CN112007140A - 脾氨肽在制备治疗肠屏障功能缺损的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脾氨肽在制备治疗肠屏障功能缺损的药物中的应用。所述肠屏障功能缺损为由化疗药物如盐酸表柔比星引起的肠屏障功能缺损，所述脾氨肽为动物的脾脏提取物，所述脾氨肽能够显著改善化疗后小鼠肠道的病理情况、有效改善小鼠的生存状况，具有治疗化疗药物引起的肠屏障功能缺损的作用。本发明通过构建ICR小鼠化疗模型，验证了脾氨肽能够修复化疗后小鼠的肠道粘膜结构、缓解炎症反应、维持小鼠肠道粘膜和细胞的完整性，还能有效缓解化疗药物在化疗小鼠中引起的细菌感染，并且改善化疗小鼠的肠道菌群状况，从而为肠屏障功能缺损的治疗提供了新的途径和方法。

Description

脾氨肽在制备治疗肠屏障功能缺损的药物中的应用

技术领域

本发明属于生化制药领域，涉及脾氨肽的新用途，具体涉及脾氨肽在制备治疗肠屏障功能缺损的药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病，数据显示，我国恶性肿瘤死亡率属于世界较高水平，而且呈持续增长趋势，已经成为城市居民的第一位死因。化疗是治疗恶性肿瘤的重要手段之一，也是患者较为接受的治疗手段。但是目前常用的不同种类的化疗药物如表柔比星、顺铂、长春新碱等均会对患者产生不同程度的副作用，导致患者生存状态较差。

对于肿瘤患者而言，药物在抑制或杀伤癌细胞的同时，对正常细胞、组织或器官也有一定的损伤，产生不同类型和不同程度的不良反应。其中肠功能障碍是某些抗癌药物剂量毒性的反映，也是大剂量化疗患者骨髓抑制时常见的并发症，并可诱发和/或加重全身炎症反应和多器官功能障碍，对疾病的发生、发展、转归有重要影响。肠功能状态已经成为判断危重患者预后最重要的指标之一。

化疗对肠功能的损伤主要体现在以下几个方面：1、破坏黏膜屏障，主要表现为肠黏膜上皮细胞正常更新减慢，绒毛不同程度萎缩，吸收面积减少，细胞连接的松弛致肠道通透性增加，为肠内细菌及毒素提供通道；2、破坏化学屏障，肠腔内化学物质因黏膜自身抵抗能力下降而加剧其损害；3、破坏生物屏障，化疗药物可直接杀伤肠腔正常菌群，导致微生态平衡发生紊乱，；4、破坏免疫屏障：由肠黏膜淋巴组织(如Peyer结、肠系膜淋巴结)、细胞(如树突状细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞等)和肠黏膜表面的分泌型抗体(sIgA)构成，对黏膜表面的抗原具有摄取、处理和递呈作用，及时地识别外来微生物、食物及自身异常抗原，诱导局部及全身免疫应答反应，保护肠道免受外来抗原的破坏和异常的免疫应答；化疗药物导致局部sIgA分泌减少，T细胞免疫功能受损，其既可引起免疫细胞数量变化，又可致免疫调控异常，使得肠道免疫功能失调，甚至是全身免疫调节受影响，最终可能造成消化道甚至全身性疾病。

目前对肠屏障功能损伤的主要的治疗方法包括：(1)改善肠黏膜的血液灌流，除补充血容量外，还选择应用改善肠血液循环的药物，包括小剂量多巴胺、654-2与前列腺素I₂以解除肠系膜微小血管的痉挛；(2)改善肠内营养，常用的特殊营养素有谷氨酰胺(Gln)、生长激素、精氨酸、ω脂肪酸等；(3)生长因子能直接刺激小肠干细胞增殖分化，增强肠上皮损伤后的修复作用，改善肠屏障功能，减少菌群移位，常用的生产因子有胰岛素样生长因子(IGF-1)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF-α)等；(4)改善生物屏障，微生态制剂如双歧杆菌和乳酸杆菌等可通过补充有益菌群，调节肠道菌群生态平衡，有益菌在消化道内生成致密的膜菌群、形成微生物屏障。必要时，应用肠道不吸收的抗生素行选择性肠去污染治疗，以改善肠微生态环境。

目前治疗肠屏障功能缺损药物的方法主要是从改善黏膜屏障、化学屏障、生物屏障等角度着手，在临床应用中具有一定的局限，如对于化疗患者，血浆谷氨酰胺水平不是评价化疗效果的指标，要进一步证实口服谷氨酰胺对化疗患者肠屏障功能的保护作用，为临床用药提供据，还需要对更重要的指标进行研究，如肠黏膜的损害、化疗药的不良反应等。此外，口服补充谷氨酰胺的适应证、时机、疗程、最佳效果的获得等问题也有待于进一步的探讨。

此外，通过调节化疗患者的免疫功能平衡的药物有限，对于脾氨肽是否能够有效改善肠屏障功能缺损及其合适的治疗剂量尚且没有深入研究。

因此寻找更优的途径来护理化疗患者，改善患者生存状况迫在眉睫。

脾氨肽是提取自动物脾脏的一种多肽及核苷酸类免疫调节剂，具有特异地将供体某一特定细胞免疫转移给受体、非特异的增强受体的细胞免疫体系、改善单核细胞与含有Ig复合体结合的能力；具有促进干扰素及淋巴因子释放的功能，能提高机体的免疫功能，促进辅助性T细胞的功能，使T细胞分泌IL-2,IL-6及IFN-γ增加，促进PHA诱导体内淋巴细胞转化和白细胞诱生干扰素，激活单核-巨噬系统的活性、提高患者的血清IgG和IgA水平，并对组织中病毒的复制有一定的抑制作用，即脾氨肽能诱导淋巴细胞致敏或激活，从而对靶细胞发起细胞免疫反应，包括直接的细胞毒杀伤效应、协同效益、增殖效应、复制效应，来达到增强细胞免疫功能的目的。同时，脾氨肽还能改善单核细胞吞噬功能，促进干扰素及淋巴因子的释放，提高机体非特异免疫功能等。多项研究证实，脾氨肽在抗感染、抗过敏、调节免疫力等方面有一定的作用，耐受程度高。

脾氨肽是否能够作为一种患者化疗后辅助治疗的药物来提高患者免疫力，改善患者生存状况的问题仍待进一步研究。

发明内容

发明要解决的问题

针对现有技术存在的问题，本申请提供了一种脾氨肽在制备治疗肠屏障功能缺损的药物中的应用以及一种用于治疗肠屏障功能损伤的方法。

用于解决问题的方案

本研究鉴于上述现有技术中存在的问题，进行了深入的研究、反复实验，本发明以ICR小鼠为对象建立肠功能障碍模型，探究脾氨肽对小鼠肠功能障碍的影响，通过比较不同治疗组小鼠肠道病理情况、肠道标本HE染色、血清内内毒素含量、肠道菌群的变化来探究脾氨肽对化疗小鼠免疫功能的调节作用，并进一步探究其相关的免疫学机制从而完成了本发明。即，本发明如下所述：

本发明首先提供了脾氨肽在制备治疗肠屏障功能缺损的药物中的应用，其特征在于，所述肠屏障功能缺损为由化疗药物引起的肠屏障功能缺损；优选的，所述化疗药物为盐酸表柔比星。

在一些实施方案中，所述脾氨肽为动物的脾脏提取物；优选的，所述脾氨肽为脾氨肽的液体制剂。

在一些实施方案中，所述脾氨肽在小鼠中施用的剂量为1.5mg/kg/天至7.5mg/kg/天；优选的，所述施用的剂量为7.5mg/kg/天。并且，所述脾氨肽能够显著改善化疗后小鼠肠道的病理情况，有效缓解化疗药物引起的肠屏障功能缺损。

本发明还提供了一种组合物在制备治疗肠屏障功能缺损的药物中的应用，所述组合物包括脾氨肽和一种或多种药学上可接受的载体。其中，所述载体包括药学上可接受的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、促进吸收剂、表面活性剂和增效剂组成的组中的1种以上。并且，所述脾氨肽能够显著改善化疗后小鼠肠道的病理情况，有效缓解化疗药物引起的肠屏障功能缺损。

在一些实施方案中，所述肠屏障功能缺损为由化疗药物引起的肠屏障功能缺损，优选的，所述化疗药物为盐酸表柔比星。

在一些实施方案中，所述脾氨肽为动物的脾脏提取物；优选的，所述脾氨肽为脾氨肽的液体制剂。

本发明还提供了一种治疗肠屏障功能缺损的方法，所述方法包括将脾氨肽向患有肠屏障功能缺损的受试者使用，从而治疗所述肠屏障功能缺损。进一步的，所述脾氨肽为动物的脾脏提取物；优选的，所述脾氨肽为脾氨肽的液体制剂。更进一步的，所述肠屏障功能缺损为由化疗药物引起的肠屏障功能缺损；优选的，所述化疗药物为盐酸表柔比星。当所述脾氨肽施用在ICR小鼠化疗模型上时，所述脾氨肽在小鼠中施用的剂量为1.5mg/kg/天至7.5mg/kg/天；优选的，所述施用的剂量为7.5mg/kg/天。

发明的效果

由本发明的试验结果可见，本发明的结果不仅证明了化疗药物对于小鼠肠道会有一定的损伤，而且初步证明了脾氨肽对于肠道损伤是有一定治疗作用的。本发明的技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

1)脾氨肽不仅能够显著改善化疗后小鼠肠道的病理情况、有效改善小鼠的生存状况；还能够修复化疗后小鼠的肠道粘膜结构、缓解炎症反应、维持小鼠肠道粘膜和细胞的完整性。

2)脾氨肽能够有效缓解化疗药物在化疗小鼠中引起的细菌感染，并且改善化疗小鼠的肠道菌群状况。

为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下：

附图说明

图1中的a-f分别为空白对照组、化疗模型组、低剂量脾氨肽治疗组、正常剂量脾氨肽治疗组、高剂量脾氨肽治疗组、谷氨酰胺治疗组的小鼠肠道标本大体观察的结果图。

图2中的a-f分别为空白对照组、化疗模型组、低剂量脾氨肽治疗组、正常剂量脾氨肽治疗组、高剂量脾氨肽治疗组、谷氨酰胺治疗组的小鼠肠道标本HE染色的结果图。

图3中的a-f分别为空白对照组、化疗模型组、低剂量脾氨肽治疗组、正常剂量脾氨肽治疗组、高剂量脾氨肽治疗组、谷氨酰胺治疗组的小鼠肠道标本的免疫组化结果图。

图4示出了实验第30天各组小鼠血清中内毒素的含量。其中，CK代表空白对照组；EPI代表化疗模型组；LD-SAOS代表低剂量脾氨肽治疗组；ND-SAOS代表正常剂量脾氨肽治疗组；HD-SAOS代表高剂量脾氨肽治疗组；Gln代表谷氨酰胺治疗组。

图5示出了实验第30天各组小鼠肠道中菌群在科水平的相对丰度图。其中，A代表空白对照组；B代表化疗模型组；C代表低剂量脾氨肽治疗组；D代表正常剂量脾氨肽治疗组；E代表高剂量脾氨肽治疗组；F代表谷氨酰胺治疗组。O、L、R分别代表各组内不同标记的小鼠个体。

图6示出了出了实验第30天各组小鼠肠道中菌群多样性结果图。其中，CK代表空白对照组；EPI代表化疗模型组；LD-SAOS代表低剂量脾氨肽治疗组；ND-SAOS代表正常剂量脾氨肽治疗组；HD-SAOS代表高剂量脾氨肽治疗组；Gln代表谷氨酰胺治疗组。纵坐标Chao1多样性指数是衡量菌群丰度即菌群数量的指数。

具体实施方式

本发明实施例中所述使用的脾氨肽的原料提取自新鲜的牛脾脏，本实施例中使用的药物与试剂和主要实验仪器均可从市场上购买获得。

药物与试剂：脾氨肽(北京第一生物化学药业有限公司，规格为10mg/ml，该样本提取自新鲜健康牛脾脏，经喷雾、分子筛过滤至无色至微黄色澄清液体，最后经玻璃管制口服液瓶装，密封于4℃凉暗处保存，国家药品标准WS1-(X-451)-2003Z)；盐酸表柔比星(T0125，规格10mg×3瓶，上海陶术生物有限公司)；谷氨酰胺粉(550-065-EG，100g/瓶，成人剂量2g/人/天)；枸橼酸钠抗凝剂(R-10269，规格100ml/瓶，宝如亿(北京)生物技术有限公司)；PBS缓冲液(AC13716274，规格500ml/瓶，HyClone公司)；组织固定液(MA0192，500ml，EPSILON)；苏木精染液(货号T1686，规格50ml，上海陶术)；伊红染液(货号C0109，规格100ml，上海碧云天生物技术有限公司)；Anti-Claudin 1antibody(abcam，货号ab15098，500μl)；内毒素检测试剂盒(Genescript，货号L00447-20，1kit)。

主要实验仪器：小鼠固定器(DM10171，纳纯生物科技有限公司)；正置拍照显微镜(OLYMPUS，型号BX53F)；酶标仪(Thermo，型号Multiskan Mk3)。

实施例1肠功能障碍小鼠模型的建立及治疗

1.材料：6-8周龄雌性ICR小鼠，由北京大学医学部动物部提供。

2.肠功能障碍小鼠模型的建立及治疗：

将30只6-8周龄雌性ICR小鼠(由北京大学医学部动物部提供)随机分成6组，每组5只。

第一组为空白对照组(简称为CK)，每天灌胃1ml生理盐水；其余五组为实验组，分别在第0、5、10天注射等剂量化疗药物盐酸表柔比星溶液(10mg/kg体重)。其中，第二组为化疗模型组(简称为EPI)，第三组到第六组为治疗组，分别以低剂量脾氨肽(灌胃剂量1.5mg/kg/天，简称为LD-SAOS)、正常剂量脾氨肽(灌胃剂量4.5mg/kg/天,简称为ND-SAOS)、高剂量脾脏小分子量多肽(灌胃剂量7.5mg/kg/天，简称为HD-SAOS)、谷氨酰胺溶液(灌胃3.0mg/kg/天，简称为Gln)对化疗后小鼠进行治疗(小鼠实验用剂量按照目前公认的徐叔云教授主编《药理实验方法学》进行换算，系数为0.0026)。

实施例2脾氨肽口服溶液对肠功能障碍小鼠指标的影响

1.施用不同剂量的脾氨肽口服溶液在化疗小鼠肠道标本大体观察结果的比较

试验方法：将实施例1中所述的6组小鼠在处理30天之后断颈处死，观察小鼠肠道的大体标本并拍照记录。

试验结果：由图1各组小鼠肠道解剖大体标本结果可以看出：化疗组小鼠经过化疗药物处理后肠道出现严重水肿，黏连现象比较严重，无法分清肠道的基本特征；相比于化疗组小鼠，低剂量脾氨肽、正常剂量脾氨肽及高剂量脾氨肽组小鼠肠道大体结果显示经过脾氨肽的治疗，小鼠肠道结构清晰可见，水肿现象显著改善，且小鼠生存状况较好；阳性药物对照组(即谷氨酰胺溶液治疗组)，结果显示小鼠肠道相比化疗组有明显改善。该实验结果表明，脾氨肽能够显著改善化疗小鼠肠道病理情况，改善小鼠生存状况。

2.施用不同剂量的脾氨肽口服溶液在化疗小鼠肠道标本HE染色结果和免疫组化结果的比较

2.1HE染色和免疫组化的试验方法：将实施例1中所述的6组小鼠在处理30天之后断颈处死小鼠，将小鼠解剖后取出约1cm小肠器官置于组织固定液中避光保存，经脱水、包埋等处理制成蜡块，然后切片做HE染色及免疫组化，最后在显微镜下拍照观察。

2.2 HE染色试验结果：由图2的HE染色结果可以看出，化疗组小鼠肠道黏膜结构破坏，黏膜上皮细胞损伤，黏膜水肿，细胞间缝隙变大，连接结构破坏，黏膜下淋巴组织结构紊乱，可见炎症细胞浸润；脾氨肽治疗组小鼠肠道黏膜结构完整，细胞排布较为均匀，无明显病变情况，但是不同剂量组的效果仅由HE染色结果无法判断；阳性药物对照组(即谷氨酰胺溶液治疗组)，结果显示小鼠肠道粘膜亦有明显改善。该实验结果表明，脾氨肽能够修复肠道黏膜结构，缓解炎症反应，维持肠道粘膜及细胞的完整性。

2.3 Claudins蛋白是构成紧密连接的主要骨架蛋白，对于维持细胞间连接、增殖、迁移等有重要作用。肠粘膜上皮细胞中的caludins可以表征粘膜是否完整及健康，因此常利用anti-claudin蛋白抗体做组化或相关实验来检测claudins的表达及分布。本次实验采用anti-claudin1抗体做肠道黏膜的免疫组化探究各组肠粘膜的claudins蛋白分布。

免疫组化试验结果：由图3各组小鼠肠道免疫组化结果可以看出，化疗组小鼠claudin-1蛋白较其他组分布明显减少，着色较浅，预示着肠道粘膜紧密连接功能受损，而脾氨肽治疗组尤其是高剂量组小鼠肠道粘膜claudins蛋白分布比较均匀。需要注意的是，免疫组化结果只能表征定性判断肠道黏膜功能是否损伤。从结果来看，脾氨肽治疗组对于肠道黏膜损伤有一定的治疗作用。

3.施用不同剂量的脾氨肽口服溶液对化疗小鼠血清中内毒素含量的影响

内毒素含量升高是机体发生细菌感染的重要标志，为进一步探究化疗药物给小鼠带来的危害及验证脾低分子量多肽对化疗小鼠的治疗作用，我们在实验结束时利用眼球取血法获得各组小鼠的血液，离心得到血清，并利用内毒素检测试剂盒对血清中内毒素做了ELISA分析。

试验方法：利用眼球取血法将各组小鼠的血液收集至无菌1.5mlEP管中，3000r/分钟离心取上层血清；利用内毒素ELISA试剂盒检测各组小鼠的血清内毒素含量并记录。

试验结果：由图4可以看出，化疗组小鼠血清中内毒素含量相比于正常组(即空白对照组)小鼠显著升高(P<0.0001)，表明化疗小鼠体内存在严重的细菌感染；脾氨肽治疗组小鼠血清中内毒素含量显著低于化疗组小鼠，且高剂量脾氨肽治疗组小鼠血清中内毒素含量更低，与正常组几乎没有差异；阳性药物对照组(即谷氨酰胺溶液治疗组)小鼠血清中内毒素含量有所降低。因此，脾氨肽能够缓解化疗药物引起的细菌感染。

4.施用不同剂量的脾氨肽口服溶液对化疗小鼠肠道菌群的影响

肠道免疫是人体免疫系统组成的重要部分，而肠道菌群的稳定是肠道屏障及免疫的重要基础，为了探究化疗对小鼠肠道菌群的影响及脾氨肽对小鼠肠道菌群的影响，我们在实验第30天取小鼠新鲜粪便进行了肠道菌群测序分析。

试验结果：如图5所示，在科水平各组小鼠菌群结果分析相对丰度图可以看出，化疗组小鼠肠道菌群多样性降低，且拟杆菌科相对丰度显著增加，紫单胞菌科显著降低；正常剂量及高剂量脾氨肽治疗组小鼠肠道菌群变化趋向于空白对照组，证明该药物能够显著调节化疗小鼠肠道菌群结构，改善肠道菌群状况。

如图6各组小鼠肠道菌群多样性结果对比可以看出：化疗组小鼠肠道菌群丰度显著降低，表示肠道菌群状况恶化；脾氨肽治疗组相对丰度趋近于正常组。该结果再次验证了脾氨肽能够增加小鼠肠道菌群数量，改善化疗小鼠肠道菌群状况。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.脾氨肽在制备治疗肠屏障功能缺损的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肠屏障功能缺损为由化疗药物引起的肠屏障功能缺损；优选的，所述化疗药物为盐酸表柔比星。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述脾氨肽为动物的脾脏提取物；优选的，所述脾氨肽为脾氨肽的液体制剂。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的应用，其特征在于，所述脾氨肽在小鼠中施用的剂量为1.5mg/kg/天至7.5mg/kg/天；优选的，所述施用的剂量为7.5mg/kg/天。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的应用，其特征在于，所述脾氨肽能够显著改善化疗后小鼠肠道的病理情况，有效缓解化疗药物引起的肠屏障功能缺损。

6.一种组合物在制备治疗肠屏障功能缺损的药物中的应用，所述组合物包括脾氨肽和一种或多种药学上可接受的载体。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肠屏障功能缺损为由化疗药物引起的肠屏障功能缺损；优选的，所述化疗药物为盐酸表柔比星。

8.根据权利要求6或7所述的应用，所述载体包括药学上可接受的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、促进吸收剂、表面活性剂和增效剂组成的组中的1种以上。

9.根据权利要求6～8中任一项所述的应用，其特征在于，所述脾氨肽为动物的脾脏提取物；优选的，所述脾氨肽为脾氨肽的液体制剂。

10.根据权利要求6～9中任一项所述的应用，其特征在于，所述脾氨肽能够显著改善化疗后小鼠肠道的病理情况，有效缓解化疗药物引起的肠屏障功能缺损。

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