JP2023134610A - 椎間板治療用組成物 - Google Patents

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武尊 辻本
Takeru TSUJIMOTO
倫政 岩崎
Tomomasa Iwasaki
賢 清水
Masaru Shimizu
三津子 伊佐次
Mitsuko Isaji
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Abstract

【課題】椎間板の髄核の再生を促進することが可能な髄核補填用組成物を提供する。【解決手段】対象の髄核部位に適用し、適用後に一部分を硬化するように用いられ、髄核部位への適用時に流動性を有する、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含有する、椎間板の髄核補填用組成物とする。【選択図】なし

Description

本発明は、椎間板治療用組成物、特には、椎間板の髄核補填用組成物に関する。
脊椎は、椎骨が連なる棒状の骨格であり、体幹および頭部を支える。椎骨と椎骨は、椎
骨間にある椎間板によって連結されている。椎間板は、円板状の無血管組織であり、髄核
を中心にして周りを線維輪が取り巻き、さらに上下に終板が配置された構造をしている。
椎間板の髄核は、髄核細胞とその細胞外マトリクスから構成され、水分を多く含むゲル状
の弾力に富む構造物であり、椎体間にかかる圧を吸収するクッションの役割を果たす。線
維輪は、層状構造の線維軟骨とそれを取り巻くコラーゲンの層からできており、椎体間の
回転運動を制限する。終板は、硝子軟骨組織であり、椎間板と椎体を強固に連結する。
椎間板の中心部に位置する髄核は、線維輪や終板、また他の軟骨組織と比較して特徴的
な組成を有する。すなわち、髄核の細胞外マトリックスの主成分は、水分（７０～９０％
；加齢に伴い低下）、タイプＩＩコラーゲン（乾燥重量の２０％）、プロテオグリカン（
乾燥重量の５０％）であり、終板や関節軟骨などの他の軟骨組織と比較して、コラーゲン
に対するプロテオグリカンの割合が高い、という特徴をもつ（非特許文献１）。一方、関
節軟骨など他の軟骨組織の細胞外マトリックスは、プロテオグリカンと比較してコラーゲ
ンの割合が高い。椎間板のショック吸収体としての機能は、その豊富な水分含量に負うと
ころが大きい。こうした豊富な水分は、主としてプロテオグリカンのコア蛋白に結合して
いるグリコサミノグリカンが陰性に荷電し、水分を引き寄せていることによって維持され
ている。また、椎間板に存在するプロテオグリカンの構造と大きさは、関節軟骨に存在す
るプロテオグリカンと異なり、特に髄核のプロテオグリカンはその差が顕著であったこと
が開示されている（非特許文献２）。
椎間板の髄核、線維輪、及び終板は、それぞれ異なる構造及び機能を持ち、それぞれ異
なる表現型をもつ細胞群により維持されている。髄核に存在する髄核細胞は、円形で、プ
ロテオグリカン豊富なマトリックスを作り出している。線維輪に存在する細胞はコラーゲ
ンファイバーマトリックスに包まれている。このような椎間板内の細胞は、それぞれ表現
型が異なり、また、関節軟骨細胞と比較しても、表現型の差異があることが近年報告され
ている（非特許文献１）。
椎間板は、加齢、外傷、疾病などにより変性、損傷が生じる。椎間板の変性は、椎間板
の細胞数、水分含有量、細胞外マトリックス（タイプＩＩコラーゲン、アグリカンなど）
等が低下している状態であり、進行すると椎間板のショック吸収体としての機能が果たせ
なくなる。椎間板変性および椎間板損傷は、具体的には、椎間板ヘルニア、椎間板症、脊
椎変性辷り症、化膿性椎間板炎、変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、外傷などによる椎間板損
傷などである。例えば、椎間板ヘルニアでは、髄核を覆う線維輪が変形または亀裂を生じ
ることによってヘルニアを形成して椎間板外へ突出し、突出した髄核が、脊髄神経を圧迫
し、痛み、麻痺などを引き起こす。
椎間板ヘルニアに対する治療の一つに椎間板髄核摘出（切除）術があり、一定の効果が
確認されている。しかしながら、椎間板髄核摘出（切除）術では、椎間板髄核摘出術後の
手術部位に処置を施さないため、椎間板の変性変化が進行することがあることが知られて
いる。椎間板髄核摘出術で髄核の一部を取り除くと、髄核部位に空洞（本明細書において
「欠損部」ともいう）ができる。髄核には自己修復能及び再生能がほとんどないため、髄
核の空洞は物理的にも弱くなりやすい。また、空洞部分には、線維芽様細胞が集積して本
来の髄核とは力学的特性の異なる組織が形成されることがある。このため、椎間板髄核摘
出術後は、ヘルニアの再発率が高い。椎間板髄核摘出後の５年以内の再発率は４～１５％
程度といわれているが、最近の長期データでは１０年後には過半数に再発することが分か
ってきた。ヘルニアが再発すると再手術が必要になるが、脊髄神経は、１回目の手術後に
形成された瘢痕組織の中に埋没しており、脊髄神経の位置を確認することが困難となる。
たとえ脊髄神経の位置を確認できても瘢痕は厚く硬くなっているので脊髄神経と周囲の組
織との間を分離することは極めて困難となる。再手術では、極めて難しい技術を要求され
る。このため、椎間板髄核摘出術後に、ヘルニアが再発せず、瘢痕化しない手術方法の確
立が求められている。
椎間板疾患に対する治療の試みとして、例えば、髄核又は線維輪を除去することなく、
椎間板のスペースへ高分子電解質材料（polyelectrolyte materials）を導入する治療方
法が提案され、その高分子電解質の多数ある具体例のひとつとしてアルギネートが挙げら
れている（特許文献１）。また、グリコサミノグリカン等の軟骨保護材料を必要とする部
位へ注入することを含む椎間板の機能を高める方法が提案されており、その軟骨保護材料
の多数ある具体例のひとつにアルギン酸ナトリウムの両親媒性誘導体が挙げられている（
特許文献２）。また、制酸剤を椎間板へ注入するためのデバイスが開示されている（特許
文献３）。制酸剤を注入することに加え、任意で椎間板のフィラーを注入してもよいとさ
れ、フィラーの多数ある具体例のひとつとしてカルシウム又はバリウムで架橋したアルギ
ネートが挙げられている（特許文献３）。しかし、これらの文献では、多数ある具体例の
ひとつとしてこれらが挙げられているにすぎず、その具体的な使用方法や使用例は記載さ
れていない。
また、髄核補填材料として、アルギン酸塩などのハイドロゲルが検討されている。アル
ギン酸塩などのハイドロゲルを髄核補填材料として用いる場合には、その機械的強度が問
題とされ、ｉｎ ｖｉｖｏで用いられたとき一定期間形状が保たれるものが推奨され、硬
度の高いほうがよいと考えられていた（非特許文献３～９）。
ここで、アルギン酸塩を、関節、胸郭壁、椎間板、半月板などの軟骨の再生に利用する
ことが提案されている（特許文献４～５）。
米国特許出願公開第２００７／０１５００６０号明細書 米国特許出願公開第２００３／００６９６３９号明細書 米国特許出願公開第２００９／００８２７１９号明細書 国際公開第２００８／１０２８５５号 国際公開第２０１３／０２７８５４号
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎａｔｏｍｙ（２０１２）２２１，ｐ．４８０－４９６ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８９）７， ｐ．１４６－１５１ Ｅｕｒ Ｓｐｉｎｅ Ｊ （２００７） １６， ｐ．１８９２－１８９８ Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｃａｒｔｉｌａｇｅ （２００９） １７， ｐ．１３７７－１３８４ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ （２０１４） ２９， ｐ．５６－６７ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ （２０１１） ４， ｐ．１１９６－１２０５ Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａ （２０１４） １０， ｐ．１６４６－１６６２ Ｓｐｉｎｅ Ｊ （２０１３） １３（３）， ｐ．２４３－２６２ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６３ （２０１６） ｐ．１９８－２１０
上記状況において、本発明の課題は、椎間板の髄核の再生を促進することが可能な髄核
補填用組成物を提供することである。また、充填操作が比較的簡便で、脊髄神経の圧迫な
どの合併症の恐れの少ない髄核補填用組成物を提供することである。
本発明者らは、椎間板変性や椎間板損傷の治療方法として、生体適合性材料による髄核
補填の可能性を検討した。従来、この治療分野において、特に、髄核補填材料としてアル
ギン酸塩などのハイドロゲルを用いることが検討される場合には、ハイドロゲルの機械的
強度が問題とされ、ｉｎ ｖｉｖｏで用いられたときにも一定期間形状が保持されること
が推奨されていた。しかし、本発明者らは、逆に、低エンドトキシンアルギン酸ナトリウ
ムを含む組成物をゾル状態で髄核部位に注入し、漏出を防ぐために椎間板の表面の組成物
の充填口に架橋剤を接触させて組成物の一部を硬化させることにより、椎間板髄核の変性
を抑制し、髄核再生に好ましいタイプＩＩコラーゲン陽性細胞の割合を増加させ、椎間板
髄核の再生を促進することを見出した。また、線維輪も含めた椎間板組織全体の変性も抑
制することを見出した。
本発明者らは、このような知見に基づきさらに検討を重ね、本発明を完成するに至った
。
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］ 対象の髄核部位に適用し、適用後に一部分を硬化するように用いられ、髄核部位
への適用時に流動性を有する、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含有する、椎
間板の髄核補填用組成物。
［１Ａ］ 低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含有し、髄核部位への適用時に流
動性を有する、対象の髄核部位への適用後に一部分を硬化するように用いられる、椎間板
の髄核補填用組成物。
［２］ 前記組成物の硬化を、前記組成物の表面の少なくとも一部分に架橋剤を接触させ
ることで行う、上記［１］または［１Ａ］に記載の組成物。
［３］ 前記組成物の髄核部位への適用を、椎間板表面の組成物の充填口を介して行い、
前記組成物の一部分の硬化を、椎間板表面の組成物の充填口に架橋剤を接触させることで
行う、上記［１］～［２］のいずれか１項に記載の組成物。
［４］ 前記組成物の髄核部位への適用を、髄核の少なくとも一部を除去することで形成
した髄核欠損部に、前記組成物を適用することで行う、上記［１］～［３］のいずれか１
項に記載の組成物。
［５］ 前記流動性を有する組成物の粘度が、１００ｍＰａ・ｓ～３００００ｍＰａ・ｓ
である、上記［１］～［４］のいずれか１項に記載の組成物。
［５Ａ］ 前記流動性を有する組成物の見掛け粘度が、コーンプレート型粘度計を用いた
20℃の条件での測定により、１００ｍＰａ・ｓ～３００００ｍＰａ・ｓである、上記［１
］～［４］のいずれか１項に記載の組成物。
［６］ 前記低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩は、ＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測
定された重量平均分子量が８万以上である、上記［１］～［５Ａ］のいずれか１項に記載
の組成物。
［６Ａ］ 前記低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩は、ＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により
測定された重量平均分子量（絶対分子量）が８万以上である、上記［１］～［５Ａ］のい
ずれか１項に記載の組成物。
［７］ 前記組成物は、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩の濃度が０．５ｗ／ｖ
％～５ｗ／ｖ％である、上記［１］～［６Ａ］のいずれか１項に記載の組成物。
［７Ａ］ 前記組成物は、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩の濃度が０．５ｗ／
ｗ％～５ｗ／ｗ％である、上記［１］～［６Ａ］のいずれか１項に記載の組成物。
［８］ 前記組成物は、前記対象の髄核部位に適用する前に、前記組成物を硬化させる量
の架橋剤を含有しない、上記［１］～［７Ａ］のいずれか１項に記載の組成物。
［９］ 前記組成物は、細胞を含有しない、上記［１］～［８］のいずれか１項に記載の
組成物。
［１０］ 架橋剤が２価以上の金属イオン化合物である、上記［２］～［９］のいずれか
１項に記載の組成物。
［１０Ａ］ ２価以上の金属イオン化合物がＣａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋か
らなる群より選ばれる少なくとも１つの金属イオン化合物である、上記［１０］に記載の
組成物。
［１１］ 前記組成物が、椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発
抑制のために用いられる、上記［１］～［１０Ａ］のいずれか１項に記載の組成物。
［１２］ 前記椎間板変性および／または椎間板損傷が、椎間板ヘルニア、椎間板症、脊
椎変性辷り症、化膿性椎間板炎、変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、及び椎間板損傷からなる
群から選択される少なくとも１種である、上記［１１］に記載の組成物。
［１３］ 前記組成物が、髄核部位への適用前に乾燥状態である、上記［１］～［１２］
のいずれか１項に記載の組成物。
［１３Ａ］ 前記組成物が、髄核部位への適用前に乾燥状態または溶液状態である、上記
［１］～［１２］のいずれか１項に記載の組成物。
［１４］ 前記乾燥状態の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩が、凍結乾燥体であ
る、上記［１３］または［１３Ａ］に記載の組成物。
［１４Ａ］ 前記組成物の一部分の硬化が、髄核部位への充填と同様の架橋剤の使用方法
および使用比率を用いて、本明細書の実施例４に準じて、in vitroで、直径６ｍｍの試験
管に低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム５００μＬおよび架橋剤を充填して１時間静
置後に、試験管内の組成物の容量の少なくとも５割が２１Ｇの注射針をつけたシリンジで
吸引できることで示される、上記［１］～［１４］のいずれか１項に記載の組成物。
［１４Ｂ］ 前記流動性を有する組成物は、組成物を２０℃で１時間静置した後に、２１
Ｇの注射針で注入できる流動性を有する、上記［１］～［１４Ａ］のいずれか１項に記載
の組成物。
［１５］ 上記［１］ないし［１４Ｂ］のいずれか１項に記載の組成物、および架橋剤を
少なくとも含む、椎間板の髄核補填用キット。
［１６］ 椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制のための方
法であって、
低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含有し、流動性を有する組成物を、前記治
療、予防または再発抑制を必要とする対象の椎間板の髄核部位に適用し、
適用した前記組成物の一部分を硬化することを含む、前記方法。
［１７］ 前記椎間板変性および／または椎間板損傷が、椎間板ヘルニア、椎間板症、脊
椎変性辷り症、化膿性椎間板炎、変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、及び椎間板損傷からなる
群から選択される少なくとも１種である、上記［１６］に記載の方法。
［１８］ 椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制のための組
成物を製造するための低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩の使用であって、
前記組成物が、対象の髄核部位に適用され、適用後に一部分を硬化するように用いられ
、髄核部位への適用時に流動性を有する、前記使用。
［１９］ 前記椎間板変性および／または椎間板損傷が、椎間板ヘルニア、椎間板症、脊
椎変性辷り症、化膿性椎間板炎、変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、及び椎間板損傷からなる
群から選択される少なくとも１種である、上記［１８］に記載の使用。
［２０］ 低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含有し、流動性を有する組成物を
、椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制を必要とする対象の
椎間板の髄核部位に適用し、適用した組成物の一部を硬化する、椎間板変性および／また
は椎間板損傷の治療、予防または再発抑制において使用されるための低エンドトキシンア
ルギン酸の１価の金属塩。
本発明は、椎間板の髄核の再生を促進することが可能な髄核補填用組成物を提供する。
本発明の組成物によれば、椎間板髄核のみならず線維輪も含めた椎間板組織全体の変性変
化も抑制することも可能となる。また、本発明の組成物は、髄核におけるタイプＩＩコラ
ーゲン陽性の硝子軟骨様細胞の割合を増加させる効果を有する。
本発明の好ましい態様の１つでは、本発明の組成物は、椎間板ヘルニア等の椎間板変性
に関する疾患、あるいは外傷などによる椎間板損傷等の予防、治療、または再発抑制にお
いて、髄核補填材料として用いることができる。
また、本発明の好ましい態様の組成物は、ゾル状態でシリンジ等を用いて髄核部位に注
入することが可能であり、また、直視下のみならず、経皮的髄核摘出術（約5mmの切開）
、顕微鏡下（約3～4 cmの切開）および内視鏡下（約1～2cmの切開）での充填も可能とな
るため、患者の負担を軽減でき、手技も比較的簡便である。
さらに、全体をゲル化した従来の髄核補填材料では、万一脊柱管内に突出した場合に、
脊髄神経を圧迫し障害する恐れがあるが、本発明のさらに好ましい態様の組成物は、表面
のみをゲル化するため、そのような合併症の心配も少なく安全である。
本発明の特に好ましい態様の組成物は、椎間板髄核摘出（切除）術後のヘルニアの再発
や、瘢痕化を防ぐことができる。また、本発明の好ましい態様の１つでは、椎間板変性お
よび／または椎間板損傷のある椎間板髄核に本発明の組成物を適用して治療することによ
り、治療した椎間板に隣接する椎間板の負担も軽減され、隣接する椎間板の変性を予防お
よび／または軽減することが可能となる。
本発明の組成物は、上記のいずれか１以上の効果を満たす。
血清飢餓開始後６時間後、４８時間後の生細胞率を示す。Ａ群：低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム；およびＢ群：食品グレードアルギン酸ナトリウム。 血清飢餓開始後６時間後、４８時間後のアポトーシス細胞率を示す。Ａ群：低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム；およびＢ群：食品グレードアルギン酸ナトリウム。 術後４週における、Ｐｆｉｒｒｍａｎｎ分類による椎間板組織の評価結果を示すグラフである。正常コントロール群、吸引単独群、および治療群（Ａ－１群およびＡ－２群）。 術後４週における、ＭＲＩ ｉｎｄｅｘによる椎間板組織の評価結果を示すグラフである。吸引単独群、および治療群（Ａ－１群およびＡ－２群）。 術後４週における、椎間板変性の重症度の組織学的評価結果を示すグラフである。正常コントロール群、吸引単独群、および治療群（Ａ－１群およびＡ－２群）。 （Ａ）術後４週の椎間板組織標本の染色写真を示す。正常コントロール群、吸引単独群、および治療群（Ａ－２群）。 （Ｂ）術後１２週の椎間板組織標本の染色写真を示す。正常コントロール群、吸引単独群、および治療群（Ａ－２群）。 術後４週と１２週における、椎間板組織切片中の細胞数に対する抗Ｔｙｐｅ ＩＩｃｏｌｌａｇｅｎ抗体陽性細胞率を示すグラフである。正常コントロール群、吸引単独群、および治療群（Ａ－２群）。 ヒツジ 術後４週における、改変されたＢｏｏｓ分類による評価結果を示すグラフである。正常コントロール群、髄核摘出群、および治療群。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。 ヒツジ 術後４週における椎間板高インデックスによる評価結果を示すグラフである。正常コントロール群、髄核摘出群、および治療群。＊Ｐ＜０．０５。 ヒツジ 術後４週における椎間板組織切片中の細胞中に対する抗Type II collagen抗体陽性細胞率を示すグラフである。正常コントロール群、髄核摘出群、および治療群。＊Ｐ＜０．０５。 術後４週時における椎間板髄核のヒドロキシプロリン（HYP）に対する硫酸化グリコサミノグリカン（GAG）の割合を示す。髄核摘出群、治療群、正常コントロール群、および関節軟骨。
以下、本発明について詳細に説明する。

１．本発明の組成物
本発明は、椎間板の髄核補填に好ましく用いられる組成物に関する。
本発明の組成物は、対象の髄核部位に適用し、適用後に一部分を硬化するように用いら
れ、髄核部位への適用時に流動性を有する、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を
含有する、椎間板の髄核補填用組成物である（本明細書において、「本発明の組成物」と
いう場合がある）。
「低エンドトキシン」、「アルギン酸の１価金属塩」は、後述の通りである。
「椎間板」は、脊椎に連なる椎骨と椎骨との間にある円柱状の組織である。椎間板は、
円板状の無血管組織であり、髄核を中心にして周りを線維輪が取り巻き、さらに上下に終
板が配置された構造をしている。
「髄核」は、椎間板の中心に存在するゲル状の組織であり、髄核細胞と、主にプロテオ
グリカンとＩＩ型コラーゲンで構成される細胞外基質と、水を主として含有する。髄核に
は、自己修復能・再生能がほとんどないと考えられている。
「髄核補填」とは、加齢、外傷、感染、およびそれらに対する外科的手術（例えば、椎
間板髄核摘出（切除）術）などにより、変性、縮小、または除去した髄核の変性分、縮小
分、または除去分を補填することをいう。なお、本明細書において「髄核充填」の語は、
「髄核補填」と同じ意味で用いられ、本発明の「髄核補填用組成物」は「髄核充填用組成
物」と同義である。
「髄核部位」とは、髄核が存在する部位、髄核の変性若しくは縮小が生じている部位、
又は、髄核の少なくとも一部を除去することで形成された髄核の欠損部をいい、髄核が存
在する部位の周辺部も含む。
「対象」は、ヒト、またはヒト以外の生物、例えば、トリおよび非ヒト哺乳動物（例え
ば、ウシ、サル、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、イヌ、ウサギ
、ヒツジ、およびウマ）である。
「適用」とは、本発明の組成物を椎間板の髄核部位の変性分、縮小分、除去分、欠損部
などを埋めるのに十分な量で髄核部位に充填することを意味する。
「一部分を硬化する」とは、後述の通りである。
「低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含有する」とは、本発明の組成物が、適
用された髄核部位において、髄核を再生するのに十分な量の低エンドトキシンアルギン酸
の１価金属塩を含有することを意味する。
「流動性を有する」とは、後述の通りである。
「椎間板変性および／または椎間板損傷」、「治療、予防または再発抑制」とは、後述
の通りである。
本発明の組成物は、溶媒を用いて溶液状態で提供されてもよいし、凍結乾燥体（特には
、凍結乾燥粉体）などの乾燥状態で提供されてもよい。乾燥状態として提供される場合、
本発明の組成物は、適用時には溶媒を用いて、溶液状などの流動性を有する状態で使用さ
れる。溶媒は、生体へ適用可能な溶媒であれば特に限定されないが、例えば、注射用水、
精製水、蒸留水、イオン交換水（または脱イオン化水）、ミリＱ水、生理食塩水、リン酸
緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などが挙げられる。好ましくは、ヒトおよび動物の治療に用い
ることが可能な注射用水、蒸留水、生理食塩水などである。
２．アルギン酸の１価金属塩
「アルギン酸の１価金属塩」は、アルギン酸の６位のカルボン酸の水素原子を、Ｎａ＋
やＫ＋などの１価金属イオンとイオン交換することでつくられる水溶性の塩である。アル
ギン酸の１価金属塩としては、具体的には、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム
などを挙げることができるが、特には、市販品により入手可能なアルギン酸ナトリウムが
好ましい。アルギン酸の１価金属塩の溶液は、架橋剤と混合したときにゲルを形成する。
本発明に用いる「アルギン酸」は、生分解性の高分子多糖類であって、Ｄ－マンヌロン
酸（Ｍ）とＬ－グルロン酸（Ｇ）という２種類のウロン酸が直鎖状に重合したポリマーで
ある。より具体的には、Ｄ－マンヌロン酸のホモポリマー画分（ＭＭ画分）、Ｌ－グルロ
ン酸のホモポリマー画分（ＧＧ画分）、およびＤ－マンヌロン酸とＬ－グルロン酸がラン
ダムに配列した画分（ＭＧ画分）が任意に結合したブロック共重合体である。アルギン酸
のＤ－マンヌロン酸とＬ－グルロン酸の構成比（Ｍ／Ｇ比）は、主に海藻等の由来となる
生物の種類によって異なり、また、その生物の生育場所や季節による影響を受け、Ｍ／Ｇ
比が約０．４の高Ｇ型からＭ／Ｇ比が約５の高Ｍ型まで高範囲にわたる。
アルギン酸の１価金属塩は高分子多糖類であり、分子量を正確に定めることは困難であ
るが、分子量が低すぎると粘度が低くなり、適用した部位の周辺組織への密着性が弱くな
る恐れがあり、また、分子量が高すぎるものは製造が困難であるとともに、溶解性が低下
する、溶液状にした際に粘度が高すぎて取扱いが悪くなる、長期間の保存で物性を維持し
にくい等の問題を生じるため、一般的に重量平均分子量で１万～１０００万、好ましくは
２万～８００万、より好ましくは５万～５００万の範囲である。本明細書において、「～
」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および
最大値として含む範囲を示す。
一方、天然物由来の高分子物質の分子量測定では、測定方法により値に違いが生じうる
ことが知られている。例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）又はゲルろ過クロ
マトグラフィー（これらを合わせてサイズ排除クロマトグラフィーともいう）により測定
した重量平均分子量は、本発明の実施例で示された効果によれば、好ましくは１０万以上
、より好ましくは５０万以上であり、また好ましくは、５００万以下、より好ましくは３
００万以下である。その好ましい範囲は、１０万～５００万であり、より好ましくは５０
万～３５０万である。
また、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）と多角度光散乱検出器（Multi
Angle Light Scattering：ＭＡＬＳ）とを組み合わせたＧＰＣ－ＭＡＬＳ法によれば、絶
対重量平均分子量を測定することができる。ＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定した重量平均
分子量（絶対分子量）は、本発明の実施例で示された効果によれば、好ましくは１万以上
、より好ましくは８万以上、さらに好ましくは９万以上であり、また好ましくは、１００
万以下、より好ましくは８０万以下、さらに好ましくは７０万以下、とりわけ好ましくは
５０万以下である。その好ましい範囲は、１万～１００万であり、より好ましくは８万～
８０万であり、よりさらに好ましくは９万～７０万、とりわけ好ましくは９万～５０万で
ある。
通常、高分子多糖類の分子量を上記のような手法で算出する場合、１０～２０％以上の
測定誤差を生じうる。例えば、４０万であれば３２～４８万、５０万であれば４０～６０
万、１００万であれば８０～１２０万程度の範囲で値の変動が生じうる。
アルギン酸の１価金属塩の分子量の測定は、常法に従い測定することができる。
分子量測定にゲル浸透クロマトグラフィーを用いる場合の代表的な条件は、本明細書の
実施例に記載のとおりである。カラムは、例えば、ＧＭＰＷ－ＸＬ×２＋Ｇ２５００ＰＷ
－ＸＬ（７．８ｍｍ Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ）を用いることができ、溶離液は、例えば、
２００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液とすることができ、分子量標準としてプルランを用いる
ことができる。
分子量測定にＧＰＣ－ＭＡＬＳを用いる場合の代表的な条件は、本明細書の実施例に記
載のとおりである。検出器として、例えば、ＲＩ検出器と光散乱検出器（ＭＡＬＳ）を用
いることができる。
アルギン酸の１価金属塩は、褐藻類から抽出された当初は、分子量が大きく、粘度が高
めだが、熱による乾燥、精製などの過程で、分子量が小さくなり、粘度は低めとなる。製
造工程の温度等の条件管理、原料とする褐藻類の選択、製造工程における分子量の分画な
どの手法により分子量の異なるアルギン酸の１価の金属塩を製造することができる。さら
に、異なる分子量あるいは粘度を持つ別ロットのアルギン酸の１価金属塩と混合すること
により、目的とする分子量を有するアルギン酸の１価金属塩とすることも可能である。
本発明に用いられるアルギン酸の１価金属塩は、好ましくは、アルギン酸の１価金属塩
をMilliQ水に溶解して１ｗ／ｗ％濃度の溶液とし、コーンプレート型粘度計を用いて、２
０℃の条件で、粘度測定を行ったときの見掛け粘度が、４０ｍPa・ｓ～８００ｍPa・ｓで
あることが好ましく、より好ましくは、５０ｍPa・ｓ～６００ｍPa・ｓであることが望ま
しい。見掛け粘度の測定条件は、後述の条件に従うことが望ましい。なお、本明細書にお
いて「見掛け粘度」を単に「粘度」という場合がある。
本発明に用いるアルギン酸は、天然由来でも合成物であってもよいが、天然由来である
のが好ましい。天然由来のアルギン酸としては、例えば、褐藻類から抽出されるものを挙
げることができる。アルギン酸を含有する褐藻類は世界中の沿岸域に繁茂しているが、実
際にアルギン酸原料として使用できる海藻は限られており、南米のレッソニア、北米のマ
クロシスティス、欧州のラミナリアやアスコフィラム、豪のダービリアなどが代表的なも
のである。アルギン酸の原料となる褐藻類としては、例えば、レッソニア（Ｌｅｓｓｏｎ
ｉａ）属、マクロシスティス（Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）属、ラミナリア（Ｌａｍｉｎａ
ｒｉａ）属（コンブ属）、アスコフィラム（Ａｓｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）属、ダービリア（
Ｄｕｒｖｉｌｌｅａ）属、アラメ（Ｅｉｓｅｎｉａ）属、カジメ（Ｅｃｋｌｏｎｉａ）属
などがあげられる。
３．低エンドトキシン処理
本発明で用いるアルギン酸の１価金属塩は、低エンドトキシンのアルギン酸の１価金属
塩である。低エンドトキシンとは、実質的に炎症、または発熱を惹起しない程度にまでエ
ンドトキシンレベルが低いことをいう。より好ましくは、低エンドトキシン処理されたア
ルギン酸の１価金属塩であることが望ましい。
低エンドトキシン処理は、公知の方法またはそれに準じる方法によって行うことができ
る。例えば、ヒアルロン酸ナトリウムを精製する、菅らの方法（例えば、特開平９－３２
４００１号公報など参照）、β１，３－グルカンを精製する、吉田らの方法（例えば、特
開平８－２６９１０２号公報など参照）、アルギネート、ゲランガム等の生体高分子塩を
精製する、ウィリアムらの方法（例えば、特表２００２－５３０４４０号公報など参照）
、ポリサッカライドを精製する、ジェームスらの方法（例えば、国際公開第９３／１３１
３６号パンフレットなど参照）、ルイスらの方法（例えば、米国特許第５５８９５９１号
明細書など参照）、アルギネートを精製する、ハーマンフランクらの方法（例えば、Ａｐ
ｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （１９９４）４０：６３８－６４３
など参照）等またはこれらに準じる方法によって実施することができる。本発明の低エン
ドトキシン処理は、それらに限らず、洗浄、フィルター（エンドトキシン除去フィルター
や帯電したフィルターなど）によるろ過、限外ろ過、カラム（エンドトキシン吸着アフィ
ニティーカラム、ゲルろ過カラム、イオン交換樹脂によるカラムなど）を用いた精製、疎
水性物質、樹脂または活性炭などへの吸着、有機溶媒処理（有機溶媒による抽出、有機溶
剤添加による析出・沈降など）、界面活性剤処理（例えば、特開２００５－０３６０３６
号公報など参照）など公知の方法によって、あるいはこれらを適宜組合せて実施すること
ができる。これらの処理の工程に、遠心分離など公知の方法を適宜組み合わせてもよい。
アルギン酸の種類などに合わせて適宜選択するのが望ましい。
エンドトキシンレベルは、公知の方法で確認することができ、例えば、リムルス試薬（
ＬＡＬ）による方法、エントスペシー（登録商標）ＥＳ－２４Ｓセット（生化学工業株式
会社）を用いる方法などによって測定することができる。
本発明の組成物に含有されるアルギン酸の１価金属塩のエンドトキシンの処理方法は特
に限定されないが、その結果として、アルギン酸の１価金属塩のエンドトキシン含有量が
、リムルス試薬（ＬＡＬ）によるエンドトキシン測定を行った場合に、５００エンドトキ
シン単位（ＥＵ）／ｇ以下であることが好ましく、さらに好ましくは、１００ＥＵ／ｇ以
下、とりわけ好ましくは５０ＥＵ／ｇ以下、特には３０ＥＵ／ｇ以下である。低エンドト
キシン処理されたアルギン酸ナトリウムは、例えば、Ｓｅａ Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）
（持田製薬株式会社）、ＰＲＯＮＯＶＡＴＭＵＰ ＬＶＧ（ＦＭＣ ＢｉｏＰｏｌｙｍｅ
ｒ）など市販品により入手可能である。
４．アルギン酸の１価金属塩の溶液の調製
本発明の組成物は、アルギン酸の１価金属塩の溶液を用いて調製してもよい。アルギン
酸の１価金属塩の溶液は、公知の方法またはそれに準じる方法により調製することができ
る。すなわち、本発明で用いられるアルギン酸の１価金属塩は、前述の褐藻類を用いて、
酸法、カルシウム法など公知の方法により製造することができる。具体的には、例えば、
これらの褐藻類から、炭酸ナトリウム水溶液などのアルカリ水溶液を用いて抽出した後、
酸（例えば、塩酸、硫酸など）を添加することによってアルギン酸を得ることができ、ア
ルギン酸のイオン交換によりアルギン酸の塩を得ることができる。前述のとおり、低エン
ドトキシン処理を行う。アルギン酸の１価金属塩の溶媒は、生体へ適用可能な溶媒であれ
ば特に限定されないが、例えば、精製水、蒸留水、イオン交換水、ミリＱ水、生理食塩水
、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などが挙げられる。これらは、滅菌されていることが
好ましく、低エンドトキシン処理されたものが好ましい。例えば、ミリＱ水をろ過滅菌し
て用いることができる。
本発明の組成物が、凍結乾燥体などの乾燥状態で提供される場合にも、上記の溶媒を用
いて流動性のある溶液に調製することができる。
また、本発明の組成物を得るための操作は全てエンドトキシンレベル、および、細菌レベ
ルの低い環境下で行うことが望ましい。例えば、操作はクリーンベンチで、滅菌器具を使
用して行うことが好ましく、使用する器具を市販のエンドトキシン除去剤で処理してもよ
い。
５．本発明の組成物の見掛け粘度
本発明のいくつかの態様の組成物は、流動性のある液体状、すなわち、溶液状である。
本発明の組成物は、髄核部位への適用時に流動性を有する。本発明の態様の１つでは、好
ましくは、本発明の組成物は、組成物を２０℃で１時間静置した後に、２１Ｇの注射針で
注入できる流動性を有する。この態様の本発明の組成物の見掛け粘度は、本発明の効果が
得られれば、特に限定されないが、粘度が低すぎると適用した部位の周辺組織への密着性
が弱くなる恐れがあるため、好ましくは１０ｍＰａ・ｓ以上、より好ましくは１００ｍＰ
ａ・ｓ以上、さらに好ましくは２００ｍＰａ・ｓ以上、とりわけ好ましくは５００ｍＰａ
・ｓ以上である。見掛け粘度が高すぎると取扱性が悪くなる恐れがあるため、好ましくは
５００００ｍＰａ・ｓ以下、より好ましくは２００００ｍＰａ・ｓ以下であり、さらに好
ましくは１００００ｍＰａ・ｓ以下である。見掛け粘度が２００００ｍＰａ・ｓ以下のと
きシリンジ等での適用がより容易に行える。しかし、見掛け粘度が２００００ｍＰａ・ｓ
以上であっても加圧型や電動型の充填器具やその他の手段を用いて適用可能である。本発
明の組成物の好ましい範囲は、１０ｍＰａ・ｓ～５００００ｍＰａ・ｓ、より好ましくは
、１００ｍＰａ・ｓ～３００００ｍＰａ・ｓ、さらに好ましくは２００ｍＰａ・ｓ～２０
０００ｍＰａ・ｓ、またさらに好ましくは５００ｍＰａ・ｓ～２００００ｍＰａ・ｓ、と
りわけ好ましくは７００ｍＰａ・ｓ～２００００ｍＰａ・ｓである。別の好ましい態様で
は、５００ｍＰａ・ｓ～１００００ｍＰａ・ｓ、あるいは２０００ｍＰａ・ｓ～１０００
０ｍＰａ・ｓであってもよい。本発明のいくつかの態様の組成物は、シリンジ等で対象に
適用することもできる粘度である。
アルギン酸類の水溶液などアルギン酸の１価金属塩を含有する組成物の見掛け粘度の測
定は、常法に従い測定することができる。例えば、回転粘度計法の、共軸二重円筒形回転
粘度計、単一円筒形回転粘度計（ブルックフィールド型粘度計）、円すい－平板形回転粘
度計（コーンプレート型粘度計）等を用いて測定することができる。好ましくは、日本薬
局方（第１６版）の粘度測定法に従うことが望ましい。本発明において粘度測定は２０℃
の条件で行うことが望ましい。後述のように本発明の組成物が細胞など溶媒に溶解しない
ものを含有する場合には、粘度測定を正確に行うため、組成物の見掛け粘度は、細胞など
を含有しない状態の見掛け粘度とすることが好ましい。
本発明においては、アルギン酸の１価金属塩を含有する組成物の見掛け粘度の測定は、
特に、コーンプレート型粘度計を用いて測定することがより望ましい。例えば、以下のよ
うな測定条件で測定することが望ましい。試料溶液の調製は、MilliQ水を用いて行う。測
定温度は２０℃とする。コーンプレート型粘度計の回転数は、アルギン酸１価金属塩の１
％溶液測定時は１ｒｐｍ、２％溶液測定時は０．５ｒｐｍとし、これを目安にして決定す
る。読み取り時間は、アルギン酸１価金属塩の１％溶液測定の場合は２分間測定し、開始
１分から２分までの平均値とする。２％溶液測定の場合は２．５分間測定し、開始０．５
分から２．５分までの平均値とする。試験値は３回の測定の平均値とする。
本発明の組成物の見掛け粘度は、例えば、アルギン酸の１価金属塩の濃度、分子量、又
はＭ／Ｇ比等を制御することにより調整することができる。
アルギン酸の１価金属塩の溶液の見掛け粘度は、溶液中のアルギン酸１価金属塩濃度が
高い場合に粘度が高く、濃度が低い場合に粘度が低くなる。またアルギン酸１価金属塩の
分子量が大きい場合に粘度が高く、分子量が小さい場合に粘度が低くなる。
アルギン酸の１価金属塩の溶液の見掛け粘度は、Ｍ／Ｇ比によって影響を受けるため、
例えば、溶液の粘度等により好ましいＭ／Ｇ比を有するアルギン酸を適宜選択することが
できる。本発明に用いるアルギン酸のＭ／Ｇ比は、約０．１～５．０であり、好ましくは
約０．１～４．０、より好ましくは約０．２～３．５である。
前述のように、Ｍ／Ｇ比が主に海藻の種類によって決まることなどから、原料として用
いられる褐藻類の種類はアルギン酸の１価金属塩の溶液の粘度に影響を及ぼす。本発明で
用いられるアルギン酸としては、好ましくは、レッソニア属、マクロシスティス属、ラミ
ナリア属、アスコフィラム属、ダービリア属の褐藻由来であり、より好ましくはレッソニ
ア属の褐藻由来であり、特に好ましくはレッソニア・ニグレッセンズ（Ｌｅｓｓｏｎｉａ
ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）由来である。
６．本発明の組成物の調製
本発明の組成物は、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を有効成分として含有す
ることを特徴とする。本発明者らは、低エンドトキシンアルギン酸１価金属塩を生体の髄
核部位に充填した場合に、アルギン酸の１価金属塩自体が髄核組織の再生または治療効果
を発揮することを初めて見出した。有効成分として含有するとは、低エンドトキシンアル
ギン酸の１価金属塩が患部に適用された際に、髄核組織の再生または治療効果を発揮でき
る量で含有されていればよく、少なくとも、組成物全体の０．１ｗ／ｖ％以上であること
が好ましく、より好ましくは０．５ｗ／ｖ％以上、さらに好ましくは、１ｗ／ｖ％である
。本発明の組成物中の好ましいアルギン酸の１価金属塩濃度は、分子量の影響を受けるの
で、一概にはいえないが、好ましくは０．５ｗ／ｖ％～５ｗ／ｖ％、より好ましくは１ｗ
／ｖ％～５ｗ／ｖ％であり、さらに好ましくは、１ｗ／ｖ％～３ｗ／ｖ％で、とりわけ好
ましくは１．５ｗ／ｖ％～２．５ｗ／ｖ％である。また、別の態様では、本発明の組成物
中のアルギン酸の１価金属塩濃度は、好ましくは、０．５ｗ／ｗ％～５ｗ／ｗ％、より好
ましくは１ｗ／ｗ％～５ｗ／ｗ％であり、さらに好ましくは、１ｗ／ｗ％～３ｗ／ｗ％で
、とりわけ好ましくは１．５ｗ／ｗ％～２．５ｗ／ｗ％であってもよい。
好ましいエンドトキシンレベルを示すまで精製したアルギン酸の１価金属塩を用いて、
上記のように組成物を作製した場合には、組成物のエンドトキシン含有量は、通常、５０
０ＥＵ／ｇ以下であり、より好ましくは３００ＥＵ／ｇ以下、さらに好ましくは１５０Ｅ
Ｕ／ｇ以下であり、とりわけ好ましくは１００ＥＵ／ｇ以下である。
本発明の組成物は、細胞を含有しないことが好ましい。
本発明の別のいくつかの態様の組成物は、細胞を用いる。
細胞としては、例えば、髄核細胞、幹細胞、間質細胞、間葉系幹細胞、骨髄間質細胞な
どが挙げられ、由来は特に限定されないが、椎間板髄核、骨髄、脂肪組織、臍帯血などを
挙げることができる。また、細胞として、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞を挙げることもでき
る。
「細胞を用いる」とは、必要に応じて、椎間板髄核、骨髄、脂肪組織、臍帯血などから
目的とする細胞を回収し濃縮する処理や、培養して量を増やす処理を行い、調製した細胞
を本発明の組成物に添加することを言う。具体的には、例えば、１×１０４個／ｍｌ以上
、または１×１０５個／ｍｌ以上、好ましくは、１×１０４個／ｍｌ～１×１０７個／ｍ
ｌの細胞を本発明の組成物に含有させることを言う。細胞は市場から入手して用いてもよ
い。
本発明の組成物は、細胞の成長を促進する因子を含ませることもできる。そのような因
子としては、例えば、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ、ＴＧＦ－β、ＩＧＦ－１，Ｐ
ＤＧＦ，ＣＤＭＰ（cartilage-derived-morphogenetic protein），ＣＳＦ，ＥＰＯ、Ｉ
Ｌ、ＰＲＰ（Platelet Rich Plasma）、ＳＯＸおよびＩＦ等が挙げられる。これらの因子
は、組み換え法により製造してもよく、あるいは蛋白組成物から精製してもよい。尚、本
発明のいくつかの態様の組成物は、これらの成長因子を含まない。成長因子を含まない場
合でも、髄核の再生は十分に良好であるし、積極的に細胞の成長を促す場合と比較してよ
り安全性も高い。
本発明の組成物は、細胞死を抑制する因子を含ませることもできる。細胞死を引き起こ
す因子としては、例えば、Caspase、TNFα等が挙げられ、これらを抑制する因子としては
、抗体やsiRNA等が挙げられる。これらの細胞死を抑制する因子は、組み換え法により製
造してもよく、あるいは蛋白組成物から精製してもよい。尚、本発明のいくつかの態様の
組成物は、これらの細胞死を抑制する因子を含まない。細胞死を抑制する因子を含まない
場合でも、髄核の再生は十分に良好であるし、積極的に細胞死を抑制する場合と比較して
より安全性も高い。
尚、本発明の１つの態様では、本発明の組成物は、低エンドトキシンアルギン酸の１価
金属塩以外に、椎間板の髄核組織に対し薬理作用を発揮する成分を含まない。低エンドト
キシンアルギン酸の１価金属塩のみを有効成分として含有する組成物においても、充分な
髄核の再生または治療効果を発揮しうる。
本発明のいくつかの態様では、必要に応じて、他の医薬活性成分や、慣用の安定化剤、
乳化剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤、着色剤等、通常医薬に用
いられる成分を本発明の組成物に含有させることもできる。
７．本発明の組成物の硬化
本発明の組成物は、髄核部位への適用後に一部分を硬化するように用いられる。
「一部分を硬化する」とは、流動性を有する本発明の組成物の一部分に架橋剤を接触さ
せて、架橋剤と接触した組成物の全体ではなく一部分をゲル化し、固めることをいう。好
ましくは、流動性を有する本発明の組成物の表面の少なくとも一部分に架橋剤を接触させ
ることで本発明の組成物の一部分を硬化する。本発明のいくつかの態様では、「組成物を
髄核部位への適用後に一部分を硬化させる」とは、髄核部位への充填と同様の架橋剤の使
用方法および使用比率を用いて、本明細書の実施例４に準じて、in vitroで、直径６ｍｍ
の試験管に低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム５００μＬおよび架橋剤を充填して１
時間静置後に、試験管内の組成物の容量の少なくとも５割はゲル化しておらず、ゲル化し
ていない部分は、試験管内の組成物の容量の少なくとも５割が２１Ｇの注射針をつけたシ
リンジで吸引できることで示されてもよい。組成物が髄核部位への充填後にもこのような
性状を示すことにより、充填後に椎間板の頭尾側から圧縮力をかけた場合でも組成物が逸
脱することがないと考えられる。「組成物の表面の少なくとも一部分」は、例えば、髄核
へつながる椎間板の表面の開口部であり、好ましくは、髄核部位に組成物を適用するのに
使用した椎間板の表面の開口部、すなわち組成物の充填口である。組成物の表面の少なく
とも一部分をゲル化して固めることで、椎間板から組成物が漏れ出すのを効果的に防ぐこ
とができる。椎間板表面の組成物の充填口は、例えば、椎間板の表面にシリンジの針やメ
スで作製した組成物の充填に用いられた開口部、あるいは、椎間板ヘルニア摘出時にメス
等により作製された椎間板表面の開口部であることが好ましい。この態様における椎間板
とは好ましくは線維輪である。
本発明の組成物は、好ましくは、対象の髄核部位に適用する前に、組成物を硬化させる
量の架橋剤を含有しない。このため、本発明の組成物には、一定時間経過後も組成物を硬
化させない量の架橋剤が含まれていてもよい。ここでの一定時間とは、特に限定されない
が、好ましくは３０分～１２時間程度である。「組成物を硬化させる量の架橋剤を含有し
ない」ことは、例えば、組成物を２０℃で１時間静置した後に、２１Ｇの注射針をつけた
シリンジで注入できることで示されてもよい。本発明のいくつかの態様の組成物には、架
橋剤が含まれていない。
架橋剤としては、アルギン酸の１価金属塩の溶液を架橋することにより、その表面を固
定化することができるものであれば、特に限定されない。架橋剤として、例えば、Ｃａ２
＋、Ｍｇ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋などの２価以上の金属イオン化合物、分子内に２～４
個のアミノ基を有する架橋性試薬などが挙げられる。より具体的には、２価以上の金属イ
オン化合物として、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＣａＳＯ４、ＢａＣｌ２等を、分子内に２
～４個のアミノ基を有する架橋性試薬として、窒素原子上にリジル（ｌｙｓｙｌ）基（－
ＣＯＣＨ（ＮＨ２）－（ＣＨ２）４－ＮＨ２）を有することもあるジアミノアルカン、す
なわちジアミノアルカンおよびそのアミノ基がリジル基で置換されてリジルアミノ基を形
成している誘導体が包含され、具体的にはジアミノエタン、ジアミノプロパン、Ｎ－（リ
ジル）－ジアミノエタン等を挙げることができるが、入手しやすいこと、ゲルの強度等の
理由から、特に、ＣａＣｌ２溶液とするのが好ましい。
本発明のいくつかの態様の１つでは、本発明の組成物の表面に架橋剤を接触させるタイ
ミングは、好ましくは、本発明の組成物を髄核部位へ適用した後である。本発明の組成物
の一部分に架橋剤（例えば、２価以上の金属イオン）を接触させる方法としては、特に限
定されないが、例えば、シリンジ、噴射器（スプレー）などで、２価以上の金属イオンの
溶液を組成物表面にかける方法などを挙げることができる。例えば、架橋剤は、ゆっくり
と数秒～１０数秒、椎間板に形成された組成物の充填口にかけ続けてもよい。その後は、
必要に応じて、充填口付近に残存する架橋剤を除去する処理を加えてもよい。架橋剤の除
去は、例えば、生理食塩水等による適用部位の洗浄であってもよい。
架橋剤の使用量は、本発明の組成物の適用量、椎間板表面の組成物の充填口の大きさ、
椎間板の髄核の適用部位サイズ、などを考慮して適宜調節するのが望ましい。組成物の充
填口の周囲組織に架橋剤の影響を強く及ぼさないためには、架橋剤の使用量を過剰になら
ないよう調節する。２価以上の金属イオンの使用量としては、アルギン酸の１価金属塩を
含有する組成物の表面を固めることができる量であれば、特に限定されない。しかし、例
えば、１００ｍＭのＣａＣｌ2溶液を用いる場合には、椎間板の表面の充填口が直径１ｍ
ｍ程度の場合には、ＣａＣｌ2溶液の使用量は０．３ｍｌ～５．０ｍｌ程度であることが
好ましく、より好ましくは０．５ｍｌ～３．０ｍｌ程度である。椎間板表面の充填口が椎
間板ヘルニア摘出時にメス等により作製され、辺縁が５ｍｍ×１０ｍｍ程度の場合には、
１００ｍＭのＣａＣｌ２溶液の使用量は、０．３ｍｌ～１０ｍｌ程度であることが好まし
く、より好ましくは、０．５ｍｌ～６．０ｍｌ程度である。適用部位における本発明の組
成物の状態を見ながら、適宜増減できる。
架橋剤にカルシウムが含まれる場合、カルシウムの濃度が高い方が、ゲル化が早く、ま
た、より硬いゲルを形成することができることが知られている。しかし、カルシウムには
細胞毒性があるため、濃度が高すぎると、本発明の組成物の椎間板の髄核再生作用に悪影
響を及ぼす恐れもある。そこで、アルギン酸の１価金属塩を含有する組成物の表面を固め
るのに、例えばＣａＣｌ2溶液を用いる場合には、好ましくは、２５ｍＭ～２００ｍＭ、
より好ましくは、５０ｍＭ～１５０ｍＭの濃度とするのが望ましい。
本発明においては、好ましくは、組成物に架橋剤を添加後、一定時間静置した後に、添
加した部位に残存する架橋剤を洗浄などにより除去することが望ましい。静置する一定時
間は特に限定されないが、好ましくは、約１分間以上、より好ましくは約４分間以上静置
して組成物の表面をゲル化させることが望ましい。あるいは、約１分～約１０分間、より
好ましくは約４分～約１０分間、約４分間～約７分間、さらに好ましくは約５分間静置す
ることが好ましい。この一定時間の間は、組成物と架橋剤とを接触させた状態にすること
が望ましく、組成物の液面が乾かないように、架橋剤を適宜追加してもよい。
例えば、アルギン酸ナトリウム溶液をＣａＣｌ2溶液中に滴下し、ゲル化して作成した
ものにアルギン酸ビーズがある。しかし、アルギン酸ビーズは、適用部位に押し付けて適
用する必要があるが、適用部位の大きさにあったものを作成する必要があり、実際の臨床
で使うには、技術的に困難である。また、ＣａＣｌ2溶液を架橋剤として用いた場合、ビ
ーズ表面のＣａイオンが周囲組織に接触するため、カルシウムの細胞毒性の問題もある。
これに対して、本発明の組成物は、溶液状であるから、いずれの形状の適用部位へも容易
に適用することができるし、適用部位の全体を本組成物で覆うことができ、周囲組織への
密着性も良い。本発明の組成物の周囲組織に接触する部分は、カルシウム濃度を低く保つ
ことが可能であり、カルシウムの細胞毒性の問題も少ない。本発明の組成物の周囲組織に
接触する部分は、架橋剤の影響が少ないから、本発明の組成物は、容易に適用部位の細胞
や組織にコンタクトできる。好ましくは、本発明の組成物は、髄核部位に適用した後、約
４週間も経過すれば、適用した部位において識別できなくなるほど生体の組織と融合し、
生体への親和性も高い。
本発明の組成物を髄核部位に適用する際に、架橋剤により一部分をゲル化させると、本
発明の組成物は患部で一部分が硬化し、周囲組織に密着した状態で局在し、髄核部位から
の漏出を防ぐことができる。加えて、本発明の組成物が周囲組織に密着することにより、
本発明の組成物の髄核再生効果がより強力に発揮される。
本発明の実施例において、比較例として、髄核部位へ充填した補填材全体をゲル化させ
硬化させた場合には、椎間板に頭尾側から圧縮力をかけると椎間板表面の組成物充填口か
ら硬化ゲルが逸脱する現象がみられた。一方、本発明の溶液状の組成物を髄核部位に充填
した場合には、頭尾側から圧縮力をかけた場合にも椎間板表面の充填口からの逸脱はなか
った。すなわち、実際に本発明の組成物により髄核補填を行った場合、椎間板に対する上
下からの圧力に対しても、補填した組成物が漏れ出る恐れが低いといえる。
また、硬化したゲルを髄核部位へ充填する場合には、硬化したゲルが脊柱管内に突出し
、重大な神経障害を引き起こす危険性がある。一方、本発明の溶液状の組成物は、そのよ
うな危険性は低く、合併症発症の危険が低い。
８．本発明の組成物の適用
本発明の組成物は、ヒト、またはヒト以外の生物、例えば、トリおよび非ヒト哺乳動物
（例えば、ウシ、サル、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ブタ、イヌ、
ウサギ、ヒツジ、およびウマ）の椎間板の髄核部位に適用し、髄核の再生を促進するため
に用いられる。
本発明の組成物の形態は、好ましくは流動性のある液体状、すなわち、溶液状である。
本発明において「流動性を有する」とは、その形態を不定形に変化させる性質を持つこと
を意味し、例えば溶液のように、常に流れ動く性質を持つことを必要としない。好ましく
は、例えば、組成物をシリンジなどに封入し、椎間板の髄核部位へ注入することができる
ような流動性を有することが望ましい。また、本発明のいくつかの態様の１つでは、組成
物を２０℃で１時間静置した後に、１４Ｇ～２６Ｇの注射針をつけたシリンジで椎間板の
髄核部位へ注入できるような流動性を有することが望ましく、さらに好ましくは２１Ｇの
注射針で注入できることが望ましい。本発明の組成物が凍結乾燥体などの乾燥状態で提供
される場合には、適用時に溶媒などを用いて上述のような流動性のある組成物とすること
ができる。
溶液状である本発明の組成物は、シリンジ、ゲル用ピペット、専用注射器、専用注入器
、充填器具などで椎間板の髄核部位に容易に適用することができる。
本発明の組成物の粘度が高い場合には、シリンジで適用するのが困難になるため、加圧型
や電動型などのシリンジを用いてもよい。シリンジなどを使用しなくても、例えば、へら
、棒などで髄核部位の欠損部へ適用してもよい。シリンジで注入する場合、例えば、１４
Ｇ～２７Ｇまたは１４Ｇ～２６Ｇの針を使用するのが好ましい。
本発明の組成物の髄核部位への適用方法は、特に限定されないが、好ましくは、公知の
外科的手法により患部を直視下に露出した後に、あるいは、顕微鏡下又は内視鏡下で、シ
リンジ、充填器具等を用いて、本発明の組成物を髄核部位に適用することができる。好ま
しい態様の一つでは、例えば、線維輪表面から髄核部位へ向かって充填器具の針などを挿
入し、本発明の組成物を適用してもよい。
本発明の組成物は溶液状であるため、髄核の縮小、髄核部位の空洞や欠損部など、いず
れの形状の髄核部位にも適合することができ、髄核の縮小、空洞または欠損部の全体を充
填することもできる。髄核の縮小、髄核部位の空洞や欠損部は、椎間板の変性または損傷
により生じたものであり得るし、あるいは、外科的手術で髄核の少なくとも一部を除去ま
たは吸引することにより生じたものでもあり得る。好ましくは、髄核の少なくとも一部を
除去することで形成した髄核欠損部に、本発明の組成物を適用することが望ましい。
髄核の少なくとも一部の除去は、特に限定されず、例えば、直視下、経皮的、顕微鏡視
下、又は内視鏡的に行われる椎間板髄核摘出術等であってもよい。また例えば、背中に２
ｃｍ～１０ｃｍの切開を加え、筋肉を椎弓という脊椎の後方要素後面から剥離し、椎弓間
の靭帯を切除し、神経と椎間板ヘルニアを確認し、神経を圧迫しているヘルニアを摘出す
る方法（ラブ法）であってもよい。また、髄核にレーザーを照射し、髄核の容量を減少さ
せる方法であってもよい。
本発明の組成物の髄核部位への適用後は、前術のとおり、架橋剤により組成物の一部を
硬化させることができる。
本発明の組成物の適用量は、適用する対象の髄核の適用部位の容積に応じて決めれば良
く、特に限定されないが、例えば、０．０１ｍｌ～１０ｍｌ、より好ましくは、０．１ｍ
ｌ～５ｍｌであり、さらに好ましくは０．２ｍｌ～３ｍｌである。本発明の組成物を髄核
欠損部に適用する場合は、髄核部位の欠損部容積を十分に満たすように注入されるのが望
ましい。
本発明の組成物の適用回数・頻度は、症状と効果に応じて増減可能である。例えば、１
回のみの適用であってもよいし、１月～１年に１回の適用を継続して行ってもよい。
アルギン酸は動物の体内に元来存在しない物質であるため、動物はアルギン酸を特異的に
分解する酵素を保有していない。アルギン酸は動物体内においては、通常の加水分解によ
り徐々に分解されるが、ヒアルロン酸等のポリマーに比べ体内の分解が緩やかであり、ま
た髄核内には血管が存在しないため、髄核内に充填した場合、長期間の効果持続が期待で
きる。
本発明の組成物が、前述のような細胞や成長因子とともに提供されない場合でも、本発
明の組成物が髄核部位へ適用される際に、前述の細胞や成長因子、細胞死抑制因子、後述
の他の薬剤などが併用して用いられてもよい。
本発明の組成物は、髄核部位へ適用することにより、椎間板組織全体及び髄核の変性変
化を抑制し、再生を促進する効果を発揮する。そのため、本発明の組成物は、椎間板の髄
核補填用組成物として好ましく用いられる。
本発明の組成物の好ましい態様の１つは、椎間板の変性抑制のための組成物、より好ま
しくは、椎間板髄核の変性抑制のための組成物である。「椎間板又は髄核の変性」とは、
加齢などにより椎間板の細胞数、水分含有量、細胞外マトリックス（タイプＩＩコラーゲ
ン、アグリカン等）等が低下して形態的な変化が生じ、機能低下をきたす状態をいい、進
行すると椎間板のショック吸収体としての機能が果たせなくなる。本明細書において「変
性の抑制」は、未処置の場合と比較して、変性変化が抑制されていればよく、必ずしも変
性のない状態にすることを意味するものではない。
本発明の組成物の態様の１つは、髄核再生のための組成物である。髄核再生とは、線維
芽様細胞の集積を防ぎ、髄核細胞の比率が高い髄核が再生されることを目的とするもので
あり、ＩＩ型コラーゲンやプロテオグリカンに富む髄核組織が再生されることを意図する
ものである。この髄核再生の語には、髄核の変性を抑制することも包含される。本発明の
好ましい態様のひとつは、本発明の組成物を適用して再生された髄核の組成が、天然の正
常な髄核の組成に近いことが望ましい。
また、本発明の好ましい態様の組成物は、椎間板変性および／または椎間板損傷の治療
、予防または再発抑制のために用いられる。本明細書において「治療、予防または再発抑
制」は、治療、予防、再発抑制、低減、抑制、改善、除去、発症率の減少、発症時期の遅
延、進行抑制、重症度の軽減、再発率の低下、再発時期の遅延、臨床症状の緩和等を含む
。
これらの本発明の組成物の好ましい態様、組成物の使用方法等は、前記の記載に従う。
椎間板変性および／または椎間板損傷は、例えば、椎間板ヘルニア、椎間板症、脊椎変
性辷り症、化膿性椎間板炎、変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、椎間板損傷からなる群から選
択される少なくとも１種の状態または疾患である。
９．治療方法
本発明は、前記本発明の組成物を用いる、椎間板変性および／または椎間板損傷の治療
、予防または再発抑制のための方法を提供する。好ましくは、本発明の治療方法は、椎間
板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制のための方法であって、低
エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含有し、流動性を有する組成物を、前記治療、
予防または再発抑制を必要とする対象の椎間板の髄核部位に適用し、適用した前記組成物
の一部分を硬化することを含む。
本発明の治療方法は、本発明の組成物を髄核部位へ適用する前に、髄核の少なくとも一
部を除去する工程を含んでもよい。
前記椎間板変性および／または椎間板損傷は、例えば、椎間板ヘルニア、椎間板症、脊
椎変性辷り症、化膿性椎間板炎、変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、椎間板損傷からなる群か
ら選択される少なくとも１種の状態または疾患である。本発明のいくつかの態様の治療方
法では、前記椎間板変性および／または椎間板損傷は、椎間板ヘルニアであり、特には、
腰椎椎間板ヘルニアである。
また、本発明のいくつかの態様の１つでは、前記本発明の組成物を用いる、椎間板の変
性変化を抑制する方法を提供する。また、本発明の好ましい態様の１つでは、前記本発明
の組成物を用いる、椎間板の髄核を再生する方法を提供する。
これらの方法は、エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含有し、流動性を有する組
成物を、椎間板変性抑制または髄核再生を必要とする対象の椎間板の髄核部位に適用し、
適用した組成物の一部を硬化することを含む。前記の方法は、本発明の組成物を髄核部位
へ適用する前に、髄核の少なくとも一部を除去する工程を含んでもよい。
本発明の組成物の好ましい態様、具体的な椎間板の髄核部位への適用方法、組成物の硬
化方法、用語の意義等は、前述のとおりである。他の椎間板の治療方法や治療薬を適宜組
み合せて本発明の治療方法を行ってもよい。
また、髄核部位に本発明の組成物を適用する前に、あるいは同時に、あるいは後で、ス
トレプトマイシン、ペニシリン、トブラマイシン、アミカシン、ゲンタマイシン、ネオマ
イシン、およびアンホテリシンＢ等の抗生物質、アスピリン、非ステロイド性解熱鎮痛剤
（NSAIDｓ）、アセトアミノフェン等の抗炎症薬、タンパク分解酵素、副腎皮質ステロイ
ド薬、シンバスタチン、ロバスタチン等のＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素阻害剤等の併用薬を充
填するようにしても良い。これらの薬剤は本発明の組成物に混入して用いてもよい。また
は、経口あるいは非経口で併用して投与されてもよい。その他、筋弛緩薬、オピオイド鎮
痛薬、神経性疼痛緩和薬等が必要に応じて経口あるいは非経口で併用して投与されてもよ
い。
また、本発明のいくつかの態様では、本発明の組成物とともに、前述の細胞を髄核部位
に適用してもよい。あるいは、本発明のいくつかの態様では、本発明の組成物とともに、
前述の細胞の成長を促進する因子を髄核部位に適用してもよい。なお、本発明の別の態様
では、本発明の組成物が前述の細胞を併用しない態様も望ましい。また、本発明の組成物
が細胞の成長を促進する因子を併用しない態様も望ましい。本発明の組成物は、これらの
細胞や因子を用いない場合でも、髄核の再生を促すことができる。
本発明は、本発明の組成物を製造するための低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩
の使用にも関する。
本発明の使用は、椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制の
ための組成物を製造するための低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩の使用であって
、前記組成物が、対象の髄核部位に適用し、適用後に一部分を硬化するように用いられ、
髄核部位への適用時に流動性を有する。
本発明は、さらに、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含有し、流動性を有す
る組成物を、椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制を必要と
する対象の椎間板の髄核部位に適用し、適用した組成物の一部を硬化する、椎間板変性お
よび／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制において使用されるための低エンド
トキシンアルギン酸の１価の金属塩を提供する。
１０．凍結乾燥製剤、キット
本発明は、椎間板の髄核補填用キットを提供する。
本発明のキットには、本発明の組成物を含めることができる。本発明のキットに含める
本発明の組成物は、溶液状態または乾燥状態であるが、好ましくは、乾燥状態であり、よ
り好ましくは、凍結乾燥体であり、特に好ましくは、凍結乾燥粉体である。また、本発明
の組成物が乾燥状態のときは溶解用の溶媒（例えば、注射用水）を含むことが望ましい。
本発明のキットは、さらに、架橋剤を含んでいてよい。
本発明のキットは、さらに、架橋剤、シリンジ、注射針、ゲル用ピペット、専用充填器
、取り扱い説明書等を含めることができる。
キットとして好適な具体例としては、（１）低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムの
凍結乾燥体を封入したバイアル（２）溶解液として注射用水などの溶媒を封入したアンプ
ル（３）架橋剤として塩化カルシウム溶液など２価以上の金属イオン化合物を封入したア
ンプル等を一つのパックに入れたキットとすることができる。また別の例としては、一体
成型され、隔壁により仕切られた二つの部屋からなるシリンジの１室にアルギン酸の１価
金属塩を封入し、他方の部屋に溶解液としての溶媒、または架橋剤を含む溶液を封入し、
両部屋の隔壁を用時容易に開通できるよう構成し、用時両者を混合・溶解して用いること
のできるキットとする。他の例としては、アルギン酸の１価金属塩溶液をプレフィルドシ
リンジに封入し、使用時に調製操作なくそのまま充填できるキットとする。他の例として
は、アルギン酸溶液と架橋剤を別々のシリンジに封入し、一つのパックに同梱したキット
とする。あるいは、アルギン酸の１価金属塩溶液を充填したバイアルと架橋剤を封入した
アンプル等を含むキットとしてもよい。「本発明の組成物」、「架橋剤」、「シリンジ」
などについては、前記で説明した通りである。
本キットは、例えば、本発明の治療方法に用いることができる。
なお、本明細書に記載した全ての文献および刊行物は、その目的にかかわらず参照によ
りその全体を本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、本願の優先権主張の基
礎となる日本国特許出願である特願2016-058396 (2016年3月23日出願)の特許請求の範囲
、明細書、および図面の開示内容を包含する。
以下の実施例により本発明を更に詳述するが、本発明はこれらの実施例に限定して理解
されるべきではない。
実施例１：ヒト椎間板細胞に対する低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムの効果

１－（１）非変性ヒト椎間板細胞の単離・培養
ヒト非変性椎間板組織から髄核組織を取り出し、０．２５％コラゲナーゼ（Wako）を含
むＤＭＥＭ（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）培地で３７℃、４時間処理し、髄
核細胞を単離した。得られた髄核細胞を１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１．２５
μｇ／ｍｌ ファンギゾン（fungizone，Invitrogen）、１０％ＦＢＳ（fetal bovine ser
um）を含むＤＭＥＭを培養液として３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２の条件下で培養し、
２継代の細胞を実験で使用した。
１－（２）アルギン酸ビーズの作製、培養
下記表１に示す（Ａ）低エンドトキシン処理されたアルギン酸ナトリウムと、（Ｂ）食
品グレード（commercial grade）のアルギン酸ナトリウム（和光純薬工業（株）、１９９
－０９９６１）の２種類のアルギン酸ナトリウム（持田製薬（株））とをそれぞれ用いて
、ヒト髄核細胞を培養し、比較を行った。
ミリＱ水を用いて、２ｗ／ｖ ％濃度のアルギン酸ナトリウム溶液をそれぞれ作製した
。上記（１）で得られたヒト髄核細胞４．０×１０６cellsを、これらのアルギン酸ナト
リウム溶液１．０ｍｌにそれぞれ懸濁した。この細胞懸濁液を、２２ゲージ針を用いて１
０２ｍＭ塩化カルシウム水溶液に滴下し１０分間放置することにより、髄核細胞含有アル
ギン酸ナトリウム溶液を内包するビーズを作製した。
得られたビーズは０．９％生理食塩水で２回洗浄後、１％ペニシリン／ストレプトマイ
シン、１．２５μｇ／ｍｌ ファンギゾン、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培養液中に入れ
て、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２の条件下で３次元（３Ｄ）培養した。培養開始後４
８時間、７日、１４日、および２８日後に細胞を回収し、以下の評価に用いた。
１－（３）生細胞率の評価
培養開始から４８時間、７日、１４日、および２８日後にビーズを回収し、４℃の５５
ｍＭクエン酸ナトリウム水溶液中にビーズを２０分間浸すことでビーズを溶解し、遠心分
離により細胞を回収した。５μＭのＣａｌｃｅｉｎ ＡＭと１．５μＭのｐｒｏｐｉｄｉ
ｕｍ ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）により、得られた細胞を染色し、共焦点レーザー顕微鏡（オ
リンパス、FV300）で観察した。Ｃａｌｃｅｉｎ ＡＭ陽性細胞を生細胞、ＰＩ陽性細胞を
死細胞とし、ＩｍａｇｅＪ（National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA）を用
いて、生細胞率を算定した。細胞を回収した各時点においてｎ＝５とした。
本明細書の実施例における統計分析は、結果を平均値±標準偏差（mean±SD）で示した
。２群間比較には、Student’s t-test、多群間比較にはSteel-Dwass-testを用いた。ｐ
＜０．０５を統計学的有意とした。
その結果、Ａ群（低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム）およびＢ群（食品グレード
アルギン酸ナトリウム）は、培養開始４８時間後、７日、１４日、および２８日後のいず
れの時点においても、生細胞率は約９０％程度であり、両群間で生細胞率に差は見られな
かった。
１－（４）アポトーシス細胞の評価
１－（３）と同様に、培養開始から４８時間、７日、１４日、および２８日後にそれぞ
れビーズを回収し、ビーズをＰＢＳで２回洗浄後細胞を回収し、３．６×１０５個の細胞
をAnnexin V-fluorescein isothiocyanate(FITC) Apoptosis Detection Kit II（BD Bios
ciences, San Jose, CA, USA）によりラベリングし、フローサイトメーター（FACS Cant;
BD biosciences, CA, USA）を用いてアポトーシス細胞を計測した。FITC＋／PI－を早期
アポトーシス細胞、FITC＋／PI＋を後期アポトーシス細胞とし、これらを合わせてアポト
ーシス細胞とした。また、FITC－／PI－を生細胞として、全細胞に対する生細胞の比率、
および、全細胞に対するアポトーシス細胞の比率を評価した。細胞を回収した各時点にお
いてｎ＝５とした。
その結果、Ａ群（低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム）およびＢ群（食品グレード
アルギン酸ナトリウム）は、培養開始４８時間後、７日、１４日、および２８日後のいず
れの時点においても、生細胞率は約９０％程度、アポトーシス細胞の比率は約１０％程度
であり、両群間に差は見られなかった。
１－（５）血清飢餓誘導下における細胞の評価
ヒト椎間板内は無血管領域であり低栄養の環境下にあるため、椎間板内の環境を想定し
た血清飢餓下で細胞培養試験を実施し、評価した。
１－（２）の３Ｄ培養７日目にビーズを回収し、ＰＢＳを用いてビーズを２回洗浄した
。血清を含まないＤＭＥＭ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１．２５μｇ／ｍｌ
ファンギゾン培地にビーズを添加し、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２の条件でインキ
ュベートを行い、血清飢餓を誘導した。血清飢餓開始後６時間後、４８時間後にそれぞれ
細胞を回収した。前記と同様に、共焦点レーザー顕微鏡を用いた評価、および、フローサ
イトメーターを用いた評価を行った。
その結果、血清飢餓条件下での共焦点レーザー顕微鏡を用いた評価では、Ａ群（低エン
ドトキシンアルギン酸ナトリウム）およびＢ群（食品グレードアルギン酸ナトリウム）に
おける生細胞率は、６時間後、４８時間後とも、両群間に有意な差はみられなかったが、
４８時間後では、Ａ群（低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム）はＢ群（食品グレード
アルギン酸ナトリウム）と比較して生細胞率が高い傾向がみられた。
また、フローサイトメーターを用いた評価では、６時間後のサンプルは両群間に差は見
られなかったが、４８時間後では、Ａ群（低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム）はＢ
群（食品グレードアルギン酸ナトリウム）と比較して生細胞率が有意に高く、かつ、アポ
トーシス細胞率が有意に低かった（図１および図２）。
本試験の血清飢餓の誘導は、無血管野で低栄養の環境下にあるヒト椎間板髄核の環境を
想定した試験である。低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムを用いた髄核細胞の培養は
、食品グレードアルギン酸ナトリウムを用いた場合と比較して、血清飢餓誘導下における
アポトーシスに対して抵抗性が高いことが示唆された。すなわち、低エンドトキシンアル
ギン酸ナトリウムは、食品グレードアルギン酸ナトリウムと比較して、椎間板の髄核部位
へ充填したとき、髄核細胞のアポトーシスを誘導せず、細胞生存率を保持することが示唆
された。
実施例２：ウサギ椎間板髄核欠損モデルへの低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム溶液
の適用

ウサギ椎間板髄核欠損モデルに対して、２種類の低エンドトキシンアルギン酸ナトリウ
ム溶液をそれぞれ充填し、効果を評価した。
２－（１）ウサギ椎間板髄核欠損モデルの作製
体重３．２～３．５ｋｇの日本白色家兎に対し、ペントバルビタールによる静脈麻酔と
１％キシロカインの局所麻酔を行い、１８Ｇ針を用いて椎間板の髄核組織を吸引し、椎間
板髄核欠損モデルを作製した。Ｌ２／３、および、Ｌ４／５椎間板髄核に対し吸引を行い
、椎間板欠損モデルとし、Ｌ３／４は吸引を行わず、正常椎間板とした（正常コントロー
ル群）。
２－（２）低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム溶液の充填
低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムは、次の２種類を用いた。いずれもエンドトキ
シン含量は、５０ｇ／ＥＵ未満であった。各低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムの見
掛け粘度及び重量平均分子量は表２のとおりである。アルギン酸ナトリウムの見掛け粘度
測定は、日本薬局方（第１６版）の粘度測定法に従い、回転粘度計法（コーンプレート型
回転粘度計）を用いて測定した。具体的な測定条件は以下のとおりである。試料溶液の調
製は、MilliQ水を用いて行った。測定機器は、コーンプレート型回転粘度計（粘度粘弾性
測定装置レオストレスRS600（Thermo Haake GmbH）センサー：３５／１）を用いた。回転
数は、１ｗ／ｗ％アルギン酸ナトリウム溶液測定時は１ｒｐｍ、２ｗ／ｗ％アルギン酸ナ
トリウム溶液測定時は０．５ｒｐｍとした。読み取り時間は、１ｗ／ｗ％溶液測定時は、
２分間測定し、開始１分から２分までの平均値とし、２ｗ／ｗ％溶液測定時は、２．５分
間測定し、開始０．５分から２．５分までの平均値とした。３回の測定の平均値を測定値
とした。測定温度は２０℃とした。
また、各アルギン酸ナトリウムの重量平均分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（Ｇ
ＰＣ）と、ＧＰＣ－ＭＡＬＳの２種類の測定法で測定した。測定条件は以下のとおりであ
る。
［前処理方法］
試料に溶離液を加え溶解後、０．４５μｍメンブランフィルターろ過したものを測定溶
液とした。
（１）ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）測定
［測定条件（相対分子量分布測定）］
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＧＭＰＷ－ＸＬ×２＋Ｇ２５００ＰＷ－ＸＬ（７．８ｍｍ Ｉ
．Ｄ．×３００ｍｍ×３本）
溶離液：２００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液
流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
濃度：０．０５％
検出器：ＲＩ検出器
カラム温度：４０℃
注入量：２００μＬ
分子量標準：標準プルラン、グルコース
（２）ＧＰＣ－ＭＡＬＳ測定
［屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）測定（測定条件）］
示唆屈折率計：Ｏｐｔｉｌａｂ Ｔ－ｒＥＸ
測定波長：６５８ｎｍ
測定温度：４０℃
溶媒：２００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液
試料濃度：０．５～２．５ｍｇ／ｍＬ（５濃度）
［測定条件（絶対分子量分布測定）］
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＧＭＰＷ－ＸＬ×２＋Ｇ２５００ＰＷ－ＸＬ（７．８ｍｍ Ｉ
．Ｄ．×３００ｍｍ×３本）
溶離液：２００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液
流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
濃度：０．０５％
検出器：ＲＩ検出器、光散乱検出器（ＭＡＬＳ）
カラム温度：４０℃
注入量：２００μＬ
各低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムをミリＱ水で溶解して２ｗ／ｖ％溶液を調製
した。
椎間板の側面から髄核へ向かって注射針を挿入し、低エンドトキシンアルギン酸ナトリ
ウム溶液２０μｌを髄核欠損部へ注入した。注射針を抜いた椎間板の側面に、１０２ｍＭ
塩化カルシウム水溶液を数秒かけた（それぞれＡ－１群、Ａ－２群といい、これらを合わ
せて治療群という）。
髄核吸引のみを行った群を吸引単独群とした（吸引単独群）。
術後４週にペントバルビタールを過量充填し安楽死させ腰椎を切除し、椎間板組織を回
収した。Ａ－２群は、術後１２週についても評価した。各群８例ずつ実施した。
２－（３）ＭＲＩ，Ｐｆｉｒｒｍａｎｎ分類による椎間板組織の評価
7.0-Tesla MR scanner (Unity Inova, Varian)により、椎間板のＴ２強調矢状断像を撮
影した。椎間板のＴ２強調ＭＲＩ画像により、椎間板の変性による変化が確認できる。椎
間板変性の重症度を評価するため、Ｐｆｉｒｒｍａｎｎ分類を用いてスコア化した。本分
類は、ＭＲＩにおける椎間板変性を５段階で評価した指標である（グレード１：正常～グ
レード５：高度に変性）。椎間板変性の評価基準を表３に示す（Spine (Phila Pa 1976).
2001;26(17) 1873-8）。
その結果、椎間板変性の重症度をスコア化したＰｆｉｒｒｍａｎｎ分類では、術後４週
において、吸引単独群および治療群（Ａ－１群およびＡ－２群）は、正常コントロール群
と比較して、有意にスコアが高値であり椎間板変性を示す所見であった。また、Ａ－１群
は、吸引単独群と比較してスコアが有意に低く、変性が抑制されていた。Ａ－２群と吸引
単独群では、スコアに有意な差は見られなかったが、Ａ－２群は吸引単独群に比較してス
コアが低値である傾向がみられた（図３）。
Ａ－２群についての術後１２週の評価では、Ａ－２群のスコアは、吸引単独群と比較し
て、有意に低値を示した。
２－（４）ＭＲＩ ｉｎｄｅｘによる椎間板組織の評価
Analyze 10.0 software (AnalyzeDirect, Overland Park, KS, USA)を用いて、矢状断
におけるMRI index（髄核の平均信号強度と髄核面積の積）を測定し定量的に評価した。
正常コントロール群の椎間板のMRI indexを１００としたときの、各群におけるMRI index
の割合で評価した（Spine (Phila Pa 1976). 2005 Jan 1;30(1):15-24.参照）。
その結果、術後４週において、治療群（Ａ－１群およびＡ－２群）のＭＲＩ ｉｎｄｅ
ｘは、吸引単独群と比較して有意に高値であり、変性変化が抑制されていた（図４）。
Ａ－２群についての術後１２週の評価においても、Ａ－２群のＭＲＩ ｉｎｄｅｘは、
吸引単独群と比較して有意に高値であった。
２－（５）組織学的評価
ＭＲＩ撮像後に椎間板の組織標本を作製した。１０％ホルムアルデヒドでサンプルを固
定、１０％ＥＤＴＡ（pH7.5）で脱灰処理し、パラフィンに包埋した。矢状断５μｍ厚の
パラフィン切片をキシレンにより脱パラフィンし、アルコール処理、水洗いした後、ＨＥ
染色、サフラニン－Ｏ染色を施した。線維輪における変性変化の分類であるＮｉｓｈｉｍ
ｕｒａらの分類（Spine (Phila Pa 1976). 1998;23(14):1531-8）を用いて、椎間板組織
全体における変性度をスコア化した。Ｎｉｓｈｉｍｕｒａらの分類は以下のとおりである
。
グレード１：破裂を伴い低度に湾曲（mildly serpentine with rupture）
グレード２：破裂を伴い中程度に湾曲（moderately serpentine with rupture）
グレード３：低度に逆転を伴い高度に湾曲（severely serpentine with mildly reversed
）
グレード４：高度に逆転した形状（severely reversed contour）
グレード５：不明瞭（indistinct）
椎間板変性の重症度を組織学的に評価した結果、術後４週の時点において、吸引単独群
、および、治療群（Ａ－１群およびＡ－２群）は、正常コントロール群と比較して、Nish
imuraらの分類によるスコアが有意に高値を示し、変性を示唆する所見であった。しかし
、治療群（Ａ－１群およびＡ－２群）は、吸引単独群と比較して、スコアが有意に低く、
変性が抑制されていた（図５）。
Ａ－２群についての術後１２週の評価においても、Ａ－２群は、吸引単独群と比較して
スコアが有意に低かった。正常コントロール群、吸引単独群、およびＡ－２群の術後４週
と１２週の組織標本の写真を示す（図６）。
２－（６）免疫組織学的評価
２－（５）で作製した組織標本に対して、抗Type I collagen抗体および抗type II col
lagen抗体を用いて免疫組織学的染色を行い、椎間板髄核において無作為に選択した５視
野において陽性細胞数を計測した。
その結果、切片中の細胞数に対する抗Type I collagen抗体陽性細胞率は、術後４週の
時点において、正常コントロール群、吸引単独群、および治療群（Ａ－１群およびＡ－２
群）の間で差はみられなかった。
一方、抗type II collagen抗体陽性細胞率は、術後４週の時点において、正常コントロ
ール群と比較して、吸引単独群および治療群（Ａ－１群およびＡ－２群）ともに有意に低
値を示し、正常椎間板組織にみられる細胞外器質産生が低下していた。しかし、治療群（
Ａ－１群およびＡ－２群）は、吸引単独群と比較して、抗type II collagen抗体陽性細胞
率が有意に高値であった。
Ａ－２群についての術後１２週の評価では、Ａ－２群の抗type II collagen抗体陽性細
胞率は、吸引単独群と比較して有意に高く、かつ、正常コントロール群との差がみられな
くなった。術後４週と１２週における正常コントロール群、吸引単独群、およびＡ－２群
の椎間板髄核組織切片中の細胞数に対する抗type II collagen抗体陽性細胞率のグラフを
図７に示す。Type II collagen抗体陽性細胞は、硝子軟骨様細胞の存在を示している。低
エンドトキシンアルギン酸ナトリウム溶液を用いることにより、ウサギ椎間板髄核におけ
る硝子軟骨様細胞の割合は、術後１２週時点で、正常コントロール群に匹敵する程度まで
回復していることが示された。
以上より、低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム溶液は、髄核欠損部へ充填すること
により、椎間板組織全体及び髄核の変性変化を抑制し、再生を促進することが明らかとな
った。また、低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムのＡ－１とＡ－２では、同程度の椎
間板変性抑制及び再生効果が認められた。
取扱性の観点からは、Ａ－２の２％溶液は、Ａ－１の２％溶液と比較して粘度が高いた
め、髄核部位への充填時に充填部から逆流しにくい、体液との判別がつきやすいなどの利
点を有していた。Ａ－２の２％溶液は、充填するのに粘度が適度であり、取扱性に優れる
ことが分かった。
実施例３：低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム溶液の注入方法の検討

３－（１）低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム溶液の注入方法の検討
次の２種類の注入方法（ｉ）（ii）により、低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム溶
液をヒツジ屍体（Ｃａｄａｖｅｒ）腰椎へ注入し、評価を行った。
（ｉ）実施例２の記載に従い、実施例２に記載のＡ－２の低エンドトキシンアルギン
酸ナトリウム２％溶液を椎間板髄核部分摘出部へ注入した後、椎間板表面の注射針の穴付
近に１００ｍＭ塩化カルシウム溶液を接触させる方法（アルギン酸ナトリウムは塩化カル
シウム溶液と接触した部分が硬化する）。
（ii）Ａ－２の低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム２％溶液と１００ｍＭ塩化カ
ルシウム溶液とを同時に１：１で椎間板髄核部分摘出部へ充填する手法（髄核部位へ注入
するアルギン酸ナトリウム全体が硬化する）。
（ii）は、低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム溶液と塩化カルシウム溶液
をそれぞれ別のシリンジに入れ、２２Ｇ針で椎間板髄核の欠損部に同時に注入することに
より実施した。
その結果、（ｉ）の手法は、ヒツジカダバーの椎間板で実施した場合、注入の手技に困
難性はなかった。一方、（ii）の手法は、低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム溶液と
塩化カルシウム溶液との混合割合を均一にすることに対する再現性が低いと考えられた。
また、充填の途中で一部がゲル化した場合、残りの空間も空隙なくゲルを充填させること
ができるか不確定であった。さらに、（ii）の手法により椎間板髄核部位に硬化ゲルを充
填後、椎間板に頭尾側から圧縮力をかけると、ゲルを注入した椎間板側面の穴から、硬化
したゲルが逸脱する現象がみられた。（ｉ）の手法では、椎間板外への逸脱は見られなか
った。
（ｉ）の方法は、（ii）の方法と比較して、椎間板内のカルシウム濃度を低減でき、細
胞毒性を軽減できるというメリットがある。また、（ii）の方法は、硬化したゲルが脊柱
管内に突出すると重大な神経障害を引き起こす危険性があるところ、（ｉ）の方法ではそ
のような危険性は低い。
以上より、（ｉ）の方法、すなわち、低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム溶液を椎
間板髄核部位へ注入した後に椎間板表面に塩化カルシウム溶液をかける手法が、低エンド
トキシンアルギン酸ナトリウムを用いた髄核補填に適した方法であると考えられた。
３－（２）ヒツジカダバーを用いた力学的試験
３－（１）において（ｉ）の手法で作製したヒツジカダバーの椎間板（Ａ－２の低エン
ドトキシンアルギン酸ナトリウム２％溶液を椎間板髄核部分摘出部へ注入後、椎間板表面
の注射針の穴付近に１００ｍＭ塩化カルシウム溶液を接触させたもの）について、充填か
ら約１時間後に、Instron5943（インストロン社）を用いて、椎間板に頭尾側から、－３
００Ｎ～３００Ｎの軸圧縮・伸張力で、１０００回繰り返し圧縮力および伸張力をかけて
、アルギン酸ナトリウム溶液を注入した穴からの逸脱がないかを観察した。このとき、ア
ルギン酸ナトリウム溶液は、視認性向上のために０．０５％トルイジンブルーで呈色した
ものを用いた。
その結果、注入口から椎間板外へのアルギン酸ナトリウム溶液の逸脱は見られなかった
。このことから、アルギン酸ナトリウム溶液を椎間板髄核へ注入後、椎間板表面の注入口
付近を架橋剤で硬化させる手法は、アルギン酸ナトリウム溶液の充填後の、体位の変更や
歩行などによる椎間板への圧縮力や伸張力にも耐えられる充填方法であることが示唆され
た。
実施例４：低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム溶液注入後の性状の検討

椎間板髄核に低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム溶液を注入後、椎間板表面のアル
ギン酸ナトリウム溶液注入口付近に塩化カルシウム溶液を接触させ、その接触部を硬化さ
せたとき、注入した低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム溶液が椎間板髄核内でどのよ
うな性状であるかを予測するため、in vitroで以下の検討を行った。
４－（１）試験方法
下記のＸ、Ｙ、Ｚの３種の方法で、ミクロ試験管（直径6mm、高さ25mm）にアルギン酸
ナトリウム溶液をそれぞれ入れて、試験管を横にして静置し、1時間後、24時間後、48時
間後、１週間後に、試験管内の被験物質の性状を評価した。実施例５のヒツジ椎間板髄核
摘出モデルにおいて、線維輪を5mm×3mmで切除して髄核摘出を行っているため、このin v
ivo試験に比較的サイズが近く、かつ、試験管内での操作が可能なサイズとして直径6mmの
ミクロ試験管を選択した。実施例２のＡ－２の低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムを
生理食塩水で溶解し、２ｗ／ｖ％溶液として用いた。試験は室温２０℃で行った。
４－（２）結果
試験に用いた２ｗ／ｖ％アルギン酸ナトリウム溶液は、生理食塩水と比較して粘度が高
く、バイアルを傾けると液面がゆっくり移動し、２１Ｇの注射針をつけたシリンジで時間
をかけて吸うことができた。
Ｘ群の性状は、１時間後から１週間後までほぼ同様であった。すなわち、試験管内のア
ルギン酸ナトリウム溶液の表面部分２～３ｍｍ程度はゲル状であったが、表面以外は固ま
りが観察されず、ゾル状であった。ゾル状の部分は、そのほとんどは２１Ｇの注射針をつ
けたシリンジで吸引することができたが、２ｗ／ｖ％アルギン酸ナトリウム溶液と比較し
て粘度が高く、吸引により時間を要した。
Ｙ群の性状は、１時間後から１週間後までほぼ同様であった。すなわち、試験管内の大
部分がゼリー状にゲル化しており、わずかに一部、水のような液体がみられた。ゲルが収
縮して液が分離して滲みだす「離漿」現象と推測された。ゲル化している部分は２１Ｇの
注射針をつけたシリンジで吸引することは不可能であった。
Ｚ群の性状は、１時間後から１週間後までほぼ同様であった。すなわち、直径５ｍｍほ
どの白く濁ったゲル化した塊が形成され、その他の部分は水のような液体となった。これ
も離漿現象と推測された。ゲル化している部分は２１Ｇの注射針をつけたシリンジで吸引
することは不可能であった。
以上、Ｘ群の方法が、本発明の実施例で行った椎間板髄核への注入方法を模した方法で
あって、アルギン酸ナトリウム溶液を椎間板髄核へ注入したときにもアルギン酸ナトリウ
ム溶液はゾル状で存在すると予測された。一方、Ｙ群およびＺ群は、ともにゲル状で存在
しており、本発明の実施例３で確認されたように、椎間板髄核にゲルを充填した後に頭尾
側から圧縮力をかけた場合、ゲルを注入した椎間板の側面から硬化したゲルが逸脱する可
能性が懸念された。
実施例５：ヒツジ椎間板髄核欠損モデルへの低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム溶液
の適用

ヒツジ椎間板髄核欠損モデルに対して、低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム溶液を
充填し、効果を評価した。体重４０ｋｇ～６０ｋｇのヒツジ（雄、サフォーク種）の７頭
の椎間板のＬ１／２、Ｌ２／３、Ｌ３／４、及びＬ４／５を用いて以下の評価を行った。
５－（１）ヒツジ椎間板髄核欠損モデルの作製
ヒツジに対して麻酔を行い、電気メスを用いて椎間板を露出した。椎間板の線維輪を５
ｍｍ×３ｍｍで切除、除去し、その穴から鉗子を挿入し髄核を０．１０ｇ除去し、椎間板
髄核欠損モデルを作製した。ここで、線維輪の切除の大きさ、及び、髄核摘出量は、事前
に、ヒツジ椎間板髄核摘出による椎間板変性試験を行い決定した。線維輪の切除の大きさ
は、５ｍｍ×３ｍｍ、及び１０ｍｍ×３ｍｍで検討し、髄核摘出量に応じて椎間板変性の
進行を認めた５ｍｍ×３ｍｍを選択した。髄核摘出量は、０．０２ｇ、０．０５ｇ、０．
１ｇ、及び０．２ｇの４種類で検討した。ヒツジ髄核摘出量０．１ｇは、ヒトに換算する
と１．２ｇとなり、最もヒト臨床での髄核摘出量に近いため、髄核摘出量は、０．１ｇを
選択した。
５－（２）低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム溶液の充填
実施例２のＡ－２の低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムをミリＱ水で２ｗ／ｖ％溶
液に調製し、その０．１０ｍｌをシリンジで、５－（１）で作製したヒツジ椎間板髄核欠
損部へ注入した。注入したアルギン酸ナトリウム溶液の表面に、１０２ｍＭ塩化カルシウ
ム水溶液を数秒かけた。約５分間放置した後、塩化カルシウム溶液をかけた部位を生理食
塩水で洗浄し、縫合した。これを治療群とした（ｎ＝１１）。また、５－（１）で椎間板
髄核摘出のみ行い縫合を行った群を髄核摘出群（ｎ＝１０）とした。無処置のヒツジ椎間
板を正常コントロール群（ｎ＝７）とした。
術後４週時にペントバルビタールを過量投与し安楽死させ、腰椎を切除し、椎間板組織
を回収した。
５－（３）組織学的評価
前記２－（５）の記載に準じて、ＨＥ染色、サフラニンＯ染色を施し、椎間板の組織標
本を作製した。Ｂｏｏｓ分類をもとに改変された分類（Eur Spine J. 2014 Jan; 23(1):1
9-26. Spine 2002 Vol.27, No.23 p.2631-2644）を用いて、椎間板の変性度を評価した。
分類を表５に示す。椎間板の項目は最大２０ポイント、椎体終板の項目は最大１６ポイン
トであり、合計を最大３６ポイントとして評価した。
椎間板変性の重症度を組織学的に評価した結果、術後４週の時点において、髄核摘出群
、および、治療群は、正常コントロール群と比較して、表５の分類によるスコアが有意に
高値を示し、変性を示唆する所見であった。しかし、治療群は、髄核摘出群と比較してス
コアが有意に低く、変性が抑制されていた（図８）。
また、椎間板高インデックス（Disc height index：DHI）により、椎間板の高さを評価
した。椎間板高インデックスは、椎間板高（前部、中央部および後部の椎間板の高さの平
均値）を、椎間板の前後の直径で除した値とした（Eur Spine J. 2014, 23(1):19-26.）
。
その結果、髄核摘出群の椎間板高インデックスは、正常コントロール群と比較して、有
意に低下していた。一方、治療群の椎間板高インデックスは、正常コントロール群と比較
して有意な差がみられなかった。このことから、低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム
溶液の髄核への充填により、髄核摘出による椎間板高の低下が抑制されたことが分かった
（図９）。
５－（４）免疫組織学的評価
前記５－（３）で作製した組織標本に対して、抗Type I collagen抗体および抗Type II
collagen抗体を用いて免疫組織学的染色を行い、椎間板髄核において無作為に選択した
５視野において陽性細胞数を計測した。
その結果、術後４週の時点において、切片中の細胞数に対する抗Type I collagen抗体
陽性細胞の割合は、正常コントロール群では１０％以下であるのに対し、髄核摘出群、お
よび、治療群では、有意に高値を示した。しかし、治療群では、髄核摘出群と比較して、
抗Type I collagen抗体陽性細胞の割合は有意に低かった。
また、術後４週の時点において、切片中の細胞数に対する抗Type II collagen抗体陽性
細胞の割合は、正常コントロール群および治療群では、いずれも約６０％程度を示し、差
がみられなかった。一方、髄核摘出群では約４０％程度を示し、正常コントロール群と比
較して、また治療群と比較して、それぞれ有意な差がみられた（図１０）。髄核摘出のみ
では、抗Type II collagen抗体陽性細胞の割合は正常と比較して低下を示すが、低エンド
トキシンアルギン酸ナトリウム溶液を充填することにより、術後４週時には正常コントロ
ール群に匹敵する程度まで回復することが示された。
以上の結果から、低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム溶液の髄核への適用は、椎間
板髄核の変性を抑制し、再生を促進することが示された。実施例３の力学的試験の結果も
合わせて考えると、本発明の組成物は、特に、椎間板髄核摘出術後の髄核の補填に好まし
く用いることができる。また、治療群では髄核摘出による椎間板高インデックスの低下が
抑制されたこと等から、治療した椎間板に隣接する椎間板についても、その変性を予防お
よび／または軽減する可能性が示唆された。
実施例６： ヒツジ椎間板髄核の組成の検討

椎間板の髄核の細胞外マトリックスの主成分は、水分、タイプ II コラーゲン、プロテ
オグリカンであり、椎間板終板や関節軟骨など他の軟骨組織と比較して、コラーゲンに対
するプロテオグリカンの割合が高いといわれている。このコラーゲンに対するプロテオグ
リカンの比を、ヒドロキシプロリン（Hydroxyproline: HYP）に対する硫酸化グリコサミ
ノグリカン（sulfated glycosaminoglycans: GAG）の比でみた文献が存在する（European
Cells and Materials Vol.8. 2004 p.58-64）。
ヒツジ椎間板髄核欠損モデルに対して、低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム溶液を
充填し、術後４週時に、上記文献に準じて髄核組織の生化学的分析を行い、評価を行った
。
６－（１）方法
体重３５ｋｇ～６０ｋｇのヒツジ（雄、サフォーク種）の２頭の椎間板のＬ１／２、Ｌ
２／３、Ｌ３／４、および、Ｌ４／５を試験に用いた。実施例５に準じて、ヒツジ椎間板
髄核欠損モデルを作製し、２ｗ／ｖ％低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム溶液を充填
し、治療群とした（ｎ＝４）。実施例５に準じて、椎間板髄核摘出のみ行い縫合を行った
群を髄核摘出群とした（ｎ＝４）。無処置のヒツジ椎間板（Ｔ１２／Ｌ１、Ｌ５／６）を
正常コントロール群とした（ｎ＝４）。術後４週時に椎間板髄核、および、無処置の大腿
骨左右の軟骨組織（関節軟骨）を回収し、検体の前処理をした後、硫酸化グリコサミノグ
リカン（GAG）およびヒドロキシプロリン（HYP）の測定を行った。
検体の前処理は、検体を凍結乾燥し、乾燥重量測定後、乾燥済みの検体に１ｍLのプロ
ナーゼ液（プロナーゼ（Calbiochem社）を１ｍｇ／ｍＬの濃度で含む20mM HEPES緩衝液（
pH7.5））を加え、１時間おきに撹拌しながら60℃で3時間消化した。8,000×gで10分間、
遠心分離し、得られた上清を測定用試料原液とした。測定時まで冷蔵保存した。
硫酸化グリコサミノグリカン（GAG）の測定は、Wieslab (登録商標) sGAG quantitativ
e kit (Euro Diagnostica、品番：GAG201RUO)を用いて、取扱説明書に従い、GAG量を測定
した。測定用試料原液を精製水で100倍希釈し、得られた希釈液を測定用試料とした。ブ
ランク試料はプロナーゼ液の100倍希釈とした。測定波長は620nmとし、測定キット中のch
ondroitin 6-sulfate(CS-6)を標準として作成した検量線を用いて、検体中のGAG量を算出
した。
ヒドロキシプロリン（HYP）の測定は、以下のように実施した。測定用試料原液を精製
水で100倍希釈し、得られた希釈液を測定用試料とした。ブランク試料はプロナーゼ液の1
00倍希釈とした。50μLの測定用試料を加水分解用バイアルビンに採取し、同量の濃塩酸
を加え、密閉した後、120℃で16時間、加水分解した。１検体あたり３本の加水分解試料
を調製した。20μLの加水分解試料、100μLのHYP標準溶液をウエルプレートに採取し、４
０℃で15時間減圧し、乾固させた。乾燥済みの試料に100μLの精製水を加え、以下、Woes
snerの方法（Woessner JF Jr, Arch Biochem Biophys, 93,(1961) p.440-447）に従って
発色し、557nmの吸光度を測定した。加水分解及び発色時における測定用試料の希釈率は1
0倍なので、総希釈率は1000倍になる。標準HYP溶液の結果に基づいて作成した検量線を用
いて、検体中のHYP量を算出した。
６－（２）結果
検体乾燥重量あたりのGAG量およびHYP量（μg／mg dry weight）を得て、HYPに対するG
AGの比（GAG／HYP）を求めた。各群n=4について、平均値および標準偏差を求めた（表６
）。また、各群の散布図を図１１に示す。
その結果、正常コントロール群（椎間板髄核）のGAG／HYPの平均値は17.8であり、無処置
の関節軟骨の3.1と比較して高値を示した。術後４週時に、髄核摘出群および治療群のGAG
／HYPの平均値は、正常コントロール群の同値と比較して、低下していた。治療群は、髄
核摘出群と比較して、GAG／HYPの平均値はやや高い傾向がみられた。以上より、椎間板髄
核は、関節軟骨と比較して、硫酸化グリコサミノグリカン（GAG）／ヒドロキシプロリン
（HYP）の値が高く、すなわち、組織を構成する成分比が異なり、椎間板髄核と関節軟骨
とでは組織の特性も異なることが示唆された。本発明の組成物は、このような髄核特有の
組成を回復する可能性があると考えられた。
これらの方法は、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含有し、流動性を有する組成物を、椎間板変性抑制または髄核再生を必要とする対象の椎間板の髄核部位に適用し、適用した組成物の一部を硬化することを含む。前記の方法は、本発明の組成物を髄核部位へ適用する前に、髄核の少なくとも一部を除去する工程を含んでもよい。
１－（２）アルギン酸ビーズの作製、培養
下記表１に示す（Ａ）低エンドトキシン処理されたアルギン酸ナトリウム（持田製薬（株））と、（Ｂ）食品グレード（commercial grade）のアルギン酸ナトリウム（和光純薬工業（株）、１９９－０９９６１）の２種類のアルギン酸ナトリウムとをそれぞれ用いて、ヒト髄核細胞を培養し、比較を行った。
２－（２）低エンドトキシンアルギン酸ナトリウム溶液の充填
低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムは、次の２種類を用いた。いずれもエンドトキシン含量は、５０ＥＵ／ｇ未満であった。各低エンドトキシンアルギン酸ナトリウムの見掛け粘度及び重量平均分子量は表２のとおりである。アルギン酸ナトリウムの見掛け粘度測定は、日本薬局方（第１６版）の粘度測定法に従い、回転粘度計法（コーンプレート型回転粘度計）を用いて測定した。具体的な測定条件は以下のとおりである。試料溶液の調製は、MilliQ水を用いて行った。測定機器は、コーンプレート型回転粘度計（粘度粘弾性測定装置レオストレスRS600（Thermo Haake GmbH）センサー：３５／１）を用いた。回転数は、１ｗ／ｗ％アルギン酸ナトリウム溶液測定時は１ｒｐｍ、２ｗ／ｗ％アルギン酸ナトリウム溶液測定時は０．５ｒｐｍとした。読み取り時間は、１ｗ／ｗ％溶液測定時は、２分間測定し、開始１分から２分までの平均値とし、２ｗ／ｗ％溶液測定時は、２．５分間測定し、開始０．５分から２．５分までの平均値とした。３回の測定の平均値を測定値とした。測定温度は２０℃とした。

Claims (17)

  1. 対象の髄核部位に適用し、適用後に一部分を硬化するように用いられ、髄核部位への適
    用時に流動性を有する、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩を含有する、椎間板の
    髄核補填用組成物。
  2. 前記組成物の硬化を、前記組成物の表面の少なくとも一部分に架橋剤を接触させること
    で行う、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記組成物の髄核部位への適用を、椎間板表面の組成物の充填口を介して行い、前記組
    成物の一部分の硬化を、椎間板表面の組成物の充填口に架橋剤を接触させることで行う、
    請求項１または２に記載の組成物。
  4. 前記組成物の一部分の硬化が、髄核部位への充填と同様の架橋剤の使用方法および使用
    比率を用いて、本明細書の実施例４に準じて、in vitroで、直径６ｍｍの試験管に低エン
    ドトキシンアルギン酸ナトリウム５００μＬおよび架橋剤を充填して１時間静置後に、試
    験管内の組成物の容量の少なくとも５割が２１Ｇの注射針をつけたシリンジで吸引できる
    ことで示される、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
  5. 前記組成物の髄核部位への適用を、髄核の少なくとも一部を除去することで形成した髄
    核欠損部に、前記組成物を適用することで行う、請求項１～４のいずれか１項に記載の組
    成物。
  6. 前記流動性を有する組成物の見掛け粘度が、コーンプレート型粘度計を用いた20℃の条
    件での測定により、１００ｍＰａ・ｓ～３００００ｍＰａ・ｓである、請求項１～５のい
    ずれか１項に記載の組成物。
  7. 前記低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩は、ＧＰＣ－ＭＡＬＳ法により測定され
    た重量平均分子量（絶対分子量）が８万以上である、請求項１～６のいずれか１項に記載
    の組成物。
  8. 前記組成物は、低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩の濃度が０．５ｗ／ｗ％～５
    ｗ／ｗ％である、請求項１～７のいずれか１項に記載の組成物。
  9. 前記組成物は、前記対象の髄核部位に適用する前に、前記組成物を硬化させる量の架橋
    剤を含有しない、請求項１～８のいずれか１項に記載の組成物。
  10. 前記流動性を有する組成物は、組成物を２０℃で１時間静置した後に、２１Ｇの注射針
    で注入できる流動性を有する、請求項１～９のいずれか１項に記載の組成物。
  11. 前記組成物は、細胞を含有しない、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物。
  12. 架橋剤が２価以上の金属イオン化合物である、請求項２～１１のいずれか１項に記載の
    組成物。
  13. 前記組成物が、椎間板変性および／または椎間板損傷の治療、予防または再発抑制のた
    めに用いられる、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物。
  14. 前記椎間板変性および／または椎間板損傷が、椎間板ヘルニア、椎間板症、脊椎変性辷
    り症、化膿性椎間板炎、変形性脊椎症、脊柱管狭窄症、及び椎間板損傷からなる群から選
    択される少なくとも１種である、請求項１３に記載の組成物。
  15. 前記組成物が、髄核部位への適用前に乾燥状態または溶液状態である、請求項１～１４
    のいずれか１項に記載の組成物。
  16. 前記乾燥状態の低エンドトキシンアルギン酸の１価金属塩が、凍結乾燥体である、請求
    項１５に記載の組成物。
  17. 請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の組成物、および架橋剤を少なくとも含む、
    椎間板の髄核補填用キット。

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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2959937T3 (es) * 2017-03-07 2024-02-29 Mochida Pharm Co Ltd Formulación líquida de alginato
JP6984829B2 (ja) * 2018-01-31 2021-12-22 国立大学法人神戸大学 椎間板変性の治療剤および椎間板細胞培養材
CN112154158A (zh) 2018-03-22 2020-12-29 持田制药株式会社 连接有非甾体抗炎化合物的海藻酸衍生物
US20220056235A1 (en) * 2018-12-26 2022-02-24 Toray Industries, Inc. Porous membrane, composite membrane, and method for producing porous membrane
WO2021118379A1 (en) 2019-12-12 2021-06-17 Ineb - Instituto De Engenharia Biomédica Fetal decellularized nucleus pulposus material and methods for obtaining pharmaceutic compositions to be used in the treatment of intervertebral disc degeneration and back pain
KR20220127821A (ko) 2020-01-14 2022-09-20 모찌다 세이야쿠 가부시끼가이샤 알긴산염을 사용한 대상의 처치를 위한 조합 및 방법
JPWO2022092298A1 (ja) * 2020-11-01 2022-05-05
JPWO2022102093A1 (ja) * 2020-11-13 2022-05-19
KR20230136606A (ko) * 2021-01-29 2023-09-26 국립대학법인 홋가이도 다이가쿠 추간판 재생용 조성물

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5589591A (en) 1986-07-03 1996-12-31 Advanced Magnetics, Inc. Endotoxin-free polysaccharides
WO1993013136A1 (en) 1991-12-20 1993-07-08 Howmedica Inc. Ultra-pure polysaccharide materials for medical use
US6187048B1 (en) * 1994-05-24 2001-02-13 Surgical Dynamics, Inc. Intervertebral disc implant
JPH08269102A (ja) 1995-03-30 1996-10-15 Shiseido Co Ltd エンドトキシンフリーのβ１，３−グルカン及びその製造法並びに医療用ゲル素材
JPH09324001A (ja) 1996-04-02 1997-12-16 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ヒアルロン酸ナトリウムの精製法
JPH11253547A (ja) * 1998-03-11 1999-09-21 Kunio Ishikawa 細胞遮断膜
AU1726400A (en) 1998-11-13 2000-06-05 Cp Kelco U.S., Inc. Biopolymer salts with low endotoxin levels, biopolymer compositions thereof and methods of making the same
US20030069639A1 (en) 2001-04-14 2003-04-10 Tom Sander Methods and compositions for repair or replacement of joints and soft tissues
JP2005036036A (ja) 2003-07-16 2005-02-10 Tanabe Seiyaku Co Ltd エンドトキシン除去方法
WO2006119455A1 (en) 2005-05-03 2006-11-09 Yeung Jeffrey E Injection device for the intervertebral disc
CA2606084A1 (en) * 2005-06-17 2006-12-28 Abbott Laboratories Improved method of treating degenerative spinal disorders
ITPI20050071A1 (it) * 2005-06-20 2006-12-21 Giuseppe Calvosa Composizione biocompatibile per la sostituzione/rigenerazione di tessuti
US8506633B2 (en) 2005-12-27 2013-08-13 Warsaw Orthopedic, Inc. Rehydration and restoration of intervertebral discs with polyelectrolytes
CN104906126B (zh) * 2007-02-21 2019-05-28 持田制药株式会社 用于治疗软骨疾病的组合物
EP2082755A1 (de) * 2008-01-16 2009-07-29 CellMed AG Monolithische in-situ vernetzte Alginatimplantate
US20140213524A1 (en) 2011-08-23 2014-07-31 National University Corporation Hokkaido University Composition for regeneration of cartilage
JP6196283B2 (ja) 2015-12-10 2017-09-13 トヨタ自動車株式会社 燃料電池用電極、燃料電池用電極の製造方法、固体高分子形燃料電池、および触媒インクの製造方法

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