WO2016087636A1 - Microbille d'hydrogel - Google Patents

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WO2016087636A1
WO2016087636A1 PCT/EP2015/078644 EP2015078644W WO2016087636A1 WO 2016087636 A1 WO2016087636 A1 WO 2016087636A1 EP 2015078644 W EP2015078644 W EP 2015078644W WO 2016087636 A1 WO2016087636 A1 WO 2016087636A1
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WO
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chitosan
hydrogel
alginate
microbeads
solution
Prior art date
Application number
PCT/EP2015/078644
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English (en)
Inventor
Renaud LECLER
Pierre DOUETTE
Mickaël CHAUSSON
Original Assignee
Kiomed Pharma
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Publication date
Application filed by Kiomed Pharma filed Critical Kiomed Pharma
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    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/14—Macromolecular materials
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    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/24—Materials or treatment for tissue regeneration for joint reconstruction

Definitions

  • the present invention relates to hydrogel microbeads, their method of manufacture and their uses, in particular in pharmaceutical compositions or medical devices, more particularly for the treatment of a pathology of a joint.
  • Chitosan is a naturally occurring polymer of known interest for many years. This polysaccharide can be obtained from animal sources such as from crustacean shell, but also from fungal sources from fungal cell walls.
  • Chitosan is for example used in the form of matrix to encapsulate active ingredients. It is usually used as a pharmaceutical vehicle. These vehicles may be in solid form, particularly when they are dried or lyophilized. Many patents relate to this technology.
  • hydrogel particles based on chitosan in the form of hydrogel have developed. These compositions have a particularly high level of water making them very different from the aforementioned matrices. In general, water represents more than 85% or even more than 90% by weight of the composition. Such hydrogel particles have a composition and properties very different from the chitosan matrices mentioned above. Such hydrogel particles are especially used in tissue engineering or also as a vector of active compounds.
  • any hydrogel is not suitable for forming beads that can be easily injected into the human or animal body.
  • Patent application WO 2007/1351 14 discloses beads for tissue engineering comprising a mixture of alginate with a chitosan derivative.
  • This application teaches the use of a chitosan derivative in order to make it soluble in an aqueous medium, in particular in a pH 7.4 buffer, to prevent the formation of insoluble coacervates in the mixture with the alginate.
  • This application particularly recommends grafting oligosaccharide units, in particular based on lactose, to modify the chitosan.
  • An aqueous solution of chitosan derivative at pH 7.4 and an aqueous solution of alginate at the same pH are prepared.
  • the aqueous solution of chitosan derivative mixed with the alginate has a pH of about 7.4 and can then be used to form droplets, which are then gelled in contact with an alginate gelling agent, thus forming hydrogel beads.
  • the application teaches more particularly the formation of droplets of the solution of alginate and of chitosan derivative at a mass ratio of 3: 1, by passage via a type 23Ga syringe or by the use of an electrostatic type generator, with a 0.7mm nozzle.
  • the capsules obtained after gelling in a bath containing a calcium ion and after washing are of millimeter size, with a diameter of approximately 3 to 4 mm.
  • alginate 75% of the total polymers
  • chitosan 25% of the total polymers
  • hydrogel beads based on chitosan and alginate, in particular for their use in intra-articular supplementation. It is in this patent to improve the effects of a hydrogel by combining it with hydrogel beads, usable at least in this specific application. In particular, these beads have a life time after injection at the intra-articular high level as well as interesting mechanical properties where the injection is performed. Such beads are particularly interesting because of their properties, in particular their elastic properties, provided during the intra-articular injection.
  • the hydrogel beads according to this patent have trabeculae. Trabeculae are fibrillar or filamentous species present inside the hydrogel.
  • microbeads are formed of a homogeneously distributed alginate / chitosan network, they also have trabeculae.
  • This pilot study provides results supporting the interest of microbeads for the treatment of osteoarthritis and associated cartilage lesions, intra-articularly. This technology still needs to be improved because the microbeads have a diameter that is difficult to reduce, in particular by the presence in the solution of the alginate / chitosan mixture trabecules limiting the injection via a nozzle of very fine diameter.
  • the present inventors consider that a larger shear could have been used, but such shearing would probably have altered the molecular weight of the polymers involved and the structure of the lattice they form between them, and thus lose the cohesion of the microbeads. obtained by example as estimated by manipulation between the fingers. This loss of cohesion is undesirable for the applications contemplated in the present invention.
  • the application WO 2009/150651 still describes a hydrogel based on the combination of two solutions of chitosan of different characteristics, starting from an acid solution brought gradually to neutral pH.
  • the first chitosan is highly acetylated with a degree of acetylation of between 40% and 60%.
  • the second chitosan is highly deacetylated with a degree of acetylation of at most 20%.
  • Such hydrogels are sensitive to temperature which allows them to gel in situ, after injection into the human or animal body.
  • the application does not teach how to form hydrogel particles.
  • the present invention aims to provide hydrogel particles.
  • the present application aims to provide hydrogel beads that do not have solid particles, such as trabeculae.
  • the present invention also aims to provide hydrogel beads whose composition comprises chitosan, optionally mixed with other compounds.
  • This composition is advantageously homogeneous.
  • the composition is considered "homogeneous" in the sense that the composition is in the form of an aqueous solution and does not form polymeric coacervates, solid filaments or trabeculae.
  • the present invention also aims to provide hydrogel beads, starting from a solution whose viscosity is adequate to be implemented in the form of droplets according to one or more of the commercially available techniques, and advantageously by adapting the droplet diameter for the preparation of injectable hydrogel microbeads through fine needles.
  • the present invention also aims to provide hydrogel beads whose manufacturing process is industrially, preferably by limiting the manufacturing costs and ensuring good reproducibility of the microbeads thus manufactured.
  • the object of the invention is to provide microbeads having good properties, for example good mechanical properties for the envisaged applications, and more specifically for intra-articular injections, for example of good elastic and shock absorption properties, good crush resistance, and good adhesion to fabrics.
  • the hydrogel beads according to the prior process described in patent EP 2538987 B1 have a large diameter.
  • the article by Oprenyeszk et al. 2013, shows that such particles have a diameter of 600 to 900 micrometers ( ⁇ ).
  • the hydrogel beads are therefore not suitable for intra-articular injections which require fine needles of small diameter, especially in the context of articular diseases treated by intra-articular viscosupplementation and chronic joint diseases.
  • Such diseases are typically cartilage pathologies, which cause cartilage damage and defects and joint pain, such as osteoarthritis, for example due to aging or an accident.
  • To ensure ease of injection by the practitioner increase the comfort of the patient, limit the risk of misplaced injection and avoid the risk of infection, especially during repeated injections, it is necessary to use fine needles.
  • the present invention therefore still aims to provide an injectable composition intra-articularly which facilitates repeated injections, in particular through fine needles such as for example 18-22 Gauge type needles as recommended for most products viscosupplementation currently marketed, especially above 21 Gauge, or possibly even finer, for example 23 Gauge. It is therefore desired to develop microbeads whose properties and diameter distribution can be adjusted so that they can be easily injected through fine needles, in particular microbeads whose number-average diameter is less than 900 ⁇ m, preferably less than ⁇ , preferably less than 700 ⁇ , and more preferably whose D (0.9) is less than 900 ⁇ , preferably less than ⁇ , preferably less than 700 ⁇ .
  • the invention implements a specific manufacturing process for chitosan-based hydrogel microbeads, which does not include the formation of solid trabeculae in the microbeads, thus avoiding the drawbacks mentioned in the prior art, so that surprising. It is apparent from reading the prior art discussed above that the solution provided by the present invention was not obvious to those skilled in the art.
  • the invention more specifically relates to a hydrogel particle or ball, and more particularly to a hydrogel microbead.
  • the present invention relates to a hydrogel microbead comprising at least water, chitosan and alginate, the water being present at a concentration at least 90% by weight, the chitosan being present at a concentration of 0.3 to 10% by weight and the alginate being present at a concentration of 0.5 to 10% by weight, the percentages by weight being expressed by relative to the mass of the hydrogel microbead, said ball having a number average diameter ranging from 100 to 900 ⁇ , said ball having no solid trabecules.
  • the mass percentages expressed relative to the mass of the hydrogel microbead are expressed relative to the constituents of the hydrogel.
  • the mass percentages expressed relative to the mass of the hydrogel microbead preferably include the hydrogel microbead without active agent, for example cells, polypeptides, proteins, polynucleosides or polynucleotides, which have a Therapeutic virtue and which are not directly necessary for the preparation of the hydrogel.
  • beams means a particle of substantially spherical shape. Such a shape can be appreciated by microscope. Such a ball may have inherent imperfections in the manufacturing process.
  • microbead means a ball having a size less than 1000 micrometers.
  • the beads according to the invention advantageously have a number average diameter of between 200 and 800 micrometers, and advantageously between 300 and 700 micrometers.
  • the balls according to the invention have a number average diameter preferably of between 100 and 500 micrometers, and preferably between 200 and 500 micrometers.
  • the measurement of the average diameter by number of the balls according to the invention is preferably carried out by optical microscopy, according to the following method:
  • the number average diameter, the standard deviation and the coefficient of variation of a population of microbeads are measured using an inverted optical microscope, for example of the OLYMPUS brand, model CKX41 and equipped with a camera and a 20X lens.
  • a fraction of the population of microbeads is placed in an observation cup itself placed under the objective.
  • a digital photo is taken after adjusting the image.
  • the program "LABSENSE" brand OLYMPUS and accompanying the microscope allows tracing straight lines calibrated according to the lens used. A minimum of 20 balls is selected on the image and a diagonal is drawn by the program on each of them.
  • the program allows direct visualization of the measurement. These measurements are reported on a spreadsheet, for example EXCEL of the MICROSOFT brand, and the following variables are calculated.
  • n 1-1 1 The standard deviation is calculated using the formula:
  • the coefficient of variation C v is calculated using the formula (split standard deviation)
  • N represents the number of balls of the sample whose diameter is measured
  • X represents the diameter measured for a ball
  • i being an integer ranging from 1 to n.
  • the diameter distribution of the microbeads can also be measured by a laser diffraction method, for example using a Malvern Mastersizer equipment, for example a Mastersizer 2000, using a preference measurement protocol according to the IS013320 standard: 2009 or following the monograph of the European Pharmacopoeia EP2.9.31, implementing Mi's theory.
  • the distribution of the beads is narrow, that is to say with a small dispersion of the diameter of the balls relative to the average diameter, that is to say for example a dispersity index of less than 2 measured by laser diffraction, for example as mentioned above.
  • the microspheres have a D (0, 1) between 100 and 600 microns, and advantageously between 200 and 400 microns.
  • the microbeads have a D (0.5) comprised alternatively between 100 and 800 micrometers, and preferably between 300 and 700 micrometers.
  • the microbeads have a D (0.5) comprised alternately between 300 and 600 micrometers.
  • the microspheres have a D (0.9) of between 100 and 1000 micrometers, and advantageously between 300 and 950 micrometers.
  • the microspheres have a D (0.9) of between 100 and 950 micrometers, and advantageously between 300 and 900 micrometers, more advantageously between 300 and 800 micrometers.
  • the microspheres have a D (0.9) of between 200 and 700 microns, and advantageously between 300 and 650 microns.
  • the invention relates in particular to sterilized or non-sterilized hydrogel beads whose diameter D (0.9) is:
  • the hydrogel microbeads comprise at least 95% water by weight. According to a specific variant, the hydrogel microbeads comprise at least 97% by weight of water.
  • the chitosan is present in the hydrogel at a concentration of between 0.3 and 5%, and preferably 0.5 and 3% by weight of chitosan.
  • the microbead comprises between 0.5 and 0.7% by weight of chitosan.
  • Chitosan is referenced as CAS No. 9012-76-4.
  • the chitosan of the invention is a polysaccharide preferably prepared from a fungal source. It is preferably extracted and purified from safe and abundant food or biotechnological fungal sources such as Agaricus bisporus or Aspergillus niger. Chitosan is obtained by hydrolysis of an extract rich in chitin. Chitin is a polysaccharide composed of several N-acetyl-D-glucosamine units linked together by a ⁇ -type bond (1, 4).
  • Chitosan consists of D-glucosamine units (deacetylated units) and N-acetyl-D-glucosamine units (acetylated units) linked together by ⁇ -type bonds (1, 4) and constitutes a poly-type polymer ( N-acetyl-D-glucosamine) -poly (D-glucosamine).
  • the chitosan of the invention is therefore advantageously of fungal origin, and preferably derived from the mycelium of a mushroom of the Ascomycete type, and in particular of Aspergillus niger, and / or of a Basidiomycete fungus, and in particular Lentinula edodes. (shiitake) and / or Agaricus bisporus.
  • the fungus is Agaricus bisporus.
  • Any origin and method of preparation of chitosan may be used.
  • a method for preparing chitosan is that described in the patents resulting from the application WO03068824 (EP1483299; US 7,556,946).
  • Chitosan is advantageously a chemically unmodified chitosan by a covalent coupling reaction with one or more other chemical species.
  • Chitosan is advantageous for its ability to form particles of three-dimensional structure of the mechanically resistant hydrogel type, its biocompatibility and its biodegradability after administration or implantation.
  • the presence of chitosan in such hydrogel particles is desired for its intrinsic, physicochemical and / or biological properties, for example for its ability to adhere to biological surfaces or its ability to stimulate tissue healing.
  • the average molecular weight of chitosan is less than or equal to 80,000.
  • the molecular weight of chitosan is between 15,000 and 70,000, and preferably between 35,000 and 60,000.
  • the average molecular weight is the viscosity average molecular weight (Mv), calculated from the intrinsic viscosity according to the Mark-Houwink equation. The intrinsic viscosity is measured by capillary viscosimetry, with a Ubbelohde capillary viscometer, according to the method of the European Pharmacopoeia monograph EP2.2.9.
  • the flow time of the solution is measured through a suitable capillary tube (Lauda, for example the capillary tube Ubbelohde 510 01 with a diameter of 0.53 mm) using an automatic viscometer Lauda Vise, first at the concentration initially in chitosan, then for several dilutions, for example according to the recommendations of method EP2.2.9.
  • the reduced intrinsic viscosity is deduced for each of the concentrations.
  • the reduced viscosity is plotted as a function of temperature, and the value is extrapolated to the concentration 0 to deduce the intrinsic viscosity.
  • the reduced viscosity ( ⁇ 2 in ml / g) of the dilutions as a function of the concentration C of the dilutions (g / ml) according to formula 5 should be used.
  • the chitosan may have a degree of acetylation of between 10 and 40%, and preferably between 10 and 25%.
  • the degree of acetylation is determined by potentiometry. Chitosan is dissolved in a solution of hydrochloric acid. The excess of unreacted hydrochloric acid with the amino functions of chitosan is determined by a standard solution of sodium hydroxide. This gives the number of moles of D-glucosamine unit present in the chitosan and thus by subtraction the degree of acetylation.
  • the chitosan of the present invention may have a dynamic viscosity of between 5 and 50 mPa.s in 1% (w / v) solution in 1% (v / v) acetic acid.
  • the dynamic viscosity of the 1% chitosan solution is preferably between 5 and 25mPa.s. Viscosity is typically measured on a device Brookfield DV2T at a speed of 50 to 100 rpm (eg 100rpm) with a "Spindle S18" needle at 25 ° C.
  • the chitosan solution behaves like a Newtonian fluid: the viscosity is independent of the speed of rotation. The viscosity value is therefore the same regardless of the rotational speed chosen. The selected speed is compatible with the maximum torsion of the spring of the measuring device.
  • Alginates, salts of alginic acid are polysaccharides with multiple applications, commonly used in particular in the pharmaceutical, cosmetic and food fields. Their ability to form gels is one of their most exploited properties. Alginates of alkali metals (sodium, potassium, magnesium, etc.) are soluble in water, whereas alginates of divalent or trivalent ions such as calcium, aluminum or iron are practically insoluble. Thus, for example, the placing in the presence of a sodium alginate with a gelling agent, for example a calcium salt, in aqueous solution allows the gelation of the alginate, for example in the form of calcium alginate.
  • a sodium alginate with a gelling agent for example a calcium salt
  • Alginate is a polymer formed from two monomers bonded together: mannuronate or mannuronic acid, some of which are acetylated, and guluronate or guluronic acid.
  • a preferred alginate is a pharmaceutical grade or medical grade, particularly a sodium alginate suitable for injection or implantation into the human or animal body. It is in particular a low molecular weight alginate, for example characterized by its viscosity in 1% solution.
  • the alginate is present in the hydrogel at a concentration of between 1 to 10%, and preferably 1 to 5% by weight.
  • the microbead comprises 1 and 1, 4% by weight of alginate.
  • the microbead comprises from 0.5 to 0.7% by weight of chitosan and less than 1.3% by weight of alginate. According to one variant, the microbead comprises less than 1.2% by weight of alginate.
  • composition of the microbead comprises 0.5% chitosan and 1.0% alginate by mass relative to the mass of the total composition of the microbead.
  • the microbead of the present invention may comprise different excipients and / or different active ingredients.
  • the agents that promote the gelling of the bead the agents for modifying the viscosity, the agents for modifying the rheology.
  • the composition of the microbeads is advantageously non-thermogelifiable. Indeed, to ensure good stability of the beads before and after injection, typically intra-articularly, the gelation or the sol-gel transition must not occur after or at the time of injection.
  • the microbeads of the invention are in hydrogel form before their application, in particular by injection into the body of a subject in need, in particular at the intra-articular level.
  • the microbeads are not sensitive to temperature variations between 8 and 40 ° C, that is to say that they do not undergo a sol-gel transition or are not degraded in this temperature range.
  • the microbeads may be suspended in a viscous solution or a hydrogel, which, advantageously, may be thermally gelable.
  • a viscous solution or a hydrogel which, advantageously, may be thermally gelable.
  • This is typically a hydrogel of one or more gel polysaccharides.
  • the present invention also relates to a viscous solution or a hydrogel, thermogelifiable or not, comprising a plurality of microbeads of the invention.
  • composition of the microbead according to the invention may also comprise compounds of interest, particularly at the pharmaceutical level (active pharmaceutical ingredient) and even more specifically for intra-articular action, more particularly on cartilage. It is even more specifically beneficial agents in compositions for intra-articular use, for example to reduce pain or decrease inflammation.
  • anti-inflammatory drugs more particularly non-steroidal drugs, anesthetic agents, analgesic agents, in particular of the opioid type, corticosteroids, anti-neoplastics, monoclonal antibodies, vitamins minerals, contrast agents, etc.
  • Non-steroidal drugs may for example be mentioned for example: Diclofenac TM, Ibuprofen TM, Piroxicam TM; anesthetics, for example: Lidocaine TM, Bupivacaine TM; opioid analgesics for example: codeine, morphine; corticosteroids, for example: dexamethasone, prednisone; anti-neoplastic agents, for example: Methotrexate TM; antiviral agents, for example: Acyclovir TM, Vidarabine TM; monoclonal antibodies, for example: Humira TM Infliximab TM.
  • Diclofenac TM Diclofenac TM
  • Ibuprofen TM Piroxicam TM
  • anesthetics for example: Lidocaine TM, Bupivacaine TM
  • opioid analgesics for example: codeine, morphine
  • corticosteroids for example: dexamethasone, prednisone
  • microbeads of the invention in particular that can be used as intra-articular injectable supplements, may also contain compounds such as cells, proteins, polynucleotides (RNA, DNA), minerals such as, for example: selenium, strontium, vitamins as for example: tocopherol, or other active agents such as curcumin.
  • compounds such as cells, proteins, polynucleotides (RNA, DNA), minerals such as, for example: selenium, strontium, vitamins as for example: tocopherol, or other active agents such as curcumin.
  • chondrocytes chondrocytes, stem cells, or cells having the capacity to produce active substances.
  • the hydrogel microbeads according to the present invention have a homogeneous hydrogel structure.
  • the hydrogel microbeads according to the present invention do not have trabeculae or solid particles inherent in the preparation of the hydrogel. It is not excluded that active agents are in solid or colloidal form, for example in nanoparticulate form.
  • the microbeads of the invention are cohesive.
  • the cohesion of the balls is not lost during the friction between the hands.
  • the beads advantageously have good compressive strength, in particular when handling between the fingers.
  • a resistance can for example be evaluated by measuring the compressive strength of a test bench (eg Instron Bluehill). It is also possible to use a nanoindentation technique (for example with the Picoindenter range of PI series equipment marketed by the company Hysitron or the Mach 1 marketed by Biomomentum) or else a suitable tribology technique (for example with the range). Tl Series Triboindenteur equipment marketed by Hysitron).
  • the balls are deformable and can be injected by a needle into the inner diameter is smaller than the maximum diameter of the balls. This has a great advantage for injection into a tissue because with equal inner diameter, a smaller outside diameter needle can be used, thus forming a smaller diameter hole.
  • microbeads can be manufactured advantageously according to the method of the invention.
  • the method of the invention comprises:
  • the pH is determined by following the method described in the European Pharmacopoeia (EP 2.2.3).
  • the pH meter used is a pH meter from the Sartorius range with a combined glass electrode (PY-P1 1). PH measurements are made between 20 and 25 ° C.
  • the chitosan is preferably dissolved in an aqueous solution at a pH below 7.
  • a solution typically comprises an acid, preferably a weak one, such as an organic acid. It is advantageous to use acetic acid.
  • the solution typically comprises 0.5 to 3% of acetic acid expressed in volume relative to the total volume of the chitosan solution
  • the pH of the chitosan solution is typically between 2 and 6.5, and preferably between 3.5 and 6.0.
  • the dynamic viscosity of the chitosan solution is preferably between 5 and 50mPa.s, and more preferably between 10 and 30mPa.s. Dynamic viscosity is typically measured using a Brookfield DV2T device at 20 rpm with a Spindle S18 needle.
  • the osmolarity of the chitosan solution ranges from 100 to 300 mOsm / kg.
  • the determination of the osmolarity of the solutions is carried out with an automatic micro osmometer (Osmometer Type 15M from Loser Messtechnik).
  • the equipment is calibrated beforehand with a solution of 300mosm / kg.
  • the sample is placed in a container provided for this purpose, and is put to the standard temperature of the measurement.
  • the sodium alginate solution has a pH greater than 10, and preferably between 12 and 14, and more preferably about 13.
  • a base can be used to adjust the pH.
  • bases mention may be made of sodium hydroxide, sodium carbonate, potassium hydroxide, etc.
  • the alginate solution advantageously has a dynamic viscosity of between 50 and 300mPa.s, and preferably between 50 and 150mPa.s.
  • a dynamic viscosity can be measured on a rotating mob device, for example the Brookfield DV2T device at 5 rpm with a Spindle S18 needle.
  • the sodium alginate solution does not comprise a buffering agent.
  • the solution of chitosan and alginate are mixed in a volume proportion, for example ranging from 1: 10 to 10: 1, preferably 1/5 to 5/1, and typically ranging from 1: 3 to 1: 1 (v / v).
  • the volume proportion of the alginate solution is greater than that of the chitosan solution.
  • a device of the type comprising a rotor and a stator ensuring axial movement and radial movement of the solution for its homogenization.
  • Such devices are in particular marketed under the commercial reference Ultra-Turrax®.
  • the rotation is carried out initially at low speed and then at high speed.
  • a slow speed is typically a few revolutions per minute (1 to 10tr / m).
  • a slow speed is implemented when the solutions of chitosan and alginate are added to each other.
  • a high speed is typically several thousand revolutions per minute, preferably greater than 3000 rpm, and more preferably greater than 10,000 rpm.
  • the high speed generally remains below 20000 rpm.
  • a high speed is implemented when the addition of a solution to the other is completed. In general, stirring at high speed is stopped when the solution is homogeneous.
  • a particularly preferred method comprises mixing the chitosan-alginate solution with agitation, preferably shear, with low rotation. After complete addition of the chitosan solution, the mixture is sheared at high speed. The homogeneous solution obtained has no trabeculae or solid fibers.
  • the pH of the premix is greater than 10, or even greater than 1 1, and preferably between 12 and 13. Below the above-mentioned advantageous pH, precipitation occurs which induces the formation of undesirable solid particles.
  • no buffer solution is used to make the premix.
  • the premix is also an object of the invention. More specifically, the invention also relates to a solution comprising water, chitosan and alginate, called "premix", having a pH greater than 12 and capable of forming microbeads according to the invention.
  • the premix has a dynamic viscosity of between 100 and 500 mPa.s.
  • the dynamic viscosity of the premix is preferably between 100 and 500 mPa.s, and more preferably between 180 and 300 mPa.s.
  • the dynamic apparent viscosity of the premix is measured using a rotating mobile viscometer, for example a rotational mobile viscometer of the Brookfield mark, for example equipped with a S18 type spindle at a speed at 5 rpm and at a temperature of 25 ° C.
  • the osmolarity of the premix is advantageously between 100 and 300 mOsm / kg, and typically between 100 and 200 mOsm / kg.
  • the gelation of the microbeads occurs under conditions suitable for the gelling of the premix.
  • one or more gelling agents are used which are capable of forming a chitosan and alginate hydrogel from the premix.
  • the gelling of the solution takes place by placing the premix in the presence of at least one agent for gelling the alginate.
  • the alginate present in the premix is preferably in a form capable of gelling.
  • sodium alginate can be used.
  • gelling agents that may be mentioned are calcium and strontium ions, which are specifically suitable for the gelling of sodium alginate.
  • a gelling agent is therefore preferably selected from calcium chloride, strontium chloride, and mixtures thereof. Calcium chloride is preferably used in the context of the invention.
  • the gelation is carried out by bringing the premix into contact drop by drop with a solution comprising a gelling agent.
  • the concentration of gelling agent is determined by those skilled in the art. Typically, a concentration of 50 to 200 mM calcium chloride may be used.
  • the device for the formation of the drops and their gelation may be of the "prilling" type, that is to say a grilling process.
  • a device comprising a drop production nozzle having an internal diameter of greater than or equal to 100 ⁇ is preferably used. one can for example use a diameter of 100 or 150 ⁇ .
  • a batch process may be used, for example by passing the solution through a needle using a peristaltic pump. It is also possible to use a continuous, industrially appropriate process. Examples of continuous processes that may be mentioned include, for example, an electromagnetic laminar jet process also known as prilling, as with the VAR-D continuous equipment marketed by Nisco), or others such as, for example, a electrostatic drops, or with coaxial air flow, or dynamic air flow, or by gravity, or by spray (“spray drying"), or by continuous extrusion with the outgoing jet cut with the aid of a rotary tool (called Jetcutter, as with Genialab equipment).
  • stirring can be carried out, for example using a magnetic bar, for example a speed of between 50 and 500 rpm.
  • the process comprises washing the microbeads, preferably with an aqueous solution, and more preferably water.
  • the process of the invention comprises for example the recovery of microbeads by gravity.
  • the beads settle to the bottom of the container containing the solution, typically the washing bath container.
  • the solution can be removed by a suction device, such as through a needle whose characteristics (typically the diameter) do not allow the passage of microbeads. After removal of the solution, only the microbeads remaining in the container remain, which can be manipulated for subsequent operations.
  • the present invention also relates to sterile microbeads.
  • the microbeads are sterilized with moist heat, typically using an autoclave.
  • the autoclave conditions are a temperature of about 121 ° C for a period of at least 15 minutes.
  • the present invention also relates to a method for sterilizing the microbeads described in the invention.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition or a medical device comprising a plurality of microbeads according to the invention or obtained according to the method of the invention.
  • the present invention also relates to an injectable pharmaceutical composition comprising the microbeads of the invention.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition or a medical device consisting of an artificial synovial fluid.
  • the pharmaceutical composition or the medical device is useful in the treatment of a pathology of a joint.
  • the pharmaceutical composition or medical device is useful in the treatment of pain or discomfort associated with a pathology affecting a joint or to slow the progression of a pathology of a joint.
  • the present invention also relates to a medical device, possibly in the form of one or more packaging kits, possibly physically separated, comprising a syringe, a needle and a pharmaceutical composition or medical device according to the invention, said syringe comprising a reservoir optionally pre-filled with the aforementioned pharmaceutical composition or medical device.
  • the present invention relates to such a medical device for its use in the treatment of a joint pathology comprising the injection of a pharmaceutical composition or medical device according to the invention intra-articularly.
  • the present invention also relates to hydrogel microbeads according to the invention, or obtained according to the invention for its use in the treatment of a pathology, by injection into the human or animal body, possibly presence of an injectable solution or hydrogel.
  • the needle used is a needle selected from 18 to 22 gauge needles, more preferably 22 gauge and larger.
  • the needle used has normal walls, thin or extra-fine.
  • the present invention also relates to a method for supplementing the synovial fluid, in particular in a pathology affecting a joint, such as osteoarthritis (osteoarthritis or osteoarthritis) or cartilage lesions, etc.
  • a pathology affecting a joint such as osteoarthritis (osteoarthritis or osteoarthritis) or cartilage lesions, etc.
  • the present invention further relates to a method of combating pain or discomfort associated with a condition affecting a joint.
  • the present invention further relates to a method of controlling inflammation of a joint.
  • pathologies are for example: osteoarthritis (osteoarthritis) (primary (idiopathic) or secondary), rheumatoid arthritis (rheumatoid arthritis), injury of a joint (for example traumatic or a mobility injury) repeated joint disease), cartilage pathology (eg, chondrocalcinosis or chondromalacia), septic arthritis.
  • osteoarthritis primary (idiopathic) or secondary
  • rheumatoid arthritis rheumatoid arthritis
  • injury of a joint for example traumatic or a mobility injury
  • cartilage pathology eg, chondrocalcinosis or chondromalacia
  • septic arthritis e.g, chondrocalcinosis or chondromalacia
  • the present invention further relates to a method of reducing or combating the pain associated with a disease, for example as those mentioned above, or to slow down the progression.
  • the present invention further relates to a method for improving bone repair, particularly cartilage.
  • Such methods typically include intra-articular injection of a composition comprising microbeads according to the invention.
  • the method according to the invention comprises a plurality of injections.
  • an injection can be made once or twice a month for several months.
  • two injections spaced apart from a variable time are carried out.
  • a single injection is made.
  • the methods of the invention are useful for a subject in need, such as for example a subject requiring the treatment of an articular pathology.
  • the injection site or sites are typically chosen from: a knee, a shoulder, a hip, a temporomandibular joint, a carpometacarpal joint, an elbow, ankle, a wrist, a joint of the hand, a disc intervertebral, or other joint.
  • the injection is performed in an articular cavity, in contact with the cartilage.
  • the microbeads of the invention are used in tissue engineering or as vectors of active compounds, in particular as vectors of pharmaceutically active compounds.
  • composition according to the invention or equivalent terms means a defined composition, method or process as in the present invention, including any one of the variants, particular or specific embodiments, independently or according to any of their combinations, including according to the preferred features.
  • each example has a general scope.
  • the outer diameter (OD) (min - max) denotes the tolerance according to the aforementioned standard. Unless otherwise indicated, the diameter of the needles mentioned is that ID normal / regular walls.
  • Ultrapure chitosan comes from Synolyne Pharma (Belgium). It is of fungal origin (Paris mushrooms, Agaricus bisporus), and has the following characteristics: degree of acetylation 14mol% and average viscosimetric molecular mass (Mv) 54000.
  • the chitosan is solubilized at a concentration of 1, 5% ( m / m) in a solution of acetic acid at 1% (v / v).
  • the dynamic viscosity of the solution thus obtained is between 15 and 25mPa.s (according to the measurement method described in the description).
  • the pH of the solution is about 4.4.
  • the ultrapure sodium alginate (Pronova UP LVM) comes from Novamatrix (Norway). It has a dynamic viscosity in solution at 1% (measured according to the description) of about 1 10mPa.s.
  • the sodium alginate is solubilized at a concentration of 1.5% (w / w) in 0.5% (v / v) aqueous sodium hydroxide solution.
  • the dynamic viscosity of the solution thus obtained is between 10 and 120 mPa.s (according to the measurement method described in the description).
  • the pH of the solution is about 13. There was no addition of buffering agent.
  • the solutions of chitosan and alginate are mixed at a rate of 66.7 ml of chitosan solution and 133.3 ml of alginate solution, then they are homogenized for 3 minutes at high speed using an IKAT18 homogenizer ( IKA, Germany). The result is a solution that does not have a trabecula or fibers. This homogeneous solution forms the premix.
  • the premix has the following characteristics:
  • the final concentrations of chitosan and alginate in the premix are 0.5% (w / w), and 1.0% (w / w), respectively.
  • the solid trabeculae of chitosan can be investigated by light microscopy after staining the sample with hematoxylin-eosin.
  • Eosin is anionic and tends to bind to positively charged chitosan.
  • the beads are incubated for 4 hours at 4 ° C. in a 100 mM sodium cyanodilate buffer solution, 20 mM CaCl 2 , pH 7.4 and containing 40 g / l of paraformaldehyde.
  • the beads are washed 3x with a 100 mM Sodium cacodylate buffer; 50 mM BaCI 2 , pH 7.4 to prevent their disintegration
  • the beads are then dehydrated by successive passages in baths of increasing concentration of methanol, isopropanol and xylene
  • the beads are then embedded in the paraffin and the paraffin blocks cut into strips of 5 ⁇ thick using a microtome (Leica RM 2145).
  • the beads sections are previously deparaffinized and rehydrated by successive baths of xylene, ethanol in decreasing concentration and demineralized water. The whole bead is colored directly.
  • the beads or sections of beads are incubated for 15 minutes in a Mayer hematoxylin solution.
  • the beads or sections of balls are rinsed 2x with water and then with a 2.6% NH 4 OH solution.
  • the beads or sections of beads are incubated in a solution of 0.5% eosin Y aqueous and 0.5% acetic acid
  • the beads or sections of beads are then rinsed with water and then dehydrated using a bath of increasing concentrations of ethanol and xylene
  • the drops of premix according to Example 1 are formed by an electromagnetic laminar jet process also called “prilling” with equipment “Encapsulator VAR-D (Gen. 2) (Nisco, Zurich, Switzerland), connected to a Watson peristaltic pump. Marlow (Willmington, MA, USA) model 520S, equipped with a nozzle of appropriate diameter.In this example, we use a 100 ⁇ diameter nozzle, and a flow between 1 and 3tr / min and a frequency of 500 to 2500Hz.
  • the drops of premix according to Example 1 fall into a solution of calcium chloride of concentration 102 mM (15 g / l) and are stirred between 15 min and one hour (more particularly one hour) using a magnetic bar, to a speed of 250tr / min.
  • the beads are then washed with water for injection (approximately one liter each wash) 6 to 7x.
  • Bulk is stirred about a minute between each wash at 250rpm, using a magnetic bar.
  • the balls are recovered by gravity. Stirring is stopped and the beads sediment at the bottom of the wash bath. The liquid is removed. When the recovery container is free of water, the balls are weighed and the net mass of the balls is adjusted to a net mass equal to that of the premix before production.
  • microbeads have a diameter of between 100 and 700 ⁇ by optical microscopy, and the following diameter distribution, measured by laser diffractometry according to the method of the description: D (0.1) of 250 ⁇ , D (0.5) of 430 ⁇ and D ( 0.9) of 690 ⁇ (measured).
  • the beads are sterilized with moist heat (autoclave - model SYSTEC DX-23, Wettenberg, Germany) at 121 ° C for 15 minutes.
  • moist heat autoclave - model SYSTEC DX-23, Wettenberg, Germany
  • the sterilized microbeads have a diameter measured by optical microscopy of between 100 and 700 ⁇ m (measured according to the method of the description).
  • the diameter distribution of the sterilized beads is as follows, measured by laser diffractometry according to the method of the description:
  • the preparation of three batches of premix is carried out according to Example 1, starting from 3 batches of chitosan (whose dynamic viscosity in solution at 1% is about 15 mPa.s), and a lot of alginate.
  • the dynamic viscosity of the chitosan solution is about 25mPa.s, and its osmolarity is about 150mOsm / kg.
  • the three batches of premix have the following characteristics:
  • microbeads prepared according to Example 2 are prepared, with either a nozzle of diameter 150 ⁇ or with a nozzle of 100 ⁇ diameter, using 50 ml of premix. In total, 6 batches of microbeads were produced.
  • microbeads before sterilization have the diameter distribution reported in Table 2 (according to the methods of the description).
  • the diameter of the nozzle makes it possible to modulate the size distribution of the hydrogel microbeads. It is possible, for example, to obtain a diameter D (0.9) of less than 650 ⁇ m by using a nozzle of 100 ⁇ m diameter.
  • microbeads are easily injectable through needles of variable diameter, for example a needle adapted to intra-articular injection.
  • the logs harvested after injection retain substantially the same size distribution.
  • the preparation of premix is carried out according to Example 1, with 1 lot of chitosan whose dynamic viscosity in 1% solution is 12mPa.s.
  • the dynamic viscosity of the chitosan solution is 25mPa.s and its osmolarity is 150mOsm / kg.
  • microbeads are prepared according to Example 2 with a 150 ⁇ diameter nozzle, starting with 500 ml of premix.
  • the microbeads before sterilization have a diameter of between 100 and 700 ⁇ measured by optical microscopy, and the diameter distribution measured by laser diffractometry:
  • the beads are sterilized according to the procedure of Example 2, and after sterilization have a diameter of between 100 and 700 ⁇ measured by optical microscopy, and the diameter distribution measured by laser diffractometry:
  • microbeads prepared according to Examples 2, 3 and 4 have a homogeneous composition, without trabeculae or solid particles.
  • the mechanical resistance to manual pressure of the microbeads prepared according to Examples 2 to 4 is good, and the microbeads are advantageously deformable.
  • microbeads are able to be injected by a fine needle adapted to intra-articular injection.
  • microbeads retain their elasticity and their size distribution after injection through a fine needle adapted to intra-articular injection, and after storage for 6 months in an aqueous medium.
  • EXAMPLE 5 Physicochemical Characteristics of the Microbeads of the Invention
  • Hydrogel beads based on chitosan and alginate are prepared according to the methods of the invention (see Examples 1 and 2) by a method of forming electromagnetic balls with a laminar jet with a nozzle of 100 ⁇ m diameter (method 1). .
  • the beads are also prepared according to the method of the prior art described according to Example 1 of Patent EP 2538987 B1 (Method 2).
  • the process parameters and the composition of the beads obtained are summarized in Table 3, and the physico-chemical characteristics of the beads are given in Table 4.
  • Alginate concentration (expressed as 1.0% 1, 2% in% m / m in the final beads)
  • the beads have a needle through a suitable diameter too high
  • the viscosity of the viscous solution with and without the microbeads is measured at 37.degree. C. by means of a rheometer under continuous rotation, at increasing speed, over a determined shearing range. It is thus observed that the viscosity is not modified by adding the beads.
  • the hydrogel microbeads are stored at 4 ° C. in an aqueous solution. After a storage period of 3 and 6 months, their appearance, their average diameter in number and their size distribution, measured according to the methods of the description, are unchanged. The beads are injectable without difficulty through a fine needle, and retain substantially their size characteristics after injection.

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Abstract

La présente invention concerne des microbilles d'hydrogel comprenant au moins de l'eau, du chitosane et de l'alginate, l'eau étant présente à une concentration d'au moins 90% en masse, le chitosane étant présent une concentration de 0,3 à 10 % en masse et l'alginate étant présent à une concentration de 0,5 à 10% en masse, les pourcentages en masse étant exprimés par rapport à la masse de la microbille d'hydrogel, lesdites billes présentant un diamètre moyen en nombre allant de 100 à 900 μm, lesdites billes ne présentant pas de trabécules solides. L'invention concerne également leur procédé de fabrication et leurs utilisations, en particulier dans des compositions pharmaceutiques ou des dispositifs médicaux, plus particulièrement pour le traitement d'une pathologie d'une articulation.

Description

Microbille d'hydrogel
La présente invention concerne des microbilles d'hydrogel, leur procédé de fabrication et leurs utilisations, en particulier dans des compositions pharmaceutiques ou des dispositifs médicaux, plus particulièrement pour le traitement d'une pathologie d'une articulation.
Le chitosane est un polymère d'origine naturelle présentant un intérêt connu depuis de nombreuses années. Ce polysaccharide peut être obtenu à partir de sources animales comme à partir de carapace de crustacés, mais également à partir de sources fongiques à partir de parois cellulaires de champignons.
Le chitosane est par exemple utilisé sous la forme de matrice pour encapsuler des principes actifs. Il sert alors en général de véhicule pharmaceutique. Ces véhicules peuvent se présenter sous forme solide, en particulier lorsqu'ils sont séchés ou lyophilisés. De nombreux brevets concernent cette technologie.
En parallèle de cette technologie, se sont développées des particules à base de chitosane sous forme d'hydrogel, de différentes dimensions. Ces compositions présentent un taux particulièrement élevé d'eau les rendant très différentes des matrices précitées. En général l'eau représente plus de 85%, voire plus de 90% en masse de la composition. De telles particules d'hydrogels présentent une composition et des propriétés très différentes des matrices de chitosane évoquées ci-dessus. De telles particules d'hydrogel sont notamment utilisées en ingéniérie tissulaire ou également comme vecteur de composés actifs.
Cependant tout hydrogel ne convient pas pour former des billes pouvant être facilement injectables dans le corps humain ou animal.
La demande de brevet WO 2007/1351 14 décrit des billes pour l'ingéniérie tissulaire comprenant un mélange d'alginate avec un dérivé de chitosane. Cette demande enseigne d'utiliser un dérivé de chitosane afin de le rendre soluble en milieu aqueux, en particulier dans un tampon à pH 7.4, pour éviter la formation de coacervats insolubles dans le mélange avec l'alginate. Cette demande préconise en particulier de greffer des unités d'oligosaccharide, en particulier à base de lactose, pour modifier le chitosane. Il est préparé une solution aqueuse de dérivé de chitosane à pH 7,4 et une solution aqueuse d'alginate au même pH. La solution aqueuse de dérivé de chitosane en mélange avec l'alginate présente un pH d'environ 7,4 et peut ensuite servir à former des gouttelettes, qui sont alors gélifiées au contact d'un agent de gélation de l'alginate, formant ainsi des billes d'hydrogel. La demande enseigne plus particulièrement la formation de gouttelettes de la solution d'alginate et de dérivé de chitosane à un ratio massique de 3:1 , par passage via une seringue de type 23Ga ou par l'utilisation d'un générateur de type électrostatique, avec une buse de 0.7mm. Les capsules obtenues après gélation dans un bain contenant un ion calcium et après lavage sont de taille millimétrique, de diamètre d'environ 3 à 4mm. Elles contiennent en majeure partie de l'alginate (75% du total des polymères) et en mineure partie un dérivé de chitosane (25% du total des polymères). Cette proportion élevée d'alginate peut être expliquée par la difficulté à préparer une solution gélifiable homogène et pouvant facilement former des microcapsules lorsque la proportion d'alginate diminue.
Il est connu de par le brevet EP 2538987 B1 (US 20120321678) des billes d'hydrogel à base de chitosane et d'alginate, en particulier pour leurs utilisations en supplémentation intra-articulaire. Il s'agit dans ce brevet d'améliorer les effets d'un hydrogel en le combinant avec des billes d'hydrogel, utilisable au moins dans cette application spécifique. Il convient notamment que ces billes présentent une durée de vie après injection au niveau intra-articulaire élevée ainsi que des propriétés mécaniques intéressantes où l'injection est réalisée. De telles billes sont particulièrement intéressantes de par leurs propriétés, en particulier leurs propriétés élastiques, apportées lors de l'injection intra-articulaire. Les billes d'hydrogel selon ce brevet présentent toutefois des trabécules. Les trabécules sont des espèces fibrillaires ou filamenteuses présentes à l'intérieur de l'hydrogel.
L'article d'Oprenyeszk et al., 2013 (Protective effect of a new biomaterial against the development of expérimental osteoarthritis lésions in rabbit: a pilot study evaluating the intra-articular injection of alginate-chitosan beads dispersed in an hydrogel ; Osteoarthritis Cartilage. 2013 Aug. 21 '(8):1099- 107. doi: 10. 1016/j.joca.2013.04.017) décrit une étude de l'injection chez des lapins des microbilles d'hydrogel d'un mélange de chitosane et d'alginate préparées selon l'enseignement du brevet EP 2538987 B1 . Ces microbilles présentent une gamme de diamètre de 600 à 900μηι. Bien que ces microbilles soient formées d'un réseau alginate/chitosane répartis de manière homogène, elles présentent également des trabécules. Cette étude pilote fournit des résultats supportant l'intérêt des microbilles pour le traitement de l'ostéoarthrite et des lésions du cartilage associées, par voie intra-articulaire. Cette technologie nécessite encore d'être améliorée car les microbilles présentent un diamètre qu'il est difficile de diminuer, notamment de par la présence dans la solution du mélange alginate/chitosane des trabécules limitant l'injection via une buse de diamètre très fin. Les présents inventeurs considèrent qu'il aurait pu être utilisé un cisaillement plus important, mais un tel cisaillement aurait probablement altéré la masse moléculaire des polymères en jeu et la structure du réseau qu'ils forment entre eux, et ainsi fait perdre la cohésion des microbilles obtenues, par exemple telle qu'estimée par une manipulation entre les doigts. Cette perte de cohésion est indésirable pour les applications envisagées dans la présente invention.
La demande WO 2009/150651 décrit encore un hydrogel à base de la combinaison de deux solutions de chitosanes de caractéristiques différentes, au départ d'une solution acide portée progressivement à pH neutre. Le premier chitosane est hautement acétylé avec un degré d'acétylation compris entre 40% et 60%. Le second chitosane est hautement déacétylé avec un degré d'acétylation d'au plus 20%. De tels hydrogels sont sensibles à la température ce qui leur permet de gélifier in situ, après injection dans le corps humain ou animal. La demande n'enseigne pas comment former des particules d'hydrogel.
La présente invention a pour but de fournir des particules d'hydrogel.
En particulier, la présente demande a pour but de fournir des billes d'hydrogel ne présentant pas de particules solides, comme des trabécules.
La présente invention a également pour but de fournir des billes d'hydrogel dont la composition comprend du chitosane, éventuellement en mélange avec d'autres composés. Cette composition est avantageusement homogène. La composition est considérée « homogène » au sens où la composition est sous la forme d'une solution aqueuse et ne forme pas de coacervats polymériques, des filaments solides ou des trabécules.
La présente invention a également pour but de fournir des billes d'hydrogel, au départ d'une solution dont la viscosité est adéquate pour pouvoir être mise en œuvre sous forme de gouttelettes selon une ou plusieurs des techniques disponibles industriellement, et avantageusement en adaptant le diamètre des gouttelettes pour la préparation de microbilles d'hydrogel injectables au travers d'aiguilles fines.
II ressort de l'état de la technique que la préparation de telles billes d'hydrogel n'est pas aisée puisque le brevet EP 2538987 B1 décrit que le mélange chitosane- alginate est très visqueux, et forme des microbilles comprenant des trabécules, et la demande WO 2007/13514 préconise l'utilisation d'un dérivé de chitosane soluble pour surmonter le problème technique de la formation de particules solides dans les billes d'hydrogel.
La présente invention a encore pour but de fournir des billes d'hydrogel dont le procédé de fabrication soit industrialisable, de préférence en limitant les coûts de fabrication et en assurant une bonne reproductibilité des microbilles ainsi fabriquées.
Avantageusement, l'invention a pour but de fournir des microbilles présentant de bonnes propriétés, par exemple de bonnes propriétés mécaniques pour les applications envisagées, et plus spécifiquement pour des injections intra-articulaires, par exemple de bonnes propriétés élastiques et d'absorption des chocs, une bonne résistance à l'écrasement, et une bonne adhésion sur les tissus.
À cet égard, les billes d'hydrogel selon le procédé antérieur décrit dans le brevet EP 2538987 B1 ont un diamètre élevé. L'article d'Oprenyeszk et al. 2013, montre que de telles particules présentent un diamètre de 600 à 900 micromètres (μηι). Les billes d'hydrogel ne sont donc pas convenables pour des injections intra-articulaires qui nécessitent des aiguilles fines de faible diamètre, notamment dans le cadre de maladies articulaires traitée par viscosupplémentation intra-articlaire et de maladies articulaires chroniques. De telles maladies sont typiquement les pathologies du cartilage, qui entraînent des lésions et des défauts du cartilage et une douleur articulaire, comme l'arthrose, par exemple due soit au vieillissement soit à un accident. Pour assurer la facilité d'injection par le praticien, augmenter le confort du patient, limiter les risques d'injection mal placée et éviter les risques d'infection, en particulier lors d'injections répétées, il convient d'utiliser des aiguilles fines.
La présente invention a donc encore pour but de fournir une composition injectable par voie intra-articulaire qui facilite des injections répétées, notamment au travers d'aiguilles fines tel que par exemple des aiguilles de type 18 à 22 Gauge comme recommandé pour la plupart des produits de viscosupplémentation actuellement commercialisé, en particulier au-dessus de 21 Gauge, ou éventuellement encore plus fines, par exemple de 23 Gauge. Il est donc désiré de mettre au point des microbilles dont les propriétés et la distribution de diamètre peuvent être ajustés pour pouvoir être facilement injectées au travers d'aiguilles fines, en particulier des microbilles dont le diamètre moyen en nombre est inférieur à 900μηι, de préférence inférieur à δθθμηι, de préférence inférieur à 700μηι, et encore de préférence dont le D(0.9) est inférieur à 900μηι, de préférence inférieur à δθθμηι, de préférence inférieur à 700μηι.
Il a été découvert que les problèmes techniques évoqués ci-dessus peuvent être résolus par la présente invention. En particulier, l'invention met en œuvre un procédé de fabrication spécifique des microbilles d'hydrogel à base de chitosane, lequel ne comprend pas la formation de trabécules solides dans les microbilles, évitant ainsi les inconvénients mentionnés dans l'art antérieur, de manière surprenante. Il est apparent à la lecture de l'art antérieur discuté ci-dessus que la solution apportée par la présente invention n'était pas évidente pour l'homme du métier.
L'invention concerne plus spécifiquement une particule ou une bille d'hydrogel, et plus particulièrement une microbille d'hydrogel.
Ainsi, la présente invention concerne une microbille d'hydrogel comprenant au moins de l'eau, du chitosane et de l'alginate, l'eau étant présente à une concentration d'au moins 90% en masse, le chitosane étant présent une concentration de 0,3 à 10 % en masse et l'alginate étant présent à une concentration de 0,5 à 10% en masse, les pourcentages en masse étant exprimés par rapport à la masse de la microbille d'hydrogel, ladite bille présentant un diamètre moyen en nombre allant de 100 à 900 μηι, ladite bille ne présentant pas de trabécules solides.
Les pourcentages en masse exprimés par rapport à la masse de la microbille d'hydrogel sont exprimés par rapport aux constituants de l'hydrogel. Les pourcentages en masse exprimés par rapport à la masse de la microbille d'hydrogel s'entendent de préférence de la microbille d'hydrogel sans agent actif, par exemple des cellules, des polypeptides, des protéines, des polynucléosides ou polynucléotides, qui ont une vertu thérapeutique et qui ne sont pas directement nécessaires à la préparation de l'hydrogel.
On entend en particulier par « billes » une particule de forme sensiblement sphérique. Une telle forme peut être appréciée par microscope. Une telle bille peut présenter des imperfections inhérentes au procédé de fabrication. On entend par « microbille » une bille présentant une taille inférieure à 1000 micromètres.
Les billes selon l'invention présentent avantageusement un diamètre moyen en nombre compris entre 200 et 800 micromètres, et avantageusement compris entre 300 et 700 micromètres.
Selon une variante, les billes selon l'invention présentent un diamètre moyen en nombre de préférence compris entre 100 et 500 micromètres, et de préférence entre 200 et 500 micromètres. La mesure du diamètre moyen en nombre des billes selon l'invention est réalisée de préférence par microscopie optique, selon la méthode suivante :
Le diamètre moyen en nombre, l'écart-type et le coefficient de variation d'une population de microbilles sont mesurées à l'aide d'un microscope optique inversé, par exemple de la marque OLYMPUS, modèle CKX41 et muni d'une caméra et d'un objectif 20X. Une fraction de la population de microbilles est placée dans une cupule d'observation elle-même placée sous l'objectif. Une photo numérique est prise après ajustement de l'image. Le programme « LABSENSE » de la marque OLYMPUS et accompagnant le microscope permet un traçage de lignes droites calibrées selon l'objectif utilisé. Un minimum de 20 billes est sélectionné sur l'image et une diagonale est tracée par le programme sur chacune d'elle. Le programme permet une visualisation directe de la mesure. Ces mesures sont reportées sur un tableur, par exemple EXCEL de la marque MICROSOFT et les variables suivantes sont calculées.
La moyenne est calculée à l'aide de la formule : n 1-1 1 L'écart-type est calculé à l'aide de la formule :
Figure imgf000007_0001
Le coefficient de variation Cv est calculé à l'aide de la formule (écart-type divisé
C _ i **
v ~~~ ™—
par la moyenne) : x
« n » représente le nombre de billes de l'échantillons dont le diamètre est mesuré, « X, » représente le diamètre mesuré pour une bille, « i » étant un nombre entier allant de 1 à n.
La distribution du diamètre des microbilles peut également être mesurée par une méthode de diffraction laser, par exemple à l'aide d'un équipement Mastersizer de Malvern, par exemple un Mastersizer 2000, en utilisant un protocole de mesure de préférence suivant la norme IS013320:2009 ou suivant la monographie de la Pharmacopée Européenne EP2.9.31 , mettant en œuvre la théorie de Mi.
Avantageusement, la distribution des billes est étroite, c'est-à-dire avec une faible dispersion du diamètre des billes par rapport au diamètre moyen, c'est à dire par exemple un indice de dispersité de moins de 2 mesuré par diffraction laser, par exemple comme précité.
Avantageusement, les microbilles présentent un D(0, 1 ) compris entre 100 et 600 micromètres, et avantageusement compris entre 200 et 400 micromètres.
Selon une variante, les microbilles présentent un D(0,5) compris selon une variante entre 100 et 800 micromètres, et de préférence entre 300 et 700 micromètres.
De préférence, les microbilles présentent un D(0,5) compris selon une variante entre 300 et 600 micromètres.
Avantageusement, les microbilles présentent un D(0,9) compris entre 100 et 1000 micromètres, et avantageusement compris entre 300 et 950 micromètres.
Selon une variante spécifique, les microbilles présentent un D(0,9) compris entre 100 et 950 micromètres, et avantageusement compris entre 300 et 900 micromètres, en encore avantageusement entre 300 et 800 micromètres.
Selon une variante spécifique, les microbilles présentent un D(0,9) compris entre 200 et 700 micromètres, et avantageusement compris entre 300 et 650 micromètres.
L'invention concerne notamment des billes d'hydrogels stérilisées ou non dont le diamètre D(0.9) est :
inférieur à 700μηι (pouvant être injectées via une aiguille de 19 Gauge), inférieur à 650μηι (pouvant être injectées via une aiguille de 20 Gauge), inférieur à 500μηι (pouvant être injectées via une aiguille de 21 Gauge). Le D(0,1 ), D(0,5) et le D(0,9) sont mesurés par diffraction laser comme précité. Avantageusement, les microbilles d'hydrogel comprennent au moins 95% d'eau en masse. Selon une variante spécifique, les microbilles hydrogel comprennent au moins 97% en masse d'eau.
Selon une variante, le chitosane est présent dans l'hydrogel à une concentration comprise entre 0,3 et 5 %, et de préférence de 0,5 et 3 % en masse de chitosane.
Selon une variante spécifique, la microbille comprend entre 0,5 et 0.7 % en masse de chitosane.
Le chitosane est référencé sous le N°CAS 9012-76-4. Le chitosane de l'invention est un polysaccharide de préférence préparé à partir d'une source fongique. Il est de préférence extrait et purifié à partir de sources fongiques alimentaires ou biotechnologique sûres et abondantes tels que Agaricus bisporus ou Aspergillus niger. Le chitosane est obtenu par hydrolyse d'un extrait riche en chitine. La chitine est un polysaccharide composé de plusieurs unités N-acétyl-D-glucosamine reliées entre elles par une liaison de type β (1 ,4). Le chitosane est constitué des unités D-glucosamine (unités désacétylées) et d'unités N-acétyl-D-glucosamine (unités acétylées) reliées entre elles par des liaisons de type β (1 ,4) et constitue un polymère du type poly(N-acétyl-D- glucosamine)-poly(D-glucosamine).
Le chitosane de l'invention est donc avantageusement d'origine fongique, et de préférence issus du mycélium d'un champignon du type Ascomycète, et en particulier d'Aspergillus niger, et/ou d'un champignon Basidiomycète, et en particulier Lentinula edodes (shiitake) et/ou Agaricus bisporus. De préférence le champignon est Agaricus bisporus. Toute origine et méthode de préparation de chitosane peuvent être utilisées. Une méthode de préparation du chitosane est celle décrite dans les brevets issus de la demande WO03068824 (EP1483299 ; US 7,556,946).
Le chitosane est avantageusement un chitosane non modifié chimiquement par une réaction de couplage par liaison covalente avec une ou plusieurs autres espèces chimiques.
Le chitosane est avantageux pour sa capacité à former des particules de structure tridimensionnelle de type hydrogel mécaniquement résistante, sa biocompatibilité et sa biodégradabilité après administration ou implantation. De plus, la présence de chitosane dans de telles particules d'hydrogel est désirée pour ses propriétés intrinsèques, physicochimiques et/ou biologiques, par exemple pour sa capacité à adhérer aux surfaces biologiques ou sa capacité à stimuler la cicatrisation de tissus.
Avantageusement, la masse moléculaire moyenne du chitosane est inférieure ou égale à 80,000. Selon une variante, la masse moléculaire du chitosane est comprise entre 15,000 et 70,000, et de préférence entre 35,000 et 60,000. De préférence ici, la masse moléculaire moyenne est la masse moléculaire moyenne en viscosité (Mv), calculée à partir de la viscosité intrinsèque selon l'équation de Mark-Houwink. La viscosité intrinsèque est mesurée par viscosimètrie capillaire, avec un viscosimètre capillaire de type Ubbelohde, selon la méthode de la monographie de la Pharmacopée Européenne EP2.2.9. On mesure le temps d'écoulement de la solution à travers un tube capillaire adapté (Lauda, par exemple le tube capilaire Ubbelohde 510 01 de diamètre 0.53mm) à l'aide d'un viscosimètre automatique Lauda Vise, d'abord à la concentration initiale en chitosane, puis pour plusieurs dilutions, par exemple selon les recommandations de la méthode EP2.2.9. On en déduit la viscosité intrinsèque réduite pour chacune des concentrations. On porte la viscosité réduite en fonction de la température, et on extrapole la valeur à la concentration 0 pour en déduire la viscosité intrinsèque. Il faut par exemple porter la viscosité réduite (η^ en ml/g) des i dilutions en fonction de la concentration C des i dilutions (g/ml) selon la formule 5.
Formule 2. hréd] = ( - 10) - (1 - C).
Pour calculer la masse viscosimétrique moyenne, on applique l'équation de Mark- Houwink avec les constantes k et alpha recommandées par Rinaudo et al. (Int. J. Biol. Macromol, 1993, 15, 281 -285), selon le DA du chitosane, selon l'une des trois formules suivantes.
Formule 3. Mv = ([η]/0,082)(1/076), pour un DA de 2% ;
Formule 4. Mv = ([η]/0,076)<1/0'76), pour un DA de 10% (par exemple 1 1 .5%) ;
Formule 5. Mv = ([η]/0,074)(1/076), pour un DA de 20% (par exemple 21 %).
Pour les valeurs de DA intermédiaires, on réalise une interpolation linéraire pour calculer la masse viscosimétrique moyenne (Mv).
À titre d'exemple, le chitosane peut présenter un degré d'acétylation compris entre 10 et 40 %, et de préférence entre 10 et 25 %.
Le degré d'acétylation est déterminé par potentiométrie. Le chitosane est dissout dans une solution d'acide chlorhydrique. L'excès d'acide chlorhydrique n'ayant pas réagi avec les fonctions aminés du chitosane est dosé par une solution titrée d'hydroxyde de sodium. On en déduit ainsi le nombre de mole d'unité D-glucosamine présentes dans le chitosane et donc par soustraction le degré d'acétylation.
Avantageusement, le chitosane de la présente invention peut présenter une viscosité dynamique comprise entre 5 et 50mPa.s en solution à 1 % (m/v) dans l'acide acétique à 1 % (v/v).
La viscosité dynamique de la solution de chitosane à 1 % est de préférence comprise entre 5 et 25mPa.s. La viscosité est mesurée typiquement sur dispositif Brookfield DV2T à une vitesse de 50 à 100 tr/min (par exemple 100tr/min) avec une aiguille « Spindle S18 » à 25°C. La solution de chitosane se comporte comme un fluide newtonien : la viscosité est indépendante de la vitesse de rotation. La valeur de viscosité est donc la même quelle que soit la vitesse de rotation choisie. La vitesse sélectionnée est compatible avec la torsion maximale du ressort du dispositif de mesure.
Les alginates, sels de l'acide alginique, sont des polysaccharides aux applications multiples, couramment utilisés notamment dans les domaines pharmaceutique, cosmétique et alimentaire. Leur capacité à former des gels est une de leurs propriétés les plus exploitées. Les alginates de métaux alcalins (sodium, potassium, magnésium...) sont solubles dans l'eau tandis que les alginates d'ions divalents ou trivalents comme le calcium, l'aluminium ou le fer y sont pratiquement insolubles. Ainsi, par exemple la mise en présence d'un alginate de sodium avec un agent de gélification, comme par exemple un sel de calcium, en solution aqueuse permet la gélification de l'alginate, par exemple sous forme d'alginate de calcium.
L'alginate est un polymère formé de deux monomères liés ensemble : le mannuronate ou acide mannuronique dont certains sont acétylés et le guluronate ou acide guluronique. Un alginate préféré est un de grade pharmaceutique ou médical, en particulier un alginate de sodium adapté à son injection ou son implantation dans le corps humain ou animal. Il s'agit en particulier d'un alginate de faible masse moléculaire, par exemple caractérisée par sa viscosité en solution à 1 %.
Avantageusement, l'alginate est présent dans l'hydrogel à une concentration comprise entre 1 à 10%, et de préférence de 1 à 5 %, en masse.
Selon une variante spécifique, la microbille comprend de 1 et 1 ,4% en masse d'alginate.
Plus particulièrement, la microbille comprend de 0,5 à 0,7% en masse de chitosane et moins de 1 ,3% en masse d'alginate. Selon une variante, la microbille comprend moins de 1 ,2% en masse d'alginate.
L'alginate peut présenter avantageusement une viscosité dynamique en solution à
1 % comprise entre 20 et 300m Pa.s, et de préférence entre 20 et 180mPa.s, et par exemple de 70 à 150 mPa.s. La mesure de cette viscosité est effectuée selon la même méthode et appareillage que pour les solutions de chitosane, avec une vitesse de rotation allant de 5 à 20 tr/min (par exemple 10tr/min). La solution d'alginate se comporte aussi comme un fluide newtonien.
Un exemple spécifique de composition de la microbille comprend 0,5% de chitosane et 1 ,0% d'alginate en masse par rapport à la masse de la composition totale de la microbille. Outre le chitosane et l'alginate, la microbille de la présente invention peut comprendre différents excipients et/ou différents principes actifs.
Parmi les excipients, on peut citer les agents favorisant la gélification de la bille, les agents de modification de la viscosité, les agents de modification de la rhéologie, La composition des microbilles est avantageusement non-thermogélifiable. En effet, pour assurer une bonne stabilité des billes avant et après injection, typiquement par voie intra-articulaire, la gélation ou la transition sol-gel ne doit pas intervenir après ou au moment de l'injection. Avantageusement, les microbilles de l'invention sont sous forme d'hydrogel avant leur application, en particulier par injection dans le corps d'un sujet en ayant besoin, notamment au niveau intra-articulaire. En particulier, les microbilles ne sont pas sensibles aux variations de température entre 8 et 40°C, c'est-à-dire qu'elles ne subissent pas de transition sol-gel ou ne sont pas dégradées dans cette gamme de température.
À cet égard, les microbilles peuvent être suspendues dans une solution visqueuse ou un hydrogel, qui lui, avantageusement, peut-être thermogélifiable. Il s'agit typiquement d'hydrogel d'un ou plusieurs polysaccharides gélifiables. La présente invention concerne encore une solution visqueuse ou un hydrogel, thermogélifiable ou non, comprenant une pluralité de microbilles de l'invention.
La composition de la microbille selon l'invention peut également comprendre des composés d'intérêt, tout particulièrement au niveau pharmaceutique (principe actif pharmaceutique) et encore plus spécifiquement pour une action intra-articulaire, plus particulièrement sur le cartilage. Il s'agit encore plus spécifiquement d'agents bénéfiques dans des compositions à usage intra-articulaire, par exemple pour diminuer la douleur ou diminuer l'inflammation.
Parmi de tels agents, on peut citer les médicaments anti-inflammatoires, plus particulièrement les médicaments non-stéroïdiens, les agents anesthésiques, les agents analgésiques, en particulier du type opioïdes, les corticostéroïdes, les anti-néoplastiques, les anticorps monoclonaux, les vitamines, les minéraux, les agents de contrastes, etc.
On peut notamment citer parmi les médicaments non-stéroïdiens (NSAIDS) par exemple : Diclofenac™, Ibuprofen™, Piroxicam™; les anesthésiques, par exemple : Lidocaine™ , Bupivacaine™; les analgésiques opioïdes par exemple : codéine, morphine; corticostéroïdes, par exemple : dexamethasone, prednisone; les agents anti- néoplastiques, par exemple : Methotrexate™; les agents antiviraux, par exemple : Acyclovir™ , Vidarabine™; les anticorps monoclonaux, par exemple : Humira™ Infliximab™. Les microbilles de l'invention, en particulier utilisables comme suppléments injectables par voie intra-articulaire peuvent aussi contenir des composés comme des cellules, des protéines, de polynucléotides (ARN, ADN), des minéraux comme par exemple : sélénium, strontium, des vitamines comme par exemple : tocophérol, ou d'autres agents actifs comme par exemple le curcumin.
Parmi les cellules, il est particulièrement intéressant d'utiliser des chondrocytes, des cellules souches, ou des cellules ayant la capacité de produire des substances actives.
Les microbilles d'hydrogel selon la présente invention présentent une structure d'hydrogel homogène. Les microbilles d'hydrogel selon la présente invention ne présentent pas de trabécules, ni de particules solides inhérentes à la préparation de l'hydrogel. Il n'est pas exclu que des agents actifs soient sous forme solide ou colloïdale, par exemple sous forme nanoparticulaire.
Avantageusement, les microbilles de l'invention sont cohésives. La cohésion des billes n'est pas perdue lors de la friction entre les mains.
De plus le les billes présentent avantageusement une bonne résistance à la compression, en particulier lors de la manipulation entre les doigts. Une telle résistance peut être par exemple évaluée par la mesure de résistance à la compression de sur un banc d'essai (par exemple Instron Bluehill). On peut aussi utiliser une technique de nanoindentation (par exemple avec la gamme d'équipements de marque PI Séries Picoindenter commercialisé par la société Hysitron ou le Mach 1 commercialisé par la société Biomomentum) ou encore une technique de tribologie adaptée (par exemple avec la gamme d'équipements de marque Tl Séries Triboindenteur commercialisé par Hysitron).
Encore avantageusement, les billes sont déformables et peuvent être injectées par une aiguille dans le diamètre intérieur est plus faible que le diamètre maximum des billes. Ceci présente un grand avantage pour l'injection dans un tissu car à diamètre intérieur égal, on peut utiliser une aiguille de diamètre extérieur plus faible, formant ainsi un trou de diamètre moins important.
Les microbilles peuvent être fabriquées avantageusement selon le procédé de l'invention.
Le procédé de l'invention comprend :
(i) le mélange d'une solution aqueuse comprenant un chitosane à pH inférieur à 7 auquel le chitosane est soluble, et d'une solution aqueuse comprenant un alginate à pH supérieur à 7 auquel l'alginate est soluble, ledit mélange comprenant au moins un mélange par cisaillement, ledit mélange étant dénommé « prémix », et (ii) la gélification du prémix sous forme de microbilles par précipitation de gouttes de prémix dans une solution comprenant au moins un agent de gélification du prémix.
Le pH est déterminé en suivant la méthode décrite dans la pharmacopée européenne (EP 2.2.3). Le pH-mètre utilisé est un pH-mètre de la gamme Sartorius muni d'une électrode combiné en verre (PY-P1 1 ). Les mesures de pH sont réalisées entre 20 et 25 °C.
Le chitosane est de préférence dissout dans une solution aqueuse à pH inférieur à 7. Une telle solution comprend typiquement un acide, de préférence faible, comme par exemple un acide organique. On peut avantageusement utiliser l'acide acétique. La solution comprend typiquement 0,5 à 3% d'acide acétique exprimé en volume par rapport au volume total de la solution de chitosane
Le pH de la solution de chitosane est typiquement compris entre 2 et 6,5, et de de préférence compris entre 3,5 et 6,0.
La viscosité dynamique de la solution de chitosane est de préférence comprise entre 5 et 50mPa.s, et encore de préférence entre 10 et 30mPa.s. La viscosité dynamique est mesurée typiquement à l'aide d'un dispositif Brookfield DV2T à 20 tr/min avec une aiguille « Spindle S18 ».
Avantageusement, l'osmolarité de la solution de chitosane va de 100 à 300mOsm/kg.
La détermination de l'osmolarité des solutions est effectuée avec un micro- osmomètre automatique (Osmometer Type 15M de la marque Loser Messtechnik). L'équipement est préalablement calibré avec une solution de 300mosm/kg. L'échantillon est placé dans un récipient prévu à cet effet, et est mis à la température standard de la mesure.
La solution d'alginate de sodium présente un pH supérieur à 10, et de préférence compris entre 12 et 14, et encore de préférence d'environ 13. On peut utiliser une base pour ajuster le pH. Parmi les bases, on peut citer l'hydroxyde de sodium, le carbonate de sodium, l'hydroxyde de potassium, etc.
La solution d'alginate présente avantageusement une viscosité dynamique comprise entre 50 et 300mPa.s, et de préférence comprise entre 50 et 150mPa.s. Une telle viscosité dynamique peut être mesurée sur un dispositif à mobille tournant, par exemple le dispositif Brookfield DV2T à 5 tr/min avec une aiguille « Spindle S18 ».
Avantageusement, la solution d'alginate de sodium ne comprend pas d'agent tampon.
La solution de chitosane et d'alginate sont mélangées dans une proportion volumique par exemple allant de 1 :10 à 10:1 , de préférence 1/5 à 5/1 , et typiquement allant de 1 :3 à 1 :1 (v/v). Avantageusement, la proportion volumique de la solution d'alginate est supérieure à celle de la solution de chitosane.
Pour l'homogénéisation des solutions de chitosane et d'alginate pour la préparation du prémix, on peut utiliser par exemple un dispositif du type comprenant un rotor et un stator assurant un mouvement axial et un mouvement radial de la solution pour son homogénéisation. De tels dispositifs sont notamment commercialisés sous la référence commerciale Ultra-Turrax®. Avantageusement, la rotation est réalisée dans un premier temps à faible vitesse puis à vitesse élevée.
Une vitesse lente est typiquement de quelques tours par minute (1 à 10tr/m). Avantageusement, une vitesse lente est mise en œuvre lorsque l'on ajoute les solutions de chitosane et d'alginate l'une à l'autre.
Une vitesse élevée est typiquement de plusieurs milliers de tours par minute, de préférence supérieure à 3000 tr/min, et encore de préférence supérieure à 10000 tr/m. La vitesse élevée reste en générale inférieure à 20000 tr/min. Avantageusement, une vitesse élevée est mise en œuvre lorsque l'ajout d'un solution à l'autre est terminé. En général, l'agitation à vitesse élevée est arrêtée lorsque la solution est homogène.
Un procédé particulièrement préféré comprend le mélange entre la solution de chitosane et d'alginate avec une agitation, de préférence par cisaillement, avec une rotation faible. Après ajout complet de la solution de chitosane, le mélange est agité par cisaillement à une vitesse élevée. La solution homogène obtenue ne présente pas de trabécules ni de fibres solides.
Avantageusement, le pH du prémix est supérieur à 10, voire supérieur à 1 1 , et de préférence compris entre 12 et 13. En-dessous du pH avantageux précité, il se produit une précipitation induisant la formation de particules solides indésirables.
Avantageusement, on n'utilise pas de solution tampon pour réaliser le prémix.
Le prémix est également un objet de l'invention. Plus précisément, l'invention concerne encore une solution comprenant de l'eau, du chitosane et de l'alginate, dénommée « prémix », présentant un pH supérieur à 12 et apte à former des microbilles selon l'invention. Avantageusement, le prémix présente une viscosité dynamique comprise entre 100 et 500 mPa.s.
La viscosité dynamique du prémix est de préférence comprise entre 100 et 500mPa.s, et encore de préférence comprise entre 180 et 300 mPa.s.
La viscosité apparente dynamique du prémix est mesurée à l'aide d'un viscosimètre à mobile tournant, par exemple un viscosimètre à mobile tournant de la marque Brookfield, par exemple muni d'une aiguille (« spindle ») de type S18 à une vitesse de 5 tr/min et à une température de 25°C. L'osmolarité du prémix est avantageusement comprise entre 100 et 300 mOsm/kg, et typiquement comprise entre 100 et 200mOsm/kg.
La gélification des microbilles intervient dans des conditions aptes à la gélification du prémix.
Plus précisément, on utilise un ou plusieurs agents de gélification aptes à la formation d'un hydrogel de chitosane et d'alginate à partir du prémix.
Selon une variante, la gélification de la solution intervient par la mise en présence du prémix avec au moins un agent de gélification de l'alginate. L'alginate présent dans le prémix est de préférence sous une forme apte à gélifier. Par exemple on peut utiliser un alginate de sodium. Comme agents de gélification, on peut citer à titre d'exemple les ions calcium et strontium, qui conviennent spécifiquement pour la gélification d'un alginate de sodium. Un agent de gélification est donc de préférence choisi parmi le chlorure de calcium, le chlorure de strontium, et leurs mélanges. On préfère utiliser dans le cadre de l'invention le chlorure de calcium.
La gélification est réalisée en mettant le prémix en contact goutte-à-goutte avec une solution comprenant un agent de gélification.
La concentration d'agent de gélification est déterminée par l'homme du métier. On peut utiliser typiquement une concentration de 50 à 200 mM de chlorure de calcium.
Le dispositif pour la formation des gouttes et leur gélification peut être du type « prilling », c'est-à-dire un procédé de grelonage. On utilise de préférence un dispositif comprenant une buse de production de gouttes présentant un diamètre interne supérieur ou égal à 100 μηι. on peut par exemple utiliser un diamètre de 100 ou 150μηι.
Pour la formation des microbilles, on peut utiliser un procédé discontinu, par exemple en faisant passer la solution à travers une aiguille à l'aide d'une pompe péristaltique. On peut aussi utiliser un procédé continu, industriellement approprié. A titre d'exemple de procédé continu on peut citer par exemple un procédé électromagnétique à jet laminaire appelé aussi prilling, comme avec l'équipement en continu VAR-D commercialisé par Nisco) ou d'autres procédaient comme par exemple un procédé de formation de gouttes électrostatique, ou à flux d'air coaxial, ou à flux d'air dynamique, ou par gravité, ou par nébulisation (ou « spray drying »), ou encore par extrusion en continu avec le jet sortant coupé à l'aide d'un outil rotatif (appelé Jetcutter, comme avec l'équipement Genialab). Lorsque les gouttes de prémix tombent dans la solution comprenant l'agent de gélification, une agitation peut être réalisée, par exemple à l'aide d'un barreau magnétique, par exemple une vitesse comprise entre 50 et 500tr/min.
Avantageusement, le procédé comprend le lavage des microbilles, de préférence avec une solution aqueuse, et encore de préférence de l'eau. Le procédé de l'invention comprend par exemple la récupération des microbilles par gravité. Lorsque l'agitation est arrêtée, les billes sédimentent au fond du récipient contenant la solution, typiquement le récipient du bain de lavage. On peut retirer par exemple la solution par un dispositif d'aspiration, comme à travers une aiguille dont les caractéristiques (typiquement le diamètre) ne permettent pas le passage des microbilles. Après retrait de la solution, il ne reste que les microbilles dans le récipient, qui peuvent être manipulées pour des opérations ultérieures.
La présente invention concerne également des microbilles stériles. Avantageusement les microbilles sont stérilisées à la chaleur humide, typiquement en utilisant un autoclave. Typiquement, les conditions d'autoclave sont une température d'environ 121 °C, pendant une durée d'au moins 15 minutes.
Ainsi, la présente invention concerne encore une méthode de stérilisation des microbilles décrites dans l'invention.
La présente invention concerne une composition pharmaceutique ou un dispositif médical comprenant une pluralité des microbilles selon l'invention ou obtenues selon le procédé de l'invention.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique injectable comprenant les microbilles de l'invention.
La présente invention concerne une composition pharmaceutique ou un dispositif médical consistant en un fluide synovial artificiel.
Selon une variante, la composition pharmaceutique ou le dispositif médical est utile dans le traitement d'une pathologie d'une articulation.
Selon une variante, la composition pharmaceutique ou le dispositif médical est utile dans le traitement de la douleur ou l'inconfort associé à une pathologie affectant une articulation ou pour ralentir la progression d'une pathologie d'une articulation.
La présente invention concerne encore un dispositif médical, éventuellement sous forme d'un ou plusieurs kits d'emballages, éventuellement séparés physiquement, comprenant une seringue, une aiguille et une composition pharmaceutique ou dispositif médical selon l'invention, ladite seringue comprenant un réservoir éventuellement pré- rempli de la composition pharmaceutique ou dispositif médical précité.
La présente invention concerne un tel dispositif médical pour son utilisation dans le traitement d'une pathologie articulaire comprenant l'injection d'une composition pharmaceutique ou dispositif médical selon l'invention par voie intra-articulaire.
La présente invention concerne également des microbilles d'hydrogel selon l'invention, ou obtenues selon l'invention pour son utilisation dans le traitement d'une pathologie, par injection dans le corps humain ou animal, éventuellement présence d'une solution ou hydrogel injectable.
Par exemple, l'aiguille utilisée est une aiguille choisie parmi les aiguilles de 18 à 22 gauge, de préférence encore de 22 gauge et plus. Par exemple, l'aiguille utilisée présente des parois normales, fines ou extra-fines.
La présente invention concerne encore une méthode de supplément du fluide synovial, en particulier lors d'une pathologie affectant une articulation, comme par exemple l'arthrose (ostéoarthrite ou osteoarthritis) ou des lésions du cartilage, etc.
La présente invention concerne encore une méthode de lutte contre la douleur ou l'inconfort associé à une pathologie affectant une articulation.
La présente invention concerne encore une méthode de lutte contre une inflammation d'une articulation.
Plus spécifiquement, de telles pathologies sont par exemple : l'ostéoarthrite (osteoarthritis) (primaire (idiopathique) ou secondaire), l'arthrite rhumatoïde (rheumatoid arthritis), blessure d'une articulation (par exemple traumatique ou une blessure iée à la mobilité articulaire répétée), une pathologie du cartilage (par exemple, chondrocalcinose ou chondromalacie), arthrite septique.
La présente invention concerne encore une méthode de réduction ou de lutte contre la douleur associée avec une maladie, par exemple comme celles précitées, ou encore en ralentir la progression.
La présente invention concerne encore une méthode pour améliorer la réparation osseuse, en particulier du cartilage.
De telles méthodes comprennent typiquement l'injection intra-articulaire d'une composition comprenant des microbilles selon l'invention. Selon une variante, la méthode selon l'invention comprend une pluralité d'injections. Selon une variante, on peut réaliser une injection une ou deux fois par mois pendant plusieurs mois. Selon une autre variante, on réalise deux injections espacées d'un temps variable. Selon une autre variante, on réalise une seule injection.
Les méthodes de l'invention sont utiles à un sujet en ayant besoin, tel que par exemple un sujet nécessitant le traitement d'une pathologie articulaire.
Le ou les sites d'injection sont typiquement choisis parmi : un genou, une épaule, une hanche, une articulation temporo- mandibulaire, une articulation carpo- métacarpienne, un coude, une cheville, un poignet, une articulation de la main, un disque intervertébral, ou une autre articulation. Selon une variante, l'injection est réalisée dans une cavité articulaire, au contact du cartilage. Plus généralement les microbilles de l'invention sont utilisées en ingénierie tissulaire ou comme vecteurs de composés actifs, en particulier comme vecteurs de composés pharmaceutiquement actifs.
Les expressions du type « comprend de... à ... » « compris entre... et... » « allant de... à... » ou leurs équivalents incluent les bornes cités, sauf indication contraire. Selon une variante, les bornes de l'intervalle sont exclues.
On couvre par «selon l'invention » ou des termes équivalents, une composition, méthode ou procédé défini tel que dans la présente invention, y compris selon l'une quelconques des variantes, modes de réalisation particuliers ou spécifiques, indépendamment ou selon l'une quelconque de leurs combinaisons, y compris selon les caractéristiques préférées.
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à l'homme de l'art suite à la lecture de la description explicative qui fait référence à des exemples qui sont donnés seulement à titre d'illustration et qui ne sauraient en aucune façon limiter la portée de l'invention.
Les exemples font partie intégrante de la présente invention et toute caractéristique apparaissant nouvelle par rapport à un état de la technique antérieure quelconque à partir de la description prise dans son ensemble, incluant les exemples, fait partie intégrante de l'invention dans sa fonction et dans sa généralité.
Ainsi, chaque exemple a une portée générale.
D'autre part, dans les exemples, tous les pourcentages sont donnés en masse, sauf indication contraire, et la température est exprimée en degré Celsius sauf indication contraire, et la pression est la pression atmosphérique, sauf indication contraire.
Exemples
Tableau 1 - Références pour les tailles des aiguilles en vue de l'injection des microbilles selon la norme ISO 9626 (1991 : Amd 1 :2001 )
Figure imgf000019_0001
1 - "The Gauge System for the médical use" in Anesthesia & Analgesia, 2002 ; les valeurs sont extraites de la norme IS09626:1991 /Amd 1 :2001 .
2- "Does needle size matter ?", in J Diab Sci Technol 1 , 725, 2007.
Le diamètre externe (OD) (min - max) dénote la tolérance selon la norme précitée. Sauf indication contraire, le diamètre des aiguilles mentionné est celui ID parois normales/regular.
Exemple 1 - Préparation d'un prémix de chitosane et d'alginate
Le chitosane ultrapur provient de Synolyne Pharma (Belgique). Il est d'origine fongique (champignons de Paris, Agaricus bisporus), et présente les caractéristiques suivantes : degré d'acétylation 14mol% et masse moléculaire viscosimétrique moyenne (Mv) 54000. On solubilise le chitosane à une concentration de 1 ,5% (m/m) dans une solution d'acide acétique à 1 % (v/v). La viscosité dynamique de la solution ainsi obtenue est comprise entre 15 et 25mPa.s (selon la méthode de mesure décrite dans la description). Le pH de la solution est d'environ 4.4. L'alginate de sodium ultrapur (Pronova UP LVM) provient de Novamatrix (Norvège). Il présente une viscosité dynamique en solution à 1 % (mesurée selon la description) de environ 1 10mPa.s.
L'alginate de sodium est solubilisé à la concentration de 1 ,5% (m/m) dans une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium à 0,5% (v/v). La viscosité dynamique de la solution ainsi obtenue est comprise entre 1 10 et 120 mPa.s (selon la méthode de mesure décrite dans la description). Le pH de la solution est d'environ 13. Il n'y a pas eu d'ajout d'agent tampon.
Les solutions de chitosane et d'alginate sont mélangées à raison de 66,7ml de solution de chitosane et 133,3ml de solution d'alginate, puis elles sont homogénéisées durant 3 minutes à vitesse élevée à l'aide d'un homogénéisateur IKAT18 (IKA, Allemagne). Le résultat est une solution qui ne présente pas de trabécule ou de fibres. Cette solution homogène forme le prémix. Le prémix présente les caractéristiques suivantes :
-pH : environ 12,2 ;
-Viscosité dynamique : environ 190mPa.s ;
-Osmolarité : environ 180mOsm/kg ;
Les concentrations finales de chitosane et d'alginate dans le prémix sont de 0,5% (m/m), et 1 ,0% (m/m), respectivement.
Les trabécules solides de chitosane peuvent être recherchées par microscopie optique après une coloration de l'échantillon à l'hématoxyline-éosine. L'éosine étant anionique a tendance à se fixer sur le chitosane, chargé positivement.
- Les billes sont colorées et observées entières (et libres) ou sous forme de coupes réalisées à l'aide d'un microtome ou encore d'un bistouri. Les coupes sont alors incluses dans la paraffine :
- Fixation des billes et inclusion en paraffine :
Les billes sont incubées durant 4 heures à 4°C dans une solution tampon cacodylate de Sodium 100 m M, CaCI2 20 m M, pH 7,4 et contenant 40g/L de paraformaldéhyde
Les billes sont lavées 3x à l'aide d'un tampon cacodylate de Sodium 100 mM ; BaCI2 50 mM, pH 7,4 afin de prévenir leur désintégration Les billes sont ensuite déshydratées par passages successifs dans des bains de concentration croissante en méthanol, d'isopropanol et de xylène Les billes sont ensuite incluses dans la paraffine et les blocs de paraffine découpés en lamelles de 5 μηι d'épaisseur à l'aide d'un microtome (Leica RM 2145). - Coloration à l'hématoxyline-éosine :
Afin d'être colorées, les sections de billes sont au préalable déparaffinées et réhydratées par des bains successifs de xylène, d'éthanol en concentration décroissantes et d'eau déminéralisée. Les billes entières sont colorées directement.
Les billes ou sections de billes sont incubées 15 minutes dans une solution d'hématoxyline de Mayer
Les billes ou sections de billes sont rincées 2x à l'eau, puis à l'aide d'une solution de NH4OH à 2,6%
Les billes ou sections de billes sont incubées dans une solution d'éosine Y 0,5% aqueuse et d'acide acétique 0,5%
Les billes ou sections de billes sont alors rincées à l'eau puis déshydratées à l'aide de bain de concentrations croissantes en éthanol puis de xylène
- Pour l'observation au microscope optique (Olympus CKX41 ) les coupes de billes sont alors montées sur lames et lamelles ou les billes entières sont placées dans une cupule avec de l'eau.
- L'observation de la trame interne de la ou les billes au microscope optique permet d'apprécier la présence ou l'absence de trabécules directement visibles et exacerbés par la coloration à l'éosine. Si la trame interne observée est homogène et sans filaments ressortant du contraste, la bille est qualifiée comme ne comportant pas de trabécules solides.
Exemple 2 - Préparation des microbilles à l'échelle 200ml à partir du prémix de chitosane et d'alginate
Les gouttes de prémix selon l'exemple 1 sont formées par un procédé électromagnétique de jet laminaire aussi appelé "prilling" avec un équipement "Encapsulator VAR-D (Gen. 2) (Nisco, Zurich, Suisse), connecté à une pompe péristaltique Watson Marlow (Willmington, MA, USA) modèle 520S; équipé d'une buse de diamètre approprié. Dans cet exemple, on utilise une buse de diamètre 100μηι, et un débit entre 1 et 3tr/min et une fréquence de 500 à 2500Hz. Les gouttes de prémix selon l'exemple 1 tombent dans une solution de chlorure de calcium de concentration 102mM (15g/l) et sont agitées entre 15min et une heure (plus particulièrement une heure) à l'aide d'un barreau magnétique, à une vitesse de 250tr/min.
Les billes sont ensuite lavées à l'eau pour injection (environ un litre à chaque lavage) 6 à 7x. Le bulk est agité environ une minute entre chaque lavage à 250tr/min, à l'aide d'un barreau magnétique.
Les billes sont récupérées par gravité. L'agitation est arrêtée et les billes sédimentent au fond du bain de lavage. Le liquide est enlevé. Lorsque le récipient de récupération est exempt d'eau, les billes sont pesées et la masse nette des billes est ajustée à une masse nette égale à celle du prémix avant production.
On obtient en fin de production un récipient contenant une masse connue de billes, ainsi qu'une masse connue d'eau pour injection. Les microbilles présentent un diamètre compris entre 100 et 700μηι par microscopie optique, et la distribution de diamètre suivante, mesurée par diffractométrie laser selon la méthode de la description: D(0.1 ) de 250μηι, D(0,5) de 430μηι et D(0.9) de 690μηι (mesurés).
Les billes sont stérilisées à la chaleur humide (autoclave - modèle SYSTEC DX- 23, Wettenberg, Allemagne), à 121 °C, pendant 15 minutes.
Les microbilles stérilisées présentent un diamètre mesuré par microscopie optique compris entre 100 et 700μηι (mesuré selon la méthode de la description). La distribution de diamètre des billes stérilisées est la suivante, mesurée par diffractométrie laser selon la méthode de la description :
Ο(0.1 ) = 210μΓΠ
D(0,5) = 345μπι
D(0,9) = 550μπι.
Exemple 3 - Reproductibilité de la préparation de microbilles
La préparation de trois lots de prémix est réalisée selon l'exemple 1 , au départ de 3 lots de chitosane (dont la viscosité dynamique en solution à 1 % est d'environ 15mPa.s), et un lot d'alginate. La viscosité dynamique de la solution de chitosane est d'environ 25mPa.s, et son osmolarité est d'environ 150mOsm/kg. Les trois lots de prémix ont les caractéristiques suivantes :
-Viscosité dynamique : entre 160 et 250mPa.s
-Osmolarité : environ 175mOsm/kg
-pH : environ 12.3 On réalise trois lots de microbilles préparées selon l'exemple 2, avec soit une buse de diamètre 150μηι, soit avec une buse de diamètre 100μηι, en utilisant 50ml de prémix. Au total, 6 lots de microbilles ont été produits.
Les microbilles avant stérilisation présentent la distribution de diamètre rapportées dans le Tableau 2 (selon les méthodes de la description).
Figure imgf000023_0001
On déduit de cet exemple que le procédé de production des billes est robuste, conduisant à des distributions de taille reproductibles. On conclut également que le diamètre de la buse permet de moduler la distribution de taille des microbilles d'hydrogel. On peut, par exemple, obtenir un diamètre D(0,9) de moins de 650μηι en utilisant une buse de diamètre 100μηι.
On vérifie que les microbilles sont facilement injectables au travers d'aiguilles de diamètre variable, par exemple une aiguille adaptée à l'injection intra-articulaire. Les billes récoltées après injection conservent sensiblement la même distribution de taille.
Exemple 4 - Préparation de microbilles à l'échelle 500ml à partir du prémix de chitosane et d'alginate
La préparation de prémix est réalisée selon l'exemple 1 , avec 1 lot de chitosane dont la viscosité dynamique en solution à 1 % est de 12mPa.s. La viscosité dynamique de la solution de chitosane est de 25mPa.s et son osmolarité est de 150mOsm/kg. Une fois le prémix chitosane-alginate réalisé, ses caractéristiques sont les suivantes :
-Viscosité dynamique : 210mPa.s
-Osmolarité : 175mOsm/kg
-pH : 12.3 Les microbilles sont préparées selon l'exemple 2 avec une buse de diamètre 150μηι, au départ de 500ml de prémix. Les microbilles avant stérilisation présentent un diamètre compris entre 100 et 700 μηι mesuré par microscopie optique, et la distribution de diamètre mesurée par diffractométrie laser suivante :
- D(0,1 ) = 373μΓΠ ;
- D(0,5) = 584μΓΠ ;
- D(0,9) = 892μΓΠ.
Les billes sont stérilisées selon la procédure de l'exemple 2, et après stérilisation présentent un diamètre compris entre 100 et 700 μηι mesuré par microscopie optique, et la distribution de diamètre mesurée par diffractométrie laser suivante :
- D(0,1 ) = 269μΓΠ ;
- D(0,5) = 401 μΓΠ ;
- D(0,9) = 595μπι. Les microbilles préparées selon les exemples 2, 3 et 4 présentent une composition homogène, sans trabécules ni des particules solides.
La résistance mécanique à la pression manuelle des microbilles préparées selon les exemples 2 à 4 est bonne, et les microbilles sont avantageusement déformables.
Les microbilles sont aptes à être injectées par une aiguille fine adaptée à une injection intra-articulaire.
Les microbilles conservent leur élasticité et leur distribution de taille après injection à travers une aiguille fine adapté à une injection intra-articulaire, et après stockage pendant 6 mois en milieu aqueux. Exemple 5 - Caractéristiques physico-chimiques des microbilles de l'invention
Des billes d'hydrogel à base de chitosane et d'alginate sont préparées selon les méthodes de l'invention (voir exemples 1 et 2) par un procédé de formation des billes électromagnétique à jet laminaire avec une buse de diamètre 100μηι (procédé 1 ). Les billes sont également préparées selon la méthode de l'art antérieur décrite selon l'exemple 1 du brevet EP 2538987 B1 (procédé 2). Les paramètres des procédés et la composition des billes obtenues sont résumés dans le Tableau 3, et les caractéristiques physico-chimiques des billes sont données dans le Tableau 4. Tableau 3- Paramètres des procédés de fabrication de billes d'hydrogel de l'invention (procédé 1 ) et selon le brevet EP 2538987 B1 (procédé 2)
Procédé de préparation Procédé 1 Procédé 2
Composition Chitosane-alginate Chitosane-alginate selon selon les EP 2538987 B1 (exemple exemples 1 et 2 1 )
Concentration en chitosane dans les 0,5% 0.6% billes finales (exprimé en % m/m dans
les billes finales)
Concentration en alginate (exprimé 1 ,0% 1 ,2% en % m/m dans les billes finales)
Procédé d'homogénéisation du Par cisaillement Par agitation vigoureuse prémix pendant 3 minutes pendant plusieurs minutes
Homogénéité du prémix Oui Non
(le chitosane forme des trabécules-filaments)
Viscosité dynamique du prémix 200-300mPa.s >500mPa.s
Technologie de production des Continue Discontinue gouttes (par jet à flux (avec une seringue laminaire)) équipée d'une aiguille
25Ga)
Plus petite taille possible pour la 100μηι (diamètre de environ 250μηι (diamètre formation des gouttelettes d'hydrogel la buse) interne de l'aiguille) (avant gélation)
Tableau 4- Caractéristiques physico-chimiques des billes d'hydrogel
Procédé de préparation des billes Procédé 1 Procédé 3
Composition Chitosane-alginate Chitosane-alginate selon selon l'exemple 1 brevet EP 2538987 B1
Diamètre moyen des billes après
gélation et avant stérilisation (mesuré 300 ± 50μηι 2600 ± 200μηι par microscopie selon la méthode de
la description)
Facilité d'injection intra-articulaire au Oui Non, les billes ont un travers d'une aiguille adaptée diamètre trop élevé
Résistance mécanique à la pression Bonne Faible manuelle* (les billes sont (les billes sont déformables) friables)
Stabilité - intégrité des billes** Bonne Faible Evaluation manuelle
***Evaluation manuelle
Par ailleurs, afin de déterminer les propriétés élastiques et d'absorption des microbilles d'hydrogel, on réalise des mesures de rhéologie en oscillation à l'aide d'un rhéomètre rotatif avec cisaillement de plateaux, (ARES G2, TA Instrument). Pour pouvoir réaliser les mesures, on ajoute les microbilles à une solution visqueuse d'un biopolymère, à 37°C. On met ainsi en évidence que le module élastique (G, appelé aussi module de stockage) de la solution visqueuse avec les microbilles est significativement supérieur au module G' de la solution du biopolymère sans les microbilles. Cette différence est indicative de l'élasticité des billes et de leur capacité à absorber les chocs en milieu physiologique. En parallèle, on mesure la viscosité de la solution visqueuse avec et sans les microbilles, à 37°C, à l'aide du rhéomètre sous rotation continue, à vitesse croissante, sur une plage de cisaillement déterminée. On observe ainsi que la viscosité n'est pas modifiée par l'ajout des billes.
Exemple 6- Stabilité des billes au stockage
Les microbilles d'hydrogel sont conservées à 4°C dans une solution aqueuse. Après une durée de stockage de 3 et 6 mois, leur aspect, leur diamètre moyen en nombre et leur distribution de taille, mesurées selon les méthodes de la description, sont inchangés. Les billes sont injectables sans difficulté à travers une aiguille fine, et conservent sensiblement leurs caractéristiques de taille après injection.

Claims

REVENDICATIONS
1 . - Microbille d'hydrogel comprenant au moins de l'eau, du chitosane et de l'alginate, l'eau étant présente à une concentration d'au moins 90% en masse, le chitosane étant présent une concentration de 0,3 à 10 % en masse et l'alginate étant présent à une concentration de 0,5 à 10% en masse, les pourcentages en masse étant exprimés par rapport à la masse de la microbille d'hydrogel, ladite bille présentant un diamètre moyen en nombre allant de 100 à 900 μηι, ladite bille ne présentant pas de trabécules solides.
2. - Microbille d'hydrogel, selon la revendication 1 , caractérisée en ce qu'elle présente un D(0,9) compris entre 100 et 950 micromètres. 3.- Microbille d'hydrogel, selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le chitosane est présent dans l'hydrogel à une concentration comprise entre 0,
3 et 5 %, et de préférence de 0,5 et 3 % en masse de chitosane.
4. - Microbille d'hydrogel, selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'alginate est présent dans l'hydrogel à une concentration comprise entre 1 à 10%, et de préférence de 1 à 5 %, en masse.
5. - Microbille d'hydrogel, selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle est stérile.
6. - Procédé pour la préparation de microbilles d'hydrogel selon la revendication 1 , ledit procédé comprenant (i) le mélange d'une solution aqueuse comprenant un chitosane à pH inférieur à 7 auquel le chitosane est soluble, et d'une solution aqueuse comprenant un alginate à pH supérieur à 7 auquel l'alginate est soluble, ledit mélange comprenant au moins un mélange par cisaillement, ledit mélange étant dénommé « prémix », et (ii) la gélification du prémix sous forme de microbilles par précipitation de gouttes de prémix dans une solution comprenant au moins un agent de gélification du prémix, lesdites microbilles comprenant au moins de l'eau, du chitosane et de l'alginate, l'eau étant présente à une concentration d'au moins 90% en masse, le chitosane étant présent une concentration de 0,3 à 10 % en masse et l'alginate étant présent à une concentration de 0,5 à 10% en masse, les pourcentages en masse étant exprimés par rapport à la masse de la microbille d'hydrogel, ladite bille présentant un diamètre moyen en nombre allant de 100 à 900 μηι, ladite microbille ne présentant pas de trabécules solides.
7. - Solution comprenant de l'eau, du chitosane et de l'alginate, dénommée « prémix », caractérisée en ce qu'elle présente un pH supérieur à 12 et apte à former des microbilles telles que définies telles que définies selon l'une quelconque des revendications 1 à 5.
8. - Solution selon la revendication 7, caractérisée en ce qu'elle présente une viscosité dynamique comprise entre 100 et 500 mPa.s.
9. - Composition pharmaceutique ou dispositif médical comprenant une pluralité des microbilles telles que définies selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, ou obtenues selon la revendication 6.
10. - Composition pharmaceutique ou dispositif médical selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il consiste en un fluide synovial artificiel.
1 1 . - Composition pharmaceutique ou dispositif médical selon la revendication 9 ou 10, pour son utilisation dans le traitement d'une pathologie d'une articulation.
12. - Composition pharmaceutique ou dispositif médical selon la revendication 9 ou 10, pour son utilisation dans le traitement de la douleur ou l'inconfort associé à une pathologie affectant une articulation ou pour ralentir la progression d'une pathologie d'une articulation.
13. - Dispositif médical, éventuellement sous forme d'un ou plusieurs kits d'emballages, éventuellement séparés physiquement, comprenant une seringue, une aiguille et une composition pharmaceutique ou dispositif médical selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, ladite seringue comprenant un réservoir éventuellement prérempli de la composition pharmaceutique ou dispositif médical précité.
14. - Dispositif médical selon la revendication 13 pour son utilisation dans le traitement d'une pathologie articulaire comprenant l'injection d'une composition pharmaceutique ou dispositif médical selon l'une quelconque des revendications 9 à 12 par voie intra-articulaire.
15.- Microbilles d'hydrogel telles que définies selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, ou obtenues selon la revendication 6 pour son utilisation dans le traitement d'une pathologie, par injection dans le corps humain ou animal, éventuellement présence d'une solution ou hydrogel injectable.
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