WO2016091778A1 - Microbille d'hydrogel de chitosane - Google Patents

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WO2016091778A1
WO2016091778A1 PCT/EP2015/078770 EP2015078770W WO2016091778A1 WO 2016091778 A1 WO2016091778 A1 WO 2016091778A1 EP 2015078770 W EP2015078770 W EP 2015078770W WO 2016091778 A1 WO2016091778 A1 WO 2016091778A1
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hydrogel
chitosan
microbeads
microbead
solution
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PCT/EP2015/078770
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Renaud LECLER
Mickaël CHAUSSON
Pierre DOUETTE
Guillem ROCASALBAS
Sandrine Gautier
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Kiomed Pharma
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Publication date
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Definitions

  • the present invention relates to hydrogel microbeads, their method of manufacture and their uses, in particular in pharmaceutical compositions or medical devices, more particularly for the treatment of a pathology of a joint.
  • Chitosan is a naturally occurring polymer of known interest for many years. This polysaccharide can be obtained from animal sources such as from crustacean shell, but also from fungal sources from fungal cell walls.
  • Chitosan is for example used in the form of matrix to encapsulate active ingredients. It is usually used as a pharmaceutical vehicle. These vehicles may be in solid form, particularly when they are dried or lyophilized. Many patents relate to this technology.
  • hydrogel particles based on chitosan in the form of hydrogel have developed. These compositions have a particularly high level of water making them very different from the aforementioned matrices. In general, water represents more than 85% or even more than 90% by weight of the composition. Such hydrogel particles have a composition and properties very different from the chitosan matrices mentioned above. Such hydrogel particles are especially used in tissue engineering or also as vectors of active compounds.
  • any hydrogel is not suitable for forming beads that can be easily injected into the human or animal body.
  • hydrogel beads based on chitosan and alginate, in particular for their use in intra-articular supplementation. It is in this patent to improve the effects of a hydrogel by combining it with hydrogel beads, usable at least in this specific application. In particular, these beads have a life time after injection at the intra-articular high level as well as interesting mechanical properties where the injection is performed. Such beads are particularly interesting because of their properties, in particular their elastic properties, provided during the intra-articular injection.
  • the hydrogel beads according to this patent have trabeculae. Trabeculae are fibrillar or filamentous species present inside the hydrogel.
  • the application WO 2009/150651 still describes a hydrogel based on the combination of two solutions of chitosan of different characteristics, starting from an acid solution brought gradually to neutral pH.
  • the first chitosan is highly acetylated with a degree of acetylation of between 40% and 60%.
  • the second chitosan is highly deacetylated with a degree of acetylation of at most 20%.
  • Such hydrogels are sensitive to temperature which allows them to gel in situ, after injection into the human or animal body.
  • the application does not teach how to form hydrogel particles.
  • the present invention aims to provide chitosan hydrogel particles.
  • the present invention further aims to improve the stability of chitosan beads.
  • the present application aims to provide hydrogel beads that do not have solid particles, such as trabeculae.
  • the present invention also aims to provide hydrogel beads whose composition comprises chitosan, optionally mixed with other compounds. This composition is advantageously homogeneous.
  • the present invention also aims to provide hydrogel beads whose manufacturing process is industrializable, preferably by limiting the manufacturing costs and ensuring good reproducibility of the particles thus manufactured.
  • the object of the present invention is to simplify the manufacturing process, in particular by reducing the variability of the process, variability which is found in particular when several biopolymers are used as chitosans of different types or mixtures of chitosan and alginate, and in particular by reducing the number of process steps and the number of raw materials to be used.
  • the present invention aims to avoid the preparation of a preliminary solution containing alginate, while retaining the 'hydrogel' nature of the microbeads, ie the ability to remain stable while retaining a large amount of water, and to remain deformable and elastic to compression.
  • the object of the invention is to provide microbeads having good properties, for example good mechanical properties for the envisaged applications, and more specifically for intra-articular injections, for example good elastic properties and shock absorption properties. , good crush resistance, and good adhesion to tissue.
  • EP 2538987 B1 have a large diameter.
  • the article by Oprenyeszk et al. 2013, shows that such particles have a diameter of 600 to 900 micrometers ( ⁇ ).
  • the hydrogel beads are therefore not suitable for intra-articular injections which require fine needles of small diameter, especially in the context of articular diseases treated by intra-articular viscosupplementation and chronic joint diseases.
  • Such diseases are typically cartilage pathologies, which cause cartilage damage and defects and joint pain, such as osteoarthritis, for example due to aging or an accident.
  • To ensure ease of injection by the practitioner increase the comfort of the patient, limit the risk of misplaced injection and avoid the risk of infection, especially during repeated injections, it is necessary to use fine needles.
  • the present invention therefore still aims to provide an injectable composition intra-articularly which facilitates repeated injections, in particular through fine needles such as for example 18-22 Gauge type needles as recommended for most products viscosupplementation currently marketed, especially above 21 Gauge, or possibly even finer, for example 23 Gauge. It is therefore desired to develop microbeads whose properties and diameter distribution can be adjusted so that they can be easily injected through fine needles, in particular microbeads whose number-average diameter is less than 900 ⁇ m, preferably less than ⁇ , preferably less than 700 ⁇ , and more preferably whose D (0.9) is less than 900 ⁇ , preferably less than ⁇ , preferably less than 700 ⁇ .
  • the invention implements a specific manufacturing process for chitosan hydrogel microbeads, which does not include the formation of solid trabeculae in the microbeads, thus avoiding the disadvantages mentioned in the prior art, surprisingly. It is apparent from reading the prior art discussed above that the solution provided by the present invention was not obvious to those skilled in the art.
  • the microbeads of the invention make it possible to increase the proportion of chitosan.
  • the principle of gelling alginate by a calcium ion is not the principle that is implemented.
  • the invention uses the principle of the crosslinking of chitosan by polyphosphate ions to obtain a composition of chitosan hydrogel. It is already known to form solutions of chitosan in the presence of sodium beta-glycerophosphate, for example solutions of chitosan and beta-glycerophosphate having the property of gelling when the temperature increases, for example at the temperature of the human body. It is also known to stabilize solid and dry microspheres of chitosan by combining it with sodium tripolyphosphate.
  • the present invention also makes it possible to increase the stability of chitosan by acting on the non-covalent crosslinking of chitosan, and not on the gelling of alginate in the presence of a calcium ion, via the chelation of the calcium ion by alginate.
  • the invention more specifically relates to a hydrogel particle or ball, and more particularly to a hydrogel microbead.
  • the present invention relates to a hydrogel microbead comprising at least water, chitosan, at least one polyphosphate compound, the water being present at a concentration of at least 85% by weight of hydrogel, said ball having a mean diameter in number ranging from 100 to 900 ⁇
  • beams means a particle of substantially spherical shape. Such a shape can be appreciated by microscope. Such a ball can have inherent imperfections in the manufacturing process.
  • microbead means a ball having a size less than 1000 micrometers.
  • the beads according to the invention advantageously have a number average diameter of between 200 and 800 micrometers, and advantageously between 300 and 700 micrometers.
  • the balls according to the invention have a number average diameter preferably of between 100 and 500 micrometers, and preferably between 200 and 500 micrometers.
  • the measurement of the average diameter by number of the balls according to the invention is preferably carried out by optical microscopy, according to the following method:
  • the number average diameter, the standard deviation and the coefficient of variation of a population of microbeads are measured using an inverted optical microscope, for example of the OLYMPUS brand, model CKX41 and equipped with a camera and a 20X lens.
  • a fraction of the population of microbeads is placed in an observation cup itself placed under the objective.
  • a digital photo is taken after adjusting the image.
  • the program "LABSENSE" brand OLYMPUS and accompanying the microscope allows tracing straight lines calibrated according to the lens used. A minimum of 20 balls is selected on the image and a diagonal is drawn by the program on each of them.
  • the program allows direct visualization of the measurement. These measurements are reported on a spreadsheet, for example EXCEL of the MICROSOFT brand, and the following variables are calculated.
  • the average is calculated using the formula ⁇ 1 1 * '
  • the coefficient of variation C v is calculated using the formula (standard deviation divided by mean):
  • N represents the number of balls of the sample whose diameter is measured
  • X represents the diameter measured for a ball
  • i being an integer ranging from 1 to n.
  • the diameter distribution of the microbeads can also be measured by a laser diffraction method, for example using a Malvern Mastersizer equipment, for example a Mastersizer 2000, using a preference measurement protocol according to the IS013320 standard: 2009 or following the monograph of the European Pharmacopoeia EP2.9.31, implementing Mi's theory.
  • the distribution of the beads is narrow, that is to say with a small dispersion of the diameter of the balls relative to the average diameter, that is to say for example a dispersity index of less than 2 measured by laser diffraction, for example as mentioned above.
  • the microspheres have a D (0, 1) between 100 and 600 microns, and advantageously between 200 and 400 microns.
  • the microbeads have a D (0.5) comprised alternatively between 100 and 800 micrometers, and preferably between 300 and 700 micrometers.
  • the microbeads have a D (0.5) comprised alternately between 300 and 600 micrometers.
  • the microspheres have a D (0.9) of between 100 and 1000 micrometers, and advantageously between 300 and 950 micrometers.
  • the microspheres have a D (0.9) of between 100 and 950 micrometers, and advantageously between 300 and 900 micrometers, more advantageously between 300 and 800 micrometers.
  • the microspheres have a D (0.9) of between 200 and 700 microns, and advantageously between 300 and 650 microns.
  • the invention relates in particular to sterilized or non-sterilized hydrogel beads whose diameter D (0.9) is:
  • the hydrogel microbeads comprise at least 95% water by weight. According to a specific variant, the hydrogel microbeads comprise at least 97% by weight of water.
  • the chitosan is present at a concentration of 0.3 to 10% by weight, and the polyphosphate compound (s) being present in an amount sufficient to form a hydrogel microbead, the percentages by mass being expressed relative to the mass of the microbead.
  • the chitosan is present in the hydrogel at a concentration of between 0.5 and 5%, and preferably between 1.0 and 3% by weight of chitosan, the percentages by weight being expressed relative to the mass of the microbead.
  • the mass percentages expressed relative to the mass of the hydrogel microbead are expressed relative to the constituents of the hydrogel. Percentages in mass expressed relative to the mass of the hydrogel microbead is preferably an active agent-free hydrogel microbead, for example cells, polypeptides, proteins, polynucleosides or polynucleotides, which have a therapeutic and which are not directly necessary for the preparation of the hydrogel.
  • the microbead comprises between 1.0 and 3.0% and for example 1.5% by weight of chitosan.
  • Chitosan is referenced as CAS No. 9012-76-4.
  • the chitosan of the invention is a polysaccharide preferably prepared from a fungal source. It is preferably extracted and purified from safe and abundant food or biotechnological fungal sources such as Agaricus bisporus or Aspergillus niger. Chitosan is obtained by hydrolysis of an extract rich in chitin. Chitin is a polysaccharide composed of several N-acetyl-D-glucosamine units linked together by a ⁇ -type bond (1, 4).
  • Chitosan consists of D-glucosamine units (deacetylated units) and N-acetyl-D-glucosamine units (acetylated units) linked together by ⁇ -type bonds (1, 4) and constitutes a poly-type polymer ( N-acetyl-D-glucosamine) -poly (D-glucosamine).
  • the chitosan of the invention is therefore advantageously of fungal origin, and preferably derived from the mycelium of a mushroom of the Ascomycete type, and in particular of Aspergillus niger, and / or of a Basidiomycete fungus, and in particular Lentinula edodes. (shiitake) and / or Agaricus bisporus.
  • the fungus is Agaricus bisporus.
  • Any origin and method of preparation of chitosan may be used.
  • a method for preparing chitosan is that described in the patents resulting from the application WO03068824 (EP1483299; US 7,556,946).
  • Chitosan is advantageously a chemically unmodified chitosan by a covalent coupling reaction with one or more other chemical species.
  • Chitosan is advantageous for its ability to form particles of three-dimensional structure of the mechanically resistant hydrogel type, its biocompatibility and its biodegradability after administration or implantation.
  • the presence of chitosan in such hydrogel particles is desired for its intrinsic, physicochemical and / or biological properties, for example for its ability to adhere to biological surfaces or its ability to stimulate tissue healing.
  • the average molecular weight of chitosan is less than or equal to 80,000. According to one variant, the molecular weight of chitosan is between 15,000 and 70,000, and preferably between 35,000 and 60,000. According to another variant, the average molecular weight of chitosan is greater than 80000. In particular, the molecular weight of chitosan is greater than 140000. The upper limit and in general imposed by the viscosity of the chitosan solution. It is preferred to use a chitosan whose average molecular weight is less than 1,000,000.
  • the average molecular weight is the viscosity average molecular weight (Mv), calculated from the intrinsic viscosity according to the Mark-Houwink equation.
  • the intrinsic viscosity is measured by capillary viscosimetry, with a Ubbelohde capillary viscometer, according to the method of the European Pharmacopoeia monograph EP2.2.9.
  • the flow time of the solution is measured through a suitable capillary tube (Lauda, for example the capillary tube Ubbelohde 510 01 with a diameter of 0.53 mm) using an automatic viscometer Lauda Vise, first at the concentration initially in chitosan, then for several dilutions, for example according to the recommendations of method EP2.2.9.
  • the reduced intrinsic viscosity is deduced for each of the concentrations.
  • the reduced viscosity is plotted as a function of temperature, and the value is extrapolated to the concentration 0 to deduce the intrinsic viscosity.
  • red in ml / g) of the dilutions as a function of the concentration C of the dilutions (g / ml) according to formula 5 should be used.
  • chitosan may have a degree of acetylation between
  • the degree of acetylation is determined by potentiometry. Chitosan is dissolved in a solution of hydrochloric acid. The excess of unreacted hydrochloric acid with the amino functions of chitosan is determined by a standard solution of sodium hydroxide. This gives the number of moles of D-glucosamine unit present in the chitosan and thus by subtraction the degree of acetylation.
  • the chitosan solution at a concentration of 1.5% (w / v) in 1% (v / v) acetic acid can have a dynamic viscosity of between 100 and 500mPa.s.
  • the chitosan of the present invention may have a dynamic viscosity of between 50 and 400 mPa.s in a 1.5% solution.
  • the dynamic viscosity of the chitosan solution at 1.5% (w / v) is preferably between 150 and 300mPa.s, and more preferably between 200 and 280mPa.s.
  • the viscosity is typically measured by rotating mobile viscometry, for example on a Brookfield DV2T device at a rotation speed of 5 rpm with a Spindle SC4-18 needle at 25 ° C.
  • the polyphosphate compound is preferably a salt of an organic or inorganic polyphosphate compound.
  • organic polyphosphate compounds examples include phytic acid, in particular sodium inositol hexakisphosphate, or a glycerophosphate, for example sodium beta-glycerophosphate.
  • inorganic polyphosphate compounds examples include tripolyphosphate, in particular sodium tripolyphosphate.
  • the polyphosphate compound is chosen from phytic acid, for example sodium phytic acid, a tripolyphosphate, for example sodium tripolyphosphate, a glycerophosphate such as, for example, sodium beta-glycerophosphate, and any of their mixtures.
  • Phytic acid or hexaphosphoric myo-inositol acid or also hexakisphosphoric acid inositol is a biomolecule of the empirical formula CeH 2 C 2 P 6
  • Phytic acid is a compound of ubiquitous plants, present at 1 -5% by mass of most cereals, nuts, seed oil, spores, and pollens. It typically represents 60 to 90% of the total phosphorus content of the seeds. It is found as a mixture of salts, typically calcium / magnesium and potassium in some parts of the seeds. This molecule is highly charged with the six phosphate groups extending from the center of the myo-ionisol nucleus, with each group having its own pKa. The properties of phytic acid can be found, for example, in the article by Evans et al. (Titration Studies of Phytic Acid, JAOCS, 59, 4, 1982).
  • phytic acid is present in the hydrogel of microbeads at a concentration of 0.5 to 10% by weight.
  • the phytic acid is present in the hydrogel at a concentration of at least 1%, and preferably at least 2% by weight of phytic acid.
  • the microbead comprises between 2 to 10%, and more particularly from 4 to 8% by weight of phytic acid.
  • the present invention relates to a microbead comprising 1 to 2% of chitosan and at least 3% by weight of phytic acid.
  • composition of the microbead comprises 1.5% of chitosan and 4 to 8% of phytic acid in mass relative to the mass of the total composition of the microbead.
  • the microbead comprises between 0.5 to 5%, and more particularly from 1 to 5% by weight of tripolyphosphate, preferably of sodium tripolyphosphate.
  • the present invention relates to a microbead comprising 1 to 1% of chitosan and at least 0.5% by weight of tripolyphosphate, preferably sodium tripolyphosphate.
  • An exemplary microbead composition comprises 1.5% chitosan and 1 to 2% tripolyphosphate, preferably sodium tripolyphosphate, by weight based on the weight of the total composition of the microbead.
  • the microbead comprises between 2% to 10% and more particularly from 4% to 8% by weight of glycerophosphate, preferably sodium betaglycerophosphate.
  • the present invention relates to a microbead comprising 1 to 2% of chitosan and at least 3% by weight of glycerophosphate, preferably a sodium beta-glycerolphosphate.
  • An exemplary composition of the microbead comprises 1.5% chitosan and 4-8% glycerophosphate, preferably a sodium beta-glycerophosphate by mass relative to the mass of the total composition of the microbead.
  • the microbead comprises a basic amount sufficient to raise the pH to a value allowing the formation of hydrogel microbeads of the invention.
  • mineral bases such as, for example, sodium hydroxide, sodium carbonate, potassium hydroxide and the like.
  • the microbead After washing with successive baths of water, the microbead contains water, chitosan and the polyphosphate compound.
  • chitosan In addition to water, chitosan, the polyphosphate compound, the microbead of the present invention may comprise different excipients and / or different active ingredients.
  • the agents promoting the gelling of the bead mention may be made of the agents promoting the gelling of the bead, the agents for modifying the viscosity, the agents for modifying the rheology, and agents for modifying the kinetics of degradation of the microbeads in vivo, etc.
  • the composition of the microbeads is advantageously non-thermogelifiable. Indeed, to ensure good stability of the balls before and after injection, typically by Intra-articular route, freezing or sol-gel transition should not occur after or at the time of injection.
  • the microbeads of the invention are in hydrogel form before their application, in particular by injection into the body of a subject in need, in particular at the intra-articular level.
  • the microbeads are in hydrogel form during storage, for example at room temperature or in the cold, and are not sensitive to temperature variations between 8 and 40 ° C., that is to say that they are not disintegrated or degraded in this temperature range.
  • the microbeads may be suspended in a viscous solution or a hydrogel, which, advantageously, may be thermally gelable.
  • a viscous solution or a hydrogel which, advantageously, may be thermally gelable.
  • This is typically a hydrogel of one or more gel polysaccharides.
  • the present invention also relates to a viscous solution or a hydrogel, thermogelifiable or not, comprising a plurality of microbeads of the invention.
  • composition of the microbead according to the invention may also comprise compounds of interest, particularly at the pharmaceutical level (active pharmaceutical ingredient) and even more specifically for intra-articular action, more particularly on cartilage. It is even more specifically beneficial agents in compositions for intra-articular use, for example to reduce pain or decrease inflammation.
  • anti-inflammatory drugs more particularly non-steroidal drugs, anesthetic agents, analgesic agents, in particular of the opioid type, corticosteroids, anti-neoplastics, monoclonal antibodies, vitamins minerals, contrast agents, etc.
  • Non-steroidal drugs may for example be mentioned for example: Diclofenac TM, Ibuprofen TM, Piroxicam TM; anesthetics, for example: Lidocaine TM, Bupivacaine TM; opioid analgesics for example: codeine, morphine; corticosteroids, for example: dexamethasone, prednisone; anti-neoplastic agents, for example: Methotrexate TM; antiviral agents, for example: Acyclovir TM, Vidarabine TM; monoclonal antibodies, for example: Humira TM Infliximab TM.
  • Diclofenac TM Diclofenac TM
  • Ibuprofen TM Piroxicam TM
  • anesthetics for example: Lidocaine TM, Bupivacaine TM
  • opioid analgesics for example: codeine, morphine
  • corticosteroids for example: dexamethasone, prednisone
  • microbeads of the invention in particular that can be used as intra-articular injectable supplements, may also contain compounds such as cells, proteins, polynucleotides (RNA, DNA), minerals such as, for example: selenium, strontium, vitamins as for example: tocopherol, or other active agents such as curcumin.
  • compounds such as cells, proteins, polynucleotides (RNA, DNA), minerals such as, for example: selenium, strontium, vitamins as for example: tocopherol, or other active agents such as curcumin.
  • RNA polynucleotides
  • minerals such as, for example: selenium, strontium
  • vitamins as for example: tocopherol or other active agents such as curcumin.
  • curcumin such as curcumin.
  • the hydrogel microbeads according to the present invention have a homogeneous hydrogel structure.
  • the hydrogel microbeads according to the present invention do not have trabeculae or solid particles inherent in the preparation of the hydrogel. It is not excluded that active agents are in solid or colloidal form, for example in nanoparticulate form.
  • the microbeads of the invention are cohesive.
  • the cohesion of the balls is not lost during the friction between the hands.
  • the beads advantageously have good compressive strength, especially when handling between the fingers.
  • a resistance can be evaluated, for example, by measuring the compressive strength of a mechanical compression bench (for example an Instron Bluehill equipment).
  • a nanoindentation technique for example with the Picoindenter range of PI series equipment marketed by the company Hysitron or the Mach 1 marketed by Biomomentum
  • a suitable tribology technique for example with the range. Tl Series Triboindenteur equipment marketed by Hysitron).
  • the balls are deformable and can be injected by a needle into the inner diameter is smaller than the maximum diameter of the balls. This has a great advantage for injection into a tissue because with equal inner diameter, a smaller outside diameter needle can be used, thus forming a smaller diameter hole.
  • microbeads can be manufactured advantageously according to the method of the invention.
  • the invention therefore relates to a process for the preparation of hydrogel microbeads according to the invention.
  • the process of the invention comprises adding a chitosan solution to a crosslinking solution comprising at least one polyphosphate compound, and then gelling the chitosan in the presence of the crosslinking solution to form the hydrogel microbeads. .
  • the chitosan is preferably dissolved in an aqueous solution at a pH below 7.
  • a solution typically comprises an acid, preferably a weak one, such as an organic acid. It is advantageous to use acetic acid.
  • the solution typically comprises 0.5 to 3% of acetic acid expressed in volume relative to the total volume of the chitosan solution
  • the pH of the chitosan solution is typically between 2 and 6.5, and preferably between 3.5 and 6.0.
  • 1.5% (w / v) ranges from 100 to 300 mOsm / kg at a temperature of 25 ° C.
  • the determination of the osmolarity of the solutions is carried out with an automatic micro osmometer (Osmometer Type 15M from Loser Messtechnik).
  • the equipment is calibrated beforehand with a solution of 300mosm / kg.
  • the sample is placed in a container provided for this purpose, and is put to the standard temperature of the measurement.
  • the gelling of the droplets of the chitosan solution in the form of microbeads takes place under conditions suitable for gelling the chitosan solution and the polyphosphate compound.
  • one or more polyphosphate compounds may be added to the chitosan solution, before this solution is dripped into the crosslinking solution comprising one or more polyphosphate compounds identical to or different from those added to the chitosan solution.
  • polyphosphate compound can be added to the chitosan solution.
  • the crosslinking solution has a pH of between 8 and 14, more particularly between 9.5 and 14, adjusted by adding a dilute solution of a base, for example sodium hydroxide.
  • the crosslinking solution is a solution of phytic acid and of sodium hydroxide having a pH of between 5.5 and 7, for example of approximately 6.
  • the crosslinking solution is a solution of phytic acid and sodium hydroxide having a pH of between 8 and 14.
  • the crosslinking solution is a solution of phytic acid and sodium hydroxide having a pH of between 8 and 10, for example about 9.
  • the crosslinking solution is a solution of phytic acid and sodium hydroxide having a pH of between 11 and 14, for example about 13.
  • the base concentration in the crosslinking solution is determined by those skilled in the art in order to obtain the desired pH.
  • a base concentration of from 0.01 to 1 M, and more specifically from 0.05 to 0.75 M, can typically be used in the crosslinking solution.
  • Gelation is performed by contacting the chitosan solution dropwise with a crosslinking solution comprising at least one polyphosphate compound, or optionally one or more other gelling agents.
  • the device for the formation of the drops and their gelation may be of the "prilling" type, that is to say a grilling process.
  • a device comprising a drop production nozzle having an internal diameter of greater than or equal to 100 ⁇ is preferably used. one can for example use a diameter of 100 or 150 ⁇ .
  • a batch process may be used, for example by passing the solution through a needle using a peristaltic pump. It is also possible to use a continuous, industrially appropriate process. Examples of continuous processes include, for example, an electromagnetic laminar jet process also called prilling, as with the continuous VAR-D equipment (marketed by Nisco) or others such as for example a training process. electrostatic drops, or coaxial air flow, or dynamic air flow, or by gravity, or by spray (or "spray drying"), or by continuous extrusion with the outgoing jet cut using a rotary tool (called Jetcutter, as with Genialab equipment). When the droplets of chitosan solution fall into the crosslinking solution comprising the polyphosphate compound, stirring can be carried out, for example using a magnetic bar, for example a speed of between 50 and 500 rpm.
  • a magnetic bar for example a speed of between 50 and 500 rpm.
  • the process comprises washing the microbeads, preferably with an aqueous solution, and more preferably water. Intensive washing is preferably carried out under conditions capable of obtaining hydrogel microbeads of constant diameter from one wash to another.
  • the process of the invention comprises for example the recovery of microbeads by gravity.
  • the beads settle to the bottom of the container containing the solution, typically the washing bath container.
  • the solution can be removed by a suction device, such as through a needle whose characteristics (typically the diameter) do not allow the passage of microbeads.
  • a suction device such as through a needle whose characteristics (typically the diameter) do not allow the passage of microbeads.
  • the microbeads remaining in the container remain, which can be manipulated for subsequent operations.
  • the present invention also relates to sterile microbeads.
  • the microbeads are sterilized with moist heat, typically using an autoclave.
  • the autoclave conditions are a temperature of about 121 ° C for a period of at least 15 minutes.
  • the present invention also relates to a method for sterilizing the microbeads described in the invention.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition or a medical device comprising a plurality of microbeads according to the invention or obtained according to the method of the invention.
  • the present invention also relates to an injectable pharmaceutical composition comprising the microbeads of the invention.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition or a medical device consisting of an artificial synovial fluid.
  • the pharmaceutical composition or the medical device is useful in the treatment of a pathology of a joint.
  • the pharmaceutical composition or medical device is useful in the treatment of pain or discomfort associated with a pathology affecting a joint or to slow the progression of a pathology of a joint.
  • the present invention also relates to a medical device, possibly in the form of one or more packaging kits, possibly physically separated, comprising a syringe, a needle and a pharmaceutical composition or medical device according to the invention, said syringe comprising a reservoir optionally prefilled with the pharmaceutical composition or medical device mentioned above.
  • the present invention relates to such a medical device for its use in the treatment of a joint pathology comprising the injection of a pharmaceutical composition or medical device according to the invention intra-articularly.
  • the present invention also relates to hydrogel microbeads according to the invention, or obtained according to the invention for its use in the treatment of a pathology, by injection into the human or animal body, possibly presence of a solution or injectable hydrogel .
  • the needle used is a needle selected from 18 to 22 gauge needles, more preferably 22 gauge and larger.
  • the needle used has normal walls, thin or extra-fine.
  • the present invention also relates to a method for supplementing the synovial fluid, in particular in a pathology affecting a joint, such as osteoarthritis (osteoarthritis or osteoarthritis) or cartilage lesions, etc.
  • the present invention further relates to a method of combating pain or discomfort associated with a condition affecting a joint.
  • the present invention further relates to a method of controlling inflammation of a joint.
  • pathologies are for example: osteoarthritis
  • osteoarthritis primary (idiopathic) or secondary
  • rheumatoid arthritis rheumatoid arthritis
  • joint injury eg, traumatic or joint mobility injury
  • cartilage pathology eg, chondrocalcinosis or chondromalacia
  • the present invention further relates to a method of reducing or combating the pain associated with a disease, for example as those mentioned above, or to slow down the progression.
  • the present invention further relates to a method for improving bone repair, particularly cartilage.
  • Such methods typically include intra-articular injection of a composition comprising microbeads according to the invention.
  • the method according to the invention comprises a plurality of injections.
  • an injection can be made once or twice a month for several months.
  • two injections spaced apart from a variable time are carried out.
  • a single injection is made.
  • the methods of the invention are useful for a subject in need, such as for example a subject requiring the treatment of an articular pathology.
  • the injection site or sites are typically chosen from: a knee, a shoulder, a hip, a temporomandibular joint, a carpometacarpal joint, an elbow, ankle, a wrist, a joint of the hand, a disc intervertebral, or other joint.
  • the injection is performed in an articular cavity, in contact with the cartilage.
  • a viscous solution or a hydrogel for example to a viscosupplement, for example comprising a hyaluronic acid
  • G ' modulus of elasticity
  • the present invention also relates to the use of microbeads according to the invention, or obtained according to the invention, for modifying the properties, in particular the mechanical properties, of a viscosupplement for example injectable at a joint.
  • microbeads of the invention are used in tissue engineering or as vectors of active compounds, in particular as vectors of pharmaceutically active compounds.
  • composition according to the invention or equivalent terms means a defined composition, method or process as in the present invention, including any one of the variants, particular or specific embodiments, independently or according to any of their combinations, including according to the preferred features.
  • FIG. 1 represents an optical microscope observation of the hydrogel microbeads formed in the presence of the crosslinking solution containing sodium betaglycerophosphate at a concentration of 5% and sodium hydroxide at a concentration of 0.1M (No. 7).
  • FIG. 2 represents an optical microscope observation of the hydrogel microbeads formed in the presence of the crosslinking solution containing the
  • sodium tripolyphosphate at a concentration of 2%, sodium glycerophosphate at a concentration of 5% and sodium hydroxide at a concentration of 0.1M (No. 8).
  • each example has a general scope.
  • all percentages are given by weight, unless otherwise indicated, and the temperature is expressed in degrees Celsius unless otherwise indicated, and the pressure is atmospheric pressure unless otherwise indicated.
  • the outer diameter (OD) (min - max) denotes the tolerance according to the aforementioned standard. Unless otherwise indicated, the internal diameter of the needles mentioned is normal / regular walls.
  • the pH of the chitosan solution is about 4, its osmolarity at 25 ° C is about 150mOsm / kg, and its dynamic viscosity is about 220mPa.s (measured by viscometry rotating mobile with Brookfield equipment at 5 rpm with Spindle SC4-18). Droplets from this chitosan solution can be formed with small diameter nozzles up to the smallest size available for the VAR-D (Nisco) equipment, ie with the 100 ⁇ diameter nozzle.
  • the crosslinking solutions are mixtures of polyphosphate compounds alone or in combination at different concentrations, the pH of which is adjusted in the presence of a base such as, for example, sodium hydroxide or not.
  • the polyphosphate used is a compound chosen from: sodium tripolyphosphate (TPP, Sigma), sodium betaglycerophosphate (GP, Safic Alcan), or phytic acid in the form of sodium salt anhydride (or inositol hexakisphosphate). anhydrous sodium, PA, Sigma).
  • concentrations of the polyphosphate compounds and the base (NaOH) as well as the pH of the crosslinking solutions are shown in Table 2.
  • Droplets are formed from the chitosan solution according to Example 1 by an electromagnetic process with equipment "Encapsulator VarD (Gen 2) (Nisco, Zurich, Switzerland), equipped with a nozzle diameter 150 ⁇ .
  • the droplets are immersed in a volume of 50 ml of one of the crosslinking solutions according to Example 2 (No. 1-8c of Table 1), and are stirred for a period of 3 hours using a magnetic bar. at a speed of between 100 and 1000 rpm.
  • microbeads When microbeads are formed, they are then washed with water (about one liter each wash) several times consecutively. A slight stirring with a magnetic bar is carried out for about one minute between each wash, at a speed between 100 and 1000 rpm. The beads are left to settle between each wash. The balls are finally recovered by gravity. A container containing a known mass of hydrogel beads as well as a known mass of water is obtained.
  • stable hydrogel beads can be formed in the presence of crosslinking solutions No. 6, 6c, 7 and 8c, that is to say only in the presence of polyphosphate salts TPP and / or GP and a sufficient amount of NaOH.
  • the stable hydrogel beads can not be formed in the presence of NaOH alone (Nos. 1 to 3), in the absence of polyphosphate: although at these pH the chitosan precipitates, no ball is formed. stable hydrogel. In the presence of polyphosphate TPP and / or GP and in the absence of NaOH, the beads formed are not sufficiently stable from a mechanical point of view, and are not resistant to successive washes.
  • microbeads of the invention do not have solid trabecules.
  • the solid trabeculae of chitosan can be investigated by light microscopy after staining the sample with hematoxylin-eosin.
  • Eosin is anionic and tends to bind to positively charged chitosan.
  • the beads are incubated for 4 hours at 4 ° C. in a 100 mM sodium cyanodilate buffer solution, 20 mM CaCl 2 , pH 7.4 and containing 40 g / l of paraformaldehyde.
  • the beads are washed 3x with a 100 mM Sodium cacodylate buffer; 50 mM BaCl 2 , pH 7.4 to prevent their disintegration
  • the beads are then dehydrated by successive passages in baths of increasing concentration of methanol, isopropanol and xylene.
  • the beads are then included in the paraffin and the paraffin blocks. cut into strips of 5 ⁇ thick using a microtome (Leica RM 2145).
  • the beads sections are previously deparaffinized and rehydrated by successive baths of xylene, ethanol in decreasing concentration and demineralized water. The whole bead is colored directly.
  • the beads or sections of beads are incubated for 15 minutes in a Mayer hematoxylin solution.
  • the beads or sections of balls are rinsed 2x with water and then with a 2.6% NH 4 OH solution.
  • the beads or sections of beads are incubated in a solution of 0.5% eosin Y aqueous and 0.5% acetic acid
  • the beads or sections of beads are then rinsed with water and then dehydrated using a bath of increasing concentrations of ethanol and xylene
  • FIGS. 1 and 2 show the substantially spherical shape of the hydrogel microbeads of the invention.
  • hydrogel beads formed by contact with the TPP and GP-based solution in combination are more stable and elastic than the beads formed from TPP or GP alone at equivalent basic pH.
  • microbeads of the invention are injectable through fine needles.
  • Example 4 Preparation of Chitosan Hydrogel Microbeads with Phytic Acid
  • Droplets are formed from the chitosan solution according to Example 1 by an electromagnetic process with equipment "Encapsulator VarD (Gen 2) (Nisco, Zurich, Switzerland), equipped with a nozzle diameter 100 ⁇ .
  • the droplets are immersed in a volume of 50 ml of one of the phytic acid (PA) -based crosslinking solutions according to Example 2 (No. 9 to 15 of Table 1), and are stirred for a period of 3 hours. using a magnetic bar, at a speed between 100 and 10OOtr / min.
  • PA phytic acid
  • microbeads When microbeads are formed, they are then washed with water (about one liter each wash) several times consecutively. A slight stirring with a magnetic bar is carried out for about one minute between each wash, at a speed between 100 and 1000 rpm. The beads are left to settle between each wash. The balls are finally recovered by gravity. A container containing a known mass of hydrogel beads as well as a known mass of water is obtained.
  • the beads formed are not stable over time, and are not resistant to successive washings with water.
  • stable beads are formed at a concentration of 0.1 M NaOH (pH 6.0), unlike in the case of the TPP and GP polyphosphates of Example 3, for which the pH must be higher (for example, higher than 12.5) for the beads to be stable.
  • Min / max diameter Smallest / largest diameter measured among the 20 beads observed.
  • hydrogel microbeads can be formed regardless of NaOH concentration and pH (above 6.0 ).
  • the proportion of NaOH strongly influences the appearance and the mechanical strength of the hydrogel beads. It is thus possible to modulate the properties of the microbeads.
  • the beads are sterilized with moist heat (autoclave - model SYSTEC DX-23, Wettenberg, Germany).
  • the autoclaving parameters are as follows: temperature of 121 ° C, duration of 15 minutes.
  • the microbeads thus sterilized have a number average diameter of between 100 and 700 ⁇ .
  • the beads prepared using the crosslinking solution No. 10 have a number average diameter of 200 ⁇ .
  • Example 5 Rheological properties
  • G ' modulus of elasticity measured by rheology (detail of the method).
  • G ' modulus of elasticity measured by rheology
  • the microbeads - prepared according to Examples 3 and 4 with the crosslinking solutions Nos. 6a, 6c, 8b, 8c, 10, 11 and 12 of Example 2 - to a viscous fluid, for example a hyaluronic acid solution, at 37 ° C.
  • the rheological properties are measured by oscillating the viscous fluid alone and the viscous fluid with the microbeads, using a rotary rheometer with shearing plates (ARES G2, TA Instrument).
  • This analysis can provide information on the evolution of the variables G ', G "and Tan (5) over a given range of shear frequencies, for example from 0.1 Hz to 100 rad.s 1 , and at a given temperature, for example 37 ° C.
  • the amplitude is fixed in constant value, for example 1%.
  • the elastic modulus (G ', also called storage module) of the viscous solution comprising the microbeads is significantly greater than the modulus G' of the solution of the viscous solution without the microbeads, and this regardless of the composition of the crosslinking solution.
  • the difference of G ' is indicative of the elasticity of microbeads.
  • the value of the modulus G 'of the fluid is significantly increased in the presence of the microbeads, which indicates that the microbeads give the fluid a better ability to withstand stress and absorb shock.
  • the dynamic viscosity of the viscous solution is measured with and without the microbeads, at 37 ° C., using the same equipment of rheometry, under continuous rotation, at increasing speed, over a determined shearing range. It is observed that the dynamic viscosity of the viscous fluid is not modified by the addition of microbeads. It thus remains easily injectable through a needle, and can for example act as viscosupplement to relieve a joint after injection into the knee joint.
  • a mixture of a viscosupplement (based on hyaluronic acid) commercially available (SynVisc®, Sanofi) is prepared with the microbeads prepared according to Example 3 with the crosslinking solution No. 10 (phytic acid 5%, NaOHM, pH6). Both solutions (with and without microbeads) contain the same concentration of hyaluronic acid.
  • the modulus of elasticity G 'and the dynamic viscosity of the two solutions are measured at 37 ° C., according to the measurement parameters recorded in Tables 5 and 6.
  • microbeads are easily injectable through a needle of variable diameter, and in particular a needle adapted to intra-articular injection.
  • the microbeads of the invention harvested after injection retain substantially the same size distribution.
  • the same hyaluronic acid solution with the microbeads (obtained with solution No. 10 of Table 3) is injectable through needles of variable diameter, for example a needle adapted to intra-articular injection.
  • the logs harvested after injection retain substantially the same size distribution.
  • HA Hyaluronic acid
  • Example 6 Stability of the beads during storage and injectability
  • the hydrogel microbeads prepared using the crosslinking solutions Nos. 6a, 6c, 8b, 8c, 10, 11 and 12 of Example 2 are stored at 4 ° C. in an aqueous solution. After a storage period of 3 and 6 months, their appearance, their average diameter in number and their size distribution, measured according to the methods of the description, are unchanged.
  • the microbeads are injectable without difficulty through a thin needle, and substantially retain their size characteristics after injection.

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Abstract

La présente invention concerne des microbilles d'hydrogel comprenant au moins de l'eau, du chitosane, au moins un composé polyphosphate, l'eau étant présente à une concentration d'au moins 85% en masse, d'hydrogel, lesdites microbilles présentant un diamètre moyen en nombre allant de 100 à 900 μm. La présente invention concerne également leur procédé de fabrication et leurs utilisations, en particulier dans des compositions pharmaceutiques ou des dispositifs médicaux, plus particulièrement pour le traitement d'une pathologie d'une articulation.

Description

Microbille d'hydrogel de chitosane
La présente invention concerne des microbilles d'hydrogel, leur procédé de fabrication et leurs utilisations, en particulier dans des compositions pharmaceutiques ou des dispositifs médicaux, plus particulièrement pour le traitement d'une pathologie d'une articulation.
Le chitosane est un polymère d'origine naturelle présentant un intérêt connu depuis de nombreuses années. Ce polysaccharide peut être obtenu à partir de sources animales comme à partir de carapace de crustacés, mais également à partir de sources fongiques à partir de parois cellulaires de champignons.
Le chitosane est par exemple utilisé sous la forme de matrice pour encapsuler des principes actifs. Il sert alors en général de véhicule pharmaceutique. Ces véhicules peuvent se présenter sous forme solide, en particulier lorsqu'ils sont séchés ou lyophilisés. De nombreux brevets concernent cette technologie.
En parallèle de cette technologie, se sont développées des particules à base de chitosane sous forme d'hydrogel, de différentes dimensions. Ces compositions présentent un taux particulièrement élevé d'eau les rendant très différentes des matrices précitées. En général l'eau représente plus de 85%, voire plus de 90% en masse de la composition. De telles particules d'hydrogels présentent une composition et des propriétés très différentes des matrices de chitosane évoquées ci-dessus. De telles particules d'hydrogel sont notamment utilisées en ingénierie tissulaire ou également comme vecteurs de composés actifs.
Cependant tout hydrogel ne convient pas pour former des billes pouvant être facilement injectables dans le corps humain ou animal.
II est connu de par le brevet EP 2538987 B1 (US 20120321678) des billes d'hydrogel à base de chitosane et d'alginate, en particulier pour leurs utilisations en supplémentation intra-articulaire. Il s'agit dans ce brevet d'améliorer les effets d'un hydrogel en le combinant avec des billes d'hydrogel, utilisable au moins dans cette application spécifique. Il convient notamment que ces billes présentent une durée de vie après injection au niveau intra-articulaire élevée ainsi que des propriétés mécaniques intéressantes où l'injection est réalisée. De telles billes sont particulièrement intéressantes de par leurs propriétés, en particulier leurs propriétés élastiques, apportées lors de l'injection intra-articulaire. Les billes d'hydrogel selon ce brevet présentent toutefois des trabécules. Les trabécules sont des espèces fibrillaires ou filamenteuses présentes à l'intérieur de l'hydrogel. La demande WO 2009/150651 décrit encore un hydrogel à base de la combinaison de deux solutions de chitosanes de caractéristiques différentes, au départ d'une solution acide portée progressivement à pH neutre. Le premier chitosane est hautement acétylé avec un degré d'acétylation compris entre 40% et 60%. Le second chitosane est hautement déacétylé avec un degré d'acétylation d'au plus 20%. De tels hydrogels sont sensibles à la température ce qui leur permet de gélifier in situ, après injection dans le corps humain ou animal. La demande n'enseigne pas comment former des particules d'hydrogel.
La présente invention a pour but de de fournir des particules d'hydrogel à base de chitosane.
La présente invention a encore pour but de de fournir des particules d'hydrogel à base de chitosane dont la concentration est plus élevée que certaines billes d'hydrogel antérieures, présentant environ 0,5% en masse de chitosane par rapport à la masse de l'hydrogel, tout en conservant de bonnes propriétés mécaniques en particulier pour des applications en injection intra-articulaire.
La présente invention encore pour but d'améliorer la stabilité des billes de chitosane.
En particulier, la présente demande a pour but de fournir des billes d'hydrogel ne présentant pas de particules solides, comme des trabécules.
La présente invention a également pour but de fournir des billes d'hydrogel dont la composition comprenant du chitosane, éventuellement en mélange avec d'autres composés. Cette composition est avantageusement homogène.
Il ressort de l'état de la technique que la préparation de telles billes d'hydrogel n'est pas aisée puisque le brevet EP 2538987 B1 décrit la formation de trabécules et la demande WO 2007/13514 préconise l'utilisation d'un dérivé de chitosane pour surmonter le problème technique de la formation de particules solides.
La présente invention a encore pour but de fournir des billes d'hydrogel dont le procédé de fabrication soit industrialisable, de préférence en limitant les coûts de fabrication et en assurant une bonne reproductibilité des particules ainsi fabriquées.
En particulier, la présente invention a pour but de simplifier le procédé de fabrication, notamment en diminuant la variabilité du procédé, variabilité que l'on retrouve en particulier lorsque plusieurs biopolymères sont utilisés comme des chitosanes de nature différente ou des mélanges de chitosane et d'alginate, et notamment encore en diminuant le nombre d'étapes du procédé et le nombre de matières premières à mettre en œuvre. En particulier, la présente invention a pour but d'éviter la préparation d'une solution préliminaire contenant de l'alginate, tout en conservant le caractère 'hydrogel' des microbilles, c'est à dire la capacité à rester stable tout en retenant une grande quantité d'eau, et à rester déformables et élastiques à la compression.
Avantageusement, l'invention a pour but de fournir des microbilles présentant de bonnes propriétés, par exemple de bonnes propriétés mécaniques pour les applications envisagées, et plus spécifiquement pour des injections intra-articulaires, par exemple de bonnes propriétés élastiques et d'absorption des chocs, une bonne résistance à l'écrasement, et une bonne adhésion sur les tissus.
À cet égard, les billes d'hydrogel selon le procédé antérieur décrit dans le brevet
EP 2538987 B1 ont un diamètre élevé. L'article d'Oprenyeszk et al. 2013, montre que de telles particules présentent un diamètre de 600 à 900 micromètres (μηι). Les billes d'hydrogel ne sont donc pas convenables pour des injections intra-articulaires qui nécessitent des aiguilles fines de faible diamètre, notamment dans le cadre de maladies articulaires traitée par viscosupplémentation intra-articulaire et de maladies articulaires chroniques. De telles maladies sont typiquement les pathologies du cartilage, qui entraînent des lésions et des défauts du cartilage et une douleur articulaire, comme l'arthrose, par exemple due soit au vieillissement soit à un accident. Pour assurer la facilité d'injection par le praticien, augmenter le confort du patient, limiter les risques d'injection mal placée et éviter les risques d'infection, en particulier lors d'injections répétées, il convient d'utiliser des aiguilles fines.
La présente invention a donc encore pour but de fournir une composition injectable par voie intra-articulaire qui facilite des injections répétées, notamment au travers d'aiguilles fines tel que par exemple des aiguilles de type 18 à 22 Gauge comme recommandé pour la plupart des produits de viscosupplémentation actuellement commercialisé, en particulier au-dessus de 21 Gauge, ou éventuellement encore plus fines, par exemple de 23 Gauge. Il est donc désiré de mettre au point des microbilles dont les propriétés et la distribution de diamètre peuvent être ajustés pour pouvoir être facilement injectées au travers d'aiguilles fines, en particulier des microbilles dont le diamètre moyen en nombre est inférieur à 900μηι, de préférence inférieur à δθθμηι, de préférence inférieur à 700μηι, et encore de préférence dont le D(0.9) est inférieur à 900μηι, de préférence inférieur à δθθμηι, de préférence inférieur à 700μηι.
Il a été découvert que les problèmes techniques évoqués ci-dessus peuvent être résolus par la présente invention. En particulier, l'invention met en œuvre un procédé de fabrication spécifique des microbilles d'hydrogel à base de chitosane, lequel ne comprend pas la formation de trabécules solides dans les microbilles, évitant ainsi les inconvénients mentionnés dans l'art antérieur, de manière surprenante. Il est apparent à la lecture de l'art antérieur discuté ci-dessus que la solution apportée par la présente invention n'était pas évidente pour l'homme du métier.
Par ailleurs, les microbilles de l'invention permettent d'augmenter la proportion de chitosane. A cette fin, le principe de la gélification de l'alginate par un ion calcium n'est pas le principe qui est mis en œuvre. En effet, l'invention utilise le principe de la réticulation du chitosane par des ions polyphosphates pour obtenir une composition d'hydrogel de chitosane. Il est déjà connu de former des solutions de chitosane en présence de beta-glycerophosphate de sodium, par exemple des solutions de chitosane et de beta-glycerophosphate ayant la propriété de gélifier lorsque la température augmente, par exemple à la température du corps humain. Il est également connu de stabiliser des microsphères solides et sèches de chitosane en le combinant avec du tripolyphosphate de sodium. Il est encore connu de former des complexes à base de chitosane et d'acide phytique (inositol hexakisphosphate) en solution, ou encore des capsules de taille millimétriques composées de chitosane et d'acide phytique. Cependant l'art antérieur ne présume pas de la possibilité de former des microbilles de chitosane qui soient sous forme d'hydrogel et possédant des propriétés convenables pour leur passage au travers d'une aiguille de diamètre adapté pour réaliser des injections intra-articulaires, par exemple dans le but de traiter une pathologie d'une articulation, comme par exemple une lésion du cartilage, en particulier chez un être humain.
La présente invention permet encore d'augmenter la stabilité du chitosane en jouant sur la réticulation non covalente du chitosane, et non pas sur la gélification de l'alginate en présence d'un ion calcium, via la chélation de l'ion calcium par l'alginate.
Il n'était notamment pas évident pour l'homme du métier que l'association du chitosane avec un composé polyphosphate aurait permis d'obtenir des billes d'hydrogel aux bonnes propriétés, en particulier mécaniques, pour une injection intra-articulaire, par viscosupplémentation, et injectable au travers d'une aiguille fine.
L'invention concerne plus spécifiquement une particule ou une bille d'hydrogel, et plus particulièrement une microbille d'hydrogel.
Ainsi, la présente invention concerne une microbille d'hydrogel comprenant au moins de l'eau, du chitosane, au moins un composé polyphosphate, l'eau étant présente à une concentration d'au moins 85% en masse d'hydrogel, ladite bille présentant un diamètre moyen en nombre allant de 100 à 900 μηι
On entend en particulier par « billes » une particule de forme sensiblement sphérique. Une telle forme peut être appréciée par microscope. Une telle bille peut présenter des imperfections inhérentes au procédé de fabrication. On entend par « microbille » une bille présentant une taille inférieure à 1000 micromètres.
Les billes selon l'invention présentent avantageusement un diamètre moyen en nombre compris entre 200 et 800 micromètres, et avantageusement compris entre 300 et 700 micromètres.
Selon une variante, les billes selon l'invention présentent un diamètre moyen en nombre de préférence compris entre 100 et 500 micromètres, et de préférence entre 200 et 500 micromètres. La mesure du diamètre moyen en nombre des billes selon l'invention est réalisée de préférence par microscopie optique, selon la méthode suivante :
Le diamètre moyen en nombre, l'écart-type et le coefficient de variation d'une population de microbilles sont mesurées à l'aide d'un microscope optique inversé, par exemple de la marque OLYMPUS, modèle CKX41 et muni d'une caméra et d'un objectif 20X. Une fraction de la population de microbilles est placée dans une cupule d'observation elle-même placée sous l'objectif. Une photo numérique est prise après ajustement de l'image. Le programme « LABSENSE » de la marque OLYMPUS et accompagnant le microscope permet un traçage de lignes droites calibrées selon l'objectif utilisé. Un minimum de 20 billes est sélectionné sur l'image et une diagonale est tracée par le programme sur chacune d'elle. Le programme permet une visualisation directe de la mesure. Ces mesures sont reportées sur un tableur, par exemple EXCEL de la marque MICROSOFT et les variables suivantes sont calculées.
La moyenne est calculée à l'aide de la formule ^1 1 * '
L'écart-type est calculé à l'aide de la formule :
Figure imgf000006_0001
Le coefficient de variation Cv est calculé à l'aide de la formule (écart-type divisé par la moyenne) :
Figure imgf000006_0002
« n » représente le nombre de billes de l'échantillons dont le diamètre est mesuré, « X, » représente le diamètre mesuré pour une bille, « i » étant un nombre entier allant de 1 à n.
La distribution du diamètre des microbilles peut également être mesurée par une méthode de diffraction laser, par exemple à l'aide d'un équipement Mastersizer de Malvern, par exemple un Mastersizer 2000, en utilisant un protocole de mesure de préférence suivant la norme IS013320:2009 ou suivant la monographie de la Pharmacopée Européenne EP2.9.31 , mettant en œuvre la théorie de Mi. Avantageusement, la distribution des billes est étroite, c'est-à-dire avec une faible dispersion du diamètre des billes par rapport au diamètre moyen, c'est à dire par exemple un indice de dispersité de moins de 2 mesuré par diffraction laser, par exemple comme précité.
Avantageusement, les microbilles présentent un D(0, 1 ) compris entre 100 et 600 micromètres, et avantageusement compris entre 200 et 400 micromètres.
Selon une variante, les microbilles présentent un D(0,5) compris selon une variante entre 100 et 800 micromètres, et de préférence entre 300 et 700 micromètres.
De préférence, les microbilles présentent un D(0,5) compris selon une variante entre 300 et 600 micromètres.
Avantageusement, les microbilles présentent un D(0,9) compris entre 100 et 1000 micromètres, et avantageusement compris entre 300 et 950 micromètres.
Selon une variante spécifique, les microbilles présentent un D(0,9) compris entre 100 et 950 micromètres, et avantageusement compris entre 300 et 900 micromètres, en encore avantageusement entre 300 et 800 micromètres.
Selon une variante spécifique, les microbilles présentent un D(0,9) compris entre 200 et 700 micromètres, et avantageusement compris entre 300 et 650 micromètres.
L'invention concerne notamment des billes d'hydrogels stérilisées ou non dont le diamètre D(0.9) est :
· inférieur à 700μηι (pouvant être injectées via une aiguille de 19 Gauge), inférieur à 650μηι (pouvant être injectées via une aiguille de 20 Gauge), inférieur à 500μηι (pouvant être injectées via une aiguille de 21 Gauge). Le D(0,1 ), D(0,5) et le D(0,9) sont mesurés par diffraction laser comme précité. Avantageusement, les microbilles d'hydrogel comprennent au moins 95% d'eau en masse. Selon une variante spécifique, les microbilles hydrogel comprennent au moins 97% en masse d'eau.
Avantageusement, le chitosane est présent à une concentration de 0,3 à 10 % en masse, et le ou les composés polyphosphate étant présents en quantité suffisante pour former une microbille d'hydrogel, les pourcentages en masse étant exprimés par rapport à la masse de la microbille.
Selon un mode de réalisation, le chitosane est présent dans l'hydrogel à une concentration comprise entre 0,5 et 5 %, et de préférence entre 1 ,0 et 3 % en masse de chitosane, les pourcentages en masse étant exprimés par rapport à la masse de la microbille.
Les pourcentages en masse exprimés par rapport à la masse de la microbille d'hydrogel sont exprimés par rapport aux constituants de l'hydrogel. Les pourcentages en masse exprimés par rapport à la masse de la microbille d'hydrogel s'entendent de préférence de la microbille d'hydrogel sans agent actif, par exemple des cellules, des polypeptides, des protéines, des polynucléosides ou polynucléotides, qui ont une vertu thérapeutique et qui ne sont pas directement nécessaires à la préparation de l'hydrogel.
Selon une variante spécifique, la microbille comprend entre 1 ,0 et 3,0%, et par exemple 1 ,5%, en masse de chitosane.
Le chitosane est référencé sous le N°CAS 9012-76-4. Le chitosane de l'invention est un polysaccharide de préférence préparé à partir d'une source fongique. Il est de préférence extrait et purifié à partir de sources fongiques alimentaires ou biotechnologique sûres et abondantes tels que Agaricus bisporus ou Aspergillus niger. Le chitosane est obtenu par hydrolyse d'un extrait riche en chitine. La chitine est un polysaccharide composé de plusieurs unités N-acétyl-D-glucosamine reliées entre elles par une liaison de type β (1 ,4). Le chitosane est constitué des unités D-glucosamine (unités désacétylées) et d'unités N-acétyl-D-glucosamine (unités acétylées) reliées entre elles par des liaisons de type β (1 ,4) et constitue un polymère du type poly(N-acétyl-D- glucosamine)-poly(D-glucosamine).
Le chitosane de l'invention est donc avantageusement d'origine fongique, et de préférence issus du mycélium d'un champignon du type Ascomycète, et en particulier d'Aspergillus niger, et/ou d'un champignon Basidiomycète, et en particulier Lentinula edodes (shiitake) et/ou Agaricus bisporus. De préférence le champignon est Agaricus bisporus. Toute origine et méthode de préparation de chitosane peuvent être utilisées. Une méthode de préparation du chitosane est celle décrite dans les brevets issus de la demande WO03068824 (EP1483299 ; US 7,556,946).
Le chitosane est avantageusement un chitosane non modifié chimiquement par une réaction de couplage par liaison covalente avec une ou plusieurs autres espèces chimiques.
Le chitosane est avantageux pour sa capacité à former des particules de structure tridimensionnelle de type hydrogel mécaniquement résistante, sa biocompatibilité et sa biodégradabilité après administration ou implantation. De plus, la présence de chitosane dans de telles particules d'hydrogel est désirée pour ses propriétés intrinsèques, physicochimiques et/ou biologiques, par exemple pour sa capacité à adhérer aux surfaces biologiques ou sa capacité à stimuler la cicatrisation de tissus.
Selon une variante, la masse moléculaire moyenne du chitosane est inférieure ou égale à 80000. Selon une variante, la masse moléculaire du chitosane est comprise entre 15000 et 70000, et de préférence entre 35000 et 60000. Selon une autre variante, la masse moléculaire moyenne du chitosane est supérieure à 80000. En particulier, la masse moléculaire du chitosane est supérieure à 140000. La limite supérieure et en général imposé par la viscosité de la solution de chitosane. On préfère utiliser un chitosane dont la masse moléculaire moyenne est inférieure à 1000000.
De préférence ici, la masse moléculaire moyenne est la masse moléculaire moyenne en viscosité (Mv), calculée à partir de la viscosité intrinsèque selon l'équation de Mark-Houwink. La viscosité intrinsèque est mesurée par viscosimètrie capillaire, avec un viscosimètre capillaire de type Ubbelohde, selon la méthode de la monographie de la Pharmacopée Européenne EP2.2.9. On mesure le temps d'écoulement de la solution à travers un tube capillaire adapté (Lauda, par exemple le tube capilaire Ubbelohde 510 01 de diamètre 0.53mm) à l'aide d'un viscosimètre automatique Lauda Vise, d'abord à la concentration initiale en chitosane, puis pour plusieurs dilutions, par exemple selon les recommandations de la méthode EP2.2.9. On en déduit la viscosité intrinsèque réduite pour chacune des concentrations. On porte la viscosité réduite en fonction de la température, et on extrapole la valeur à la concentration 0 pour en déduire la viscosité intrinsèque. Il faut par exemple porter la viscosité réduite (r|réd en ml/g) des i dilutions en fonction de la concentration C des i dilutions (g/ml) selon la formule 5.
Formule 2. hréd] = (U - 10) - (1 - C).
Pour calculer la masse viscosimétrique moyenne, on applique l'équation de Mark-
Houwink avec les constantes k et alpha recommandées par Rinaudo et al. (Int. J. Biol. Macromol, 1993, 15, 281 -285), selon le DA du chitosane, selon l'une des trois formules suivantes.
Formule 3. Mv = ([η]/0,082)(1/0'76), pour un DA de 2% ;
Formule 4. Mv = ([η]/0,076)<1/0'76), pour un DA de 10% (par exemple 1 1.5%) ;
Formule 5. Mv = ([η]/0,074)(1/076), pour un DA de 20% (par exemple 21%).
Pour les valeurs de DA intermédiaires, on réalise une interpolation linéraire pour calculer la masse viscosimétrique moyenne (Mv).
À titre d'exemple, le chitosane peut présenter un degré d'acétylation compris entre
10 et 40 %, et de préférence entre 10 et 25 %.
Le degré d'acétylation est déterminé par potentiométrie. Le chitosane est dissout dans une solution d'acide chlorhydrique. L'excès d'acide chlorhydrique n'ayant pas réagi avec les fonctions aminés du chitosane est dosé par une solution titrée d'hydroxyde de sodium. On en déduit ainsi le nombre de mole d'unité D-glucosamine présentes dans le chitosane et donc par soustraction le degré d'acétylation. Par exemple, la solution de chitosane à une concentration de 1 ,5% (m/v) dans l'acide acétique 1 % (v/v) peut présenter une viscosité dynamique comprise entre 100 et 500mPa.s. Avantageusement, le chitosane de la présente invention peut présenter une viscosité dynamique comprise entre 50 et 400mPa.s en solution à 1 ,5%.
La viscosité dynamique de la solution de chitosane à 1 ,5% (m/v) est de préférence comprise entre 150 et 300mPa.s, et encore de préférence entre 200 et 280mPa.s. La viscosité est mesurée typiquement par viscosimétrie à mobile tournant, par exemple sur un dispositif Brookfield DV2T à une vitesse de rotation de 5tr/min avec une aiguille « Spindle SC4-18 » à 25°C.
Le composé polyphosphate est de préférence un sel d'un composé polyphosphate organique ou inorganique.
Parmi les composés polyphosphates organiques on peut citer par exemple l'acide phytique, en particulier le inositol hexakisphosphate de sodium, ou un glycérophosphate, par exemple le beta-glycérophosphate de sodium .
Parmi les composés polyphosphates inorganiques on peut citer par exemple le tripolyphosphate, en particulier le tripolyphosphate de sodium.
Avantageusement, le composé polyphosphate est choisi parmi l'acide phytique, comme par exemple sel de sodium d'acide phytique, un tripolyphosphate, comme par exemple le tripolyphosphate de sodium, un glycérophosphate comme par exemple un beta-glycérophosphate de sodium, et l'un quelconque de leurs mélanges.
L'acide phytique ou acide myo-inositol hexaphosphorique ou encore acide inositol hexakisphosphorique est une biomolécule de formule brute CeH^C^Pe- L'acide phytique est un composé de plantes ubiquitaires, présent à 1 -5 % en masse de la plupart des céréales, noix, huile de graines, les spores, et pollens. Il représente typiquement une proportion de 60 à 90% duotal du phosphore des graines. Il se retrouve sous forme de mélange de sels, typiquement de calcium/magnésium et potassium dans certaines parties des graines. Cette molécule est hautement chargée avec les six groupes phosphate s'étendant du centre du noyau myo-ionisol, chacun des groupes ayant son propre pKa. Les propriétés de l'acide phytique peuvent se retrouver par exemple dans l'article deEvans et al. (Titration studies of phytic acid, JAOCS, 59, 4, 1982).
Par exemple l'acide phytique est présent dans l'hydrogel des microbilles à une concentration de 0,5 à 10% en masse. Selon une variante spécifique, l'acide phytique est présent dans l'hydrogel à une concentration d'au moins 1 %, et de préférence d'au moins 2% en masse d'acide phytique.
Selon une variante spécifique, la microbille comprend entre 2 à 10%, et plus particulièrement de 4 à 8% en masse d'acide phytique. Avantageusement, la présente invention concerne une microbille comprenant de 1 à 2% de chitosane et au moins 3% en masse d'acide phytique.
Un exemple de composition de la microbille comprend 1 ,5 % de chitosane et 4 à 8 % d'acide phytique en masse par rapport à la masse de la composition totale de la microbille.
Selon une variante spécifique, la microbille comprend entre 0.5 à 5%, et plus particulièrement de 1 à 5% en masse de tripolyphosphate, de préférence de tripolyphosphate de sodium.
Avantageusement, la présente invention concerne une microbille comprenant de 1 à 1 % de chitosane et au moins 0.5 % en masse de tripolyphosphate, de préférence de tripolyphosphate de sodium.
Un exemple de composition de la microbille comprend 1 ,5 % de chitosane et 1 à 2% de tripolyphosphate, de préférence de tripolyphosphate de sodium, en masse par rapport à la masse de la composition totale de la microbille.
Selon une variante spécifique, la microbille comprend entre 2 à 10%, et plus particulièrement de 4 à 8% en masse de glycérophosphate, de préférence un beta- glycérophosphate de sodium.
Avantageusement, la présente invention concerne une microbille comprenant de 1 à 2% de chitosane et au moins 3 % en masse de glycérophosphate, de préférence un beta-glycérolphosphate de sodium.
Un exemple de composition de la microbille comprend 1 ,5% de chitosane et 4 à 8% de glycérophosphate, de préférence un beta-glycérophosphate de sodium en masse par rapport à la masse de la composition totale de la microbille.
Avantageusement, la microbille comprend une quantité de base suffisante pour élever le pH à une valeur permettant la formation de microbilles d'hydrogel de l'invention.
Parmi les bases on peut citer les bases minérales comme par exemple l'hydroxide de sodium, le carbonate de sodium, l'hydroxyde de potassium, etc.
Après lavage par des bains d'eau successifs, la microbille contient l'eau, le chitosane et le composé polyphosphate.
Outre l'eau, le chitosane, le composé polyphosphate, la microbille de la présente invention peut comprendre différents excipients et/ou différents principes actifs.
Parmi les excipients, on peut citer les agents favorisant la gélification de la bille, les agents de modification de la viscosité, les agents de modification de la rhéologie, et des agents de modification de la cinétique de dégradation des microbilles in vivo, etc.
La composition des microbilles est avantageusement non-thermogélifiable. En effet, pour assurer une bonne stabilité des billes avant et après injection, typiquement par voie intra-articulaire, la gélation ou la transition sol-gel ne doit pas intervenir après ou au moment de l'injection. Avantageusement, les microbilles de l'invention sont sous forme d'hydrogel avant leur application, en particulier par injection dans le corps d'un sujet en ayant besoin, notamment au niveau intra-articulaire. En particulier, les microbilles sont sous forme hydrogel lors de leur stockage, par exemple à température ambiante ou au froid, et ne sont pas sensibles aux variations de température entre 8 et 40°C, c'est-à-dire qu'elles ne sont pas désintégrées ou dégradées dans cette gamme de température.
À cet égard, les microbilles peuvent être suspendues dans une solution visqueuse ou un hydrogel, qui lui, avantageusement, peut-être thermogélifiable. Il s'agit typiquement d'hydrogel d'un ou plusieurs polysaccharides gélifiables. La présente invention concerne encore une solution visqueuse ou un hydrogel, thermogélifiable ou non, comprenant une pluralité de microbilles de l'invention.
La composition de la microbille selon l'invention peut également comprendre des composés d'intérêt, tout particulièrement au niveau pharmaceutique (principe actif pharmaceutique) et encore plus spécifiquement pour une action intra-articulaire, plus particulièrement sur le cartilage. Il s'agit encore plus spécifiquement d'agents bénéfiques dans des compositions à usage intra-articulaire, par exemple pour diminuer la douleur ou diminuer l'inflammation.
Parmi de tels agents, on peut citer les médicaments anti-inflammatoires, plus particulièrement les médicaments non-stéroïdiens, les agents anesthésiques, les agents analgésiques, en particulier du type opioïdes, les corticostéroïdes, les anti-néoplastiques, les anticorps monoclonaux, les vitamines, les minéraux, les agents de contrastes, etc.
On peut notamment citer parmi les médicaments non-stéroïdiens (NSAIDS) par exemple : Diclofenac™, Ibuprofen™, Piroxicam™; les anesthésiques, par exemple : Lidocaine™ , Bupivacaine™; les analgésiques opioïdes par exemple : codéine, morphine; corticostéroïdes, par exemple : dexamethasone, prednisone; les agents anti- néoplastiques, par exemple : Methotrexate™; les agents antiviraux, par exemple : Acyclovir™ , Vidarabine™; les anticorps monoclonaux, par exemple : Humira™ Infliximab™.
Les microbilles de l'invention, en particulier utilisables comme suppléments injectables par voie intra-articulaire peuvent aussi contenir des composés comme des cellules, des protéines, de polynucléotides (ARN, ADN), des minéraux comme par exemple : sélénium, strontium, des vitamines comme par exemple : tocophérol, ou d'autres agents actifs comme par exemple le curcumin. Parmi les cellules, il est particulièrement intéressant d'utiliser des chondrocytes, des cellules souches, ou des cellules ayant la capacité de produire des substances actives.
Les microbilles d'hydrogel selon la présente invention présentent une structure d'hydrogel homogène. Les microbilles d'hydrogel selon la présente invention ne présentent pas de trabécules, ni de particules solides inhérentes à la préparation de l'hydrogel. Il n'est pas exclu que des agents actifs soient sous forme solide ou colloïdale, par exemple sous forme nanoparticulaire.
Avantageusement, les microbilles de l'invention sont cohésives. La cohésion des billes n'est pas perdue lors de la friction entre les mains.
De plus, les billes présentent avantageusement une bonne résistance à la compression, en particulier lors de la manipulation entre les doigts. Une telle résistance peut être par exemple évaluée par la mesure de résistance à la compression ur un banc de compression mécanique (par exemple un équipement Instron Bluehill). On peut aussi utiliser une technique de nanoindentation (par exemple avec la gamme d'équipements de marque PI Séries Picoindenter commercialisé par la société Hysitron ou le Mach 1 commercialisé par la société Biomomentum) ou encore une technique de tribologie adaptée (par exemple avec la gamme d'équipements de marque Tl Séries Triboindenteur commercialisé par Hysitron).
Encore avantageusement, les billes sont déformables et peuvent être injectées par une aiguille dans le diamètre intérieur est plus faible que le diamètre maximum des billes. Ceci présente un grand avantage pour l'injection dans un tissu car à diamètre intérieur égal, on peut utiliser une aiguille de diamètre extérieur plus faible, formant ainsi un trou de diamètre moins important.
Les microbilles peuvent être fabriquées avantageusement selon le procédé de l'invention.
L'invention concerne donc un procédé pour la préparation de microbilles d'hydrogel selon l'invention.
Plus spécifiquement, le procédé de l'invention comprend l'ajout d'une solution de chitosane à une solution de réticulation comprenant au moins un composé polyphosphate, puis la gélification du chitosane en présence de la solution de réticulation pour former les microbilles d'hydrogel.
Le chitosane est de préférence dissout dans une solution aqueuse à pH inférieur à 7. Une telle solution comprend typiquement un acide, de préférence faible, comme par exemple un acide organique. On peut avantageusement utiliser l'acide acétique. La solution comprend typiquement 0,5 à 3% d'acide acétique exprimé en volume par rapport au volume total de la solution de chitosane
Le pH de la solution de chitosane est typiquement compris entre 2 et 6,5, et de de préférence compris entre 3,5 et 6,0.
Avantageusement, l'osmolarité de la solution de chitosane à la concentration de
1 ,5% (m/v) va de 100 à 300 mOsm/kg, à la température de 25°C.
La détermination de l'osmolarité des solutions est effectuée avec un micro- osmomètre automatique (Osmometer Type 15M de la marque Loser Messtechnik). L'équipement est préalablement calibré avec une solution de 300mosm/kg. L'échantillon est placé dans un récipient prévu à cet effet, et est mis à la température standard de la mesure.
La gélification des gouttelettes de la solution de chitosane sous forme de microbilles intervient dans des conditions aptes à la gélification de la solution de chitosane et du composé polyphosphate.
Selon une variante, on peut ajouter un ou plusieurs composés polyphosphates à la solution de chitosane, avant de faire tomber goutte à goutte cette solution dans la solution de réticulation comprenant un ou plusieurs composés polyphosphate identiques ou différents de celui/ceux ajouté(s) à la solution de chitosane. On peut ainsi par exemple ajouter de 0,01 à 1 % (m/m), et de préférence de 0,1 à 0,5% (m/m, signifiant masse/masse), de composé polyphosphate dans la solution de chitosane.
Selon une variante la solution de réticulation présente un pH compris entre 8 et 14, plus particulièrement entre 9,5 et 14, ajusté par ajout d'une solution diluée d'une base, par exemple d'hydroxyde de sodium.
Selon une variante, la solution de réticulation est une solution d'acide phytique et d'hydroxyde de sodium présentant un pH compris entre 5,5 et 7, par exemple d'environ 6.
Selon une variante, la solution de réticulation est une solution d'acide phytique et d'hydroxyde de sodium présentant un pH compris entre 8 et 14.
Selon une autre variante spécifique, la solution de réticulation est une solution d'acide phytique et d'hydroxyde de sodium présentant un pH compris entre 8 et 10, par exemple d'environ 9.
Selon une autre variante spécifique, la solution de réticulation est une solution d'acide phytique et d'hydroxyde de sodium présentant un pH compris entre 1 1 et 14, par exemple d'environ 13.
Avantageusement, il est possible de faire varier les propriétés des microbilles hydrogel selon le pH de la solution de réticulation utilisée. La concentration de base dans la solution de réticulation est déterminée par l'homme du métier afin d'obtenir le pH est désiré. On peut typiquement utiliser une concentration de base allant de 0,01 à 1 M, et plus spécifiquement allant de 0,05 à 0,75M dans la solution de réticulation.
La gélification est réalisée en mettant la solution de chitosane en contact goutte à goutte avec une solution de réticulation comprenant au moins un composé polyphosphate, ou éventuellement un ou plusieurs autres agents de gélification.
Le dispositif pour la formation des gouttes et leur gélification peut être du type « prilling », c'est-à-dire un procédé de grelonage. On utilise de préférence un dispositif comprenant une buse de production de gouttes présentant un diamètre interne supérieur ou égal à 100 μηι. on peut par exemple utiliser un diamètre de 100 ou 150μηι.
Pour la formation des microbilles, on peut utiliser un procédé discontinu, par exemple en faisant passer la solution à travers une aiguille à l'aide d'une pompe péristaltique. On peut aussi utiliser un procédé continu, industriellement approprié. A titre d'exemple de procédé continu on peut citer par exemple un procédé électromagnétique à jet laminaire appelé aussi prilling, comme avec l'équipement en continu VAR-D (commercialisé par Nisco) ou d'autres procédaient comme par exemple un procédé de formation de gouttes électrostatique, ou à flux d'air coaxial, ou à flux d'air dynamique, ou par gravité, ou par nébulisation (ou « spray drying »), ou encore par extrusion en continu avec le jet sortant coupé à l'aide d'un outil rotatif (appelé Jetcutter, comme avec l'équipement Genialab). Lorsque les gouttes de solution de chitosane tombent dans la solution de réticulation comprenant le composé polyphosphate, une agitation peut être réalisée, par exemple à l'aide d'un barreau magnétique, par exemple une vitesse comprise entre 50 et 500tr/min.
Avantageusement, le procédé comprend le lavage des microbilles, de préférence avec une solution aqueuse, et encore de préférence de l'eau. On réalise de préférence un lavage intensif dans des conditions aptes à obtenir des microbilles d'hydrogel de diamètre constant d'un lavage à l'autre.
Le procédé de l'invention comprend par exemple la récupération des microbilles par gravité. Lorsque l'agitation est arrêtée, les billes sédimentent au fond du récipient contenant la solution, typiquement le récipient du bain de lavage. On peut retirer par exemple la solution par un dispositif d'aspiration, comme à travers une aiguille dont les caractéristiques (typiquement le diamètre) ne permettent pas le passage des microbilles. Après retrait de la solution, il ne reste que les microbilles dans le récipient, qui peuvent être manipulées pour des opérations ultérieures. La présente invention concerne également des microbilles stériles. Avantageusement les microbilles sont stérilisées à la chaleur humide, typiquement en utilisant un autoclave. Typiquement, les conditions d'autoclave sont une température d'environ 121 °C, pendant une durée d'au moins 15 minutes.
Ainsi, la présente invention concerne encore une méthode de stérilisation des microbilles décrites dans l'invention.
La présente invention concerne une composition pharmaceutique ou un dispositif médical comprenant une pluralité des microbilles selon l'invention ou obtenues selon le procédé de l'invention.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique injectable comprenant les microbilles de l'invention.
La présente invention concerne une composition pharmaceutique ou un dispositif médical consistant en un fluide synovial artificiel.
Selon une variante, la composition pharmaceutique ou le dispositif médical est utile dans le traitement d'une pathologie d'une articulation.
Selon une variante, la composition pharmaceutique ou le dispositif médical est utile dans le traitement de la douleur ou l'inconfort associé à une pathologie affectant une articulation ou pour ralentir la progression d'une pathologie d'une articulation.
La présente invention concerne encore un dispositif médical, éventuellement sous forme d'un ou plusieurs kits d'emballages, éventuellement séparés physiquement, comprenant une seringue, une aiguille et une composition pharmaceutique ou dispositif médical selon l'invention, ladite seringue comprenant un réservoir éventuellement prérempli de la composition pharmaceutique ou dispositif médical précité.
La présente invention concerne un tel dispositif médical pour son utilisation dans le traitement d'une pathologie articulaire comprenant l'injection d'une composition pharmaceutique ou dispositif médical selon l'invention par voie intra-articulaire.
La présente invention concerne également des microbilles d'hydrogel selon l'invention, ou obtenues selon l'invention pour son utilisation dans le traitement d'une pathologie, par injection dans le corps humain ou animal, éventuellement présence d'une solution ou hydrogel injectable.
Par exemple, l'aiguille utilisée est une aiguille choisie parmi les aiguilles de 18 à 22 gauge, de préférence encore de 22 gauge et plus. Par exemple, l'aiguille utilisée présente des parois normales, fines ou extra-fines.
La présente invention concerne encore une méthode de supplément du fluide synovial, en particulier lors d'une pathologie affectant une articulation, comme par exemple l'arthrose (ostéoarthrite ou osteoarthritis) ou des lésions du cartilage, etc. La présente invention concerne encore une méthode de lutte contre la douleur ou l'inconfort associé à une pathologie affectant une articulation.
La présente invention concerne encore une méthode de lutte contre une inflammation d'une articulation.
Plus spécifiquement, de telles pathologies sont par exemple : l'ostéoarthrite
(osteoarthritis) (primaire (idiopathique) ou secondaire), l'arthrite rhumatoïde (rheumatoid arthritis), blessure d'une articulation (par exemple traumatique ou une blessure iée à la mobilité articulaire répétée), une pathologie du cartilage (par exemple, chondrocalcinose ou chondromalacie), arthrite septique.
La présente invention concerne encore une méthode de réduction ou de lutte contre la douleur associée avec une maladie, par exemple comme celles précitées, ou encore en ralentir la progression.
La présente invention concerne encore une méthode pour améliorer la réparation osseuse, en particulier du cartilage.
De telles méthodes comprennent typiquement l'injection intra-articulaire d'une composition comprenant des microbilles selon l'invention. Selon une variante, la méthode selon l'invention comprend une pluralité d'injections. Selon une variante, on peut réaliser une injection une ou deux fois par mois pendant plusieurs mois. Selon une autre variante, on réalise deux injections espacées d'un temps variable. Selon une autre variante, on réalise une seule injection.
Les méthodes de l'invention sont utiles à un sujet en ayant besoin, tel que par exemple un sujet nécessitant le traitement d'une pathologie articulaire.
Le ou les sites d'injection sont typiquement choisis parmi : un genou, une épaule, une hanche, une articulation temporo- mandibulaire, une articulation carpo- métacarpienne, un coude, une cheville, un poignet, une articulation de la main, un disque intervertébral, ou une autre articulation. Selon une variante, l'injection est réalisée dans une cavité articulaire, au contact du cartilage.
Lorsqu'on ajoute les microbilles à un fluide, une solution visqueuse ou un hydrogel, par exemple à un viscosupplément, par exemple comprenant un acide hyaluronique, on obtient une augmentation du module d'élasticité (G') mesuré par rhéologie. Ceci traduit la résistance au stress des microbilles d'hydrogel, et par conséquent une amélioration de la résistance au stress du fluide contenant les microbilles. Par extension, la capacité du fluide à absorber les chocs, par exemple quand il est injecté dans une articulation et plus spécifiquement l'articulation du genou, est améliorée en présence des billes. La viscosité du fluide à température physiologique est inchangée de manière avantageuse, de sorte qu'il reste facile à injecter à travers une aiguille de diamètre acceptable par un médecin, et qu'il garde une viscosité suffisante pour agir comme viscosupplément.
Ainsi, la présente invention concerne encore, l'utilisation de microbilles selon l'invention, ou obtenues selon l'invention, pour modifier les propriétés, en particulier les propriétés mécaniques, d'un viscosupplément par exemple injectable au niveau d'une articulation.
Plus généralement les microbilles de l'invention sont utilisées en ingénierie tissulaire ou comme vecteurs de composés actifs, en particulier comme vecteurs de composés pharmaceutiquement actifs.
Les expressions du type « comprend de... à ... » « compris entre... et... » « allant de... à... » ou leurs équivalents incluent les bornes cités, sauf indication contraire. Selon une variante, les bornes de l'intervalle sont exclues.
On couvre par «selon l'invention » ou des termes équivalents, une composition, méthode ou procédé défini tel que dans la présente invention, y compris selon l'une quelconques des variantes, modes de réalisation particuliers ou spécifiques, indépendamment ou selon l'une quelconque de leurs combinaisons, y compris selon les caractéristiques préférées.
Sur les figures :
La figure 1 représente une observation par microscope optique des microbilles d'hydrogel formées en présence de la solution de réticulation contenant le beta- glycérophosphate de sodium à la concentration 5% et l'hydroxyde de sodium à la concentration 0,1 M (N°7).
La figure 2 représente une observation par microscope optique des microbilles d'hydrogel formées en présence de la solution de réticulation contenant le
tripolyphosphate de sodium à la concentration de 2%, le glycérophosphate de sodium à la concentration de 5% et l'hydroxyde de sodium à la concentration de 0,1 M (N°8).
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à l'homme de l'art suite à la lecture de la description explicative qui fait référence à des exemples qui sont donnés seulement à titre d'illustration et qui ne sauraient en aucune façon limiter la portée de l'invention.
Les exemples font partie intégrante de la présente invention et toute caractéristique apparaissant nouvelle par rapport à un état de la technique antérieure quelconque à partir de la description prise dans son ensemble, incluant les exemples, fait partie intégrante de l'invention dans sa fonction et dans sa généralité.
Ainsi, chaque exemple a une portée générale. D'autre part, dans les exemples, tous les pourcentages sont donnés en masse, sauf indication contraire, et la température est exprimée en degré Celsius sauf indication contraire, et la pression est la pression atmosphérique, sauf indication contraire. Exemples
Tableau 1 - Références pour les tailles des aiguilles en vue de l'injection des microbilles selon la norme ISO 9626 (1991 : Amd 1 :2001 )
Figure imgf000019_0001
1 - "The Gauge System for the médical use" in Anesthesia & Analgesia, 2002 ; les valeurs sont extraites de la norme IS09626:1991 /Amd 1 :2001 .
2- "Does needle size matter ?", in J Diab Sci Technol 1 , 725, 2007.
Le diamètre externe (OD) (min - max) dénote la tolérance selon la norme précitée. Sauf indication contraire, le diamètre interne des aiguilles mentionné est des parois normales/regular.
Exemple 1 - Préparation de la solution de chitosane
Un chitosane ultrapur de source fongique (Synolyne Pharma, Belgique), de masse moléculaire viscosimétrique moyenne (Mv) de 180.000 (supérieure à 140.000) et de degré d'acétylation (DA) de 27mol% (supérieur à 20mol%) est dispersé dans une solution contenant 1 % (0,167M) d'acide acétique, à une concentration de 1 ,5% (comprise entre 1 et 2%) sous agitation magnétique ou mécanique. La solution est mélangée pendant une durée de 3 heures (1 à 12 heures). La solution est filtrée sur filtre avec un diamètre de pore de 5μηι. A une concentration de 1 .5%, le pH de la solution de chitosane est d'environ 4, son osmolarité à 25°Cest d'environ 150mOsm/kg, et sa viscosité dynamique est d'environ 220mPa.s (mesurée par viscosimétrie à mobile tournant avec un équipement Brookfield, à 5 tr/min avec le Spindle SC4-18). On peut former des gouttelettes au départ de cette solution de chitosane avec des buses de faible diamètre jusqu'à la plus petite taille disponible pour l'équipement VAR-D (Nisco), c'est à dire avec la buse de diamètre 100μηι.
Exemple 2 - Préparation des solutions de réticulation à base de composés polyphosphate
Les solutions de réticulation sont des mélanges de composés polyphosphate seuls ou combinés, à différentes concentrations, dont le pH est ajusté en présence d'une base comme par exemple un hydroxyde de sodium, ou non. On utilise comme polyphosphate un composé choisi parmi : le tripolyphosphate de sodium (TPP, Sigma), le beta- glycérophosphate de sodium (GP, Safic Alcan), ou l'acide phytique sous la forme de sel de sodium anhydride (ou inositol hexakisphosphate de sodium anhydre, PA, Sigma). Les concentrations des composés polyphosphates et la base (NaOH), ainsi que le pH des solutions de réticulation sont consignées dans le tableau 2.
Tableau 2 - Solutions de réticulation à base de composés polyphosphate
Faisabilité de la préparation
Polyphosphate
N° NaOH PH de microbilles d'hydrogel stables (Exemples 3 et 4)
1 0 0,05M 12,8 Non
2 0 0,1 M 13,0 Non
3 0 0,5M 13,2 Non
4 TPP 5% 0 8,6 Non
5 GP 5% 0 9,3 Non
6a TPP 5% 0,1 M 12,9 Oui
6b TPP 2.5% 0,05M 12,4 Non
6c TPP 1.25% 0,075M 12,7 Oui
7 GP 5% 0,1 M 13,0 Oui
8a* TPP 2% et GP 5% 0M 8,8 Non
8b** TPP 2% et GP 5% 0.05M 12,5 Oui
8c TPP 2% et GP 5% 0,1 M 12,9 Oui
9 PA 5% 0 3,0 Non
10 PA 5% 0,1 M 6,0 Oui
1 1 PA 5% 0,3M 9,0 Oui
12 PA 5% 0,5M 13,0 Oui
13 PA 2% 0,1 M 6,0 Non
14 PA 2% 0,3 M 9,0 Non
15 PA 2% 0,5 M 13,0 Non
*8a : TPP 2% + GP 5% sans NaOH => les billes se forment mais sont instables : elles s'effritent après 5 à 10 minutes : les billes ne sont pas conformes aux microbilles de l'invention ;
**8b : TPP 2% + GP 5% + NaOH 0.05M => les billes se forment et restent stables après une heure dans la solution de réticulation: les billes sont conformes à l'invention Exemple 3 - Préparation de microbilles d'hydrogel de chitosane par réticulation avec le tripolyphosphate (TPP) seul ou en combinaison avec le glycerophosphate (GP)
On forme des gouttelettes au départ de la solution de chitosane selon l'exemple 1 par un procédé électromagnétique avec un équipement "Encapsulator VarD (Gen 2) (Nisco, Zurich, Suisse), équipé d'une buse de diamètre 150μηι.
Les gouttelettes sont plongées dans un volume de 50ml d'une des solutions de réticulation selon l'exemple 2 (N° 1 à 8c du Tableau 1 ), et sont agitées pendant une durée de 3 heures à l'aide d'un barreau magnétique, à une vitesse comprise entre 100 et 1000tr/min.
Lorsque des microbilles se forment, elles sont ensuite lavées à l'eau (environ un litre à chaque lavage) plusieurs fois de manière consécutive. On réalise une légère agitation avec un barreau magnétique durant environ une minute entre chaque lavage, à une vitesse comprise entre 100 et 1000tr/min. Les billes sont laissées à sédimenter entre chaque lavage. Les billes sont finalement récupérées par gravité. On obtient un récipient contenant une masse connue de billes d'hydrogel, ainsi qu'une masse connue d'eau.
Il ressort de cet exemple que des billes d'hydrogel stables peuvent être formées en présence des solutions de réticulation N° 6, 6c, 7 et 8c, c'est-à-dire seulement en présence de sels de polyphosphate TPP et/ou GP et d'une quantité suffisante de NaOH.
Les billes d'hydrogel stables ne peuvent pas être formées en présence de NaOH seul (N° 1 à 3), en l'absence de polyphosphate : bien qu'à ces pH le chitosane précipite, il ne se forme pas de bille d'hydrogel stable. En présence de polyphosphate TPP et/ou GP et en l'absence de NaOH, les billes formées ne sont pas suffisamment stables d'un point de vue mécanique, et ne résistent pas aux lavages successifs.
Les conditions de la solution de réticulation qui donnent les meilleurs résultats en termes de cohésion et de stabilité des microbilles d'hydrogel sont les conditions N° 6c, 7 et 8c. Les caractéristiques des billes d'hydrogels ainsi obtenues sont résumées dans le Tableau 3.
Les microbilles de l'invention ne présentent pas de trabécules solides.
Les trabécules solides de chitosane peuvent être recherchées par microscopie optique après une coloration de l'échantillon à l'hématoxyline-éosine. L'éosine étant anionique a tendance à se fixer sur le chitosane, chargé positivement.
- Les billes sont colorées et observées entières (et libres) ou sous forme de coupes réalisées à l'aide d'un microtome ou encore d'un bistouri. Les coupes sont alors incluses dans la paraffine :
- Fixation des billes et inclusion en paraffine : Les billes sont incubées durant 4 heures à 4°C dans une solution tampon cacodylate de Sodium 100 m M, CaCI2 20 m M, pH 7,4 et contenant 40g/L de paraformaldéhyde
Les billes sont lavées 3x à l'aide d'un tampon cacodylate de Sodium 100 mM ; BaCI2 50 mM, pH 7,4 afin de prévenir leur désintégration Les billes sont ensuite déshydratées par passages successifs dans des bains de concentration croissante en méthanol, d'isopropanol et de xylène Les billes sont ensuite incluses dans la paraffine et les blocs de paraffine découpés en lamelles de 5 μηι d'épaisseur à l'aide d'un microtome (Leica RM 2145).
- Coloration à l'hématoxyline-éosine :
Afin d'être colorées, les sections de billes sont au préalable déparaffinées et réhydratées par des bains successifs de xylène, d'éthanol en concentration décroissantes et d'eau déminéralisée. Les billes entières sont colorées directement.
Les billes ou sections de billes sont incubées 15 minutes dans une solution d'hématoxyline de Mayer
Les billes ou sections de billes sont rincées 2x à l'eau, puis à l'aide d'une solution de NH4OH à 2,6%
Les billes ou sections de billes sont incubées dans une solution d'éosine Y 0,5% aqueuse et d'acide acétique 0,5%
Les billes ou sections de billes sont alors rincées à l'eau puis déshydratées à l'aide de bain de concentrations croissantes en éthanol puis de xylène
- Pour l'observation au microscope optique (Olympus CKX41 ) les coupes de billes sont alors montées sur lames et lamelles ou les billes entières sont placées dans une cupule avec de l'eau.
- L'observation de la trame interne de la ou les billes au microscope optique permet d'apprécier la présence ou l'absence de trabécules directement visibles et exacerbés par la coloration à l'éosine. Si la trame interne observée est homogène et sans filaments ressortant du contraste, la bille est qualifiée comme ne comportant pas de trabécules solides. Tableau 3 - Caractéristiques des microbilles d'hydrogels formées en présence de GP et d'un mélange GP/TPP en présence de NaOH (buse de diamètre 150μηι)
Solution de Distribution de diamètre Aspect et tenue réticulation des billes d'hydrogel mécanique
Par microscopie Par diffraction
optique laser
N°6c
D(0.1 ) = 190μπι
TPP 1 ,25%
ND D(0.5) = 490μπι Bonne tenue NaOH 0,075M
D(0.9) = 740μπι
pH = 12,7
N° 7 Billes peu résistantes, diamètre moyen = 645μηι
GP 5% élastiques,
diamètre min = 370μηι ND
NaOH 0,1 M moyennement rondes diamètre max = 890μηι
pH = 13,0 (Figure 1 )
N° 8c
diamètre moyen = 560 μηι Billes plus résistantes,
GP 5%
diamètre min = 420μηι moins élastiques, plus TPP 2% ND
diamètre max = 700μηι rondes
NaOH 0,1 M
(Figure 2) pH = 12,9
ND : Non déterminé
On observe sur les figures 1 et 2 la forme sensiblement sphérique des microbilles d'hydrogel de l'invention.
On conclut de cet exemple qu'il est nécessaire d'atteindre un pH suffisamment élevé pour obtenir des billes d'hydrogel de bonne stabilité et intégrité et bien élastiques avec les polyphosphates TPP et GP.
On conclut également que les billes d'hydrogel formées par contact avec la solution à base de TPP et de GP en combinaison sont plus stables et élastiques que les billes formées au départ de TPP ou de GP seul, à pH basique équivalent.
On peut également produire des microbilles d'hydrogel stables de plus petite taille avec la buse de diamètre 10Ομηι.
Les microbilles de l'invention sont injectables au travers d'aiguilles fines. Exemple 4 : Préparation des microbilles d'hydrogel de chitosane avec l'acide phytique
On forme des gouttelettes au départ de la solution de chitosane selon l'exemple 1 par un procédé électromagnétique avec un équipement "Encapsulator VarD (Gen 2) (Nisco, Zurich, Suisse), équipé d'une buse de diamètre 100μηι.
Les gouttelettes sont plongées dans un volume de 50ml d'une des solutions de réticulation à base d'acide phytique (PA) selon l'exemple 2 (N° 9 à 15 du Tableau 1 ), et sont agitées pendant une durée de 3 heures à l'aide d'un barreau magnétique, à une vitesse comprise entre 100 et 10OOtr/min.
Lorsque des microbilles se forment, elles sont ensuite lavées à l'eau (environ un litre à chaque lavage) plusieurs fois de manière consécutive. On réalise une légère agitation avec un barreau magnétique durant environ une minute entre chaque lavage, à une vitesse comprise entre 100 et 1000tr/min. Les billes sont laissées à sédimenter entre chaque lavage. Les billes sont finalement récupérées par gravité. On obtient un récipient contenant une masse connue de billes d'hydrogel, ainsi qu'une masse connue d'eau.
Il ressort de cet exemple que des billes d'hydrogel stables peuvent être formées en présence des solutions de réticulation N° 10, 1 1 et 12, c'est-à-dire seulement en présence de polyphosphate PA et de NaOH simultanément, les deux composants devant se trouver en quantité suffisante l'un et l'autre. Les caractéristiques des billes d'hydrogels ainsi obtenues sont résumées dans le Tableau 4.
En présence d'acide phytique à une concentration de 5% et en l'absence de NaOH, les billes formées ne sont pas stables au cours du temps, et ne résistent pas aux lavages successifs à l'eau. Lorsqu'on ajoute NaOH, on forme des billes stables dès la concentration en NaOH de 0,1 M (pH 6,0), contrairement aux cas des polyphosphates TPP et GP de l'exemple 3 pour lesquels le pH doit être plus élevé (par exemple plus élevé que 12,5) pour que les billes soient stables.
En présence d'acide phytique à une concentration plus faible de 2% quelle que soit la quantité de NaOH (de 0,1 à 0,5M), on forme des billes, mais elles ne sont pas stables. Tableau 4 - Caractéristiques des microbilles d'hydrogels formées en présence d'acide phytique et de NaOH
Distribution de diamètre
Solution de Aspect et tenue des billes d'hydrogel (avant stérilisation)
réticulation mécanique des billes
Par microscopie
optique
N°10 Diamètre moyen = 325μηι
Opaque
PA 5% Diamètre min = 260μηι
Molles, déformables, NaOH 0,1 M Diamètre max = 360μηι
élastiques et tendres pH = 6,0
Transparentes avec un
N° 11
Diamètre moyen en nombre compris entre cœur opaque
PA 5%
100 et 700 μηι Moyennement NaOH 0,3M
élastiques, pH = 9,0
moyennement dures
Très transparentes, avec un cœur très
N° 12
Diamètre moyen en nombre compris entre dense et de faible
PA 5%
100 et 700 μηι diamètre NaOH 0,5M
Peu déformables et pH = 13,0
élastiques, dures
Diamètre min/max : Plus petit/ grand diamètre mesuré parmi les 20 billes observées.
On conclut qu'avec une quantité suffisante d'acide phytique (par exemple 5%) et en présence de NaOH, on peut former des microbilles d'hydrogel quels que soient la concentration en NaOH et le pH (au-dessus de 6,0). Par contre, la proportion en NaOH influence fortement l'aspect et la tenue mécanique des billes d'hydrogel. On peut ainsi moduler les propriétés des microbilles.
Les billes sont stérilisées à la chaleur humide (autoclave - modèle SYSTEC DX- 23, Wettenberg, Allemagne). Les paramètres d'autoclavage sont les suivants : température de 121 °C, durée de 15 minutes. Les microbilles ainsi stérilisées présentent un diamètre moyen en nombre compris entre 100 et 700 μηι. Précisément, les billes préparées à l'aide de la solution de réticulation N°10 présentent un diamètre moyen en nombre de 200μηι.
Elles sont injectables au travers d'aiguilles fines.
Exemple 5 - Propriétés rhéologiques Lorsqu'on ajoute les microbilles selon les exemples 3 et 4 à un fluide, une solution visqueuse ou un hydrogel, par exemple à un viscosupplément à base d'acide hyaluronique, on obtient une augmentation du module d'élasticité (G') mesuré par rhéologie (détail de la méthode). Ceci traduit la résistance au stress des microbilles d'hydrogel, et par conséquent une amélioration de la résistance au stress du fluide contenant les microbilles. Par extension, la capacité du fluide à absorber les chocs, par exemple quand il est injecté dans une articulation et plus spécifiquement l'articulation du genou, est améliorée en présence des billes. La viscosité du fluide à température physiologique est inchangée de manière avantageuse, de sorte qu'il reste facile à injecter à travers une aiguille de diamètre acceptable par un médecin, et qu'il garde une viscosité suffisante pour agir comme viscosupplément.
Exemple 6 - Elasticité des microbilles
Afin de déterminer les propriétés élastiques et d'absorption des microbilles d'hydrogel, on ajoute les microbilles - préparées selon les exemples 3 et 4 avec les solutions de réticulation N°6a, 6c, 8b, 8c, 10, 1 1 et 12 de l'exemple 2 - à un fluide visqueux, par exemple une solution d'acide hyaluronique, à 37°C.
On mesure les propriétés rhéologiques en oscillation du fluide visqueux seul et du fluide visqueux avec les microbilles, à l'aide d'un rhéomètre rotatif avec cisaillement de plateaux, (ARES G2, TA Instrument). Cette analyse peut renseigner sur l'évolution des variables G', G" et Tan(5)) sur une plage de fréquences de cisaillement donnée, par exemple de 0,1 Hz à 100 rad.s 1 , et a une température donnée, par exemple 37°C. L'amplitude est fixée en valeur constante, par exemple 1 %.
On met en évidence que le module élastique (G', appelé aussi module de stockage) de la solution visqueuse comprenant les microbilles est significativement supérieur au module G' de la solution de la solution visqueuse sans les microbilles, et ceci quelle que soit la composition de la solution de réticulation. La différence de G' est indicative de l'élasticité des microbilles. La valeur du module G' du fluide est augmentée significativement en présence des microbilles, ce qui indique que les microbilles confèrent au fluide une meilleure capacité à résister au stress et à absorber les chocs.
En parallèle, on mesure la viscosité dynamique de la solution visqueuse avec et sans les microbilles, à 37°C, à l'aide du même équipement de rhéomètrie, sous rotation continue, à vitesse croissante, sur une plage de cisaillement déterminée. On observe que la viscosité dynamique du fluide visqueux n'est pas modifiée par l'ajout des microbilles. Il reste ainsi facilement injectable au travers d'une aiguille, et peut par exemple agir comme viscosupplément pour soulager une articulation après injection dans l'articulation du genou.
Par exemple, on prépare un mélange d'un viscosupplément (à base d'acide hyaluronique) disponible commercialement (SynVisc®, Sanofi) avec les microbilles préparées selon l'exemple 3 avec la solution de réticulation N°10 (acide phytique 5%, NaOHO.I M, pH6). Les 2 solutions (avec et sans microbilles) contiennent la même concentration en acide hyaluronique. On mesure le module d'élasticité G' et la viscosité dynamique des 2 solutions à 37°C, selon les paramètres de mesure consignés dans les tableaux 5 et 6.
Les résultats sont présentés dans les tableaux 5 et 6. Il ressort de cet exemple que l'ajout des microbilles de chitosane et d'acide phytique entraîne une augmentation du module d'élasticité de la solution d'acide hyaluronique de 40%, sans modification de sa viscosité dynamique.
Les microbilles sont injectables facilement à travers une aiguille de diamètre variable, et en particulier d'une aiguille adaptée à l'injection intra-articulaire. Les microbilles de l'invention récoltées après injection conservent sensiblement la même distribution de taille.
Par ailleurs, la même solution d'acide hyaluronique avec les microbilles (obtenues avec la solution N°10 du tableau 3) est injectable au travers d'aiguilles de diamètre variable, par exemple une aiguille adaptée à l'injection intra-articulaire. Les billes récoltées après injection conservent sensiblement la même distribution de taille. Tableau 5 - Module d'élasticité G' d'un acide hyaluronique commercial
avec et sans microbilles (N°10), à 37°C
Fréquence G'HA G' HA+MB Différence Différence
d'oscillation Sans Avec G'HA+MB— G'HA (G'HA+MB-G'HA)/G'HAX100
(Hz) microbilles microbilles (Pa) (%)
(Pa) (Pa)
1 25 35 10 +40%
10 66 93 27 +41 %
Figure imgf000029_0001
HA : Acide hyaluronique ;
MB : Microbille
Exemple 6 - Stabilité des billes au stockage et injectabilité
Les microbilles d'hydrogel préparées à l'aide des solutions de réticulation N°6a, 6c, 8b, 8c, 10, 1 1 et 12 de l'exemple 2 sont conservées à 4°C dans une solution aqueuse. Après une durée de stockage de 3 et 6 mois, leur aspect, leur diamètre moyen en nombre et leur distribution de taille, mesurées selon les méthodes de la description, sont inchangés. Les microbilles sont injectables sans difficulté à travers une aiguille fine, et conservent sensiblement leurs caractéristiques de taille après injection.

Claims

REVENDICATIONS
1 . - Microbille d'hydrogel comprenant au moins de l'eau, du chitosane, au moins un composé polyphosphate, l'eau étant présente à une concentration d'au moins 85% en masse, d'hydrogel, ladite microbille présentant un diamètre moyen en nombre allant de 100 à 900 μπι.
2. - Microbille d'hydrogel, selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le D(0,9) est compris entre 100 et 950 micromètres.
3. - Microbille d'hydrogel, selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le chitosane est présent à une concentration de 0,3 à 10 % en masse, et le ou les composés polyphosphate étant présents en quantité suffisante pour former une microbille d'hydrogel, les pourcentages en masse étant exprimés par rapport à la masse de la microbille.
4. - Microbille d'hydrogel, selon des revendications 1 à 3, micromètres caractérisée en ce que le chitosane est présent dans l'hydrogel à une concentration comprise entre 0,5 et 5%, et de préférence entre 1 ,0 et 3% en masse de chitosane, les pourcentages en masse étant exprimés par rapport à la masse de la microbille.
5. - Microbille d'hydrogel, selon des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le composé polyphosphate est choisi parmi l'acide phytique, comme par exemple sel de sodium d'acide phytique, un tripolyphosphate, comme par exemple le tripolyphosphate de sodium, un glycérophosphate comme par exemple un beta-glycérophosphate de sodium, et l'un quelconque de leurs mélanges.
6. - Microbille d'hydrogel, selon des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle est stérilisée.
7. - Procédé pour la préparation de microbilles d'hydrogel tel que défini selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.
8. - Procédé, selon la revendication 7, caractérise en ce qu'il comprend l'ajout d'une solution de chitosane à une solution de réticulation comprenant au moins un composé polyphosphate, puis la gélification du chitosane en présence de la solution de réticulation pour former les microbilles d'hydrogel.
9. - Composition pharmaceutique ou dispositif médical comprenant une pluralité des microbilles telles que définies selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ou obtenues selon l'une quelconque des revendications 7 à 8.
10. - Composition pharmaceutique ou dispositif médical selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il consiste en un fluide synovial artificiel.
1 1 . - Composition pharmaceutique ou dispositif médical selon la revendication 9 ou 10, pour son utilisation dans le traitement d'une pathologie d'une articulation.
12. - Composition pharmaceutique ou dispositif médical selon la revendication 9 ou 10, pour son utilisation dans le traitement de la douleur ou l'inconfort associé à une pathologie affectant une articulation ou pour ralentir la progression d'une pathologie d'une articulation.
13. - Dispositif médical, éventuellement sous forme d'un ou plusieurs kits d'emballages, éventuellement séparés physiquement, comprenant une seringue, une aiguille et une composition pharmaceutique ou dispositif médical selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, ladite seringue comprenant un réservoir éventuellement prérempli de la composition pharmaceutique ou dispositif médical précité.
14.- Dispositif médical selon la revendication 13 pour son utilisation dans le traitement d'une pathologie articulaire comprenant l'injection d'une composition pharmaceutique ou dispositif médical selon l'une quelconque des revendications 9 à 12 par voie intra-articulaire.
15.- Utilisation de microbilles telles que définies selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ou obtenues selon l'une quelconque des revendications 7 à 8 pour modifier les propriétés, en particulier les propriétés mécaniques, d'un viscosupplément par exemple injectable au niveau d'une articulation.
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