CN101977938A - 海藻酸盐的超纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及海藻酸盐超纯化方法,尤其涉及在人类细胞移植中用于微囊化的海藻酸盐的超纯化方法。
Description
说明书
本发明涉及用于海藻酸盐超纯化的方法,具体地,本发明涉及用于人细胞移植中的微囊化。所述方法有利地适用于药品级海藻酸钠起始粉末的纯化、内毒素和内原性热原的去除以及保持产物的分子结构不发生改变。
技术现状
海藻酸钠(AG)是一种从一些沿太平洋西海岸生长的海藻,特别是巨藻(Macrocystis pyrifera),中提取的多糖,其广泛应用于包括生物技术在内的多个领域中。生物聚合物盐类的纯化是本发明的主题,它们是从活植物体中自发渗出或从活植物体中提取的水溶性多糖。事实上,海藻酸盐是海藻酸的盐,其表现出D-甘露糖醛酸(-M-)和L-古罗糖醛酸(-G-)单元的共聚物结构。这些单元构成了聚合物或二聚物嵌段MM或GG,它们有时在分子图(molecular pattern)中交替出现。
海藻酸盐的分子排列和组成主要取决于获得它们的来源。例如,最常用的海藻酸盐来源于褐海藻,具体地说,来源于巨藻(Macrocystis pyrifera)的产物的M/G比等于1.56∶1,而来源于北方海带(Laminaria Hyperborea)的产物的M/G比等于0.45。海藻酸盐的一价盐(Na、K)通常是水溶性的,这与以凝胶或固体形式存在的二价盐(Ba、Ca)或多价盐(Fe、Al)不同。
AG已在食品和药品行业中使用多年,分别用于生产果冻和某些种类药物(例如,抗酸剂等)的赋形剂。然而,对于特定应用,例如人类移植中的应用来说,可商购的海藻酸钠并未得到充分纯化,在这些应用中要求严格并且需要(符合)国际认可的质量控制标准,例如,卫生部(the Ministry of Health)的指导方针或美国药典(U.S.Pharmacopeia)的指导方针。
海藻酸盐可以作为待纯化的粗提物或作为部分纯化的溶液商购得到。根据组分(FG或FM)和M/G比说明了海藻酸盐粉末的化学组成。例如,产品AG KELTONE LVCR的内毒素水平范围为约30,000EU/g至约60,000EU/g,这样,就使得它不适合用于要求内毒素水平不超过100EU/g(尽管优选更低水平)的肠胃外应用。
因此,在可以肠胃外使用AG KELTONE LVCR前,必须显著降低内毒素水平。
将AG用于制备包含杂交瘤细胞的微胶囊从而用于生产单克隆抗体(Damon Biotech,Inc.)和用于保护胰岛(脑岛)移植不受宿主排异反应的影响已经超过20年(美国专利第483092号)。在患有糖尿病啮齿动物和高等哺乳动物的第一微胶囊移植试验规程中明确强调了所使用材料的纯度是移植本身成功的基础。可能造成微胶囊移植失败的主要污染物有细菌脂多糖内毒素、存在于革兰氏阴性细菌膜中的热原性物质。这些物质耐受大多数灭菌系统(例如,高压灭菌锅)。诸如γ辐照或干热灭菌法的技术能够破坏内毒素,但也会损害需要进行灭菌的材料或产品。此外,它们分子量通常较小(10-20kd)而不能通过标准过滤法去除。无论如何,为了避免二次污染的风险,应考虑获得无菌并且不含内毒素的产品的需要。最后,通过肠胃外引入人体的物质中的内毒素含量必须低于100EU/g,尽管优选低于50EU/g的水平。在使用AG制备用于移植的包含胰岛的微胶囊的情况下,内毒素的存在会使胶囊所提供的免疫保护失效,并促使发生严重的炎症反应。
在过去几年中,对获得超纯化产物(实际上是“不含内毒素”)的需求促进了一些纯化方法的发展,然而,它们仍不能满足所有的工业和安全需要。一些纯化方法设计使用加入或未加入多粘菌素-b的离子交换树脂或通过醋酸纤维素过滤器进行过滤并进一步进行膜透析,其缺点在于:内毒素水平没有相对降低(约70-80E.U./g),由于原始产物大量损失而造成成本过高并且不适用于大量的AG生产,其在临床使用方案开始时实际上是必不可少的,以及在使用氯仿的情况下表现出难以去除所述溶剂,即使是使用适度的量也具有潜在毒性。例如,在使用AG乙醇沉淀并随后用氯仿提取的技术中,为了获得1升最终产物,需要使用约10升AG作为起始材料。此外,产物的低产率表示不同AG批次可能具有不均匀的特征,这显然不适合用于制备在临床方案中使用的产品,因此大规模可重复的技术是必要的。
美国专利第6451772号以粗海藻酸盐起始,基本上提供了通过聚丙烯过滤器过滤(和/或使用离子交换树脂)并随后用有机溶剂沉淀滤液。该方法的主要限制有:
1、相对于所生产的海藻酸盐的最终体积得率来说,材料成本过高,得率仍不能使人满意,
2、尽管偶尔也能获得内毒素含量足够低的海藻酸盐,但是所述方法变化性过大且产物本身不能用于系统性应用是事实;和
3、由于使用溶剂所引起的对海藻酸盐结构的改变作用。
现在意外地发现用通过具有电荷改性滤膜(荷电滤膜)的滤筒过滤代替沉淀操作能够获得具有以下特征的AG:
1)具有很高并且恒定的纯度(内毒素含量≤20EU/g)
2)能够大规模超纯化,
3)不使用溶剂即可获得,并因此
a、不改变海藻酸盐的化学结构
b、无海藻酸盐污染物,从而能够被肠胃外使用方案所接受。
因此,本发明的主题是一种用于获得未改变结构(无结构变化)并且内毒素含量不高于20EU/g的海藻酸盐溶液的方法,其包括下列步骤:
a、将商品级海藻酸盐粉末加入至盐溶液中,直到获得浓度范围为按重量计1.6%到2.0%的海藻酸盐溶液,并将pH调节到7.4-7.6的范围;
b、用至少一个亲水性过滤器过滤步骤a)中所获得的溶液并回收所得的溶液;
其特征在于,将得自步骤b)的溶液在疏水性过滤器上过滤并回收所得溶液。
在本发明中,附加了两个图表,其显示:
图1:所产生的海藻酸盐的碳NMR谱,和
图2:所产生的海藻酸盐的氘NMR谱。
步骤b)中的过滤优选地通过使用三个醋酸纤维素亲水物过滤器进行,有利地,其中第一个过滤器为药品级30并且标称孔径为2μm,第二个过滤器为药品级60并且标称孔径为2μm,而第三个过滤器为药品级90并且标称孔径为2μm。
第二次过滤利用疏水性过滤器;所述过滤器有利地优选电荷改性的(荷电的)尼龙过滤器,尤其是带有正电荷的Nylon 66过滤器。
根据本发明,经过摩尔稀释和多次过滤后由药品级AG粉末获得了最终产品(溶液和粉末形式),其内毒素含量不超过20E.U./g,从而完全符合上述质量控制标准。本发明人通常以1.8%(w/v)的溶液提供最终产物,并且适当地保存在避光环境以及4℃-6℃的温度下,该最终产物在超过约5年的时间内保持稳定并且几乎不含蛋白质(<0.4%-美国食品与药物管理局(FDA)的另一项生物不可见性标准)。
本发明利用了由两部分组成的脂多糖内毒素(LPS)的化学结构,其中一部分是亲水的(多糖)而另一部分是疏水的(脂质)。根据本发明,在超滤过程结束时使用了(带正电荷的)尼龙过滤器,其能够选择性地结合内毒素的(疏水)脂质部分,从而在不改变和/或损坏AG结构的情况下保留它们。除了避免根据现有技术所需的其他操作外,增加第四个过滤器确保结果可重复并且简单。此外,产物的化学结构未发生改变,这方面已经在上述美国专利中加以强调。通过本发明说明书后所附的产物NMR谱明确地证明了这一点,在氘谱和碳谱中显示了(未纯化的)起始产物和(超纯化的,临床级)最终产物之间未发生结构和分子变化,即使是最小的变化也未发生。
根据本发明所述的方法能够获得约50%的起始产物,相比之下使用另一种方法获得了可以以回收量计算的10%的起始产物。
由于本发明所述方法只需在清洁容器(“外壳”)中装配适合的过滤器,连接到泵系统并向下通到收集容器中,因此该方法实施简单,人工干预有限,并因此污染风险比上述已知方法低。整个方法可以在II类层流生物罩中容易地进行。这些样本的蛋白质含量范围为0至0.016mg/ml。通过在2年中完成的21种不同过滤法所获得的数值进行计算得到了这些数据,如下表1所示。
表1
根据本发明所述方法所获得的多个样本中的蛋白质含量
平均值:0.090846
纯化(内部编号) | 蛋白质(mg/ml) |
1 | 0.0072 |
2 | 0.0087 |
3 | 0.0179 |
4 | 0.0095 |
5 | 0.0116 |
6 | 0.0121 |
7 | 0.0077 |
8 | 0.0062 |
9 | 0.0098 |
10 | 0.0118 |
11 | 0.0125 |
12 | 0.0124 |
13 | 0.0138 |
14 | 0.0089 |
15 | 0.0120 |
16 | 0.0131 |
17 | 0.0088 |
18 | 0.0063 |
19 | 0.0110 |
20 | 0.0157 |
21 | 0.0079 |
本发明所述方法包括两个步骤:
1)将AG粉末溶解在氯化钠中,控制pH并通过三个亲水性过滤器。
优选地,采用醋酸纤维素或其他可商购过滤器作为亲水性过滤材料,所述可商购过滤器例如,“zetaplus”级叠片转动式过滤器(Cuno filter),它的孔径范围为1微米至0.1微米,并且具有如本发明人所使用的宽过滤表面,该过滤器的优势在于降低了过滤压而不改变产物,去除细胞碎片和所谓的“惰性”微粒。因此,所获得的产物是无菌的,并且内毒素含量不高于100EU/g;
2)为了结合脂多糖的带负电荷部分从而不再使用溶剂沉淀或其他技术,第二步为通过带正电荷的疏水性尼龙过滤器除去残留内毒素(支持了本发明的独创性),该步骤获得了可用于各种用途的产物,其内毒素含量始终低于30EU/g。
本发明能够应用于移植生物技术领域,尤其是能够应用于生产用聚氨基酸和稀释的AG适当涂覆的AG微胶囊,已证明该微胶囊能够免疫保护岛的移植而不受宿主免疫系统细胞的侵袭。目前,本发明人已对用于治疗I型糖尿病(胰岛素依赖型,或T1DM)的微囊化的胰岛的移植进行了几年的研究,并且该研究活动已在科学出版物(主要为国际性出版物)中进行了详细的记载。此外,由于所使用材料的纯度和高生物相容性,Istituto Superiore di Sanità已授权本发明人在无药理学免疫抑制的T1DM患者中通过手术进行微囊化的人胰岛移植的相关I期临床研究。从截至目前所获得的结果来看,发现根据本发明可获得的微胶囊是高度生物相容的,并且不同的国际性研究实验室都对该产物的有效性做出了评价。
实施例
为了制备超纯并且内毒素水平不高于20EU/g的海藻酸钠溶液,需要下列材料:
○耐热玻璃(Pyrex)烧杯,
○耐热玻璃(Pyrex)量筒,
○磁力搅拌器,
○硅胶管HW155,内径5,外径8,
○蠕动泵,
○无菌吸量管(移液管),
○证明不含内毒素的无菌瓶,
○30、60和90药品级的醋酸纤维素过滤器,其过滤辅助物(辅料,coadjuvant)由硅藻土和珍珠岩构成,高为20”并且直径为12”。
○过滤器,具有荷电Nylon 66滤过膜,孔径为0.2μm,高为20”而直径为8”。
○AISI316不锈钢清洁容器,用于20”过滤滤筒,直径为12”。
○AISI316不锈钢清洁容器,用于20”过滤滤筒,直径为8”。
制备超纯并且内毒素水平不高于20EU/g的海藻酸钠溶液的方法包括下列步骤:
所使用的“外壳”、过滤器和材料的灭菌
用1%的etoxate溶液(产品号E9029,Sigma-Aldrich,米兰,意大利)处理在制备海藻酸盐溶液和过滤步骤中使用的玻璃容器(带刻度的烧杯、量筒、烧瓶等)、连接用硅胶管、AISI316不锈钢清洁容器(称作“外壳”)以及任何其他材料(磁力转子、玻璃棒等)24小时,然后用去离子水正确清洗,并且最后在120C高压灭菌1小时。将孔径均为0.2μm的30、60和90药品级纤维素过滤器以及孔径为0.2μm的荷电(电荷改性)的Nylon66过滤膜的滤筒与外壳分开,在120℃高压灭菌1小时。
1.8%的AG溶液的制备
所使用的AG(海藻酸的钠盐(E400))为LVCR(Kelco),其粘度低并且以超纯粉末的形式由生产商:Monsanto-Kelco(20N,Wacker Dr,Chicago IL USA)提供。以组分(FG或FM)和M/G比说明海藻酸盐粉末的化学组成,并且通过NMR(核磁共振)分析确定,本发明人所使用的海藻酸盐的M百分比为52.26%而G百分比为47.74%,M/G比为1.093。制备1.8%的海藻酸盐溶液的所有程序均在II类层流清洁生物罩中进行。称量后,将海藻酸盐粉末置于烧杯中并且在通过使用磁力搅拌器和磁力转子所实现的温和搅拌下缓慢加入生理溶液(0.9%的NaCl)以避免发生凝结(所使用的生理溶液为无菌的、无热源的并且专门用于注射制剂),直到获得均匀溶液为止。
过滤系统(外壳)组装
使用时,将适合的过滤器插入外壳,所有步骤在生物罩中进行,并且封闭所述过滤器并在特定支架上组装。在外壳的出口和入口处将硅胶管系紧。将过滤装置入口处的管连接(hook)到蠕动泵,而将泵的自由端浸没于含有海藻酸盐溶液的烧杯中。将过滤系统出口处的硅胶管的自由端置于无菌收集瓶中。
过滤
对溶液实施4次不同的过滤步骤,这些过滤步骤均使用“外壳”过滤系统并且不间断地进行。
第一步提供了将通过30药品级纤维素纤维(标称孔径2μm)胶囊过滤的溶液。通过蠕动泵,将外壳充满约7升产品,并且开始收集滤液。将泵速率设置为极低的值,从而使材料和过滤器之间的相互作用更大,并且实际上将外壳内部压力值保持在1.5巴左右。弃去富含可提取物的第一部份滤液,该部分滤液的量大约为2升。将剩余滤液收集到无菌的并且证明不含内毒素的塑料瓶中。
第二过滤步骤使用60药品级纤维素纤维胶囊(标称孔径2μm)。同样地,在这种情况下将泵的流速设置为能够在过滤系统中产生1.5巴压力的流速。用如上所述相同类型的塑料瓶进行收集。
第三步在纤维素纤维胶囊上进行,使用90药品级胶囊(标称孔径2μm)。同样地,在这种情况下将泵的流速设置为能够在过滤系统中产生1.5巴压力的流速。用如上所述相同类型的塑料瓶进行收集。
第四步是最后一步过滤步骤,其中提供了具有荷电Nylon 66过滤膜的滤筒,所述膜的标称尺寸为0.2μm。在这最后一步中,通过控制泵本身的流速将蠕动泵所产生的压力保持在0.3-0.5巴左右。现在,将滤液收集到针对内毒素进行预先处理并且在120℃高压灭菌1小时的玻璃瓶中。
最终产物评价
实施例2
对所得产物的等分试样进行下列测试:取适合的等份并将其送到专门采用鲎试验法(Limulus method)测定内毒素剂量的公司(Lonza Verviers,SPRL)来测试内毒素的存在,采用考马斯亮兰法(Bradford method)测定蛋白质含量,使用微量法测定+4℃和+20℃的pH值,并通过NMR分析以确认其化学组成和相关单体组分。发现内毒素含量低于20EU/g。通过标准规程来评价重金属的存在和产物的无菌性。
本发明能够应用于移植生物技术领域。具体地说,在本发明人的努力下,已证明用聚氨基酸和稀释AG适当涂覆的AG微胶囊能够免疫保护细胞不受受体免疫系统的侵袭。目前,本发明人已在实验室中对用于治疗I型糖尿病(胰岛素依赖型)的微囊化的胰岛的移植进行了几年的研究,并且该研究活动已在科学出版物(主要为国际性出版物)中进行了详细的记载。此外,由于所使用材料的纯度和高生物相容性,意大利Istituto Superiore di Sanità已授权本发明人在无药理学免疫抑制的糖尿病患者(receiver)中通过手术进行微囊化的人胰岛移植的相关I期临床研究。从截至目前所获得的结果来看,发现本发明人的微胶囊是高度生物相容的,并且不同的国际性研究实验室都对该产物的有效性做出了评价。
用于各种细胞株生长和分化的胶囊和人工细胞外基质
使用根据本发明生产的海藻酸钠制备海藻酸盐/聚鸟氨酸(AG/PLO)微胶囊的标准操作步骤(SOP)
试剂
●无菌并且无热源的生理溶液;
●1.2%CaCl2的蒸馏水溶液;
●55mM柠檬酸钠的蒸馏水溶液;
●0.12%和0.06%的聚鸟氨酸在生理溶液中的溶液
(上述溶液通过过滤除菌)
●1.6%的NAG,通过之前公开的过滤方法获得;
●0.05%的NAG,将上述NAG溶液在生理溶液中1∶10稀释。
方法
用生理溶液清洗岛以除去任何存在的蛋白。
然后,对于每毫升的颗粒,加入0.5mL生理溶液和10mL 1.6%的NAG,并使该混悬液混匀。
将蠕动泵调节为15ml/min并将气体流速调节为5l/min,开始时先让生理溶液流过该系统。
将海藻酸盐微滴收集到含有200ml1.2%的CaCl2的250ml烧杯中,其通过胶凝化而形成含有岛的海藻酸盐微胶囊。针头距离CaCl2溶液液面(meniscus)的距离等于约3cm,这是至关重要的。将胶囊在CaCl2中保持5分钟,然后用生理溶液替换100ml 1.2%的CaCl2并再保持5分钟。接着,用生理溶液反复冲洗后,将胶囊转移到50ml的falcon培养瓶中。然后,以相当于胶囊所占体积两倍的量顺次加入下列反应物,每次加入前除去之前所加入的反应物,搅拌并在加入反应物和用生理溶液进行其他适当清洗之间进行:
-0.12%的聚鸟氨酸保持10分钟;
-0.06%的聚鸟氨酸保持5分钟;
-0.1%的NAG保持6分钟;
-55mM的柠檬酸钠保持2分钟。
反复冲洗具有双重功能,它们一方面能够除去反应物或细胞碎片,另一方面能够除去大部分较小的胶囊、空的或破碎的胶囊,这是因为这些胶囊重量较轻从而沉降较慢。这些处理结束后,将胶囊重悬浮于CMRL 1066培养基中。移植前,用生理溶液清洗胶囊,并且移植时仍用生理溶液对进行重悬浮。
Claims (12)
1.一种用于获得内毒素含量不高于20EU/g的结构未改变的海藻酸盐溶液的方法,包括以下步骤:
a.向盐溶液中加入商品级海藻酸盐粉末直至获得浓度范围为按重量计1.6至2.0%的海藻酸盐溶液,并将pH调节到7.4-7.6的范围;
b.在至少一个亲水性过滤器上过滤步骤a)中得到的溶液并回收所得的溶液;
c.其特征在于,将从步骤b)得到的溶液在疏水性过滤器上进行过滤并回收所得的溶液。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述海藻酸盐粉末是海藻酸钠粉末。
3.根据以上权利要求中至少一项所述的方法,其中,所述海藻酸盐的组成包含52.26%的M和47.74%的G,相应的M/G比为1.093。
5.根据权利要求1所述的方法,其中,所述过滤是在三个醋酸纤维素亲水物的亲水性过滤器上进行的。
6.根据权利要求5所述的方法,其中,所述三个过滤器中的第一个为药品级30并且标称孔径为2μm,所述三个过滤器中的第二个为药品级60并且标称孔径为2μm,而所述三个过滤器中的第三个为药品级90并且标称孔径为2μm。
7.根据权利要求1所述的方法,其中,所述疏水性过滤器为电荷改性Nylon过滤器。
8.根据权利要求7所述的方法,其中,所述疏水性过滤器是带有正电荷的Nylon 66过滤器。
9.可通过权利要求1至8中所述的方法得到的海藻酸盐的盐溶液。
10.可通过权利要求9所述的溶液得到的海藻酸钠。
11.权利要求9所述的海藻酸钠溶液和/或权利要求10所述的海藻酸钠用于生产在人类移植中肠胃外使用的医疗装置的应用。
12.根据权利要求11所述的应用,其中,所述装置是人类细胞移植中使用的海藻酸盐/聚鸟氨酸微胶囊。
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