CN118286386A - Nod1激动剂在制备治疗肝细胞癌药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及NOD1激动剂在制备治疗肝细胞癌药物中的用途。本发明首次提出NOD1在肝癌中通过诱导TAMs免疫刺激表型，促进CD8⁺T细胞增殖、浸润以及活化，发挥抗肿瘤效果；并且发现用NOD1激动剂C12‑iE‑DAP能抑制小鼠肝癌的生长，具有协同抗PD‑1治疗抑制肝细胞癌的效果。由此，本发明提供了NOD1激动剂在制备治疗肝细胞癌药物中的用途，有效解决现有ICB治疗方法对肝细胞癌疗效不佳的问题。

Description

NOD1激动剂在制备治疗肝细胞癌药物中的用途

技术领域

本发明涉及生物医药术技术领域，具体涉及NOD1激动剂在制备治疗肝细胞癌药物中的用途。

背景技术

肝细胞癌(HCC)是一种高度流行的恶性肿瘤，也是世界上癌症相关死亡的第三大原因。许多HCC患者在晚期被诊断，错过了进行手术的最佳时间。免疫检查点抑制剂(ICB)治疗，特别是针对程序性细胞死亡(PD-1/PD-L1)信号通路的抗体的使用，使癌症的治疗发生了革命性的变化。然而，临床试验显示，抗PD-1抑制剂在晚期HCC患者中仅达到14％的客观缓解率和56％的疾病控制率。因此目前迫切需要确定一种联合治疗策略来提高ICB治疗HCC的疗效。

肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)存在于HCC进展的所有阶段，并有助于形成一个高度免疫豁免的肿瘤环境(TME)。大量研究表明，TAMs抑制效应T细胞的激活或阻断其进入TME，是ICB治疗的一个重要障碍。因此，靶向TAMs已成为补充肝细胞癌ICB治疗最受欢迎的策略之一。

肠道微生物群和抗PD-1治疗HCC的疗效之间存在显著相关性。NORD样受体(NLRs)构成了一个高度进化保守的胞质细菌传感器家族，主要在免疫细胞中表达，包括淋巴细胞和抗原提呈细胞(APCs)。由于它们能够检测不同的病原体相关分子模式(PAMP)并触发炎症反应，通常被认为是先天免疫反应领域内病原体识别的受体。已有证据表明，肠道微生物群释放的PAMP能够通过循环转移到肝脏，肝脏能够通过肝细胞上表达的NLRs来感知它们，进而诱发炎症以及肝癌。然而，对于NLR是否介导微生物对癌症免疫微环境以及免疫治疗的影响，仍然缺乏研究。

发明内容

本发明的目的是提供NOD1激动剂在制备治疗肝细胞癌药物中的用途，以解决ICB治疗肝细胞癌疗效不佳的问题。

核苷酸结合寡聚结构域1(NOD1)是一种细胞内模式识别受体，属于转录调节因子，NOD1是研究最多的NLR之一，主要识别细菌肽聚糖保守分子模式γ-D-谷氨酰基中二氨基庚酸(iE-DAP)。发明人研究发现：在对抗PD-1治疗表现出阳性反应的HCC患者中，NOD1的表达显著增加；NOD1激活直接诱导TAMs的免疫刺激表型，从而促进效应CD8⁺T细胞增殖，减少HCC肿瘤负担；这种抗肿瘤作用主要依赖于PLIN5调控脂质代谢，导致共刺激分子OX40L膜定位。本发明首次揭示了NOD1可作为增强HCC中ICB治疗的一个有效性的辅助靶点，从而抑制肝细胞癌的发生发展。

基于以上发现，本发明提供NOD1激动剂在制备治疗肝细胞癌药物中的用途。

进一步地，本发明所述的NOD1激动剂优选为C12-iE-DAP，其可在NOD1激活后诱导TAMs免疫刺激表型，促进CD8⁺T细胞增殖、浸润以及活化，上调IFN-γ、GZMB等细胞毒性效应分子，显著抑制HCC生长。

具体而言，本发明的C12-iE-DAP，是一种有效的、选择性的核苷酸结合寡聚结构域1(NOD1)激动剂，它是二肽γ-iE DAP的酰化衍生物，存在于革兰氏阴性杆菌和部分革兰氏阳性菌的肽聚糖(PGN)中，是Lauroyl-g-D-Glu-D-mDAP和Lauroyl-gD-Glu-L-mDAP的混合物。

进一步地，所述C12-iE-DAP与抗PD-1抗体联合使用。小鼠腹腔注射NOD1激动剂C12-iE-DAP实验显示，NOD1激动剂C12-iE-DAP可以与抗PD-1抗体协同作用，增强抗HCC的免疫应答，提升对肝细胞癌的抑制效果。

进一步地，所述药物包括有效成分，所述有效成分为C12-iE-DAP和抗PD-1抗体。

进一步地，所述药物还包括药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体包括但不限于以下任一种或多种：填充剂、粘合剂、增溶剂、崩解剂和助流剂。

进一步地，所述药物的剂型包括但不限于以下任一种：片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、口服液、涂剂、巴布剂、喷雾剂、粉针剂和水针剂。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明首次揭示了NOD1可作为增强HCC中免疫检查点抑制剂治疗的一个有效性的辅助靶点，从而抑制肝细胞癌的发生发展。

2、本发明体外实验显示NOD1激动剂C12-iE-DAP可激活TAMs免疫刺激表型，增强CD8⁺T细胞增殖和细胞毒性作用，发挥抗肿瘤效果。

3、本发明证实了NOD1激动剂C12-iE-DAP具有协同抗PD-1治疗抑制肝细胞癌的效果。

由此，本发明提供了NOD1激动剂C12-iE-DAP在治疗肝细胞癌方面的新应用。

附图说明

图1：本发明实施例1中NOD1激动剂C12-iE-DAP单独、联合NOD1抑制剂ML130体外刺激巨噬细胞的结果。

图2：本发明实施例1中不同浓度NOD1激动剂C12-iE-DAP体外刺激的巨噬细胞与CD8⁺T细胞共培养的结果。

图3:本发明实施例2中NOD1激动剂C12-iE-DAP单独、联合NOD1抑制剂ML130治疗肝癌的结果。其中，A为肝原位瘤大小变化情况，B为注射有Hepa1-6细胞的C57BL/6小鼠皮下瘤生长曲线和肿瘤重量。

图4：本发明实施例2中NOD1激动剂C12-iE-DAP联合抗PD-1治疗肝癌的结果。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明进行进一步的说明。

实施例1

本实施例为体外试验，具体操作如下：

1)巨噬细胞的提取，观察使用NOD1激动剂C12-iE-DAP后TAMs的极化状态

处死C57BL/6小鼠，用DMEM培养基(Gibco)冲洗股骨和胫骨，用注射器收集骨髓细胞。红细胞裂解后，用含10％胎牛血清(Gibco)和20ng/mL小鼠M-CSF(Absin)的DMEM(Gibco)培养5d，获得骨髓源性巨噬细胞(BMDMs)。然后将BMDMs暴露于来源于Hepa 1-6细胞的肿瘤条件培养基(TCM)24小时，以促进其向肿瘤相关巨噬细胞表型极化。在培养基中分别加入PBS(Vehicle)、C12-iE-DAP(NOD1激动剂)、C12-iE-DAP+ML130(NOD1激动剂联合NOD1抑制剂)培养6小时，流式细胞术观察TAMs是否出现M1免疫刺激表型，MHC-II代表M1型巨噬细胞，CD206代表M2型巨噬细胞。结果如图1所示，可以看出在C12-iE-DAP刺激下，巨噬细胞向M1免疫刺激表型分化。

2)CD8⁺T细胞与巨噬细胞共培养，观察CD8⁺T细胞增殖和细胞毒性作用

红细胞裂解后，使用CD8⁺T细胞分离试剂盒(Biolegend，#480035)从野生型C57BL/6小鼠的脾脏中分离出CD8⁺T细胞。对于增殖测定，纯化的CD8⁺T细胞用2μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE，Invitrogen)在室温、黑暗中标记10分钟。然后对CD8⁺T细胞进行计数并接种到平底96孔培养板中。利用CD3/CD28 Dynabeads激活CD8⁺T细胞后，将不同浓度C12-iE-DAP(800ng/mL、400ng/mL、200ng/mL)刺激下的TAMs或PBS(Vehicle)与CD8⁺T细胞共培养，流式细胞术观察CD8⁺T细胞细胞增殖情况。结果如图2所示，可以看出C12-iE-DAP刺激浓度越高，CD8⁺T细胞增殖能力越强。

体外试验证明，NOD1激动剂C12-iE-DAP可激活TAMs免疫刺激表型，增强CD8⁺T细胞增殖和细胞毒性作用。

实施例2

本实施例为小鼠注射试验，具体步骤如下：

1)构建小鼠肝癌模型

为抑制小鼠肠道中携带iE-DAP的乳杆菌，在肿瘤细胞种植前1周，在饮用水中添加新霉素(1mg/ml，开曼化学公司，#145-10-3)，每周更换2次水瓶。

原位肝细胞癌模型：在原位肿瘤细胞植入前麻醉小鼠。取上腹部8mm皮肤横切口，用微量注射器将25μl Hepa 1-6细胞单细胞悬液(2×10⁶/只)，用Matrigel(Corning，#356234)和1×phosphate缓冲液(PBS)配制成1∶1比例，注入C57BL/6小鼠肝左叶。

皮下瘤模型:将5×10⁶个Hepa 1-6细胞(小鼠肝癌细胞)的单细胞悬液100μl接种于实验鼠右侧腹股沟皮下。

2)注射NOD1激动剂C12-iE-DAP及NOD1抑制剂ML130，观察肿瘤大小

对上述原位瘤小鼠模型进行分组，分为对照组(Vehicle，n＝5只)、NOD1激动剂组(C12-iE-DAP，n＝5只)、NOD1激动剂联合抑制剂组(C12-iE-DAP+ML130，n＝5只)，进行挽救实验。在上述原位瘤小鼠模型构建后，分别予以腹腔注射PBS(1ml/次，隔日1次)、C12-iE-DAP(10μg/次，隔日1次，InvivoGen，#tlrl-c12dap)，C12-iE-DAP(10μg/次，隔日1次，InvivoGen，#tlrl-c12dap)联合ML130(50μg/injection，隔日1次，MedChemExpress，#HY-18639)。2周后，观察小鼠肿瘤大小。利用小动物PET/CT活体影像系统(In Vivo Xtreme设备(Bruker))对小鼠进行肿瘤成像，感兴趣区的总辐射通量(Total radiation Flux)代表肿瘤大小，秩和检验统计组间辐射通量的差异(图3A)。

对上述皮下瘤小鼠模型进行同上分组及给药操作。每2天测量1次肿瘤体积，计算公式为长×宽×0.5(mm³)。在研究终点(2周后)评估肿瘤重量，并收集组织样本进行分析。秩和检验统计组间肿瘤大小及重量的差异(图3B)。

3)注射NOD1激动剂C12-iE-DAP及抗PD-1抗体，观察肿瘤大小

对上述原位瘤小鼠模型进行分组，分为对照组(Vehicle，n＝5只)、抗PD-1治疗组(Anti-PD-1，n＝5只)、NOD1激动剂组(C12-iE-DAP，n＝5只)、抗PD-1治疗联合NOD1激动剂组(Anti-PD-1+C12-iE-DAP，n＝5只)。在上述原位瘤小鼠模型构建后，分别予以腹腔注射PBS(1ml/次，隔日1次)、抗PD-1抗体(200μg/次,隔三日1次,Bio X Cell,#BE0146)、C12-iE-DAP(10μg/次，隔日1次，InvivoGen，#tlrl-c12dap)、抗PD-1抗体(200μg/次,隔三日1次,BioXCell,#BE0146)联合C12-iE-DAP(10μg/次，隔日1次，InvivoGen，#tlrl-c12dap)。2周后，观察小鼠肿瘤大小。利用小动物PET/CT活体影像系统(In Vivo Xtreme设备(Bruker))对小鼠进行肿瘤成像，感兴趣区的总辐射通量(Total radiation Flux)代表肿瘤大小，秩和检验统计组间辐射通量的差异(图4)。

本实施例实验结果如图3-4所示，可以看出：用NOD1激动剂C12-iE-DAP治疗小鼠原位肝癌缩小，联合NOD1抑制剂ML130治疗，肿瘤大小不缩小(图3A)；注射有Hepa1-6细胞的C57BL/6小鼠肿瘤生长曲线和肿瘤重量提示，使用NOD1激动剂C12-iE-DAP能够有效减少肝肿瘤生长和重量(图3B)；NOD1激动剂C12-iE-DAP联合抗PD-1治疗起到更好的抗肿瘤效果，肿瘤缩小明显(图4)。

小鼠实验证明，NOD1激动剂C12-iE-DAP具有协同抗PD-1治疗抑制肝细胞癌的效果。

本具体实施方式仅仅是对本发明的解释，并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读了本发明的说明书之后所做的任何改变，只要在本发明权利要求书的范围内，都将受到专利法的保护。

Claims (5)

1.NOD1激动剂在制备治疗肝细胞癌药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的NOD1激动剂在制备治疗肝细胞癌药物中的用途，其特征在于：所述NOD1激动剂为C12-iE-DAP。

3.根据权利要求2所述的NOD1激动剂在制备治疗肝细胞癌药物中的用途，其特征在于：所述C12-iE-DAP与抗PD-1抗体联合使用。

4.根据权利要求3所述的NOD1激动剂在制备治疗肝细胞癌药物中的用途，其特征在于：所述药物包括有效成分，所述有效成分为C12-iE-DAP和抗PD-1抗体。

5.根据权利要求4所述的NOD1激动剂在制备治疗肝细胞癌药物中的用途，其特征在于：所述药物还包括药学上可接受的载体。