CN102395390A - 软骨修复 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于软骨修复的组合物、其制备方法和其用途。

Description

软骨修复
技术领域
本发明涉及用于软骨修复的组合物、其制备方法及其用途。
背景
软骨损伤在人中是很常见的。如果不治疗，损伤可逐渐恶化并且可导致慢性疾病例如骨关节炎。目前许多不同的治疗方法用于修复损伤的软骨。示例性方法包括直接或通过细胞递送媒介物将软骨细胞或间质干细胞植入骨软骨缺损，或使用生长因子促进修复过程(Gao，等人Clinical Orthopaedics and Related Research 2004，S62-66)。修复组织的耐久性、初始最佳生长因子剂量的确定或多个生物因子之间的相互作用的知识是非常重要的并且有时是有问题的(Gao，等人Clinical Orthopaedics and Related Research 2004，S62-66)。
概述
我们已发现用于修复软骨的某些组合物和方法。
在一个方面中，本发明表征了可成型的组合物(formablecomposition)，其包含按重量计算约25％至约40％的脱矿物质骨基质(DBM)、按重量计算约3.5％至约25％的透明质酸盐，以及按重量计算约40％至约72％的生物学相容性液体。
在一些实施方案中，透明质酸盐可以是透明质酸的钠盐、钾盐或钙盐。
在一些实施方案中，可成型的组合物可包括生物学相容性液体，所述液体可以是PBS、水、盐水或LRS，例如PBS。
可成型的组合物还可包含流变改进剂(rheology modifier)，例如甘油或羧甲基纤维素。
在一些实施方案中，可成型的组合物可包括按重量计算低于35％的脱矿物质骨基质例如，按重量计算约25％至约35％的脱矿物质骨基质。
在一些实施方案中，可成型的组合物可包含按重量计算至少约6％的透明质酸盐。在某些实施方案中，可成型的组合物可包含按重量计算约6％至约15％的透明质酸盐。在其他实施方案中，可成型的组合物可包含按重量计算约6％至约9％的透明质酸盐。
在一些实施方案中，透明质酸盐可具有至少约500,000道尔顿的平均分子量。
在一些实施方案中，可成型的组合物可包含至少两种透明质酸盐的混合物。在其他实施方案中，可成型的组合物可包含两种透明质酸盐的混合物，例如第一平均分子量在约0.05至约1.0百万道尔顿的范围内的透明质酸盐和第二平均分子量在约1.0至约5.0百万道尔顿的范围内的透明质酸盐。具有第一平均分子量的透明质酸盐对具有第二平均分子量的透明质酸盐的平均分子量的比可在1∶5至5∶1的范围内变化。
在一些实施方案中，具有第一平均分子量的透明质酸盐与具有第二平均分子量的透明质酸盐之间的平均分子量的差异可以为至少约0.5百万道尔顿。
在一些实施方案中，可在测试中进一步表征可成型的组合物。例如，当经历Instron注射器挤压力(Instron Syringe Extrusion Force，ISEF)测试时，组合物可展示约12.0牛顿至约30.0牛顿的挤压力。在一些实施方案中，挤压力可为约18.0牛顿至约26.0牛顿。在实施方案中，在具有8.6mm的直径和15规1-1/1针头的3mL注射器中测量挤压力。
可成型的组合物还可包含药物活性成分。药物活性成分可以是骨形态发生蛋白、组织生长因子、胰岛素生长因子、抗氧化剂、抗生素或生长因子的组合。在实施方案中，药物活性成分可选自BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、TGF-B、IGF-1、抗坏血酸盐或酯、丙酮酸盐或酯、BHT、庆大霉素、万古霉素、TGF-β和BMP-2的组合、以及TGF-β和IGF-1的组合。
在一些实施方案中，可将药物活性成分与透明质酸盐缀合。
在另一个方面中，本发明表征了干燥混合组合物，所述组合物包含按重量计算约60％至约92％的脱矿物质骨基质、按重量计算约3.5％至约38％的透明质酸盐和按重量计算约3％至约10％的生物学相容性液体。在一些实施方案中，透明质酸盐具有至少约200,000道尔顿的平均分子量。
在另一个方面中，本发明表征了塞子(plug)，所述塞子包含按重量计算约25％至约88％的脱矿物质骨基质和按重量计算约3.5％至约38％的透明质酸盐以及按重量计算约3％至约20％的的生物学相容性液体。在一些实施方案中，组合物包括按重量计算约5％至约10％的生物学相容性液体。在一些实施方案中，透明质酸盐具有至少约200,000道尔顿的平均分子量。在一些实施方案中，塞子包含低于约10％的生物学液体。在某些实施方案中，塞子包含按重量计算约或低于约5％的生物学液体。在一些实施方案中，生物学相容性液体可以为水。例如，生物学相容性液体是可利用干燥失重法(loss on drying)测量的残留水分。在一些实施方案中，塞子展示至少约1.55MPa(例如，至少约1.60MPa或至少约1.65MPa或至少约1.70MPa)的无侧限压缩应力(unconfined Compression Stress)。在某些方施方案中，塞子展示约1.55MPa至约1.70MPa的无侧限压缩应力。
在一个方面中，本发明表征了修复受试者的软骨的方法，所述方法包括在软骨组织的缺损位置给受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含脱矿物质骨基质和透明质酸盐。所述组合物可以是可成型的组合物、干燥混合组合物或塞子。
在其他方面中，本发明表征了制备可成型的组合物的方法，所述组合物包含按重量计算约25％至约40％的脱矿物质骨基质，按重量计算约3.5％至约25％的透明质酸盐和按重量计算约40％至约72％的生物学相容性液体，所述方法包括混合固体成分，然后添加液体成分。固体成分可包括脱矿物质骨基质和透明质酸盐。透明质酸盐可具有至少约200,000道尔顿的平均分子量。在一些实施方案中，可在意欲使用前加入液体成分。在一些实施方案中，液体成分为水。在组合物包含药物活性成分的情况下，可将药物活性成分与透明质酸盐缀合。在其他实施方案中，可将药物活性成分与固体成分例如脱矿物质骨基质和透明质酸盐混合。在某些实施方案中，可将药物活性成分与液体成分混合。
在另一个方面中，本发明表征了形成塞子的方法，其包括
a)提供透明质酸盐和脱矿物质骨基质的粉末，
b)混合所述粉末，
c)添加液体成分以形成油灰(putty)样材料，
d)将油灰置于模具中，以及
e)干燥成形的油灰以形成塞子。
通常″油灰″是稳固而柔韧的。其不会碎裂。其具有可通过手工塑形或可通过人工挤压迫入骨空隙(bone void)或网状骨质间隙(cancellous interstice)的延展性。
在一些实施方案中，粉末还可包含增塑剂例如甘油或PEG。
在一些实施方案中，干燥可以是冷冻干燥，风干，或者烘箱或真空干燥。
在某些实施方案中，还可控制塞子以获得按重量计算约3-20％(例如，按重量计算至少5％)的含湿量。在一些实施方案中，含湿量为按重量计算约5％至约10％。在其他实施方案中，含湿量为按重量计算约5％至约15％。
如本文中所使用的，“可成型的组合物”是能够被外科医生操作形成所需形状而基本上不粘附至手套，并且与良好的外科技术相符的可成型的组合物。例如，可将可成型的组合物塑形以符合外科缺损的轮廓。油灰可以是可成型的组合物的一种类型并且可用于患者。更常见地，我们在本申请的其他地方使用该术语来描述被干燥成塞子的中间材料。
如本文中所使用的，“平均分子量”是指可利用下式计算的平均分子量(Mw)，
Mw＝∑Ni2Mi2/∑Ni Mi
其中Ni是分子量为Mi的分子的数目。
如本文中所使用的，“生物学相容性液体”是生理上可接受的并且不引起不可接受的细胞损伤的液体。此类液体的实例为水、缓冲液、盐水、蛋白质溶液和糖溶液。
如本文中所使用的，可互换使用的术语“受试者”或“患者”是指任何动物，包括哺乳动物，优选小鼠、大鼠、其他啮齿类动物、兔、狗、猫、猪、牛、羊、马或灵长类动物，以及最优选人。
如本文中所使用的，短语“有效量”是指在组织、系统、动物、个体或人中引发研究者、兽医、医生(medical doctor)或其他临床医生所寻求的生物学或医学应答的活性化合物或药剂的量。
如本文中所使用的，术语″修复″意欲表示但不限于，组织的修复、再生、重建、重构(reconstitution)或膨胀(bulking)。
本发明的一个或多个实施方案的详细内容示于下文中。根据本说明书和权利要求，本发明的其他特征、目的和有利方面将变得显然。
详细描述
本发明至少部分基于某些组合物可用于修复软骨的意外发现。
组合物
可用于修复软骨的组合物包括但不限于可成型的组合物、干燥混合组合物和塞子。
可成型的组合物可包含按重量计算约20％至约40％，优选约25％至约40％或约25％至约35％，更优选约30％至约40％，最优选约30％至约35％的脱矿物质骨基质(DBM)。DBM与透明质酸盐之间的重量比可在约1∶1至约25∶1，或约2∶1至约20∶1，或约2∶1至约15∶1或约2.5∶1至约7.5∶1的范围内变化。
可成型的组合物还可包含生物学相容性液体成分，例如水或盐水。在一些实施方案中，液体成分可以是乳酸盐林格溶液(LactatedRinger′s solution，LRS)。在其他实施方案中，液体成分包括生理上可接受的缓冲盐水溶液例如磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
在一些实施方案中，本发明的可成型的组合物可包括按重量计算约40％至约72％(例如，约45％至约66％，或约50％至约66％，或约60％至约66％，或约62％至约65％)的液体成分。在某些实施方案中，液体成分基本上不含有机溶剂。有机溶液的实例包括乙醇、异丙醇、N-甲基吡咯烷酮、丙二醇、甘油、低分子量聚乙二醇和DMSO。
可成型的组合物可包含按重量计算至少约3.5％(例如至少约5％、至少约6％、至少约9％、至少约12％或至少约15％或至少约20％)的透明质酸盐。在一些实施方案中，组合物可包含按重量计算至少约6％的透明质酸盐。
在一些实施方案中，可成型的组合物可包含按重量计算约3.5％至约25％(例如，约5％至约25％，约6％至约25％，约9％至约25％)的透明质酸盐。在一些实施方案中，可成型的组合物可包含按重量计算约3.5％至约20％(例如约5％至约20％，约6％至约20％，约9％至约20％)的透明质酸盐。在某些实施方案中，可成型的组合物包含按重量计算约3.5％至约15％(例如，约5％至约15％，约6％至约15％，或约9％至约15％)的透明质酸盐。在某些实施方案中，组合物包含按重量计算约3.5％至约10％(例如，约5％至约10％，约6％至约10％，或约9％至约10％)的透明质酸盐。在某些实施方案，可成型的组合物包含按重量计算约3.5％至约9％(例如，约5％至约9％或约6％至约9％)的透明质酸盐。
在一些实施方案中，可成型的组合物在Instron注射器挤压力(ISEF)测试中展示约12.0至约30.0牛顿的挤压力。例如，可成型的组合物可展示约14.0至约26.0牛顿(例如，约14.0至约23.0牛顿，或约14.0至约21.0牛顿，或约14.0至约19.0牛顿，或约14.0至约16.0牛顿)的挤压力。在其他实施方案，可成型的组合物可展示约16.0至约26.0牛顿(例如，约18.0至约26.0牛顿，或约20.0至约26.0牛顿，或约22.0至约26.0牛顿)的挤压力。
在一些实施方案中，可成型的组合物还可包含流变改进剂，例如甘油或羧甲基纤维素。
在一些实施方案中，透明质酸盐具有至少约500,000道尔顿(Da)(例如，至少约0.8MDa，至少约1.0MDa，至少约1.2MDa，至少约1.5MDa，至少约1.8MDa或至少约2.0MDa)的平均分子量。
在组合物是干燥混合组合物的情况下，干燥混合组合物可包含按重量计算约60％至约92％(例如，约70％至约92％，约80％至约92％，约85％至约92％，或约90％至约92％)的DBM。在一些实施方案中，干燥混合组合物可包含按重量计算约3.5％至约38％(例如，约4％至约38％，约6％至约38％，约9％至约38％，约9％至约30％，约9％至约25％，约9％至约20％)的透明质酸盐。在实施方案中，干燥混合组合物可包含按重量计算约3％至约10％(例如，约3％至约9％，约3％至约7％，约3％至约5％)的源自DBM和透明质酸盐的残留水分。
当将组合物制备为塞子时，塞子中DBM的量按总组合物的重量计算可在25％至约88％(例如，约35％至约88％，约55％至约88％，约60％至约88％，约65％至约88％，约75％至约88％，或约85％至约88％)的范围内变化。
塞子中透明质酸盐的量按总组合物的重量计算可在约3.5％至约38％(例如，约5％至约38％，或约6％至约38％，约6％至约28％，约6％至约24％，约6％至约18％，或约6％至约15％，或约7％至约15％)的范围内变化。在一些实施方案中，透明质酸盐的重量按总组合物的重量计算为至少约6％(例如，至少约7％，至少约15％或至少约20％)。在一些实施方案中，塞子包含按重量计算约3％至约20％(例如按重量计算低于10％)的生物学相容性液体。在一些实施方案中，生物学相容性液体可以为水。例如，生物学相容性液体可以为按重量计算约3％至约20％(例如，约5％至约10％，约5％至约15％)的残留水分。残留水分或其他低挥发性溶剂可利用干燥失重法来测量。在某些实施方案中，干燥失重为约3％至约20％(例如，约3％至约17％，约5％至约12％，约5％至约10％)。
可成型的组合物、干燥混合组合物和塞子中DBM的适当粒度可以为约70微米至约850微米，例如约150微米至约800微米或200微米至约800微米。透明质酸盐的适当粒度可以为约600微米，或约500微米或约400微米。
在一些实施方案中，可成型的组合物中透明质酸盐具有至少约500,000道尔顿(例如，至少约0.8MDa，至少约1.0MDa，至少约1.2MDa，至少约1.5MDa，至少约1.8MDa或至少约2.0MDa)的平均分子量。在一些实施方案中，干燥组合物或塞子中透明质酸盐可具有至少约200,000道尔顿(例如，至少约0.4MDa，至少约0.6MDa，至少约0.8MDa，至少约1.0MDa或至少约1.2MDa)的平均分子量。
本发明的组合物可以为可成型的组合物、干燥混合组合物或塞子。
组合物可包括至少两种透明质酸盐的混合物，例如两种透明质酸盐的混合物或超过两种(例如，3种或4种)透明质酸盐的混合物。在一些实施方案中，组合物可包括两种透明质酸盐的混合物，其包含具有第一平均分子量的透明质酸盐和具有第二平均分子量的透明质酸盐。在一些实施方案中，具有第一平均分子量的透明质酸盐为约0.05-1.0百万道尔顿(MDa)(例如，约0.05MDa，约0.1MDa，约0.3MDa，约0.6MDa，约0.8MDa或约1.0MDa)。
在一些实施方案中，具有第一平均分子量的透明质酸盐为约0.1-1.0百万道尔顿。在一些实施方案中，具有第一平均分子量的透明质酸盐为约0.3-1.0百万道尔顿。在某些实施方案中，具有第一平均分子量的透明质酸盐为约0.3-0.8百万道尔顿，例如，约0.3-0.6百万道尔顿。
在一些实施方案中，具有第二平均分子量的透明质酸盐为约1.0-5.0百万道尔顿(MDa)(例如，约1.0MDa，约1.4MDa，约2.0MDa，约2.5MDa，约3.0MDa，约4.0MDa或约5.0MDa)。
在一些实施方案中，具有第二平均分子量的透明质酸盐为约1.2-4.0百万道尔顿。在某些实施方案中，具有第二平均分子量的透明质酸盐为约1.0-3.0百万道尔顿。例如，具有第二平均分子量的透明质酸盐可为约1.0-2.0百万道尔顿，例如，约1.0-1.4百万道尔顿。
本发明的组合物可包括两种透明质酸盐的混合物，其包含具有第一平均分子量的透明质酸盐和具有第二平均分子量的透明质酸盐。本发明的一个方面是：组合物中两种透明质酸盐允许操作组合物的流变性质。
在一些实施方案中，具有第一平均分子量的透明质酸盐可为约0.05-1.0百万道尔顿并且具有第二平均分子量的透明质酸盐可为约1.0-5.0百万道尔顿。例如，具有第一平均分子量的透明质酸盐可以为约0.1-1.0百万道尔顿并且具有第二平均分子量的透明质酸盐可以为约1.0-3.0百万道尔顿。在某些实施方案中，具有第一平均分子量的透明质酸盐可以为0.3-0.8百万道尔顿并且具有第二平均分子量的透明质酸盐可以为1.0-2.0百万道尔顿。在其他实施方案中，具有第一平均分子量的透明质酸盐可以为0.3-0.6百万道尔顿并且具有第二平均分子量的透明质酸盐可以为1.0-1.6百万道尔顿。例如，具有第一平均分子量的透明质酸盐可以为0.4-0.6百万道尔顿并且具有第二平均分子量的透明质酸盐可以为约1.1-1.6百万道尔顿。
具有第一平均分子量的透明质酸盐对具有第二平均分子量的透明质酸盐的重量比可以为约1∶5至约5∶1(例如，约1∶5，约1∶2，约1∶1，约2∶1，约3∶1，约4∶1或约5∶1)。在某些实施方案中，具有第一平均分子量的透明质酸盐对具有第二平均分子量的透明质酸盐的重量比可为约1∶4至约4∶1(例如，约1∶3至约1∶1，或约1∶1至约3∶1)。在一些实施方案中，具有第一平均分子量的透明质酸盐对具有第二平均分子量的透明质酸盐的重量比可为约1∶3至约1∶1。
在一些实施方案中，具有第一平均分子量的透明质酸盐与具有第二平均分子量的透明质酸盐之间的平均分子量的差异为至少约0.5百万道尔顿(MDa)(例如，至少约0.5MDa，至少约0.7MDa，至少约0.9MDa或至少约1.2MDa)。
组合物还可包含药物活性成分。药物活性成分可以为骨形态发生蛋白、组织生长因子、胰岛素生长因子、抗氧化剂、抗生素或其组合。
组合物可包含能够诱导骨和软骨形成的蛋白质。例如，骨形态发生蛋白例如BMP-2、BMP-4、BMP-6和BMP-7。
组合物还可包含有效量(天然存在的或有意添加的)的组织生长因子例如TGF-B。在某些实施方案中，组合物可具有胰岛素生长因子例如IGF-1。在某些实施方案中，组合物可具有抗氧化剂。示例性抗氧化剂包括抗坏血酸盐或酯、丙酮酸盐或酯和BHT。在其他实施方案中，组合物可包含抗生素例如庆大霉素和万古霉素。
组合物可以以有效地促进组织生长的量包含两种或更多种药物活性成分的混合物。例如，骨形态发生蛋白与组织生长因子的混合物例如TGF-β与BMP-2的混合物，或胰岛素生长因子与组织生长因子的混合物例如TGF-β与IGF-1的混合物。
组合物还可包含其他治疗剂，例如，止痛药(无论是用于本文中描述的病状还是用于一些其他病状)。
此类实例仅为了举例说明目的，并且可使用文献中描述的任何其他试剂。
当将药物活性成分用于组合物时，可将它们与粉末形式的透明质酸盐和脱矿物质骨基质(DBM)简单混合或与液体成分混合。可选地，可将药物活性成分与透明质酸盐缀合。
如本文中所使用的，可使用本领域技术人员熟知的方法制备脱矿物质骨基质(DBM)。一般的合成方法可见于文献中。参见Yee等人，Spine(2003)，28(21)和Colnot等人Clinical Orthopaedics andRelated Research (2005)，(435)，69-78。例如，可利用同种异体移植物骨的酸提取(其导致大部分矿化成分丢失但保留胶原和非胶原蛋白质(包括生长因子))来制备脱矿物质骨基质(DBM)。可将DBM加工为粉碎的颗粒、粉末或碎片。可将其配制用作颗粒、凝胶、海绵样材料或油灰，并且可将其冷冻干燥以进行贮存。此外，可从商业来源例如Tissue Banks International (TBI)，San Rafael，California或Exactech，Gainesville，Florida获得DBM。
透明质酸是包含重复D-葡糖醛酸和N-乙酰葡糖胺二糖单位的长直链多糖。其可以例如通过从动物组织例如雄鸡冠和脐带提取(Klein，J.，& Meyer，F.A.，1983，Biochem. & Biophys.Acta，755(3)，400-411)或通过从细菌种类例如链球菌(Streptococcus)取出透明质酸荚膜材料(Van Brunt，J.，1986，Biotechnology，4，780-782)而获得。
还可将透明质酸经历γ辐射以允许发生所需分子量减少(Miller，R.& Shiedlin，A.U.S.Patent No.6,383,344)。在一些实施方案中，透明质酸是基本上水溶性的。
透明质酸可以是经修饰的透明质酸。例如，可将透明质酸的葡糖醛酸部分中的羧基转化成经取代的酰胺基。上述经取代的酰胺基的适当取代基可包括：氨基烷基(其亚烷基链可被一个或多个，例如1至8个，优选1至3个羟基取代)；氨基(聚亚烷基氧基)烷基；氨基(聚亚烷基氨基)烷基；巯基(聚亚烷基氨基)烷基；丙烯酰氧基烷基；丙烯酰氨基烷基和丙烯酰氨基(聚亚烷基氧基)烷基。
此外，经修饰的透明质酸还可以是交联的透明质酸，其通常具有更高的分子量。具有更高分子量的透明质酸可因其增强的粘弹性而更有效。
在生理pH下，透明质酸可以是盐。在透明质酸盐是与无机碱例如碱金属(例如，锂、钠或钾)或碱土金属(镁或钙)形成的盐的情况下，此类盐可以例如通过将透明质酸与含有碱金属或碱土金属的碱反应来容易地获得。透明质酸盐(例如，银盐)还可利用如美国专利4,784,991和5,472,950中公开的方法来制备。此外，透明质酸盐还可购自多种商业来源。
组合物还可包含经修饰的或天然的多糖，例如壳聚糖、几丁质、硫酸软骨素、硫酸角质素、硫酸皮肤素、肝素和硫酸肝素。
组合物可包含天然的、重组的或合成的蛋白质，例如可溶性胶原或可溶性明胶或聚氨基酸例如多聚赖氨酸。
在某些实施方案中，组合物不包含任何脂质。在其他实施方案中，组合物包含按重量计算低于12％(例如，低于10％，或低于8％，或低于5％，或低于3％)的脂质。
使用方法
本发明的组合物可用于修复受试者的软骨。可在软骨组织的缺损位置或骨与软骨缺损的组合例如骨软骨缺损的位置上给受试者施用组合物。本发明的组合物还可用于修复骨，或其他组织例如关节盘(meniscus)、韧带、腱和椎间盘环状部中的缺损。有效剂量将取决于待治疗的疾病状况以及主治临床医生基于因素例如疾病的严重度、患者的年龄、体重和总体状况等的判断。
给患者施用的组合物可以以本文中描述的药物组合物(例如，可成型的组合物、干燥混合组合物或塞子)的形式存在。因此，可在使用之前用生物学液体水化干燥混合组合物和塞子。水化的组合物的pH优选为6.5至7.8，或优选6.8至7.4。可利用常规灭菌技术对组合物灭菌，或可将其过滤灭菌。可以以原样、或冻干形式(在施用之前将所述冻干组合物与无菌液体成分组合)包装组合物以待使用。
可将本发明的组合物直接应用于需要软骨修复的位置和/或组织。在一些实施方案中，可用外科方法准备身体的治疗位置以除去异常组织，然后将本发明的组合物置于缺损区域中。可选地，外科准备包括刺穿(piercing)、打磨(abrading)或钻孔(drilling)入邻近组织区域或血管化区域中，以产生用于细胞或骨髓迁移进入塞子或油灰的通道。本发明的组合物可用于填充骨软骨缺损，或包括微小骨折(microfracture)的缺损，或软骨缺损。
组合物的制备
在制备组合物时，可碾磨DBM和透明质酸盐以在与其他成分组合之前提供适当的粒度，例如，小于600微米或小于850微米。
可使用已知的碾磨法例如干或湿碾磨法碾磨DBM和透明质酸盐以获得适合于油灰或塞子和适合于其他制剂类型的粒度。可利用本领域内已知的方法制备本发明的化合物的细碎制剂，例如参见国际专利公开案WO 2002/000196。
可通过将透明质酸盐和脱矿物质骨基质(DBM)的干燥混合物与液体成分(例如，PBS)混合来制备本发明的可成型的组合物。本发明的重要方面是预混合所有固体粉末成分，包括透明质酸盐和DBM，然后添加液体成分例如PBS。
可将透明质酸盐和脱矿物质骨基质(DBM)预混合约10-24小时(例如，约10小时，约12小时，约18小时，约20小时或约24小时)以形成固体组合物，其包括DBM与透明质酸盐的均匀混合物。当提及组合物为均匀的时候，成分通常均一地分散在整个组合物中，以便可容易地将组合物再分成等效的单位剂量形式。可以理解：当已将至少两种透明质酸盐的混合物用于组合物时，将所有透明质酸盐与DBM预混合。可机械地进行混合(例如，在高速混合器例如Turbula T2F中)直至形成均匀的粉末混合物。可向均匀的粉末混合物中加入液体成分例如PBS。可以例如在高速混合器中混合所得的混合物，进行另外的约12-36小时(例如，约12小时，约20小时，约24小时，约30小时或约36小时)。在一些实施方案中，可在混合DBM和透明质酸盐后立即加入液体成分。在其他实施方案中，可紧在意欲使用之前加入液体成分。
本发明的另一个重要方面是：可利用具有不同分子量的两种透明质酸盐来产生具有改进的和受控的流变性和生物学性质的糊剂/油灰。可利用本发明的教导，通过在混合过程中向组合物中加入物质或直接向终组合物中加入物质来制备许多医学上有用的物质。为了将DBM与透明质酸盐的混合物用作用于原位药物递送的媒介物，可将药物与DBM和透明质酸盐的粉末混合，然后可水化所述组合物。可选地，可将药物与液体成分例如PBS混合，然后将其加入至预混合的粉末组合物。此外，可将药物与透明质酸盐缀合，然后将其加入组合物。
本发明的方法允许制备在组合物中具有至少约3.5％浓度的透明质酸盐的可用的骨油灰或糊剂。使用更高浓度的透明质酸盐的有利方面包括提高的糊剂的粘弹性。此外，利用本发明的方法制备的油灰或糊剂显示良好的内聚性(cohesive property)和最小的粘着。例如，油灰不附着至乳胶手套并且在整个操作过程中保持内聚，并且不破碎或“形成丸状”。此外，还观察到良好的延展性(malleability)。例如，可将其形成多种形状(例如，球体)并且其可保持期望的形状。在一些实施方案中，在植入前将油灰与干细胞或骨髓细胞预混合。在一些实施方案中，通过操作油灰进入缺损位置中来将组合物植入缺损。在其他实施方案中，通过经针头从注射器注射来将组合物植入缺损。
还可将本发明的组合物制备为塞子。塞子是为骨或软骨的修复和替代而独特设计的生物吸收性支架。通过利用根据本发明的HA和DBM的组合，该材料被设计为支持骨/软骨结合(incorporation)和再塑的高度多孔的支架。其是生物学友好的(通过吸收液体和营养物)且经独特地设计用以将骨髓吸入支架。
塞子可在湿膝关节镜手术(wet arthroscopic knee surgery)过程中提供更方便的支架递送方法。可通过将HA与DBM混合，然后水化粉末混合物来获得包含脱矿物质骨基质(DBM)和透明质酸盐的具有多孔、骨传导结构的塞子。例如，可在定制设计的模具中利用冷冻干燥或其他干燥方法从DBM与透明质酸盐的混合物制备塞子，以最优化塞子性能和吻合骨软骨缺损。塞子是DBM和透明质酸盐的干燥制剂，从而在室温下可具有增强的稳定性。在一些实施方案中，塞子可包含增塑剂。优选的增塑剂可以是甘油或PEG。可将增塑剂与粉末混合物(例如脱矿物质骨基质和透明质酸盐)混合。在一些实施方案中，在植入前将塞子与干细胞或骨髓细胞预混合。
为了可更有效地理解本文中公开的发明，在下文中提供了实施例。应当理解，此类实施例仅用于举例说明目的并且不被解释为以任何方式限定本发明。
实施例1-3：骨油灰或糊剂的制备
实施例1
材料：
在Genzyme公司从兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)的发酵物(fermentation)纯化透明质酸盐(HA)粉末∶MW＝1.2MDa，从Tissue Banks International(TBI)，San Rafael，CA获得物理形式(细粉)的脱矿物质骨基质(DBM)。
方法1：
将2.4克HA与21.4mL液体成分PBS在高速混合器(Turbula T2F，Glen Mills Inc.，Clifton，New Jersey)中预混合24小时。在混合24小时后，制备均匀水凝胶。此时，加入12克DBM。在该过程结束时，组合物不形成油灰(HA/DBM面团样组合物(dough composition))，而是呈现未掺入全部DBM的非均匀混合物。
方法2：
将12克DBM与2.4克HA在高速混合器(Turbula T2F)中以粉末形式预混合12小时以产生均匀的粉末混合物。此时，加入21.4mL液体成分PBS，并且将容器返回高速混合器以进行另外24小时。在该过程结束时，获得具有良好内聚性并且具有最小的对乳胶手套的粘着的均匀油灰(HA/DBM面团样组合物)。
表1.实施例1中使用的HA/DBM油灰的组成
  HA MW   HA   DBM   PBS   总计
  1.2MDa   2.4克   12克   21.4克   35.8克
表2.实施例1中组合物中HA的计算的浓度以及油灰中HA和DBM的计算的浓度
  [HA]*w/w   [DBM]w/w   [PBS]w/w
  6.7％   33.5％   59.8％
*油灰(HA+DBM+PBS)中的浓度
在实施例1的方法1中，通过首先将HA溶解于PBS中，然后在DBM中混合以形成油灰来制备油灰。结果显示，形成不均匀的油灰。一部分DBM可能未被掺入油灰。此外，部分DBM未被PBS润湿。这可能是由于在HA与DBM之间发生的对水的竞争性吸收。在实施例1的方法2中，通过首先均匀地分散HA和DBM粉末，然后加入PBS来制备油灰。这产生均匀的并且具有内聚性和延展性的油灰。
实施例2
材料：
在Genzyme公司从兽疫链球菌的发酵物纯化透明质酸盐(HA)粉末∶MW＝1.2MDa，物理形式(细粉)。在Genzyme公司从兽疫链球菌的发酵物纯化HA粉末，然后对其进行γ辐射以将分子量减小至500kDa(Miller，R. & Shieldlin，A.美国专利6,383,344)，物理形式(细粉)。从Tissue Banks International(TBI)San Rafael，CA获得脱矿物质骨基质。
方法：
将12克DBM和2克HA(分子量1.2MDa)以及1克HA(分子量500kDa)以粉末形式在高速混合器(Turbula T2F)中预混合12小时以产生均匀的粉末混合物。此时，加入21.4mL液体成分PBS并且将容器返回高速混合器再进行另外24小时。在该过程结束时，获得具有良好内聚性并且具有最小的对乳胶手套的粘着的油灰(HA/DBM面团样组合物)。
表3.用于实施例2的HA/DBM油灰的组成
  HA MW＝0.5MDa   HA MW＝1.2MDa   DBM   PBS   总计
  1克   2克   12克   21.4克   36.4克
表4.实施例2中组合物中HA的计算的浓度以及油灰中HA和DBM的计算的浓度。
  [HA]**w/w   [DBM]w/w   [PBS]w/w
  8.24％   33％   58.76％
**油灰(HA+DBM+PBS)中的浓度
在实施例2中，通过在组合物中使用14％HA获得具有良好内聚性并且具有最小的对乳胶手套的粘着的油灰。此外，该组合物使用两种HA分子量，0.5和1.2MDa HA。混合两种分子量的HA成分允许操作流变性。
实施例3
材料：
在Genzyme公司从兽疫链球菌的发酵物纯化透明质酸盐(HA)粉末∶MW＝1.2MDa，物理形式(细粉)。在Genzyme公司从兽疫链球菌的发酵物纯化HA粉末，然后对其进行γ辐射以将分子量减小至500kDa(Miller，R. & Shieldlin，A.美国专利6,383,344)，物理形式(细粉)。从Tissue Banks International(TBI)San Rafael，CA获得脱矿物质骨基质。
方法：
将9克DBM、1.9克HA(分子量1.2MDa)和0.85克HA(分子量500kDa)以粉末形式在高速混合器(Turbula T2F)中预混合12小时以产生均匀的粉末混合物。将0.9克(1.4mL)混合的粉末置于称重皿(weight boat)中并且加入1.5克PBS。在添加后，用抹刀(spatula)混合粉末和PBS直到获得均匀的油灰(30秒)。
表5.实施例3中使用的HA/DBM粉末的组成
  HA MW＝0.5MDa   HA MW＝1.2MDa   DBM   [HA]w/w   [DBM]w/w
  0.85克   1.9克   9克   23％   77％
表6.实施例3中使用的HA/DBM油灰的组成
  HA   DBM   PBS   [HA]w/w   [DBM]w/w
  0.21克   0.69克   15克   8.75％   29％
在实施例3中，通过在HA/DBM混合物中使用23％HA获得具有良好内聚性且具有最小的对乳胶手套的粘着的油灰。在混合粉末后，根据需要加入PBS以产生具有所需流变性的糊剂。此外，该组合物使用两种HA分子量，0.5和1.2MDa的HA。混合两种分子量的HA成分允许操作流变性。
实施例4：可接受的油灰的挤压力和挤压力的测量
开发了其他测试以表征HA/DBM的机械性质。Instron注射器挤压力测试是用于表征油灰的性质的测试。在该测试中，测量以恒定的速率推动材料通过具有8.6mm的直径和15规1-1/2针的3mL注射器所需要的力。在以0.5mm/秒的速率压缩的过程中测量挤压力直至达到平稳状态。(参见图1)。测量5个HA/DBM制剂并且将其与DBXTM(可从Synthes，PA商购获得的DBM)相比较。
表7
  批号   [HA]   [DBM]   力[N]
  A   6％70kDa；6％1.6MDa   31％   22.9±0.7
  B   4％0.5MDa；4％1.2MDa   31％   21.3±0.7
  C   6％1.2MDa   31％   18.6±0.7
  D   5％3MDa   31％   14.0±1.4
  E   8％660kDa   31％   25.8±0.4
  DBXTM   2.8％1MDa   31％   16.2±1.4
图1
Figure BDA0000098217420000191
实施例5：HA-DBM塞子制剂的吸收
如实施例2中所述或通过将HA-DBM粉末与液体成分PBS在具有Luer-lock注射器连接器的两个注射器中手工混合来制备HA-DBM油灰。将均匀的油灰加载至具有期望的尺寸的特氟隆(Teflon)模具中。将成形的油灰于-80℃下在模具中冷冻至少4小时，然后冷冻干燥过夜。从特氟隆模具中取出所得的HA-DBM干燥塞子。
为了优化塞子将骨髓吸入支架的能力，在下列方法中测试不同塞子制剂的吸收。
方法：将1cc注射器的两个末端切掉，将105-149um聚丙烯筛连接至注射器的一个末端。每一个注射器中放置一个HA-DBM塞子并且记录塞子的初始高度。将注射器置于15mL圆锥形管中，将在PBS中的染料置于管中至刚好覆盖注射器的底端(连接有过滤器的末端)。将样品置于37℃下。在7天的时间内记录染料至各塞子内的迁移。将100％的染料被吸收进入塞子的时间用于比较不同制剂的吸收速率。
表8
该数据显示，更慢的吸收速率归因于更高分子量的HA和/或更高浓度的HA。
实施例6：HA-DBM塞子制剂的膨胀
为了在体内维持DBM的最大浓度，需要具有最小膨胀的塞子。为了测量膨胀，在下列方法中测试不同的塞子制剂：
方法：切掉1cc注射器的两个末端并且将5um聚丙烯筛连接至注射器的一端。在每一个注射器中放置一个HA-DBM塞子并且记录塞子的初始高度。将注射器置于15mL圆锥形管中并且将PBS置于管中和注射器内。将样品放置于37℃下。在72小时的时期内记录各塞子的高度。将塞子的高度的差异用于计算百分比膨胀。
表9
该数据显示，膨胀的增加归因于更高分子量的HA。HA的浓度也可影响HA-DBM塞子的膨胀。
实施例7：HA/DBM塞子制剂的关节镜递送评估
在下列方法中测试塞子在操作过程中保持完整性的能力：
方法：将合成的、以关节连接的膝关节用于模拟关节镜递送情况。将标准关节镜设备用于在膝中产生进入孔(access port)并且使关节囊内的操作可见。标准流体管理设备用于控制关节囊内的流速以及根据需要扩张关节囊。在内侧髁和股骨髁上产生骨软骨缺损。将HA/DBM塞子载入管和柱塞装置。将该装置的末端通过插管引入关节间隙并且与缺损对齐。此时，起始恒定的液体流动并且通过推动柱塞将HA/DBM塞子植入骨软骨缺损。在植入过程中和植入后(5-60分钟)在流动条件下评估塞子的完整性和滞留性能。
测试结果(表10)显示，具有6％的HA浓度且具有200,000道尔顿分子量的HA的塞子制剂在恒定的流体流动下从施用位置移位。相反地，具有6％或更高的HA浓度和具有至少450,000道尔顿分子量的HA的塞子在恒定的液体流动下成功地保持在施用位置。
表10
Figure BDA0000098217420000211
图2.关节镜评估
2A.条目A从施用位置移位。  2B.条目B成功地保持在施用位置上。
实施例8：HA/DBM塞子制剂的无侧限压缩测试
方法：
将Instron机械测试仪用于测量干燥HA/DBM塞子的无侧限压缩性。在各测试开始时，以1mm/分钟的速率将塞子预装载至1N。在预装载后，以1mm/分钟的速率压缩表11中所述的塞子直至获得13％的压缩应变。根据应力应变曲线计算压缩应力(在10％的应变下)和模量(modulus)(在5至10％的应变之间)的值。
图3.12％HA(450kDa)+88％DBM的无侧限压缩测试
Figure BDA0000098217420000222
表11
Figure BDA0000098217420000231
样本1-3展示适当的压缩应力。这些结果基于3个单独的塞子(包含12％HA(450k Da)+88％DBM)的测试。如表10条目C中所示，该制剂通过关节镜评估。
可以以任意组合来组合本说明书中公开的所有特征。本说明书中公开的各个特征可用适用于相同、等同或相似目的的备选特征来替代。因此，除非另外明确地指出，否则公开的每一个特征只是一系列等同或相似特征的实例。
根据前述说明，除了本文中描述的变动外，本发明的各种变动对于本领域技术人员来说是显然的。此类变动也意欲落在所附权利要求的范围内。

Claims (131)

1.可成型的组合物，其包含按重量计算约25％至约40％的脱矿物质骨基质，按重量计算约3.5％至约25％的透明质酸盐，以及按重量计算约40％至约72％的生物学相容性液体。
2.权利要求1的组合物，其中所述透明质酸盐是透明质酸的钠盐、钾盐或钙盐。
3.权利要求1的组合物，其中所述生物学相容性液体为PBS、水、盐水或LRS。
4.权利要求1的组合物，其中所述生物学相容性液体为PBS。
5.权利要求1的组合物，其还包含流变改进剂。
6.权利要求5的组合物，其中所述流变改进剂为甘油或羧甲基纤维素。
7.权利要求1的组合物，其包含按重量计算约25％至约35％的脱矿物质骨基质。
8.权利要求1的组合物，其包含按重量计算约6％至约15％的透明质酸盐。
9.权利要求1的组合物，其包含按重量计算约6％至约9％的透明质酸盐。
10.权利要求1的组合物，其中所述透明质酸盐具有至少约500,000道尔顿的平均分子量。
11.权利要求1的组合物，其包含至少两种透明质酸盐的混合物。
12.权利要求11的组合物，其包含两种透明质酸盐的混合物，所述混合物包含具有第一平均分子量的透明质酸盐和具有第二平均分子量的透明质酸盐。
13.权利要求12的组合物，其中具有第一平均分子量的透明质酸盐为约0.05-1.0百万道尔顿。
14.权利要求12的组合物，其中具有第二平均分子量的透明质酸盐为约1.0-5.0百万道尔顿。
15.权利要求12的组合物，其中具有第一平均分子量的透明质酸盐对具有第二平均分子量的透明质酸盐的平均分子量的比在1∶5至5∶1的范围内变化。
16.权利要求12的组合物，其中具有第一平均分子量的透明质酸盐与具有第二平均分子量的透明质酸盐之间的平均分子量的差异为至少约0.5百万道尔顿。
17.权利要求1的组合物，其进一步的特征在于，当经历Instron注射器挤压力(ISEF)测试时，所述组合物展示约12.0牛顿至约30.0牛顿的挤压力。
18.权利要求17的组合物，其中所述挤压力为约18.0牛顿至约26.0牛顿。
19.权利要求17的组合物，其中在具有8.6mm的直径和15规1-1/1针的3mL注射器中测量挤压力。
20.权利要求1的组合物，其还包含药物活性成分。
21.权利要求20的组合物，其中所述药物活性成分为骨形态发生蛋白、组织生长因子、胰岛素生长因子、抗氧化剂、抗生素或生长因子的组合。
22.权利要求20的组合物，其中所述药物活性成分选自BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、TGF-B、IGF-1、抗坏血酸盐或酯、丙酮酸盐或酯、BHT、庆大霉素、万古霉素、TGF-β和BMP-2的组合以及TGF-β和IGF-1的组合。
23.权利要求20的组合物，其中将所述药物活性成分与透明质酸盐缀合。
24.修复受试者的软骨的方法，其包括在软骨组织缺损位置处给受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含脱矿物质骨基质和透明质酸盐。
25.权利要求24的方法，其中所述透明质酸盐为透明质酸的钠盐、钾盐或钙盐。
26.权利要求24的方法，其中所述组合物还包含生物学相容性液体。
27.权利要求26的方法，其中所述生物学相容性液体是PBS、水、盐水或LRS。
28.权利要求26的方法，其中所述生物学相容性液体是PBS。
29.权利要求26的方法，其中所述生物学相容性液体为水。
30.权利要求24的方法，其中所述组合物还包含流变改进剂。
31.权利要求30的方法，其中所述流变改进剂为甘油或羧甲基纤维素。
32.权利要求24的方法，其中所述组合物是可成型的组合物，其包含按重量计算约25％至约40％的脱矿物质骨基质。
33.权利要求32的方法，其中所述组合物包含按重量计算至少约3.5％至约25％的透明质酸盐。
34.权利要求32的方法，其中所述组合物包含按重量计算约6％至约15％的透明质酸盐。
35.权利要求32的方法，其中所述组合物包含按重量计算约6％至约9％的透明质酸盐。
36.权利要求32的方法，其中所述组合物包含按重量计算约40％至约72％的生物学相容性液体。
37.权利要求24的方法，其中所述组合物为干燥混合组合物，其包含按重量计算约60％至约92％的脱矿物质骨基质。
38.权利要求37的方法，其中所述组合物包含按重量计算至少约3.5％至约38％的透明质酸盐。
39.权利要求37的方法，其中所述组合物包含按重量计算约3％至约10％的生物学相容性液体。
40.权利要求24的方法，其中所述组合物为塞子，其包含按重量计算约25％至约88％的脱矿物质骨基质。
41.权利要求40的方法，其中所述组合物包含按重量计算至少约3.5％至约38％的透明质酸盐。
42.权利要求40的方法，其中所述组合物还包含按重量计算约3％至约20％的生物学相容性液体。
43.权利要求40的方法，其中所述组合物还包含按重量计算约5％至约10％的生物学相容性液体。
44.权利要求24的方法，其中所述组合物包含至少两种透明质酸盐的混合物。
45.权利要求44的方法，其中所述组合物包含两种透明质酸盐的混合物，所述混合物包含具有第一平均分子量的透明质酸盐和具有第二平均分子量的透明质酸盐。
46.权利要求45的方法，其中具有第一平均分子量的透明质酸盐为约0.05-1.0百万道尔顿。
47.权利要求45的方法，其中具有第二平均分子量的透明质酸盐为约1.0-5.0百万道尔顿。
48.权利要求45的方法，其中具有第一平均分子量的透明质酸盐对具有第二平均分子量的透明质酸盐的平均分子量的比在1∶5至5∶1的范围内变化。
49.权利要求45的方法，其中具有第一平均分子量的透明质酸盐与具有第二平均分子量的透明质酸盐之间的平均分子量的差异为至少约0.5百万道尔顿。
50.权利要求24的方法，其中所述组合物还包含药物活性成分。
51.权利要求50的方法，其中所述药物活性成分为骨形态发生蛋白、组织生长因子、胰岛素生长因子、抗氧化剂、抗生素或生长因子的组合。
52.权利要求50的方法，其中所述药物活性成分选自BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、TGF-B、IGF-1、抗坏血酸盐或酯、丙酮酸盐或酯、BHT、庆大霉素、万古霉素、TGF-β和BMP-2的组合以及TGF-β和IGF-1的组合。
53.权利要求50的方法，其中将所述药物活性成分与透明质酸盐缀合。
54.制备可成型的组合物的方法，所述可成型的组合物包含按重量计算约25％至约40％的脱矿物质骨基质，按重量计算约3.5％至约25％的透明质酸盐和按重量计算约40％至约72％的生物学相容性液体，所述方法包括混合固体成分，然后添加液体成分。
55.权利要求54的方法，其中所述固体成分包括脱矿物质骨基质和透明质酸盐。
56.权利要求54的方法，其中所述透明质酸盐为透明质酸的钠盐、钾盐或钙盐。
57.权利要求54的方法，其中所述液体成分为生物学相容性液体。
58.权利要求57的方法，其中所述生物学相容性液体是PBS、水、盐水或LRS。
59.权利要求57的方法，其中所述生物学相容性液体为水。
60.权利要求54的方法，其中在意欲使用之前加入所述液体成分。
61.权利要求54的方法，其中所述组合物还包含流变改进剂。
62.权利要求61的方法，其中所述流变改进剂为甘油或羧甲基纤维素。
63.权利要求54的方法，其中所述透明质酸盐具有至少约200,000道尔顿的平均分子量。
64.权利要求54的方法，其中所述组合物包含至少两种透明质酸盐的混合物。
65.权利要求64的方法，其中所述组合物包含两种透明质酸盐的混合物，所述混合物包含具有第一平均分子量的透明质酸盐和具有第二平均分子量的透明质酸盐。
66.权利要求65的方法，其中具有第一平均分子量的透明质酸盐为约0.05-1.0百万道尔顿。
67.权利要求65的方法，其中具有第二平均分子量的透明质酸盐为约1.0-5.0百万道尔顿。
68.权利要求65的方法，其中具有第一平均分子量的透明质酸盐对具有第二平均分子量的透明质酸盐的平均分子量的比在1∶5至5∶1的范围内变化。
69.权利要求65的方法，其中具有第一平均分子量的透明质酸盐与具有第二平均分子量的透明质酸盐之间的平均分子量的差异为至少约0.5百万道尔顿。
70.权利要求54的方法，其中所述组合物还包含药物活性成分。
71.权利要求70的方法，其中所述药物活性成分为骨形态发生蛋白、组织生长因子、胰岛素生长因子、抗氧化剂、抗生素或生长因子的组合。
72.权利要求70的方法，其中所述药物活性成分选自BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、TGF-B、IGF-1、抗坏血酸盐或酯、丙酮酸盐或酯、BHT、庆大霉素、万古霉素、TGF-β和BMP-2的组合以及TGF-β和IGF-1的组合。
73.权利要求70的方法，其中将所述药物活性成分与透明质酸盐缀合。
74.权利要求70的方法，其中将所述药物活性成分与脱矿物质骨基质和透明质酸盐混合。
75.权利要求70的方法，其中将所述药物活性成分与液体成分混合。
76.一种干燥混合组合物，其包含按重量计算约60％至约92％的脱矿物质骨基质，按重量计算约3.5％至约38％的透明质酸盐和按重量计算约3％至约10％的生物学相容性液体。
77.权利要求76的组合物，其中所述透明质酸盐为透明质酸的钠盐、钾盐或钙盐。
78.权利要求76的组合物，其中所述透明质酸盐具有至少约200,000道尔顿的平均分子量。
79.权利要求76的组合物，其包含至少两种透明质酸盐的混合物。
80.权利要求76的组合物，其包含两种透明质酸盐--具有第一平均分子量的透明质酸盐和具有第二平均分子量的透明质酸盐--的混合物。
81.权利要求80的组合物，其中具有第一平均分子量的透明质酸盐为约0.05-1.0百万道尔顿。
82.权利要求80的组合物，其中具有第二平均分子量的透明质酸盐为约1.0-5.0百万道尔顿。
83.权利要求76的组合物，其还包含药物活性成分。
84.权利要求83的组合物，其中所述药物活性成分为骨形态发生蛋白、组织生长因子、胰岛素生长因子、抗氧化剂、抗生素或生长因子的组合。
85.权利要求83的组合物，其中所述药物活性成分选自BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、TGF-B、IGF-1、抗坏血酸盐或酯、丙酮酸盐或酯、BHT、庆大霉素、万古霉素、TGF-β和BMP-2的组合以及TGF-β和IGF-1的组合。
86.权利要求83的组合物，其中将所述药物活性成分与透明质酸盐缀合。
87.一种塞子，其包含按重量计算约25％至约88％的脱矿物质骨基质和按重量计算约3.5％至约38％的透明质酸盐以及按重量计算约3％至约20％的生物学相容性液体。
88.权利要求87的塞子，其中所述生物学相容性液体为按重量计算约5-10％。
89.权利要求87的塞子，其中所述生物学相容性液体为水。
90.权利要求87的塞子，其中粉末还包含增塑剂。
91.权利要求90的塞子，其中所述增塑剂为甘油或PEG。
92.权利要求87的塞子，其中所述透明质酸盐为透明质酸盐的钠盐、钾盐或钙盐。
93.权利要求87的塞子，其包含按重量计算至少约6％的透明质酸盐。
94.权利要求87的塞子，其包含按重量计算约6％至约24％的透明质酸盐。
95.权利要求87的塞子，其包含按重量计算约6％至约18％的透明质酸盐。
96.权利要求87的塞子，其中所述透明质酸盐具有至少约200,000道尔顿的平均分子量。
97.权利要求87的塞子，其包含至少两种透明质酸盐的混合物。
98.权利要求97的塞子，其包含两种透明质酸盐的混合物，所述混合物包含具有第一平均分子量的透明质酸盐和具有第二平均分子量的透明质酸盐。
99.权利要求98的塞子，其中具有第一平均分子量的透明质酸盐为约0.05-1.0百万道尔顿。
100.权利要求98的塞子，其中具有第二平均分子量的透明质酸盐为约1.0至5.0百万道尔顿。
101.权利要求98的塞子，其中具有第一平均分子量的透明质酸盐对具有第二平均分子量的透明质酸盐的平均分子量的比在1∶5至5∶1的范围内变化。
102.权利要求98的塞子，其中具有第一平均分子量的透明质酸盐与具有第二平均分子量的透明质酸盐之间的平均分子量的差异为至少约0.5百万道尔顿。
103.权利要求87的塞子，其中所述粉末还包含药物活性成分。
104.权利要求103的塞子，其中所述药物活性成分为骨形态发生蛋白、组织生长因子、胰岛素生长因子、抗氧化剂、抗生素或生长因子的组合。
105.权利要求103的塞子，其中所述药物活性成分选自BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、TGF-B、IGF-1、抗坏血酸盐或酯、丙酮酸盐或酯、BHT、庆大霉素、万古霉素、TGF-β和BMP-2的组合以及TGF-β和IGF-1的组合。
106.权利要求103的塞子，其中将所述药物活性成分与透明质酸盐辍合。
107.权利要求87的塞子，其特征在于所述塞子展示至少约1.55MPa的无侧限压缩应力。
108.形成塞子的方法，其包括
a)提供脱矿物质骨基质和透明质酸盐的粉末，
b)混合所述粉末，
c)添加液体成分以形成油灰样材料，
d)将油灰置于模具中，和
e)干燥成型的油灰以形成塞子。
109.权利要求108的方法，其中所述透明质酸盐为透明质酸盐的钠盐、钾盐或钙盐。
110.权利要求108的方法，其中所述塞子包含按重量计算低于约20％的生物学相容性液体。
111.权利要求110的方法，其中所述塞子包含按重量计算低于约10％的生物学相容性液体。
112.权利要求110的方法，其中所述生物学相容性液体为水。
113.权利要求108的方法，其中所述粉末还包含增塑剂。
114.权利要求113的方法，其中所述增塑剂为甘油或PEG。
115.权利要求108的方法，其中所述塞子包含按重量计算至少约6％的透明质酸盐。
116.权利要求108的方法，其中所述塞子包含按重量计算约6％至约24％的透明质酸盐。
117.权利要求108的方法，其中所述塞子包含按重量计算约6％至约18％的透明质酸盐。
118.权利要求108的方法，其中所述透明质酸盐具有至少约200,000道尔顿的平均分子量。
119.权利要求108的方法，其中所述塞子包含至少两种透明质酸盐的混合物。
120.权利要求119的方法，其中所述组合物包含两种透明质酸盐的混合物，所述混合物包含具有第一平均分子量的透明质酸盐和具有第二平均分子量的透明质酸盐。
121.权利要求120的方法，其中具有第一平均分子量的透明质酸盐为约0.05-1.0百万道尔顿。
122.权利要求120的方法，其中具有第二平均分子量的透明质酸盐为约1.0-5.0百万道尔顿。
123.权利要求120的方法，其中具有第一平均分子量的透明质酸盐对具有第二平均分子量的透明质酸盐的平均分子量的比在1∶5至5∶1的范围内变化。
124.权利要求120的方法，其中具有第一平均分子量的透明质酸盐与具有第二平均分子量的透明质酸盐之间的平均分子量的差异为至少约0.5百万道尔顿。
125.权利要求108的方法，其中所述粉末还包含药物活性成分。
126.权利要求125的方法，其中所述药物活性成分为骨形态发生蛋白、组织生长因子、胰岛素生长因子、抗氧化剂、抗生素或生长因子的组合。
127.权利要求125的方法，其中所述药物活性成分选自BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、TGF-B、IGF-1、抗坏血酸盐或酯、丙酮酸盐或酯、BHT、庆大霉素、万古霉素、TGF-β和BMP-2的组合以及TGF-β和IGF-1的组合。
128.权利要求125的方法，其中将所述药物活性成分与透明质酸盐缀合。
129.权利要求108的方法，其中所述干燥是冻干、风干或烘箱或真空干燥。
130.权利要求108的方法，其中进一步处理所述塞子以获得按重量计算约3-20％的含湿量。
131.权利要求130的方法，其中所述含湿量为按重量计算约5％至约10％。
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