WO2018139869A1 - 골재생용 세포 치료제 및 이것의 제조 방법 - Google Patents

골재생용 세포 치료제 및 이것의 제조 방법 Download PDF

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WO2018139869A1
WO2018139869A1 PCT/KR2018/001114 KR2018001114W WO2018139869A1 WO 2018139869 A1 WO2018139869 A1 WO 2018139869A1 KR 2018001114 W KR2018001114 W KR 2018001114W WO 2018139869 A1 WO2018139869 A1 WO 2018139869A1
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bone
stem cells
mesenchymal stem
differentiated
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PCT/KR2018/001114
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박현숙
이순례
이종민
박장미
추설
모현정
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(주)세포바이오
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    • A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a cell therapeutic agent for treating bone diseases in which umbilical cord-derived undifferentiated mesenchymal stem cells and umbilical cord-derived mesenchymal stem cells are initially mixed with osteoblasts.
  • the present invention relates to a method for producing a cell therapeutic agent by differentiating umbilical cord-derived mesenchymal stem cells into bone cells in a three-dimensional environment.
  • Regenerative medicine aims to regenerate damaged areas by activating inherent recovery mechanisms of previously unrecoverable tissues or organs, or by replacing damaged tissues, so that the body can repair tissues or organs that the body cannot heal itself. Incubated in an animal, and attempting to safely implant or inject it into the body.
  • stem cell therapy using stem cell self-replicating ability and differentiation ability has been spotlighted as a treatment method for intractable diseases.
  • Bone defects are often caused by fracture and are not a problem because they are regenerated into original tissues, but bone defects or extensive bone defects caused by etiologies such as diabetes are difficult to cure by conventional treatments.
  • a wide range of bone defects occur as a result of trauma or tumors, and nearly 10,000 cases of reconstructive surgery are performed in Korea in order to treat the defects.
  • Existing major treatment methods for bone defect disease are performed by directly injecting or transplanting bone tissue into a bone defect site or by using a bone substitute.
  • autologous bone graft, xenograft, or allogeneic bone graft has been developed and applied. .
  • osteoconduction materials such as hydroxyapatite and osteoinduction materials such as air quality are used.
  • the hydroxyapatite is a physiologically active ceramic of an inorganic component and is known as a bone substitute which is highly biocompatible and biocompatible, causing bone conduction and directly being combined with bone.
  • they are effective at filling small space-constrained defects, and are not suitable for treating widespread defects or defects in areas where blood supply is insufficient.
  • BMP Breast Morphogenetic Protein
  • the treatment of bone disease tends to improve the prognosis even if the blood circulation is good.
  • blood regeneration and vascular induction are not considered. It is not superior to conventional treatments that do not contain cells, and thus, there are limitations in the treatment of bone-related diseases such as widespread bone defects or avascular necrosis. Accordingly, the present invention aims to solve this problem by providing an undifferentiated cell with excellent vascular inducer secretion and a differentiated cell with excellent bone regeneration ability by culturing and differentiating stem cells in a three-dimensional environment.
  • the osteoblast differentiation technology in the conventional two-dimensional environment takes about 3 to 6 weeks from differentiation of mesenchymal stem cells, so it takes a lot of time and money, so it is difficult to secure sufficient bone cells in a short period of time. there was. Accordingly, the present invention can rapidly culture and differentiate stem cells using a technique capable of completing differentiation within a week in a three-dimensional environment in order to obtain a large amount of cells required for application in clinical treatment.
  • the cell therapy technology according to the present invention is effective in the treatment of bone defect disease by generating new bone and cartilage and improving the surrounding environment when it is injected into the bone defect site.
  • the present invention includes both undifferentiated cells with excellent vascular inducibility and early differentiated cells into osteocytes to favor new bone formation, and in particular, it can be prepared by immediately mixing in the field during use.
  • an object of the present invention is to provide a cell therapy agent for treating bone diseases excellent in blood vessel induction and bone regeneration ability based on allograft.
  • the inventors of the present invention in the development of bone cell therapy with excellent bone regeneration effect using stem cells, stem cells differentiated into bone cells based on umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, such as VEGF, with good ability to secrete blood vessels It was found that the excellent bone regeneration effect appeared by mixing the proper ratio to complete the present invention.
  • the present invention is characterized by the early differentiation of stem cells in a three-dimensional environment to prepare a cell therapy.
  • One aspect of the present invention provides a cell therapeutic agent for treating bone diseases composed of umbilical cord-derived undifferentiated mesenchymal stem cells and umbilical cord-derived mesenchymal stem cells and initially differentiated into osteoblasts at a rate of 0.5 to 1.5.
  • Cells initially differentiated into osteoblasts are characterized in that they are preosteoblst or immature osteoblasts.
  • the cells differentiated into bone cells is characterized in that differentiated in less than about 5 days in a three-dimensional environment based on the hydrogel.
  • CD 73 marker expression is reduced by less than 10% compared to undifferentiated mesenchymal stem cells
  • osteopontin (osteopontin) expression is increased by more than 10% compared to undifferentiated mesenchymal stem cells do.
  • the cell therapeutic agent according to the present invention can be prepared by storing and moving each of the undifferentiated mesenchymal stem cells and the cells initially differentiated into osteoblasts separately, and mixing the undifferentiated cells and the differentiated cells in use. Can be.
  • the cell therapy agent according to the present invention is characterized in that it is placed in the implanted bone defect site for about 1 month to about 2 months to promote bone regeneration.
  • Another aspect of the invention provides a method of preparing a cell therapy for treating bone disease, comprising the following steps:
  • step (b) fractionating a portion from the cells cultured in step (a) to induce bone differentiation in about three days or less in a three-dimensional environment;
  • step (c) separately cryopreserving the undifferentiated cells cultured in step (a) and the cells initially differentiated into osteocytes in step (b);
  • the cells differentiated initially from the osteoblasts into the undifferentiated cells may be mixed at a ratio of 0.5 to 1.5.
  • Cell therapy according to the present invention is prepared by mixing the cells differentiated into osteocytes from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells and umbilical cord-derived undifferentiated mesenchymal stem cells in an appropriate ratio, and can provide an effect of promoting bone regeneration at the site of bone disease.
  • the cells differentiated into osteoblasts induce osteoogenesis
  • the undifferentiated stem cells induce angiogenesis, thereby mixing the two kinds of cells with different properties to significantly increase bone reconstruction. Can be achieved effectively.
  • the cell therapy agent of the present invention is not an autotransplantation but an allograft method, the cell therapy agent is not only inexpensive, but also has the advantage of easily obtaining the raw material in that cells or tissues called mesenchymal stem cells can be recycled.
  • the three-dimensional bone differentiation method of the present invention can be shortened the production period compared to the conventional two-dimensional bone differentiation method that requires a period of 4 to 6 weeks by differentiation from mesenchymal stem cells to bone cells for less than 5 days. There is an advantage.
  • the method of culturing and differentiating mesenchymal stem cells in a three-dimensional environment is not a laboratory environment, but provides an environment very similar to the culture and differentiation environment of cells in the human body, thereby undifferentiating cells differentiated into bone cells.
  • all stem cells by releasing a biological material as compared to cells cultured or differentiated in a two-dimensional environment it can exhibit an excellent effect as a cell therapy.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a cell therapeutic agent according to the present invention.
  • the cell therapeutic agent according to the present invention is prepared by mixing both undifferentiated mesenchymal stem cells excellent in angiogenesis and mesenchymal stem cells differentiated into osteoblasts having excellent bone differentiation ability.
  • mesenchymal stem cells that are not differentiated in a three-dimensional environment provide angiogenesis
  • mesenchymal stem cells differentiated into bone cells differentiated in a three-dimensional environment can provide excellent bone regeneration effect by providing bone differentiation ability. It is a concept.
  • Figure 1 shows an X-ray photograph confirming the degree of bone regeneration after applying the cell therapy according to the invention to the bone disease site.
  • Figure 2 is a graph showing the results of comparative experiments on the differentiation capacity of mesenchymal stem cells derived from various.
  • the degree of bone differentiation was measured in bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMMSC), adipose derived mesenchymal stem cells (ADMSC), umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (UCMSC), embryonic-derived mesenchymal stem cells (ESMSC) and periodontal ligament cells (PDL).
  • BMMSC bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • ADMSC adipose derived mesenchymal stem cells
  • UMSC umbilical cord-derived mesenchymal stem cells
  • EMSC embryonic-derived mesenchymal stem cells
  • PDL periodontal ligament cells
  • Figure 3 is a graph and image showing the degree of vascular growth factor secretion and angiogenesis of various mesenchymal stem cells.
  • Figure 3 (a) is a graph measuring the secretion amount of VEGF in bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMMSC), adipose derived mesenchymal stem cells (ADMSC), umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (UCMSC), periodontal ligament cells (PDL).
  • BMMSC bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • ADMSC adipose derived mesenchymal stem cells
  • UMSC umbilical cord-derived mesenchymal stem cells
  • PDL periodontal ligament cells
  • Figure 3 (b) is F- showing the degree of angiogenesis induced in bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMMSC), adipose derived mesenchymal stem cells (ADMSC), umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (UCMSC), periodontal ligament cells (PDL) Actin fluorescence image.
  • BMMSC bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • ADMSC adipose derived mesenchymal stem cells
  • UMSC umbilical cord-derived mesenchymal stem cells
  • PDL periodontal ligament cells Actin fluorescence image.
  • Figure 4 is a graph measuring the alkaline phosphatase activity (Alkaline Phosphatase activity) according to the mixed ratio of cells differentiated into osteocytes and undifferentiated stem cells derived from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.
  • Figure 4 (a) is a graph measuring the activity while increasing the ratio of undifferentiated cells based on the differentiated cells.
  • Figure 4 (b) is a graph measuring the activity while increasing the ratio of differentiated cells on the basis of undifferentiated cells.
  • FIG. 5 is an X-ray image showing bone regeneration results of a rat 1.5mm partial bone defect model test in rat.
  • Three experimental groups were derived from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (UCMSCs), each of undifferentiated stem cells (undiff), osteoblast-differentiated cells (diff), and undifferentiated stem cells and differentiated cells.
  • UMSCs umbilical cord-derived mesenchymal stem cells
  • rediff undifferentiated stem cells
  • diff osteoblast-differentiated cells
  • mixed group is an image taken 1 day, 2 weeks, 5 weeks after injection.
  • ADMSC adipose derived mesenchymal stem cells
  • UMSC umbilical cord-derived mesenchymal stem cells
  • FIG. 7 is an image showing bone regeneration results in the femur 1.5cm defective goat model test.
  • the left drawings are the results of treatment using conventional exelos, and the right drawings are the results of treatment using the smart cell bone and exelos according to the present invention.
  • the uppermost drawing is a picture of the goat's femur bone
  • the middle drawing is an image of the femur at the test site to check whether the bone is regenerated using a micro CT.
  • the figure below shows the degree of calcium deposition in the image taken of the cross section of the test site to check whether the bone defects bone regeneration.
  • FIG. 8 is a graph showing markers of mesenchymal stem cells according to the course of differentiation. The degree of expression of VEGFR-2, CD73, and OSP markers on day 0 (undifferentiated), day 3, and day 5 of differentiation was measured.
  • Figure 9 shows the experimental results for measuring the length of time that the animals treated with the cell therapeutic agent according to the present invention and the transplanted cells are seated and maintained in the host tissue.
  • the left side is a mixture of undifferentiated and differentiated cells of adipocyte-derived mesenchymal stem cells, and the right side is a result of mixing undifferentiated and differentiated cells of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells.
  • the upper image is a measure of the degree of neo-collagen formation, and the lower image shows the fluorescence staining of markers specific for human-derived cells (ie, the nucleus).
  • bone disease refers to a condition in which bones (bones, bones) are damaged, so that the composition and density of bones are changed and fractures are likely to occur.
  • Bone is the hardest tissue in the body that maintains the stability of the skeletal system. It is used as a lever for muscles and protects internal organs as well as storing minerals such as calcium and magnesium. Most of these bone diseases are caused by trauma such as fracture, or metabolic diseases such as avascular necrosis and osteoporosis, and regardless of the cause, there is a problem in the mechanical support of the body. cause.
  • Bone disease herein includes osteoporosis, osteonecrosis, arthropathy, Paget's disease and bone dysplasia.
  • osteoporosis refers to a condition in which the amount of bone decreases and the bone strength decreases due to qualitative changes, and thus the fracture is likely to occur.
  • the main causes are genetics, early menopause, excessive diet, and steroid drugs. Becomes
  • ischemic necrosis is used in the same sense as ischemic necrosis and avascular necrosis and is a painful disease in which bone tissue is killed by blocking oxygen or nutrient supply as a disorder of blood circulation. Progresses, and in severe cases, arthritis.
  • the "pseudoarthrosis” is a disease in which broken bones are not completely healed in the process of healing the broken bones, and the broken parts play a role as a joint, and osteogenic union does not occur in the fractured parts, and is connected with simple connective tissue.
  • the "Paget's disease” is a metabolic disorder that occurs during the bone remodeling process in old age. It is a localized bone disease in which the skeletal system of a wide range of areas is invaded. Bone formation occurs in mosaic form, accompanied by fibrosis and angiogenesis, and malformations and swelling. It is a disease that occurs. Bone dysplasia is a congenital rare hereditary disease that causes bones to fracture without sneezing or lightly bumping.
  • MSCs Mesenchymal Stem Cells
  • Mesenchymal Stem Cells are proliferative progenitor cells or parts derived directly from mesoderm and forming cells such as mesenchymal tissue, dental tissue, cartilage, tendons, bone marrow stroma or muscle. Means differentiated cells. Mesenchymal stem cells can be obtained from bone marrow, periosteum, spongy bone, fat, synovial membrane, smooth muscle, lungs, teeth, cord blood and umbilical cord.
  • differentiation refers to a phenomenon in which structures or functions are specialized to each other during cell division, proliferation, and growth, that is, the shape or function of an organism's cells, tissues, etc., to perform a given task to each one. It means to change. For example, qualitatively between parts of a living organism that were almost homogeneous in the first place, such as head or torso distinctions between eggs that were initially homogenous in the development, or cells such as muscle cells or neurons. Phosphorus difference occurs, or as a result, the state divided into subclasses which can be distinguished qualitatively is called differentiation.
  • the term “differentiated cell” refers to a cell in which a stem cell develops directionally as a cell having a specific function.
  • the term “undifferentiated cell” as used herein has the potential to develop into a cell having a specific function according to differentiation conditions and has a self-proliferative function as a stem cell, but has not yet been activated It means a cell in a state.
  • cell differentiated into bone cells refers to pre-osteoblasts, immature osteoblasts, which are in the bone development (osteogenesis) stage of differentiation from stem cells to bone cells.
  • mature osteoblasts and osteoblasts differentiated into osteoblasts refers to the cells forming bone cells.
  • characteristic factors of osteogenic cells begin to be expressed. For example, differentiation into osteocytes increases the level of alkaline phosphatase, which is an early marker of osteoblast differentiation expressed by mesenchymal stem cells. As shown in the graphs of FIGS.
  • the amount of alkaline phosphatase expression varies according to the mixing ratio in a composition prepared by mixing undifferentiated stem cells and stem cells differentiated into osteoblasts. .
  • CD73 is characterized that the expression decreases as the bone differentiation progresses
  • osteopontin osteopontin, osp
  • VEGFR-2 is an angiogenesis factor inducer VEGF receptor that is reduced upon induction of bone differentiation.
  • a cell therapeutic agent for treating bone diseases which comprises a mixture of initial differentiated cells and undifferentiated mesenchymal stem cells into mesenchymal stem cells in a specific ratio.
  • the cell therapeutic agent concept according to the present invention may refer to FIG. 1.
  • the cell therapeutic agent of the present invention is characterized by improving bone regeneration by inducing angiogenesis by including mesenchymal stem cells and mesenchymal stem cells, which are initially differentiated into osteoblasts.
  • the stem cells initially differentiated into the bone cells are not lost in the injected body, and thus the differentiated stem cells serve to induce angiogenesis so that bone differentiation is continuously formed to form complete bone cells.
  • angiogenesis is very important. Because they differentiate into bone cells, but if angiogenesis is not rapid, the transplanted cells do not survive and eventually lead to necrosis.
  • the present invention solves this problem by adding undifferentiated stem cells excellent in angiogenesis inducing ability to stem cells differentiated into osteocytes, and allows the implanted stem cells to be stably seated to allow bone regeneration.
  • the cell therapeutic agent according to the present invention is characterized by using umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (UCMSC).
  • the umbilical cord-derived mesenchymal stem cells are excellent in the degree of cell proliferation, can secure a sufficient amount without a separate surgery, has the advantage of releasing a large amount of vascular inducer.
  • BDMSC bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • ADMSC adipose derived mesenchymal stem cells
  • EMSC embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells
  • PDL periodontal ligament cells
  • umbilical cord-derived mesenchymal stem cells As a result of these experiments, umbilical cord-derived stem cells excellent in bone regeneration and angiogenesis are selected among various mesenchymal stem cells, and used as raw materials for the cell therapy of the present invention.
  • the cells differentiated into osteocytes used in the cell therapy of the present invention are characterized in that the cells are initially induced even in the osteoblast differentiation step.
  • the "differentiated cells into osteoblasts” refers to cells before the osteoblast stage, and refers to pre-osteoblasts or immature osteoblasts.
  • the "cells initially differentiated into bone cells” is characterized in that the expression of the CD 73 marker is reduced by 10% or less compared to undifferentiated mesenchymal stem cells, the expression of osteopontin (osteopontin, osp) compared to undifferentiated mesenchymal stem cells It is characterized by an increase of 10% or more.
  • the "differentiated cells into bone cells early" of the present invention is preferably differentiated by about three days or less by a three-dimensional differentiation method, more preferably about three days.
  • the cells differentiated into osteoblasts have excellent osteoinduction inducing ability.
  • the graph of Figure 2 shows the color development by measuring the absorbance at 550 nm after staining various mesenchymal stem cells with Alizarin red dye.
  • Induction of bone differentiation in bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMMSC), adipose derived mesenchymal stem cells (ADMSC), umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (UCMSC), embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells (ESMSC) and periodontal ligament cells (PDL) Indicates.
  • BMMSC bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • ADMSC adipose derived mesenchymal stem cells
  • UMSC umbilical cord-derived mesenchymal stem cells
  • EMSC embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells
  • PDL periodontal ligament cells
  • the undifferentiated cells can induce angiogenesis important for bone regeneration by secreting a large amount of vascular endothelial growth factor (VEGF).
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • BMMSC bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • ADMSC adipose derived mesenchymal stem cells
  • UMSC umbilical cord-derived mesenchymal stem cells
  • EMSC embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells
  • PDL periodontal ligament cells
  • the cells differentiated into the bone cells with respect to the undifferentiated cells can be mixed at a ratio of 0.5 to 1.5.
  • the ratio is counted based on the number of cells. It is preferable to mix the cells differentiated into the osteoblasts at a ratio of 0.5 to less than 1 with respect to the undifferentiated cells, and most preferably mix the differentiated cells at a ratio of 1 to 1 with respect to the undifferentiated cells. .
  • the inventors performed the following experiment. Referring to FIG. 4, the cells differentiated into osteoblasts were mixed at different ratios with respect to undifferentiated cells, and then alkaline phosphatase activity was measured.
  • Alkali phosphatase activity was measured after a constant increase in the proportion of undifferentiated cells relative to differentiated cells. As a result, there was no change in alkaline phosphatase activity even when the content of undifferentiated cells was increased (FIG. 4A). Therefore, even if the content of undifferentiated cells was increased, it was determined that undifferentiated cells did not affect alkaline phosphatase activity of differentiated cells. However, in experiments where the ratio of differentiated cells was constantly increased on the basis of undifferentiated cells, the ratio of the differentiated cells to the undifferentiated cells was 1 to 1, and the activity was highest until 0.5 to 1.5. This was somewhat superior.
  • the cell therapy agent according to the present invention provides an excellent bone regeneration effect in the bone defect area. This effect was confirmed through animal model experiments. Animal models in which (i) only cells differentiated into osteoblasts are injected, (ii) only undifferentiated cells are injected, and (iii) osteoblasts and undifferentiated cells are mixed and injected together. Eggplant groups were compared. In FIG. 5, the degree of bone regeneration was examined using cells obtained from umbilical cord stem cells (UCMSC) in a rat tibia bone defect model. Certainly, when the cells differentiated into osteocytes and the undifferentiated cells were mixed together (Fig. 5 (iii)), the bone regeneration effect was excellent. In FIG.
  • UMSC umbilical cord stem cells
  • a method of preparing a cell therapeutic agent for treating bone diseases is provided.
  • the method for producing a cell therapeutic agent according to the present invention is characterized in that differentiation of mesenchymal stem cells in a three-dimensional environment, wherein the three-dimensional environment is formed by a hydrogel, the hydrogel simulates the actual environment in the organism Make it possible. It is preferable that it is a poloxamer as said hydrogel.
  • the method for preparing a cell therapeutic agent according to the present invention includes the following steps:
  • step (b) fractionating a portion from the cells cultured in step (a) to induce bone differentiation in about three days or less in a three-dimensional environment;
  • step (c) separately cryopreserving the undifferentiated cells cultured in step (a) and the cells initially differentiated into osteocytes in step (b);
  • Step (a) is a step of proliferating and culturing stem cells at 37 ° C. and CO 2.
  • step (a) differentiation of stem cells does not occur, and in order to stably preserve undifferentiated cells
  • step (a) Some of the cells in the step may be cryopreserved.
  • Step (b) according to the present invention is a step of inducing differentiation of some fractionated cells of the cells cultured in step (a) into osteocytes.
  • Existing bone differentiation step inoculated stem cells into cell culture vessels and exchanged with bone differentiation-inducing media when the cell density was 85-90% in pretreatment medium for inducing bone differentiation and induced bone differentiation for 4 to 8 weeks.
  • the bone differentiation period of mesenchymal stem cells can be shortened to about 7 days or less by using a hydrogel-based three-dimensional bone differentiation method.
  • the bone differentiation in step (b) according to the present invention is preferably about 5 days or less.
  • the period of induction of bone differentiation of about 5 days is such that the stem cells do not completely differentiate into osteocytes, but only into early osteoblasts.
  • the cells differentiated into osteocytes as a constituent of the cell therapy according to the present invention are preferably cells of an early differentiation stage rather than complete differentiation, the osteoblast differentiation time according to the present invention should be shorter than the complete differentiation time.
  • the mesenchymal stem cells may be differentiated into osteoblasts or immature osteoblasts, which are the initial cells of the bone differentiation stage, according to the above osteogenic differentiation of step (b).
  • the step (c) is to cryopreserve the undifferentiated cells and the differentiated cells, respectively, and thaw the cryopreserved cells when necessary and mix them.
  • Step (d) is a step of mixing the initially differentiated cells into undifferentiated cells and osteocytes.
  • the differentiated cells may be mixed at a ratio of 0.5 to 1.5 with respect to the undifferentiated cells. It is preferable to mix the cells differentiated into the osteoblasts at a ratio of 0.5 to less than 1 with respect to the undifferentiated cells, and most preferably mix the differentiated cells at a ratio of 1 to 1 with respect to the undifferentiated cells. .
  • the mesenchymal stem cells were passaged using a culture medium suitable for each tissue-derived cells in CEFOgro TM series medium at 37 ° C. 5% CO 2 , and the cells were incubated at 6,000 cells / cm 2 for 4 days. Once every two days, the medium was changed freshly and passaged at 90-95% confluency to maintain cells.
  • UMSC umbilical cord-derived mesenchymal stem cells
  • BMMSC Bone bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • ADMSC adipose derived mesenchymal stem cells
  • UMSC umbilical cord-derived mesenchymal stem
  • EMSC embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells
  • PDL periodontal ligament cells Alizarin Red S. staining was used to induce differentiation and to confirm the deposition of deposited calcium.
  • the same conditions as the cell inoculation and the total incubation period of the experimental group were the same, but only bone differentiation pretreatment medium was used without treating the differentiation induction medium.
  • Each cell from different tissues was used after culturing up to 6 passages in a T75 culture vessel. Inoculate each cell at 20,000 cells / cm 2 in a petri dish prepared by applying hydrogel (SIGMA, Germany) at least 1 hour and 30 minutes to induce bone differentiation and solidifying in a gel state. Incubated at. After 24 hours, the culture dish was removed and the bone differentiation pretreatment medium was replaced with bone differentiation induction medium. Culture plate with bone differentiation induction medium was placed in the cell culture medium and replaced the bone differentiation induction medium every two days, and induction of bone differentiation was carried out for 3, 5, 7 days according to the experimental conditions.
  • BMMSC Bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • ADMSC adipose derived mesenchymal stem cells
  • UMSC umbilical cord-derived mesenchymal stem cells
  • PDL periodontal ligament cells
  • Mesenchymal stem cells were co-cultured for one day without direct contact between the two cells, with a polymer membrane (12 mm transwell) at the boundary.
  • umbilical vein-derived endothelial cells were cultured alone using a membrane (12mm transwell), and the negative control group was cultured without treatment of VEGF, and the positive control group induced vascularization by treating 20ng / ml of VEFG.
  • VEGF ELISA Endothelial Growth Factor
  • BMMSC bone marrow-derived mesenchymal stem cells
  • ADMSC adipose derived mesenchymal stem cells
  • UMSC umbilical cord-derived mesenchymal stem cells
  • PDL periodontal ligament cells
  • ALP alkaline phosphatase
  • the cells used in the experiment were UCMSC (undifferentiated) cultured with bone differentiation pretreatment medium (CEFO, Korea) at passage 7 with UCMSC and bone differentiation-induced cells (differentiation) treated with bone differentiation induction medium in polymer membrane for 5 days.
  • the experiment was carried out by dividing the two cells in two ways. 4A shows that when 38,000 cells of differentiated cells were set to 1, the ratio of undifferentiated cells was increased by 0.5 from 0 to 2, and in contrast, in FIG. 4B, the ratio of undifferentiated cells was fixed to 1 and the ratio of differentiated cells increased from 0.5 to 0 to 2. And analyzed.
  • the cells were washed twice with PBS, and all the cells attached to 400ul were dissolved in the assay buffer, and 400ul of lysate was collected in a 1.5ml tube. The supernatant obtained by centrifugation for 3 min at 13,000 g was analyzed for ALP activity. The reaction plate was measured for absorbance at 405nm and the results are shown in Figures 4a and 4b.
  • CEFOgro TM UCMSC (CEFO Co., Korea) media collected umbilical cord-derived mesenchymal stem cells cultured at 37 ° C and 5% CO2 and bone differentiation-induced cells with 3D bone differentiation.
  • Samples were prepared by washing twice with (PBS) with phosphate buffered saline containing 2% albumin and at 4 ° C. for 1 hour with VEGFR-2 (SantaCruz), CD73 (Merck-Millipore), and OSteopontin (OSP, R & D system) antibodies. Reaction at It was then washed twice with PBS containing 2% albumin and reacted with an anti-mouse secondary antibody labeled with FITC at 488 nm for 30 minutes. After washing twice with PBS, 2% formaldehyde was fixed and read by flow cytometer (FACS Calibur, BD science) and analyzed using the CellQuest Pro (BD science) program (FIG. 8).
  • Pellets of differentiated cells were collected, suspended in a heterogeneous cryopreservation solution (CEFO Co., Koera) for bone differentiation-induced cells to a concentration of 1x10 7 cells / mL, and stored in a 1mL container in a -196 ° C nitrogen storage tank. .
  • a heterogeneous cryopreservation solution CEFO Co., Koera
  • Rat tibia was drilled to create a 1.5 mm partial bone defect model.
  • three experimental groups were constructed to treat cells obtained from umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (UCMSC) and confirmed the therapeutic effect for 7 weeks.
  • the three experimental groups were undifferentiated group, bone differentiation induction group, undifferentiated and osteodifferentiated cell mixed group, respectively.
  • the degree of bone regeneration was confirmed by X-ray image. (FIG. 6)
  • a model of bone defect 4 mm in diameter was made in the rat's skull (calvaria).
  • three experimental groups were constructed to treat cells to confirm the bone regeneration effect of each experimental group for 8 weeks.
  • the cells were obtained from adipose derived mesenchymal stem cells (ADMSC) and umbilical cord derived mesenchymal stem cells (UCMSC).
  • ADMSC adipose derived mesenchymal stem cells
  • UMSC umbilical cord derived mesenchymal stem cells
  • the three experimental groups were undifferentiated group, bone differentiation induction group, undifferentiated and osteodifferentiated cell mixed group, respectively.
  • the degree of bone regeneration was confirmed by the ⁇ CT image (FIG. 6).
  • Tissues were obtained after treatment with cells using a rat cranial defect model and maintained for 8 weeks. The obtained tissues were frozen and sectioned to examine whether bone regeneration was performed. First, staining was performed using Goldner's Trichrome Kit (Merck) to confirm neo-collagen production. After staining, bone regeneration was confirmed by confirming the production of collagen using a microscope. To confirm whether bone regeneration is caused by the injected cells, frozen sections of the tissues in which the bone deficiency test was completed for 8 weeks were washed well with PBS, and then reacted with PBS containing 2% albumin for 10 minutes, and the Human Nuclei antibody (Millipore) was used. And reacted for 1 hour.
  • PBS Human Nuclei antibody

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Abstract

본 발명은 탯줄유래 간엽줄기세포에서 유래된 골세포로 분화된 세포 및 미분화된 탯줄유래 간엽줄기세포를 특정 비율로 혼합하여 제조된 골 질환 치료용 세포 치료제에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명은 미분화 세포에 대하여 골세포로 분화된 세포를 0.5 내지 1.5 비율로 혼합하여 사용함으로써, 미분화 세포가 혈관형성을 촉진함으로써 골재건 또는 골 형성을 촉진시킴으로써 골 질환을 효과적으로 치료할 수 있는 세포치료제를 제공할 수 있다.

Description

골재생용 세포 치료제 및 이것의 제조 방법
본 발명은 탯줄유래 미분화 간엽줄기세포 및 탯줄유래 간엽줄기세포에서 골세포로 초기 분화된 세포를 혼합한 골 질환 치료용 세포 치료제에 관한 것이다. 특히, 3차원 환경에서 탯줄유래 간엽줄기세포를 골세포로 분화시킴으로써 세포 치료제의 제조 방법에 관한 것이다.
현대 의료기술은 인간의 세포와 조직 또는 장기를 대체 또는 재생시켜서 원래의 기능으로 회복 또는 복원시키는 방향으로 발전하고 있는데, 이러한 기술을 재생의학이라고 일컫는다. 재생의학은 기존에는 회복이 불가능했던 조직이나 장기의 고유 회복 메커니즘을 활성화시키거나 또는 손상된 조직을 교체함으로써 손상된 부위를 재생시키는 것에 목적을 두고 있기 때문에, 신체가 스스로 치유할 수 없는 조직 또는 장기를 실험실에서 배양하여, 이를 신체 내로 안전하게 이식하거나 주입하는 시도를 포함한다. 재생의료에 기반한 치료법으로서 난치성 질환에 대한 치료방법으로 줄기세포의 자기복제능력 및 분화능력을 이용한 줄기세포치료제가 각광을 받고 있다. 그러나, 사용되는 세포의 기원, 유래 부위, 배양 정도, 분화 정도 등 다양한 요인에 기인된 위험요소로 인하여 안전성 및 유효성에 대한 기준이 엄격하여 인허가에 어려움이 있으나 차세대 치료제로 연구 개발이 활발히 진행되고 있다.
고령화 시대를 맞이하여 노령인구가 증가하면서 골 결손 치료제의 시장규모가 크게 증가할 것으로 예상된다. 골 결손은 골절에 의하여 흔히 발생하며 원래의 조직으로 재생되므로 문제가 되지 않지만, 당뇨병 등의 병인에 의한 골 결손 또는 광범위한 골 결손은 기존의 치료법으로는 완치가 어렵다. 특히 광범위한 골 결손은 외상이나 종양 등의 결과로 발생하는데 결손을 치료하기 위하여 국내에서 1년에 1만건에 가까운 재건 수술이 행하여지고 있는 실정이다. 골 결손 질환에 대한 기존의 주요 치료 방법은 골 결손 부위에 골 조직을 직접 주입 또는 이식하거나 골대체제를 이용하는 방법으로 수행되고 있으며, 최근에는 자가 골이식술, 이종 또는 동종 골 이식술이 발달되어 적용되고 있다. 그러나, 자가 골 이식의 경우, 골 형성 측면에서는 효과적이나 공급에 한계가 있고 채취 부위의 손상을 가져오는 문제가 있으며, 이종 골 이식술의 경우, 질병의 전염, 감염의 위험이 있으며, 인조 골의 사용은 골전도성은 좋으나 골유도성은 제한되어 있다.
한편, 자가 골대체제로는 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 등의 골전도(osteoconduction) 물질 및 공기질과 같은 골유도(osteoinduction) 물질이 이용되고 있다. 상기 하이드록시아파타이트는 무기질 성분의 생리활성 세라믹으로 생체적합성이 좋고 생체친화성이 높아 골전도도 유발하고 직접적으로 골과 합해지는 골대체물로 알려졌다. 하지만 이들은 작은 크기의 한정된 공간의 결손을 채우는데 효과적이지 광범위한 결손이나 혈관공급이 충분하지 않은 부위의 결손을 치유하는데 적합하지 않다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서 최근에는 골형성 단백질(BMP: Bone Morphogenetic Protein)를 이용하는 방법도 연구되고 있으나 종양형성의 위험으로 인하여 점차 사용이 감소되고 있고 청소년 및 유아 등의 특정 연령대에서 사용이 금지되기도 하였다.
이에 최근 조직공학과 재생의학의 발달에 의하여 손상된 조직과 장기를 치료할 수 있는 종래와는 다른 치료방법들이 개발되고 있는데 그 중 제일 각광을 받는 것이 간엽줄기세포에 의한 세포치료이다.
기존의 줄기세포를 이용한 세포치료제는 자가이식인 경우가 대부분이지만, 자가이식에 의한 세포치료제는 단가가 높아서 실제 대중적으로 상용화되기에는 어렵다는 한계가 있으며, 본 발명은 이러한 자가이식 줄기세포치료제의 문제를 해결하고자 한다.
또한, 골질환의 치료는 혈액순환이 좋은 경우 치료 예후가 더욱 향상되는 경향이 있는데 기존의 골질환 치료용 줄기세포치료제에서는 혈액순화 및 혈관유도에 대한 부분이 고려되지 않아 골재생 및 치료효과가 줄기세포가 포함되지 않는 기존 치료법에 비해 월등하지 않아 광범위 골결손이나 무혈성괴사와 같은 골 관련 질환의 치료법으로는 한계가 있었다. 이에 본 발명은 3차원적 환경에서 줄기세포를 배양 및 분화시킴으로써 혈관유도물질 분비가 우수한 미분화세포와 분화기간을 단축하고도 우수한 골재생능을 가진 분화세포를 제공함으로써 이러한 문제를 해결하고자 한다.
또한, 기존의 2차원적 환경에서의 골세포 분화 기술은 간엽줄기세포로부터 분화 시간이 대략 3주 내지 6주가 소요되므로, 시간과 비용이 많이 소요되어 단기간 내에 충분한 양의 골세포 확보가 어렵다는 한계가 있었다. 이에 본 발명은 임상 치료에 적용하기 위하여 요구되는 다량의 세포를 얻기 위하여 3차원적 환경에서 1주일 이내에 분화를 완성할 수 있는 기술을 이용하여 줄기세포를 신속하게 배양 및 분화할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 세포치료제 기술은 골결손 부위에 주입시 골결손 부위에 안착하여 새로운 골 및 연골을 생성하고 주변 환경을 개선함으로써 골결손 질환의 치료에 효과적이다.
또한, 본 발명은 혈관유도능이 우수한 미분화된 세포와 신생 골생성에 유리하도록 골세포로 초기 분화된 세포를 모두 포함하며, 특히 사용시 현장에서 즉시 혼합하여 제조할 수 있다는 특징이 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 동종이식 방식을 토대로 혈관유도 및 골재생능이 뛰어난 골 질환 치료용 세포치료제를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 줄기세포를 이용하여 골재생 효과가 우수한 골세포 치료제를 개발함에 있어서, VEGF와 같은 혈관유도인자 분비능이 좋은 탯줄유래 간엽줄기세포를 기초로 골세포로 분화된 세포와 분화되지 않은 줄기세포를 적정 비율로 혼합함으로써 우수한 골재생 효과가 나타남을 발견하여 본 발명을 완성하였다. 특히, 본 발명은 3차원적 환경에서 줄기세포를 초기 분화시켜 세포치료제를 제조하는데 그 특징이 있다.
본 발명의 일 양태는 탯줄유래 미분화 간엽줄기세포 및 탯줄유래 간엽줄기세포에서 유래하여 골세포로 초기 분화된 세포를 0.5 내지 1.5 비율로 혼합하여 구성되는 골 질환 치료용 세포 치료제를 제공한다.
상기 골세포로 초기 분화된 세포는 골아전구세포(preosteoblst) 또는 미성숙 골아세포(immature osteoblast)인 것을 특징으로 한다. 특히, 상기 골세포로 분화된 세포는 하이드로겔을 기반으로 구성된 3차원적 환경에서 약 5일 이하로 분화시킨 것을 특징으로 한다.
상기 골세포로 초기 분화된 세포는 CD 73 마커의 발현이 미분화 간엽줄기세포에 비하여 10% 이하 감소되고, 오스테오폰틴(osteopontin)의 발현이 미분화 간엽줄기세포에 비하여 10% 이상 증가되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 세포치료제는 상기 미분화 간엽줄기세포 및 상기 골세포로 초기 분화된 세포를 각각 별도로 동결보존한 상태에서 보관 및 이동하고, 사용시에 상기 미분화 세포와 상기 분화 세포를 혼합하여 제조될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 세포치료제는 이식된 골 결손 부위에서 약 1달 내지 약 2달 동안 안착되어 골재생을 촉진하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 양태는, 골질환 치료용 세포 치료제를 제조하는 방법을 제공하며, 다음의 단계를 포함한다:
(a) 탯줄유래 간엽줄기세포를 항온 배양기에서 3 내지 4일간 배양하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 배양된 세포로부터 일부를 분획하여 3차원적 환경에서 약 5일 이하로 골분화 유도시키는 단계;
(c) 상기 (a) 단계에서 배양된 미분화 세포 및 상기 (b) 단계에서 골세포로 초기 분화된 세포를 각각 별개로 동결보존시키는 단계; 및
(d) 필요한 때에 상기 동결보존된 미분화 세포 및 상기 동결보존된 골세포로초기 분화된 세포를 혼합하는 단계.
상기 미분화 세포에 대하여 상기 골세포로 초기 분화된 세포를 0.5 내지 1.5의 비율로 혼합할 수 있다.
상기 (b) 골분화 유도 단계의 3차원적 환경은 하이드로겔을 기반으로 조성된다.
본 발명에 따른 세포치료제는 탯줄유래 간엽줄기세포에서 골세포로 분화된 세포 및 탯줄유래 미분화 간엽줄기세포를 적정 비율로 혼합하여 제조된 것으로서, 골 질환 부위에서 골 재생을 촉진시키는 효과를 제공할 수 있다. 특히, 상기 골세포로 분화된 세포는 골조직 신생(osteogenesis)을 유도하고, 상기 분화되지 않은 줄기세포는 혈관신생(angiogenensis)을 유도함으로써, 두 종류의 서로 다른 성질의 세포를 혼합함으로써 골재건을 매우 효과적으로 달성할 수 있다.
또한, 본 발명의 세포치료제는 자가이식이 아닌 동종이식 방법이므로 비용이 저렴할 뿐만 아니라, 간엽줄기세포라는 세포 또는 조직을 재활용할 수 있다는 점에서 그 원료 입수가 용이하다는 장점도 있다.
또한, 본 발명의 3차원적 골분화 방법은 5일이하동안 간엽줄기세포로부터 골세포로 분화가 이루어짐으로써 기존의 4 내지 6주의 기간이 필요한 2차원적 골분화 방법에 비하여 제조기간을 단축할 수 있다는 장점이 있다.
또한, 3차원적 환경에서 간엽줄기세포를 배양 및 분화시키는 방법은, 실험실적인 환경이 아니라, 인체내에서 세포의 배양 및 분화 환경과 매우 유사한 환경을 제공함으로써, 골세포로 분화된 세포와 미분화된 줄기세포 모두에서는 2차원적 환경에서 배양 또는 분화된 세포에 비하여 친생체적인 물질을 분비하게 됨으로써 세포치료제로서 우수한 효과를 나타낼 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 세포 치료제의 개략도이다. 본 발명에 따른 세포치료제는 혈관생성능이 우수한 미분화 간엽줄기세포와 골분화능이 우수한 골세포로 분화된 간엽줄기세포의 양자를 혼합하여 제조하는 것을 특징으로 한다. 구체적으로는, 3차원 환경에서 분화되지 않은 간엽줄기세포가 혈관생성능을 제공하고, 3차원 환경에서 분화시킨 골세포로 분화된 간엽줄기세포는 골분화능을 제공함으로써, 우수한 골재생 효과를 제공할 수 있다는 개념이다. 또한, 도 1에서는 본 발명에 따른 세포치료제를 골질환 부위에 적용한 후 골재생 정도를 확인하 X-선 사진을 보여주고 있다.
도 2는 다양한 유래의 간엽줄기세포의 골분화능에 대한 비교 실험 결과를 보여주는 그래프이다. 골수유래 간엽줄기세포(BMMSC), 지방유래 간엽줄기세포(ADMSC), 탯줄유래 간엽줄기세포(UCMSC), 배아유래 간엽줄기세포(ESMSC) 및 치주인대세포(PDL)에서 골분화 유도 정도를 측정하였다.
도 3은 다양한 간엽줄기세포의 혈관성장인자 분비 정도 및 혈관형성 정도를 보여주는 그래프 및 이미지이다. 도 3(a)는 골수유래 간엽줄기세포(BMMSC), 지방유래 간엽줄기세포(ADMSC), 탯줄유래 간엽줄기세포(UCMSC), 치주인대세포(PDL)에서 VEGF의 분비량을 측정한 그래프이다. 도 3(b)는 골수유래 간엽줄기세포(BMMSC), 지방유래 간엽줄기세포(ADMSC), 탯줄유래 간엽줄기세포(UCMSC), 치주인대세포(PDL)에서 혈관형성이 유도된 정도를 보여주는 F-액틴 형광 이미지이다.
도 4는 탯줄유래 간엽줄기 세포에서 골세포로 분화된 세포와 분화되지 않은 줄기세포 혼합율에 따른 알칼리 포스파타제 활성(Alkaline Phosphatase activity)을 측정한 그래프이다. 도 4(a)는 분화된 세포를 기준으로 미분화 세포의 비율을 증가시키면서 그 활성을 측정한 그래프이다. 도 4(b)는 미분화 세포를 기준으로 분화된 세포의 비율을 증가시키면서 그 활성을 측정한 그래프이다.
도 5는 쥐의 정강이뼈 1.5mm 부분 골결손 모델 시험의 골재생 결과를 보여주는 X-선 이미지이다. 3종의 실험군은 탯줄유래 간엽줄기세포(UCMSC)에서 유래한 것으로서, 각각 분화되지 않은 줄기세포(undiff), 골세포로 분화된 세포(diff), 그리고, 분화되지 않은 줄기세포와 분화된 세포의 혼합군(mix)을 주입후 1일, 2주, 5주차에 찍은 이미지이다.
도 6은 쥐의 두개골 4mm 골결손 모델 시험의 골재생 결과를 보여주는 CT 이미지이다. 상측 도면은 지방유래 간엽줄기세포(ADMSC)를 사용한 것으로서, 각각 분화되지 않은 줄기세포(undiff), 골세포로 분화된 세포(diff), 그리고, 분화되지 않은 줄기세포와 분화된 세포의 혼합군(mix)이다. 하측 도면은 탯줄유래간엽줄기세포(UCMSC)에서 유래한 세포를 사용한 것이며, 각각 분화되지 않은 줄기세포(undiff), 골세포로 분화된 세포(diff), 그리고, 분화되지 않은 줄기세포와 분화된 세포의 혼합군(mix)이다.
도 7은 대퇴골 1.5cm 결손 염소 모델 시험에서의 골재생 결과를 보여주는 이미지이다. 좌측 도면들은 통상의 골대체제(exelos)를 이용한 치료결과이고, 우측 도면들은 본 발명에 따른 세포치료제(smart cell bone)과 골대체제(exelos)를 이용하여 치료한 결과이다. 최상측 도면은 염소의 대퇴골을 발골하여 외관을 찍은 사진이며, 중간 도면은 마이크로 CT를 사용하여 골재생 여부를 확인하기 위해 시험부위의 대퇴골을 촬영한 이미지이다. 아래 도면은 골결손 부위의 골재생 여부를 확인하기 위해 시험부위의 단면을 촬영한 이미지로 칼슘이 침착된 정도를 보여준다.
도 8은 분화 경과에 따른 간엽줄기세포의 마커를 보여주는 그래프이다. VEGFR-2, CD73, OSP 마커가 분화 0일(미분화), 분화 3일, 분화 5일차에 발현되는 정도를 측정하였다.
도 9는 동물에 본 발명에 따른 세포 치료제를 처리하고 이식된 세포가 호스트 조직에서 안착하여 유지되는 기간을 측정하기 위한 실험결과를 보여준다. 좌측은 지방세포 유래 간엽줄기세포의 미분화 및 분화 세포를 혼합한 것이고, 우측은 탯줄유래 간엽줄기세포의 미분화 및 분화 세포를 혼합한 것에 대한 결과이다. 상부의 이미지는 신생 콜라겐 형성 정도를 측정한 것이며, 하부의 이미지는 인간유래 세포(즉, 핵)에 특이적인 표지자의 형광염색 결과를 보여주는 이미지이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본원 명세서에서 사용되는 용어“골 질환(bone disease)”이란 골(bone, 骨, 뼈)에 손상이 생겨서 뼈의 구성 및 밀도가 변화하고 골절이 일어나기 쉬운 상태를 의미한다. 골은 골격계의 안정성을 유지하는 신체내 가장 단단한 조직으로서, 근육의 지렛대로 사용되고 내부의 장기를 보호할 뿐 아니라 칼슘, 마그네슘과 같은 미네랄을 저장하는 역할을 한다. 이러한 골 질환은 대부분 골절과 같은 외상, 또는 무혈성 괴사, 골다공증과 같은 대사성 질환에 의하여 발생하며, 원인과 관계없이 신체의 기계적 지지에 문제가 생겨 운동능이 저하될 뿐만 아니라 기관절의 형성 등으로 지속적 통증을 유발한다. 본 명세서에서 골 질환은 골다공증, 골괴사증, 가관절증, 파제트병 및 골형성부전증을 포함한다.
상기“골다공증(osteoporosis)”이란 골의 양이 감소하고 질적인 변화로 인해 골의 강도가 약해져서 골절이 일어날 가능성이 높은 상태를 의미하며, 주로 유전, 조기폐경, 과도한 식이요법, 스테로이드 약제 등이 주원인이 된다.
상기 “골괴사증(ostenonecrosis)”이란 허혈성 괴사증, 무혈성 괴사증과 같은 의미로 사용되며 혈액순환의 장애로 산소나 영양공급이 차단되어 골 조직이 사멸되는 통증성 질환이며, 모든 골에서 발생되지만 주로 고관절에서 진행되고, 심한 경우 관절염으로 진행된다.
상기 “가관절증(pseudoarthrosis)”이란 부러진 뼈가 치유되는 과정에서 완전히 아물지 못하여 부러진 부분이 관절과 같은 역할을 하는 상태로 골절된 부분에 골성유합이 일어나지 않고 단순한 결합 조직성으로 연결되는 질환이다.
상기 “파제트병(Paget’s disease)”이란 노년기의 골 재형성 과정에서 생기는 대사성 장애로 광범위한 부위의 골격계가 침범되는 국소성 골 질환으로 골 형성이 모자이크상으로 일어나 섬유화와 혈관신생을 동반하고 기형과 종창이 발생하는 질환이다. 골형성부전증은 특별한 원인없이 뼈가 약하여 재채기를 하거나 가볍게 부딪치는 행동만으로도 골절되는 선천성 희귀 유전질환이다.
본원 명세서에서 사용되는 “간엽줄기세포(Mesenchymal Stem Cells, MSC)”란 중배엽으로부터 직접 유래되며, 간엽 조직, 치아 조직, 연골, 힘줄, 골수 기질 또는 근육 등의 세포를 형성하는 증식성 전구 세포 또는 부분 분화된 세포를 의미한다. 간엽줄기세포는 골수, 골막, 해면질 골, 지방, 활액막, 평활근, 폐, 유치, 제대혈 그리고 제대에서 얻을 수 있다.
본원 명세서에서 사용되는 용어 "분화(differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 예를 들면, 개체발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포라든가 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다.
본원 명세서에서 사용되는 용어 “분화된 세포(differentiated cell)”는 줄기세포가 특정 기능을 가지는 세포로 방향성을 가지고 발달하는 세포를 의미하는 것이다. 또한, 본원 명세서에서 사용되는 용어 “미분화 세포(undifferentiated cell)”는 줄기세포로서 자가증식기능을 가지고 있으며 분화조건에 따라 특정기능을 가진 세포로 발달할 수 있는 잠재가능성을 가졌으나, 아직 활성화되지 않은 상태의 세포를 의미한다.
본원 명세서에서 사용되는 용어 “골세포로 분화된 세포”는 줄기세포에서 골세포로 분화되는 골형성(bone development, osteogenesis) 단계에 있는 골아전구세포(pre-osteoblast), 미성숙 골아세포(immature osteoblast), 성숙 골아세포(mature osteoblast) 그리고 골세포(osteocyte)으로 점차 분화되면서 골세포를 형성하는 세포를 의미한다. 줄기세포에서 골분화가 진행됨에 따라, 골원성 세포의 특징적인 인자들이 발현되기 시작한다. 예를 들면, 골세포로 분화되면, 간엽줄기세포에 의해 발현되는 골아세포 분화의 초기 표식이 되는 알칼리 포스파타제 수준이 증가된다. 도 4(a) 및 도 4(b)의 그래프에서 확인되는 바와 같이, 미분화 줄기세포와 골세포로 분화된 줄기세포를 혼합하여 제조된 조성물에 있어서 그 혼합 비율에 따라 알칼리 포스파타제 발현의 양이 달라진다. 이는 골 세포로의 분화 정도가 그 미분화 줄기세포와 골세포로 분화된 줄기세포의 혼합비에 따라 달라짐을 보여주는 것이다. 또한, CD73는 골분화가 진행될수록 발현이 줄어들게 되고, 오스테오폰틴(osteopontin, osp)은 골형성이 진행될수록 발현이 증가하게 되는 특징이 있다. VEGFR-2는 혈관생성인자 혈관유도인자 VEGF 리셉터로서 골분화 유도시 감소된다.
이하, 본 발명에 따른 골질환 치료용 세포 치료제 및 이것의 제조방법에 대하여 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본 발명이 이러한 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태로서, 간엽줄기세포에서 골세포로 초기 분화된 세포 및 미분화된 간엽줄기세포를 특정 비율로 혼합하여 포함하는 골질환 치료용 세포 치료제를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 세포 치료제 개념은 도 1을 참조할 수 있다. 본 발명의 세포치료제는 골세포로 초기 분화된 간엽줄기세포 및 미분화된 간엽줄기세포를 함께 포함함으로써 혈관생성의 유도를 통하여 골재생능을 향상시킨다는데 그 특징이 있다. 즉, 상기 골세포로 초기 분화된 줄기세포는 주입된 체내에서 유실되지 않고 계속적으로 골분화가 이루어져 완전한 골세포로 형성되도록 상기 미분화된 줄기세포가 혈관생성을 유도하는 역할을 한다. 줄기세포를 이용한 골 재생 방식에 있어서, 혈관생성은 매우 중요하다. 왜냐하면, 골세포로 분화는 되지만, 혈관형성이 신속히 이루어지지 않는다면, 이식된 세포는 생존하지 못하고 결국 괴사에 이르게 된다. 본 발명은 골세포로 분화된 줄기세포에 혈관생성 유도능이 탁월한 미분화된 줄기세포를 추가함으로써, 이러한 문제점을 해결하고, 주입된 줄기세포가 안정적으로 안착하여 골재생이 이루어지도록 한다.
본 발명에 따른 세포 치료제는 탯줄유래 간엽줄기세포(UCMSC)를 사용하는 것을 특징으로 한다. 상기 탯줄유래 간엽줄기세포는 세포증식 정도가 우수하고, 별도의 수술 없이 충분한 양을 확보할 수 있으며, 혈관유도인자를 다량 배출한다는 장점이 있다. 또한, 도2에서 볼 수 있는 바와 같이, 골수유래 간엽줄기세포(BDMSC), 지방유래 간엽줄기세포(ADMSC), 배아줄기세포유래 간엽줄기세포(ESMSC) 또는 치주인대세포(PDL)에 비하여, 탯줄유래 간엽줄기세포(UCMSC)는 골분화 정도가 우수하다. 또한, 도 3a 및 도 3b에서 볼 수 있는 바와 같이, 골수유래 간엽줄기세포(BDMSC), 지방유래 간엽줄기세포(ADMSC), 또는 치주인대세포(PDL)에 비하여, 탯줄유래 간엽줄기세포(UCMSC)가 혈관형성능이 훨씬 우수하다. 이와 같은 실험 결과, 다양한 간엽줄기세포 중에서도 골재생능과 혈관생성능이 가장 우수한 탯줄유래줄기세포가 선택되어 본 발명의 세포치료제의 원료로 사용되게 된다.
본 발명의 세포치료제에 사용되는 골세포로 분화된 세포는 골세포 분화 단계에서도 초기 유도된 세포인 것을 특징으로 한다. 상기“골세포로 초기 분화된 세포”는 골아세포(osteoblast) 단계 이전의 세포를 의미하는 것으로서, 골아전구세포(pre-osteoblast) 또는 미성숙 골아세포 (immature osteoblast)를 일컫는 것이다. 상기 “골세포로 초기 분화된 세포”는 CD 73 마커의 발현이 미분화 간엽줄기세포에 비하여 10% 이하 감소되는 것을 특징으로 하고, 오스테오폰틴(osteopontin, osp)의 발현은 미분화 간엽줄기세포에 비하여 10% 이상 증가되는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 “골세포로 초기 분화된 세포”는 3차원적 분화 방식에 의하여 약 5일 이하로 분화시킨 것이 바람직하며, 약 3일 분화시킨 것이 더욱 바람직하다.
상기 골세포로 분화된 세포는 우수한 골분화 유도능을 갖는다. 도 2의 그래프는 다양한 간엽줄기세포를 알리자린 레드(Alizarin red) 염색약으로 염색 후 550 nm에서 그 흡광도를 측정하여 그 발색정도를 보여준다. 골수유래 간엽줄기세포(BMMSC), 지방유래 간엽줄기세포(ADMSC), 탯줄유래 간엽줄기세포(UCMSC), 배아줄기세포유래 간엽줄기세포(ESMSC) 및 치주인대세포(PDL)에서 모두 골분화 유도능을 나타내고 있다. 특히, 탯줄유래 간엽줄기세포의 골분화 유도능이 우수하였다.
한편, 상기 미분화된 세포는 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF) 등을 다량 분비함으로써 골재생에 중요한 신생혈관형성을 유도할 수 있다. 도 3(a)에서는 다양한 간엽줄기세포의 미분화세포에서 혈관유도인자로 알려진 VEGF의 분비량을 측정함으로써 줄기세포 유래 미분화된 세포의 혈관생성유도능을 확인할 수 있다. 골수유래 간엽줄기세포(BMMSC), 지방유래 간엽줄기세포(ADMSC), 탯줄유래 간엽줄기세포(UCMSC), 배아줄기세포유래 간엽줄기세포(ESMSC) 및 치주인대세포(PDL)에서 모두 혈관생성유도능을 나타내고 있지만, 탯줄유래 간엽줄기세포에서 가장 높은 분비량을 나타내어 혈관성장 및 유도 기능이 우수함을 알 수 있다. 또한, 도 3(b)의 형광 이미지를 통하여 다양한 간엽줄기세포들의 혈관유도능을 확인할 수 있었으나, 그 중에서도 탯줄유래 간엽줄기세포의 혈광생성능이 가장 우수하였다. 도 8에 따르면, 간엽줄기세포가 분화되면 VEGFR-2의 발현이 줄어듬을 확인할 수 있는 바, 이는 간엽줄기세포가 분화되면 혈관내피성장인자 VEGF가 감소할 수 있음을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포 치료제에서 탯줄유래 미분화 간엽줄기세포가 혈관생성을 유도하는 역할을 할 수 있을 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 미분화된 세포에 대하여 상기 골세포로 분화된 세포를 0.5 내지 1.5 비율로 혼합할 수 있다. 상기 비율이란 세포의 수를 기준으로 계수된 것이다. 상기 미분화된 세포에 대하여 상기 골세포로 분화된 세포를 0.5 내지 1 미만의 비율로 혼합하는 것이 바람직하고, 상기 미분화된 세포에 대하여 상기 분화된 세포를 1 대 1의 비율로 혼합하는 것이 가장 바람직하다. 이와 같이 분화된 세포와 미분화된 세포의 적정 비율을 발견하기 위하여 본 발명자는 다음과 같은 실험을 수행하였다. 도 4를 참조하면, 골세포로 분화된 세포를 미분화된 세포에 대하여 그 비율을 달리하면서 혼합한 후 알칼리 포스파타제 활성을 측정하였다. 분화된 세포를 기준으로 미분화된 세포의 비율을 일정하게 증가시킨 후 알칼리 포스파타제 활성을 측정하였다. 그 결과 미분화 세포의 함량을 증대시켜도 알칼리 포스파타제 활성에 변화가 없는 것으로 나타났다(도 4a). 따라서 미분화 세포의 함량이 증가한다고 하더라도 미분화 세포가 분화세포의 알칼리 포스파타제 활성에는 영향을 끼치지 않는 것으로 판단되었다. 그러나, 미분화된 세포를 기준으로 분화된 세포의 비율을 일정하게 증가시킨 실험의 경우, 분화된 세포가 미분화된 세포에 대하여 그 비율이 1 대 1인 경우가 가장 활성이 높았고, 0.5 내지 1.5까지는 활성이 어느 정도 우수하였다. 그러나, 그 비율이 1.5 이상인 경우는 분화세포의 부착율 저하로 분실세포가 많아져서 알칼리 포스파타제의 활성이 상대적으로 낮게 나타나는 것으로 판단되었다(도 4b). 한편, 그 비율이 0.5 이하로 낮아지게 되면 골세포로 분화된 세포의 양이 적어서 골분화 유도효과를 충분히 나타내지 못하기 때문에 활성이 떨어지는 것이다.
본 발명에 따른 세포치료제는 골결손 부분에서 우수한 골 재생 효과를 제공한다. 이러한 효과는 동물모델 실험을 통하여 확인하였다. 동물 모델을 대상으로 (i) 골세포로 분화된 세포만을 주입한 경우, (ii) 미분화 세포만을 주입한 경우 그리고 (iii) 골세포로 분화된 세포 및 미분화 세포를 함께 혼합하여 주입한 경우의 3가지 그룹을 비교실험하였다. 도 5에서는 쥐(rat)의 정강이뼈(tibia) 골결손 모델에 탯줄유래 줄기세포(UCMSC)에서 얻은 세포를 사용하여 골재생 정도를 실험하였다. 확실히 골세포로 분화된 세포와 미분화된 세포를 함께 혼합한 경우(도5의 (iii))가 골재생 효과가 뛰어났다. 또한 도 6에서는 쥐의 두개골(calvaria) 골결손 모델에 대하여 탯줄유래 줄기세포(UCMSC)에서 얻은 각각 3가지 대조군을 비교실험하였다. 이 실험에서도 골세포로 분화된 세포와 미분화세포를 혼합한 경우(도 6의 (iii))가 골재생 효과가 우수함을 보여주었다. 특히, 본 발명에 따른 세포치료제는 이식된 골결손 부위에서 약 1달 내지 2달간 안착되어서 골재생을 도와주는 역할을 한다(도 9 참조).
본 발명의 다른 양태로서, 골질환 치료용 세포 치료제를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 세포 치료제의 제조방법은 3차원적 환경에서 간엽줄기세포를 분화시키는 것을 특징으로 하며, 상기 3차원적 환경은 하이드로겔에 의하여 조성되고, 상기 하이드로젤은 실제 생물체 내 환경의 모사를 가능하게 해준다. 상기 하이드로젤로서 폴록사머인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 세포 치료제의 제조방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 탯줄유래 간엽줄기세포를 항온 배양기에서 배양하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 배양된 세포로부터 일부를 분획하여 3차원적 환경에서 약 5일 이하로 골분화 유도하는 단계;
(c) 상기 (a) 단계에서 배양된 미분화 세포 및 상기 (b) 단계에서 골세포로 초기 분화된 세포를 각각 별개로 동결보존시키는 단계; 및
(d) 필요한 때에 상기 동결보존된 미분화 세포 및 상기 동결보존된 골세포로 초기 분화된 세포를 혼합하는 단계.
본 발명에 따른 (a) 단계는 줄기세포를 37℃, CO2 에서 증식 배양하는 단계로서, (a) 단계에서는 줄기세포의 분화는 일어나지 않으며, 미분화 상태의 세포를 안정적으로 보존하기 위하여 (a) 단계의 세포 중 일부를 동결보존할 수 있다.
본 발명에 따른 (b) 단계는 (a) 단계에서 배양된 세포 중 일부 분획된 세포를 골세포로 분화 유도시키는 단계이다. 기존의 골분화 단계는 세포배양 용기에 줄기세포를 접종하고 골분화 유도를 위한 전처리 배지에서 세포 밀도가 85~90% 정도일 때 골분화 유도배지로 교환하고 4주에서 8주동안 골분화를 유도하였다. 그러나, 본 발명에 따른 (b) 골분화 단계에서는 하이드로겔을 기반으로 하는 3차원 골분화 방식을 이용함으로써 간엽줄기세포의 골분화기간을 약 7일 이하로 단축시킬 수 있다. 본 발명에 따른 (b) 단계에서의 골분화는 약 5일 이하가 바람직하다. 특히, 약 5일 간의 골분화 유도 기간은 줄기세포가 골세포로 완전 분화되는 것이 아니라 초기 골세포로의 분화에 그치도록 하는 것이다. 본 발명에 따른 세포치료제의 구성성분으로서 골세포로 분화된 세포는 완전 분화가 아닌 초기 분화 단계의 세포가 바람직하기 때문에, 본 발명에 따른 골세포 분화 시간은 완전 분화 시간보다 짧아야 한다. 이러한 상기 (b) 단계의 골분화 유도에 따라 간엽줄기세포는 골분화 단계의 초기 세포인 골아전구세포 또는 미성숙 골아세포로 분화될 수 있다.
상기 (c) 단계는 상기 미분화 세포와 상기 분화된 세포를 각각 동결보존하는 것으로서, 필요한 때에 상기 동결보존된 세포를 해동하여 이들을 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 (d) 단계는 미분화 세포와 골세포로 초기 분화된 세포를 혼합하는 단계이다. 상기 미분화 세포에 대하여 상기 분화된 세포를 0.5 내지 1.5의 비율로 혼합할 수 있다. 상기 미분화된 세포에 대하여 상기 골세포로 분화된 세포를 0.5 내지 1 미만의 비율로 혼합하는 것이 바람직하고, 상기 미분화된 세포에 대하여 상기 분화된 세포를 1 대 1의 비율로 혼합하는 것이 가장 바람직하다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
<실시예>
간엽줄기세포의 배양
각 조직(골수, 탯줄, 지방, 치아)에서 분리 및 배양된 간엽줄기세포와 배아줄기세포유래 간엽줄기세포 계대1을 해동하여 모든 실험에 사용하였다. 해당 간엽줄기세포들은 37℃ 5% CO2조건에서 CEFOgro™시리즈 배지 중 각 조직유래 세포에 적합한 배양 배지를 이용하여 계대 배양하였으며, 세포는 6,000 cells/cm2로 접종하여 4일간 배양하였다. 이틀에 한 번 간격으로 배지를 새로 교환하였고 90~95%의 confluency를 나타내면 계대 배양하여 세포를 유지하였다.
골분화 (Osteogenic Differentiation) 의 유도
골분화 유도를 위하여 동결보존된 4계대의 탯줄 유래 간엽 줄기세포(UCMSC)를 해동하여 T75 배양용기(Nunc)에서 골분화 전처리 배지(CEFO, Korea)로 6계대까지 배양하였다. 배양된 계대6의 세포를 PBS로 2회 세척하고 0.25%의 트립신을 5분간 처리하여 배양면과 분리시켰다. 분리된 세포를 15mL tube에 포집하고 1500rpm으로 3분간 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 포집된 세포를 골분화 전처리 배지로 고르게 풀어 세포를 계수하였다.
12well-Transwell(Corning Co.)의 폴리머막 위에 하이드로겔(SIGMA, Germany) 250ul를 도포하여 약 0.3~0.5mm 두께가 되도록 1시간 30분 동안 세포배양기에 넣고 37℃에서 방치하여 졸 상태의 하이드로겔을 겔 상태로 만들었다. 겔 처리가 완료된 배양용기를 꺼내 처리된 하이드로겔 위에 용량이 250ul가 되도록 배지를 첨가하고 세포를 130,000 cells/cm2씩 접종하였다. 폴리머막 외부의 well에는 1.5mL씩 골분화 전처리 배지로 채우고 24시간 동안 세포가 안정화되도록 배양하였다. 이후 배양접시를 꺼내 배지를 모두 제거하고 골분화 유도 배지(CEFOgro™ DM Osteo, CEFO Co.)로 교체하였다. 골분화 유도 처리가 완료된 배양접시는 37℃ 5% CO2조건의 배양기에 넣고 3일간 분화시켰다.
골분화 유도능의 분석
골수유래 간엽줄기세포(BMMSC), 지방유래 간엽줄기세포(ADMSC), 탯줄유래 간엽줄기(UCMSC), 배아줄기세포유래 간엽줄기세포(ESMSC), 치주인대세포(PDL) 5가지 세포를 이용하여 골분화를 유도하고 이를 확인하기 위하여 침착된 칼슘을 염색할 수 있는 Alizarin Red S. 염색법을 이용하였다.
대조군은 실험군의 세포 접종 및 총 배양기간과 같은 조건은 동일하나 분화 유도 배지를 처리하지 않고 골분화 전처리 배지만을 사용하였다. 서로 다른 조직 유래의 각 세포는 T75 배양용기에서 6계대까지 배양 후 사용하였다. 골분화 유도를 위해서 최소 1시간 30분 전에 하이드로겔(SIGMA, Germany)을 도포하여 겔 상태로 굳은 채로 준비된 배양접시에 각각의 세포를 20,000 cells/cm2로 접종하고 골분화 전처리 배지로 채워 세포 배양기에서 배양하였다. 24시간 후 배양접시를 꺼내 골분화 전처리 배지를 골분화 유도 배지로 교체하였다. 골분화 유도배지 처리가 완료된 배양접시는 세포배양기에 넣고 2일 간격으로 골분화 유도 배지를 교체하였고, 실험조건에 따라 골분화 유도를 3,5,7일 동안 진행했다.
Alizarin Red Staining 키트(CEFO, Korea)의 사용방법에 따라 분석하였다. 분화 유도된 세포들은 각각 PBS로 2회 세척하고 4℃ 냉장시킨 70% 에탄올로 10분간 고정하였다. 3차 증류수로 에탄올을 제거한 표면에 SolⅠ으로 빛을 차단한 상태로 20분간 실온에서 반응시키고 Sol1용액을 제거하였다. Sol1용액을 SolⅡ 용액으로 3회 세척하여 완전히 제거 후 SolⅢ 용액 100ul를 처리하여 상온에서 10분간 반응시켰다. 반응 종료 후, 반응이 완료된 SolⅢ용액을 각각 96well plate에 100ul씩 옮겨 담고 550nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다. 도2에 나타난 바와 같이, 5가지 실험군 중 탯줄유래 중간엽 줄기세포(UCMSC)에서 무기질침착(칼슘침착) 정도가 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.
혈관형성능의 분석
다양한 간엽줄기세포의 신생 혈관 형성능을 비교하기 위하여, 인간탯줄정맥유래 내피세포 (Human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)를 이용한 혈관 튜브 형성 실험을 실시 하였다. 골수유래 간엽줄기세포(BMMSC), 지방유래 간엽줄기세포(ADMSC), 탯줄유래 간엽줄기세포(UCMSC), 치주인대세포(PDL)를 25,000cells/㎠로 접종하고, 인간 탯줄정맥유래 내피세포는 폴리머막(12mm Transwell)을 이용하여 배양 하였다. 간엽줄기세포는 폴리머막 (12mm Transwell)을 경계로 하여, 두 세포가 직접적인 접촉되지 않도록 하고 1일간 공배양 하였다. 대조군은 막 (12mm Transwell)을 이용하여 탯줄정맥유래 내피세포을 단독 배양 하였으며, 음성대조군은 혈관유도인자인 VEGF를 처리하지 않고 배양하였고 양성대조군은 VEFG 20ng/ml을 처리하여 혈관형성을 유도하였다.
1일간 배양된 각각의 세포는 2% 포름알데히드에 5분간 고정하였고 PBS로 세척한 후 F-actin염색을 위하여 FITC(Fluorescein Isothiocyanate)로 표지된 phalloidin (Sigma) 염색법을 실시하여 도 3b에 나타낸 바와 같이 결과를 나타내었다.
VEGF의 분비량 확인
간엽줄기세포에서 혈관내피세포증식인자 (Vascular endothelial growth factor, VEGF)의 분비 정도를 확인하기 위하여 VEGF ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)를 실시 하였고, ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하였다.
보다 구체적으로, 세포 수를 25,000cells/㎠ 로 접종하고, 골수유래 간엽줄기세포(BMMSC), 지방유래 간엽줄기세포(ADMSC), 탯줄유래 간엽줄기세포(UCMSC), 치주인대세포(PDL)를 24 well 배양 접시에 1일 배양 하였다. 1일 간 배양한 배양액만을 채취하여 VEGF ELISA를 수행 하였고, 그 결과를 도 3a에 나타내었다.
알칼리 포스파타제 활성의 분석
골분화 유도된 탯줄유래 간엽줄기세포와 미분화 탯줄 유래 간엽줄기세포를 일정 비율로 혼합하여 골결손 부위에 투여하였을 때, 골분화 표지인자인 알카라인 포스파타아제(ALP)의 발현을 보다 효과적으로 증가시키는 비율을 찾고자 Alkaline Phosphatase activity kit(GeneTex, USA)를 이용하여 ALP activity 확인 시험을 실시하였다.
실험에 사용된 세포는 UCMSC로 계대7에서 골분화 전처리 배지(CEFO, Korea)로 배양한 UCMSC(미분화)와 폴리머막에서 5일간 골분화 유도 배지를 처리한 골분화 유도 세포(분화)이다. 이 두 세포를 두 가지 방법으로 나눠 실험을 진행했다. 도 4a는 분화 세포 38,000cells을 1로 두었을 때, 미분화 세포의 비율을 0~2로 0.5씩 증가시켰고 반대로 도 4b에서는 미분화 세포를 1로 고정하고 분화세포의 비율을 0~2로 0.5씩 증가시켜 분석하였다.
UCMS 혼합비율 a b c d e
분화(고정):미분화 1:0 1:0.5 1:1 1:1.5 1:2
미분화(고정):분화 1:0 1:0.5 1:1 1:1.5 1:2
즉, 상기 표와 같은 비율로 분화와 미분화 세포를 혼합하였고 이를 각 24well 배양용기에 n=3이 되도록 3개 well씩 접종하여 24시간 부착시켰다. 부착이 완료된 배양접시는 ALP activity kit가 제공하는 실시방법에 따라 ALP 활성을 확인하였다.
세포를 PBS로 2회 세척하고 분석용 버퍼로 400ul로 부착된 세포를 모두 녹인 후, 1.5ml 튜브에 용해액 400ul를 수집하였다. 이를 13,000g에서 3min 원심분리하여 얻은 상등액으로 ALP activity 분석을 진행하였다. 반응이 완료된 분석 플레이트는 405nm에서 흡광도를 측정하였으며 이에 따른 결과는 도 4a와 도 4b에 나타내었다.
유세포분석기를 이용한 세포표면발현 표지자 분석
CEFOgro™ UCMSC (CEFO Co.,Korea)배지로 37℃, 5% CO2조건하에 배양된 탯줄유래 간엽줄기세포와 3차원 골분화 방식이 적용된 골분화 유도세포를 포집하여 각각의 세포를 4℃의 차가운 2% 알부민이 포함된 포스페이트 버퍼 살린으로 (PBS)로 2회 세척하여 샘플을 준비하고 VEGFR-2 (SantaCruz), CD73 (Merck-Millipore), OSteopontin(OSP, R&D system) 항체로 1시간 동안 4℃에서 반응시켰다. 그 후 2% 알부민이 포함된 PBS로 2회 세척하고 488nm에서 확인가능한 FITC로 표지된 항마우스 2차 항체와 30분동안 반응시켰다. PBS로 2회 세척 한 후 2% 포름알데히드로 고정하고 유세포분석기(FACS Calibur, BD science)로 읽고 CellQuest Pro (BD science)프로그램을 이용하여 분석하였다 (도 8).
세포치료제 제조 방법
(i) 미분화 세포의 제조: 동결 보관된 UCMSC를 해동하여 골분화 전처리 배지에서 2회 계대 배양한 후, 세포를 계수하여 배양접시에 8,000cells/cm2 로 접종하여 4일간 세포를 배양하여 펠렛을 얻었다. 이를 미분화 UCMSC 전용 무이종성 동결보존액(CEFO Co., Koera)으로 1x107cells/mL의 농도가 되도록 부유시켜 1mL씩 저장용기에 담아 -196℃에서 질소 저장 탱크에서 보관하였다.
(ii) 분화 세포의 제조: 동결 보관된 UCMSC를 해동하여 골분화 전처리 배지에서 2회 계대 배양한 후, 적어도 1시간 30분 전에 폴리머막에 하이드로겔을 도포하여 0.5cm 높이가 되도록 겔화시켜 둔 배양용기에 세포를 130,000cells/cm2로 접종하여 37℃ 5% CO2조건에서 24시간 배양하였다. 이 후 배양 용기에서 골분화 전처리 배지를 모두 제거하고 골분화 유도배지로 교체하여 3일간 세포를 분화시켰다. 분화가 완료된 세포의 펠렛 모아 골분화 유도세포용 무이종성 동결보존액(CEFO Co., Koera)으로 1x107cells/mL의 농도가 되도록 부유시켜 1mL씩 저장용기에 담아 -196℃ 질소 저장 탱크에서 보관하였다.
(iii) 혼합 단계: 생체 적용시, 보관된 미분화세포와 분화세포를 각각 1 바이알(1x107cells/vial)씩 꺼내 37℃에서 10분동안 해동하여 미분화 세포의 용액을 주사기를 이용하여 분화세포의 바이알에 주입하고 가볍게 흔들어 용액을 일대일 비율로 고르게 혼합되도록 하고 2x107cells/mL 농도가 된 용액을 개체에 주입할 수 있도록 제작하였다.
쥐 정강이뼈 결손 모델을 이용한 세포치료제 효능 시험
쥐(rat)의 정강이뼈(tibia)를 드릴링하여 1.5mm 부분 골결손 모델을 만들었다. 여기에 3종의 실험군을 구성하여 탯줄유래 간엽줄기세포(UCMSC)에서 얻은 세포를 처리하고 7주간 치료효과를 확인하였다. 3종의 실험군은 각각 미분화군, 골분화 유도군, 미분화와 골분화 세포 혼합군이다. 골 재생 정도는 X-ray 이미지에 의하여 확인하였다.(도 6)
쥐 두개골 결손 모델을 이용한 세포치료제 효능 시험
쥐의 두개골(calvaria)에 직경 4mm 골결손 모델을 만들었다. 여기에 3종의 실험군을 구성하여 세포를 처리하여 8주간 각 실험군의 골재생 효과를 확인하였다. 상기 세포는 지방유래 간엽줄기세포(ADMSC) 및 탯줄유래 간엽줄기세포(UCMSC)로부터 획득하였다. 3종의 실험군은 각각 미분화군, 골분화 유도군, 미분화와 골분화 세포 혼합군이다. 골재생 정도는 μCT 이미지에 의하여 확인하였다(도 6).
신생콜라겐 생성 및 세포치료제의 조직 대체 확인
쥐 두개골 결손모델을 이용한 세포를 처리하고 8주간 유지한 후 조직을 획득하였다. 획득한 조직을 동결 절편하여 골재생 여부를 확인하는 시험을 실시하였다.먼저, 신생콜라겐 생성을 확인하기 위하여 Goldner’s Trichrome Kit (Merck)를 이용하여 염색을 실시하였으며 염색은 Merck사 제공 프로토콜을 따랐다. 염색 완료후 현미경을 이용하여 콜라겐의 생성을 확인함으로써 골재생을 확인할 수 있었다. 주입된 세포에 의한 골재생 여부를 확인하기 위하여는 8주간의 골결손 시험이 완료된 조직의 동결절편을 PBS로 잘 세척한 후 10분간 2% 알부민이 포함된 PBS로 반응시키고 Human Nuclei 항체(Millipore)와 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 488nm에서 확인가능한 FITC가 표지되어 있는 2차 항체인 항마우스 항체와 30분간 반응시키고 형광현미경을 이용하여 Human Nuclei 발현여부를 확인함으로써 주입한 인간유래 세포에 의해 골재생이 이루어졌음을 확인할 수 있었다 (도 9).
염소 대퇴골결손 모델을 이용한 세포치료제 효능 시험
염소의 대퇴골에 1.5cm의 완전 골결손 모델을 제작하고 대조군으로 현재 골치료에 많이 사용되고 있는 100% β-TCP로 구성된 ExelOS (인공골대체제)만 처리한 군을 선정하고, 실험군은 ExelOS에 세포치료제 샘플군을 처리하여 봉합한 후 6개월 경과 후 μCT를 찍어 골재생 정도를 확인하였다.(도 7)
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (11)

  1. 탯줄유래 미분화 간엽줄기세포 및 탯줄유래 간엽줄기세포에서 유래하여 골세포로 초기 분화된 세포를 0.5 내지 1.5 비율로 혼합하여 구성되는 골 질환 치료용 세포 치료제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 골 질환은 골다공증, 골괴사증, 가관절증, 파제트병 또는 골형성부전증인 것을 특징으로 하는 세포 치료제.
  3. 제1항에 있어서, 상기 골세포로 초기 분화된 세포는 골아전구세포(pre-osteoblast) 또는 미성숙 골아세포(immature osteoblast)인 것을 특징으로 하는 세포 치료제.
  4. 제1항에 있어서, 상기 골세포로 초기 분화된 세포는 3차원적 환경에서 약 5일 이하로 분화된 것을 특징으로 하는 세포 치료제.
  5. 제1항에 있어서, 상기 골세포로 초기 분화된 세포는 CD 73 마커의 발현이 미분화 간엽줄기세포에 비하여 10% 이하 감소되고, 오스테오폰틴(osteopontin)의 발현이 미분화 간엽줄기세포에 비하여 10 % 이상 증가되는 것을 특징으로 하는 세포 치료제.
  6. 제1항에 있어서, 상기 미분화 간엽줄기세포와 상기 골세포로 초기 분화된 세포는 각각 별도로 동결보존하고, 필요한 때에 해동하여 혼합하는 것을 특징으로 하는 세포 치료제.
  7. 제1항에 있어서, 상기 세포 치료제는 이식된 골 결손 부위에서 약 1달 내지 약 2달 동안 안착되어 골재생을 촉진하는 것을 특징으로 하는 세포 치료제.
  8. (a) 탯줄유래 간엽줄기세포를 항온배양기에서 3~4일간 배양하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 배양된 세포로부터 일부를 분획하여 3차원적 환경에서 약 5일 이하로 골분화 유도하는 단계;
    (c) 상기 (a) 단계에서 배양된 미분화 세포 및 상기 (b) 단계에서 골세포로 초기 분화된 세포를 각각 별개로 동결보존시키는 단계; 및
    (d) 필요한 때에 상기 동결보존된 미분화 세포 및 상기 동결보존된 골세포로 초기 분화된 세포를 혼합하는 단계;
    를 포함하는 제1항에 따른 세포 치료제를 제조하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 3차원적 환경은 하이드로 겔에 의하여 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 (d) 단계에서 상기 미분화 세포에 대하여 상기 골세포로 초기 분화된 세포를 0.5 내지 1.5의 비율로 혼합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 골세포로 초기 분화된 세포는 CD 73 마커의 발현이 미분화 간엽줄기세포에 비하여 10 %가 감소되고, 오스테오폰틴(osteopontin)의 발현이 미분화 간엽줄기세포에 비하여 10 % 이상 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
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