WO2017009346A1 - Chitosane pour mélange avec un fluide coagulable - Google Patents

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WO2017009346A1
WO2017009346A1 PCT/EP2016/066559 EP2016066559W WO2017009346A1 WO 2017009346 A1 WO2017009346 A1 WO 2017009346A1 EP 2016066559 W EP2016066559 W EP 2016066559W WO 2017009346 A1 WO2017009346 A1 WO 2017009346A1
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WO
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chitosan
formulation
solution
composition
salt
Prior art date
Application number
PCT/EP2016/066559
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Inventor
Mickaël CHAUSSON
Pierre DOUETTE
Sandrine Gautier
Original Assignee
Kiomed Pharma
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Publication date
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    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
    • A61L2400/06—Flowable or injectable implant compositions
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    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/06—Materials or treatment for tissue regeneration for cartilage reconstruction, e.g. meniscus

Definitions

  • the present invention relates to the field of implantable compositions for repairing a tissue defect and a joint defect, and in particular cartilage.
  • the compositions may be implanted or injected onto a cartilage lesion that has been debrided and has undergone a microfracture procedure that involves puncturing microtunnels to stimulate the bone marrow.
  • Chitosan is a polysaccharide well known in the prior art. It is a copolymer composed of glucosamine units, deacetylated, and N-acetyl-glucosamine (acetylated) units.
  • the properties of chitosan vary in particular according to the structure of the polymer, and in particular its molecular weight, reflected by its dynamic viscosity, for example.
  • Chitosan presents formulation difficulties because it is soluble at acidic pH, less than 6, but insoluble at pH higher than this value.
  • Glycerophosphate solutions mixed with a high molecular weight chitosan have a temperature-dependent sol-gel transition and can gel during the transition from a temperature of about 4 ° C to a temperature of about 40 ° C. ° C.
  • the concentrations of chitosan used are about 2% by weight. Coagulation times are at best 5 minutes with human blood (see Example 2, and Figure 5). It can be noted by comparing Tables 3 and 6 that the clotting time on human blood can be very different from that obtained on animal blood, in this case the time of coagulation with human blood is clearly greater than the time of clotting. coagulation with rabbit blood (from one to five times). This document does not describe how to prepare other chitosan and blood compositions with rapid clotting time. This document does not describe how to prepare a clot that spreads easily when applied to the surface of a fabric that is not arranged in a horizontal plane. This document suggests that clots break up into at least two fragments (Tables 3 and 7).
  • the molecular weight of chitosan does not appear to have any effect in the presence of NaCl, but it appears to influence the clot formation time in the presence of GP, the best results being obtained for a high molecular weight, ie a molecular mass of 232kDa and 298 kDa (see Example 2, Tables 9, 11, 13 and 15).
  • a chitosan molecular weight of less than 232 kDa the coagulation time with rabbit blood is greater than 12 minutes in the presence of an organic salt, according to FIGS. 3 and 5. This would justify the molecular weight value of the recommended chitosan by the application WO 201 1/060545 (232kDa according to the examples).
  • the chitosan concentrations used in WO 201 1/060544 are less than 2% (tables, examples).
  • the clots are evaluated with freshly collected blood in the rabbit, which does not allow to conclude on the coagulation time or the mechanical properties of a chitosan / human blood mixture.
  • This document does not describe how to prepare other chitosan-based compositions having a rapid coagulation time, nor how to improve the coagulation time especially of a coagulable human fluid.
  • This document does not describe how to prepare a clot that spreads easily when applied to a fabric that is not arranged in a horizontal plane. This document suggests that clots break up into at least two fragments (Tables 10, 12, 14 and 16).
  • coagulation times described in the presence of a composition comprising chitosan and an organic salt are greater, largely, at 20 minutes.
  • Such clot formation time is not desired by a clinical practitioner, usually the surgeon, when he is to inject such a composition into a tissue of a patient. It is therefore appropriate to limit the coagulation time of a formulation of chitosan mixed with human blood.
  • This document does not describe how to prepare other chitosan-based compositions with rapid clotting time, or how to improve coagulation time.
  • This document does not describe how to prepare a clot that spreads easily when applied to a fabric, including a fabric that is not arranged in a horizontal plane. This document aims to provide compositions at physiological pH (pH 7).
  • This document does not indicate how to prevent a clot fragmenting and also does not describe how to obtain a clot which is not pre-solidified, in particular to allow the injection of blood-chitosan mixture through a needle in the case of an arthroscopic implantation procedure.
  • the patent application WO 201 1/060553 describes a teaching close to the aforementioned patent applications (WO 201 1/060545, WO 201 1/060544, and WO 201 1/060554), but relates to compositions in two parts, one of which comprising chitosan, the other the organic salt (glycerophosphate). It describes compositions comprising up to 2.5% chitosan (on page 8). Feasibility studies include 2-part compositions comprising chitosan with a molecular weight greater than 300 kDa (Table 3) and concentrations of 1.5% chitosan in solution (Table 6).
  • the concentrations of chitosan used in mixture with human blood are less than 2% by mass relative to the mass of the chitosan solution.
  • This document does not describe how to prepare other chitosan-based compositions with rapid clotting time, or how to improve coagulation time.
  • This document does not describe how to prepare a clot that spreads easily when applied to a fabric that is not arranged in a horizontal plane. This document does not indicate whether the clots are fragmenting and does not address the specific problem of providing both homogeneous mixtures prior to coagulation and clots with both rapid coagulation and integrity, not retracted, no fragmented, resistant to compression and deformation.
  • the patent application WO 02/00272 describes a composition and a method for repairing and regenerating cartilage or other tissues.
  • This application teaches pages 15 and 16 that it is known to mix a chitosan with a glycerophosphate, chitosan having a concentration of 0.5 to 3% and a high molecular mass (several hundred kDa) especially to avoid the precipitation of chitosan at pH greater than 6.2.
  • This document also teaches (page 16) that chitosan can remain in the soluble state at physiological pH but that it requires reducing the concentration or the molecular weight and the degree of deacetylation of chitosan (0.1%, 350 kDa, 50%). %).
  • the examples support a chitosan concentration of 1.5% for its applications mixed with blood (Example 4).
  • the concentrations of chitosan solutions used in mixture with human blood are less than 2%.
  • This document does not suggest how to prepare other chitosan-based compositions exhibiting rapid clotting time, or how to improve coagulation time. This document does not describe how to prepare a clot that spreads easily when applied to a fabric that is not arranged in a horizontal plane.
  • thermo-gellable composition based on chitosan. This document does not suggest how to decrease the coagulation time of a mixture of such a composition with blood. This document does not describe how to prepare a clot that spreads easily when applied to a fabric that is not arranged in a horizontal plane.
  • compositions with a high concentration of chitosan have the technical disadvantage, in the presence of an organic salt of sugar or polyol, of gelling at room temperature over time, because of their thermo-gelling character, especially during of their storage.
  • compositions comprising a combination of chitosan and glycerophosphate have a coagulation time generally well above 10 minutes in mixture with blood.
  • the patient In the case for example of the use of such a composition for the regeneration of cartilage, the patient must be operated so that the composition is implanted at the level of defective cartilage. During this operation, the clinical practitioner must wait for the composition containing chitosan mixed with the blood of the patient to coagulate, as described for example by Stanish et al. (Oper Tech Orthop 16: 271, 2006) and Tey et al. (Arthroscopy Techniques 4, 29, 2015), from 15 to 25 minutes. The longer the time, the more the patient is immobilized in the operating room. However, in general, the shortest possible surgical procedures are sought, in particular to minimize personnel costs, to be able to carry out more daily interventions, to avoid the risks of infection related to prolonged exposure to the patient. external environment, etc.
  • the composition may have a texture, and in particular a viscosity that is not suitable.
  • the composition when brought into contact with the cartilage, may not remain in position or even flow.
  • the present invention aims to solve one or preferably many of the technical problems set forth above.
  • the object of the present invention is in particular to solve the technical problem of providing a composition based on chitosan and a coagulable fluid that can be used for tissue regeneration and that has a short coagulation time in the presence of a coagulable fluid, and in particular whole blood.
  • Another object of the present invention is to provide a chitosan-based composition which is homogeneous in the presence of a coagulable fluid, and in particular whole blood, before coagulation.
  • Another object of the present invention is to improve the mechanical properties of the chitosan / coagulable fluid mixture having coagulated and formed a clot, and in particular of the chitosan / blood mixture.
  • the present invention aims to provide a composition based on chitosan and a coagulable fluid having both a rapid coagulation time, good homogeneity, and good mechanical properties, in particular to facilitate implantation on a plane. non-horizontal.
  • the present invention also aims to provide such a composition so that it is easily injectable, in particular through a needle, and more precisely through a needle provided for an arthroscopic procedure.
  • the present invention also aims to provide such a composition meeting the maximum of technical criteria to provide an integral clot, non-retracted, non-fragmented, resistant to compression and deformation.
  • the present invention also aims to provide stable compositions over time.
  • the present invention also aims to provide storage systems and administration of suitable compositions for their manufacture and preservation, and easy to use for the surgeon.
  • the present invention aims in particular to solve these technical problems reliably, industrial and inexpensive.
  • Blood coagulation is a complex phenomenon (primary and secondary hemostasis). Different parameters may positively or negatively affect the coagulation process during clot formation, especially when forming a blood clot. It has been surprisingly discovered by the present inventors that it is possible to solve one or more of the aforementioned technical problems by preparing a composition comprising a mixture of a chitosan formulation and a coagulable fluid, wherein the formulation of chitosan has a concentration of at least 2.5% chitosan by mass relative to the total mass of chitosan formulation, said chitosan having a dynamic viscosity of less than or equal to 60mPa.s, measured in 1% acetic acid (v / v), said composition comprising at least one organic sugar or polyol salt.
  • the coagulation rate is particularly optimized when the concentration of chitosan is greater than or equal to 3% by weight, relative to the mass of the chitosan formulation.
  • composition according to the invention covers, when it refers to the mixture of chitosan and coagulable fluid, both to the fluid composition prior to coagulation of the coagulable fluid in the presence of chitosan, and the coagulated mixture.
  • the composition of the invention relates to the fluid mixture.
  • the composition of the invention relates to the coagulated mixture.
  • chitosan formulation means the solution comprising chitosan, the organic sugar or polyol salt and any other ingredients of the formulation, just before mixing with the coagulable fluid. It is not the “chitosan solution” which means the chitosan solution before it comes into contact with the organic salt of sugar or polyol. Any other meaning is specified specifically, where appropriate, or the context makes this clarification unnecessary.
  • coagulable fluid means a body fluid (or biological) of a mammal, preferably a human being, which can be isolated from the body, for example by means of a syringe of samples, and which coagulates, that is, it ultimately forms a clot, in other words a thrombus.
  • coagulable fluids that may be mentioned in particular: a blood, a plasma, a platelet lysate, a platelet-rich plasma, a plasma rich in platelets without erythrocytes, and mixtures thereof.
  • Blood refers to both whole blood and processed itself blood (that is to say having undergone a technical operation), the venous blood, arterial blood, bone blood, blood to the spinal cord, the umbilical cord blood, placental blood.
  • the coagulable fluid used is preferably a fluid of the subject considered. It is an autologous coagulable fluid.
  • the coagulable fluid can be enriched by amplifying the presence of one or more of its components.
  • a component of the fluid may for example be erythrocytes, leucocytes, lymphocytes, polymorphonuclear cells, monocytes, platelets, fibrinogens, stem cells, thrombin hemoglobin, neutrophils, eosinophils, basophils, a coagulation factor.
  • the coagulable fluid may be supplemented with an exogenous agent, for example one or more coagulation factors, to obtain an optimal coagulation time, and / or the desired mechanical properties, when the coagulable fluid is coagulated, for example a calcium salt.
  • the coagulable fluid may also be supplemented with therapeutic agents.
  • therapeutic substances that may be mentioned are polysaccharides, polypeptides, liposomes, DNAs, antibodies, RNAs, proteins, peptides, extracellular matrix fragments, growth factors, chemotactic factors, cytokines, the factors angiogenic, living cells, for example chondrocytes, osteoblasts, stem cells.
  • human embryonic stem cells are excluded from stem cells.
  • the chitosan formulation according to the invention makes it possible to obtain satisfactory results in terms of retraction of the coagulable fluid clot, in particular clots formed by coagulated blood and chitosan.
  • the chitosan formulation according to the invention makes it possible to obtain satisfactory mechanical properties, especially in terms of spreading and adhesion to the tissue to be repaired, in particular when it is not arranged in a horizontal plane.
  • the inventors have in particular found that when the concentration of chitosan is greater than 2%, the coagulation is not satisfactory if the dynamic viscosity of the chitosan formulation is not in accordance with the present invention.
  • compositions according to the prior art comprising a mixture of chitosan with a molecular mass greater than 200k, in the presence of an organic sugar or polyol salt (glycerophosphate salt) had a viscosity which can lead to problems with the handling of the composition and the blood clot. Indeed, it is difficult to easily prepare a blood / chitosan solution mixture prior to coagulation which is homogeneous, that is to say for which the two parts of the composition are intimately mixed and form an interpenetrating network.
  • the pre-coagulation composition be homogeneous, because the entire surface of the lesion and the microtunnels that are formed in the cartilage lesion can be treated with the same amount of chitosan and blood, to promote formation of new cartilage of good quality over the newly formed volume.
  • compositions of the invention have a dynamic viscosity allowing a good spreading of the composition of chitosan mixed with a coagulable fluid when it is coagulated.
  • the coagulated compositions of the invention also exhibit good adhesion at the site of application, for example on cartilage, and more generally on bone tissue or other tissue.
  • a tissue is a set of similar cells of the same origin, grouped into a functional whole, that is to say, contributing to the same function.
  • Chitosan is for example referenced under the CAS number 9012-76-4.
  • the chitosan used for the invention is advantageously of fungal origin, and preferably derived from the mycelium of a mushroom of the Ascomycete type, and in particular Aspergillus niger, and / or a Basidiomycete fungus, and in particular Lentinula edodes. (shiitake) and / or Agaricus bisporus (Paris mushroom).
  • chitosan is derived from Agaricus bisporus.
  • the chitosan is preferably very pure, that is to say containing few impurities from its fungal origin, and a microbiological quality compatible with its use as an implant or pharmaceutical composition.
  • a method for preparing chitosan is that described, for example, in patents of the family WO 03/068824 (EP 1483299, US 7,556,946, etc.).
  • the average molecular weight of chitosan can be estimated by the dynamic viscosity value of the 1% (w / w) solution of chitosan in 1% (v / v) acetic acid.
  • the "1% (m / m) solution of chitosan” refers to a distilled water solution comprising 1% by weight of chitosan relative to the total mass of the chitosan solution in distilled water.
  • acetic acid to obtain a 1% (w / w) solution of chitosan and 1% (v / v) of acetic acid.
  • the chitosan powder can also be added in an acetic acid solution to reach 1%.
  • Acetic acid 1% (v / v) means a concentration of 1% by volume of acetic acid relative to the volume of the final distilled water solution.
  • the dynamic viscosity is measured using a rotational mobile viscometer, for example a rotational viscometer of the Brookfield brand, for example equipped with a S34 type spindle at a speed adjusted according to of the viscosity by the man of the art of 0.3 to 100tr / min according to the recommendations related to the viscometer, and for example 5 rpm, and at a temperature of 25 ° C.
  • a rotational mobile viscometer for example a rotational viscometer of the Brookfield brand, for example equipped with a S34 type spindle at a speed adjusted according to of the viscosity by the man of the art of 0.3 to 100tr / min according to the recommendations related to the viscometer, and for example 5 rpm, and at a temperature of 25 ° C.
  • the chitosan used according to the invention has, according to the aforementioned measurement method, a dynamic viscosity of between 5 and 60 mPa.s, for example from 5 to 55 mPa.s, when it is in solution at the concentration of 1 % (m / m) in 1% (v / v) acetic acid.
  • the chitosan used according to the invention has a dynamic viscosity of between 5 and 25mPa.s, for example from 8 to 20mPa.s, when it is in solution at a concentration of 1% (m / m). in acetic acid 1% (v / v).
  • the chitosan used according to the invention has an apparent dynamic viscosity of between 26 and 50mPa.s, for example from 30 to 45mPa.s, when it is in solution at the concentration of 1% (m / m ) in acetic acid 1% (v / v).
  • the chitosan can be of different molecular weights, in the molecular weight range according to the present invention.
  • the invention relates to a chitosan having a viscosimetric average molecular weight Mv ranging from 20,000 (20k) to 145,000 (145k).
  • the average viscosity (Mv) molecular weight is between 20,000 (20k) and 120,000 (120k).
  • the average molecular weight in viscosity (Mv) is between 20,000 (20k) and 60,000 (60k).
  • the average molecular weight in viscosity (Mv) is between 60,000 (60k) and 100,000 (100k).
  • the average molecular weight is the viscosity average molecular weight (Mv), calculated from the intrinsic viscosity according to the Mark-Houwink equation.
  • Mv viscosity average molecular weight
  • the intrinsic viscosity is measured by capillary viscosimetry, with a Ubbelohde capillary viscometer, according to the method of the European Pharmacopoeia monograph EP2.2.9.
  • the flow time of the solution is measured through a suitable capillary tube (Lauda, for example the capillary tube Ubbelohde 510 01 with a diameter of 0.53 mm) using an automatic viscometer Lauda Vise, first at the concentration initially in chitosan, then for several dilutions, for example according to the recommendations of method EP2.2.9.
  • the reduced intrinsic viscosity is deduced for each of the concentrations.
  • the reduced viscosity is plotted against the temperature, and the value is extrapolated to the concentration 0 to deduce the viscosity. intrinsic.
  • the reduced viscosity ( ⁇ 2 in ml / g) of the dilutions as a function of the concentration C of the dilutions (g / ml) according to formula 2 should be used.
  • chitosan has a degree of acetylation of between 5 and 50%.
  • the degree of acetylation is expressed as the number of moles of N-acetyl-D-glucosamine units relative to the number of moles of total N-acetyl-D-glucosamine and D-glucosamine units present.
  • the degree of acetylation is between 25 and 40%.
  • the degree of acetylation is between 20 and 30%.
  • the degree of acetylation is between 15 and 25%.
  • the degree of acetylation is between 5 and 20%.
  • the degree of acetylation is from 5 to 20%, and more preferably from 5 to 15%.
  • the degree of acetylation is determined by potentiometric titration. Chitosan is dissolved in a solution of hydrochloric acid. The excess of unreacted hydrochloric acid with the amino functions of chitosan is determined by a standard solution of sodium hydroxide. This gives the number of moles of D-glucosamine unit present in the chitosan and thus by subtraction the degree of acetylation.
  • Chitosan advantageously has a controlled degree of acetylation.
  • chitosan having a controlled degree of acetylation is meant a product whose degree of acetylation, i.e. the proportion of N-acetyl-glucosamine units, can be adjusted in a controlled manner.
  • the invention uses a chitosan having a degree of acetylation of between 5 and 20%, a dynamic viscosity (measured as previously described, with a 1% (w / w) solution of chitosan in 1% (v / v) acetic acid of 5 and 60mPa.s, for example 5 to 55mPa.s.
  • the invention uses a chitosan having a degree of acetylation of between 5 and 20%, and a dynamic viscosity (measured as described above, with a 1% solution (m / m) of chitosan in acetic acid 1% (v / v) of 5 and 25mPa.s, for example from 8 to 20mPa.s.
  • the invention uses a chitosan having a degree of acetylation of between 5 and 15%, and a dynamic viscosity (measured as described above, with a 1% solution (m / m)). of chitosan in acetic acid 1% (v / v) of 5 and 25mPa.s, for example 7 to 20mPa.s.
  • the chitosan is advantageously purified and then preferably dried.
  • the process of the invention may comprise a step of drying the substituted chitosan, and optionally grinding it to obtain a powder.
  • the chitosan can be dried, for example by evaporation of water, for example by a spray-drying (atomization), fluidized bed, vacuum drying or atmospheric pressure, or by freeze-drying.
  • the chitosan may be solubilized in an aqueous solution, and for example in water of acceptable quality for injection or implantation in a body, and in particular a human body.
  • the dissolution of chitosan in an aqueous solution can be promoted by adjusting the pH to a sufficiently acidic pH by the addition of an acid.
  • acetic acid or hydrochloric acid may be used.
  • chitosan is brought to a pH of about 4.5 to 7 in the presence of the acid.
  • the pH can be readjusted, for example, with an organic sugar or polyol salt, for example a glycerophosphate.
  • the aim is a pH of between 4.5 and 8.5, and preferably between 5.5 and 7.5.
  • the pH can be brought to about 7.
  • the chitosan solution or formulation comprises an acid.
  • the acid may be present at a concentration of 0.001 to 0.1 N, for example about 0.01 N.
  • a composition according to the invention having a higher concentration of chitosan than the compositions of the prior art is interesting because of the intrinsic properties of chitosan which are beneficial for the repair of cartilage, as described by Hoemann et al. (Osteoarthritis & Cartilage 15, 78, 2007), Chen et al. (Cartilage 2, 173, 201 1), or Stanish et al. (J Bone Joint Surg 95, 1640, 2013) in combination with a microfracture bone marrow stimulation procedure, or as described by Oprenyeszk et al. (Osteoarthritis Cart 21, 1099, 2013; Plos One 10, 2015). Reference may in particular be made to application WO 201 1/060553 for the various complement activation pathways.
  • the chitosan formulation has a chitosan concentration greater than 2.5% and less than 10% by weight relative to the final solution mass.
  • the concentration of chitosan is greater than or equal to 2.8%, for example greater than or equal to 3%, or even greater than or equal to 3.2% by weight relative to the total weight of the chitosan formulation (m / m).
  • the concentration of chitosan ranges from 2.9 to 3.5% (w / w), expressed in mass relative to the total weight of the chitosan formulation.
  • the concentration of chitosan ranges from 3.6 to 4.5% (w / w), expressed in mass relative to the total weight of the chitosan formulation.
  • the concentration of chitosan ranges from 4.6 to 5.5% (w / w), expressed in mass relative to the total weight of the chitosan formulation.
  • the concentration of chitosan is approximately 3.0%
  • the concentration of chitosan is approximately 4.0% (w / w), expressed in mass relative to the mass of the chitosan formulation.
  • the concentration of chitosan is approximately 5.0% (w / w), expressed in mass relative to the mass of the chitosan formulation.
  • the invention relates to a chitosan formulation and a chitosan solution for preparing said chitosan formulation, said chitosan, having a degree of acetylation of between 5 and 20%, and a dynamic viscosity (measured as as previously described, with a 1% (m / m) solution of chitosan in 1% (v / v) acetic acid) of 5 and 25mPa.s, for example from 8 to 20mPa.s, said chitosan formulation having a chitosan concentration greater than or equal to 3%, or even greater than or equal to 3.2% by weight relative to the total weight of the chitosan formulation (m / m).
  • the invention uses a chitosan formulation and a chitosan solution to prepare this chitosan formulation, said chitosan having a degree of acetylation ranging from 5 to 15% and a dynamic viscosity (measured as as previously described, with a 1% (w / w) solution of chitosan in 1% (v / v) acetic acid) of 5 and 25mPa.s, for example 7 to 20mPa.s., said formulation of chitosan having a chitosan concentration greater than or equal to 2.8%, for example greater than or equal to 3%, or even greater than or equal to or 3.2% by weight relative to the total mass of the chitosan formulation (m / m).
  • the phosphate salts and more particularly the dibasic salts of polyol monohydrogen or sugar. Mention may also be made of sulfate salts, for example polyol monoalphate or sugar salts.
  • the phosphate salts mention may be made especially of dibasic glycerol mono-phosphates, including glycerol-2-phosphate, sn-glycerol-3-phosphate and 1-glycerol-3-phosphate. According to one variant, it is beta-2-glycerophosphate (for example C 3 H 7 O 6 PNa 2 , 5.5 H 2 0, CAS No. 13-408-09-8).
  • polyols and sugars for such salts mention may be made of the following polyols and sugars: histidinol, acetol, diethylstilbestrol, indoleglycerol, sorbitol, ribitol, xylitol, arabinitol, erythritol, inositol, mannitol, glucitol, palmitoylglycerol, linoleoylglycerol , oleoyl-glycerol, arachidonoyl-glycerol, fructose, galactose, ribose, glucose, xylose, rhamnulose, sorbose, erythrulose, deoxy-ribose, ketose, mannose, arabinose, fuculose, fructopyranose, ketoglucose, sedoheptulose
  • the organic polyol salt is a glycerophosphate, and more particularly a salt of disodium beta-glycerophosphate pentahydrate.
  • the concentration of polyol salt or sugar, and preferably glycerol phosphate is between 1 and 20%.
  • the concentration of polyol salt or sugar, and preferably glycerol is between 1 and 15%.
  • the concentration of polyol salt or sugar is from 2% to 5%.
  • the concentration of polyol salt or sugar is between 2% and 10%. The values are expressed in mass relative to the total weight of the chitosan formulation.
  • the glycerol salt is a glycerophosphate, and more specifically a sodium salt, such as, for example, disodium glycerophosphate.
  • the concentration of beta-glycerophosphate (GP) is chosen to adjust the pH to 7.0 ⁇ 0.2 and the osmolarity to 300 ⁇ 25 mOsmol / kg of the chitosan formulation, which are compatible with use in contact with biological tissues, in particular a joint.
  • the final GP concentration in the chitosan formulation is about 2% (w / w).
  • the polyol salt or sugar, and preferably glycerol phosphate can be used to bring the pH to a basic pH, then the pH of the composition is adjusted by the addition of an acid, which has the advantage of providing a composition whose pH is adjustable very easily and accurately.
  • composition according to the invention has a pH greater than or equal to 5.5, and for example a pH of 5.8 to 8.0.
  • the pH is between 5.5 and 7.5, and preferably ranges from 6 to
  • the pH is less than 7.0.
  • the pH of the chitosan formulation is 6 +/-
  • the pH is 7.2 +/- 0.2.
  • the pH is 7.0 +/- 0.2.
  • the pH is measured on the chitosan formulation.
  • the pH is determined by following the method described in the European Pharmacopoeia (EP 2.2.3).
  • the pH meter used is a pH meter from the Sartorius range with a combined glass electrode (PY-P1 1). PH measurements are made between 20 and 25 ° C.
  • the chitosan formulation has an osmolality of 100 to 700mosm / kg, preferably 200 to 500mosm / kg, and still more preferably 300 to 400mosm / kg.
  • the osmolality of the chitosan formulation is between
  • the chitosan formulation exhibits an osmolality that is compatible with a joint.
  • the osmolality of the chitosan formulation be between 250 and 400, and more specifically between 250 and 380mosm / kg.
  • the determination of the osmolality of the solutions is carried out with an automatic micro-osmometer (Osmometer Type 15M from Loser Messtechnik).
  • the equipment is calibrated beforehand with a solution of 300mosm / kg.
  • the sample is placed in a container provided for this purpose, and is put to the standard temperature of the measurement.
  • the composition comprises a buffer, for example an acetate buffer.
  • Buffering agents are known to those skilled in the art.
  • polyols may for example be selected from the group consisting of: isopropanol, sorbitol, mannitol, alkylene glycol such as propylene glycol, poly (alkyl glycol), for example poly (ethylene glycol), fructose, galactose, ribose, glucose, xylose, rhamnulose, sorbose, erythrulose, deoxyribose, ketose, mannose, arabinose, fuculose, fructopyranose, ketoglucose, sedoheptulose, trehalose, tagatose, sucrose, allose, threose, xylulose, hexose, methylthio-ribose, methylthio-deoxy-ribulose
  • the composition comprises at least one reducing sugar, for example mannitol.
  • the present invention relates to a chitosan formulation
  • a chitosan formulation comprising at least 2% by weight of chitosan, and preferably from 1 to 10% of polyol salt or of sugar, for example of glycerophosphate, and optionally from 0.1 to 20% reducing sugar.
  • the chitosan formulation comprises from 2.8 to 6.5% by weight of substituted chitosan and from 2 to 6% by weight of glycerol, preferably of glycerophosphate, and optionally from 0.1 to 15% by weight of sugar. reducing agent, with respect to the total mass of the composition.
  • the chitosan formulation may also comprise one or more inorganic salts, in addition to the organic polyol or sugar salt.
  • the inorganic salts there may be mentioned for example a sodium salt, a salt of chloride, potassium, calcium, magnesium, phosphate, sulfate, or salt any of their mixtures.
  • the inorganic salt may be potassium chloride, sodium chloride, cesium chloride, calcium chloride, cesium fluoride, potassium perchlorate, sodium nitrate, calcium sulphate, or any of their mixtures.
  • the chitosan formulation comprises a calcium salt, in particular calcium chloride.
  • the invention also relates to a process for preparing a composition or a formulation according to the invention.
  • This process typically comprises:
  • a chitosan in an aqueous solution of a dilute acid, preferably water and a dilute acid, preferably a weak acid, preferably an organic acid, optionally a buffered solution of an acid and a a weak base, preferably at pH between 4.5 and 8.5, and preferably between 5.5 and 7.5;
  • Chitosan solutions without organic sugar or polyol salt can be prepared as follows:
  • an acid solution to adjust the pH, for example at a pH of between 4.5 to 7, and preferably between 4.5 and 6.9, and for example at pH 6,
  • the organic sugar solution of sugar or polyol can be prepared according to the knowledge of the skilled person.
  • the organic sugar solution of sugar or polyol may be added to the chitosan solution after sterilization thereof, for example.
  • the organic sugar solution of sugar or polyol can itself be sterilized, for example by steam autoclaving or by sterilizing filtration.
  • the glycerophosphate - chitosan mixture is produced before sterilization.
  • the dissolution of chitosan is carried out in water comprising a reducing sugar, such as, for example, mannitol.
  • the buffering agent is an acetate buffer.
  • the method also comprises a subsequent step of filling an injection device, such as for example a syringe, with the chitosan formulation or the chitosan solution.
  • an injection device such as for example a syringe
  • the injection device can then undergo steam sterilization.
  • This device for example a syringe, can then be packaged, preferably in a sterile manner.
  • the invention also covers a chitosan or a formulation of chitosan in a dry form, especially in a freeze-dried form.
  • the lyophilized product can be (re) dispersed and preferably solubilized before use.
  • the chitosan may be in dry form, in particular in a freeze-dried form, before it is brought into contact with the organic polyol or sugar salt, which may be in the form of an aqueous solution.
  • the invention relates to a chitosan in dry form, in particular in powder form, for example in freeze-dried form, suitable and intended to be dissolved in a solution comprising at least one organic polyol salt or sugar, such as those above, the resulting formulation being suitable and intended to be brought into contact with a coagulable fluid.
  • the invention therefore relates to a medical device comprising a chamber containing a chitosan in a dry form, in particular in a freeze-dried form, and a chamber containing a solution of at least one organic polyol salt or sugar.
  • one of the chambers of the syringe contains a solid powder from the dried chitosan solution, and the other chamber contains the solution of organic polyol salt or sugar.
  • Such packaging variants make it possible on the one hand to preserve the components of the formulation in a practical and prolonged manner, and to provide a device for simple and rapid preparation of the formulation. These variants make it possible to prevent the composition from gelling spontaneously when it is stored for a long time.
  • the solution or chitosan powder may be disposed in a chamber of a medical device comprising a second chamber comprising a solution of organic polyol salt or sugar.
  • a medical device comprising a second chamber comprising a solution of organic polyol salt or sugar.
  • Such a device may comprise a separation between the chamber comprising the chitosan solution (without the organic polyol salt or sugar) and the chamber comprising the organic polyol salt or sugar solution. This separation may be removed, pierced, or allow contact by any other action or means between the chitosan solution and the organic polyol salt or sugar solution.
  • the invention relates to a medical device comprising a chamber containing the chitosan solution mixed with the organic polyol salt or sugar.
  • the invention relates to a medical device comprising or constituting a chitosan formulation at a concentration of at least 2.5% of mass chitosan with respect to the volume of chitosan formulation, said chitosan having a dynamic viscosity less than or equal to 60mPa.s, measured in 1% (v / v) acetic acid, to be mixed with a coagulable fluid.
  • the invention also relates to a medical device comprising a chitosan composition according to the invention.
  • the invention also relates to a medical device comprising a plurality of containers, said containers being possibly physically independent (“kit-of-part"), characterized in that the medical device comprises at least (i) a container containing a solution or a powder of chitosan, said chitosan having a dynamic viscosity of less than or equal to 60mPa.s, measured in 1% (v / v) acetic acid, and (ii) a container containing a solution of an organic sugar or polyol salt , said chitosan being present in an amount capable of forming a formulation of chitosan and organic sugar or polyol salt in which the chitosan concentration is greater than or equal to 2.5% of mass chitosan with respect to the weight of the formulation of chitosan, the chitosan formulation being formed by contacting the chitosan solution with the solution of an organic sugar or polyol salt.
  • the medical device is a syringe of the double chamber type, pre-filled.
  • Such formulations of chitosan may for example be stored at a temperature below the sol-gel transition temperature.
  • these chitosan solutions are stable for several months, for example at room temperature, or at a refrigerated temperature (generally 4 ° C. to 8 ° C.), and in particular at 4 ° C.
  • the chitosan formulation or the chitosan solution is contacted with the coagulable fluid, and then the assembly is mixed.
  • the initial chitosan solution is contacted with the solution comprising the organic sugar polyol salt, and then the resulting chitosan formulation is mixed with the coagulable fluid, and in particular the blood.
  • the initial chitosan solution is mixed with the coagulable fluid, and in particular the blood, and then the solution of organic polyol salt or sugar is added to the mixture.
  • the mixing with the coagulable fluid can be carried out in the medical device containing the formulation, solution, or chitosan powder (with or without the organic sugar or polyol salt) via a system designed to make this mixture, or in a separate device .
  • the clinical practitioner takes the coagulable fluid by a syringe and then injects this fluid into a bottle containing the formulation, the solution, or the chitosan powder, and then agitates this bottle. The mixture is left to stand or stirred until a satisfactory coagulation.
  • the clinical practitioner takes the coagulated mixture with a spatula to arrange or implant the clot at the desired location.
  • the clinical practitioner takes the coagulable fluid by a syringe and then injects this fluid into a bottle containing the formulation, the solution, or the chitosan powder, and then agitates this bottle.
  • the mixture is injected through a needle under endoscopy before or after coagulation.
  • Before coagulation means before the chitosan / coagulable fluid mixture is coagulated.
  • the present invention relates to a composition
  • a composition comprising or consisting of a mixture of chitosan and coagulable fluid in a coagulable fluid / chitosan volume ratio ranging from 1: 1 to 4: 1, and for example from 2: 1 to 3: 1, this ratio being expressed as a coagulable fluid volume with respect to the volume of chitosan formulation (v / v).
  • the coagulable fluid / chitosan ratio is 3: 1.
  • the present invention more particularly relates to an injectable or implantable composition comprising or consisting of a composition according to the invention.
  • the composition according to the invention is used as a pharmaceutical composition or an injectable or implantable medical device.
  • the present invention allows sterilization, especially sterilization by autoclaving solutions or formulations of chitosan.
  • the chitosan solution or formulation according to the present invention is sterile.
  • the formulation or solution of chitosan according to the present invention (with or without an organic polyol salt or sugar) is sterilized by raising the temperature, preferably under an autoclave.
  • the formulation or solution of chitosan (with or without an organic salt of polyol or sugar) is sterilized by steam, for example by raising the temperature to a temperature greater than 100 ° C., and preferably greater than 100 ° C. 120 ° C, for example between 121 and 138 ° C, under autoclave, for a time sufficient for sterilization, for example in general from 15 to 25 minutes.
  • the chitosan formulations of the invention are transparent or translucent.
  • translucent we mean that we can distinguish an object when placing the formulation of chitosan between the eye of the observer and the object.
  • transparent it is meant that alphanumeric characters can be distinguished when placing the chitosan formulation between the observer's eye and the observed characters. In general, this evaluation is carried out with a thickness of about 1 cm.
  • the chitosan formulation of the invention is colorless, that is to say in particular that an observer with the naked eye does not assign a specific color to the chitosan formulation.
  • the invention particularly relates to articles or packaging, preferably sterile, comprising one or more injection devices pre-filled with a formulation or solution of chitosan (with or without organic polyol salt or sugar). It is typically syringes, one or more chambers and provided with pistons and possibly mixing devices, or bottles for biological use pre-filled.
  • the present invention relates to a composition, formulation, solution or chitosan powder according to the invention, possibly included in a medical device, for its use in a therapeutic treatment method.
  • the invention relates to a composition, formulation, solution or chitosan powder according to the invention, optionally included in a medical device, for its use in a method of therapeutic treatment of an articular disease.
  • the present invention relates more particularly to a composition according to the invention for its use in a method of therapeutic treatment, for example comprising the injection or implantation subcutaneously, intradermally, intraocularly, intraosseous, or intra-articular, of said composition, for example for the repairing or filling at least one body tissue requiring repair or filling.
  • the body tissue is chosen from the tissues belonging to the vocal cords, muscles, ligaments, tendons, cartilages, sexual organs, bones, joints, eyes (cornea), skin (dermis), a periodontal tissue, a maxillary tissue. facial tissue, temporomandibular tissue, abscess, resected tumor, ulcer, or any of their combinations, and more particularly at joint joints.
  • the invention notably allows the treatment of a meniscus.
  • the present invention relates more particularly to a composition according to the invention for its use in a method of treating osteoarthritis, or the repair of a cartilage defect, for example by injection or after mixing with the coagulable fluid and implantation in the cartilage.
  • the present invention relates more particularly to a medical device, for example a medical implant, characterized in that it comprises or consists of a composition according to the invention and optionally a system for mixing the components of the composition and a system of administration of the composition.
  • the present invention may also include one or more additives or excipients for modulating its properties.
  • the composition of the invention comprises a suspension of particles, for example solid or gel particles.
  • the present invention also relates to a composition according to the invention for use as a cellular vector, one or more cell types, and / or one or more active agents. It can be active agents from a pharmaceutical or biological point of view.
  • the composition of the invention may indeed be compatible with the presence of cells, preferably living cells. Among the living cells of interest, there may be mentioned for example chondrocytes (articular cartilage), fibrochondrocytes (meniscus), ligament fibroblasts (ligament), skin fibroblasts (skin), tenocytes (tendons), myofibroblasts (muscle), cells mesenchymal strains, red blood cells (blood) and keratinocytes (skin).
  • the composition of the invention may also be used as a therapeutic vector for the targeted delivery and / or controlled release of at least one therapeutic agent.
  • the chitosan formulation is particularly intended to be mixed with blood or plasma, or a platelet lysate. or platelet-rich plasma, or any coagulable fluid in the presence of the formulation of the invention for example to increase the performance of the product.
  • the present invention thus relates to a method of therapeutic treatment implementing the injection or implantation of a composition according to the present invention.
  • Therapeutic treatment methods cover any use of the composition such as for example those mentioned above.
  • the present invention particularly covers an in situ treatment method and the preparation of the chitosan composition in situ.
  • mixing with a fluidecoagulable can be achieved at the site of implantation or injection, the coagulable fluid being available at this site.
  • the invention also relates to the use of a composition according to the invention for the preparation of a pharmaceutical composition for a therapeutic treatment.
  • the invention relates in particular to the treatment of a joint, such as the meniscus.
  • the chitosan formulation is applied directly at the injection or implantation site for coagulation with a coagulable fluid available at the injection or implantation site.
  • composition according to the invention chitosan formulation according to the invention
  • chitosan solution according to the invention or equivalent terms, a composition, a chitosan formulation, or a chitosan solution, respectively, as defined in the present invention, including any of the variants, particular, specific or advantageous embodiments, independently or in any of their combinations, including according to the preferred features.
  • the present invention also covers a method of aesthetic care, in other words non-therapeutic, comprising the injection or implantation of a composition according to the invention.
  • a method of aesthetic care in other words non-therapeutic, comprising the injection or implantation of a composition according to the invention.
  • This is for example the filling of wrinkles or the filling of one or more visible tissue areas damaged, for example following an accident or surgery, for aesthetic purposes.
  • each example has a general scope.
  • Chitosans of different molecular masses are prepared in the following manner: the chitin is suspended in the presence of aqueous sodium hydroxide, then the medium is heated at high temperature for a variable duration depending on the desired molecular weight. The chitosan is then purified by solubilization in acid medium and precipitated in an alkaline medium, washed and dried.
  • the dynamic viscosity of solutions of different fungal and crustacean chitosan of concentration 1% (w / w) in 1% (v / v) acetic acid was determined using a Brookfield rotating mobile viscometer equipped with a Spindle type S34.
  • the viscosimetric average molecular weight (Mv) is also determined by capillary viscometry, and the degree of acetylation by potentiometric titration.
  • the crustacean CS7 reference chitosan has an estimated viscosimetric average molecular weight greater than 400,000, given its solution viscosity of 489mPa.s.
  • the value of the dynamic viscosity at 1% can be used to estimate the molecular weight of a chitosan.
  • Example 2 Dynamic viscosity of solutions of chitosan in acetic acid 1% (v / v) as a function of the chitosan concentration (%, m / m)
  • Chitosans of different molecular masses (prepared according to Example 1) are dissolved in 1% (v / v) acetic acid at concentrations of 0.5% to 5%.
  • the dynamic viscosity is measured using a Brookfield rotating mobile viscometer equipped with an S34 type spindle.
  • H CS12 27 101 307 828 2105 4210 24940 It is understood from Table 2 that the viscosity of the chitosan solutions increases with the concentration of chitosan, especially as the molecular weight is high.
  • the relation between the logarithm of the viscosity and the concentration of chitosan is linear.
  • the slope of the curve of the log of the viscosity as a function of the concentration is all the higher as the molecular weight of the chitosan is high.
  • the inventors have surprisingly put forward that the chitosans of the invention are particularly well suited for preparing blood clots in an easy manner and which are homogeneous, because for high molecular weight chitosans, the chains are too long and likely to have reduced mobility and result in non-homogeneous mixtures of chitosan with the blood before the clot forms, which is not desired.
  • Chitosan of lower molecular weight for example in the 'low' and 'ultra-low' range, make it possible to increase the concentration without compromising the homogeneity of the mixture with the blood.
  • Example 3 Rapid formation of a clot of fresh blood in the presence of chitosan solution of different molecular weights
  • mixtures of chitosan solutions of molecular weight (expressed in terms of viscosity at 1%) and freshly collected blood in human volunteers are formed in order to obtain a homogeneous mixture and a firm clot. flexible, non-retracted and non-fragmented.
  • the clinical objective is that this clot can be easily handled by a surgeon, to affix it on an osteochondral surface, for example a lesion of the cartilage having been previously pierced by microfractures - in the form of microtunnels.
  • the procedure can be done by implantation, called mini-arthrotomy, or by athroscopy, that is to say through a needle under endoscopy, if the lesion can be visualized entirely through the arthroscopic field of vision, as described by Stanish et al. (J Bone Joint Surg Am. 95, 1640, 2013) and Steinwachs et al. (Arthroscopy Techniques 3, 399, 2014).
  • the clot it is advantageous for the clot to be flexible, non-fragmented and resistant so that it can be injected through the needle and positioned homogeneously at the entrance of the microtunnels, in order to fill them and stimulate the regeneration of the cartilage in an equivalent way over the entire lesion.
  • the mixture of the fresh blood of the patient and the chitosan solution is homogeneous before the formation of the clot; indeed, the repair must be done homogeneous over the entire surface of the lesion, that is to say, it is intended that the filling of microtunnels is equivalent to one microtunnel to another and that the amount of the composition (of chitosan mixed with the blood) in contact with the osteochondral surface should be homogeneously distributed.
  • the clot must not break and must be deformable to spread properly on the cartilage surface and not be unhooked during the procedure.
  • a significantly faster clot formation time is sought than that of the chitosan / blood compositions described in the literature or commercially available.
  • a faster formation of the clot is sought than that of the 2.05% CS7 chitosan solution and used as a control in this example.
  • This "control" solution provides a clot in 15 minutes, with a retraction of 0.2%.
  • clot formation duration of less than 10 minutes, ideally less than 5 minutes, while having a clot in one part (without fragment, maintaining its integrity), which does not retract and which resists manual compression.
  • it is therefore characterized only clots whose training time is less than or equal to 10 minutes.
  • the volume ratio of blood to chitosan solution of the mixture is set at 3: 1 (v / v).
  • Chitosan solutions of concentration ranging from 2% to 4% are prepared.
  • Chitosans of variable molecular weight are used, which makes it possible to study the influence of the molecular weight of chitosan on the duration of formation of a complete clot, non-retracted and resistant to manual compression.
  • a solution of beta-glycerophosphate (GP) is prepared by dissolving beta-glycerol-sodium phosphate, pharmaceutical grade water for injection and 1N hydrochloric acid. This solution is then filtered through 0.2 ⁇ . The chitosan is dispersed in this solution, then a volume of glacial acetic acid variable as a function of the chitosan concentration is added to reach a pH of 7.0 ⁇ 0.2. This solution is then sterilized by autoclave. The final GP concentration is 2% (w / w), the pH is 7.0 ⁇ 0.2 and the osmolality is 300 ⁇ 25 mOsmol / kg. Blood sampling and preparation of the blood / chitosan solution mixture:
  • the freshly collected whole blood ie less than 5 minutes before use, is mixed with the solution of chitosan / beta-glycerophosphate (GP) at a volume ratio of 3/1, by mixing 1.5 ml of Chitosan / GP solution and 4.5 ml of blood.
  • the blood / chitosan mixture is then slightly agitated manually for 10 seconds.
  • the clots are formed as follows:
  • the tube is then placed in a bath thermostated at 37 ° C without stirring.
  • the appearance of the clots is checked by gently rocking the tube. It is determined visually whether the clot is formed in the center (complete clot), or if only the edges of the clot are solidified, or if the blood is still flowing. The time necessary for the formation of the complete clot is noted.
  • the clot is made with fresh blood without addition of chitosan solution / GP.
  • the clots are allowed to incubate for 1 hour in a thermostated bath at 37 ° C., without stirring. After 1 hour of incubation, the clot has more or less retracted, which causes an expulsion of a certain volume of blood. To determine the rate of retraction, the tube and the clot are weighed together at the outlet of the bath. The liquid expelled from the clot is then removed using a glass syringe with a needle. The tube and the clot are again weighed together. The retraction rate is determined according to the following calculation:
  • the clot with fresh blood shrinks by about 40%.
  • the clots are placed in a petri dish.
  • a compressive force is manually applied to the clot to determine its strength, characterized by visual observation of the effect of compression: release of blood after compression and / or clot fragmentation.
  • the test is always performed by the same person with a substantially identical compressive force.
  • the ability of the clot to be extended over a surface to be treated without slipping too easily is evaluated by tilting the surface vertically at an angle of about 60 ° to the horizontal axis.
  • the homogeneity of the blood / chitosan mixture prior to coagulation is simulated and evaluated visually: the chitosan solution is prepared at pH 7.0 or pH 6.0, and a phosphate buffer is added to mimic the addition of blood, in a volume ratio of 1/3 and in a glass tube. It is stirred manually for 10 seconds, and the mixture is observed. If the chitosan formulation is evenly distributed, the mixture is considered homogeneous. If it is observed that the mixture forms some opaque zones and of 'gelatinous' consistency, it is considered that the mixture is not homogeneous. If it is observed that the mixture forms many opaque areas of gelatinous consistency, it is considered that the mixture is non-homogeneous.
  • Example 4 Influence of the concentration of the low molecular weight chitosan solution on the clot formation time
  • the influence of the low molecular weight chitosan concentration 1% viscosity of 15mPa was studied.
  • s reference chitosan CS2
  • s reference chitosan CS2
  • the formulations of the invention make it possible to provide clots having a coagulation time that is significantly lower (5 minutes) than that of the 2.0% CS7 chitosan control solution, which is 15 minutes.
  • Example 2 shows that the viscosity of the solution of low molecular weight chitosan similar to CS2 does not increase significantly with the concentration in the range studied, which does not compromise the formation of a homogeneous mixture with fresh blood, before clot formation. Maintaining a viscosity of the low chitosan solution further allows easy industrial manufacture, which is not the case for higher molecular weight chitosans, as described in Example 2.
  • the calcium salt, in chloride form (Calcium chloride dehydrate, Merck (ref: 1 .02465.1000)) is added to the chitosan solution to obtain the desired concentration, and then the glycerophosphate is added.
  • This formulation is then mixed with fresh blood the previously described protocol.

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Abstract

L'invention concerne une composition comprenant un mélange d'une formulation de chitosane et d'un fluide coagulable, dans laquelle la formulation de chitosane présente une concentration d'au moins 2,5% de chitosane en masse par rapport à la masse totale de formulation de chitosane, ledit chitosane présentant une viscosité dynamique inférieure ou égale à 60mPa.s, mesurée dans l'acide acétique à 1 % (v/v), ladite composition comprenant au moins un sel organique de sucre ou de polyol. L'invention concerne un dispositif médical.

Description

Chitosane pour mélange avec un fluide coagulable
La présente invention concerne le domaine des compositions implantables pour réparer un défaut tissulaire et un défaut articulaire, et en particulier du cartilage. Par exemple, les compositions peuvent être implantées ou injectées sur une lésion du cartilage ayant été débridée et ayant subi une procédure de microfractures qui consiste à percer des microtunnels pour stimuler la moelle osseuse.
Le chitosane est un polysaccharide bien connu de l'art antérieur. Il s'agit d'un copolymère composé d'unités glucosamine, désacétylées, et d'unités N-acétyle- glucosamine (acétylées). Les propriétés du chitosane varient notamment selon la structure du polymère, et en particulier de sa masse moléculaire, reflété par sa viscosité dynamique par exemple.
Le chitosane présente des difficultés de formulation car il est soluble à pH acide, inférieur à 6, mais insoluble à pH supérieur à cette valeur.
Il est connu que l'ajout de sel organique comme le glycérophosphate de sodium permet de solubiliser le chitosane à pH plus élevée en évitant sa précipitation. Les solutions de glycérophosphate en mélange avec un chitosane de haute masse moléculaire (>200kDa) présentent une transition sol-gel dépendante de la température et peuvent gélifier lors du passage d'une température d'environ 4°C à une température d'environ 40°C.
II est connu de la demande de brevet WO 201 1/060545 de préparer un mélange chitosane/sang présentant une concentration de chitosane décrite comme allant de 1 à 10% en masse et dans lequel le ratio volumique sang/solution de chitosane va de 4 :1 à 1 :1 de manière à former un caillot sous la forme d'une pâte par un mécanisme de coagulation du sang en présence de chitosane. Cette demande de brevet évoque l'utilisation de différents sels organiques ou inorganiques, et se focalise (exemples et modes de réalisation) sur l'utilisation de sels inorganiques. Cette demande préconise l'utilisation d'un chitosane présentant une masse moléculaire supérieur à 200 kDa, et plus spécifiquement de 232kDa. Les concentrations de chitosane utilisées sont d'environ 2% en masse. Les temps de coagulation sont au mieux de 5 minutes avec le sang humain (voir exemple 2, et figure 5). On peut relever en comparant les tableaux 3 et 6 que le temps de coagulation sur le sang humain peut être très différent de celui obtenu sur le sang animal, en l'occurrence ici le temps de coagulation avec le sang humain est nettement supérieur au temps de coagulation avec le sang de lapin (du simple au quintuple). Ce document ne décrit pas comment préparer d'autres compositions à base de chitosane et de sang présentant un temps de coagulation rapide. Ce document ne décrit pas comment préparer un caillot qui s'étale facilement lors de son application sur la surface d'un tissu qui n'est pas disposé selon un plan horizontal. Ce document évoque que les caillots se fragmentent en au moins en deux fragments (tableaux 3 et 7). Par ailleurs, ce document évoque (tableau 8) que les caillots présentant une concentration de 2% de chitosane n'étaient pas homogènes. Il n'est donc pas aisé d'obtenir à la fois une coagulation rapide du caillot de sang qui soit intègre, non rétracté, non fragmenté, résistant à la compression et la déformation.
La demande de brevet WO 201 1 /060544, du même déposant que la demande WO 201 1/060545 (Corporation de l'Ecole Polytechnique de Montréal), décrit la préparation de compositions à base de chitosane pour leur utilisation pour la réparation tissulaire, et se focalise sur une comparaison de formulations avec ou sans glycérophosphate de sodium (en abrégé « GP »), remplacé dans ce cas par un sel de chlorure de sodium tout en ajustant la formulation au pH de 6,6 - voir exemples. Il est étudié notamment l'influence de la masse moléculaire qui varie dans une large gamme (2,7 à 298 kDa). La masse moléculaire du chitosane ne semble pas avoir d'effet en présence de NaCI mais il semble qu'elle influence le temps de formation du caillot en présence de GP, les meilleurs résultats étant obtenus pour une masse moléculaire élevée, soit une masse moléculaire de 232kDa et 298 kDa (voir exemple 2, tableaux 9, 1 1 , 13 et 15). Pour une masse moléculaire du chitosane inférieure à 232kDa le temps de coagulation avec du sang de lapin est supérieur à 12 minutes en présence d'un sel organique, d'après les figures 3 et 5. Ceci justifierait la valeur de masse moléculaire du chitosane préconisée par la demande WO 201 1/060545 (232kDa d'après les exemples). Les concentrations de chitosane utilisées dans WO 201 1/060544 sont inférieures à 2% (tableaux, exemples). Dans tous les exemples de cette demande, les caillots sont évalués avec du sang fraîchement prélevé chez le lapin, ce qui ne permet pas de conclure sur le temps de coagulation ou les propriétés mécaniques d'un mélange chitosane/sang humain. Ce document ne décrit pas comment préparer d'autres compositions à base de chitosane présentant un temps de coagulation rapide, ni comment améliorer le temps de coagulation en particulier d'un fluide humain coagulable. Ce document ne décrit pas comment préparer un caillot qui s'étale facilement lors de son application sur un tissu qui n'est pas disposé selon un plan horizontal. Ce document évoque que les caillots se fragmentent en au moins en deux fragments (tableaux 10, 12, 14 et 16). Par ailleurs, ce document évoque que l'homogénéité des mélanges chitosane/sang est variable. Il n'est donc pas aisé d'obtenir à la fois une coagulation rapide du caillot de sang qui soit intègre, non rétracté, non fragmenté, résistant à la compression et la déformation et au départ d'un mélange homogène de manière aisément reproductible. La demande de brevet WO 201 1 /060554, du même déposant que la demande WO 201 1/060545 (Corporation de l'Ecole Polytechnique de Montréal), décrit la préparation de compositions à base de chitosane pré-solidifiées pour leur utilisation pour la réparation tissulaire. Les concentrations de chitosane utilisées dans WO 201 1/060554 sont inférieures à 2% (tableaux, exemples). Les temps de coagulation décrit en présence d'une composition comprenant du chitosane et un sel organique sont supérieurs, largement, à 20 minutes. Une telle durée de formation du caillot n'est pas souhaitée par un praticien clinique, en général le chirurgien, lorsqu'il doit injecter une telle composition dans un tissu d'un patient. Il convient donc de limiter le temps de coagulation d'une formulation de chitosane en mélange avec du sang humain. Ce document ne décrit pas comment préparer d'autres compositions à base de chitosane présentant un temps de coagulation rapide, ni comment améliorer le temps de coagulation. Ce document ne décrit pas comment préparer un caillot qui s'étale facilement lors de son application sur un tissu, notamment un tissu qui n'est pas disposé selon un plan horizontal. Ce document vise à fournir des compositions à pH physiologique (pH 7). Ce document n'indique pas comment éviter qu'un caillot se fragmente et ne décrit pas non plus comment obtenir un caillot qui ne soit pas pré-solidifié, notamment pour permettre l'injection du mélange sang-chitosane à travers une aiguille dans le cas d'une procédure d'implantation par arthroscopie.
La demande de brevet WO 201 1/060553 décrit un enseignement proche des demandes de brevet précitées (WO 201 1 /060545, WO 201 1/060544, et WO 201 1/060554), mais concerne des compositions en 2 parties, l'une comprenant le chitosane, l'autre le sel organique (glycérophosphate). Elle décrit des compositions comprenant jusqu'à 2,5% de chitosane (en page 8). Les études de faisabilité portent sur des compositions en 2 parties comprenant un chitosane de masse moléculaire supérieure à 300kDa (tableau 3) et des concentrations de 1 ,5% de chitosane en solution (tableau 6). Les concentrations de chitosane utilisées en mélange avec du sang humain sont inférieures à 2% en masse par rapport à la masse de la solution de chitosane. Ce document ne décrit pas comment préparer d'autres compositions à base de chitosane présentant un temps de coagulation rapide, ni comment améliorer le temps de coagulation. Ce document ne décrit pas comment préparer un caillot qui s'étale facilement lors de son application sur un tissu qui n'est pas disposé selon un plan horizontal. Ce document n'indique pas si les caillots se fragmentent et n'adresse pas le problème spécifique de fournir à la fois des mélanges homogènes préalablement à la coagulation et des caillots présentant à la fois une coagulation rapide et qui soit intègre, non rétracté, non fragmenté, résistant à la compression et la déformation. La demande de brevet WO 02/00272 décrit une composition et une méthode pour réparer et régénérer le cartilage ou d'autres tissus. Cette demande enseigne pages 15 et 16 qu'il est connu de mélanger un chitosane avec un glycérophosphate, le chitosane présentant une concentration de 0,5 à 3% et une haute masse moléculaire (plusieurs centaines de kDa) notamment pour éviter la précipitation du chitosane à pH supérieur à 6,2. Ce document enseigne également (page 16) que le chitosane peut rester à l'état soluble à pH physiologique mais que cela nécessite de réduire la concentration ou la masse moléculaire et le degré de désacétylation du chitosane (0,1 %, 350 kDa, 50%). Les exemples supportent une concentration en chitosane de 1 ,5% pour ses applications en mélange avec le sang (exemple 4). Les concentrations de chitosane des solutions utilisées en mélange avec du sang humain sont donc inférieures à 2%. Ce document ne suggère pas comment préparer d'autres compositions à base de chitosane présentant un temps de coagulation rapide, ni comment améliorer le temps de coagulation. Ce document ne décrit pas comment préparer un caillot qui s'étale facilement lors de son application sur un tissu qui n'est pas disposé selon un plan horizontal.
La demande de brevet WO 99/07416 décrit une composition thermo-gélifiable à base de chitosane. Ce document ne suggère pas comment diminuer le temps de coagulation d'un mélange d'une telle composition avec du sang. Ce document ne décrit pas comment préparer un caillot qui s'étale facilement lors de son application sur un tissu qui n'est pas disposé selon un plan horizontal.
Ainsi, il ressort des précédentes demandes que, si certaines pistes techniques ont été envisagées pour préparer des compositions à base de chitosane présentant un temps de coagulation faible en mélange avec du sang humain, la solution proposée par la présente invention n'était pas suggérée. Au contraire, il ressort que l'homme du métier s'était focalisé sur une concentration de chitosane inférieure ou égale à 2% pour ses applications en mélange avec le sang, et plus précisément focalisé sur les chitosanes présentant une masse moléculaire supérieure à 200kDa. Or, des compositions avec une concentration de chitosane élevée présentent le désavantage technique, en présence d'un sel organique de sucre ou de polyol, de gélifier à température ambiante au cours du temps, en raison de leur caractère thermo-gélifiant, notamment au cours de leur stockage. L'homme du métier était donc encouragé à utiliser une concentration de chitosane inférieure ou égale à 2%. Par ailleurs, les compositions comprenant une association de chitosane et de glycérophosphate présentent un temps de coagulation en général bien supérieur à 10 minutes en mélange avec du sang.
Dans le cas par exemple de l'utilisation de telle composition pour la régénération de cartilage, le patient doit être opéré pour que la composition soit implantée au niveau du cartilage défectueux. Lors de cette opération, le praticien clinique doit attendre que la composition à base de chitosane mélangée avec le sang du patient coagule, comme décrit par exemple par Stanish et al. (Oper Tech Orthop 16:271 , 2006) et Tey et al. (Arthroscopy Techniques 4, 29, 2015), de 15 à 25 minutes. Plus le temps est long, plus le patient est immobilisé dans la salle d'opération. Or, d'une manière générale, on recherche des procédures chirurgicales les plus courtes possibles, en particulier pour minimiser les coûts de personnel, pouvoir réaliser plus d'interventions quotidiennes, éviter les risques d'infection liés à l'exposition prolongée à l'environnement extérieur, etc. Ainsi, il serait avantageux de les raccourcir, notamment en accélérant la formation du caillot. Par ailleurs, lorsque l'opération porte sur des articulations autres que le genou, par exemple l'épaule, ou tout autre articulation qui ne se présente pas selon un plan horizontal lorsque le patient est allongé sur la table d'opération, la composition peut présenter une texture, et en particulier une viscosité qui n'est pas adaptée. Dans un tel cas, la composition, lorsqu'elle est mise en contact du cartilage peut ne pas rester en position, voire s'écouler. II existe donc le besoin de fournir des compositions présentant une bonne intégrité, de bonnes propriétés mécaniques, une bonne adhérence à la surface du tissu pour permettre une implantation optimale sur un tissu qui n'est pas disposé dans le plan horizontal lorsque le patient est allongé sur une table d'opération.
Par ailleurs, il y a aujourd'hui une tendance générale à pratiquer les procédures chirurgicales sous endoscopie, pour minimiser le caractère invasif, les risques d'infection et minimiser le traumatisme des tissus. Par exemple, Stanish et al. (Oper Tech Orthop 16, 271 , 2006 ; J Bone Joint Surg Am. 95,1640, 2013) indiquent que le traitement d'une lésion du cartilage par une composition à base de sang et de chitosane peut être réalisée par arthroscopie si la lésion est visible entièrement dans le champ de vision. Dans ce cas, il est préconisé d'injecter le mélage avant formation du caillot sur la lésion comprenant les microtunnels, et d'attendre que le caillot se forme avant de retirer les instruments. Tey et al. (Arthroscopy Techniques 4, 29, 2015) ont par exemple utilisé une aiguille de 18 Gauge pour injecter le caillot (diamètre intérieur de 800 à 880μηι). Pour que la procédure par arthroscopie soit adéquate, il est souhaitable que le mélange entre le sang et la solution de chitosane soit bien homogène, car dans le cas contraire, celà entraînerait la formation du nouveau cartilage de manière non uniforme sur l'ensemble de la lésion traitée. Ceci compromettrait la qualité du nouveau cartilage, notamment ses propriétés de résistance à la friction et ses propriétés mécaniques au cours du temps, ce qui entraînerait de nouveau des lésions à cause de son usure. Il est également souhaitable que le mélange à injecter soit peu visqueux, pour pouvoir passer facilement au travers d'une aiguille. Il doit enfin être coagulé rapidement pour qu'il ne coule pas au délà de la lésion à traiter et pour diminuer la durée de l'intervention chirurgicale.
La présente invention a pour but de résoudre un ou de préférence plusieurs des problèmes techniques exposés ci-dessus.
La présente invention a notamment pour but de résoudre le problème technique de fournir une composition à base de chitosane et d'un fluide coagulable, utilisable pour une régénération tissulaire et présentant un faible temps de coagulation en présence d'un fluide coagulable, et en particulier du sang complet.
La présente invention a également pour but de fournir une composition à base de chitosane qui soit homogène en présence d'un fluide coagulable, et en particulier du sang complet, avant coagulation.
La présente invention a encore pour but d'améliorer les propriétés mécaniques du mélange chitosane/fluide coagulable ayant coagulé et formé un caillot, et en particulier du mélange chitosane/sang.
Plus spécifiquement la présente invention a pour but de fournir une composition à base de chitosane et d'un fluide coagulableprésentant à la fois un temps de coagulation rapide, une bonne homogénéité, et des bonnes propriétés mécaniques, en particulier pour faciliter une implantation sur un plan non-horizontal.
La présente invention a également pour but de fournir de telle composition pour qu'elle soit facilement injectable, notamment au travers d'une aiguille, et plus précisément encore au travers d'une aiguille prévue pour une procédure arthroscopique.
La présente invention a également pour but de fournir de telle composition répondant au maximum de critères techniques pour fournir un caillot intègre, non rétracté, non fragmenté, résistant à la compression et la déformation.
La présente invention a également pour but de fournir des compositions stables dans le temps.
La présente invention a également pour but de fournir des système de stockage et d'administration des compositions adéquats pour leur fabrication et conservation, et facile d'usage pour le chirurgien.
La présente invention a pour but notamment de résoudre ces problèmes techniques de manière fiable, industrielle et peu coûteuse.
La coagulation du sang est un phénomène complexe (hémostase primaire et secondaire). Différents paramètres peuvent affecter positivement ou négativement le procédé de coagulation lors de la formation de caillots, et tout particulièrement lors de la formation d'un caillot de sang. Il a été découvert de manière surprenante par les présents inventeurs qu'il est possible de résoudre un ou plusieurs des problèmes techniques précités en préparant une composition comprenant un mélange d'une formulation de chitosane et d'un fluide coagulable, dans laquelle la formulation de chitosane présente une concentration d'au moins 2,5% de chitosane en masse par rapport à la masse totale de formulation de chitosane, ledit chitosane présentant une viscosité dynamique inférieure ou égale à 60mPa.s, mesurée dans l'acide acétique à 1 % (v/v), ladite composition comprenant au moins un sel organique de sucre ou de polyol.
La vitesse de coagulation est particulièrement optimisée lorsque la concentration de chitosane est supérieure ou égale à 3% en masse, par rapport à la masse de la formulation de chitosane.
La composition selon l'invention couvre, lorsqu'elle se réfère au mélange de chitosane et de fluide coagulable, à la fois à la composition fluide préalablement à la coagulation du fluide coagulable en présence du chitosane, et le mélange coagulé. Selon une variante de la composition de l'invention concerne le mélange fluide. Selon une autre variante, la composition de l'invention concerne le mélange coagulé.
On entend par « formulation de chitosane » la solution comprenant le chitosane, le sel organique de sucre ou de polyol et les éventuels autres ingrédients de la formulation, juste avant son mélange avec le fluide coagulable. Il ne s'agit pas de la « solution de chitosane » qui s'entend de la solution de chitosane avant sa mise en contact avec le sel organique de sucre ou de polyol. Toute autre signification est précisée spécifiquement, le cas échéant ou le contexte rend cette précision inutile.
On entend par « fluide coagulable », un fluide corporel (ou biologique) d'un mammifère, de préférence un être humain, qui peut être isolé du corps, par exemple au moyen d'une seringue de prélèvements, et qui coagule, c'est-à-dire qu'il forme in fine un caillot, en d'autres termes un thrombus. Parmi les fluides coagulables on peut citer en particulier : un sang, un plasma, un lysat plaquettaire, un plasma riche en plaquettes, un plasma riche en plaquettes sans érythrocytes, et leur mélanges. Le sang se réfère à la fois au sang complet et au sang processé (c'est-à-dire ayant subi une opération technique), au sang veineux, au sang artériel, au sang des os, au sang de la moelle épinière, au sang de cordon ombilical, au sang du placenta. Le fluide coagulable utilisé est de préférence un fluide du sujet considéré. Il s'agit d'un fluide coagulable autologue.
Le fluide coagulable peut être enrichi par amplification de la présence de l'un ou plusieurs de ses composants. Un composant du fluide peut par exemple être les érythrocytes, les leucocytes, les lymphocytes, les cellules polymorphonucléaires, les monocytes, les plaquettes, les fibrinogènes, les cellules souches, la thrombine l'hémoglobine, les neutrophiles, les éosinophiles, les basophiles, un facteur de coagulation.
Le fluide coagulable peut être additionné d'un agent exogène, par exemple un ou plusieurs facteurs de coagulation, pour obtenir une durée de coagulation optimale, et/ou des propriétés mécaniques désirées, lorsque le fluide coagulable est coagulé, par exemple un sel de calcium. Le fluide coagulable peut être également additionné d'agents thérapeutiques. Parmi les substances thérapeutiques on peut citer les polysaccharides, les polypeptides, les liposomes, les ADN, les anticorps, les ARN, les protéines, les peptides, les fragments matriciels extracellulaires, les facteurs de croissance, les facteurs chémotactique, les cytokines, les facteurs angiogéniques, les cellules vivantes, par exemple les chondrocytes, ostéoblastes, les cellules souches.
Selon une variante, les cellules souches embryonnaires humaines sont exclues des cellules souches.
Il a été découvert de manière surprenante que l'augmentation de la concentration de chitosane dans la formulation de chitosane diminue le temps de coagulation du fluide coagulable lorsque l'on mélange cette formulation de chitosane avec un fluide coagulable, et en particulier le sang. Une telle formulation de chitosane permet de coaguler le fluide coagulable, en particulier le sang, rapidement. Une telle formulation de chitosane permet de former une structure tridimensionnelle avec le fluide coagulable, en formant un réseau interpénétré avec les composants du fluide et le chitosane en solution.
La formulation de chitosane selon l'invention permet d'obtenir des résultats satisfaisants en termes de rétractation du caillot de fluide coagulable, en particulier des caillots formés par le sang coagulé et le chitosane.
La formulation de chitosane selon l'invention permet d'obtenir des propriétés mécaniques satisfaisantes, notamment en terme d'étalement et d'adhésion sur le tissu à réparer, en particulier lorsqu'il n'est pas disposé selon un plan horizontal.
Les inventeurs ont notamment découvert que lorsque la concentration de chitosane est supérieure à 2%, la coagulation n'est pas satisfaisante si la viscosité dynamique de la formulation de chitosane n'est pas conforme à la présente invention.
II a également été identifié par les présents inventeurs que des compositions selon l'art antérieur, comprenant un mélange de chitosane de masse moléculaire supérieure à 200k, en présence d'un sel organique de sucre ou de polyol (sel de glycérophosphate) présentaient une viscosité pouvant mener à des problèmes de manipulation de la composition et du caillot de sang. En effet, il est difficile de préparer facilement un mélange sang/solution de chitosane préalable à la coagulation qui soit homogène, c'est-à- dire pour laquelle les deux parties de la composition sont mélangées intimement et forment un réseau interpénétré. Or, il est important que la composition prélable à la coagulation soit homogène, car toute la surface de la lésion ainsi que les microtunnels qui sont formés dans la lésion du cartilage puissent être traités avec la même quantité de chitosane et de sang, pour favoriser la formation d'un nouveau cartilage de bonne qualité sur tout le volume nouvellement formé.
Les compositions de l'invention présentent une viscosité dynamique permettant un bon étalement de la composition de chitosane en mélange avec un fluide coagulable, lorsqu'elle est coagulée.
Les compositions de l'invention, coagulées, présentent également une bonne adhésion au niveau du site d'application, par exemple sur un cartilage, et plus généralement sur un tissu osseux ou un autre tissu.
Un tissu est un ensemble de cellules semblables et de même origine, regroupées en ensemble fonctionnel, c'est-à-dire concourant à une même fonction.
Le chitosane est par exemple référencé sous le numéro CAS 9012-76-4.
Le chitosane utilisé pour l'invention est avantageusement d'origine fongique, et de préférence issu du mycélium d'un champignon du type Ascomycète, et en particulier d'Aspergillus niger, et/ou d'un champignon Basidiomycète, et en particulier Lentinula edodes (shiitake) et/ou Agaricus bisporus (champignon de Paris). De préférence, le chitosane est issu d'Agaricus bisporus. Le chitosane est de préférence très pur, c'est-à- dire contenant peu d'impuretés issues de son origine fongique, et d'une qualité microbiologique compatible avec son utilisation comme implant ou composition pharmaceutique. Une méthode de préparation du chitosane est celle décrite par exemple dans les brevets de la famille WO 03/068824 (EP 1483299 ; US 7 556 946, etc).
La masse moléculaire moyenne du chitosane peut être estimée par la valeur de viscosité dynamique de la solution à 1 % (m/m) de chitosane dans l'acide acétique 1 % (v/v). La « solution à 1 % (m/m) de chitosane » s'entend d'une solution d'eau distillée comprenant 1 % en masse de chitosane par rapport à la masse totale de la solution de chitosane dans l'eau distillée. A cette solution à 1 % (m/m) de chitosane est ajouté de l'acide acétique pour obtenir une solution à 1 % (m/m) de chitosane et 1 % (v/v) d'acide acétique. On peut aussi ajouter la poudre de chitosane dans une solution d'acide acétique pour arriver à 1 %. L'acide acétique à 1 % (v/v) s'entend d'une concentration de 1 % en volume d'acide acétique par rapport au volume de la solution d'eau distillée finale.
La viscosité dynamique est mesurée à l'aide d'un viscosimètre à mobile tournant, par exemple un viscosimètre à mobile tournant de la marque Brookfield, par exemple muni d'une aiguille (« spindle ») de type S34 à une vitesse ajustée en fonction de la viscosité par l'homme de l'art de 0,3 à 100tr/min selon les préconisations liée au viscosimètre, et par exemple de 5 tour/min, et à une température de 25°C.
Avantageusement, le chitosane utilisé selon l'invention présente, selon la méthode de mesure précitée, une viscosité dynamique comprise entre 5 et 60mPa.s, par exemple de 5 à 55mPa.s, lorsqu'il se trouve en solution à la concentration de 1 % (m/m) dans l'acide acétique 1 % (v/v).
Selon une variante, le chitosane utilisé selon l'invention présente une viscosité dynamique comprise entre 5 et 25mPa.s, par exemple de 8 à 20mPa.s, lorsqu'il se trouve en solution à la concentration de 1 % (m/m) dans l'acide acétique 1 % (v/v).
Selon une variante, le chitosane utilisé selon l'invention présente une viscosité dynamique apparente comprise entre 26 et 50mPa.s, par exemple de 30 à 45mPa.s, lorsqu'il se trouve en solution à la concentration de 1 % (m/m) dans l'acide acétique 1 % (v/v).
Le chitosane peut être de différentes masses moléculaires, dans la gamme de masses moléculaires selon la présente invention.
En particulier, l'invention concerne un chitosane présentant une masse moléculaire moyenne viscosimétrique Mv allant de 20 000 (20k) à 145 000 (145k).
Selon une variante, la masse moléculaire moyenne en viscosité (Mv) est comprise entre 20 000 (20k) et 120 000 (120k).
Selon une variante, la masse moléculaire moyenne en viscosité (Mv) est comprise entre 20 000 (20k) et 60 000 (60k).
Selon une autre variante, la masse moléculaire moyenne en viscosité (Mv) est comprise entre 60 000 (60k) et 100 000 (100k).
Il est possible d'hydrolyser le chitosane afin de diminuer sa masse moléculaire. De préférence ici, la masse moléculaire moyenne est la masse moléculaire moyenne en viscosité (Mv), calculée à partir de la viscosité intrinsèque selon l'équation de Mark-Houwink. La viscosité intrinsèque est mesurée par viscosimètrie capillaire, avec un viscosimètre capillaire de type Ubbelohde, selon la méthode de la monographie de la Pharmacopée Européenne EP2.2.9. On mesure le temps d'écoulement de la solution à travers un tube capillaire adapté (Lauda, par exemple le tube capilaire Ubbelohde 510 01 de diamètre 0.53mm) à l'aide d'un viscosimètre automatique Lauda Vise, d'abord à la concentration initiale en chitosane, puis pour plusieurs dilutions, par exemple selon les recommandations de la méthode EP2.2.9. On en déduit la viscosité intrinsèque réduite pour chacune des concentrations. On porte la viscosité réduite en fonction de la température, et on extrapole la valeur à la concentration 0 pour en déduire la viscosité intrinsèque. Il faut par exemple porter la viscosité réduite (η^ en ml/g) des i dilutions en fonction de la concentration C des i dilutions (g/ml) selon la formule 2.
Formule 2. hréd] = (ti - 10) - (1 - C).
Pour calculer la masse viscosimétrique moyenne, on applique l'équation de Mark- Houwink avec les constantes k et alpha recommandées par Rinaudo et al. (Int. J. Biol. Macromol, 1993, 15, 281 -285), selon le degré d'acétylation (DA) du chitosane, selon l'une des trois formules suivantes.
Formule 3. Mv = ([η]/0,082)(1/076), pour un DA de 2% ;
Formule 4. Mv = ([η]/0,076)<1/0'76), pour un DA de 10% (par exemple 1 1 .5%) ; Formule 5. Mv = ([η]/0,074)(1/076), pour un DA de 20% (par exemple 21 %).
Pour les valeurs de DA intermédiaires, on réalise une interpolation linéraire pour calculer la masse viscosimétrique moyenne (Mv).
Avantageusement, le chitosane présente un degré d'acétylation compris entre 5 et 50%. Le degré d'acétylation est exprimé en nombre de moles d'unités N-acétyl-D- glucosamine par rapport au nombre de moles d'unités totales N-acétyl-D-glucosamine et D-glucosamine présentes. Le degré de désacétylation correspond à cent moins le degré d'acétylation (DDA = 100-DA).
Selon une variante, le degré d'acétylation est compris entre 25 et 40%.
Selon une variante, le degré d'acétylation est compris entre 20 et 30%.
Selon une variante, le degré d'acétylation est compris entre 15 et 25%.
Selon une variante préférée, le degré d'acétylation est compris entre 5 et 20%.
Selon une variante préférée, le degré d'acétylation est va de 5 à 20%, et encore de préférence de 5 à 15 %.
Le degré d'acétylation est déterminé par titrage potentiométrique. Le chitosane est dissout dans une solution d'acide chlorhydrique. L'excès d'acide chlorhydrique n'ayant pas réagi avec les fonctions aminés du chitosane est dosé par une solution titrée d'hydroxyde de sodium. On en déduit ainsi le nombre de mole d'unité D-glucosamine présentes dans le chitosane et donc par soustraction le degré d'acétylation.
Le chitosane présente avantageusement un degré d'acétylation contrôlé. Par les termes « chitosane ayant un degré d'acétylation contrôlé » on entend un produit dont le degré d'acétylation, c'est-à-dire la proportion des unités N-acétyl-glucosamine, peut être ajustée de manière contrôlée.
Selon une variante spécifique, l'invention met en œuvre un chitosane présentant un degré d'acétylation est compris entre 5 et 20%, une viscosité dynamique (mesurée telle que décrit précédemment, avec une solution à 1 % (m/m) de chitosane dans l'acide acétique 1 % (v/v) de 5 et 60mPa.s, par exemple de 5 à 55mPa.s.
Selon une variante très avantageuse, l'invention met en œuvre un chitosane présentant un degré d'acétylation est compris entre 5 et 20%, et une viscosité dynamique (mesurée telle que décrit précédemment, avec une solution à 1 % (m/m) de chitosane dans l'acide acétique 1 % (v/v) de 5 et 25mPa.s, par exemple de 8 à 20mPa.s.
Selon une variante très avantageuse, l'invention met en œuvre un chitosane présentant un degré d'acétylation est allant de 5 à 15%, et une viscosité dynamique (mesurée telle que décrit précédemment, avec une solution à 1 % (m/m) de chitosane dans l'acide acétique 1 % (v/v) de 5 et 25mPa.s, par exemple de 7 à 20mPa.s.
Le chitosane est avantageusement purifié et ensuite de préférence séché. Après purification, le procédé de l'invention peut comprendre une étape de séchage du chitosane substitué, puis éventuellement de broyage de celui-ci pour obtenir une poudre. On peut sécher le chitosane par exemple par évaporation de l'eau, par exemple par un procédé de spray-drying (atomisation), de lit fluidisé, ou par séchage sous vide ou à pression atmosphérique, ou encore par lyophilisation.
Le chitosane peut être solubilisé dans une solution aqueuse, et par exemple dans une eau de qualité acceptable pour une injection ou implantation dans un corps, et en particulier un corps humain.
On peut favoriser la dissolution du chitosane dans une solution aqueuse par ajustement du pH à un pH suffisamment acide par l'ajout d'un acide. On peut utiliser avantageusement l'acide acétique, ou l'acide chlorhydrique. Par exemple, le chitosane est amené à un pH de l'ordre de 4,5 à 7 en présence de l'acide. Ensuite, on peut réajuster le pH par exemple avec un sel organique de sucre ou de polyol, par exemple un glycéro- phosphate. Avantageusement, on vise un pH compris entre 4,5 et 8,5, et de préférence entre 5,5 et 7,5. On peut par exemple amener le pH à environ 7.
Ainsi selon une variante, la solution ou formulation de chitosane comprend un acide. L'acide peut être présent à une concentration de 0,001 à 0,1 N, par exemple environ 0,01 N.
Une composition selon l'invention présentant une concentration de chitosane plus importante que les compositions de l'art antérieur est intéressante du fait des propriétés intrinsèques du chitosane qui sont bénéfiques pour la réparation du cartilage, comme décrit par Hoemann et al. (Osteoarthritis & Cartilage 15, 78, 2007), Chen et al. (Cartilage 2, 173, 201 1 ), ou encore Stanish et al. (J Bone Joint Surg 95, 1640, 2013) en combinaison avec une procédure de stimulation de la moelle osseuse par microfracture, ou comme décrit par Oprenyeszk et al. (Osteoarthritis Cart 21 , 1099, 2013 ; Plos One 10, 2015). On peut faire notamment référence à la demande WO 201 1/060553 pour les différentes voies d'activation du complément.
Avantageusement, la formulation de chitosane présente une concentration de chitosane supérieure à 2,5% et inférieure à 10% en masse par rapport à la masse de solution finale.
Avantageusement, la concentration de chitosane est supérieure ou égale à 2,8%, par exemple supérieure ou égale à 3%, ou encore par exemple supérieure ou égale à 3,2% en masse par rapport à la masse totale de la formulation de chitosane (m/m).
Selon une variante spécifique, la concentration de chitosane va de 2,9 à 3.5% (m/m), exprimée en masse par rapport la masse totale de la formulation de chitosane.
Selon une variante spécifique, la concentration de chitosane va de 3,6 à 4.5% (m/m), exprimée en masse par rapport la masse totale de la formulation de chitosane.
Selon une variante spécifique, la concentration de chitosane va de 4,6 à 5.5% (m/m), exprimée en masse par rapport la masse totale de la formulation de chitosane.
Selon une variante particulière, la concentration de chitosane est environ de 3,0%
(m/m), exprimée en masse par rapport la masse de la formulation de chitosane.
Selon une variante particulière, la concentration de chitosane est environ de 4,0% (m/m), exprimée en masse par rapport la masse de la formulation de chitosane.
Selon une variante particulière, la concentration de chitosane est environ de 5,0% (m/m), exprimée en masse par rapport la masse de la formulation de chitosane.
Selon une variante très avantageuse, l'invention concerne une formulation de chitosane et une solution de chitosane pour préparer cette formulation de chitosane, ledit chitosane, présentant un degré d'acétylation est compris entre 5 et 20%, et une viscosité dynamique (mesurée telle que décrit précédemment, avec une solution à 1 % (m/m) du chitosane dans l'acide acétique 1 % (v/v)) de 5 et 25mPa.s, par exemple de 8 à 20mPa.s, ladite formulation de chitosane présentant une concentration de chitosane supérieure ou égale à 3%, ou encore par exemple supérieure ou égale à 3,2% en masse par rapport à la masse totale de la formulation de chitosane (m/m).
Selon une variante très avantageuse, l'invention met en œuvre une formulation de chitosane et une solution de chitosane pour préparer cette formulation de chitosane, ledit chitosane présentant un degré d'acétylation est allant de 5 à 15% et une viscosité dynamique (mesurée telle que décrit précédemment, avec une solution à 1 % (m/m) de chitosane dans l'acide acétique 1 % (v/v)) de 5 et 25mPa.s, par exemple de 7 à 20mPa.s., ladite formulation de chitosane présentant une concentration de chitosane supérieure ou égale à 2,8%, par exemple supérieure ou égale à 3%, ou encore par exemple supérieure ou égale à 3,2% en masse par rapport à la masse totale de la formulation de chitosane (m/m).
Parmi les sels de polyol ou de sucre on peut citer notamment les sels de phosphate, et plus particulièrement les sels dibasiques de mono-phosphate de polyol ou de sucre. On peut également citer les sels de sulfate comme par exemple les sels de mono-sulfate de polyol ou de sucre. Parmi les sels de phosphate on peut notamment citer les mono-phosphates dibasiques de glycérol, incluant le glycérol-2-phosphate, le sn- glycérol-3-phosphate et le 1 -glycérol-3-phosphate. Selon une variante, il s'agit du beta-2- glycérophosphate (par exemple C3H706PNa2, 5,5 H20, n°CAS 13-408-09-8). Il peut s'agir d'une forme pentahydratée. Parmi les polyol et sucres pour de tels sels, on peut citer les polyols et sucres suivants: histidinol, acetol, diethylstilbestrol, indoleglycerol, sorbitol, ribitol, xylitol, arabinitol, erythritol, inositol, mannitol, glucitol, palmitoyl-glycerol, linoleoyl- glycerol, oleoyl-glycerol, arachidonoyl-glycerol, fructose, galactose, ribose, glucose, xylose, rhamnulose, sorbose, erythrulose, deoxy-ribose, ketose, mannose, arabinose, fuculose, fructopyranose, ketoglucose, sedoheptulose, trehalose, tagatose, sucrose, allose, threose, xylulose, hexose, methylthio-ribose or methylthio-deoxy-ribulose, ou l'un quelconque de leurs mélanges.
Selon une variante, le sel organique de polyol est un glycérophosphate, et plus particulièrement un sel de beta-glycérophosphate disodique pentahydrate
Selon une variante spécifique, la concentration de sel de polyol ou de sucre, et de préférence de glycérol phosphate, est comprise entre 1 et 20%. Avantageusement, la concentration de sel de polyol ou de sucre, et de préférence de glycérol, est comprise entre 1 et 15%. Avantageusement, la concentration de sel de polyol ou de sucre est de 2% à 5%. Selon une variante, la concentration de sel de polyol ou de sucre est compris entre 2% et 10%. Les valeurs sont exprimées en masse par rapport en masse totale de la formulation de chitosane.
Selon une variante, le sel de glycérol est un glycérophosphate, et plus précisément un sel de sodium, comme par exemple le disodium glycérophosphate.
Selon une variante, la concentration en beta-glycérophosphate (GP) est choisie pour ajuster le pH à 7,0 ± 0,2 et l'osmolarité à 300 ± 25 mOsmol/kg de la formulation de chitosane, qui sont des conditions compatibles avec l'utilisation en contact avec des tissus biologiques, en particulier une articulation. Ainsi, la concentration finale en GP dans la formulation de chitosane est d'environ 2% (m/m).
Le sel de polyol ou de sucre, et de préférence le glycérol phosphate, peut être utilisé pour amener le pH à un pH basique, puis le pH de la composition est ajusté par l'ajout d'un acide, ce qui présente l'avantage de fournir une composition dont le pH est modulable très facilement et précisément.
Ainsi, la composition selon l'invention présente un pH supérieur ou égal à 5,5, et par exemple un pH de 5,8 à 8,0.
Selon une variante, le pH est compris entre 5,5 et 7,5, et de préférence va de 6 à
7.
Selon une variante préférée, le pH est inférieur à 7,0.
Selon une variante spécifique, le pH de la formulation de chitosane est de 6 +/-
0,2.
Selon une autre variante spécifique, le pH est de 7,2 +/- 0,2.
Selon une autre variante spécifique, le pH est de 7,0 +/- 0,2.
Le pH est mesuré sur la formulation de chitosane.
Le pH est déterminé en suivant la méthode décrite dans la pharmacopée européenne (EP 2.2.3). Le pH-mètre utilisé est un pH-mètre de la gamme Sartorius muni d'une électrode combiné en verre (PY-P1 1 ). Les mesures de pH sont réalisées entre 20 et 25 °C.
Selon un mode de réalisation, la formulation de chitosane présente une osmolalité de 100 à 700mosm/kg, de préférence de 200 à 500mosm/kg, et encore de préférence de 300 à 400mosm/kg.
Avantageusement, l'osmolalité de la formulation de chitosane est comprise entre
250 et 400 mosm/kg, et de préférence de 275 à 325 mosm/kg.
Selon une variante, la formulation de chitosane présente une osmolalité compatible avec une articulation.
Il est préférable que l'osmolalité de la formulation de chitosane soit comprise entre 250 et 400, et plus spécifiquement entre 250 et 380mosm/kg.
La détermination de l'osmolalité des solutions est effectuée avec un micro- osmomètre automatique (Osmometer Type 15M de la marque Loser Messtechnik). L'équipement est préalablement calibré avec une solution de 300mosm/kg. L'échantillon est placé dans un récipient prévu à cet effet, et est mis à la température standard de la mesure.
Selon une variante, la composition comprend un tampon, par exemple un tampon acétate.
Des agents tampon sont connus de l'homme du métier.
Il est avantageux d'utiliser au moins un polyol et en particulier un sucre réducteur dans la composition de l'invention (en plus du sel de polyol comme le glycérol phosphate). De tels polyols peuvent être par exemple choisis parmi le groupe consistant en : isopropanol, sorbitol, mannitol, alkylène glycol comme le propylène glycol, poly(alkyl glycol), par exemple un poly(éthylène glycol), fructose, galactose, ribose, glucose, xylose, rhamnulose, sorbose, erythrulose, deoxy-ribose, ketose, mannose, arabinose, fuculose, fructopyranose, ketoglucose, sedoheptulose, trehalose, tagatose, sucrose, allose, threose, xylulose, hexose, methylthio-ribose, methylthio-deoxy-ribulose, et l'un quelconque de leurs mélanges.
De préférence, la composition comprend au moins un sucre réducteur, par exemple le mannitol.
Selon une variante, la présente invention concerne une formulation de chitosane comprenant au moins 2% en masse de chitosane, et de préférence de 1 à 10% de sel de polyol ou de sucre, par exemple de glycérophosphate, et éventuellement de 0,1 à 20% de sucre réducteur. Avantageusement, la formulation de chitosane comprend de 2,8 à 6,5% en masse de chitosane substitué et de 2 et 6 % en masse de glycérol, de préférence de glycérophosphate, et éventuellement de 0,1 à 15% en masse de sucre réducteur, par rapport à la masse totale de la composition.
Selon une variante, la formulation de chitosane peut comprendre également un ou plusieurs sels inorganiques, outre le sel organique de polyol ou de sucre.
Parmi les sels inorganiques, on peut citer par exemple un sel de sodium, un sel de chlorure, de potassium, de calcium, de magnésium, de phosphate, de sulfate, ou sel l'un quelconque de leurs mélanges. Selon une variante particulière, le sel inorganique peut- être le chlorure de potassium, le chlorure de sodium, chlorure de césium, le chlorure de calcium, le fluorure de césium, le perchlorate de potassium, le nitrate de sodium, le sulfate de calcium, ou l'un quelconque de leurs mélanges.
Selon une variante, la formulation de chitosane comprend un sel de calcium, en particulier le chlorure de calcium.
L'invention concerne également un procédé de préparation d'une composition ou d'une formulation selon l'invention.
Ce procédé comprend typiquement :
- la dissolution d'un chitosane dans une solution aqueuse d'un acide dilué, de préférence de l'eau et un acide dilué, de préférence un acide faible, de préférence un acide organique, éventuellement une solution tamponnée d'un acide et d'une base faibles, de préférence à pH compris entre 4,5 et 8,5, et de préférence entre 5,5 et 7,5 ;
- l'ajustement éventuel du pH à un pH physiologique ;
- le mélange avec une solution de sel de sucre ou de polyol, comme par exemple une solution de sel de glycérol phosphate ; - l'ajustement éventuel du pH à un pH physiologique, par exemple par ajout d'un agent tamponnant ;
- l'ajustement éventuel de l'osmolalité de la solution ;
- l'ajustement éventuel de la viscosité de la solution.
Les solutions de chitosane sans sel organique de sucre ou de polyol peuvent être préparées de la manière suivante :
- la dispersion du chitosane dans d'une solution aqueuse, comme par exemple de l'eau,
- l'ajout d'une solution acide pour ajuster le pH, par exemple à pH compris entre 4,5 à 7, et de préférence entre 4,5 et 6,9, et par exemple à pH 6,
- l'ajout d'excipients éventuellement présents dans la solution de chitosane à l'exception du sel organique de sucre ou de polyol,
- la stérilisation, de préférence par autoclavage à la vapeur,
- éventuellement le conditionnement pour la conservation de la solution.
La solution de sel organique de sucre ou de polyol peut être préparée selon les connaissance de l'homme du métier.
La solution de sel organique de sucre ou de polyol peut être ajoutée à la solution de chitosane après stérilisation de celle-ci, par exemple. La solution de sel organique de sucre ou de polyol peut être elle-même stérilisée, par exemple par autoclavage à la vapeur ou par filtration stérilisante.
Selon une variante, le mélange glycérophosphate - chitosane est réalisé avant stérilisation.
Selon une variante la dissolution du chitosane s'effectue dans de l'eau comprenant un sucre réducteur, comme par exemple le mannitol.
Selon une variante, l'agent tamponnant est un tampon acétate.
Avantageusement, le procédé comprend également une étape ultérieure de remplissage d'un dispositif d'injection, comme par exemple une seringue, avec la formulation de chitosane ou la solution de chitosane. Avantageusement, le dispositif d'injection, comme par exemple une seringue peut ensuite subir une stérilisation à la vapeur. Ce dispositif, par exemple une seringue, peut ensuite être emballé, de préférence de manière stérile.
Il est avantageux d'utiliser un chitosane présentant un degré de pureté suffisant pour l'application envisagée.
L'invention couvre encore un chitosane ou une formulation de chitosane sous une forme sèche, notamment sous une forme lyophilisée. On peut notamment (re)disperser, et de préférence solubiliser, le produit lyophilisé avant usage.
Selon une variante, le chitosane peut être sous forme sèche, notamment sous une forme lyophilisée, avant sa mise en contact avec le sel organique de polyol ou de sucre, qui peut se présenter sous forme d'une solution aqueuse.
Ainsi, l'invention concerne un chitosane sous forme sèche, en particulier sous forme de poudre, par exemple sous forme lyophilisée, apte et destiné à être mis en solution avec une solution comprenant au moins un sel organique de polyol ou de sucre, comme ceux précités, la formulation résultante étant apte et destinée à être mise en contact avec un fluide coagulable.
Selon une variante préférée, l'invention concerne donc un dispositif médical comprenant une chambre contenant un chitosane sous une forme sèche, notamment sous une forme lyophilisée, et une chambre contenant une solution d'au moins un sel organique de polyol ou de sucre.
Selon une variante, l'une des chambres de la seringue contient une poudre solide provenant de la solution de chitosane séchée, et l'autre chambre contient la solution de sel organique de polyol ou de sucre.
De telles variantes de conditionnement permettent d'une part de conserver les composants de la formulation de manière pratique et prolongée, et de fournir un dispositif de préparation simple et rapide de la formulation. Ces variantes permettent d'éviter que la composition ne se gélifie spontanément lorsqu'elle est conservée pendant une longue durée.
La solution ou la poudre de chitosane peut être disposée dans une chambre d'un dispositif médical comprenant une seconde chambre comprenant une solution de sel organique de polyol ou de sucre. Un tel dispositif peut comprendre une séparation entre la chambre comprenant la solution de chitosane (sans le sel organique de polyol ou de sucre) et la chambre comprenant la solution de sel organique de polyol ou de sucre. Cette séparation peut être retirée, percée, ou permettre le contact par tout autre action ou moyen entre la solution de chitosane et la solution de sel organique de polyol ou de sucre.
À titre d'exemple, on peut citer les dispositifs du type seringues double-chambre en série ou en parallèle, par exemple décrits dans le brevet EP 051 1402, EP 0728492, US 3749084, US 4538920, US 5971953, US 20120265171 , ou encore les différentes seringues double-chambre commercialisées par les sociétés Vetter-Pharma (Vetter Lyo- Ject® dual-chamber syringe), Unilife (EZMix Genesis™), Tyfill (double chamber syringe), VDW (2Seal easymiX®) Selon une variante, l'invention concerne un dispositif médical comprenant une chambre contenant la solution de chitosane en mélange avec le sel organique de polyol ou de sucre.
Ainsi l'invention concerne un dispositif médical comprenant ou constituant en une formulation de chitosane à une concentration d'au moins 2,5% de chitosane en masse par rapport au volume de formulation de chitosane, ledit chitosane présentant une viscosité dynamique inférieure ou égale à 60mPa.s, mesurée dans l'acide acétique à 1 % (v/v), destinée à être mélangée avec un fluide coagulable.
L'invention concerne encore un dispositif médical comprenant une composition de chitosane selon l'invention.
L'invention concerne encore un dispositif médical comprenant plusieurs récipients, lesdits récipients étant éventuellement physiquement indépendants (« kit-of-part »), caractérisé en ce que le dispositif médical comprend au moins (i) un récipient renfermant une solution ou une poudre de chitosane, ledit chitosane présentant une viscosité dynamique inférieure ou égale à 60mPa.s, mesurée dans l'acide acétique à 1 % (v/v), et (ii) un récipient renfermant une solution d'un sel organique de sucre ou de polyol, ledit chitosane étant présent en quantité apte à former une formulation de chitosane et de sel organique de sucre ou de polyol dans laquelle la concentration de chitosane est supérieure ou égale à 2,5 % de chitosane en masse par rapport à la masse de formulation de chitosane, la formulation de chitosane étant formée par la mise en contact de la solution de chitosane et la solution d'un sel organique de sucre ou de polyol.
Avantageusement, le dispositif médical est une seringue de type double chambre, pré-remplie.
Des telles formulations de chitosane (comprenant le sel organique de polyol ou de sucre) peuvent être par exemple conservées à une température inférieure à la température de transition sol-gel. Avantageusement, ces solutions de chitosane sont stables pendant plusieurs mois, par exemple à température ambiante, ou encore à une température réfrigérée (en général 4°C à 8°C), et en particulier à 4°C.
Pour le mélange avec le fluide coagulable, la formulation de chitosane ou la solution de chitosane est mise en contact avec le fluide coagulable, puis l'ensemble est mélangé.
Selon une variante, la solution de chitosane initiale est mise en contact avec la solution comprenant le sel organique de polyol de sucre, puis la formulation de chitosane résultante est mélangée avec le fluide coagulable, et en particulier le sang. Selon une variante, la solution de chitosane initiale est mélangée avec le fluide coagulable, et en particulier le sang, puis la solution de sel organique de polyol ou de sucre est ajoutée au mélange.
Le mélange avec le fluide coagulable peut se réaliser dans le dispositif médical contenant la formulation, solution, ou poudre de chitosane (avec ou sans le sel organique de sucre ou de polyol) via un système conçu pour réaliser ce mélange, ou dans un dispositif séparé. Selon une variante qui concerne une procédure par implantation, le praticien clinique prélève le fluide coagulable par une seringue puis injecte ce fluide dans un flacon contenant la formulation, la solution, ou la poudre de chitosane, puis agite ce flacon. Le mélange est laissé à reposer ou agité jusqu'à obtenir une coagulation satisfaisante.
Selon une variante, le praticien clinique prélève le mélange coagulé avec une spatule pour disposer ou implanter le caillot à l'endroit désiré. Selon une autre variante qui concerne par exemple une procédure par arthroscopie, le praticien clinique prélève le fluide coagulable par une seringue puis injecte ce fluide dans un flacon contenant la formulation, la solution, ou la poudre de chitosane, puis agite ce flacon. Le mélange est injecté au travers d'une aiguille sous endoscopie avant ou après coagulation. « Avant coagulation » signifie avant que le mélange chitosane/fluide coagulable ne soit coagulé.
La présente invention concerne une composition comprenant ou consistant en un mélange de chitosane et de fluide coagulable selon un rapport volumique fluide coagulable/chitosane allant de 1 :1 à 4 :1 , et par exemple de 2 :1 à 3 :1 , ce rapport étant exprimé en volume fluide coagulable par rapport au volume de formulation de chitosane (v/v).
Selon une variante, le rapport fluide coagulable/chitosane est de 3 :1 .
On ne souhaite pas diminuer la proportion de sang dans le mélange, par exemple dans le but de favoriser l'homogénéité du mélange ou bien de promouvoir une formation du caillot plus rapide, car il est désiré de maintenir une concentration en composants actifs du sang élevée, ces composants étant bénéfiques à la réparation du cartilage. Il a été montré que ce rapport volumique 3 :1 était favorable pour la réparation du cartilage (Stanish et al. 2006).
La présente invention concerne plus particulièrement une composition injectable ou implantable comprenant ou consistant en une composition selon l'invention.
Selon une variante, la composition selon l'invention est utilisée comme composition pharmaceutique ou dispositif médical injectable ou implantable.
La présente invention permet la stérilisation, en particulier la stérilisation par autoclavage des solutions ou formulations de chitosane. Avantageusement, la solution ou formulation de chitosane selon la présente invention est stérile. Très avantageusement, la formulation ou solution de chitosane selon la présente invention (avec ou sans sel organique de polyol ou de sucre) est stérilisée par montée en température, de préférence sous autoclave.
Selon une variante, la formulation ou solution de chitosane (avec ou sans sel organique de polyol ou de sucre) est stérilisée à la vapeur, par exemple par une élévation de la température à une température supérieure à 100°C, et de préférence supérieure à 120°C, par exemple entre 121 et 138°C, sous autoclave, pendant une durée suffisante à la stérilisation, par exemple en général de 15 à 25minutes.
Selon une variante, les formulations de chitosane de l'invention sont transparentes ou translucides.
Par « translucide » on entend que l'on peut distinguer un objet lorsqu'on place la formulation de chitosane entre l'œil de l'observateur et l'objet. Par « transparente » on entend que l'on peut distinguer des caractères alphanumériques lorsqu'on place la formulation de chitosane entre l'œil de l'observateur et les caractères observés. En général on réalise cette évaluation avec une épaisseur d'environ 1 cm.
Selon une variante, la formulation de chitosane de l'invention est incolore, c'est-à- dire en particulier qu'un observateur à l'œil nu n'attribue pas de couleur spécifique à la formulation de chitosane.
L'invention concerne en particulier des articles ou packaging, de préférence stériles, comprenant un ou plusieurs dispositifs d'injection pré-remplis d'une formulation ou solution de chitosane (avec ou sans sel organique de polyol ou de sucre). Il s'agit typiquement de seringues, à une ou plusieurs chambres et munie de pistons et éventuellement de dispositifs de mélange, ou de flacons à usage biologique pré-remplis.
En particulier, la présente invention concerne une composition, formulation, solution ou poudre de chitosane selon l'invention, éventuellement comprise dans un dispositif médical, pour son utilisation dans une méthode de traitement thérapeutique.
Selon une variante, l'invention concerne une composition, formulation, solution ou poudre de chitosane selon l'invention, éventuellement comprise dans un dispositif médical, pour son utilisation dans une méthode de traitement thérapeutique d'une maladie articulaire.
La présente invention concerne plus particulièrement une composition selon l'invention pour son utilisation dans une méthode de traitement thérapeutique, par exemple comprenant l'injection ou implantation par voie sous-cutanée, intradermique, intraoculaire, intra-osseuse, ou intra-articulaire, de ladite composition, par exemple pour la réparation ou le comblement d'au moins un tissu corporel nécessitant une réparation ou un comblement.
Selon une variante, le tissu corporel est choisi parmi les tissus appartenant aux cordes vocales, muscles, ligaments, tendons, cartilages, organes sexuels, os, articulations, yeux (cornée), peau (derme), un tissu périodontal, un tissu maxillo-faciale, un tissu temporomandibulaire, un abcès, une tumeur réséquée, un ulcère, ou l'une quelconque de leurs combinaisons, et plus particulièrement aux joints articulaires.
L'invention permet notamment le traitement d'un ménisque.
La présente invention concerne plus particulièrement une composition selon l'invention pour son utilisation dans une méthode de traitement d'une arthrose, ou la réparation d'un défaut de cartilage, par exemple par injection ou après mélange avec le fluide coagulable et implantation dans le cartilage.
La présente invention concerne plus particulièrement un dispositif médical, par exemple implant médical, caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en une composition selon l'invention et éventuellement d'un système de mélange des composants de la composition et d'un système d'administration de la composition.
La présente invention peut également comprendre un ou plusieurs additifs ou excipients permettant de moduler ses propriétés. Selon une variante spécifique la composition de l'invention comprend une suspension de particules, par exemple des particules solides ou de gel.
La présente invention concerne également une composition selon l'invention pour son utilisation comme vecteur cellulaire, d'un ou plusieurs type cellulaire, et/ou un ou plusieurs d'agents actifs. Il peut s'agir d'agents actifs d'un point de vue pharmaceutique ou biologique. La composition de l'invention peut en effet être compatible avec la présence de cellules, de préférence de cellules vivantes. Parmi les cellules vivantes d'intérêt, on peut citer par exemple chondrocytes (cartilage articulaire), fibrochondrocytes (ménisque), fibroblastes de ligament (ligament), fibroblastes de peau (peau), ténocytes (tendons), myofibroblastes (muscle), les cellules souches mésenchymales, les globules rouges (sang) et kératinocytes (peau). La composition de l'invention peut également être utilisée comme vecteur thérapeutique pour la délivrance ciblée et/ou à libération contrôlée d'au moins un agent thérapeutique.
Selon l'invention la formulation de chitosane est particulièrement destinée à être mélanger avec du sang ou du plasma, ou un lysat plaquettaire. ou du plasma riche en plaquettes, ou tout fluide coagulable en présence de la formulation de l'invention permettant par exemple d'augmenter les performances du produit. La présente invention concerne ainsi une méthode de traitement thérapeutique mettant en œuvre l'injection ou l'implantation d'une composition selon la présente invention. Les méthodes de traitement thérapeutique couvrent toute utilisation de la composition telles que par exemple celles précitées.
La présente invention, couvre en particulier une méthode de traitement in situ et la préparation de la composition de chitosane in situ. Ainsi le mélange avec un fluidecoagulable peut être réalisé au niveau du site d'implantation ou d'injection, le fluide coagulable étant disponible au niveau de ce site.
L'invention concerne encore l'utilisation d'une composition selon l'invention pour la préparation d'une composition pharmaceutique pour un traitement thérapeutique.
Comme énoncé précédemment, l'invention concerne en particulier le traitement d'une articulation, comme par exemple le ménisque.
Selon une variante, la formulation de chitosane est appliquée directement au niveau du site d'injection ou d'implantation pour sa coagulation avec un fluide coagulable disponible au niveau du site d'injection ou d'implantation.
Les méthodes de traitement selon l'invention peuvent être mises en œuvre selon les méthodes connues de l'homme du métier.
On entend par « composition selon l'invention », « formulation de chitosane selon l'invention », « solution de chitosane selon l'invention », ou des termes équivalents, une composition, une formulation de chitosane, ou une solution de chitosane, respectivement, telle que définie dans la présente invention, y compris selon l'une quelconques des variantes, modes de réalisation particuliers, spécifiques ou avantageux, indépendamment ou selon l'une quelconque de leurs combinaisons, y compris selon les caractéristiques préférées.
Par « compris entre » une valeur numérique et une autre valeur numérique, on entend une plage numérique incluant les bornes. Ces bornes peuvent toutefois être exclues.
La présente invention couvre également une méthode de soin esthétique, en d'autres termes non-thérapeutique, comprenant l'injection ou l'implantation d'une composition selon l'invention. Il s'agit par exemple du comblement de rides ou du comblement d'une ou plusieurs zones de tissu visible endommagées, par exemple suite à un accident ou une intervention chirurgicale, dans un but esthétique.
Sur les figures :
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à l'homme de l'art suite à la lecture de la description explicative qui fait référence à des exemples qui sont donnés seulement à titre d'illustration et qui ne sauraient en aucune façon limiter la portée de l'invention.
Les exemples font partie intégrante de la présente invention et toute caractéristique apparaissant nouvelle par rapport à un état de la technique antérieure quelconque à partir de la description prise dans son ensemble, incluant les exemples, fait partie intégrante de l'invention dans sa fonction et dans sa généralité.
Ainsi, chaque exemple a une portée générale.
D'autre part, dans les exemples, tous les pourcentages sont donnés en masse, sauf indication contraire, et la température est exprimée en degré Celsius sauf indication contraire, et la pression est la pression atmosphérique, sauf indication contraire.
Exemples
Exemple 1 - Caractéristiques de chitosanes de différentes masses moléculaires
Des chitosanes de différentes masses moléculaires sont préparés de la manière suivante : la chitine est mise en suspension aqueuse en présence d'hydroxyde de sodium, puis le milieu est porté à haute température pendant une durée variable selon la masse moléculaire désirée. Le chitosane est ensuite purifié par solubilisation en milieu acide et précipité en milieu alcalin, lavé et séché.
On détermine la viscosité dynamique de solutions de différents chitosanes d'origine fongique et crustacé de concentration 1 % (m/m) dans l'acide acétique 1 % (v/v) à l'aide d'un viscosimètre à mobile tournant Brookfield équipé d'un Spindle de type S34. On détermine également la masse moléculaire moyenne viscosimétrique (Mv) par viscosimétrie capillaire, et le degré d'acétylation par titration potentiométrique.
Tableau 1- Caractéristiques de chitosanes d'origine et masse moléculaire variable
Viscosité
dynamique DDA
Ref Gamme Origine Mv
à 1 % (mol%)
(mPa.s)
Ultra-low
CS1 A.bisporus 10 55000 86
(UL)
Ultra-low
CS2 A.bisporus 15 75000 85
(UL)
CS3 Low (L) A.bisporus 33 100000 81
CS4 Low (L) A.bisporus 40 1 15000 78
Médium
CS5 A.bisporus 50 130000 75
(M)
CS6 High (H) A.bisporus 154 220000 72
Ultra-
CS7 high Crustacé 489 ND 83
(UH)
Ultra-low
CS8 A.bisporus 12 ND 87
(UL)
CS9 Low (L) A.bisporus 32 100300 81
Médium
CS10 A.bisporus 63 150400 77
(M)
Médium
CS11 A.bisporus 78 ND 75
(M)
CS12 High (H) A.bisporus 101 190500 73 ND - Non déterminé
On voit que la masse moléculaire moyenne des chitosanes, déterminée par viscosimétrie capillaire, et la viscosité dynamique de leurs solutions à la concentration de 1 % (m/m) dans l'acide acétique à 1 % (v/v) sont corrélées. On classe les chitosanes par gamme de masse moléculaire, de 'ultra-low' (très faible) à 'ultra-high' (très élevée).
On peut ainsi estimer la masse moléculaire moyenne viscosimétrique d'un chitosane au départ de la viscosité dynamique de sa solution à 1 % (m/m) dans l'acide acétique à 1 % (v/v). Par exemple, le chitosane de référence CS7 d'origine crustacée a une masse moléculaire moyenne viscosimétrique estimée supérieure à 400,000, au vu de sa viscosité en solution de 489mPa.s.
Ainsi, la valeur de la viscosité dynamique à 1 % peut être utilisée pour estimer la masse moléculaire d'un chitosane.
Exemple 2 - Viscosité dynamique de solutions de chitosane dans l'acide acétique 1 % (v/v) en fonction de la concentration en chitosane (%, m/m)
Des chitosanes de différentes masses moléculaire (préparés selon l'exemple 1 ) sont mis en solution dans l'acide acétique 1 % (v/v) à des concentrations de 0.5% à 5%. La viscosité dynamique est mesurée à l'aide d'un viscosimètre à mobile tournant Brookfield, équipé d'un spindle de type S34.
Tableau 2 - Viscosité dynamique (mPa.s) en fonction de la concentration en chitosane
Concentration
0,5% 1 ,0% 1 ,5% 2,0% 2,5% 3,0% 4,0% 5,0%
(%, m/m)
Référence
Gamme Viscosité dynamique (mPa.s)
chitosane
UL CS1 10 39
UL CS2 15
L CS3 33 130
M CS5 50 250
H CS6 154 700
UH CS7 489 1540
UL CS8 12 22 38 64 105 244
L CS9 32 79 162 319 594 1905 5712
M CS10 62 171 451 996 2060 7700 38000
M CS1 1 78 237 579 1 194 2790 1 1900
H CS12 27 101 307 828 2105 4210 24940 On comprend de ce tableau 2 que la viscosité des solutions de chitosane augmente avec la concentration en chitosane, et ce d'autant plus que la masse moléculaire est élevée. La relation entre le logarithme de la viscosité et la concentration en chitosane est linéaire. La pente de la courbe du log de la viscosité en fonction de la concentration est d'autant plus élevée que la masse moléculaire du chitosane est élevée.
Les inventeurs ont mis en avant de manière surprenante que les chitosanes de l'invention sont particulièrement bien adaptés pour préparer des caillots de sang de manière aisée et qui soient homogènes, car pour les chitosanes de masses moléculaires élevées, les chaînes sont de longueur trop importante et susceptibles d'avoir une mobilité réduite et faire résulter en des mélanges non homogènes du chitosane avec le sang avant que le caillot ne se forme, ce qui n'est pas désiré.
Les chitosane de masse moléculaire plus faible, par exemple dans la gamme 'low' et 'ultra-low', permettent d'augmenter la concentration sans compromettre l'homogénéité du mélange avec le sang.
Exemple 3 - Rapidité de formation d'un caillot de sang frais en présence de solution de chitosane de différentes masses moléculaires
Dans cet exemple, on forme des mélanges entre des solutions de chitosane de masse moléculaire (exprimée en terme de viscosité à 1 %) et de sang fraîchement prélevé sur des adultes humains volontaires, dans le but d'obtenir un mélange homogène et un caillot ferme, souple, non rétracté et non fragmenté. L'objectif clinique est que ce caillot puisse être manipulé facilement par un chirurgien, afin de l'apposer sur une surface ostéo- chondrale, par exemple une lésion du cartilage ayant été préalablement percé par des microfractures - sous la forme de microtunnels. La procédure peut se faire par implantation, appelée mini-arthrotomie, ou bien par athroscopie, c'est-à-dire à travers une aiguille sous endoscopie, si la lésion peut être visualisée entièrement au travers du champ de vision arthroscopique, comme décrit pas Stanish et al. (J Bone Joint Surg Am. 95,1640, 2013) et Steinwachs et al. (Arthroscopy Techniques 3, 399, 2014). Dans ce cas, il est avantageux que le caillot soit souple, non fragmenté et résistant, pour pouvoir être injecté au travers l'aiguille et être positionné de manière homogène durable à l'entrée des microtunnels, en vue de les combler et de stimuler la régénération du cartilage de manière équivalente sur l'ensemble de la lésion. On recherche à ce que le mélange du sang frais du patient et de la solution de chitosane soit homogène avant la formation du caillot ; en effet la réparation doit se faire de manière homogène sur toute la surface de la lésion, c'est-à-dire qu'on vise à ce que le comblement des microtunnels soit équivalent d'un microtunnel à un autre et que la quantité de de la composition (de chitosane en mélange avec le sang) en contact avec la surface ostéo-chondrale soit être répartie de manière homogène. En outre, le caillot ne doit pas fragmenter et doit être déformable pour pouvoir s'étaler correctement sur la surface du cartilage et ne pas être décroché au cours de l'intervention.
Simultanément à l'homogénéité du mélange sang/chitosane avant formation du caillot, on recherche une durée de formation du caillot significativement plus rapide que celle des compositions chitosane/sang décrites dans la littérature ou commercialisés. Par exemple, on recherche une formation plus rapide du caillot, selon notre méthode de détermination de la durée de formation du caillot, que celle de la solution du chitosane CS7 à 2.05% et utilisée comme contrôle dans cet exemple. Cette solution « contrôle » fournit un caillot en 15 minutes, avec une rétraction de 0.2%.
En particulier, on cherche une durée de formation du caillot de moins de 10 minutes, idéalement de moins de 5 minutes, tout en ayant un caillot en une partie (sans fragment, conservant son intégrité), qui ne se rétracte pas et qui résiste à une compression manuelle. Dans cet exemple, on ne caractérise donc que les caillots dont la durée de formation est inférieure ou égale à 10 minutes.
Dans cet exemple, on travaille avec des solutions de chitosane à pH et osmolarité physiologiques, c'est-à-dire pH de 6,8 à 7,2 et osmolarité de 275 à 325mOsm/kg.
Le rapport volumique sang sur solution de chitosane du mélange est fixé à 3 :1 (v/v). On prépare des solutions de chitosane de concentration allant de 2% à 4%. Des chitosanes de masse moléculaire variable sont utilisés, ce qui permet d'étudier l'influence de la masse moléculaire du chitosane sur la durée de formation d'un caillot complet, non rétracté et résistant à une compression manuelle.
Préparation des solutions de chitosane à pH 7.0
Une solution de beta-glycérophosphate (GP) est préparée par dissolution de beta- glycérol-phosphate de sodium, d'eau de qualité pharmaceutique pour injection et d'acide chlorhydrique 1 N. Cette solution est ensuite filtrée sur 0.2μηι. Le chitosane est dispersé dans cette solution, puis on ajoute un volume d'acide acétique glacial variable en fonction de la concentration en chitosane pour atteindre un pH de 7,0 ± 0,2. Cette solution est ensuite stérilisée par autoclave. La concentration en GP finale est de 2% (m/m), le pH est de 7,0 ± 0,2 et l'osmolalité est de 300 ± 25 mOsmol/kg. Prélèvement sanguin et préparation du mélange sang/solution de chitosane :
Les prélèvements de sang complet sont réalisés par un personnel qualifié auprès d'adultes humains volontaires. Chaque échantillon de sang est analysé afin de détecter des anomalies éventuelles au niveau de la coagulation. Si une anomalie est détectée, le test n'est pas poursuivi pour cet échantillon.
Le sang complet fraîchement prélevé, c'est-à-dire moins de 5 minutes avant usage, est mélangé à la solution de chitosane/beta-glycérophosphate (GP) à un ratio volumique de 3/1 , en mélangeant 1 ,5 ml de solution de chitosane/GP et 4.5 ml de sang. Le mélange sang/chitosane est ensuite légèrement agité manuellement pendant 10 secondes.
Les caillots sont formés de la manière suivante :
0,3 ml du mélange chitosane/sang sont versés dans un tube en verre ;
Le tube est ensuite placé dans un bain thermostaté à 37°C, sans agitation.
Après 5, 10 et 15 minutes, l'aspect des caillots est vérifié en faisant basculer doucement le tube. On détermine visuellement si le caillot est formé au centre (caillot complet), ou si seuls les bords du caillot sont solidifiés, ou si le sang coule toujours. On note la durée nécessaire à la formation du caillot complet.
A titre de comparaison, on réalise le caillot avec du sang frais sans ajout de solution de chitosane/GP.
Taux de rétraction du caillot
Les caillots sont laissés à incuber durant 1 heure dans un bain thermostatisé à 37°C, sans agitation. Après 1 heure d'incubation, le caillot s'est plus ou moins rétracté, ce qui provoque une expulsion d'un certain volume de sang. Pour déterminer le taux de rétraction, le tube et le caillot sont pesés ensemble à la sortie du bain. Le liquide expulsé du caillot est ensuite retiré à l'aide d'une seringue en verre munie d'une aiguille. Le tube et le caillot sont à nouveau pesés ensemble. Le taux de rétraction est déterminé selon le calcul suivant :
masse (tube+caillot sortie du bain)*100
A titre de comparaison, le caillot avec du sang frais se rétracte d'environ 40%.
Test de compression
Une fois le test de rétraction réalisé, les caillots sont déposés dans une boîte de pétri. Une force de compression est appliquée manuellement sur le caillot afin de déterminer sa résistance, caractérisée par l'observation visuelle de l'effet de la compression: libération de sang après compression et/ou fragmentation du caillot. Le test est toujours réalisé par la même personne avec une force de compression sensiblement identique.
Test de déformation :
Ensuite, on évalue visuellement si le caillot est apte à être déformé sans se désintégrer, par exemple à passer à travers une grosse aiguille de type 18 Gauge de diamètre interne 800 à 880μηι sous forme de grosses gouttes.
Test d'étalement/adhésion :
Ensuite, on évalue la capacité du caillot à être s'étendre sur une surface à traiter sans glisser trop facilement, en inclinant la surface à la verticale avec un angle d'environ 60° par rapport à l'axe horizontal.
Caractère homogène du mélange
Le caractère homogène du mélange sang/chitosane prélablement à la coagulation est simulé et évalué visuellement : on prépare la solution de chitosane à pH 7,0 ou pH 6,0, et on y ajoute un tampon phosphate pour mimer l'ajout de sang, dans un rapport volumique de 1/3 et dans un tube en verre. On agite manuellement pendant 10 secondes, et on observe le mélange. Si la formulation de chitosane est distribuée de manière uniforme, on considère que le mélange est homogène. Si on observe que le mélange forme quelques zones opaques et de consistance 'gélatineuse', on considère que le mélange est peu homogène. Si on observe que le mélange forme beaucoup de zones opaques de consistance gélatineuse, on considère que le mélange est non homogène.
Tableau 3 - Formation de caillot de sang frais en présence d'une solution de chitosane (pH 7 +/- 0.2 ; osmolalité entre 275 et 325mOsm/kg)
Maintien du caillot
Homogéné Ref Rétractio Aspect du sur la
Durée de
ité du chitosane n caillot et surface et formation
mélange et gamme du résistance capacité du caillot
PBS / (viscosité à caillot à la de complet
chitosane 1%, mPa.s) (%)** compression combleme nt de cavité
Sang fraîchement prélevé
> 15 min 40% NS NS
Concentration en chitosane 2.0% (m/m)*
Homogène CS1 UL (10) 15 min 0.2% NS NS
Homogène CS5 M (50) 15 min 0.5% NS NS Peu
CS10 M (63) 15 min 0,2% NS NS homogène
Peu
CS6 H (154) 15 min 0,2% NS NS homogène
Intègre
Du sang est
Peu Contrôle
15 min 0.2% libéré sous OK homogène CS7 UH (489) compression, peu déformable
Concentration en chitosane 3.0% (m/m)*
Homogène CS1 UL (10) 15 min 0.2% NS NS
Homogène CS2 UL (15) 15 min 0.2% NS NS
Homogène CS5 M (50) 15 min 0.1 % NS NS
Peu
CS10 M (63) 15min 0,2% NS NS homogène
Non
CS6 H (154) 15min 0,2% NS NS homogène
Non
CS7 UH (489) 15min 0,2% NS NS homogène
Concentration en chitosane 4.0% (m/m)*
Non fragmenté
Homogène CS1 UL (10) 5 min 0.5% Résistant, OK déformable
Non fragmenté
Homogène CS2 UL (15) 10 min 0.2% Résistant, OK déformable
Légèrement
fragmenté
Homogène CS4 L (40) 10 min 0.2% OK
Résistant,
déformable
Légèrement
fragmenté
Homogène CS5 M (50) 10 min 0.2% OK
Résistant,
déformable
Peu
CS10 M (63) 15min 0,2% NS NS homogène
Non
CS6 H (154) 15min 0,2% NS NS homogène
Non
CS7 UH (489) 15min 0,2% NS NS homogène
Concentration en chitosane dans la solution chitosane/glycérophosphate avant mélange avec le sang ; **Après 1 heure à 37°C.
NS : Caillot non satisfaisant pour le critère évalué Il ressort de ces résultats que les seules solutions de chitosane qui permettent de fournir un mélange homogène avec le sang frais sont celles réalisées avec les chitosanes de référence CS1 , CS2, CS4 et CS5 dont la viscosité à 1 % est de 10 à 50mPa.s. A partir de la viscosité à 1 % de 63mPa.s (CS10), le mélange est peu homogène, ce qui favorise la fragmentation du caillot formé.
Il ressort encore de ces résultats que l'augmentation de la concentration en chitosane permet de manière surprenant d'accélérer la formation du caillot de manière significative par rapport à la solution contrôle du chitosane CS7 à 2.0%. En dessous d'une concentration de 4% en chitosane, la durée de formation du caillot est d'au moins 15 minutes pour tous les chitosanes testés, ce qui n'est pas optimal.
On obtient une durée de formation du caillot significativement plus faible, c'est-à-dire inférieure ou égale à 10 minutes, pour les solutions de chitosane à 4% dont la masse moléculaire est faible (références CS1 , CS2, CS4 et CS5, de viscosité à 1 % de 10 à 50mPa.s).
II ressort également de cet exemple qu'avec une solution de chitosane de concentration 4% pour un chitosane de viscosité à 1 % de 10mPa.s (référence CS1 ), il est possible à la fois de fournir un mélange homogène entre le sang et une solution de chitosane et de glycérophosphate à pH 7, et de former un caillot en moins de 5 minutes, ce caillot étant très satisfaisant et répondant à tous les critères techniques recherchés (intègre, non rétracté, non fragmenté, résistant à la compression et la déformation).
Exemple 4 - Influence de la concentration de la solution de chitosane de faible masse moléculaire sur la durée de formation du caillot Dans cet exemple, on a étudié l'influence de la concentration en chitosane de faible masse moléculaire (viscosité à 1 % de 15mPa.s, chitosane de référence CS2) sur la durée de formation du caillot, dans une gamme de 2% à 5% (m/m).
Seuls les caillots formés en moins de 15 minutes sont caractérisés.
Figure imgf000034_0001
Les formulations de l'invention permettent de fournir des caillots présentant une durée de coagulation significativement plus faible (5 minutes) que celle de la solution contrôle du chitosane CS7 à 2.0%, qui est de 15 minutes.
Les résultats montrent de manière surprenante que la durée de formation du caillot est de 5 minutes lorsque le chitosane est de faible masse moléculaire et sa concentration supérieure à 3%. La concentration en chitosane n'influence pas la rétraction du caillot.
De plus, l'exemple 2 montre que la viscosité de la solution des chitosanes de faible masse moléculaire similaires à CS2 n'augmente pas de manière significative avec la concentration dans la gamme étudiée, ce qui ne compromet pas la formation d'un mélange homogène avec le sang frais, avant formation du caillot. Le fait de maintenir une viscosité de la solution de chitosane faible permet en outre une fabrication industrielle aisée, ce qui n'est pas le cas pour des chitosanes de masse moléculaire plus élevée, comme décrit à l'exemple 2.
Exemple 5 - Influence de la présence d'un sel de calcium sur la formation du caillot avec une formulation de chitosane de faible masse moléculaire
Dans cet exemple, on a étudié l'influence de la présence du chlorure de calcium (CaCI2) en concentration variable sur la formation du caillot préparé avec des solutions de chitosane de faible masse moléculaire (référence CS2, viscosité à 1 % de 15mPa.s) de concentrations 3 et 4%.
Le sel de calcium, sous forme de chlorure (Calcium chloride dehydrate, Merck (réf:1 .02465.1000)), est ajouté dans la solution de chitosane pour obtenir la concentration désirée, puis le glycérophosphate est ajouté.
Cette formulation est ensuite mélangée avec du sang frais le protocole décrit précédemment.
Tableau 5 - Formation de caillot de sang frais en présence d'une solution du chitosane CS2 (viscosité à 1 % de 15mPa.s), beta-glycérophosphate de sodium et chlorure de calcium (pH 7 +/- 0.2)
Maintien
Concentration Durée de Aspect du
Rétraction du caillot sur la en CaCI2 formation caillot et
du surface et capacité du caillot résistance
(mg/l) caillot (%)**
complet à la compression de comblement de cavité
Concentration en chitosane 3% (m/m)
Intègre, résistant à
0 15 min 0.2% la compression, NS
déformable
Intègre, très
résistant à la
25 15 min 0.2% NS
compression,
déformable
Intègre, résistant à
50 15 min 0.1 % la compression, NS
déformable
Intègre, résistant à
100 15 min 0.2% la compression, NS
déformable
Concentration en chitosane 4% (m/m)
Intègre, résistant à
Bonne adhésion
0 5 min 0.2% la compression,
et bon étalement déformable
Intègre, résistant à
Bonne adhésion
25 5 min 0.2% la compression,
et bon étalement déformable
Intègre, très
résistant à la Très bonne adhésion
50 5 min 0.2%
compression, et bon étalement déformable Intègre, très
résistant à la Très bonne adhésion
100 5 min 0.2%
compression, et bon étalement déformable
Il ressort de cet exemple que la présence de chlorure de calcium dans la solution de chitosane, à pH et osmolarité égaux, n'accélère pas la formation du caillot. Par contre, la présence de chlorure de calcium améliore sa cohésion, sa capacité à rester intègre sous compression et déformation et à ne pas laisser une partie du sang se libérer sous compression, et son caractère adhérent.
Ceci est avantageux pour la mise en place du caillot sur la surface à traiter, notamment par arthroscopie.
Il est également avantageux d'avoir ces propriétés de cohésion et d'adhésion renforcées pour pouvoir positionner le caillot de manière durable sur l'articulation à traiter, même si elle est en position non horizontale, sans que le caillot ne glisse sous l'effet de la gravité.

Claims

REVENDICATIONS
1 . - Composition comprenant un mélange d'une formulation de chitosane et d'un fluide coagulable, dans laquelle la formulation de chitosane présente une concentration d'au moins 2,5% de chitosane en masse par rapport à la masse totale de formulation de chitosane, ledit chitosane présentant une viscosité dynamique inférieure ou égale à 60mPa.s, mesurée dans l'acide acétique à 1 % (v/v), ladite composition comprenant au moins un sel organique de sucre ou de polyol.
2. - Composition, selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le chitosane présente une masse moléculaire moyenne viscosimétrique Mv allant de 20 000 (20k) à 145 000 (145k).
3.- Composition, selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la formulation de chitosane présente une concentration de chitosane supérieure à 2,5% et inférieure à 10% en masse par rapport à la masse de solution finale.
4. -Composition, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le chitosane est un chitosane d'origine fongique.
5. -Composition, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le sel organique de sucre ou de polyol est un monophosphate de polyol ou sucre.
6. -Composition, selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le sel organique de polyol est un glycérophosphate, et plus particulièrement un sel de beta-glycérophosphate disodique pentahydrate.
7. -Composition, selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le rapport volumique (v/v) entre le fluide coagulable et le chitosane est de 1/1 à
4/1 .
8. - Composition, selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisée en ce que l'osmolalité de la formulation de chitosane est comprise entre 250 et 400 mosm/kg, et de préférence de 275 à 325 mosm/kg.
9.- Composition, selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que la formulation de chitosane comprend un ou plusieurs sels inorganiques, et de préférence un sel de calcium.
10. -Composition, selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que le pH est compris entre 5,5 et 7,5, et de préférence va de 6 à 7.
1 1 . - Composition, selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que la composition comprend des cellules vivantes, par exemple des ostéoblastes.
12. - Dispositif médical comprenant ou consistant en une formulation de chitosane à une concentration d'au moins 2,5% de chitosane en masse par rapport au volume de formulation de chitosane, ledit chitosane présentant une viscosité dynamique inférieure ou égale à 60mPa.s, mesurée dans l'acide acétique à 1 % (v/v), destinée à être mélangée avec un fluide coagulable.
13. - Dispositif médical comprenant une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 1 1 .
14.- Dispositif médical comprenant plusieurs récipients, lesdits récipients étant éventuellement physiquement indépendants (« kit-of-part »), caractérisé en ce que le dispositif médical comprend au moins (i) un récipient renfermant une solution ou une poudre de chitosane, ledit chitosane présentant une viscosité dynamique inférieure ou égale à 60mPa.s, mesurée dans l'acide acétique à 1 % (v/v), et (ii) un récipient renfermant une solution d'un sel organique de sucre ou de polyol, ledit chitosane étant présent en quantité apte à former une formulation de chitosane et de sel organique de sucre ou de polyol dans laquelle la concentration de chitosane est supérieure ou égale à 2,5 % de chitosane en masse par rapport à la masse de formulation de chitosane, la formulation de chitosane étant formée par la mise en contact de la solution de chitosane et la solution d'un sel organique de sucre ou de polyol.
15.- Dispositif médical, selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une seringue de type double chambre, pré-remplie.
16.- Composition telle que définie à l'une des revendications 1 à éventuellement comprise dans un dispositif médical, pour son utilisation dans méthode de traitement thérapeutique.
17.- Composition telle que définie à l'une des revendications 1 à 1 1 , éventuellement comprise dans un dispositif médical, pour son utilisation dans une méthode de traitement thérapeutique d'une maladie articulaire.
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