盐溶液可以包括约3MLiCl并且可以将所述溶液加热至沸腾30分钟。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述盐溶液可以包括约3MNaCl并且可以将所述溶液加热至沸腾15分钟。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，液基提取还可以包括将植物或真菌组织在盐溶液中机械搅动，例如，搅拌。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，碱提取可以包括在碱溶液中加热植物或真菌组织。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述碱溶液可以包括氢氧化钠(NaOH)。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述碱溶液可以包括约0.5-10M，如0.5M-3M的碱浓度。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述碱溶液可以包括约0.5M-1M的碱浓度的氢氧化钠。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，加热可以包括加热达30分钟或以上，如达45分钟或者达1小时。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，加热可以包括加热30分钟。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，加热可以包括使碱溶液沸腾。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述碱溶液可以包括约0.5MNaOH并且可以将所述溶液加热至沸腾5分钟。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，液基提取还可以包括将植物或真菌组织在碱溶液中机械搅动，例如，搅拌。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，酸提取可以包括在包含酸的酸溶液中加热植物或真菌组织。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述酸溶液可以包含酸性酸或盐酸。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述酸溶液可以包含50％的乙酸。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，加热可以包括加热达30分钟或以上的一段时间。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，加热可以包括加热30分钟。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，加热可以包括使酸溶液沸腾。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述酸溶液可以包含50％的乙酸并且将所述溶液加热至沸腾30分钟。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，液基提取还可以包括将植物或真菌组织在酸溶液中机械搅动，例如，搅拌。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，去细胞化步骤可以发生在分离步骤之前。
在任何上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述去细胞化微通道是基本不使用胶水物理成束的，例如，通过缠结。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，成束的步骤可以包括将微通道胶粘在一起。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，可以通过生物相容的，任选地生物可降解的胶水将微通道胶粘在一起。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述生物相容的胶水可以包含PEG基、聚氨脂基、明胶基或者纤维蛋白基胶水。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述生物相容性的胶水可以包括纤维蛋白基胶水。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，成束的步骤可以包括将微通道模制在一起。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，可以使用其中压紧了微通道的模具来进行模制。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述模具可以包含生物医学级的硅酮。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述模具可以包含其中用于容纳微通道的通道，所述通道具有向其中将要模制的微通道赋予的横截面尺寸。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述模具可以分成两个或更多个部分，所述部分可以围绕微通道组装以进行模制。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，可以将胶水添加至面向微通道的模具表面，并且可以将所述微通道在所述模具中压紧并在其中保持，同时胶水固化。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述模具可以包含第一部分和第二部分，并且所述模制可以包括向面向微通道的第一部分表面和面向微通道的第二部分表面添加胶水；将所述微通道放置在第一部分和第二部分中，与胶水接触；向第一部分中的微通道的暴露表面、第二部分中的微通道的暴露表面或两者添加胶水；相对于第一部分，将具有微通道的第二部分安装在第一部分的微通道的暴露表面上，借此组装所述模具；使胶水基本固化；并除去模具。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述方法还可以包括将成束的微通道切割成所期望的长度的步骤。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述方法还可以包括将成束的微通道切割成所期望的长度的步骤，其中可以在除去模具前实施所述切割步骤。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述方法还可以包括使微通道灭菌的步骤。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述灭菌步骤可以包括将所述微通道暴露于乙醇或者乙醇和水的混合物。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，微通道可以包含木质部和/或韧皮部通道。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，去细胞化微通道可以是纤维素基、几丁质基、木质素基、木质-纤维素聚合物基、半纤维素基或者果胶基的，或它们的任意组合。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述束内的去细胞化微通道密度可以大于植物或真菌组织内的微通道密度。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述植物或真菌组织可以包括来自以下各项的含有微通道的组织：苹果隐头花序(Malus pumila)组织、蕨(Monilophytes)组织、萝卜(Brassica rapa)根组织、银杏分枝组织、马尾草(equisetum)组织、萱草(hermocallis)杂交叶组织、羽衣甘蓝(Brassica oleracea)茎组织、针叶树花旗松(Pseudotsuga menziesii)组织、仙人掌果(pitaya)肉组织、斑状长春花(Maculata Vinca)组织、水生莲花(Nelumbo nucifera)组织、郁金香(Tulipa gesneriana)花瓣组织、车前草(Musa paradisiaca)组织、西兰花(Brassica oleracea)茎组织、枫叶(Acerpsuedoplatanus)茎组织、甜菜(Beta vulgaris)初生根组织、葱(Allium cepa)组织、兰科(Orchidaceae)组织、萝卜(Brassica rapa)茎组织、韭葱(Allium ampeloprasum)组织、枫树(Acer)树枝组织、芹菜(Apium graveolens)组织、葱(Allium cepa)茎组织、松树组织、芦荟组织、西瓜(Citrullus lanatus var.lanatus)组织、草甸排草(Lysimachianummularia)组织、仙人掌(cactae)组织、北极剪秋罗(Lychnis Alpina)组织、大黄(Rheumrhabarbarum)组织、南瓜果肉(Cucurbita pepo)组织、龙血树(Asparagaceae)茎组织、紫露草(Tradescantia virginiana)茎组织、芦笋(Asparagus officinalis)茎组织、蘑菇(Fungi)组织、茴香(Foeniculum vulgare)组织、玫瑰(Rosa)组织、胡萝卜(Daucus carota)组织或梨(Pomaceous)组织，或者通过直接基因组修饰或者通过选择育种产生的遗传改变的组织，或它们的任意组合
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述植物或真菌组织可以包括芹菜、芦笋或两者。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，使所述微通道去细胞化的步骤可以包括通过热冲击去细胞化、用去污剂处理、渗透性冲击、冻干、物理溶胞、电学破裂或酶促消化或它们的任意组合，借此除去细胞材料和核酸以提供去细胞化微通道。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，去细胞化的步骤可以包括用十二烷基硫酸钠(SDS)处理。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，可以通过使用二价盐水溶液除去残余的SDS以使得从微通道中沉淀出含有SDS胶束的盐残余物。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，dH2O、DI水、乙酸、DMSO或者超声处理或它们的任意组合可以用于除去二价盐水溶液、盐残余物和/或SDS胶束。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述二价盐水溶液的二价盐可以包括MgCl2或者CaCl2。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，去细胞化步骤可以包括用约0.1％或约1％SDS的SDS水溶液处理，并且可以在使用约100mM浓度的CaCl2水溶液去细胞化后，除去残余SDS，然后在dH2O或DI水中培育。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述方法还可以包括将活的植物或动物细胞引入微通道的步骤。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述活细胞可以是哺乳动物细胞。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述活细胞可以是人细胞。
在另一个实施方式中，本文提供了通过本文所描述的任何一种或多种方法产生的去细胞化微通道。
在另一个实施方式中，本文提供了通过本文所描述的任何一种或多种方法产生的支架生物材料。
在上述支架生物材料的另一个实施方式中，所述支架生物材料可以是或者包括如本文所描述的支架生物材料。
在另一个实施方式中，本文提供了试剂盒，其包含以下中的任一个、两个、三个或更多个：
模具；
胶水；
一个或多个微通道；
一种或多种去细胞化试剂；
手术刀或切片机；
无菌测量装置；
无菌盐水；
镊子；和/或
用于实施如本文所描述的任何一种或多种方法的说明书。
附图说明
参考以下描述和附图，这些及其它特征将变得更好理解，其中：
图1显示(左图)：分离的芦笋(AS)维管束，大约3cm长。(右图)：AS维管束的微观横截面视图，其中木质部通道轮廓相对于背景清楚可见。
图2显示(左图)：分离的芹菜(CL)维管束，可变长度5-10cm。(右图)：CL维管束的微观横截面视图，其中木质部通道轮廓相对于基本组织背景清楚可见。
图3显示(左图)：用于维管束压紧的生物医学级硅酮模具(5-mm内径，1-cm长)。将模具半部分挤压在一起。(右图)：含有胶粘的CL维管束的模具的2mm-厚切片；
图4显示了胶水固化步骤期间的AS通道束；将模具半部分挤压在一起；
图5显示了胶水固化步骤期间的CL通道束；将模具半部分挤压在一起；
图6显示(左图)：在DPBS中储存的HDMC(AS)束。(右图)：在从硅酮模具中除去后即刻的各个HDMC(AS)；
图7显示(左图)：在DPBS中储存的HDMC(CL)束。(右图)：在从硅酮模具中除去后即刻的各个HDMC(CL)；
图8显示了GFP-3T3细胞培养1周，然后在4％多聚甲醛中固定后HDMC(AS基)样品的共聚焦激光扫描显微照片。在木质部微通道(蓝色-自身荧光)中和周围，细胞(绿色-绿色荧光蛋白)是可见的。(左图)：胶粘的束内单个CL维管通道的横截面视图，其中细胞在木质部通道内是可见的。注意围绕木质部和韧皮部通道开口的细胞密度。(右图)：细胞在其中分散的胶粘的束内的2个脉管通道的横截面(部分)视图；
图9显示了GFP-3T3细胞培养1周，然后在4％多聚甲醛中固定后HDMC(CL基)样品的共聚焦激光扫描显微照片。在木质部微通道(蓝色-自身荧光)中和周围，细胞(绿色-绿色荧光蛋白)是可见的。(左图)：胶粘的束内单个CL维管通道的横截面视图，其中细胞在木质部通道内是可见的。注意，粘合至纤维蛋白胶水沉积物的细胞位于维管通道的右侧。(右图)：细胞在其中分散的胶粘的束内的2个脉管通道的横截面视图；
图10显示了具有通过红色箭头指示的可见的维管束的1/4AS截面。
图11显示了在含有DPBS的称量盘中的分离的AS维管束。
图12显示了在含有DPBS的称量盘中的分离的CL维管束。
图13显示了使用PEG基胶水在胶水凝固期间的AS HDMC束；
图14显示了用PEG基胶水胶粘的DPBS存储溶液中的AS HDMC。VB疏松键合并且HDMC在所使用的模具型实验条件中不保留圆柱形形状；
图15显示了胶水凝固期间的CL HDMC束，其中PEG基Coseal胶水的体积膨胀引起硅酮模具半部分分离；
图16显示了在DPBS存储溶液中使用PEG基Coseal胶粘的CL HDMC束，其中可见各个VB部分剥离；
图17显示了使用氰基丙烯酸酯基胶水胶粘的AS条束的侧视图；
图18显示了胶粘(氰基丙烯酸酯胶水)的AS条束的径向视图，其中各个通道隐约可见；
图19显示了使用生物可降解的纤维蛋白密封剂(TISSEEL)固化期间，接合的硅酮模具半部分中的AS通道；
图20显示了在使用纤维蛋白胶水的胶水固化步骤期间，硅酮模具内的AS通道；
图21显示了从硅酮模具除去后，纤维蛋白-胶粘的AS通道的视图；
图22显示了在GFP-3T3细胞培养1周，然后在4％多聚甲醛中固定后的AS样品的透视图(左图)和相同样品的俯视图(右图)；
图23显示了GFP-3T3细胞培养1周，然后在4％多聚甲醛中固定后AS HDMC束样品的CLSM图像。在木质部微通道(蓝色)中和周围，细胞(绿色)是可见的；
图24显示了在胶水(纤维蛋白)固化步骤期间，食品级硅酮细管模具内的AS通道的视图。
图25显示了在切割成5mm长之后，在无菌DPBS中储存的胶粘(纤维蛋白)的AS通道样品的视图；
图26显示了用氰基丙烯酸酯胶水胶粘的CL通道束的侧视图；
图27显示了使用氰基丙烯酸酯胶水胶粘的CL通道束的径向视图，其中各个通道是隐约可见的；
图28显示了使用纤维蛋白密封剂固化期间，在接合的硅酮模具半部分中的CL通道；
图29显示了在使用纤维蛋白密封剂的胶水固化步骤期间，硅酮模具内的CL通道的视图；
图30显示了从硅酮模具除去后，纤维蛋白-胶粘的CL通道束的视图；
图31显示了在GFP-3T3细胞培养1周，然后在4％多聚甲醛中固定后的CL束样品的透视图(左图)和相同样品的俯视图(右图)；
图32显示了GFP-3T3细胞培养1周，然后在4％多聚甲醛中固定后CL束样品的CLSM图像。在木质部微通道(蓝色)中和周围，细胞(绿色)是可见的；
图33显示了在胶水(纤维蛋白)固化步骤期间，食品级硅酮细管模具内的CL通道的视图；
图34显示了在除去顶部硅酮模具半部分后，胶粘的CL通道的视图；
图35显示了在切割成5mm长之后，在无菌达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中储存的胶粘的CL通道样品的视图。
图36显示A)HDMC/AS内木质部通道和成纤维细胞的共聚焦激光扫描荧光显微照片(Z-叠加投影)。通道显像为红色(自身荧光；假色)，GFP-3T3成纤维细胞显象为绿色(绿色荧光蛋白；假色)。B)显示了图版A中红色轮廓的多个通道的局部放大图。C)来自图版B的透视图的绿色荧光蛋白和木质部自身荧光信号的3D-体绘图(Fiji/ImageJ；3D Viewer插件)。D)3D绘图的旋转视图，其显示了细胞沿通道长度的方向性；
图37显示A)HDMC/CL内木质部通道和成纤维细胞的共聚焦激光扫描荧光显微照片(Z-叠加投影)。通道显像为红色(自身荧光；假色)，GFP-3T3成纤维细胞显象为绿色(绿色荧光蛋白；假色)。白色尖头表明了通道外细胞的存在。蓝色箭头表明了通道外细胞的存在。B)图版A中红色轮廓的单通道的局部放大图。C)来自图版B的透视图的绿色荧光蛋白信号的3D-体绘图(Fiji/ImageJ；3D Viewer插件)。D)3D绘图的旋转视图，其显示了细胞沿通道长度的方向性；
图38显示了来自实施例8的皮下注射研究的芹菜-来源的HDMC束的组织学染色。纵向切割。苏木精和伊红(A，B)；
图39显示了来自实施例8的皮下注射研究的芹菜-来源的HDMC束的组织学染色。横向切割。苏木精和伊红(A，B)；
图40显示了来自实施例8的皮下注射研究的芦笋-来源的HDMC束的组织学染色。纵向切割。苏木精和伊红(A，B)；
图41显示了来自实施例8的皮下注射研究的芦笋-来源的HDMC束的组织学染色。横向切割。苏木精和伊红(A，B)；
图42是显示作为乙酸：30％过氧化氢的不同比值和煮沸时间的函数，处理后分成各个VB的束的百分比的图；
图43显示了在不同浓度的酸和过氧化物溶液沸腾20分钟，然后摆在透明塑料板上的去细胞化芹菜。显示了冰醋酸与30％过氧化氢的比值值(图43A-3:1；图43B-2:1；图43C-1:1；图43D-1:2；图43E-1:3)。
图44显示了用冰醋酸：30％过氧化氢的1:1的酸和过氧化物的溶液处理的芦笋条。图44A显示了在酸/过氧化物溶液中切片的新切割的芦笋。图44B显示了从酸/过氧化物溶液中除去并且在蒸馏水中清洗的所产生的提取的束。图44C显示了放置在连续水清洗中的束的小的亚组。
图45是显示作为盐浓度和煮沸时间的函数，分成各个VB的LiCl-处理的束的百分比的图；
图46是显示作为盐浓度和煮沸时间的函数，分成各个VB的NaCl-处理的束的百分比的图；
图47是显示作为NaOH浓度和煮沸时间的函数，分成各个VB的NaOH-处理的束的百分比的图；
图48显示了来源于在LiCl的煮沸盐溶液中浸没15分钟的天然组织的CL维管束的粒径分布。对其它处理观察了类似的微观结构分布。图48A：用0.1％Calcofluor White对维管束染色并且对图像设阈值并分成部分以用于粒度分析。图48B：维管束直径的柱状图。平均尺寸为23.7±1.5μm。值为平均值和平均值的标准差；
图49显示在0.5M LiCl中煮沸10、15、20和30分钟后，保留的CL维管束(VB)微观结构的荧光显微镜图象。将材料用Calcofluor White染色10分钟，并将图像转化为灰度；
图50显示在1M LiCl中煮沸10、15、20和30分钟后，保留的CL维管束(VB)微观结构的荧光显微镜图象。将材料用Calcofluor White染色10分钟，并将图像转化为灰度；
图51显示在2M LiCl中煮沸10、15、20和30分钟后，保留的CL维管束(VB)微观结构的荧光显微镜图象。将材料用Calcofluor White染色10分钟，并将图像转化为灰度；
图52显示在3M LiCl中煮沸10、15、20和30分钟后，保留的CL维管束(VB)微观结构的荧光显微镜图象。将材料用Calcofluor White染色10分钟，并将图像转化为灰度；
图53显示在0.5M NaCl中煮沸10、15、20和30分钟后，保留的CL维管束(VB)微观结构的荧光显微镜图象。将材料用Calcofluor White染色10分钟，并将图像转化为灰度；
图54显示在1M NaCl中煮沸10、15、20和30分钟后，保留的CL维管束(VB)微观结构的荧光显微镜图象。将材料用Calcofluor White染色10分钟，并将图像转化为灰度；
图55显示在2M NaCl中煮沸10、15、20和30分钟后，保留的CL维管束(VB)微观结构的荧光显微镜图象。将材料用Calcofluor White染色10分钟，并将图像转化为灰度；
图56显示在3M NaCl中煮沸10、15、20和30分钟后，保留的CL维管束(VB)微观结构的荧光显微镜图象；
图57显示在0.5M NaOH中煮沸10、15、20和30分钟后，保留的CL维管束(VB)微观结构的荧光显微镜图象。将材料用Calcofluor White染色10分钟，并将图像转化为灰度；
图58显示在1M NaOH中煮沸10、15、20和30分钟后，保留的CL维管束(VB)微观结构的荧光显微镜图象。将材料用Calcofluor White染色10分钟，并将图像转化为灰度；
图59显示在2M NaOH中煮沸10、15、20和30分钟后，保留的CL维管束(VB)微观结构的荧光显微镜图象。将材料用Calcofluor White染色10分钟，并将图像转化为灰度；
图60显示在3M NaOH中煮沸10、15、20和30分钟后，保留的CL维管束(VB)微观结构的荧光显微镜图象。将材料用Calcofluor White染色10分钟，并将图像转化为灰度；
图61显示在1:1(v/v)比值的过氧化物和乙酸中煮沸10、15和20分钟后，保留的CL维管束(VB)微观结构的荧光显微镜图象。将材料用Calcofluor White染色10分钟，并将图像转化为灰度；
图62显示在1:2(v/v)比值的过氧化物和乙酸中煮沸10、15和20分钟后，保留的CL维管束(VB)微观结构的荧光显微镜图象。将材料用Calcofluor White染色10分钟，并将图像转化为灰度；
图63显示在2:1(v/v)比值的过氧化物和乙酸中煮沸10、15和20分钟后，保留的CL维管束(VB)微观结构的荧光显微镜图象。将材料用Calcofluor White染色10分钟，并将图像转化为灰度；
图64显示了从在水中煮沸30分钟(对照条件)的分离的CL维管束组装的HDMC；
图65显示了从煮沸30分钟的NaOH处理的CL维管束组装的HDMC；
图66显示了如实施例10所述，在稀乙酸和过氧化物中煮沸15分钟的浸渍的CL；和
图67显示了浸渍的芹菜，其中仅木质部和韧皮束可见。
具体实施方式
先前缺少可以模拟人、植物和动物中的某些组织的定向、通道-样微观结构的材料(生物材料)。这些定向组织的实例包括脊髓、脉管通道、淋巴组织、神经组织和多种其它组织的胞外基质(ECM)。在本领域中，具有方向性和/或通道-样结构的生物相容性材料是所期望的。
去细胞化植物组织可以用于提供支架生物材料。所述植物组织可以包括微通道，如木质部和韧皮部通道，其可以赋予支架生物材料一定的方向性。然而，在去细胞化植物组织中，功能性结构元件(微通道)的数目可能受限于它们在所述植物组织内的天然密度。例如，就SCI后的功能恢复而言，材料性能可能受限于在某些应用中对于神经元生长可用的微通道的数目。本发明人目前已开发了用于使这些通道致密化的方法以提供高密度微通道(HDMC)束，其可以在多种应用中使用，包括脊髓损伤(SCI)的治疗和/或修复以及多种其它应用。
如本文所描述的，在某些实施方式中，存在于植物组织的维管束中的微通道(即木质部和韧皮部)可以提供用于细胞(如神经元)的生长和/或再生的引导支架。与某些人工或合成基材相比，这些去细胞化植物结构可以提供更适合细胞生长的表面(就贴壁性、生物相容性等而言)。通过提取、分离和再装配这些通道，本文显示这些引导结构部件可以致密化并且可以为增殖细胞提供更多途径。据考虑在某些实施方式中，与未进一步修饰的去细胞化植物材料相比，致密化的微通道束可以在某些应用中提供来源于微通道的提高的致密化的优越性能。在其中致密化有益的某些实例中，据考虑与致密化的维管组织相比，未修饰的去细胞化材料作为每单位体积的支架材料可能不太有效。
在某些实施方式中，本文所描述的生物材料可以来源于植物和真菌界中存在的细胞壁结构和/或维管结构以产生可以促进和/或定向引导细胞浸润、细胞生长、血管生成、组织修复和/或组织重建等的3D支架。如将理解的，可以从具有维管结构或微通道(如，例如，木质部和/或韧皮部)的植物或真菌生物的任何适合的部分，包括(例如)种子、根、皮、叶、茎、果实、果肉、核产生如本文所描述的生物材料。生物材料可以包含(例如)以下物质，如纤维素、几丁质、木质素、木质纤维素聚合物、半纤维素、果胶和/或在这些生物中天然存在的任何其它适合的生物化学品/生物聚合物。
在某些实施方式中，不同于多种商品化生物材料，如本文所描述的植物/真菌来源的生物材料可以是基本不可吸收或较差可吸收的(即它们将基本不会降解并被身体吸收)，尽管在其中使用胶水的实施方式中，在某些实施方式中，所述胶水可以是生物可降解的。这些支架的不可吸收特征可以提供某些益处。例如，在某些实施方式中，本文所描述的生物材料可以耐受形变和/或可以长期保持它们的预期几何形状。在某些实施方式中，由于与某些其它产品相比，它们可以具有最小足迹，因此可以将它们认为是对身体有效不可见的，从而几乎不引起免疫应答。当可吸收生物材料降解时，它们的副产品通常引起不利免疫应答，并且诱导氧化应激并在恢复组织中导致pH升高，这可以通过使用不可吸收的生物材料避免。
如将理解的，除非另外说明，否则本文所使用的植物和真菌界的含义/定义基于Cavalier-Smith分类(1998)。
支架生物材料
本文描述了支架生物材料，方法及其用途，以及用于生产所述支架生物材料的方法。将理解出于旨在对于本领域技术人员说明性的目的提供实施方式和实施例，并且这些实施方式和实施例不旨在以任何方式进行限制。
在一个实施方式中，本文提供了包含至少一个微通道束的支架生物材料，所述微通道束包含分离自植物或真菌组织的多个去细胞化微通道，所述去细胞化微通道在所述束内彼此基本平行布置。
如将理解的，在某些实施方式中，所述支架生物材料可以是具有3-维结构的材料(尽管在某些实施方式中，x、y和z维中的任一个可以是非常薄的)，其中去细胞化通道的布置提供了通过所述微通道的尺寸、密度和取向所确定的定向孔隙度。在某些实施方式中，所述支架生物材料可以适合于提供活细胞可以在其上或通过其中浸润和/或生长的和/或增殖的支架。
在某些实施方式中，所述微通道通常可以包含来源于或分离自植物或真菌组织的任何适合的维管或其它通道-型结构。在某些实施方式中，所述微通道可以包含(例如)木质部和/或韧皮部通道。在某些实施方式中，所述微通道可以是去细胞化的，从而从所述微通道除去所述植物或真菌组织的细胞材料和核酸。在某些实施方式中，所述微通道可以单独分离自植物或真菌组织，可以聚集成分离自植物或真菌组织的一个或多个维管束或它们的任意组合。在某些实施方式中，所述微通道可以是纤维素基、几丁质基、木质素基、半纤维素基、木质纤维素聚合物基或者果胶基的，或它们的任意组合。
在某些实施方式中，所述微通道的直径可以为约50至约150微米或它们之间存在的任何子区间或值，其连续长度取决于生物材料来源的尺寸或者通过微通道向一个或多个所期望的长度的切割确定。在某些实施方式中，可以使用不同直径和/或长度的微通道的混合物，或者可以分选/选择微通道，从而使用具有类似直径和/或长度的微通道。
如将理解的，植物或真菌组织的细胞材料和核酸可以包括胞内内容物，如细胞的细胞器(例如，叶绿体、线粒体)、细胞核、细胞核酸和/或细胞蛋白。这些可以从植物或真菌组织，从微通道和/或从支架生物材料基本除去、部分除去或完全除去。将认识到在本文所描述的去细胞化植物或真菌组织中仍可以存在痕量的这些组分。如还将理解的，本文中对去细胞化微通道的提及旨在反映已从所述微通道中基本除去了在所述微通道的植物或真菌来源中存在的这些细胞材料——这不排除以下可能性：在某些实施方式中，去细胞化微通道可能含有或包含随后引入或再次引入的一般任何种类(如动物或人细胞)的细胞、细胞材料和/或核酸。
的确，在某些实施方式中，如本文所描述的去细胞化微通道和/或支架生物材料还可以包含在所述去细胞化微通道中的至少一种上和/或内的活细胞。在某些实施方式中，所述活细胞可以是动物细胞、哺乳动物细胞或人细胞。在某些实施方式中，所述活细胞可以包含植物和/或真菌细胞。
在某些实施方式中，据考虑可以将植物和/或真菌细胞添加至微通道以进一步修饰所述通道，然后(例如)可以在植入前进行去细胞化。举例来说，在某些实施方式中，去细胞化过程可以使天然细胞壁蛋白变性和/或从所述支架除去天然细胞壁蛋白，并且据考虑可以将所选和/或工程化部分，如多糖蛋白(例如，缀合至哺乳动物表面锚点(surfaceanchorage)和配体-结合域的多糖)添加至所述去细胞化支架壁。在某些实施方式中，可以添加锚点蛋白。在某些实施方式中，可以在所述去细胞化支架上添加/沉积的细胞可以包括可以向所述微通道结构中产生有用或功能性蛋白或所关心的大分子的那些细胞。在某些实施方式中，例如，可以将具有哺乳动物表面锚点的蛋白添加至所述支架以加速向周围组织的整合。在某些实施方式中，可以基因修饰细胞以产生这些部分或蛋白，并且可以将所述细胞添加至所述支架一段时间，然后除去、清洗掉或杀死。可以添加的蛋白或部分的实例可以包括特定细胞类型的哺乳动物生长因子(例如，以促进神经元增殖)。
在某些实施方式中，微通道束可以包括去细胞化微通道的任何适合的聚集和群集。在下文中所描述的实例中，使用胶粘形成束。然而，将理解在某些实施方式中，作为替代可以使用多种其它无胶水技术形成束，所述技术如(但不限于)例如，使用密封剂的技术、机械压实或缠结或者相邻分离的维管结构的化学交联。在某些实施方式中，可以通过使微通道在纤维素基水凝胶或者其它这些水凝胶中混悬来形成束。在某些实施方式中，例如，可以通过使它们彼此围绕穿过来使各个微通道和/或维管束结合在一起。在某些实施方式中，据考虑可以实施将分离(任选地，去细胞化)的维管结构向较大的包封和/或扣紧的维管结构(任选地，去细胞化)的压紧/压实。
在任何上述方法的某些实施方式中，成束步骤可以包括在不使用胶水的情况下，使微通道和/或VB物理结合或物理交联。该过程可以被称为微通道的缠结。可以使微通道物理打结或者另外包裹，从而微通道和/或VB的分离需要使用力。不同尺寸和使用不同长度(Kuhn片段或持续长度)可以造成不同的缠结和对齐轮廓。可以通过搅拌装置，如棒的搅拌发生缠结。缠结可以发生在基于液体的提取期间。
如本文详细描述的，在某些实施方式中，分离的去细胞化植物或真菌的维管结构(即其木质部、韧皮部和/或维管束)可以束(并且任选地胶粘)在一起，从而提供超过植物或真菌来源材料中存在的以外的通道致密化。在某些实施方式中，这些束可以设计成生物相容的，并且可以进行进一步官能化。据考虑在某些实施方式中，这些高密度微通道(HDMC)束可以在多种应用中使用，其可以包括(但不限于)作为胞外基质、细胞支架和专用结构支撑使用。
如将理解的，在某些实施方式中，所述束的去细胞化微通道可以在所述束内彼此基本平行布置，从而提供所述束的通道的基本共同的纵向方向性或排列。如以下进一步详细描述的，图4和5显示了具有彼此基本平行布置的去细胞化微通道的束的实例(即图4左边的束中的所有微通道彼此基本平行布置，以基本相同的方向性取向(左-右)；并且图4右边的束中的所有微通道彼此基本平行布置，以基本相同的方向性取向(前-后))。如果去细胞化微通道通过缠结成束，则基本平行可以表示所述束的共同的方向性或排列。
在某些实施方式中，所述支架生物材料的束的多个去细胞化微通道可以在所述束内胶合在一起。在某些实施方式中，所述多个去细胞化微通道可以在所述束内通过生物相容性，任选地生物可降解胶水胶粘在一起。通常，期望胶水是生物可降解的，从而它在所述支架生物材料植入后的一段时间内降解，然而本文还考虑了其中胶水不是生物可降解的的实施方式。在某些实施方式中，所述胶水可以是在潮湿条件下具有优良粘合性的胶水。在某些实施方式中，所述生物相容性的胶水可以包含PEG基、聚氨脂基、明胶基或者纤维蛋白基胶水。在某些实施方式中，所述生物相容性的胶水可以包含纤维蛋白基胶水。
在以下所描述的实例中，纤维蛋白胶水显示对于胶粘产生HDMC束和支架生物材料特别有效。然而，将理解还考虑了多种其它胶水和/或密封剂。例如，在某些实施方式中，据考虑纤维蛋白胶水可以替代其它胶水/密封剂类型，如合成胶水。这些胶水在某些实例中可以是有利的，由于(例如)植入后不太显著的免疫应答。
具有添加剂的PEG基胶水可以用于使它们生物降解，然而，本发明人已发现PEG基胶水的膨胀使得这些胶水与纤维蛋白胶水相比不太优选。通常，在某些实施方式中，可以在HDMC束的制造中使用多种适合的胶水系统，然而，应注意胶水的生物可降解性通常是所期望的，尽管不必需。在某些实施方式中，据考虑可以使用(例如)PEG、聚氨脂或明胶基胶水或密封剂。在某些实施方式中，可以将胶水选择为(例如)植入后生物相容的且可降解的。
在某些实施方式中，所述胶水可以是纤维蛋白胶水或者氰基丙烯酸酯胶水。在某些实施方式中，所述胶水可以包含纤维蛋白密封剂。在某些实施方式中，所述胶水可以包含来自Baxter的TISSEEL，来自Ethicon的Evicel，来自Stryker的Vitagel。在某些实施方式中，所述胶水可以包含PEG密封剂。在某些实施方式中，所述胶水可以包含来自Baxter的Coseal或者来自Covidien的Duraseal。胶水的实例还描述于Vyas等人,Comparison ofHemostatic Agents used in Vascular Surgery,Expert Opin Biol Ther.,2013,13(12):1663-1672中，该文献以其全部内容作为参考并入本文。
在其中HDMC束的胶粘并且具体地，模制是所期望的实施方式中，可以选择胶水以对于模具结构本身具有低粘合性，从而具有低膨胀性质以防止当胶水凝固/固化时挤压所述微通道。在某些实施方式中，据考虑可以使用非膨胀胶水或者具有低膨胀的胶水。在某些实施方式中，可以选择具有按体积计小于约20％，小于约19％，小于约18％，小于约17％，小于约16％，小于约15％，小于约14％，小于约13％，小于约12％，小于约11％，小于约10％，小于约9％，小于约8％，小于约7％，小于约6％，小于约5％，小于约4％，小于约3％，小于约2％，小于约1％或者基本无(即0％)膨胀的体积膨胀的胶水，或者具有以任何这些值的上端作为界限的任何范围或者处于这些值中的任何两个之间的任何范围的膨胀的体积膨胀的胶水。
在其中胶粘的某些实施方式中，可以使用收缩胶水(或者当干燥时收缩的胶水)。在这些实施方式中，通常可以选择胶水以提供很少或极少收缩，以防止损坏束。
在某些实施方式中，所述胶水可以是生物相容的和/或生物惰性的。在某些实施方式中，胶水可以：很好地粘合至木质纤维素；不强烈粘合至非木质纤维素材料；可以是基本无免疫原性的；可以允许无菌制备；可以不包括使用前的彻底制备和/或处理步骤；可以相对快速固化(例如，在约10分钟内)；可以具有低或无内毒素负荷；可以不渗透木质纤维素，从而它不会阻断微通道；可以不降解木质纤维素，修饰其表面化学和/或影响或降低其材料性质；在储存条件下，可以不降解或者可以非常缓慢降解(如4℃，磷酸盐缓冲盐水)；可以不随时间进行自催化化学改变，这将显著改变其性质；或者其任意组合。
在某些实施方式中，可以选择基本生物相容的和基本无毒的胶水。在某些实施方式中，可以期望胶水是基本生物惰性的，从而导致几乎没有免疫应答。在某些实施方式中，可以期望选择胶水，从而使得所述胶水在细胞侵袭和/或植入后是可吸收的。在其中期望模制和将使用硅酮基模具的实施方式中，可以期望胶水对硅酮基本不粘。在其中预期治疗和/或体内应用的实施方式中，可以期望使用管理机构，如FDA批准的胶水。多种手术胶水(例如)是可商购的。手术胶水/粘合剂的综述可见于Yepremyan等人,Surgical Glue:A BriefOverview,Austin Journal of Biomedical Engineering,2014,1(4):1020和Annabi等人,Elastic Sealants for Surgical Applications,European Journal of Pharmaceuticsand Biopharmaceutics,2015,http://dx.doi.org/10.1016/j.ejpb.2015.05.022，以上每篇文献以其全部内容作为参考并入本文。在某些实施方式中，可以期望选择合成胶水，而不是天然来源的胶水，因为生物惰性在合成胶水中更常见。尽管显示纤维蛋白基胶水在以下实例中特别有效，但是在其中免疫应答敏感性特别高的实施方式中，可以期望使用合成胶水或其它生物惰性胶水以避免(例如)植入位点附近甚至很小的免疫应答。已研究了纤维蛋白基胶水和合成粘合剂，例如，在Srinivasan等人,Novel Synthetic Adhesive as anEffective Alternative to Fibrin Based Adhesives,World Journal of Hepatology,2017,9(24):1030-1039中，该文献以其整体作为参考并入本文。
所考虑的天然来源的胶水的实例可以包括：
·天然聚合物(如多糖、多肽等)。多种类型是已知的，包括：胶原蛋白/明胶基；壳聚糖基；葡聚糖基；和海藻酸盐基胶水。
由于它们的生物相容性和可降解性，明胶型胶水是已知的；在欧洲批准销售并且具有FDA快速通道地位的明胶-型胶水的实例是得自Life-Bond(www.life-bond.com/ index.php/lifesealtm/)的LifeSealTM。
纤维蛋白-型胶水，也称为纤维蛋白密封剂是常用的，并且存在FDA-批准的胶水。存在多种不同类型的纤维蛋白胶水，包括(例如)基于牛、猪和/或人凝血酶的胶水。
还考虑了仿生胶水。这些类型的胶水，通常受壁虎、石蛾、多种虫等的启发，主要处于研究阶段，但是在本领域是已知的。
所考虑的合成胶水的实例可以包括：
·PEG基胶水：PEG基胶水被认为是合成的，并且通常是生物相容的。Coseal(Baxter Inc)是PEG基胶水广泛可用的实例。本发明人在初期使用Coseal的测试(未显示)中遇到了胶水体积膨胀和/或与硅酮模具的粘合(当使用时)，但是通过适当调整，据考虑可以使膨胀和粘着的影响最小化。
·聚氨脂胶水：聚氨脂胶水被认为是合成的，并且通常是生物相容的。正在积极研究这些类胶水。实例可以包括VIVO(Adhesys Medical GmbH)(基于聚氨脂)和/或TissuGlu(Cohera Medical Inc)(基于聚氨脂，FDA-批准的)。
·氰基丙烯酸酯：氰基丙烯酸酯被认为是合成的，尽管可以与毒性降解产物有关并因此可以在一定程度上限制可应用性。据考虑当毒性可以是可避免的时，这些胶水仍可以是有用的，如(例如)在表面使用时。
·其它胶水：正在考虑的其它合成胶水的实例可以包括(例如)MeTro(ElastagenLtd)—基于重组弹性蛋白原，和/或UV可固化粘合剂。
在某些实施方式中，据考虑可以通过(例如)微通道彼此的交联(如简单的纤维素交联)；通过将微通道包裹在外部外壳内，包裹或膜；通过将微通道缝合或系在一起；或者其任意组合来减少或完全避免胶粘。在某些实施方式中，可以使去细胞化的微通道交织或啮合在一起，其在某些实施方式中，可以改善拉伸下的性能。在某些实施方式中，通道可以是柔性的，以允许这种交织或啮合而不会显著破坏。在某些实施方式中，可以在模制期间进行交织。
在某些实施方式中，据考虑可以(例如)通过使各个部分紧密配合在一起的成形法来减少或消除胶水和/或密封剂的使用。
在本文所描述的支架生物材料的某些实施方式中，所述束内的去细胞化微通道密度可以大于植物或真菌组织来源内的微通道密度。在某些实施方式中，例如，去细胞化微通道的密度可以基于每cm2通道数的测量。在某些实施方式中，例如，这可以基于每cm2的维管束数，基于每cm2的维管结构数或者基于每cm2各个木质部和/或韧皮部通道数确定。在某些实施方式中，在具有特定直径的圆形截面积中，可以就微通道数目测量密度。在某些制备中，例如，已在每5mm直径圆形截面积的约20个通道测量了样品，并且还考虑了更高的密度。
在某些实施方式中，模拟运动和/或感觉系统的轴突投射(axonalprojections)可以是所期望的。在某些实施方式中，可能期望对齐皮质脊髓束、红核脊髓束、缝核脊髓束、网状脊髓束、脊髓固有束、脊髓丘脑束和/或背柱感觉轴突。据考虑在某些实施方式中，如本文所描述的HDMC可以用于模拟受试者内受损轴突的3D位置。HDMC可以包括多个亚单元/通道，而不是在某些实施方式，包括一个固定的植入。另外，每个SCI损伤通常是独特的并且很少影响整个脊髓。照此，在某些实施方式中，以模拟各个受试者具体受损的轴突束(axonaltract)的3D取向特异性放置HDMC/通道的能力可以是特别关心的。
在某些实施方式中，植物或真菌组织可以一般地包括含有至少一些微通道和/或维管结构(如，但不限于木质部和/或韧皮部通道)的任何适合的植物或真菌组织或部分，其可以分离自周围植物或真菌组织/结构。
在以上一种或多种支架材料的某些实施方式中，所述植物或真菌组织可以包括苹果隐头花序(Malus pumila)组织、蕨(Monilophytes)组织、萝卜(Brassica rapa)根组织、银杏分枝组织、马尾草(equisetum)组织、萱草(hermocallis)杂交叶组织、羽衣甘蓝(Brassica oleracea)茎组织、针叶树花旗松(Pseudotsuga menziesii)组织、仙人掌果(pitaya)肉组织、斑状长春花(Maculata Vinca)组织、水生莲花(Nelumbo nucifera)组织、郁金香(Tulipa gesneriana)花瓣组织、车前草(Musa paradisiaca)组织、西兰花(Brassica oleracea)茎组织、枫叶(Acer psuedoplatanus)茎组织、甜菜(Beta vulgaris)初生根组织、葱(Allium cepa)组织、兰科(Orchidaceae)组织、萝卜(Brassica rapa)茎组织、韭葱(Allium ampeloprasum)组织、枫树(Acer)树枝组织、芹菜(Apium graveolens)组织、葱(Allium cepa)茎组织、松树组织、芦荟组织、西瓜(Citrullus lanatusvar.lanatus)组织、草甸排草(Lysimachia nummularia)组织、仙人掌(cactae)组织、北极剪秋罗(Lychnis Alpina)组织、大黄(Rheum rhabarbarum)组织、南瓜果肉(Cucurbitapepo)组织、龙血树(Asparagaceae)茎组织、紫露草(Tradescantia virginiana)茎组织、芦笋(Asparagus officinalis)茎组织、蘑菇(Fungi)组织、茴香(Foeniculum vulgare)组织、玫瑰(Rosa)组织、胡萝卜(Daucus carota)组织或梨(Pomaceous)组织。在标题为“来自植物和真菌的去细胞化细胞壁结构及其作用支架材料的用途(Decellularised Cell WallStructures from Plants and Fungus and Use Thereof as Scaffold Materials)”的WO2017/136950的实施例18中描述了植物和真菌组织的其它实例，该专利以其全部内容作为参考并入本文。
在某些实施方式中，可以通过直接基因组修饰或者通过选择育种遗传改变植物或真菌组织以产生其它植物或真菌结构，其可以配置以物理模拟组织和/或在功能上促进靶组织作用。考虑本文中的教导内容，技术人员将能够选择适合的支架生物材料以适合于具体应用。
在某些实施方式中，可以基于(例如)物理性质，如尺寸、结构(多孔/管状)、坚硬度、强度、硬度和/或延展性，对于特定应用选择适合的组织，其可以测量并与具体应用相匹配。
此外，还可以考虑选择化学性质，如反应性、配位数、生成焓、燃烧热、稳定性、毒性和/或键类型以适合于具体应用。还可以在去细胞化和/或官能化之前或之后直接改变这些特征(物理和化学)以对应于具体应用。
在某些实施方式中，微通道可以来源于植物或真菌的相同组织或部分，或者来源于植物或真菌的不同部分或组织。在某些实施方式中，微通道可以来源于相同单个植物或真菌，或者来源于相同种的多个植物或真菌。在某些实施方式中，所述微通道可以来源于不同种的植物或真菌，从而使得所述束包含来自不止一个种的维管结构。在某些实施方式中，可以选择所述微通道以提供具体特征。例如，在某些实施方式中，可以选择直径在特定尺寸范围内的微通道以包括在所述束中，从而赋予所述支架生物材料特定结构特征。
在某些实施方式中，所述植物或真菌组织可以包括芹菜、芦笋或两者。
在某些实施方式中，所述支架生物材料可以是配置以物理模拟受试者组织和/或在功能上促进受试者中靶组织作用的支架生物材料。在某些实施方式中，如本文所描述的使用这些支架生物材料的方法可以包括选择如本文所描述的支架生物材料的步骤，为此配置所述去细胞化微通道以物理模拟受试者组织和/或在功能上促进受试者中的靶组织作用。考虑本文中的教导内容，技术人员将能够选择适合的支架生物材料以适合于具体应用。
多种方法可以用于生产如本文所描述的支架生物材料。举例来说，在以上支架生物材料的某些实施方式中，所述去细胞化微通道可以包括通过以下方式去细胞化的微通道：热冲击、用去污剂(例如，SDS、Triton X、EDA、碱处理、酸、离子型去污剂、非离子型去污剂和两性离子去污剂)处理、渗透性冲击、冻干、物理溶胞(例如，流体压力、临界点去细胞化、CO2临界点去细胞化)、电学破裂(例如，非热不可逆电穿孔)或者酶促消化或其任意组合。在某些实施方式中，如本文所描述的生物材料可以通过使用去细胞化方法得自植物和/或真菌，所述去细胞化方法可以包括任何一些方法，其(单独或组合)包括(但不限于)热冲击(例如，快速冷冻融化)、化学处理(例如，去污剂)、渗透性冲击(例如，蒸馏水)、冻干、物理溶胞(例如，加压处理)、电学破裂和/或酶促消化。
在某些实施方式中，所述微通道通常将首先分离自植物组织，然后去细胞化。以这种方式，去细胞化可以是更容易的，因为微通道通常在尺寸上是类似的，并且可以以类似的速率去细胞化。然而，将理解在某些实施方式中，植物组织可以首先去细胞化，然后从去细胞化的植物组织分离微通道。在这些方法中，可以因此调整去细胞化条件以适合于去细胞化植物组织的性质(例如，在某些实施方式中，与去细胞化试剂更易于接近的较小的植物组织样品相比，可以对较大的植物组织样品进行更长或侵袭性更强的去细胞化规程)。
在其它实施方式中，去细胞化微通道可以包括已通过用去污剂或表面活性剂处理去细胞化的微通道。去污剂的实例可以包括(但不限于)十二烷基硫酸钠(SDS)、Triton X、EDA、碱处理、酸、离子型去污剂、非离子型去污剂和两性离子去污剂。
在其它实施方式中，去细胞化微通道可以包括已通过用SDS处理去细胞化的微通道。在另一个实施方式中，可以通过用二价盐水溶液清洗从微通道除去残余的SDS。二价盐水溶液可以用于使含有SDS胶束的盐残余物从溶液/支架中沉淀/崩解，并且dH2O、乙酸或二甲亚砜(DMSO)处理或超声处理可以用于除去盐残余物或SDS胶束。在某些实施方式中，二价盐水溶液的二价盐可以包括(例如)MgCl2或CaCl2。
在另一个实施方式中，可以通过用0.01至10％，例如约0.1％至约1％，或者例如，约0.1％SDS或约1％SDS的SDS在溶剂，如水、乙醇或另一种适合的有机溶剂中的溶液处理使微通道去细胞化，并且可以使用浓度约100mM的CaCl2水溶液除去残余SDS，然后在dH2O中培育。在某些实施方式中，SDS溶液可以处于高于0.1％的浓度，其可以帮助去细胞化，并且可以伴随着增加清洗以除去残余SDS。在具体的实施方式中，可以通过用约0.1％SDS的SDS水溶液处理对微通道去细胞化，并且可以使用约100mM浓度的CaCl2水溶液除去残余SDS，然后在dH2O中培育。
可以适合于生产用于如本文所描述的支架生物材料的去细胞化微通道的去细胞化规程的其它实例可见于标题为“来自植物和真菌的去细胞化细胞壁结构及其作用支架材料的用途(Decellularised Cell Wall Structures from Plants and Fungus and UseThereof as Scaffold Materials)”的WO 2017/136950，该专利以其全部内容作为参考并入本文。
在某些实施方式中，如本文所描述的去细胞化微通道和/或支架生物材料还可以包含在所述去细胞化微通道中的至少一种上和/或内的活细胞。在某些实施方式中，所述活细胞可以是动物细胞、哺乳动物细胞或人细胞。在某些实施方式中，所述细胞可以是引入或接种到支架生物材料和/或去细胞化微通道中和/或上的细胞，或者可以是(例如)在支架生物材料和/或去细胞化微通道植入活的动物或植物受试者中后浸润到支架生物材料和/或去细胞化微通道中或上的细胞。
支架生物材料的方法和使用
如本文所描述的支架生物材料可以包含一个或多个高密度微通道束。尽管本发明描述的支架生物材料的多种设计根据和所考虑的用途可以与对于标题为“来自植物和真菌的去细胞化细胞壁结构及其作用支架材料的用途(Decellularised Cell WallStructures from Plants and Fungus and Use Thereof as Scaffold Materials)”的WO2017/136950(该专利以其全部内容作为参考并入本文)的支架生物材料所述的那些有关，但是本发明所描述的生物材料可以提供由于通道密度增加和/或由于可以彼此基本平行的通道的可控且方向性排列性质所产生的益处。因此，本发明所述的生物材料对于其中(例如)期望通道方向性的应用是特别有利的。
在某些实施方式中，如本文所描述的生物材料可以(例如)在人和/或兽医应用中，在生物医学实验室研究和/或临床再生医学中具有应用。作为可以用作工业/学术生物医学研究人员的研究工具的支架，对于生物医学植入物，在传感装置和药物递送媒介中和/或在其中可以使用支架的其它适合的应用中，这些生物材料可以是有效的。
在某些实施方式中，如本文所描述的支架生物材料可以用于血管系统的再生。广泛的可用结构可以允许人工产生血管-样结构和/或可以提供适合于血管生成(天然血管形成)的条件。
在某些实施方式中，如本文所描述的支架生物材料可以用作简单或复杂的组织。举例来说，支架可以用于在事故、畸形、美容、损伤或其它组织损害后替换/再生简单(皮肤、骨)或复杂(脊髓、肌肉、神经、血管等)组织。
在某些实施方式中，本文提供了在对其有需要的受试者中，支持动物细胞生长，促进组织再生，促进血管生成，置换组织或者在整容外科中提供结构支架的方法，所述方法包括：
提供根据本文所描述的任何支架生物材料的支架生物材料；和
将所述支架生物材料植入所述受试者。
在某些实施方式中，如本文所描述的高密度微通道(HDMC)法可以为细胞浸润提供定向路径。“方向性”不仅可以从所述微通道内部出现，而且还可以从它们的外表面和通道间空间出现。图36和37显示了沿HDMC内的微通道的内部和外部两者的细胞增殖的迹象。因此，HDMC可以在其中细胞连接(connection)或联接(link)切断的组织修复应用中是特别关心的。例如，定向生物材料可以在这些实例中是特别期望的。据考虑HDMC可以对于脊髓损伤(SCI)治疗是特别关心的，例如，由于脊髓中的神经元在脊髓束中是高度组织化的并且它们的正确作用依赖于定向连接。在某些实施方式中，据考虑HDMC可以提供端到端的支撑结构，该结构可以沿正确脊髓束提供神经元再次连接。如本文所描述的对于通过HDMC的修复可以是特别关心的其它结构可以包括血管系统通道。在某些实施方式中，据考虑HDMC可以起到接合件和/或接头的作用以修复特别细的血管系统。
在某些实施方式中，双向微通道可以提供纳米和/或微米表面形貌特征，其可以驱使神经元和/或轴突引导(参见Straley KS,Foo CWP,Heilshorn SC(2010)Biomaterialdesign strategies for the treatment spinal cord injuries.J Neurotrauma 27:1–19；Hoffman-Kim D,Mitchel J a,Bellamkonda R V(2010)Topography,cell response,and nerve regeneration.Annu Rev Biomed Eng 12:203–31；Hoffman-Kim D,Mitchel Ja,Bellamkonda R V(2010)Topography,cell response,and nerve regeneration.AnnuRev Biomed Eng12:203–31，以上文献作为参考并入本文)。
在某些实施方式中，HDMC可以允许各个通道与受试者自身受损的脊髓束对齐和/或可以为受损组织失去的结构提供更好的生物模拟。(还参见Ige,O.O.,Umoru,L.E.,&Aribo,S.(2012).Natural Products:A Minefield of Biomaterials.ISRN MaterialsScience,2012,1–20.https://doi.org/10.5402/2012/983062，其作为参考并入本文)。头端轴突可以移动通过瘢痕组织以使损害分开并与尾端轴突再连接。然而，由于可能通过所形成的瘢痕组织的致密纤维蛋白原纤维，通过随机轴突迁移丢失病变的3D坐标，因此存在确切的轴突束与相同上侧残肢(rostral stump)重新连接的低概率。可以从轴突束重新连接获得的任何回复可能是由于通过长期物理疗法建立的中枢神经系统的天然可塑性所造成的(还参见Anderson,M.A.,O’Shea,T.M.,Burda,J.E.,Ao,Y.,Barlatey,S.L.,Bernstein,A.M.,…Sofroniew,M.V.(2018).Required growth facilitators propelaxon regeneration across complete spinal cord injury.Nature,561(7723),396–400.https://doi.org/10.1038/s41586-018-0467-6，其作为参考并入本文)。如果维持跨过受损组织的3D坐标，如可以通过本文所描述的HDMC方法所提供的，在某些实施方式中，考虑了可以重新建立确切的轴突喙端和尾端残肢束的能力，其可以在患者物理疗法期间提高受试者的运动恢复以及降低CNS可塑性的依赖。
在某些实施方式中，所述支架生物材料可以植入脊髓并且可以促进脊髓损伤后的修复或再生；可以在受试者中提供用于组织置换和/或用于组织再生的结构植入物；可以在受试者中提供用于皮肤移植和/或皮肤再生的结构植入物；可以提供用于靶组织或区域或受试者中的血管系统再生的结构植入物；可以在受试者中提供骨置换、骨填充或骨移植材料，和/或可以促进骨再生；可以在受试者中提供皮肤、骨、肌肉、神经、血管或者其它受损或畸形组织的组织置换；和/或可以提供用于整容外科的结构植入物。
在某些实施方式中，所述支架生物材料可以植入脊髓并且可以在中枢和/或周围神经系统中的急性和/或慢性脊髓损伤后促进修复和/或再生。
在一个实施方式中，本文提供了如本文所描述的任何支架生物材料和/或微通道束用于支持动物或植物细胞生长；促进组织再生；促进血管生成；脊髓损伤治疗和/或修复；植物或动物组织的修复或重建或置换；溶液或材料过滤和/或分离；植物修饰或生长调节；材料输送；模拟所期望的形状或对象的组装件；和/或微流体；或者其中生物相容的微米级通道可以是有用的任何适合的应用的使用。
在某些实施方式中，所述支架生物材料可以用于植物或动物组织的修复或重建或置换，其中所述植物或动物组织包括受损的微维管系统，或者通过维管疾病(如萎蔫病)破坏的植物组织或者昆虫(如白蜡树蛀虫)感染的树的受损的维管结构。
在某些实施方式中，所述支架生物材料可以用于植物或动物组织的修复或重建，其中所述植物或动物组织包含受损的微脉管系统，其中血管生成受损或被损坏。
在另一个实施方式中，所述支架生物材料可以用于动物组织的修复或重建，其中所述动物是人。
在另一个实施方式中，所述支架生物材料可以用于植物修饰或生长调节，其中所述修饰是用于加速生长的移植过程的修饰。
在另一个实施方式中，所述支架生物材料可以用于材料输送，其中所述材料输送是药物递送应用。
在另一个实施方式中，所述支架生物材料可以用于热传递或热交换微流体。
在另一个实施方式中，本文提供了用于支持细胞生长的方法，所述方法包括：
提供如本文所描述的支架生物材料；和
将一个或多个细胞引入至所述支架生物材料。
在另一个实施方式中，本文提供了用于促进组织再生；促进血管生成；脊髓损伤的治疗和/或修复；或者植物或动物组织的修复或重建或置换的方法，所述方法包括：
提供如本文所描述的支架生物材料；和
将所述支架生物材料植入对其有需要的位点。
在另一个实施方式中，本文提供了用于溶液或材料过滤和/或分离的方法，所述方法包括：
提供如本文所描述的支架生物材料；和
使溶液或材料流动通过所述支架生物材料，从而基于尺寸排阻从所述溶液过滤和/或分离组分。
在另一个实施方式中，本文提供了用于植物修饰或生长调节的方法，所述方法包括：
提供如本文所描述的支架生物材料；和
将所述支架生物材料移植到所述植物中以提供加速生长。
在某些实施方式中，可以通过手术，通过用支架生物材料识别和替换植物内受损或功能紊乱的维管结构进行移植。在某些实施方式中，这种修复可以防止损失植物的一个或多个远端部分。在某些实施方式中，可以用一种或多种植物生长因子使支架生物材料官能化以促进或加速生长。在某些实施方式中，移植可以引入来自预期宿主或者另一宿主的基因修饰的细胞。例如，这些细胞可以加速生长，或者赋予对某些植物疾病的耐受性。在某些实施方式中，可以包括植物R基因，并且例如，移植可以用于引入具有工程化R基因的细胞。
在另一个实施方式中，本文提供了用于材料输送的方法，所述方法包括：
提供如本文所描述的支架生物材料；和
使用所述支架生物材料将材料输送至对其有需要的位点。
在另一个实施方式中，所述材料可以是或者包含药物，并且所述支架生物材料可以用于药物递送。在某些实施方式中，所述支架生物材料可以加载药物，并且可以在特定位点向所述受试者施用。在某些实施方式中，所述支架生物材料可以提供药物随时间的受控缓释，因此例如，避免使受试者进行多次注射。
在某些实施方式中，据考虑如本文所描述的支架生物材料可以用于药物递送以在药物递送方案中提供局部化。已作为包封药物并且以控制方式随时间释放药物的方式研究了媒介物，如海藻酸盐珠。然而，由于包封材料可以漂移，因此这类递送系统对于将药物递送至对其有需要的特定位置可能有问题。在某些实施方式中，可以设计如本文所描述的支架生物材料以锚定药物包封系统，从而使其就位以使得可以将药物递送至预定靶标。如果需要，可以使用支架生物材料的除去以终止药物递送。在某些实施方式中，如本文所描述的支架生物材料可以用于锚定药物包封剂/媒介，或者本身直接可以起到药物包封剂/媒介的作用或两者。
在另一个实施方式中，本文提供了用于制备模拟所期望的形状或对象的结构的方法，所述方法包括：
提供如本文所描述的支架生物材料；
切割或布置所述支架生物材料以模拟所期望的形状或对象；和
任选地，将所述支架生物材料胶粘以用于结构加固。
在另一个实施方式中，本文提供了用于在微流体过程中交换或传递热的方法，所述方法包括：
提供如本文所描述的支架生物材料；和
使用所述微通道以携带一个或多个流体，其中所述一个或多个流体紧密邻近以允许热交换或热传递。
在某些实施方式中，可以通过在不同微通道中的逆流或并流来携带一个或多个流体或它们的组合。
据考虑在某些实施方式中，如本文所描述的HDMC束和/或支架生物材料可以用于多种应用，其可以包括(但不限于)以下中的任何一个或多个：脊髓损伤治疗；人、植物或动物组织的修复/重建(例如，受损的微脉管系统的修复/重建，特别是在其中血管生成以任何方式不可能或受损的情况下，和/或在血管病，如萎蔫病破坏的植物组织的修复中，和/或替换昆虫，如白蜡树蛀虫感染的树中受损的维管结构)；溶液/材料过滤和/或分离；植物改良/生长调节(例如，用于加速生长的移植方法的改良)；材料输送(例如，药物递送应用)；组装以模拟所期望的形状或对象；和/或微流体(例如，热传递/交换)；或者其中生物相容的微米级通道可以有用的任何其它适合的应用。
用于微通道分离和去细胞化的方法，以及用于制备支架生物材料的方法：
在本文中详细描述了用于微通道分离和去细胞化的方法，以及用于制备支架生物材料的方法。同样，在以下实施例部分中详细描述了这些方法的实验实施例。
可以适合于生产用于如本文所描述的支架生物材料的去细胞化微通道的去细胞化规程的其它实例可见于标题为“来自植物和真菌的去细胞化细胞壁结构及其作用支架材料的用途(Decellularised Cell Wall Structures from Plants and Fungus and UseThereof as Scaffold Materials)”的WO 2017/136950，该专利以其全部内容作为参考并入本文。
在一个实施方式中，本文提供了来自植物或真菌组织的微通道的分离和去细胞化的方法，所述方法包括：
从所述植物或真菌组织分离微通道；和
使所述微通道去细胞化；和
任选地，将所述微通道灭菌。
如将理解的，在某些实施方式中，通常在去细胞化之前，从植物或真菌组织分离所述微通道，然而还考虑在某些实施方式中，可以改变顺序，从而可以在从植物或真菌组织分离微通道之前进行去细胞化。
在某些实施方式中，可以在从植物或真菌组织分离微通道之前进行去细胞化。在某些实施方式中，这种方法可以受益于实施灌注方法以帮助去细胞化试剂渗透所述植物或真菌组织的全部相关区域。
在某些实施方式中，可以在分离通道前应用灌注方法以使植物或真菌组织去细胞化，并且所述灌注可以使用如本文已对于实施去细胞化所述的基本相同的溶液和试剂。可以为去细胞化溶液提供(使用针尖，例如)进入植物或真菌组织脉管系统的路径。据考虑这些方法对于特定组织(如芹菜)是特别关心的，其可以容易地吸引流体通过它们的脉管系统。在某些实施方式中，这些方法可以用于主要或仅使植物或真菌组织的微通道结构去细胞化。举例来说，在某些实施方式中，例如，基于使用多个流体注入位点等，灌注可以用于靶向去细胞化(相对快速)或者总体去细胞化(更长时间)。
在上述方法的另一个实施方式中，分离微通道的步骤可以包括微通道或含有微通道的维管束或两者从周围植物或真菌组织的机械分离。在另一个实施方式中，可以通过温和剥离或者通过切割实施分离步骤。
在某些实施方式中，来自植物或真菌组织的一种或多种结构，如微通道的分离可以包括一个或多个手动步骤，可以实施所述手动步骤以从周围植物或真菌组织提取或分离所关心的一种或多种结构。这些手动步骤可以包括切割、切片、剥离和/或其它物理分离技术。如将理解的，对于大规模操作，这些手动步骤可以变得繁重。如本文所描述的，例如，本发明人因此开发了可以不太繁重和/或易于适合放大的提取技术。因此，在某些实施方式中，分离步骤可以包括液基提取以从植物或真菌组织分离一种或多种结构。
如将理解的，液基提取可以包括使用液体提取溶液，从植物或真菌组织(它可以是天然植物组织或真菌组织，或者去细胞化植物组织或真菌组织，或它们的组合)处理和提取一种或多种结构的任何适合的方法。在一些情况下，可以在液基提取之前处理所述植物组织或真菌组织，如通过使用适合的设备，如手术刀或曼陀林切片机(mandoline)切成小块或条。
本领域技术人员将理解作为使用液体溶液从天然植物组织或真菌组织或者去细胞化植物组织或真菌组织化学处理和提取维管束(VB)和/或微通道的方法的液基提取。可以将液基提取理解为天然或去细胞化植物或真菌组织的浸渍以获得完整亚结构，如微通道。液基提取可以导致单个微通道或者微通道束的分离。如果使用天然植物或真菌组织，基于液体的提取条件可以导致天然组织的部分或完全去细胞化。在此情况下，可以用本文所讨论的任何去细胞化方法进一步处理所述组织。
在本文所述的实施方式中，所述液体溶液可以是分别用于酸提取、酸和过氧化物提取、盐提取或碱提取的酸溶液、酸和过氧化物溶液、盐溶液或者碱溶液。在一些情况下，可以同时或顺序使用不止一种处理或溶液。
所述一种或多种溶液可以与植物或真菌组织组合并加热至所期望的温度，如沸腾。在一些情况下，将溶液加热或煮沸一段时间，如0.1-30分钟。还考虑了长于30分钟的时间段，如达一小时或以上。考虑了该范围内的任何时间量或者它们之间的任何值(任选地凑整至最近的0.1)或者覆盖这些值中任意两个之间的任何子范围。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，酸提取可以包括在包含酸的酸溶液中混合植物或真菌组织。然后加热植物或真菌组织和酸溶液的混合物。如将理解的，酸溶液可以包括能够渗透性冲击植物/真菌组织，降解外部植物/真菌组织结构、破坏植物/真菌组织内的氢键和/或破坏植物/真菌聚合物晶体结构以提取组织组分，如VB和/或微通道的一般任何适合的酸。适合的酸的实例包括(但不限于)乙酸、硼酸、碳酸、盐酸、柠檬酸、氢氟酸、硝酸、草酸、磷酸、硫酸、三氟化硼、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸等。考虑了其它类别的酸，如羧酸，其包括(但不限于)直链饱和二羧酸、支链二羧酸、不饱和二羧酸、取代的二羧酸和芳族二羧酸。所述酸可以在适合的溶剂中溶解/混合以形成酸溶液。通常，所述溶剂可以包括水，尽管还考虑了其它溶剂或溶剂组合，如(但不限于)丙醇、乙醇、甲醇、氨、乙酸、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲亚砜和两亲性溶剂或胶体。举例来说，在某些实施方式中，所述酸溶液可以包括50％乙酸的水溶液。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，酸和过氧化物提取可以包括在包含酸和过氧化物的酸和过氧化物溶液中混合植物或真菌组织。然后加热植物或真菌组织和酸和过氧化物溶液的混合物。如将理解的，酸/过氧化物溶液可以包括能够渗透性冲击植物/真菌组织，降解外部植物/真菌组织结构、破坏植物/真菌组织内的氢键和/或破坏植物/真菌聚合物晶体结构以提取组织组分，如VB和/或微通道的一般任何适合的酸和过氧化物。适合的酸的实例包括(但不限于)乙酸、硼酸、碳酸、盐酸、柠檬酸、氢氟酸、硝酸、草酸、磷酸、硫酸、三氟化硼、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸等。考虑了其它类别的酸，如羧酸，其包括(但不限于)直链饱和二羧酸、支链二羧酸、不饱和二羧酸、取代的二羧酸和芳族二羧酸。适合的过氧化物的实例包括(但不限于)过氧化氢、过氧化锂、过氧化钡、过氧化二苯酰、过氧化苯甲酰、丁酮过氧化物。当与酸混合时，过氧化物可以形成过氧酸，如过乙酸。酸和过氧化物溶液可以包含5:1至1:5，如3:1(13.05M乙酸和2.45M过氧化氢)至1:3(含有4.35M乙酸和7.35M过氧化氢)的比值的冰醋酸和30％过氧化氢。所述酸和过氧化物可以在适合的溶剂中溶解/混合以形成酸和过氧化物溶液。通常，所述溶剂可以包括水，尽管还考虑了其它溶剂或溶剂组合，如(但不限于)丙醇、乙醇、甲醇、氨、乙酸、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲亚砜和两亲性溶剂或胶体。举例来说，在某些实施方式中，所述酸/过氧化物溶液可以包含1:1的冰乙酸：30％的过氧化氢(v/v)的水溶液。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，盐提取可以包括在盐溶液中混合植物或真菌组织。然后加热植物或真菌组织和盐溶液的混合物。如将理解的，盐溶液可以包括能够渗透性冲击植物/真菌组织，降解外部植物/真菌组织结构、破坏植物/真菌组织内的氢键和/或破坏植物/真菌聚合物晶体结构以提取组织组分，如VB和/或微通道的一般任何适合的盐。适合的盐的实例可以是一价的，如LiCl和NaCl；二价的，如MgSO4和CaCl2；三价，如AlCl3等。适合的阳离子包括(但不限于)：锂、钠、钾、镁、钙、铁、铜、锌、铝和铵。适合的阴离子包括(但不限于)：氯化物、溴化物、乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、氟化物、硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐、碘化物和硼酸盐。还考虑了药物盐，如异丁苯丙酸盐(ibuprofenate)。适合的盐的选择还可以基于所期望的性质，如离子活度、筛选、配位尺寸、德拜长度或所关心的离子强度。所述盐溶液可以具有适合的盐浓度，如约0.5M-10M或者它们之间的任何值(任选地凑整至最近的0.1)，或者覆盖这些值中任意两个的任何子范围。所述盐可以在适合的溶剂中溶解/混合以形成盐溶液。通常，所述溶剂可以包括水，尽管还考虑了其它溶剂或溶剂组合，如(但不限于)丙醇、乙醇、甲醇、氨、乙酸、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲亚砜和两亲性溶剂或胶体。举例来说，在某些实施方式中，所述盐溶液可以包含盐浓度约0.5M-3M的NaCl或LiCl的水溶液。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，碱提取可以包括在碱溶液中混合植物或真菌组织。在一些情况下，加热植物或真菌组织和碱性溶液的混合物。如将理解的，碱溶液可以包括能够渗透性冲击植物/真菌组织，降解外部植物组织结构、破坏植物/真菌组织内的氢键和/或破坏植物/真菌聚合物晶体结构以提取组织组分，如VB和/或微通道的一般任何适合的碱。适合的碱的实例包括(但不限于)氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)、碳酸盐、硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐、氨、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化锂、氢氧化锌、碳酸钠、碳酸氢钠、丁基锂、叠氮化钠、氨基钠、氢化钠、硼氢化钠和二异丙基氨基锂。所述碱溶液可以具有适合的碱浓度，如约0.5-10M或者它们之间的任何值(任选地凑整至最近的0.1)，或者覆盖这些值中任意两个的任何子范围。所述碱可以在适合的溶剂中溶解/混合以形成碱溶液。通常，所述溶剂可以包括水，尽管还考虑了其它溶剂或溶剂组合，如(但不限于)丙醇、乙醇、甲醇、氨、乙酸、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲亚砜和两亲性溶剂或胶体。举例来说，在某些实施方式中，所述碱溶液可以包含碱浓度约0.5M-1M的NaOH的水溶液。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，液基提取还可以包括将植物或真菌组织在碱溶液中机械搅动，例如，搅拌。可以使用搅拌棒或者其它适合的方法，如机械或磁力搅拌器搅拌溶液。
可以调节对于基于液体的提取的方法以产生具有所期望的形态和/或最终产率强度的VB和/或微通道。还可以调节所述方法以从所期望的植物或真菌分离VB和/或微通道。例如，更长的加热或煮沸时间可以导致产生软化的微通道和/或VB，参见，表1-8。软化的VB和/或微通道对于其中期望挠性微通道的应用可以是所期望的。调节分离的微通道和/或VB的机械性质可以导致引导细胞生长和细胞分化和控制所产生的工程化组织的机械性质。硬化的VB和/或微通道可以对于其中需要强度的应用，例如，作为细胞生长的结构是所期望的。考虑了煮沸时间较短的更高浓度的酸、碱、盐(如大于10M)和酸/过氧化物(如高于5:1-1:5)。
在另一个实施方式中，本文提供了用于制备支架生物材料的方法，所述方法包括：
从植物或真菌组织分离微通道；
使所述微通道去细胞化；
将所述微通道束在一起，所述微通道彼此基本平行布置；
借此提供包含成束的微通道的支架生物材料。
如将理解的，在某些实施方式中，通常在去细胞化之前，从植物或真菌组织分离所述微通道，然而还考虑在某些实施方式中，可以改变顺序，从而可以在从植物或真菌组织分离微通道之前进行去细胞化。
在上述方法的某些实施方式中，分离微通道的步骤可以包括微通道或含有微通道的维管束或两者从周围植物或真菌组织的机械分离。在某些实施方式中，可以通过温和剥离或者通过切割实施分离步骤。
在某些实施方式中，来自植物或真菌组织的一种或多种结构，如微通道的分离可以包括一个或多个手动步骤，可以实施所述手动步骤以从周围植物或真菌组织提取或分离所关心的一种或多种结构。这些手动步骤可以包括切割、切片、剥离和/或其它物理分离技术。如将理解的，对于大规模操作，这些手动步骤可以变得繁重。如本文所描述的，例如，本发明人因此开发了可以不太繁重和/或易于适合放大的提取技术。因此，在某些实施方式中，分离步骤可以包括液基提取以从植物或真菌组织分离一种或多种结构。
如将理解的，液基提取可以包括使用液体提取溶液，从植物或真菌组织(它可以是天然植物组织或真菌组织，或者去细胞化植物组织或真菌组织，或它们的组合)处理和提取一种或多种结构的任何适合的方法。在一些情况下，可以在液基提取之前处理所述植物组织或真菌组织，如通过使用适合的设备，如手术刀或曼陀林切片机(mandoline)切成小块或条。
本领域技术人员将理解作为使用液体溶液从天然植物组织或真菌组织或者去细胞化植物组织或真菌组织化学处理和提取维管束(VB)和/或微通道的方法的液基提取。可以将液基提取理解为天然或去细胞化植物或真菌组织的浸渍以获得完整亚结构，如微通道。液基提取可以导致单个微通道或者微通道束的分离。如果使用天然植物或真菌组织，基于液体的提取条件可以导致天然组织的部分或完全去细胞化。在此情况下，可以用本文所讨论的任何去细胞化方法进一步处理所述组织。
在本文所述的实施方式中，所述液体溶液可以是分别用于酸提取、酸和过氧化物提取、盐提取或碱提取的酸溶液、酸和过氧化物溶液、盐溶液或者碱溶液。在一些情况下，可以同时或顺序使用不止一种处理或溶液。
所述一种或多种溶液可以与植物或真菌组织组合并加热至所期望的温度，如沸腾。在一些情况下，将溶液加热或煮沸一段时间，如0.1-30分钟。还考虑了长于30分钟的时间段，如达一小时或以上。考虑了该范围内的任何时间量或者它们之间的任何值(任选地凑整至最近的0.1)或者覆盖这些值中任意两个之间的任何子范围。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，酸提取可以包括在包含酸的酸溶液中混合植物或真菌组织。然后加热植物或真菌组织和酸溶液的混合物。如将理解的，酸溶液可以包括能够渗透性冲击植物/真菌组织，降解外部植物/真菌组织结构、破坏植物/真菌组织内的氢键和/或破坏植物/真菌聚合物晶体结构以提取组织组分，如VB和/或微通道的一般任何适合的酸。适合的酸的实例包括(但不限于)乙酸、硼酸、碳酸、盐酸、柠檬酸、氢氟酸、硝酸、草酸、磷酸、硫酸、三氟化硼、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸等。考虑了其它类别的酸，如羧酸，其包括(但不限于)直链饱和二羧酸、支链二羧酸、不饱和二羧酸、取代的二羧酸和芳族二羧酸。所述酸可以在适合的溶剂中溶解/混合以形成酸溶液。通常，所述溶剂可以包括水，尽管还考虑了其它溶剂或溶剂组合，如(但不限于)丙醇、乙醇、甲醇、氨、乙酸、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲亚砜和两亲性溶剂或胶体。举例来说，在某些实施方式中，所述酸溶液可以包括50％乙酸的水溶液。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，酸和过氧化物提取可以包括在包含酸和过氧化物的酸和过氧化物溶液中混合植物或真菌组织。然后加热植物或真菌组织和酸和过氧化物溶液的混合物。如将理解的，酸/过氧化物溶液可以包括能够渗透性冲击植物/真菌组织，降解外部植物/真菌组织结构、破坏植物/真菌组织内的氢键和/或破坏植物/真菌聚合物晶体结构以提取组织组分，如VB和/或微通道的一般任何适合的酸和过氧化物。适合的酸的实例包括(但不限于)乙酸、硼酸、碳酸、盐酸、柠檬酸、氢氟酸、硝酸、草酸、磷酸、硫酸、三氟化硼、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸等。考虑了其它类别的酸，如羧酸，其包括(但不限于)直链饱和二羧酸、支链二羧酸、不饱和二羧酸、取代的二羧酸和芳族二羧酸。适合的过氧化物的实例包括(但不限于)过氧化氢、过氧化锂、过氧化钡、过氧化二苯酰、过氧化苯甲酰、丁酮过氧化物。当与酸混合时，过氧化物可以形成过氧酸，如过乙酸。酸和过氧化物溶液可以包含5:1至1:5，如3:1(13.05M乙酸和2.45M过氧化氢)至1:3(含有4.35M乙酸和7.35M过氧化氢)的比值的冰醋酸和30％过氧化氢。所述酸和过氧化物可以在适合的溶剂中溶解/混合以形成酸和过氧化物溶液。通常，所述溶剂可以包括水，尽管还考虑了其它溶剂或溶剂组合，如(但不限于)丙醇、乙醇、甲醇、氨、乙酸、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲亚砜和两亲性溶剂或胶体。举例来说，在某些实施方式中，所述酸/过氧化物溶液可以包含1:1的冰乙酸：30％的过氧化氢(v/v)的水溶液。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，盐提取可以包括在盐溶液中混合植物或真菌组织。然后加热植物或真菌组织和盐溶液的混合物。如将理解的，盐溶液可以包括能够渗透性冲击植物/真菌组织，降解外部植物/真菌组织结构、破坏植物/真菌组织内的氢键和/或破坏植物/真菌聚合物晶体结构以提取组织组分，如VB和/或微通道的一般任何适合的盐。适合的盐的实例可以是一价的，如LiCl和NaCl；二价的，如MgSO4和CaCl2；三价，如AlCl3等。适合的阳离子包括(但不限于)：锂、钠、钾、镁、钙、铁、铜、锌、铝和铵。适合的阴离子包括(但不限于)：氯化物、溴化物、乙酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、氟化物、硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐、碘化物和硼酸盐。还考虑了药物盐，如异丁苯丙酸盐(ibuprofenate)。适合的盐的选择还可以基于所期望的性质，如离子活度、筛选、配位尺寸、德拜长度或所关心的离子强度。所述盐溶液可以具有适合的盐浓度，如约0.5M-10M或者它们之间的任何值(任选地凑整至最近的0.1)，或者覆盖这些值中任意两个的任何子范围。所述盐可以在适合的溶剂中溶解/混合以形成盐溶液。通常，所述溶剂可以包括水，尽管还考虑了其它溶剂或溶剂组合，如(但不限于)丙醇、乙醇、甲醇、氨、乙酸、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲亚砜和两亲性溶剂或胶体。举例来说，在某些实施方式中，所述盐溶液可以包含盐浓度约0.5M-3M的NaCl或LiCl的水溶液。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，碱提取可以包括在碱溶液中混合植物或真菌组织。在一些情况下，加热植物或真菌组织和碱性溶液的混合物。如将理解的，碱溶液可以包括能够渗透性冲击植物/真菌组织，降解外部植物组织结构、破坏植物/真菌组织内的氢键和/或破坏植物/真菌聚合物晶体结构以提取组织组分，如VB和/或微通道的一般任何适合的碱。适合的碱的实例包括(但不限于)氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)、碳酸盐、硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐、氨、氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化锂、氢氧化锌、碳酸钠、碳酸氢钠、丁基锂、叠氮化钠、氨基钠、氢化钠、硼氢化钠和二异丙基氨基锂。所述碱溶液可以具有适合的碱浓度，如约0.5-10M或者它们之间的任何值(任选地凑整至最近的0.1)，或者覆盖这些值中任意两个的任何子范围。所述碱可以在适合的溶剂中溶解/混合以形成碱溶液。通常，所述溶剂可以包括水，尽管还考虑了其它溶剂或溶剂组合，如(但不限于)丙醇、乙醇、甲醇、氨、乙酸、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲亚砜和两亲性溶剂或胶体。举例来说，在某些实施方式中，所述碱溶液可以包含碱浓度约0.5M-1M的NaOH的水溶液。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，液基提取还可以包括将植物或真菌组织在碱溶液中机械搅动，例如，搅拌。可以使用搅拌棒或者其它适合的方法，如机械或磁力搅拌器搅拌溶液。
可以调节对于基于液体的提取的方法以产生具有所期望的形态和/或最终产率强度的VB和/或微通道。还可以调节所述方法以从所期望的植物或真菌分离VB和/或微通道。例如，更长的加热或煮沸时间可以导致产生软化的微通道和/或VB，参见，表1-8。软化的VB和/或微通道对于其中期望挠性微通道的应用可以是所期望的。调节分离的微通道和/或VB的机械性质可以导致引导细胞生长和细胞分化和控制所产生的工程化组织的机械性质。硬化的VB和/或微通道可以对于其中需要强度的应用，例如，作为细胞生长的结构是所期望的。考虑了煮沸时间较短的更高浓度的酸、碱、盐(如大于10M)和酸/过氧化物(如高于5:1-1:5)。
在某些实施方式中，液基提取可以导致基本灭菌(同时灭菌)。在其它情况下，在使用任何本文所描述的灭菌方法之后，对分离的微通道和/或VB灭菌。
在某些实施方式中，HDMC束可以由得自植物的多种维管束(包括木质部和韧皮部通道)形成。在某些实施方式中，可以进一步处理维管束以分离各个木质部和/或韧皮部通道，然后其可以用于形成HDMC束，其可以具有甚至更高的密度。如将理解的，可以通过除去微通道周围更多的非维管植物组织来实现更高的密度。非维管组织通常可以表示软细胞组织和厚壁组织。在某些实施方式中，据考虑还可以通过(例如)壁厚较薄或截面积较小的微通道的选择(其可以是植物种-依赖的，并且可以通过所考虑的期望的应用进行选择，从而尺寸不小于要容纳的细胞，例如)和/或(例如)通过对模制/胶粘步骤改良(通常大尺度，机械考虑)减少在通道间空间所使用的胶水来提高通道密度。
在任何上述方法的某些实施方式中，成束的步骤可以包含将所述微通道胶粘在一起。在某些实施方式中，可以通过生物相容性，任选地生物可降解的胶水将所述微通道胶粘可以一起。在某些实施方式中，所述生物相容性的胶水可以包含PEG基、聚氨脂基、明胶基或者纤维蛋白基胶水。在某些实施方式中，所述生物相容性的胶水可以包含纤维蛋白基胶水。
在任何上述方法的某些实施方式中，成束的步骤可以包含微通道的模制。在某些实施方式中，可以使用其中压紧了所述微通道的模具来进行模制。在某些实施方式中，所述模制可以包括生物医学级硅酮。在某些实施方式中，所述模制可以包括聚丙烯塑料制品或者特氟隆或者另一种不粘材料或涂层。在某些实施方式中，所述模制可以：包括胶水不粘着或仅微弱粘着的不粘材料；是生物相容的；可以是一次性的；可以是耐高压灭菌的；可以是可模制或一定程度上柔软的；或其任意组合。在某些实施方式中，所述模制可以包含其中用于容纳所述微通道的通道，所述通道具有将要向其中模制的微通道赋予的横截面尺寸。在某些实施方式中，可以将所述模具分成两个或更多个部分，其可以围绕所述微通道组装以用于模制。在某些实施方式中，可以将胶水添加至面向所述微通道的模具表面，并且可以将所述微通道在所述模具中压紧并在其中保持，同时胶水固化。在某些实施方式中，所述模具可以包含第一部分和第二部分，并且所述模制可以包括向面向所述微通道的第一部分表面和面向所述微通道的第二部分表面添加胶水；将所述微通道放置在所述第一部分和所述第二部分中，与胶水接触(所述微通道可以在所述第一和第二部分之间划分)；向所述第一部分中的微通道的暴露表面、所述第二部分中的微通道的暴露表面或两者添加胶水；相对于所述第一部分，在与所述第一部分有关的微通道的暴露表面上，安装具有相关微通道的所述第二部分，借此组装所述模具；使胶水基本固化；并除去所述模具。
在任何上述方法的某些实施方式中，成束步骤可以包括在不使用胶水的情况下，使微通道和/或VB物理结合或物理交联。该过程可以被称为微通道的缠结。可以使微通道物理打结或另外缠结，从而微通道和/或VB的分离需要使用力。不同尺寸和使用不同长度(Kuhn片段或持续长度)可以造成不同的缠结和对齐轮廓。可以通过搅拌装置，如棒的搅拌发生缠结。缠结可以发生在基于液体的提取期间。
在任何上述方法的某些实施方式中，所述方法还可以包括将所述成束的微通道切割成所期望的长度的步骤。在某些实施方式中，可以在除去模具前将所述成束的微通道切割成所期望的长度的步骤。
在任何上述方法的另一个实施方式中，所述方法还可以包括使微通道灭菌的步骤。在另一个实施方式中，所述灭菌步骤可以包括将所述微通道暴露于乙醇，或者乙醇和水的混合物。
在任何上述方法的某些实施方式中，所述微通道可以包括木质部和/或韧皮部通道。
在任何上述方法的另一个实施方式中，所述去细胞化微通道可以是纤维素基、几丁质基、木质素基、半纤维素基或者果胶基的，或它们的任意组合。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述束内的去细胞化微通道密度可以大于植物或真菌组织内的微通道密度。
在任何上述一种或多种方法的另一个实施方式中，所述植物或真菌组织可以包括来自苹果隐头花序(Malus pumila)组织、蕨(Monilophytes)组织、萝卜(Brassica rapa)根组织、银杏分枝组织、马尾草(equisetum)组织、萱草(hermocallis)杂交叶组织、羽衣甘蓝(Brassica oleracea)茎组织、针叶树花旗松(Pseudotsuga menziesii)组织、仙人掌果(pitaya)肉组织、斑状长春花(Maculata Vinca)组织、水生莲花(Nelumbo nucifera)组织、郁金香(Tulipa gesneriana)花瓣组织、车前草(Musa paradisiaca)组织、西兰花(Brassica oleracea)茎组织、枫叶(Acer psuedoplatanus)茎组织、甜菜(Beta vulgaris)初生根组织、葱(Allium cepa)组织、兰科(Orchidaceae)组织、萝卜(Brassica rapa)茎组织、韭葱(Allium ampeloprasum)组织、枫树(Acer)树枝组织、芹菜(Apium graveolens)组织、葱(Allium cepa)茎组织、松树组织、芦荟组织、西瓜(Citrullus lanatusvar.lanatus)组织、草甸排草(Lysimachia nummularia)组织、仙人掌(cactae)组织、北极剪秋罗(Lychnis Alpina)组织、大黄(Rheum rhabarbarum)组织、南瓜果肉(Cucurbitapepo)组织、龙血树(Asparagaceae)茎组织、紫露草(Tradescantia virginiana)茎组织、芦笋(Asparagus officinalis)茎组织、蘑菇(Fungi)组织、茴香(Foeniculum vulgare)组织、玫瑰(Rosa)组织、胡萝卜(Daucus carota)组织或梨(Pomaceous)组织的含有微通道的组织或者通过直接基因组修饰或者通过选择育种产生的遗传改变的组织，或它们的任意组合。在另一个实施方式中，植物或真菌组织可以包括芹菜、芦笋或两者。在标题为“来自植物和真菌的去细胞化细胞壁结构及其作用支架材料的用途(Decellularised Cell WallStructures from Plants and Fungus and Use Thereof as Scaffold Materials)”的WO2017/136950的实施例18中描述了植物和真菌组织的其它实例，该专利以其全部内容作为参考并入本文。
可以适合于生产用于如本文所描述的支架生物材料的去细胞化微通道的去细胞化规程的实例可见于标题为“来自植物和真菌的去细胞化细胞壁结构及其作用支架材料的用途(Decellularised Cell Wall Structures from Plants and Fungus and UseThereof as Scaffold Materials)”的WO 2017/136950，该专利以其全部内容作为参考并入本文。
多种方法可以用于去细胞化。举例来说，在某些实施方式中，去细胞化可以包括通过热冲击去细胞化，用去污剂(例如，SDS、Triton X、EDA、碱处理、酸、离子型去污剂、非离子型去污剂和两性离子去污剂)处理、渗透性冲击、冻干、物理溶胞(例如，流体压力)、电学破裂(例如，非热不可逆电穿孔)或者酶促消化或其任意组合。在某些实施方式中，去细胞化方法可以包括任何一些方法，其(单独或组合)包括(但不限于)热冲击(例如，快速冷冻融化)、化学处理(例如，去污剂)、渗透性冲击(例如，蒸馏水)、冻干、物理溶胞(例如，加压处理)、电学破裂和/或酶促消化。
在某些实施方式中，去细胞化可以包括用去污剂或表面活性剂处理。去污剂的实例可以包括(但不限于)十二烷基硫酸钠(SDS)、Triton X、EDA、碱处理、酸、离子型去污剂、非离子型去污剂和两性离子去污剂。
在其它实施方式中，去细胞化微通道可以包括已通过用SDS处理去细胞化的微通道。在另一个实施方式中，可以通过用二价盐水溶液清洗从微通道除去残余的SDS。二价盐水溶液可以用于使含有SDS胶束的盐残余物从溶液/支架中沉淀/崩解，并且dH2O、乙酸或二甲亚砜(DMSO)处理或超声处理可以用于除去盐残余物或SDS胶束。在某些实施方式中，二价盐水溶液的二价盐可以包括(例如)MgCl2或CaCl2。
在另一个实施方式中，可以通过用0.01至10％，例如约0.1％至约1％，或者例如，约0.1％SDS或约1％SDS的SDS在溶剂，如水、乙醇或另一种适合的有机溶剂中的溶液处理使微通道去细胞化，并且可以使用浓度约100mM的CaCl2水溶液除去残余SDS，然后在dH2O中培育。在某些实施方式中，SDS溶液可以处于高于0.1％的浓度，其可以帮助去细胞化，并且可以伴随着增加清洗以除去残余SDS。在具体的实施方式中，可以通过用约0.1％SDS的SDS水溶液处理对微通道去细胞化，并且可以使用约100mM浓度的CaCl2水溶液除去残余SDS，然后在dH2O中培育。
在另一个实施方式中，任何上述一种或多种方法还可以包括将活的植物或动物细胞引入微通道的步骤。在另一个实施方式中，任何上述一种或多种方法还可以包括将活的植物或动物细胞在支架生物材料上和/或中培养的步骤。在一个实施方式中，所述活细胞可以包括哺乳动物细胞，如人细胞。
在某些实施方式中，可以用对于所关心的具体细胞类型所选的特异性生长因子官能化微通道和/或支架生物材料。在某些实施方式中，例如，官能化可以包括提供粘合至支架的生长因子。
在某些实施方式中，具体地对于脊髓损伤应用，据考虑可以将患者-来源的神经祖细胞添加至如本文所描述的支架以促进修复和/或恢复。
在另一个实施方式中，本文提供了通过任何上述一种或多种方法产生的去细胞化微通道。
在另一个实施方式中，本文提供了通过任何上述一种或多种方法产生的支架生物材料。
在另一个实施方式中，本文提供了试剂盒，其包含以下中的任一个、两个、三个或更多个：
模具；
胶水；
一个或多个微通道；
一种或多种去细胞化试剂；
手术刀或切片机；
无菌测量装置；
无菌盐水；
镊子；和/或
用于实施如本文所描述的任何方法的说明书。
在以下所描述的实施例中，将AS和CL植物组织来源鉴别为提供特别期望的特性。如良好鉴定和很好表现的，CL提供了益处，如与AS相比，易于维管束提取和每个维管束更多数目的木质部通道。然而，将理解可以使用多种多样的其它植物来源组织。在以下实施例中，将由生物医学级硅酮制成的定制模具用于压紧/致密化和胶粘维管束。将理解还考虑了多种其它模具材料，并且通常可以使用任何适合的材料，其将基本不会粘合至胶水/密封剂和/或HDMC束，并且其可以是适当生物相容的或另外与要生产的HDMC束相容。
实施例1-高密度微通道(HDMC)的制备及其生物相容性分析
本文描述了用于对任何适合的植物的各个维管束或脉管组织进行分离和去细胞化的方法，所述方法同时旨在避免或最大程度减少处理残余物或污染物的引入。研究了通过多种胶水和密封剂(包括天然-来源和/或合成胶水)的这些脉管通道或组织的成束/致密化。描述了定制模具技术的产生，其提供了以3D布置，同时基本上不造成破坏或引入杂质的维管束(或者一般地任何植物微通道结构)的胶粘。
在本发明的研究中，使用存在于植物维管束(即木质部和韧皮部通道)中的输送结构来制备用于多种应用的高密度微通道(HDMC)束。在植物中，木质部和韧皮部通道主要分别输送水和糖，并且在物理上和组成上不同于植物中的周围组织。它们可以视为长相邻管状结构，并且与植物中的其它结构相比，它们的壁通常具有相对高的木质素含量。木质素可以为这些结构赋予结构刚度，并且如本文所描述的，这种刚度可以帮助这些通道从周围非维管基本组织(机械)分离。
如将理解的，维管束的化学组成和结构布置可以是不同的，并且可以高度依赖于具体的植物种。在这些研究中，将芦笋-来源(AS)和芹菜-来源(CL)的来源材料鉴别为(例如)为作为某些细胞类型的生长和再生的引导载体基质的它们的去细胞化维管束的应用提供良好的结构特征。如将理解的，可以对于所产生的HDMC的具体预期应用调节植物来源的选择。
在这些研究中，将芦笋(科：天门冬科)和芹菜(科：伞形科)选择作为来源植物材料。据发现这些植物对HDMC制造具有某些有利特征，其可以包括以下：由于脉管组织和基本组织之间的结构碳水化合物组成差异，可以从周围基本组织(即非脉管组织)分离维管束；木质部通道直径足够大以容纳多种细胞类型和结构(包括神经元的体细胞，例如)；和维管束内木质部和韧皮部通道的相对高密度。
图1显示了分离的AS维管束，约3cm长(左图)，和AS维管束的微观横截面视图，其中木质部通道的轮廓相对于背景清楚看见(右图)。图2显示了分离的CL维管束，其具有5-10cm的不同长度(左图)，和CL维管束的微观横截面视图，其中木质部通道的轮廓相对于基本组织背景清楚看见(右图)。
如本文详细描述的，可以将分离的维管结构，如植物维管束胶粘在一起，从而基于所选择和使用的材料，产生可控(或任意)直径的束，其中可控(或任意)长度通常在上端仅受限于用于制备HDMC的分离的各个结构的长度(除非实施两种或更多种结构的连续纵向融合或连接以获得更长的长度)。在某些实施方式中，可以将HDMC束在一起或者切割并重组为一般地任何所期望的形状和/或长度。通常，将HDMC切割成适合于所期望的应用的所期望的长度。
对于它们的生物相容性、它们的结构完整性和它们的方向性，认为植物维管结构，包括木质纤维素是独特的。如本文所描述的，在本文中认为可以将这些特性赋予HDMC并且对于一些不同应用可以利用这些特性，所述应用包括(但不限于)胞外基质的修复和置换，即使其中起作用可能高度依赖于它们的方向性(例如，在脊髓的胞外基质中)。在其中使用胶水制备HDMC的实施方式中，据考虑胶水通常可以是生物相容的并且(任选地，但是优选地)是生物可降解的，以(例如)在它们的宿主或物理载体内主要留下处于它们所期望的取向和位置的维管植物结构。
在本实施例中所描述的研究中，从AS和CL制备HDMC，并且测定了它们的生物相容性。
HDMC的制备方法：
首先，分别通过手术刀刀片或者通过温和剥离从AS或CL茎分离维管束。解剖显微镜可以用于辅助显象，但是对于受过训练的眼睛，这是不必需的。AS和CL两者中的维管束在目视上与周围基本组织是可区分的。如果需要，可以通过将茎在带颜色的水中，在4℃保留过夜来进一步提高对比度，从而使得维管束吸收带颜色的水。在任何情况下，可以通过手术刀刀片除去围绕分离的维管束的过量基本组织。以这种方式，实现了未受损伤的各个维管束的成功分离。
然后，可以任选地将分离的维管束切成指定长度(通过手术刀或切片机刀片，例如)。还可以通过数字卡尺记录维管束厚度，小心不要在卡尺臂之间挤压通道。
然后，基于标题为“来自植物和真菌的去细胞化细胞壁结构及其作用支架材料的用途(Decellularised Cell Wall Structures from Plants and Fungus and UseThereof as Scaffold Materials)”的WO 2017/136950中详细描述的去细胞化规程(该专利以其全部内容作为参考并入本文)，使用十二烷基硫酸钠，在9-天处理中使维管束去细胞化。然后，通过在70％乙醇中浸没使去细胞化的束灭菌，并在4℃，在无菌DPBS中保存直至使用。
将分离的维管束成束在一起以提供高密度微通道(HDMC)。在本研究中，使用定制模具和胶粘实现了分离的维管束的成束。所述定制模具由生物医学级硅酮制成，据发现硅酮未粘合至在这些研究中用于将维管束胶粘在一起的纤维蛋白胶水。在硅酮模具开发前，还成功使用了由吸管制成的模具。吸管材料是食品级的，并且这些细管通常具有与大鼠脊髓直径相当的小内径，并因此还可以适合于某些应用。然而，塑料和硅酮细管作为模具不如生物医学级硅酮模具有效，因为胶水粘合至塑料细管，并且硅酮细管由于它们的柔软性而更难以操作。
图3显示了在这些研究中用于维管束压紧的定制生物医学级硅酮模具(5-mm内径，1-cm长)(左图)。将模具半部分挤压在一起，并且右图显示了含有胶粘的CL维管束的模具的2mm-厚切片。
在层流净化罩下实施成束方法以使得污染物进入胶粘的束中的概率最小。通过高压灭菌的镊子进行所有处理。首先，按照生产商的说明(TISSEEL试剂盒；BaxterHealthcare,产品目录号no.1503152；文档ID 0716820)，制备了纤维蛋白胶水试剂盒及其双-注射器应用系统。然后，将胶粘在一起的各个通道(维管束)摆放在无菌平台区域中。使通道保持潮湿以避免内部木质部和韧皮部干燥和挤毁。最终，将硅酮模具半部分在第二无菌平台区域中排列并使用镊子压紧维管束。压紧密度取决于硅酮模具的内径以及选择使用的分离的植物维管束的平均厚度。
图4显示了胶水固化步骤期间的AS通道束，其中模具半部分被挤压在一起，并且图5显示了胶水固化步骤期间的CL通道束，其中将模具半部分挤压在一起。
一旦压紧在模具半部分中，除去通道，而不是分离通道。将2至3滴胶水快速沉积在每个模具半部分的内部通道中，并且立即将压紧的通道放回模具。然后，将2至3滴胶水沉积在压紧的通道顶部，并且通过用镊子操作将模具半部分挤压在一起。然后，使模具保持不被扰动约15min以使胶水固化。适当选择使通道成功成束的胶水的量，因为过少的胶水可能导致通道在模具除去步骤期间分开，而过多的胶水可能导致大量过量的胶水“球”粘合在束的外部。另外，显示初始胶水沉积位置有助于在成束期间提供均一的胶粘/粘合。
在这些研究中，谨慎选择胶水。期望胶水是生物相容的、生物可降解的，能够粘合至潮湿的木质纤维素材料(而不是模具材料，如硅酮)，用于内部使用无毒，并且优选是快干的。还测试了氰基丙烯酸酯胶水，但是不如纤维蛋白胶水有效，因为证实很难从氰基丙烯酸酯胶水除去模具。另外，尽管物理胶粘是成功的，但是应注意根据有关手术胶水和密封剂的文献报道，氰基丙烯酸酯胶水类型可以在特定条件下产生对于内部使用有毒的降解产物。
在胶水硬化后，可以在从它们的模具中除去束之前切掉过量的通道长度。在这些研究中，这最好使用切片机刀片(非常锋利)实现。在此阶段，可以产生准确长度的胶粘的束，通常不会通过直接切割通过模具而损害所述束。与暴露的胶粘的束相比，模具可以提供载体，其在一定切割压力下可以一定程度上被挤压。
通过镊子操作轻轻撕开模具半部分，其显示了最终产物：包含胶粘的植物维管束的高密度微通道(HDMC)。可以在此阶段对HDMC束灭菌，例如，通过在70％乙醇中浸没30min，然后在4℃，在无菌DPBS中储存。图6显示了在DPBS中储存的HDMC(AS)束(左图)和从硅酮模具除去后立即的各个HDMC(AS)(右图)。图7显示了在DPBS中储存的HDMC(CL)束(左图)和从硅酮模具除去后立即的各个HDMC(CL)(右图)。
HDMC的生物相容性分析：
首先，通过用表达绿色荧光蛋白的3T3成纤维细胞系(GFP-3T3)细胞培养1周来评价HDMC的生物相容性。简要地，将HDMC部分切片并且将细胞接种到所述部分的横截面上。在标准细胞培养条件(37℃，5％CO2)下1周后，用4％多聚甲醛溶液固定所述部分以用于显微镜观察。图8(AS基HDMC)和9(CL基HDMC)显示HDMC上以及微通道内细胞的存在。总体上，结果支持HDMC束是生物相容的。
图8显示了GFP-3T3细胞培养1周，然后在4％多聚甲醛中固定后HDMC(AS基)样品的共聚焦激光扫描显微照片。在木质部微通道(蓝色-自身荧光)中和周围，细胞(绿色-绿色荧光蛋白)是可见的。左图显示胶粘的束内单个CL维管通道的横截面视图，其中细胞在木质部通道内是可见的。注意围绕木质部和韧皮部通道开口的细胞密度。右图显示了细胞在其中分散的胶粘的束内的2个脉管通道的横截面(部分)视图。
图9显示了GFP-3T3细胞培养1周，然后在4％多聚甲醛中固定后HDMC(CL基)样品的共聚焦激光扫描显微照片。在木质部微通道(蓝色-自身荧光)中和周围，细胞(绿色-绿色荧光蛋白)是可见的。左图显示胶粘的束内单个CL维管通道的横截面视图，其中细胞在木质部通道内是可见的。注意，粘合至纤维蛋白胶水沉积物的细胞位于维管通道的右侧。右图显示了细胞在其中分散的胶粘的束内的2个脉管通道的横截面视图。
图8(AS基HDMC)和9(CL基HDMC)显示HDMC上以及微通道内细胞的存在。总体上，结果支持HDMC束是生物相容的。
实施例2-对于植物或真菌(即AS)维管束(VB)的提取和分离所开发的标准操作程序(SOP)的实施例
以下描述了对于植物或真菌维管束和/或微通道的提取和分离所开发的标准操作程序(SOP)的实施例。将这种SOP用于从AS来源提取和分离维管束。
安全声明
通过保持对于手术刀片位置和切片机刀片侧面的意识来防止偶然切口。参考所有适合的MSDS。穿戴适当的个人防护器材，如塑料手套、实验工作服和护目镜。
溶液
达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水
DPBS(Hyclone，产品目录号no.350-000-CL) 瓶500ml
4℃避光储存。
过期不要使用。
程序
芦笋的选择
从食品商的生产部门选择一把芦笋。优选由大直径(>1.0cm)的芦笋嫩枝组成的一捆芦笋。在选择和购买后，立即将这把芦笋输送至冷藏环境(4℃)。可以将储存1h内未处理的一把芦笋放置在浅水(维持冷藏)中以防止嫩枝干燥。
优选地，在购买24h内处理这把芦笋。
AS维管束的产生
[注意：如果先前处理了另一种植物或真菌组织，可以在进行前用70％乙醇和Accel TB溶液对所有工具和切割垫进行消毒]
佩戴一双新手套，从这捆芦笋除去标识芦笋生产商和PLU号(如果存在)的生产标签并记录。将芦笋嫩枝从它们的包装橡筋带中解开并在自来水下漂洗。将嫩枝在紧挨切割垫的浅水烧杯中放置。
将大称量盘紧挨切割垫放置并且将小体积(～25ml)DPBS倒入所述盘中。当它们产生时，将所述盘用于容纳分离的AS维管束。
将手术刀(Feather#10)和切片机刀片备用。
逐一处理嫩枝。对每个嫩枝应用以下程序：
从浅水烧杯除去嫩枝，并且放置在切割垫上。
使用切片机刀片切下嫩枝底部(约)2cm。如果嫩枝新的末端仍出现褪色、干燥或另外受损，则再切下1cm部分，直至末端由新鲜的未受损的组织组成。
从嫩枝新切下的底部末端算起，使用切片机刀片切下3-cm部分(称为“残肢”)。该残肢对应于嫩枝的“底部部分”。
使用切片机刀片，将3-cm残肢切成纵向半部分。
对所产生的半部分，检查在切割面附近可见的维管束(例如，参见图10)。
使每个残肢半部分接近曼陀琳刀片(调节至约1mm-厚切片)，在此将其切成约1-mm-厚切片，直至不再可以产生切片。使切片直接落在含有DPBS的称量盘中。
将含有薄切片的称量盘带到砧板。对于切片，预期维管束横越片材。选择横越至少3/4切片长度的维管束用于在下一步中进行分离。
通过手术刀刀片或切片机刀片从所述切片单个切下维管束。优选地，使手术刀刀片切口平直(不要提起刀片，因为这可以在分离的VB侧产生锯齿)。在提取VB时，小心地尽可能多地除去周围基本组织。
不要通过任何切割工具修正分离的VB切口，因为这可能产生不平边缘或者锯齿。
立即目视检查分离的维管束。任何以下观察结果导致丢弃分离的维管束：
·维管束纽结或者断裂。
·连续维管结构小于1.5cm长的任何VB。
使用干净的镊子，将通过目视检查的分离的维管束立即沉积在称量盘(含有DBPS)中(参见图11)。
对于如以上所描述的VB的分离，处理所有切片，一次一个。
在所有切片已处理后，使用切片机刀片从芦笋嫩枝切下另一3-cm残肢部分。该残肢对应于嫩枝的“中间”部分。
切割3-cm部分，并且与第一3-cm残肢完全相同处理，从而产生更多的分离的维管束。任选地，可以基于它们在芦笋嫩枝中的来源(底部、中间或顶部嫩枝)对提取的VB分类。
切割最终3-cm残肢部分，并且与第一和第二3-cm残肢完全相同处理，从而产生更多的分离的维管束。
如以上所描述的方式处理芦笋嫩枝，直至产生目标数目的VB。
如果任何单个芦笋嫩枝显示出以下任何迹象，则停止处理并且丢弃整批AS：
·发霉
·腐烂
·昆虫感染
如果嫩枝显示出以下任何迹象，则丢弃嫩枝并且不进行处理(但是仍可以对剩余嫩枝进行处理，并且不丢弃该批)：
·由于干燥而裂开或裂缝
·过度弯曲或另外畸形的嫩枝。
注意：如果处理中断超过0.5h，则丢弃目前正在处理的嫩枝并且将剩余的嫩枝(在浅水中)返回冷藏环境(4℃)。优选地，在其购买24h内处理所有剩余的嫩枝。
AS维管束对于去细胞化的制备
使用镊子，将称量盘内分离的AS维管束置于50-ml falcon管中。对维管束计数；在管上标记每管的总计数。
注意：50-ml离心管(Nunc)优选地包含不超过60个AS维管束。如果称量盘含有大于60个维管束，则使用多个50-ml管。
用以下信息标记每根管：
·YYYY-MM-DD形式的日期。
·操作人员的3-字母识别首字母。
·以字母“AS”开头的生产代码。
·在管盖上写明管内含有的AS维管束数目。
如果期望VB去细胞化，则在以下实施例4中所述的SOP后，立即处理管以用于去细胞化。
植物组织废料的处理和工具的清洁
将芦笋和芹菜组织废料收集到垃圾袋中。将废料分类为可堆肥材料。
用自来水漂洗切割垫。轻轻除去干燥的植物组织。用70％乙醇溶液以及Accel TB溶液对垫彻底消毒。
以与上述切割垫相同的方式清洁厨房用刀、镊子、手术刀刀片和切片机刀片。
使用KimWipe将金属工具轻轻擦干。
在适合的液体废物罐中收集称量盘中的DPBS溶液。
实施例3-对于植物或真菌(即CL)维管束(VB)的提取和分离所开发的标准操作程序(SOP)的实施例
以下描述了对于植物或真菌维管束和/或微通道的提取和分离所开发的标准操作程序(SOP)的实施例。将这种SOP用于从CL来源提取和分离维管束。
安全声明
通过保持对于手术刀片位置和切片机刀片侧面的意识来防止偶然切口。参考所有适合的MSDS。穿戴适当的个人防护器材，如塑料手套、实验工作服和护目镜。
溶液
达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水
DPBS(Hyclone，产品目录号no.350-000-CL)瓶500ml
4℃避光储存。
过期不要使用。
程序
芹菜的选择
从食品商的生产部门选择一把芹菜。这把芹菜不含任何明显损坏的茎，并且茎优选地是坚硬的。在选择和购买后，立即将这把芹菜输送至冷藏环境(4℃)。
优选地，在购买24h内处理这把芹菜。
CL维管束的产生
[注意：如果先前处理了另一种植物或真菌组织，在进行前用70％乙醇和Accel TB溶液对所有工具和切割垫进行消毒]
佩戴一双新手套，从芹菜除去标识芹菜生产商和PLU号(如果存在)的生产标签并在记录本上记录。用自来水漂洗芹菜。
将芹菜紧挨着切割垫放置。将手术刀(Feather#10)和厨房用刀备用。将大称量盘紧挨切割垫放置并且将小体积(～50ml)DPBS倒入所述盘中。当它们产生时，将所述盘用于容纳分离的AS维管束。从该把芹菜上手动扯断单根芹菜茎并放置在切割垫上。将以下步骤应用于所有单根芹菜茎：
使用厨房用刀切下茎底部4至5cm。茎的该底部部分通常比茎剩余部分更厚并且通常在其表面上具有灰尘颗粒。
如果茎的顶部部分具有任何叶，则使用厨房用刀切下顶部部分直至剩下不具有叶的部分。
手动轻轻折断茎距顶部1至2cm的部分，小心不要折断在茎外表面附近通过的维管束。
从茎的整个长度剥离并剥落暴露的维管束。剥离缓慢进行以避免维管束断裂，同时将它们包埋在周围芹菜组织中。可以将暴露的维管束作为整体或单独剥离。
将剥离的维管束放置在砧板上。通过戴手套的手，手动除去过量松散连接的基本组织。
使用手术刀，将维管束切成6-cm长的部分。
立即目视检查分离的维管束。任何以下观察结果导致丢弃分离的维管束：
·维管束纽结或者断裂。
·过量缠绕，从而使得维管束倾向于天然卷成硬环。
将通过目视检查的新切断的维管束沉积到含有达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)的称量盘中(参见图12)。
除了这把芹菜最内部透明颜色的茎之外，以上述方式处理所有芹菜的茎。丢弃未使用的内部的茎。
如果任何单个芹菜茎显示出以下任何迹象，则停止处理并且丢弃整批CL：
·发霉
·腐烂
·昆虫感染
如果嫩枝显示出以下任何迹象，则丢弃茎并且不进行处理(但是仍可以对剩余嫩枝进行处理，并且不丢弃该批)：
·由于干燥而裂开或裂缝
·由于在食品商处或运输期间的破坏而破碎或裂开的茎
注意：如果处理中断超过0.5h，则丢弃目前正在处理的茎并且将剩余的茎返回冷藏环境(4℃)。优选地，在其购买24h内处理所有剩余的茎。
CL维管束用于去细胞化的制备
使用镊子，将称量盘内分离的CL维管束置于50-ml falcon管中。对维管束计数；在管上标记每管的总计数。
注意：50ml falcon管包含不大于50个CL维管束。如果称量盘含有大于50个维管束，则使用多个50-ml falcon管。
用以下信息标记每根管：
·YYYY-MM-DD形式的日期。
·操作人员的3-字母识别首字母。
·以字母“CL”开头的生产代码。
·在管盖上写明管内含有的CL维管束数目。
在以下实施例4中所述的SOP后，立即处理管以用于去细胞化。
植物组织废料的处理和工具的清洁
将芦笋和芹菜组织废料收集到垃圾袋中。将废料分类为可堆肥材料。
用自来水漂洗切割垫。轻轻除去干燥的植物组织。用70％乙醇溶液以及Accel TB溶液对垫彻底消毒。
以与上述切割垫相同的方式清洁厨房用刀、镊子、手术刀刀片和切片机刀片。使用KimWipe将金属工具轻轻擦干。在适合的液体废物罐中收集称量盘中的DPBS溶液。
实施例4-通过十二烷基硫酸钠(SDS)对于植物或真菌(即AS和CL)维管束(VB)的去细胞化开发的标准操作程序(SOP)的实施例
以下描述了使用十二烷基硫酸钠(SDS)对于植物或真菌来源的维管束和/或微通道的去细胞化所开发的标准操作程序(SOP)的实施例。将该SOP用于使来源于AS和CL来源的维管束去细胞化。尽管以下SOP主要关注植物组织，但是据考虑可以类似处理真菌组织。在某些实施方式中，据考虑(例如)对于真菌组织，可以对溶液中的时间和/或SDS和/或CaCl2的浓度做出一些调整。
溶液
0.1％SDS溶液
SDS粉末(Fisher,产品目录号#BP166-500) 0.5g
无菌水(Baxter,产品目录号#JF7624) 最终体积 500ml
在高压灭菌瓶中制备(Fisher,产品目录号#FB-800-500)
在20-25℃储存。
7天内使用
0.1M CaCl2溶液
CaCl2粉末(Acros Organics，产品目录号#3496150000) 5.549g
无菌水(Baxter，产品目录号#JF7624) 最终体积 500ml
在高压灭菌瓶中制备(Fisher，产品目录号#FB-800-500)
在20-25℃储存。
7天内使用。
达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水
DPBS(Hyclone，产品目录号no.350-000-CL) 瓶500ml
4℃避光储存。
过期不要使用。
灭菌乙醇溶液
HistoPrep 95％RA(Fisher，产品目录号#HC13001GL) 368.4ml
去离子水(Millipore) 最终体积 500ml
在生物安全柜(BSC)内，在高压灭菌瓶(Fisher，产品目录号#_FB-800-500)中制备。
在20-25℃储存。仅在BSC下使用。
长期稳定。
程序
注意1：在操作员的记录本中记录在以下程序中使用的所有溶液的来源和识别信息。
注意2：优选地，在以上实施例2和/或3中所述的SOP完成后，立即使用以下程序。
通过十二烷基硫酸钠(SDS)的去细胞化(第1至4天)。
第1天：
·将新切割和分离的维管束(VB)从它们的DPBS储存溶液转移至50-ml离心管(Nunc)。每个管加载不超过60个VB以确保VB在SDS溶液内正确混合。
·用0.1％SDS溶液填充每个离心管(至50-ml填充线)。然后，将离心管的盖子紧密旋转就位。
·使用胶带将管固定至定轨振荡器(Corning LSE)的板上。
·将定轨振荡器设置在120RPM旋转，无时间限制。将振荡器观察至少1分钟以确保将管固定并且未处于变松散的风险。
·记录起始时间。
第2天：
·在VB在定轨振荡器上暴露于SDS溶液开始后20-24h，使振荡器停止并且从振荡器移除管。
·除去每个管的盖子，并将SDS溶液从每个管倾倒至实验室污水槽。
·用未使用的0.1％SDS溶液填充管，并将它们的盖子拧回。
·使用胶带将管固定至定轨振荡器(Corning LSE)的板上。
·将定轨振荡器设置在120RPM旋转，无时间限制。将振荡器观察至少1分钟以确保将管固定并且未处于变松散的风险。
·记录时间。
第3天：
·在第2天SDS溶液更换结束后20-24h，使振荡器停止并且从振荡器移除管。
·除去每个管的盖子，并将SDS溶液从每个管倾倒至实验室污水槽。
·用未使用的0.1％SDS溶液填充管，并将它们的盖子拧回。
·使用胶带将管固定至定轨振荡器(Corning LSE)的板上。
·将定轨振荡器设置在120RPM旋转，无时间限制。将振荡器观察至少1分钟以确保将管固定并且未处于变松散的风险。
·记录时间。
第4天：
·在第3天SDS溶液更换结束后20-24h，使振荡器停止并且从振荡器移除管。
·除去每个管的盖子，并将SDS溶液从每个管倾倒至实验室污水槽。
·用未使用的0.1％SDS溶液填充管，并将它们的盖子拧回。
·使用胶带将管固定至定轨振荡器(Corning LSE)的板上。
·将定轨振荡器设置在120RPM旋转，无时间限制。将振荡器观察至少1分钟以确保将管固定并且未处于变松散的风险。
·记录时间。
通过CaCl2盐清洗除去十二烷基硫酸钠(SDS)(第5至6天)
第5天：
·在第4天SDS溶液更换结束后20-24h，使振荡器停止并且从振荡器移除管。
·除去每个管的盖子，并将SDS溶液从每个管倾倒至实验室污水槽。
·用DI水填充管至50-ml填充线。
·将水从每根管倾倒至实验室污水槽。
·将上述2步中所述的DI-水漂洗再重复两次。
·在倾倒第三次DI水漂洗后，用0.1M CaCl2溶液填充每根管至50-ml填充线，并且将它们的帽拧回。
·使用胶带将管固定至定轨振荡器(Corning LSE)的板上。
·将定轨振荡器设置在120RPM旋转，无时间限制。将振荡器观察至少1分钟以确保将管固定并且未处于变松散的风险。
·记录时间。
第6天：
·在第5天SDS向CaCl2溶液更换结束后20-24h，使振荡器停止并且从振荡器移除管。
·除去每根管的盖子，并将CaCl2溶液从每个管倾倒至实验室污水槽。
·用未使用的0.1M CaCl2溶液填充每根管至50-ml填充线，并且将它们的盖子拧回。
·使用胶带将管固定至定轨振荡器(Corning LSE)的板上。
·将定轨振荡器设置在120RPM旋转，无时间限制。将振荡器观察至少1分钟以确保将管固定并且未处于变松散的风险。
·记录时间。
通过水清洗除去CaCl2盐(第7至8天)：
第7天：
·在第6天CaCl2溶液更换结束后20-24h，使振荡器停止并且从振荡器移除管。
·除去每个管的盖子，并将SDS溶液从每个管倾倒至实验室污水槽。
·用DI水填充管至50-ml填充线。
·将水从每根管倾倒至实验室污水槽。
·将上述2步中所述的DI-水漂洗再重复两次。
·在倾倒第三次DI水漂洗后，用水填充每根管至50-ml填充线，并且将它们的盖子拧回。
·使用胶带将管固定至定轨振荡器(Corning LSE)的板上。
·将定轨振荡器设置在120RPM旋转，无时间限制。将振荡器观察至少1分钟以确保将管固定并且未处于变松散的风险。
·记录时间。
第8天：
·在第7天CaCl2向水溶液更换结束后20-24h，使振荡器停止并且从振荡器移除管。
·除去每根管的盖子，并将水从每根管倾倒至实验室污水槽。
·用未使用的水填充每根管至50-ml填充线，并且将它们的盖子拧回。
·使用胶带将管固定至定轨振荡器(Corning LSE)的板上。
·将定轨振荡器设置在120RPM旋转，无时间限制。将振荡器观察至少1分钟以确保将管固定并且未处于变松散的风险。
·记录时间。
灭菌(第9天)：
第9天：
·在第8天水更换结束后20-24h，使振荡器停止并且从振荡器移除管。记录时间。
·除去每根管的盖子，并将水从每根管倾倒至实验室污水槽。然后，将离心管的盖子拧回。
·用70％乙醇溶液对管喷雾并放置进生物安全柜(BSC)内部。
·用灭菌乙醇溶液填充每根管至30-ml填充线，并且将所述管的盖子拧回。将管直立放置在试管架上，从而使所有去细胞化VB浸没在乙醇溶液中。
·将管保持静置15分钟。
·15分钟后，将管反转并另外保持静置15分钟。
·15分钟后，将管重新直立定位，并除去帽。
·通过10-ml血清学移液管除去每根管中的乙醇溶液。在玻璃瓶中收集乙醇溶液以用于实验室污水槽中的处理。
·使用10-ml血清学移液管，用无菌DPBS填充每根管至30-ml填充线，然后温和旋动。
·通过无菌巴斯德吸管从每根管吸出DPBS。
·将前2步再重复两次，总计漂洗3次无菌DPBS。
·在第3次DPBS漂洗后，从每根管中吸出漂洗体积，并用30ml无菌DPBS填充每根管，并且将管的盖子紧密拧回就位。
·用以下其它信息标记每根管：生产代码、灭菌日期、液体溶液内容物、无菌状态。
·将管4℃避光放置。
实施例5-使用纤维蛋白胶水从木质纤维素材料(即AS&CL)制造高–密度微通道(HDMC)束
以下描述了对于使用纤维蛋白胶水从木质纤维素材料(即AS和CL)制造高密度微通道(HDMC)束所开发的标准操作程序(SOP)的实施例。将该SOP用于使来源于AS和CL来源的维管束成束和胶粘。
安全声明
当操作皮下注射器针头时，始终防止针刺受伤。将纤维蛋白胶水和纤维蛋白胶水-来源的产品(包括蛋白小瓶)作为2级生物危险材料处理。参考所有适合的MSDS。穿戴适当的个人防护器材，如塑料手套、实验工作服和护目镜并在层流净化罩下进行所有工作。
溶液&试剂
达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水
DPBS(Hyclone，产品目录号no.350-000-CL)瓶500ml
4℃避光储存。
过期不要使用。
TISSEEL纤维蛋白密封剂试剂盒(Baxter Healthcare，产品目录号#_1503152)
Figure BDA0003458122280000721
在2-25℃之间储存组分。
根据生产商的说明(参见以下程序)，在双-注射器系统中制备溶液。
灭菌乙醇溶液
HistoPrep 95％RA(Fisher，产品目录号#HC13001GL) 368.4ml
去离子水(Millipore) 最终体积 500ml
在生物安全柜(BSC)内，在高压灭菌瓶(Fisher，产品目录号#_FB-800-500)中制备。
在20-25℃储存。仅在BSC下使用。
长期稳定。
程序-胶水制备
TISSEEL和DUPLOJECT制备
注意：按照生产商的说明书(Baxter文档ID 0716820)进行TISSEEL制备。以下程序是适合于当地实验室条件的这些程序的等价再声明。
将TISSEEL试剂盒中的全部4个小瓶在FIBRINOTHERM(Baxter)装置的孔中预加热。装置将小瓶的内容物加热至37℃并维持该温度。当加热完成时，信号灯指示。如果小瓶冷藏，则加热可以花费5分钟。
在预热完成后，将全部4个小瓶转移到生物安全柜(BSC)中。
在不接触小瓶橡胶塞的情况下，除去抑肽酶和密封剂蛋白小瓶的塑料可掀塑料盖。通过加载了Accel TB消毒溶液的Kimwipe对橡胶塞消毒。使橡胶塞干燥。
使用试剂盒中的蓝色标度注射器和针尖，将抑肽酶溶液转移到密封剂蛋白小瓶中。
将密封剂蛋白小瓶转移到FIBRINOTHERM装置的搅拌孔中(小瓶已含有小磁力搅拌棒)。将小瓶内容物搅拌10分钟。当小瓶溶液透明且无气泡和颗粒时，搅拌完成。将小瓶保持在37℃加热孔中直至组装DUPLOJECT双-注射器系统。
在不接触小瓶橡胶塞的情况下，除去氯化钙和凝血酶小瓶的塑料可掀塑料盖。通过加载了Accel TB消毒溶液的Kimwipe对橡胶塞消毒。使橡胶塞干燥。
使用试剂盒中的黑色标度注射器和针尖，将氯化钙溶液转移到凝血酶小瓶中。
将凝血酶小瓶温和旋动直至透明，然后转移到FIBRINOTHERM装置用于再加热至37℃。
将两个含有溶液的小瓶(最初，密封剂蛋白和凝血酶小瓶)从FIBRINOTHERM装置转移到BSC。
用加载了Accel TB的Kimwipe擦拭两个小瓶的橡皮塞，然后使其干燥。
使用试剂盒中的第二蓝色标度注射器和针尖，将来自密封剂蛋白小瓶的溶液吸入注射器。
从注射器除去针尖(丢弃到利器容器中)，并将注射器夹住放置到红色双-注射器-保持DUPLOJECT组件中。
使用试剂盒中的第二黑色标度注射器和针尖，将来自凝血酶小瓶的溶液吸入注射器。
从注射器除去针尖(丢弃到利器容器中)，并将注射器夹住放置到红色DUPLOJECT组件中。
将塑料接合部分连接至夹住的注射器的末端。
将应用套管连接至接合部分的末端。
将完成的DUPLOJECT组件相对于稳定面(如试管架)直立定位直至需要纤维蛋白胶水。优选地，在以下4小时内使用纤维蛋白胶水。
维管束(VB)的键合
注意：将在该子部分中所描述的所有工具高压灭菌并且一旦处于BSC内部，则仅从它们的高压灭菌器中除去。
从储存中选择含有正确类型(AS或CL)和量的去细胞化&灭菌的维管束(每HDMC束，20个VB)的管并与下列物质一起置于BSC内部：
·切片机刀片
·定制硅酮模具(每HDMC束，1个模具)
·镊子
·24-孔板(在无菌包装中；如果从单一类型的VB制造HDMC，则最少使用2块板)
通过无菌镊子将VB管的固体内容物转移至24-孔板盖的内表面。将5ml无菌DPBS加入至该内表面以防止VB干燥。
使用无菌镊子，从它们的高压灭菌小袋中除去多达2个硅酮模具并将它们定位在第二24-孔板盖的内表面内，从而使它们的内部通道打开并面向上方(朝着操作人员)。在单一板盖内操作不超过4个模具半部分(总计2个HDMC)。
使用一对无菌镊子，将10VB压紧到每个模具半部分的通道内。
作为束从每个模具半部分中除去压紧的VB，并且将来自每个半部分的束直接放置在模具下方。
使用DUPLOJECT系统，沿每个模具半部分的内部通道长度沉积3滴纤维蛋白胶水。
在胶水沉积后立即将挤压的VB束再定位至它们的模具通道中。通过镊子尖施加温和压力以确保VB在加载胶水的模具通道内的紧密压紧。
使纤维蛋白胶水凝固10分钟。在此期间，采集模具照片。
10分钟后，将DUPLOJECT系统上的涂胶器尖更换为新的、未堵塞的尖。
沿每个挤压的VB束长度沉积3滴纤维蛋白胶水。
在胶水沉积后立即通过镊子操作将模具半部分(分别含有10个压紧的VB)挤压在一起。定位模具，从而在不需要镊子接触的情况下，使所述半部分保持在一起。
使纤维蛋白胶水凝固10分钟。在此期间，采集模具照片。
10分钟后，通过切片机刀片割掉从硅酮模具伸出的VB末端并丢弃。
通过镊子操作轻轻分离模具半部分。可以从将清空的模具半部分之一中温和撬动HDMC束产品。采集无HDMC的照片。
注意：在此阶段，可以通过在30ml 70％乙醇溶液中浸没30min，然后在无菌DPBS中漂洗3×20ml，任选地对HDMC束灭菌。
将HDMC束产物置于含有10ml无菌DPBS的50-ml离心管(Nunc)中(每个HDMC一根管)。
将HDMC管在4℃避光保存。
实施例6-测试不同胶水的实施例
以下描述了在模制类型方法中测试多种不同类型的胶水的制造胶粘高密度微通道(HDMC)束的实施例。
使用PEG基合成胶水的AS胶粘
方法：
使用了通过实施例4的SOP(去细胞化)产生的去细胞化AS维管束(VB)。
模制：将VB压紧到生物医学级硅酮(Dow Corning Silastic MDX4-4210)模具的两个半部分中。每个模具半部分10个VB；每个HDMC，20个VB。
胶水：使用来自Baxter的Coseal胶水。将2滴沉积到每个模具半部分的内部，然后将VB压紧到通道中。5分钟后，在将模具半部分挤压在一起之前，将另外2滴胶水沉积在每个模具半部分的压紧的VB上(图13)。在尝试模具半部分分离之前，允许10min沉降时间。
在BSC内进行无菌组装。
结果：
Coseal胶水产生了在沉积到模具半部分上后紧紧粘合的凝胶。然而，膨胀体积是严重的，其中估计膨胀了按体积计约400％。由于所使用的模具和该实验的具体装置并非设计以容纳膨胀，因此胶水膨胀是不利的并且导致模具半部分分离，并因此不能维持HDMC圆柱体的形状。还发现Coseal胶水对硅酮模具比纤维蛋白胶水更粘，并因此如果未从模具半部分小心分离胶水，则在半部分中发生了HDMC束的裂开。从该测试中产生的HDMC束是松散键合的，并且一旦从模具除去，则不具有圆柱形形状(参见图14)。
尽管在该实验系统中使用PEG基胶水遇到了困难，但是据考虑可以进行改进以容纳PEG基胶水膨胀和粘结，例如，通过使用更大的模具和/或居先模制；使用较低的微通道密度以允许膨胀；和/或使用不同材料的模具，例如，其在使用PEG基胶水时不太粘合。
使用PEG基合成胶水的CL胶粘
方法：
通过实施例4的SOP(去细胞化)制备去细胞化的CL维管束(VB)。
模制：将VB压紧到生物医学级硅酮(Dow Corning Silastic MDX4-4210)模具的两个半部分中。每个模具半部分10个VB；每个HDMC，20个VB。
胶水：使用来自Baxter的PEG基Coseal胶水。将2滴沉积到每个模具半部分的内部，然后将VB压紧到通道中。5分钟后，在将模具半部分挤压在一起之前，将另外2滴胶水沉积在每个模具半部分的压紧的VB上(图15)。在尝试模具半部分分离之前，允许10min沉降时间。
在BSC内进行无菌组装。
结果：
Coseal胶水产生了在沉积到模具半部分上后紧紧粘合的凝胶。然而，膨胀体积是严重的，其中估计膨胀了按体积计约400％。由于所使用的模具和该实验的具体装置并非设计以容纳膨胀，因此胶水膨胀是不利的并且导致模具半部分分离，并因此不能维持HDMC圆柱体的形状。还发现Coseal胶水对硅酮模具比纤维蛋白胶水更粘，并因此如果未从模具半部分小心分离胶水，则HDMC束将裂成两半，因为每一半可能仍保持胶粘至其硅酮模具半部分。从该测试中产生的HDMC束是松散键合的，并且一旦从模具除去，则不具有圆柱形形状(参见图16，其中各个VB的部分脱胶是可见的)。尽管在该实验系统中使用PEG基胶水遇到了困难，但是据考虑可以进行改进以容纳PEG基胶水膨胀和粘结，例如，通过使用更大的模具和/或居先模制；使用较低的微通道密度以允许膨胀；和/或使用不同材料的模具，例如，其在使用PEG基胶水时不太粘合。
使用氰基丙烯酸酯胶水(Krazy胶水)的AS胶粘
方法：
根据如上所述的实施例4的SOP(去细胞化)制备去细胞化AS维管束(通道)。
模制：将通道压紧到塑料细管的两个半部分中(5mm内径)。
胶粘：使用氰基丙烯酸酯胶水(Krazy胶水)。在将模具半部分挤压在一起前，将液滴沉积到压紧通道中。
方法是非无菌的，通过手工组装。
结果：
成功组装了束。在这些条件下的最大堆积密度为5mm直径中约34个通道，其与具有相当直径的天然AS碎片中存在的5-9个通道相比是有利的(参见图17-18)。
使用生物可降解的纤维蛋白密封剂(TISSEEL)的AS胶粘
方法：
通过以上实施例4的SOP(去细胞化)制备去细胞化AS维管束(通道)。
模制：将通道压紧到定制硅酮(Sylgard 184)模具(4mm内径)的两个半部分中。硅酮材料不粘合至纤维蛋白密封剂，从而有助于胶粘的AS通道从模具的除去。
在使用前，将模具在高压灭菌小袋中高压灭菌。
胶粘：胶水是纤维蛋白密封剂。在将模具半部分挤压在一起前，对于TISSEEL向压紧通道的应用，使用Baxter DUPLOJECT系统应用液滴。
在层流净化罩内通过高压灭菌的镊子操作实施无菌组装。在无菌24-孔板盖的内部侧面完成组装。
结果：
成功组装了胶粘的束。在所使用的条件下最大压紧密度为4mm直径中约20个通道。相对于氰基丙烯酸酯胶水，这在密度方面稍微降低。图19显示了固化期间接合的硅酮模具半部分内的AS通道。
经过轻微修改，对上述进行重复实验。将通道修饰减少至每束18个通道，并且平均单个通道厚度稍微提高。图20显示了在胶水固化步骤期间，硅酮模具内的AS通道的视图。图21显示了从硅酮模具除去后，纤维蛋白-胶粘的AS通道的视图。通过胶粘的束样品在70％乙醇中的30-min浸没进行灭菌，然后在无菌DBPS中清洗3次。在体外测试前，将样品在4℃保存在无菌DPBS中。
然后，实施体外生物相容性测试。将GPF-3T3成纤维细胞在胶粘的束样品上培养1周，然后在4％多聚甲醛中固定。起初，细胞沉积在暴露的通道开口上。对固定样品实施共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)以确定细胞的存在或不存在。图22(左图)显示了GFP-3T3细胞培养1周，然后在4％多聚甲醛中固定后AS样品的透视图。右图显示了相同样品的俯视图。
图23显示了GFP-3T3细胞培养1周，然后在4％多聚甲醛中固定后AS HDMC束的CLSM图像。在木质部微通道(蓝色)中和周围，细胞(绿色)是可见的。
结果与讨论：成功产生了多个胶粘的AS HDMC束样品。在培养1周后，在通道内以及外周材料(胶水、通道外部)上对细胞显像。由于GFP蛋白的存在，细胞显象是可能的；通过木质部微通道的自身荧光，AS纤维素支架是可见的。
还通过一些修改重复了这些实验：模具半部分由食品级硅酮吸管制成。在使用前，将模具半部分在高压灭菌小袋中高压灭菌，并且与非食品级的Sylgard 184硅酮进行对照。应注意(例如)通过高压灭菌的镊子对较小的模具半部分的操作比较大的定制的Sylgard184模具半部分的操作更困难。如上所述，使用相同灭菌程序，并且所产生的HDMC束旨在在大鼠中的植入研究中使用(参见以下实施例8)。
成功产生了多个胶粘的AS束样品。制备了7个样品，每个约5mm长，5mm直径。在4℃储存期间，一些样品变得未胶粘/不接合，这可能是由于一些束中的纤维蛋白胶水不足所造成的。图24显示了在胶水固化步骤期间，食品级硅酮模具内的AS通道的视图。图25显示了在切割成5mm长之后，在无菌DPBS中保存的胶粘的AS通道样品。
由于储存时一些样品损失，因此重复该程序，但是使用稍微更多的胶水以将通道在硅酮细管模具内保持在一起。
成功制备了多个胶粘的AS束样品。生产了4个样品，每个5mm长，5mm直径并且未观察到储存时的样品损失。以下实施例8中显示了皮下植入结果。
使用氰基丙烯酸酯胶水(Super glue/“Krazy胶水”)的CL胶粘
方法：
通过实施例4的SOP(去细胞化)制备去细胞化CL维管束(通道)。
模制：将通道压紧到塑料细管的两个半部分中(5mm内径)。
胶粘：使用氰基丙烯酸酯胶水(“Krazy胶水”)。在将模具半部分挤压在一起前，将液滴沉积到压紧通道中。
实施非无菌、手工组装。
结果：
实现了胶粘束的成功组装。在这些条件下，最大压紧密度为5mm直径中约24个通道。图26显示了用氰基丙烯酸酯胶水胶粘的CL通道束的侧视图。图27显示了使用氰基丙烯酸酯胶水胶粘的CL通道束的径向视图，其中各个通道是隐约可见的。
使用生物可降解的纤维蛋白密封剂(TISSEEL)的CL胶粘
方法：
通过实施例4的SOP(去细胞化)制备去细胞化CL维管束(通道)。
模制：将通道压紧到定制硅酮(Sylgard 184)模具(4mm内径)的两个半部分中。硅酮材料不粘合至纤维蛋白密封剂，从而有助于胶粘的CL通道从模具的除去。
在使用前，将模具在高压灭菌小袋中高压灭菌。
胶粘：将生物可降解的纤维蛋白密封剂用作胶水。在将模具半部分挤压在一起前，对于TISSEEL向压紧通道的应用，使用Baxter DUPLOJECT系统应用液滴。
在层流净化罩内通过高压灭菌的镊子操作实施无菌组装。在无菌24-孔板盖的内部侧面完成组装。
结果：
成功组装了胶粘束。在所测试的条件下最大压紧密度为4mm直径中约20个通道。图28显示了固化期间，在硅酮模具半部分中接合在一起的CL通道。
重复该实验以产生更多束样品以用于进一步测试。使用相同制造过程，其中通道挤压密度的修改减少至每束18个通道，以解释CL通道厚度的平均尺寸变化(提高)。通过胶粘的束样品在70％乙醇中的30-min浸没进行灭菌，然后在无菌DBPS中清洗3次。在体外测试前，将样品在4℃保存在无菌DPBS中。
如下实施体外生物相容性测试：将GPF-3T3成纤维细胞在胶粘的束样品上培养1周，然后在4％多聚甲醛中固定。起初，将细胞沉积在暴露的通道开口上。将固定样品的共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)用于确定细胞的存在或不存在。
结果：
成功产生了多个胶粘的CL束样品。在培养1周后，在通道内以及外周材料(胶水、通道外部)上对细胞显像。由于GFP蛋白的存在，细胞显象是可能的；通过木质部微通道的自身荧光，CL纤维素支架是可见的。
图29显示了在胶水固化步骤期间，硅酮模具内的CL通道的视图。图30显示了从硅酮模具除去后，纤维蛋白-胶粘的CL通道的视图。图31显示了在GFP-3T3细胞培养1周，然后在4％多聚甲醛中固定后的CL束样品的透视图(左图)和相同样品的俯视图(右图)。图32显示了GFP-3T3细胞培养1周，然后在4％多聚甲醛中固定后CL样品的CLSM图像。在木质部微通道(蓝色)中和周围，细胞(绿色)是可见的。
重复该实验，但是改变为使用由食品级硅酮吸管制造的模具半部分，从而使用医学或食品级硅酮模具研究并在大鼠中提供用于皮下植入的样品(参见实施例8)。在使用前，将模具半部分在小袋中高压灭菌。应注意通过高压灭菌的镊子对较小的模具半部分的操作比较大的定制的Sylgard 184模具半部分的操作更困难。使用上述相同灭菌程序，并且样品旨在用于大鼠中的皮下植入(参见实施例8)。
结果：成功实现了多个胶粘的CL束样品的产生。产生了9个样品，每个5mm长，5mm直径。9个样品中的3个最终在4℃储存期间变得未胶粘/不接合，这可能是由于这3束的纤维蛋白胶粘不足所造成的。
图33显示了在胶水固化步骤期间，在食品级硅酮模具内的CL通道的视图。图34显示了在除去顶部硅酮模具半部分后，胶粘的CL通道束的视图。图35显示了在切割成5mm长之后，胶粘的CL通道样品(保存在无菌DPBS中)的视图。
实施例7-HDMC束的导向性质和方向性
实施实验以进一步研究如本文所描述的HDMC束引导细胞方向性的能力。如本文所描述的，存在多个治疗和非治疗性实施例，其中能够赋予方向性和/或细胞生长/侵袭/增殖的引导的支架生物材料是所期望的。尽管在本领域中多种支架不能赋予方向性，但是本发明人目前已开发了如本文所描述的包含高密度微通道束的支架生物材料，其中去细胞化微通道在所述束内彼此基本平行布置，其可以赋予其上和/或其中生长的细胞方向性。
以下提供了对一种这种研究的描述。
方法：
(HDMC制造)：一般地，按照实施例3、4和5的SOP，使用AS和CL来源材料的去细胞化维管束(VB)制造了HDMC。简要地，如本文所描述的将分离的AS和CL VB去细胞化，然后通过定制硅酮(Dow,Sylgard 184)模具，分别成形和胶粘(Baxter Healthcare,TISSEEL纤维蛋白密封剂，产品目录号no.1503152)成HDMC/AS和HDMC/CL。VB密度为每HDMC 18个AS或CLVB。通过在70％乙醇溶液中浸没30-min，然后用无菌达尔伯克氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS；Hyclone，产品目录号no.350-000-CL)清洗3×并在4℃在DPBS中储存对HDMC灭菌。
(细胞培养)：将GFP-3T3成纤维细胞(产生绿色荧光蛋白)与HDMC/AS和HDMC/CL在补充有10％胎牛血清(FBS；Hyclone)和1％青霉素-链霉素(P/S)的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM；Hyclone)中培养1周(其中以2次相等时间间隔更换培养基)。将约5mm长和5mm直径的HDMC/AS和HDMC/CL部分沉积在24-孔板的孔中，并且将约50000个GFP-3T3细胞直接沉积(在小培养基液滴中)在HDMC的开放通道表面上。在通过小液滴(以使得细胞浸润和粘合在HDMC上)的原始细胞沉积后4小时，含有HDMC的孔接受1ml培养基，并且在1-周培养期结束前实施2次培养基更换。将样品在标准细胞培养条件下，在加湿的37℃，5％CO2培育箱中培育。
(固定)：在1-周细胞培养期结束时，从HDMC孔除去培养基。用DPBS清洗孔三次，然后以1ml/孔填充4％多聚甲醛(PFA)固定液并避光10分钟。在10-分钟固定期结束时，除去PFA溶液并用DPBS清洗孔三次，然后填充1/ml DPBS并在4℃避光保存。(显微镜)：从它们的24-孔板除去HDMC样品，将含有DPBS的孔置于5-mm塑料细胞培养皿中。通过激光扫描共聚焦显微镜检查检验开放通道末端(其上沉积细胞的那些)。使用10X物镜对表面扫描其中在木质部通道开口中和周围已粘合了细胞的区域。捕获了所关心区域的单个光学切片和垂直-叠加切片(“Z-叠加”；63个切片，间隔2.8微米)。使用Fiji/ImageJ对光学切片成像。通过Fiji中的标准软件包3D Viewer插件使得Z-叠加3D成像。
结果：
HDMC/AS和HDMC/CL中的木质部通道结构通过自身荧光(通过405nm激发激光器)直接可见，并且由于细胞中GFP的存在，通过绿色荧光信号(通过488nm激发激光器)指示细胞的存在。在HDMC/AS(图36A和36B)和HDMC/CL(图37A和37B)的木质部通道中和周围使细胞显象。光学切片的3D重建显示木质部通道中和周围的细胞浸润(图36C和37C)，其方向朝着HDMC内部(图36D和37D)。
讨论：
HDMC/AS和HDMC/CL的生物相容性的这种细胞培养研究表明成纤维细胞可以粘合至HDMC结构并在其上存活，这支持HDMC是生物相容性材料。成纤维细胞在木质部微通道中和周围两者中显象，表明AS和CL来源材料的通道空间对于细胞浸润和生长是尺寸适合的。值得注意地，光学切片的3D绘图表明了细胞块通过微通道-介导的引导向HDMC材料中更深地增殖的迹象。这支持HDMC材料可以为细胞在木质纤维素微通道内部与外部两者中的定向-控制增殖提供基材。因此，例如，HDMC可以提供工程化以促进跨过先前断开的联接的细胞再连接的支架。
图36A)显示了HDMC/AS内木质部通道和成纤维细胞的共聚焦激光扫描荧光显微照片(Z-叠加投影)。通道显像为红色(自身荧光；假色)，GFP-3T3成纤维细胞显象为绿色(绿色荧光蛋白；假色)。图36B)显示了图版A中红色轮廓的多个通道的局部放大图。图36C)显示了来自图版B的透视图的绿色荧光蛋白和木质部自身荧光信号的3D-体绘图(Fiji/ImageJ；3DViewer插件)。图36D)显示了3D绘图的旋转视图，其显示了细胞沿通道长度的方向性。
图37A)显示了HDMC/CL内木质部通道和成纤维细胞的共聚焦激光扫描荧光显微照片(Z-叠加投影)。通道显像为红色(自身荧光；假色)，GFP-3T3成纤维细胞显象为绿色(绿色荧光蛋白；假色)。白色尖头表明了通道外细胞的存在。蓝色箭头表明了通道外细胞的存在。图37B)显示了图版A中红色轮廓的单通道的局部放大图。图37C)显示了来自图版B的透视图的绿色荧光蛋白信号的3D-体绘图(Fiji/ImageJ；3D Viewer插件)。图37D)显示了3D绘图的旋转视图，其显示了细胞沿通道长度的方向性。
因此，这种检验表明具有来自AS和CL植物组织来源的任一个的去细胞化微通道的包含HDMC束的支架生物材料可以用于为细胞提供引导作用。在这些结果中，细胞位于HDMC束的木质部通道的内部与外部，并且它们是定向的(即通过通道的方向性引导)。
实施例8-支架生物材料和HDMC束的体内生物相容性
实施体内研究以进一步研究如本文所描述的支架生物材料和HDMC束的生物相容性。
方法：
手术程序：在手术植入前，对大鼠给予盐水0.9％和丁丙诺啡(0.05mg/kg)的皮下注射。使用异氟烷使大鼠麻醉。通过应用眼科液体凝胶保护眼睛。将大鼠从臀部至肩部在它们的右侧剃毛。清洗皮肤并用消毒溶液消毒。实施3个1-2cm切口(分别在下、中和上背部)，在脊柱前与之平行。穿过表皮、真皮和皮下脂肪层至下方肌肉做出切口。将HDMC束植入物(CL和AS)植入每个切口(每个切口1个植入物)。缝合切口并将2％的布比卡因透皮应用于缝合位点。另外，第一次注射后4-6小时皮下施用丁丙诺啡。在4和8周后收集样品。
组织学：将收集的样品在10％福尔马林中固定并在石蜡包埋前放置在70％的乙醇中。切割连续切片并用苏木精-伊红(H&E)或者Masson三色染料染色。
结果与讨论：
图38和39分别显示了从植入位点取回的HDMC/CL(芹菜-来源的)材料的纵向和横向切口的组织学染色(苏木精和伊红；H&E)。在所有情况下，图版B是图版A中的区域的局部放大。CL基微通道(在图39A中可见)保持束在一起并且清楚限定。
图40和41分别显示了从植入位点取回的HDMC/AS(芦笋-来源的)材料的纵向和横向切口的组织学染色(H&E)。AS基微通道(在图40A中可见)保持束在一起，但是在测试条件下，微通道之间的边界不如HDMC/CL中明显(图39A)。
HDMC/CL(图38和39)和HDMC/AS(图40和41)的组织学染色的大致直接比较表明HDMC/AS材料在所测试的条件下可能稍微更生物相容。
实施例9-用于HDMC产生的完整维管束微通道从天然或去细胞化维管束植物的基于液体的提取的方法和程序
实施研究以确定用于HDMC产生的从天然或去细胞化维管束植物分离VB微通道的替代方法。本文使用了多种不同的化学处理，如渗透性冲击、温度改变、机械搅动和在酸和碱溶液中浸渍。基于程序目标，确定最优溶液、浓度和时间。这些步骤的指导原则是将植物组织解构成潜在的完整结构，其可以随后单独或结合其它植物材料使用。
方法：
缓冲剂和溶液的制备
1.对于NaCl，制备了50mL，0M、0.5M、1M、2M和3M的溶液。
2.对于LiCl，制备了50mL，0M、0.5M、1M、2M和3M的溶液。
3.对于酸/过氧化物，制备了50mL冰醋酸与30％过氧化氢的比值为3:1、2:1、1:1、1:2和3:1的溶液。
4.对于碱，制备了50mL，0M、0.5M、1M、2M和3M NaOH溶液。
植物组织的制备
5.通过割掉任何表皮或者除去末端制备组织条。对于如苹果或梨的水果，剥去表皮并切成相等的部分。对于芹菜、芦笋等，切下白色末端和顶部。
6.切成3cm(或者合适的尺寸)部分，然后在曼陀琳切片机上切片。
7.对于植物，如芦笋、芹菜等，保留含有可见的木质部和韧皮部维管束的切片。对于水果，如苹果、梨等，使用所有远离核的内部果肉。
8.此时，可以用以下所描述的条件处理天然组织。作为另外一种选择，在以下所描述的其它处理前，根据我们先前的工作和专利中所述的SDS基方法，还可以首先将天然组织去细胞化。
9.将剩余的条置于充满所期望的微观结构分离溶液的烧杯中。
提取程序
所需要的材料：
a.对于每种溶液类型和/或浓度，50mL管
b.200mL烧杯(对于整个程序，使用完全相同的烧杯)
c.电炉
d.温度计
e.4×来自6孔板的盖(或者任何用于图象的透明矩形板盖)
f.1×1L装满蒸馏水的烧杯(我建议另外准备一个烧杯以倒入200mL蒸馏水以快速终止反应)。
g.钳
h.计时器
程序：可以将该程序应用于任何维管植物组织。在本文中，我们证实了使用芹菜和芦笋的结果。
1.对于每个烧杯，从初始批次获得5×10个CL条。对在桌子上摆开的条拍照。对条中VB的数目计数(总计)。
2.对于每个各个处理，制备具有溶液的烧杯(例如，1M NaCl＝5×烧杯，其分别装填了50mL 1M NaCl)-使其回到室温，或提前制备溶液。
3.将4个烧杯置于电炉上(对于盐处理，可以将电炉保持在台面上，但是对于酸和碱处理，整个程序必须在通风橱中进行)。
4.将10个CL条放置在每个烧杯中，然后将电炉温度提高至100℃。
5.一旦气泡可见，则启动计时器计时30分钟(或者间隔)。分别在10、15、20和30min后除去每个烧杯。
6.在时间结束后，从电炉除去烧杯并添加200mL室温的水(注意：不要向热烧杯添加冷水，因为这可以导致玻璃粉碎-缓慢添加)。
7.使用温度计，通过所述束进行30次数字8的转动，以充分轻轻分离疏松的束。(注意：避免剪切或分离不易于松开的条)。
8.倒出溶液-不要丢失任何疏松的束并且将条/切下的束放置在透明板盖上。拍照并且注意提取的束的数目。(注意如果简单分离条，或者如果清楚切下VB。注意束提取％)
结果：
温度和煮沸时间的影响表明了对于基于液体的提取对植物材料的束提取率的影响。以下结果显示木质部和韧皮束之间的软细胞组织可以被降解，从而将切片切成较小的块，并且延长处理可以使得木质部和韧皮束被提取。
本文所公开的实验证明多种基于液体的化学处理，如盐(NaCl、LiCl)、浸渍(用乙酸和过氧化物)和碱处理(NaOH)能够改变植物材料的机械和结构性能并且能够提取多种植物部分，如维管束。对于它们提取这些材料的能力以及这些溶液对材料的结构和机械性质的影响，评价了条件，如浓度和煮沸时间。
浸渍在纸浆和纸以及食品行业中常用于软化和消化植物材料，如木材、树皮、树叶、果实等。在食品工业中，通常将果实浸泡在液体中以将液体的风味吸收到食品中，例如，对草莓撒糖，从而它们可以释放它们的汁液并软化草莓。然而，在所有情况下，这些工业过程引起植物组织超微结构降解，这对于体外和体内组织工程应用是非常有价值的。
酸和过氧化物处理结果：酸和过氧化物可以用于软化植物材料和提取植物的不同部分以保持微观结构。这已对于芦笋和芹菜进行，其结果如下所示。图42显示了酸和过氧化物提取以及芹菜条煮沸的结果以除去每个条内所含的维管束。我们在本文中显示乙酸与30％过氧化氢的1:1的比值沸腾30分钟导致释放了大量维管束(图43和44)。可以看出1:1、1:2和1:3的比值能够从去细胞化的条中释放束。还对于盐和碱处理获得了类似的结果(以下进一步讨论)。图44显示了用冰醋酸：30％过氧化氢的1:1的酸和过氧化物的溶液处理的芦笋条。本文所描述的方法还可以应用于其它植物的脉管组织以实现相同的提取结果。图44显示了用冰醋酸：30％过氧化氢的1:1的酸和过氧化物的溶液处理的芦笋条。
应注意在室温下浸渍不会获得任何束，没有浸渍溶液的煮沸也不会。只有加热/煮沸和浸渍溶液的组合才能获得束。另外，可以将相同处理应用于去细胞化的束，并且获得类似的结果，但是煮沸时间和浓度不同。图43显示对这种借此先前去细胞化的芹菜进行了与图42中的天然条相同的条件。可以注意到能够提取各个束。
盐处理结果：已表明用盐处理对于植物束的去除是有用的。与酸和过氧化物类似，测试了盐浓度和煮沸时间的范围以确定替代溶液是否在提取植物的多个部分和保持微观结构方面是差不多有效的。图45和46显示不考虑盐浓度，提高煮沸时间通常会导致维管束的成功提取，然而，更浓的溶液(3M和1M)显示提取了最多的维管束。2M溶液也显示在15分钟后释放大量束，但是在20和30分钟后降低。
碱处理结果：除用酸处理之外，测试了使用不同浓度的NaOH碱从条切除束。结果表明它是从条分离束的优良候选。在这种特殊情况下，对于更短的煮沸时间(小于15分钟)，0.5M似乎获得了最高量的分离的维管束(图47)。更高的浓度，具体地2M和3M不能将条分离成单一的维管束。最优的束提取获得了最大量的附接至周围软细胞组织的各个分离的维管束获得干净地提取而无周围组织，所述提取似乎大致在0.5-1M的范围内并且煮沸时间在10至20分钟之间。
维管束微观结构：用0.1％的Calcofluor White对维管束染色10分钟。在PDMS模具中，用切片机刀片对HDMC进行横截面切割。在SZX16立体显微镜(1600×1200,ISO100)上在2.5X至10X采集图像。在Fiji(ImageJ)上完成图像处理。将原始图像转化为二值图像，然后用自适应定阈技术设置阈值。用降噪、去除杂点和分水岭(watershed)功能处理图象。然后，将图像分成部分以进行粒径分析。微通道的SEM图象显示在各个通道之间存在连通的孔。这种分析不关注那些结构，因为在亚微米尺度上，孔径分布将小的多。
图48显示了来源于在LiCl的煮沸盐溶液中浸没15分钟的天然组织的CL维管束的粒径分布。对其它处理观察了类似的微观结构分布。在图48A中，用0.1％Calcofluor White对维管束染色并且对图像设阈值并分成部分以用于粒度分析。图48B是维管束直径的柱状图。平均尺寸为23.7±1.5μm。值为平均值和平均值的标准差。
图49-63中所提供的图像总结了在一些酸和过氧化物(图61-63)、盐(图49-56)和碱(图57-60)的处理下的形态。表1-4总结了主要观察和定量结果。表5-8总结了处理后维管束的机械性质。
表1：LiCl处理的天然芹菜的束形态。
Figure BDA0003458122280000891
表2：NaCl处理的天然芹菜的束形态。
Figure BDA0003458122280000892
表3：NaOH处理的天然芹菜的束形态。
Figure BDA0003458122280000893
Figure BDA0003458122280000901
表4：使用不同的乙酸：过氧化物的比值的浸渍的天然芹菜的束形态。
Figure BDA0003458122280000902
表5.在多种浓度下并且煮沸5、10、15、20和30分钟时，酸和过氧化物溶液-处理的CL条的最终产率强度(以MPa为单位)。值为n＝5条±StDev。
Figure BDA0003458122280000903
表6.在多种浓度下并且煮沸5、10、15、20和30分钟时，LiCl-处理的CL条的最终产率强度(以MPa为单位)。值为n＝5条±StDev。
Figure BDA0003458122280000904
Figure BDA0003458122280000911
表7.在多种浓度下并且煮沸5、10、15、20和30分钟时，NaCl-处理的CL条的最终产率强度(以MPa为单位)。值为n＝5条±StDev。
Figure BDA0003458122280000912
表8.在多种浓度下并且煮沸5、10、15、20和30分钟时，NaOH-处理的CL条的最终产率强度(以MPa为单位)。值为n＝5条±StDev。
Figure BDA0003458122280000913
使用本实施例中所述的程序提取的VB可以用于如本文所描述的HDMC的成束中。图64和65显示了从在水中煮沸30min(对照)和在1M NaOH中煮沸30min的分离的CL维管束组装的HDMC。将NaOH束快速脱水并且快速胶粘。在本实施例中，将氰基丙烯酸酯胶水用于使HDMC成束。
实施例10：用于HDMC产生的完整维管束微通道从天然或去细胞化维管束植物的基于液体的提取的方法和程序的替代实施例
程序：
1.将芹菜切成1-英寸部分，随后在曼陀琳厨房切片机上切片；
2.将～50-60个部分置于用浸渍溶液(参见以下处理溶液1-7)装填至顶部的1L烧杯中直至覆盖所有切片。
3.使溶液达到沸腾(95-100℃)并每5分钟充分混合。
4.在煮沸10分钟后，束开始与其余的条分离。
5.在浸渍完成后，从浸渍溶液除去样品，并用蒸馏水清洗几次直至除去乙酸和过氧化物。
据观察在提高煮沸时间后，观察到更多束与其余的切片分离，然而，由于煮沸时间提高，观察到束软化。图66中显示了在稀释的乙酸和过氧化物中煮沸15分钟的浸渍的CL的图象。
另外，测试了多种溶液作为浸渍产物的可能性。这些包括：
处理溶液1：1:1的冰醋酸和30％过氧化氢
处理溶液2：1:1的冰醋酸和过氧化物(如上)，在水中50％稀释
处理溶液3：冰醋酸
处理溶液4：50％稀释的乙酸
处理溶液5：95％的乙醇
处理溶液6：3摩尔氯化钠(NaCl)
处理溶液7：4摩尔盐酸(HCl)
在这些处理中，处理溶液#s 1、2、4、6和7能够除去束，然而浓盐酸在使用点以外破坏所述束并碎成各个部分，因此这种处理条件过强。因此，对于后续测试，将其稀释两倍。
还观察到芹菜和芦笋不需要切片，或者不需要在先的样品制备或者在先的它们向浸渍溶液的添加。对于这两种，一旦从浸渍溶液除去样品，实施大量混合以从所述部分切除束。芹菜和芦笋足够柔软，从而可以从所述束挤出周围组织(在芹菜中比在芦笋中更容易)。从溶液除去长纤维并置于具有蒸馏水的新的烧杯中。然后，通过对样品剧烈混合和手动压碎，同时避免破坏所述束来清洁所述束。在每次通过混合清洗后，除去逐渐增加的周围组织的量(图67)。
如将理解的，如果/根据需要，可以在液体提取/浸渍步骤之前或之后实施去细胞化步骤(如本文所描述的SDS基去细胞化)。
已通过举例说明描述了一种或多种说明性实施方式。本领域技术人员将理解可以在不背离如权利要求中所定义的本发明的范围的情况下做出一些改变和修改。

Claims (145)

1.一种包含至少一个微通道束的支架生物材料，所述微通道束包含分离自植物或真菌组织的多个去细胞化微通道，所述去细胞化微通道在所述束内彼此基本平行布置。
2.根据权利要求1所述的支架生物材料，其中所述去细胞化微通道包含去细胞化木质部和/或韧皮部通道。
3.根据权利要求2所述的支架生物材料，其中所述去细胞化木质部和/或韧皮部通道单独分离自植物或真菌组织，在分离自植物或真菌组织的一个或多个维管束中聚集，或它们的任意组合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的支架生物材料，其中所述多个去细胞化微通道在所述束内胶粘在一起。
5.根据权利要求4所述的支架生物材料，其中所述多个去细胞化微通道在所述束内通过生物相容性的，任选地生物可降解的，任选地小体积膨胀的胶水胶粘在一起。
6.根据权利要求5所述的支架生物材料，其中所述生物相容性的胶水包含PEG基、聚氨脂基、明胶基或者纤维蛋白基胶水。
7.根据权利要求6所述的支架生物材料，其中所述生物相容性的胶水包含纤维蛋白基胶水。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的支架生物材料，其中所述去细胞化微通道是纤维素基、几丁质基、木质素基、半纤维素基或者果胶基的，或它们的任意组合。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的支架生物材料，其中所述束内的去细胞化微通道的密度大于所述植物或真菌组织内的微通道密度。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的支架生物材料，其中所述植物或真菌组织包括来自以下各项的含有微通道的组织：苹果隐头花序(Malus pumila)组织、蕨(Monilophytes)组织、萝卜(Brassica rapa)根组织、银杏分枝组织、马尾草(equisetum)组织、萱草杂交叶组织、羽衣甘蓝(Brassica oleracea)茎组织、针叶树花旗松(Pseudotsuga menziesii)组织、仙人掌果(pitaya)肉组织、斑状长春花组织、水生莲花(Nelumbo nucifera)组织、郁金香(Tulipa gesneriana)花瓣组织、车前草(Musa paradisiaca)组织、西兰花(Brassicaoleracea)茎组织、枫叶(Acer psuedoplatanus)茎组织、甜菜(Beta vulgaris)初生根组织、葱(Allium cepa)组织、兰科(Orchidaceae)组织、萝卜(Brassica rapa)茎组织、韭葱(Allium ampeloprasum)组织、枫树(Acer)树枝组织、芹菜(Apium graveolens)组织、葱(Allium cepa)茎组织、松树组织、芦荟组织、西瓜(Citrullus lanatus var.lanatus)组织、草甸排草(Lysimachia nummularia)组织、仙人掌组织、北极剪秋罗组织、大黄(Rheumrhabarbarum)组织、南瓜果肉(Cucurbita pepo)组织、龙血树(Asparagaceae)茎组织、紫露草(Tradescantia virginiana)茎组织、芦笋(Asparagus officinalis)茎组织、蘑菇(Fungi)组织、茴香(Foeniculum vulgare)组织、玫瑰(Rosa)组织、胡萝卜(Daucus carota)组织或梨(Pomaceous)组织，或者通过直接基因组修饰或者通过选择育种产生的遗传改变的组织，或它们的任意组合。
11.根据权利要求1-9中任一项所述的支架生物材料，其中所述植物或真菌组织包含芹菜、芦笋或两者。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的支架生物材料，还包括位于所述去细胞化微通道中的至少一种去细胞化微通道上和/或内的活细胞，具体地非天然细胞。
13.根据权利要求12所述的支架生物材料，其中所述活细胞是动物细胞。
14.根据权利要求13所述的支架生物材料，其中所述活细胞是哺乳动物细胞。
15.根据权利要求14所述的支架生物材料，其中所述活细胞是人细胞。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的支架生物材料用于以下各项的用途：支持动物或植物细胞生长；促进组织再生；促进血管生成；脊髓损伤治疗和/或修复；植物或动物组织的修复或重建或置换；溶液或材料过滤和/或分离；植物修饰或生长调节；材料输送；模拟所期望的形状或对象的组装件；和/或微流体；或者其中生物相容的微米级通道可以是有用的任何适合的应用。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述支架生物材料用于植物或动物组织的修复或重建或置换，其中所述植物或动物组织包括受损的微维管系统，或者通过维管疾病(如萎蔫病)破坏的植物组织或者昆虫(如白蜡树蛀虫)感染的树的受损的维管结构。
18.根据权利要求16或17所述的用途，其中所述支架生物材料用于植物或动物组织的修复或重建，其中所述植物或动物组织包括受损的微维管系统，其中血管生成受损或被损坏。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的用途，其中所述支架生物材料用于动物组织的修复或重建，其中所述动物是人。
20.根据权利要求16所述的用途，其中所述支架生物材料用于植物修饰或生长调节，其中所述修饰是用于加速生长的移植过程的修饰。
21.根据权利要求16所述的用途，其中所述支架生物材料用于材料输送，其中所述材料输送是药物递送应用。
22.根据权利要求16所述的用途，其中所述支架生物材料用于热传递或热交换微流体。
23.一种用于支持细胞生长的方法，所述方法包括：
提供如权利要求1-15中任一项所定义的支架生物材料；和
将一个或多个细胞引入至所述支架生物材料。
24.一种用于促进组织再生；促进血管生成；脊髓损伤的治疗和/或修复；或者植物或动物组织的修复或重建或置换的方法，所述方法包括：
提供如权利要求1-15中任一项所定义的支架生物材料；和
将所述支架生物材料植入对其有需要的位点。
25.一种用于溶液或材料过滤和/或分离的方法，所述方法包括：
提供如权利要求1-15中任一项所定义的支架生物材料；和
使溶液或材料流动通过所述支架生物材料，从而基于尺寸排阻从所述溶液过滤和/或分离组分。
26.一种用于植物修饰或生长调节的方法，所述方法包括：
提供如权利要求1-15中任一项所定义的支架生物材料；和
将所述支架生物材料移植到所述植物中以提供加速生长。
27.一种用于材料输送的方法，所述方法包括：
提供如权利要求1-15中任一项所定义的支架生物材料；和
使用所述支架生物材料将材料输送至对其有需要的位点。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述材料是药物，并且所述支架生物材料用于药物递送。
29.一种用于制备模拟所期望的形状或对象的结构的方法，所述方法包括：
提供如权利要求1-15中任一项所定义的支架生物材料；
雕刻或布置所述支架生物材料以模拟所期望的形状或对象；和
任选地，将所述支架生物材料胶粘以用于结构加固。
30.一种用于在微流体过程中交换或传递热的方法，所述方法包括：
提供如权利要求1-15中任一项所定义的支架生物材料；和
使用所述支架生物材料的所述微通道来携带一种或多种流体，其中所述一种或多种流体极为贴近以允许热交换或热传递。
31.一种用于来自植物或真菌组织的微通道的分离和去细胞化的方法，所述方法包括：
从所述植物或真菌组织分离微通道；和
使所述微通道去细胞化；和
任选地，将所述微通道灭菌。
32.根据权利要求31所述的方法，其中分离所述微通道的步骤包括所述微通道或含有所述微通道的维管束或两者从周围植物或真菌组织的机械分离。
33.根据权利要求32所述的方法，其中通过温和剥离或者通过切割实施分离步骤。
34.根据权利要求32所述的方法，其中通过所述微通道的液基提取从所述植物或真菌组织实施分离步骤。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述液基提取包括酸提取、酸和过氧化物提取、盐提取或碱提取中的至少一种。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述酸和过氧化物提取包括在酸和过氧化物溶液中加热所述植物或真菌组织。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述酸和过氧化物溶液包括3:1至1:3的比值的冰醋酸和30％的过氧化氢。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述酸和过氧化物溶液包括1:1的冰乙酸：过氧化氢溶液(30％v/v)。
39.根据权利要求36-38中任一项所述的方法，其中所述加热包括加热达30分钟。
40.根据权利要求39所述的方法，其中加热包括加热30分钟。
41.根据权利要求36-40中任一项所述的方法，其中加热包括使酸和过氧化物溶液沸腾。
42.根据权利要求36所述的方法，其中所述酸和过氧化物溶液包括1:1的冰乙酸：过氧化氢溶液(30％v/v)，并将所述溶液加热至沸腾30分钟。
43.根据权利要求36-42中任一项所述的方法，其中所述液基提取还包括将所述植物或真菌组织在所述酸和过氧化物溶液中机械搅动，例如，搅拌。
44.根据权利要求35所述的方法，其中所述盐提取包括在盐溶液中加热所述植物或真菌组织。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述盐溶液包括LiCl或NaCl。
46.根据权利要求44-45中任一项所述的方法，其中所述盐溶液具有约0.5M-3M的盐浓度。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述盐溶液包括约3M盐浓度的LiCl或NaCl。
48.根据权利要求44-47中任一项所述的方法，其中加热包括加热达30分钟。
49.根据权利要求48所述的方法，其中加热包括加热30分钟。
50.根据权利要求44-49中任一项所述的方法，其中加热包括使所述盐溶液沸腾。
51.根据权利要求44所述的方法，其中所述盐溶液包括约3M LiCl，并且将所述溶液加热至沸腾30分钟。
52.根据权利要求44所述的方法，其中所述盐溶液包括约3M NaCl，并且将所述溶液加热至沸腾15分钟。
53.根据权利要求44-52中任一项所述的方法，其中所述液基提取还包括将所述植物或真菌组织在所述盐溶液中机械搅动，例如，搅拌。
54.根据权利要求35所述的方法，其中所述碱提取包括在碱溶液中加热所述植物或真菌组织。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述碱溶液具有约0.5-3M的碱浓度。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述碱溶液包括氢氧化钠(NaOH)。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述碱溶液包括约0.5M-1M的碱浓度的氢氧化钠。
58.根据权利要求54-57中任一项所述的方法，其中加热包括加热达30分钟。
59.根据权利要求58所述的方法，其中加热包括加热30分钟。
60.根据权利要求54-59中任一项所述的方法，其中加热包括使所述碱溶液沸腾。
61.根据权利要求54所述的方法，其中所述碱溶液包括约0.5MNaOH，并且将所述溶液加热至沸腾5分钟。
62.根据权利要求54-61中任一项所述的方法，其中所述液基提取还包括将所述植物或真菌组织在所述碱溶液中机械搅动，例如，搅拌。
63.根据权利要求35所述的方法，其中所述酸提取包括在酸溶液中加热所述植物或真菌组织。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述酸溶液包括乙酸或盐酸。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述酸溶液包括50％的乙酸。
66.根据权利要求63-65中任一项所述的方法，其中加热包括加热达30分钟。
67.根据权利要求66所述的方法，其中加热包括加热30分钟。
68.根据权利要求63-67中任一项所述的方法，其中加热包括使所述酸溶液沸腾。
69.根据权利要求63所述的方法，其中所述酸溶液包括50％的乙酸，并且将所述溶液加热至沸腾30分钟。
70.根据权利要求63-69中任一项所述的方法，其中所述液基提取还包括将所述植物或真菌组织在所述酸和溶液中机械搅动，例如，搅拌。
71.根据权利要求34-70中任一项所述的方法，其中去细胞化步骤发生在分离步骤之前。
72.一种用于制备支架生物材料的方法，所述方法包括：
从植物或真菌组织分离微通道，或者提供已从植物或真菌组织分离的微通道；
使所述微通道去细胞化；
将所述微通道束在一起，所述微通道彼此基本平行布置；
借此提供包含成束的微通道的支架生物材料。
73.根据权利要求72所述的方法，其中分离所述微通道的步骤包括所述微通道或含有所述微通道的维管束或两者从周围植物或真菌组织的机械分离。
74.根据权利要求73所述的方法，其中通过温和剥离或者通过切割实施分离步骤。
75.根据权利要求72所述的方法，其中通过所述微通道的液基提取从所述植物或真菌组织实施分离步骤。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述液基提取包括酸提取、酸和过氧化物提取、盐提取或碱提取中的至少一种。
77.根据权利要求76所述的方法，其中酸和过氧化物提取包括在酸和过氧化物溶液中加热所述植物或真菌组织。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述酸和过氧化物溶液包括3:1至1:3的比值的冰醋酸和30％的过氧化氢。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述酸和过氧化物溶液包括1:1的冰乙酸：过氧化氢溶液(30％)。
80.根据权利要求77-79中任一项所述的方法，其中加热包括加热达30分钟。
81.根据权利要求80所述的方法，其中加热包括加热30分钟。
82.根据权利要求77-81中任一项所述的方法，其中加热包括使所述酸和过氧化物溶液沸腾。
83.根据权利要求77所述的方法，其中所述酸和过氧化物溶液包括1:1的冰乙酸：过氧化氢溶液(30％v/v)，并将所述溶液加热至沸腾30分钟。
84.根据权利要求77-83中任一项所述的方法，其中所述液基提取还包括将所述植物或真菌组织在所述酸和过氧化物溶液中机械搅动，例如，搅拌。
85.根据权利要求76所述的方法，其中盐提取包括在盐溶液中加热所述植物或真菌组织。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述盐溶液包括LiCl或NaCl。
87.根据权利要求85-86中任一项所述的方法，其中所述盐溶液具有约0.5M-3M的盐浓度。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述盐溶液包括约3M盐浓度的LiCl或NaCl。
89.根据权利要求85-88中任一项所述的方法，其中加热包括加热达30分钟。
90.根据权利要求89所述的方法，其中加热包括加热30分钟。
91.根据权利要求85-90中任一项所述的方法，其中加热包括使所述盐溶液沸腾。
92.根据权利要求85所述的方法，其中所述盐溶液包括约3M LiCl，并且将所述溶液加热至沸腾30分钟。
93.根据权利要求85所述的方法，其中所述盐溶液包括约3M NaCl，并且将所述溶液加热至沸腾15分钟。
94.根据权利要求85-93中任一项所述的方法，其中所述液基提取还包括将所述植物或真菌组织在所述盐溶液中机械搅动，例如，搅拌。
95.根据权利要求76所述的方法，其中碱提取包括在碱溶液中加热所述植物或真菌组织。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述碱溶液包括氢氧化钠(NaOH)。
97.根据权利要求95-96中任一项所述的方法，其中所述碱溶液具有约0.5-3M的碱浓度。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述碱溶液包括约0.5M-1M的碱浓度的氢氧化钠。
99.根据权利要求95-98中任一项所述的方法，其中加热包括加热达30分钟。
100.根据权利要求99所述的方法，其中加热包括加热30分钟。
101.根据权利要求95-100中任一项所述的方法，其中加热包括使所述碱溶液沸腾。
102.根据权利要求95所述的方法，其中所述碱溶液包括约0.5MNaOH，并且将所述溶液加热至沸腾5分钟。
103.根据权利要求95-102中任一项所述的方法，其中所述液基提取还包括将所述植物或真菌组织在所述碱溶液中机械搅动，例如，搅拌。
104.根据权利要求76所述的方法，其中所述酸提取包括在酸溶液中加热所述植物或真菌组织。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述酸溶液包括乙酸或盐酸。
106.根据权利要求104-105所述的方法，其中所述酸溶液包括50％的乙酸。
107.根据权利要求104-106中任一项所述的方法，其中加热包括加热达30分钟。
108.根据权利要求107所述的方法，其中加热包括加热30分钟。
109.根据权利要求104-108中任一项所述的方法，其中加热包括使所述酸溶液沸腾。
110.根据权利要求104所述的方法，其中所述酸溶液包括50％的乙酸，并且将所述溶液加热至沸腾30分钟。
111.根据权利要求104-110中任一项所述的方法，其中所述液基提取还包括将所述植物或真菌组织在所述酸和溶液中机械搅动，例如，搅拌。
112.根据权利要求76-111中任一项所述的方法，其中所述去细胞化步骤发生在分离步骤之前。
113.根据权利要求72-112中任一项所述的方法，其中成束的步骤包括将所述微通道胶粘在一起。
114.根据权利要求113所述的方法，其中通过生物相容性的，任选地生物可降解的胶水将所述微通道胶粘在一起。
115.根据权利要求114所述的方法，其中所述生物相容性的胶水包含PEG基、聚氨脂基、明胶基或者纤维蛋白基胶水。
116.根据权利要求115所述的方法，其中所述生物相容性的胶水包含纤维蛋白基胶水。
117.根据权利要求72-116中任一项所述的方法，其中成束的步骤包括模制所述微通道。
118.根据权利要求117所述的方法，其中使用其中压紧了所述微通道的模具来进行模制。
119.根据权利要求118所述的方法，其中所述模具包括生物医学级硅酮。
120.根据权利要求118或119所述的方法，其中所述模具包括其中用于容纳所述微通道的通道，所述通道具有向其中将要模制的所述微通道赋予的横截面尺寸。
121.根据权利要求118-120中任一项所述的方法，其中将所述模具分成两个或更多个部分，所述部分可以围绕所述微通道组装以用于模制。
122.根据权利要求118-121中任一项所述的方法，其中将胶水添加至面向所述微通道的所述模具的表面，并且在所述胶水固化的同时可以将所述微通道在所述模具中压紧并在其中保持。
123.根据权利要求122所述的方法，其中所述模具包括第一部分和第二部分，并且所述模制包括向面向所述微通道的所述第一部分的表面和面向所述微通道的所述第二部分的表面添加胶水；将所述微通道放置在所述第一部分和所述第二部分中，与所述胶水接触；向所述第一部分中的所述微通道的暴露表面、所述第二部分中的所述微通道的暴露表面或两者添加胶水；相对于所述第一部分，将具有微通道的所述第二部分安装在所述第一部分的所述微通道的所述暴露表面上，借此组装所述模具；使所述胶水基本固化；并除去所述模具。
124.根据权利要求72-123中任一项所述的方法，还包括将所述成束的微通道切割成所期望的长度的步骤。
125.根据权利要求118-123中任一项所述的方法，还包括将所述成束的微通道切割成所期望的长度的步骤，其中在除去所述模具前实施切割步骤。
126.根据权利要求72-125中任一项所述的方法，其中所述方法还包括灭菌所述微通道的步骤。
127.根据权利要求31-33或126中任一项所述的方法，其中灭菌步骤包括将所述微通道暴露于乙醇，或者乙醇和水的混合物。
128.根据权利要求31-127中任一项所述的方法，其中所述微通道包含木质部和/或韧皮部通道。
129.根据权利要求31-128中任一项所述的方法，其中所述去细胞化微通道是纤维素基、几丁质基、木质素基、半纤维素基或者果胶基的，或它们的任意组合。
130.根据权利要求31-129中任一项所述的方法，其中所述束内的去细胞化微通道的密度大于所述植物或真菌组织内的微通道密度。
131.根据权利要求31-130中任一项所述的方法，其中所述植物或真菌组织包括来自以下各项的含有微通道的组织：苹果隐头花序(Malus pumila)组织、蕨(Monilophytes)组织、萝卜(Brassica rapa)根组织、银杏分枝组织、马尾草(equisetum)组织、萱草杂交叶组织、羽衣甘蓝(Brassica oleracea)茎组织、针叶树花旗松(Pseudotsuga menziesii)组织、仙人掌果(pitaya)肉组织、斑状长春花组织、水生莲花(Nelumbo nucifera)组织、郁金香(Tulipa gesneriana)花瓣组织、车前草(Musa paradisiaca)组织、西兰花(Brassicaoleracea)茎组织、枫叶(Acer psuedoplatanus)茎组织、甜菜(Beta vulgaris)初生根组织、葱(Allium cepa)组织、兰科(Orchidaceae)组织、萝卜(Brassica rapa)茎组织、韭葱(Allium ampeloprasum)组织、枫树(Acer)树枝组织、芹菜(Apium graveolens)组织、葱(Allium cepa)茎组织、松树组织、芦荟组织、西瓜(Citrullus lanatus var.lanatus)组织、草甸排草(Lysimachia nummularia)组织、仙人掌组织、北极剪秋罗组织、大黄(Rheumrhabarbarum)组织、南瓜果肉(Cucurbita pepo)组织、龙血树(Asparagaceae)茎组织、紫露草(Tradescantia virginiana)茎组织、芦笋(Asparagus officinalis)茎组织、蘑菇(Fungi)组织、茴香(Foeniculum vulgare)组织、玫瑰(Rosa)组织、胡萝卜(Daucus carota)组织或梨(Pomaceous)组织或者通过直接基因组修饰或者通过选择育种产生的遗传改变的组织，或它们的任意组合。
132.根据权利要求31-131中任一项所述的方法，其中所述植物或真菌组织包含芹菜、芦笋或两者。
133.根据权利要求31-132中任一项所述的方法，其中使所述微通道去细胞化的步骤包括通过热冲击去细胞化、去污剂处理、渗透性冲击、冻干、物理溶胞、电学破裂或酶促消化或它们的任意组合去细胞化，借此除去细胞材料和核酸以提供去细胞化微通道。
134.根据权利要求133所述的方法，其中所述去细胞化步骤包括用十二烷基硫酸钠(SDS)处理。
135.根据权利要求134所述的方法，其中通过使用二价盐水溶液除去残余的SDS以使得从所述微通道中沉淀出含有SDS胶束的盐残余物。
136.根据权利要求135所述的方法，其中将dH2O、DI水、乙酸、DMSO或者超声处理或它们的任意组合用于除去所述二价盐水溶液、所述盐残余物和/或所述SDS胶束。
137.根据权利要求136所述的方法，其中所述二价盐水溶液的二价盐包括MgCl2或CaCl2。
138.根据权利要求137所述的方法，其中所述去细胞化步骤包括用约0.1％或约1％SDS在水中的SDS溶液处理，并且在使用约100mM浓度的CaCl2水溶液去细胞化后，除去残余SDS，然后在dH2O或DI水中培育。
139.根据权利要求31-138中任一项所述的方法，还包括将所述活的植物或动物细胞引入所述微通道的步骤。
140.根据权利要求139所述的方法，其中所述活细胞是哺乳动物细胞。
141.根据权利要求140所述的方法，其中所述活细胞是人细胞。
142.通过权利要求31-63或127-141中任一项所述的方法所产生的去细胞化微通道。
143.一种通过权利要求34-141中任一项所述的方法产生的支架生物材料。
144.根据权利要求143所述的支架生物材料，其是如权利要求1-15中任一项所定义的支架生物材料。
145.一种试剂盒，包含以下中的一个或多个：
模具；
胶水；
一个或多个微通道；
一种或多种去细胞化试剂；
手术刀或切片机；
无菌测量装置；
无菌盐水；
镊子；和/或
用于实施如权利要求23-141中任一项所定义的方法的说明书。
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