CN111978429B - 一种金针菇菇根多糖的提取方法 - Google Patents

一种金针菇菇根多糖的提取方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111978429B
CN111978429B CN202010973534.8A CN202010973534A CN111978429B CN 111978429 B CN111978429 B CN 111978429B CN 202010973534 A CN202010973534 A CN 202010973534A CN 111978429 B CN111978429 B CN 111978429B
Authority
CN
China
Prior art keywords
polysaccharide
root
flammulina velutipes
fermented
needle mushroom
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010973534.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111978429A (zh
Inventor
徐建雄
马升
沈城
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Jiaotong University
Original Assignee
Shanghai Jiaotong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Jiaotong University filed Critical Shanghai Jiaotong University
Priority to CN202010973534.8A priority Critical patent/CN111978429B/zh
Publication of CN111978429A publication Critical patent/CN111978429A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111978429B publication Critical patent/CN111978429B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种金针菇菇根多糖的提取方法，首先对金针菇菇根进行发酵，然后利用超高压－超声波协同法提取金针菇菇根多糖，并用响应曲面法优化得出最佳提取条件。在浸提液pH为5，超高压压力360MPa，超高压时间5min时，普通金针菇菇根多糖得率为8.65%，比罗霄山用超声波辅助提取法提取金针菇菇根多糖的得率提高12.48%；发酵菇根多糖得率为9.44%，比罗霄山的超声波辅助提取法的得率提升22.76%，比普通菇根多糖得率提升9.13%。同时，利用该方法提取的多糖，单糖组成改善，抗氧化活性提升。

Description

一种金针菇菇根多糖的提取方法
技术领域
本发明涉及一种多糖的提取方法，具体为一种金针菇菇根多糖的提取方法，属于多糖提取应用领域。
背景技术
金针菇，学名“毛柄金钱菌”，英文名称是＂Enoki Mushroom＂，隶属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、口蘑科、金钱菌属。其脂肪含量低，含有较高的蛋白质、糖类和粗纤维，还富含多种维生素和钙、磷、铁等多种矿物质，营养十分丰富。食用金针菇有利肝脏、益肠胃、增智慧和抗肿瘤等功效，适用于肝炎、胃肠淸荡、高血压、降胆固醇和幼儿智力低下等
金针菇多糖是金针菇主要活性物质中研究最多的一种化学成分，其单糖
组分主要有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖和岩藻糖等。金针菇多糖具有两种以上的多糖组分，已分离出的多糖既有均一多糖也有杂多糖，且结构特征具有多样性。
金针菇多糖具有多种生物活性，如保肝、抗肿瘤、免疫调节、抗氧化衰老、解除机体疲劳等。有学者报道金针菇多糖对小鼠肉瘤有明显的抑制作用，对小鼠血浆ALT和AST活性升高有显著的降低作用，并明显升高肝脏SOD的活性，显著降低脂质过氧化产物MDA的含量。除此之外，还具有调节细胞的生长、细胞的衰老和死亡、控制细胞分裂分化等功能。
随着现代生活节奏的加快、工作压力的加大，人类免疫系统功能降低，导致各类疾病的发病率呈上升趋势。真菌多糖不仅具有多种生物活性且没有毒副作用，是公认的有较高疗效的免疫增强剂。金针菇作为三大食用菌之一，年产量十分大。金针菇菇根作为金针菇消费利用的副产物，也具有丰富的多糖等活性物质。因此，对金针菇菇根以及其具有保健功能的多糖成分进行研究，使其废物利用，十分必要，且具有非常大的潜力。金针菇菇根实际上还含有大量的可以利用的优质膳食纤维，在制备多糖过程中，将提取多糖后的残渣废物利用，用来制备金针菇菇根不溶性膳食纤维，又可实现金针菇菇根的综合利用。
金针菇菇根中多糖含量非常丰富，但由于利用不当，多数金针菇菇根被直接丢弃。本发明旨在科学提取金针菇菇根中的多糖，并提高其多糖得率以充分利用，减少资源浪费。目前金针菇菇根多糖已成为当今食品、农牧行业日益关注的焦点，受到人们的重视。
罗霄山等分别采用热水浸提法和超声波辅助提取法进行金针菇菇根多糖提取并对两种方法进行了比较，结果表明超声波辅助提取法具有更好的效果。其采用超声波辅助提取法的最佳工艺条件为超声功率180W，液料比35:1，浸提温度80℃，浸提时间40min，粗多糖得率为7.69%，是目前现有技术得率最高的提取方法。
本试验在上述研究的基础上，先将金针菇菇根发酵，然后采用超高压－超声波协同法提取多糖，并用响应面法优化。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种金针菇菇根多糖的提取方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的，一种金针菇菇根多糖的提取方法，包括以下步骤：
（1）金针菇菇根发酵与提取纯化
a、取金针菇菇根干燥后粉碎，干燥后水分在10～12%，按0.05～0.1%添加创博发酵剂，按3%比例加入糖蜜，加水调节水分至35～40%，在28℃～35℃的密闭环境中发酵10～12天，发酵结束后取出干燥，制得发酵金针菇菇根；
b、取发酵金针菇菇根和普通金针菇菇根，分别置于烘箱中，60℃下烘干后，粉碎过80目筛；
c、分别称取10g发酵金针菇菇根和普通金针菇菇根粉末放入两个烧杯中，分别相两个烧杯中加入350ml蒸馏水，混匀后置于超声波清洗器中浸提，设置超声波清洗器工作参数为超声功率180W，浸提温度80℃，浸提时间40min；
d、将混合液离心取上清液，加入4倍体积的无水乙醇，4℃下过夜，离心收集沉淀，并用无水乙醇、丙酮和乙醚依次洗涤沉淀后50℃烘干，得粗多糖备用；
e、采用Sevage法脱蛋白、DEAE-纤维素-52色谱法初步纯化和葡聚糖凝胶色谱法对上述步骤制备的粗多糖进行二次纯化；
（2）多糖得率测定
采用蒽酮-硫酸法进行总糖的测定，采用3,5-二硝基水杨酸比色法进行还原糖测定；
（3）单因素试验
调节发酵后的发酵金针菇菇根和普通菇根浸提液的pH值，再分别装入双层高压袋中，封口后放入超高压装置内，并进行以下操作：
a、设定超高压压力350 MPa, 超高压时间 5 min，分别测定发酵金针菇菇根和普通菇根浸提液pH为3、4、5、6、7时多糖的得率；
b、设定发酵金针菇菇根和普通菇根浸提液pH为5，超高压时间5min，分别测定超高压压力为250、300、350、400、450MPa时，发酵金针菇菇根和普通菇根根多糖的得率；
c、设定发酵金针菇菇根和普通菇根浸提液pH为5，超高压压力350MPa，分别测定超高压时间为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0min时，发酵金针菇菇根和普通菇根多糖的得率；
（4）响应曲面法优化
利用Design-Expert8.0软件进行二次多项式回归拟合，得到多糖含量对混合液pH（A）、超高压压力（B）、超高压时间（C）的回归模型方程；
（5）多糖鉴定
包括扫描电镜观察、红外光谱分析和液相色谱分析；
（6）抗氧化活性研究
包括DPPH自由基、超氧阴离子自由基和羟自由基的清除率测定以及总抗氧化能力测定；
（7）测定结果
在发酵金针菇菇根和普通菇根浸提液pH为5，超高压压力360MPa，超高压时间5min时，普通金针菇菇根多糖得率为8.65%，发酵金针菇菇根多糖得率为9.44%，发酵金针菇菇根多糖得率较普通金针菇菇根多糖得率提升9.13%；相比普通菇根而言，发酵菇根具有更优的单糖组成和更强的抗氧化活性。
优选地，所述步骤（1）a发酵金针菇菇根制备过程中，菇根粉碎颗粒度标准为99%通过2.80mm编织筛，不得有整粒谷物，1.40mm编织筛筛上物不大于15%，发酵工艺是固态厌氧发酵，创博微生物发酵剂生产批号为CB08190529，执行标准Q/SWHA-56。
优选地，所述发酵金针菇菇根和普通金针菇菇根均购自上海光明森源生物科技有限公司。
优选地，所述仪器设备包括KH-250TDB型超声波清洗机，购自昆山禾创超声仪器有限公司；GENSYS 10S型紫外分光光度计，购自德国Thermo Fisher Scientific公司；6700型傅里叶变换红外光谱仪，购自美国Nicolet仪器公司；HPP600 /5L 超高压食品处理设备，购自苏州微流纳米生物技术有限公司。
优选地，所述实验试剂包括蒽酮、乙酸乙酯、硫酸、葡萄糖、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、丙三醇、无水乙醇、丙酮、氯仿—正丁醇和和乙醚，上述实验试剂均为分析纯。
本发明的有益效果是：
本发明公开的一种金针菇菇根多糖的提取方法，首次采用超高压－超声波协同法提取金针菇菇根多糖，再用响应面法优化，当pH=5，超高压压力360MPa，超高压时间5min时，普通多糖得率为8.65%，比罗霄山等的超声波辅助提取法的得率提高12.48%；发酵多糖得率为9.44%，比罗霄山等的超声波辅助提取法的得率提升22.76%，比普通多糖得率提升9.13%。
附图说明
图1为本发明金针菇菇根发酵前后对比图，A1、A2、A3为普通金针菇菇根，B1、B2、B3为发酵金针菇菇根。
图2为本发明总糖标准曲线图。
图3为本发明还原糖标准曲线图。
图4为本发明单因素试验结果对比图。
图5为本发明普通金针菇菇根多糖提取得率响应面图。
图6为本发明发酵金针菇菇根多糖提取得率响应面图。
图7为本发明金针菇菇根多糖扫描电镜图，A1、A2、A3为普通金针菇菇根多糖，B1、B2、B3为发酵金针菇菇根多糖。
图8为本发明发酵金针菇菇根多糖红外光谱图。
图9为本发明金针菇菇根多糖体外抗氧化活性图，A为DPPH自由基清除率，B为OH·清除率，C为O2-·清除率，D为总抗氧化能力。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所用的试剂包括蒽酮、乙酸乙酯、硫酸、葡萄糖、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、丙三醇、无水乙醇、丙酮、氯仿—正丁醇和和乙醚，上述实验试剂均为分析纯。
本发明数据处理与统计分析采用SPSS 18.0 统计软件进行分析，数据取3次重复平均值，显著性分析为ANOVA，多重比较采用LSD检验。
本发明所用到的仪器设备包括KH-250TDB型超声波清洗机，购自昆山禾创超声仪器有限公司；GENSYS 10S型紫外分光光度计，购自德国Thermo Fisher Scientific公司；6700型傅里叶变换红外光谱仪，购自美国Nicolet仪器公司；HPP600 /5L 超高压食品处理设备，购自苏州微流纳米生物技术有限公司；创博微生物发酵剂生产批号为CB08190529，执行标准Q/SWHA-56。
本发明所采用的发酵金针菇菇根和普通金针菇菇根均购自上海光明森源生物科技有限公司。
请参阅图1-9所示，一种金针菇菇根多糖的提取方法，包括以下步骤：
（1）金针菇菇根发酵与提取纯化
a、取金针菇菌渣菇根干燥后粉碎，干燥后水分在10～12%，按0.05～0.1%添加创博发酵剂，按3%比例加入糖蜜，加水调节水分至35～40%，在温度28℃～35℃的密闭环境中发酵10～12天，发酵结束后取出干燥粉碎，制得发酵金针菇菇根，菇根粉碎颗粒度标准为99%通过2.80mm编织筛，不得有整粒谷物，1.40mm编织筛筛上物不大于15%；
金针菇菇根发酵前后对比如图1所示。普通金针菇菇根为金针菇切掉子实体后剩余菇根部分，电镜观察发现形状不规则且大小不一，并有很多孔隙；发酵金针菇菇根呈褐色粉末状，并有淡香味，电镜下的发酵金针菇菇根形状相对规则，没有孔隙；
b、取发酵金针菇菇根和普通金针菇菇根，分别置于烘箱中，60℃下烘干后，粉碎过80目筛；
c、分别称取10g发酵金针菇菇根和普通金针菇菇根粉末放入两个烧杯中，分别相两个烧杯中加入350ml蒸馏水，混匀后置于超声波清洗器中浸提，设置超声波清洗器工作参数为超声功率180W，浸提温度80℃，浸提时间40min；
d、将混合液离心取上清液，加入4倍体积的无水乙醇，4℃下过夜，离心收集沉淀，并用无水乙醇、丙酮和乙醚依次洗涤沉淀后50℃烘干，得粗多糖备用；
e、采用Sevage法脱蛋白、DEAE-纤维素-52色谱法初步纯化和葡聚糖凝胶色谱法对上述步骤制备的粗多糖进行纯化，具体步骤如下；
Ⅰ、首先采用Sevage法脱蛋白
预先将氯仿—正丁醇配制成体积比为4∶1的混合液，分别量取普通菇根和发酵菇根粗多糖浸提液30mL于2个250mL锥形瓶中，分别取10mL氯仿—正丁醇混合液置于2个锥形瓶中，振摇15min，4000r/min离心10min，弃沉淀，取上清液，再加入其体积1/2的氯仿—正丁醇混合液，重复上述步骤两次；
Ⅱ、一次纯化
用DEAE-纤维素-52离子交换填料活化、装料与平衡并上样纯化；
Ⅲ、二次纯化
用葡聚糖凝胶色谱法二次纯化，包括Sephadex G-100 发酵、凝胶柱的装填和平衡和上样纯化。
（2）多糖得率测定
采用蒽酮-硫酸法进行总糖的测定，采用3,5-二硝基水杨酸比色法进行还原糖测定；
a、总糖的测定：蒽酮-硫酸法
总糖标准曲线的绘制：取7支试管，按表1的数据配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液：
表1 标准葡萄糖溶液配制方法表
试管号 1 2 3 4 5 6 7
蒸馏水（ml） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.4 0.2
葡萄糖标准液（ml） 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8
葡萄糖含量（ug） 0 10 20 30 40 60 80
分别从上述7支试管吸取1ml糖溶液于试管中，加入1ml去离子水，0.5ml蒽酮乙酸乙酯试剂，然后加5ml浓硫酸，在630nm波长测各管吸光值。
以所得数据绘制标准曲线，横坐标为标准糖含量，纵坐标为吸光值，测定的回归方程为y=0.0054x-0.0061，相关系数R2=0.9988，标准曲线见图2；
样品总糖含量的测定：将金针菇菇根浸提液稀释2倍，吸取1ml溶液，按上述步骤进行操作，测定样品吸光值，带入线性回归方程中，计算样品总糖的含量；
计算公式：样品总糖浓度（ug/ml）=（OD630+0.0154）/ 0.0054×稀释倍数。
b、还原糖测定：采用3,5-二硝基水杨酸比色法
标准曲线的绘制：取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/ml的葡萄糖标准溶液各1ml分别置于25ml具塞试管中，各加入3,5-二硝基水杨酸溶液（DNS）2ml，5分钟沸水浴进行显色反应，然后利用流动水迅速冷却至室温，再用蒸馏水定容至25ml并摇匀，以空白溶液进行调零，在波长为540nm处测定各管吸光度，以横坐标为标准葡萄糖溶液浓度，纵坐标为吸光度绘制标准曲线，测定的回归方程为y=0.0003x+0.0021，相关系数R2=0.999，标准曲线见图3；
样品总糖含量的测定：稀释样品到浓度低于2.5mg/ml，吸取稀释后的溶液1ml，按照上述步骤绘制标准曲线的操作处理样品，在波长为540nm处测量吸光值，并利用标准曲线的回归方程，按如下公式计算样品中还原糖的浓度；
计算公式：样品中还原糖的浓度（mg/ml）=（OD540-0.0012）/ 0.3209×稀释倍数。
多糖测定：
多糖含量（mg）=总糖含量-还原糖含量
多糖率=（多糖含量/样品质量）×100%。
（3）单因素试验
调节发酵后的发酵金针菇菇根和普通菇根浸提液的pH值，再分别装入双层高压袋中，封口后放入超高压装置内，并进行以下操作：
a、设定超高压压力350 MPa, 超高压时间 5 min，分别测定发酵金针菇菇根和普通菇根浸提液pH为3、4、5、6、7时，发酵金针菇菇根和普通菇根多糖的得率；
b、设定发酵金针菇菇根和普通菇根浸提液pH为5，超高压时间5min，分别测定超高压压力为250、300、350、400、450MPa时，发酵金针菇菇根和普通菇根根多糖的得率；
c、设定发酵金针菇菇根和普通菇根浸提液pH为5，超高压压力350MPa，分别测定超高压时间为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0min时，发酵金针菇菇根和普通菇根多糖的得率。
单因素试验结果见图4。由图4可知，三种因素下，发酵菇根多糖得率在各个水平始终高于普通菇根多糖得率。普通和发酵菇根多糖得率在pH从3至5之间均呈递增趋势，并且在pH=5时达到最大值，再增大pH，得率反而快速降低，并低于低pH下的多糖得率。超高压压力和超高压时间对多糖得率的影响也是先升高后降低，分别在超高压压力350MPa和超高压时间5min时达到最高。超高压有助于细胞破裂从而使溶剂溶出多糖，但当压力超过350MPa和时间超过5min后，细胞已基本破裂完全。
（4）响应曲面法优化
通过单因素试验初步确定变量的适宜范围，进行三因素三水平Box-Behnken试验设计，A、B、C分别表示混合液pH、超高压压力（MPa）、超高压时间（min），各因素的试验水平及编码列于表2，并对所得数据进行二次回归拟合，求得回归方程。各因素的试验水平及编码列于表2；
表2 Box-Behnken试验设计各因素的试验水平及编码表
Figure DEST_PATH_IMAGE002
表2中A表示发酵金针菇菇根和普通菇根浸提液pH值，B表示超高压压力（MPa）值，C表示超高压时间（min）。
a、普通金针菇菇根多糖提取响应面试验设计及结果
表3 普通金针菇菇根多糖提取响应面试验设计及结果
组 A混合液pH B超高压压力/MPa C超高压时间/min 得率/%
1 5 300 4.5 8.06
2 5 350 5 8.75
3 6 300 5 8.12
4 5 350 5 8.69
5 4 350 4.5 8.19
6 5 350 5 8.83
7 5 300 5.5 7.92
8 4 350 5.5 8.18
9 5 400 5.5 7.96
10 6 350 4.5 8.07
11 5 350 5 8.57
12 5 350 5 8.91
13 6 400 5 8.12
14 4 300 5 8.05
15 6 350 5.5 8.17
16 5 400 4.5 7.87
17 4 400 5 8.14
表4 响应面二次回归方程方差分析
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性
模型 1.3833 9 0.1537 16.9757 0.0006 **
A 混合液pH 0.0008 1 0.0008 0.0884 0.7749
B 超高压压力 0.0004 1 0.0004 0.0497 0.0483 *
C 超高压时间 0.0002 1 0.0002 0.0221 0.8860
AB 0.0020 1 0.0020 0.2237 0.6507
AC 0.0030 1 0.0030 0.3341 0.5814
BC 0.0132 1 0.0132 1.4606 0.2661
A<sup>2</sup> 0.1399 1 0.1399 15.4460 0.0057 **
B<sup>2</sup> 0.6152 1 0.6152 67.9481 <0.0001 **
C<sup>2</sup> 0.4789 1 0.4789 52.8915 0.0002 **
残差 0.0634 7 0.0091
失拟项 0.0137 3 0.0046 0.3677 0.7813
纯误差 0.0497 4 0.0124
综合 1.4467 16
普通金针菇菇根多糖提取响应面试验设计及结果见表3，响应面二次回归方程方差分析见表4。由表4可知，该模型的F值为16.98，P＜0.01，表明模型高度显著，回归方程拟合度好且具有统计学意义。模型失拟项的P＞0.05，说明未知因素对试验结果的干扰很小，失拟项差异不显著，试验无失拟因素存在，能充分反映实际情况，回归模型是适合的；试验模型的决定系数R2=0.9562，说明多糖得率的结果与模型预测结果有着良好的一致性，试验模型的校正系数R2 Adj=0.8999，试验结果有89.99%受试验因素的影响。因此，结果可靠，此模型可以对多糖得率结果进行分析和预测。
响应面分析法是一种用于在多因素系统中寻找最佳测试条件的统计方法。利用Design-Expert8.0软件对表4试验数据进行二次多项式回归拟合，得到多糖含量对混合液pH（A）、超高压压力（B）、超高压时间（C）的回归模型方程为：R = 8.67 - 0.01 × A -0.0075 × B + 0.005 × C - 0.023 × AB + 0.027 × AC + 0.058 × BC - 0.18 ×A2 - 0.38 × B2 - 0.34 × C2。
回归方程各项方差分析中F检验可以判断自变量对因变量的影响，由此得到各因素对多糖得率影响的主次顺序为超高压压力＞混合液pH＞超高压时间。由回归方程和方差分析还可知，模型中一次项超高压压力对多糖得率的影响达到显著水平（P＜0.05＝，混合液pH和超高压时间的影响均不显著（P＞0.05）；模型中二次项A2、B2、C2对多糖得率的影响达到极显著水平（P＜0.01＝；且混合液pH、超高压压力、超高压时间对多糖得率的影响均不具有显著的交互性（P＞0.05）。
b、发酵金针菇菇根多糖提取得率响应面试验设计及结果
表5 发酵金针菇菇根多糖提取得率响应面试验设计及结果
组 A混合液pH B超高压压力/MPa C超高压时间/min 得率/%
1 6 350 5.5 8.41
2 5 350 5 9.29
3 4 350 4.5 7.81
4 5 350 5 9.46
5 5 400 4.5 8.25
6 5 300 5.5 7.99
7 4 400 5 8.57
8 5 400 5.5 8.84
9 6 300 5 8.19
10 4 350 5.5 8.81
11 6 400 5 8.54
12 5 350 5 9.58
13 6 350 4.5 9.12
14 5 350 5 9.34
15 5 300 4.5 8.37
16 4 300 5 8.26
17 5 350 5 9.52
表6 发酵金针菇菇根多糖提取得率响应面二次回归方程方差分析
方差来源 平方和 自由度 均方 F 值 <i>P</i> 值 显著性
模型 4.9784 9 0.5532 20.6175 0.0003 **
A 混合液pH 0.0820 1 0.0820 3.0568 0.1239
B 超高压压力 0.2415 1 0.2415 9.0018 0.0199 *
C 超高压时间 0.0313 1 0.0313 1.1648 0.3163
AB 0.0004 1 0.0004 0.0150 0.9062
AC 0.7310 1 0.7310 27.2473 0.0012 **
BC 0.2352 1 0.2352 8.7675 0.0211 *
A<sup>2</sup> 0.8022 1 0.8022 29.9017 0.0009 **
B<sup>2</sup> 1.5745 1 1.5745 58.6841 0.0001 **
C<sup>2</sup> 0.9065 1 0.9065 33.7881 0.0007 **
残差 0.1878 7 0.0268
失拟项 0.1289 3 0.0430 2.9195 0.1637
纯误差 0.0589 4 0.0147
综合 5.1662 16
表7 金针菇菇根响应面试验设计最佳条件
菇根种类 混合液pH 超高压压力/MPa 超高压时间/min 得率/% 可信度
普通菇根 4.974 349.582 5.003 8.672 0.836
发酵菇根 5.083 357.831 5.035 9.458 0.753
根据 Design Expert 8.0.6结果可知，超高压-超声波协同法提取普通和发酵金针菇菇根多糖的最佳条件如表7所示, 在上述条件下的多糖得率预测值分别为8.672%和9.458 %。
为检验试验结果的可靠性,根据最佳条件进行了验证试验,为方便实际操作,选取发酵金针菇菇根和普通金针菇菇根浸提液pH为5、 超高压压力360MPa、 超高压时间5min,在此条件下进行 3 次平行试验,实际测得多糖得率分别为8.65%和9.44 %,与模型预测值基本一致,充分说明了该模型能够较好地模拟和预测金针菇菇根多糖的提取条件与多糖得率之间的关系,同时也说明了超高压-超声波协同法工艺参数的可行性。
（5）多糖鉴定
a、扫描电镜观察
取微量普通和发酵菇根多糖粉末于观察台上，用橡胶吸球吹扫黏附在表面上的多糖，喷金后置于扫描电子显微镜下观察，结果如图7所示。
由图7可知，普通菇根多糖形状不规则，大小差异较大，且表面有凸起。发酵后多糖形态变化明显，形状不规则，大小差异较小，且表面较为平整，没有凸起。
b、红外光谱分析
将普通菇根和发酵菇根多糖烘干，在红外灯下分别将两份样品和干燥的KBr粉末混合并研磨充分后，用真空的压片机压片，然后用傅里叶红外光谱仪进行扫描，扫描范围为4000～400cm-1。
如图8所示，在3480cm-1左右有一个宽而强的吸收带是羟基的伸缩振动，在3000-2800cm-1处出现的强吸收峰是烷基的C-H伸缩振动，1650-1550cm-1区域的吸收度是由于烯醇和酰胺基团的伸缩振动。1300-1400cm-1左右的吸收峰是C-H变角振动引起的。10800cm-1处的吸收峰是呋喃糖环C-O-C的C-O伸缩振动引起。875cm-1是α-1，3、α-1，4和α-1，6糖苷键的特征吸收蜂，650-800cm-1是α-1，6糖苷键的吸收峰，这两个吸收峰为多糖类物质的特征峰，因此可从定性角度证明此种物质是多糖类物质。
c、液相色谱分析
精密称定粗多糖50mg，于10ml容量瓶溶解，精密量取1ml置安瓿瓶中，加4mol/LTFA 1ml，封管，100℃水解2小时，冷却至室温。反应液转移至圆底烧瓶内，加甲醇8ml，减压旋蒸，浓缩至一半加入8ml甲醇，继续旋蒸，每次浓缩至一半加入甲醇，量分别为5ml，5ml，3ml，3ml，最后一次旋蒸至干。样品于55℃供箱烘干6小时。残渣精密加水1ml溶解，摇匀，量取25μL，置5ml离心管中，加0.6 mol/L氢氧化钠溶液25μL，混匀，再加0.4mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮甲醇溶液50μL，混匀30s，60℃水浴放置100min，室温冷却5min，加0.3mol/L盐酸50μL中和，加水850μL，混匀，加氯仿1ml，涡旋3min，离心（4000rpm，5min），去除有机相，再次加入加氯仿1ml并重复上述步骤三次。水相作为供试品溶液。另取80℃干燥至恒重的标准单糖对照品适量，精密称定，加水溶解并稀释制成每1ml含0.9mg的溶液，精密量取25μL，照供试品制备项下的方法，用水相替代有机相作为对照。精密量取上述两种溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图；按外标法以峰面积计算供试品中甘露糖、葡萄糖和半乳糖的量。
色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以磷酸盐-乙腈为流动相；流速为1ml/min；柱温检测波长为250nm。
表8 金针菇菇根多糖的单糖组成及含量
单糖 普通菇根（%） 发酵菇根（%） 含量变化（%）
葡萄糖 39.40 43.03 +3.63
半乳糖 31.64 25.07 -6.57
甘露糖 18.01 23.53 +5.52
岩藻糖 10.15 7.58 -2.57
鼠李糖 0.80 0.79 -0.01
含量变化中“+”代表升高，“-”代表降低。
如表8所示，液相色谱结果表明金针菇菇根多糖由五种单糖组成，其中葡萄糖含量最高，为43.03%，其他单糖按含量由高到低依次为为半乳糖、甘露糖、岩藻糖和鼠李糖。与普通菇根相比，发酵菇根葡萄糖和甘露糖含量升高，鼠李糖含量基本不变，半乳糖和岩藻糖含量降低。单糖组成更有利于降解和被人或动物机体消化吸收。
（6）抗氧化活性研究
a、DPPH自由基清除率
分别将普通和发酵菇根多糖配制成浓度为200、400、600、800和1000mg/L溶液，取20μL不同浓度的多糖溶液分别加入200μL的DPPH乙醇溶液（0.1mol/L）。混匀后置于无光环境中反应30min，于517nm波长下测定吸光度（A1）。用20μL无水乙醇代替多糖溶液作为空白对照（A0），以20μL多糖溶液与200μL无水乙醇混合液为样品对照(AX)。每个样品平行测定3次，取平均值。以抗坏血酸为阳性对照（下同），重复上述操作。按下式计算样品的DPPH自由基清除率。计算菇根多糖对DPPH自由基的清除率。
DPPH自由基清除率(%)=[A0－(A1－AX)]/A0×100%
b、羟自由基清除率
取0.1mL不同浓度的多糖溶液与0.15mL 2-脱氧核糖（5mmol/L）、0.4mL磷酸钠缓冲液（0.75mol/L）、0.25mL双蒸水和0.1mL硫酸亚铁溶液（7.5mmol/L）混合。向混合液中加入0.1mL过氧化氢溶液（体积分数1%），并充分混匀。37℃水浴条件下反应1h后，于536nm波长处测定吸光度，结果记为A1。用相同体积的双蒸水代替样品溶液作为对照管，进行相同的处理后，于536nm波长处测定其吸光度，结果记为A0。每个样品平行测定3次，取平均值。以下式计算羟基清除率。
羟自由基清除率(%)=(A0－A1)/A0×100%
c、超氧阴离子自由基O2-·的清除率测定
以分别加入4.50mL Tris－HCl 缓冲溶液(0.05mol/L，pH值8.2)、2.00mL H2O、0.20mLHCl溶液(0.01mol/L，pH值8.2)的混合液作为参比溶液，以加入4.50mL Tris－HCl缓冲溶液(0.05mol/L，pH值8.2)、2.00mLH2O、0.20mL邻苯三酚溶液(0.05mol/L)的混合液为空白溶液，以加入4.50mL Tris－HCl缓冲溶液(0.05mol/L，pH值8.2)、不同浓度多糖溶液和0.20mL邻苯三酚溶液(0.05mol/L)的混合液作为样品液，振荡，最后加入1滴6mol/L HCl终止反应，在37℃下加热10min，冷却10min至室温，在325nm处测定吸光度D325nm。以下式计算多糖对O2-·的清除率。
清除率=(D325nm(0)－D325nm(样))/D325nm(0)×100%
超氧阴离子自由基清除率(%)=(A0－AX)A0×100%
式中：A0代表空白管所测的吸光度；AX代表不同浓度样品液所测得的吸光度。
d、总还原能力测定(FＲAP法)
分别量取300mmol/L醋酸溶液25mL、20mmol/LFeCl3溶液2.5mL、10mmol/LTPTZ溶液混合制备FＲAP工作液。分别吸取浓度为0.15、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5mmol/L的FeSO4溶液200μL于试管中。吸取FＲAP工作液1800μL分别加入各试管中，于37℃下孵育5min，在593nm波长下测定吸光度。以FeSO4浓度作横坐标，测得的吸光值作纵坐标，绘制工作曲线。测定多糖样时，将多糖样品溶液加入试管中，再加入FＲAP工作液。依据工作曲线计算玄参多糖的总还原力抗氧化活性。
金针菇菇根多糖抗氧化活性如图9所示。总的来看，四项指标中，普通菇根多糖和发酵菇根多糖抗氧化活性均随浓度增大而增大，且发酵菇根多糖抗氧化活性始终高于普通菇根多糖，浓度越大两者差异越大。其中，DPPH自由基清除率和OH·清除率在浓度达到800mg/L后趋于平缓，清除能力没有明显得增长，说明多糖对超氧化阴离子清除能力具有明显的饱和性；O2-·清除率在浓度达到800mg/L后开始下降，总抗氧化能力继续增大。
综上所述，超高压-超声波协同法提取金针菇菇根多糖的最佳工艺条件为pH=5，超高压压力360MPa，超高压时间5min，超声功率180W，超声时间40min；利用该方法提取普通菇根多糖的得率为8.65%，比罗霄山用超声波辅助提取法提取金针菇菇根多糖的得率提高12.48%；发酵金针菇菇根多糖得率为9.44%，发酵菇根比普通菇根的多糖得率提升9.13%。
金针菇菇根多糖发酵后形态变化明显，电镜下发现形状更加规则、平整、紧凑，红外光谱结果表明发酵前后金针菇菇根多糖化学结构没有发生显著变化，即发酵没有破坏金针菇菇根多糖完整性。液相色谱结果表明发酵菇根多糖和普通菇根多糖的单糖组成一致，均由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖和鼠李糖五种单糖组成；但各单糖的含量不同，与普通菇根多糖相比，发酵菇根多糖的葡萄糖和甘露糖含量升高，鼠李糖含量基本不变，半乳糖和岩藻糖含量降低。
两种多糖的抗氧化活性随浓度增大而呈递增趋势，在各个浓度下发酵菇根多糖的抗氧化活性均高于普通菇根多糖。前人的研究发现，发酵过程可使发酵产物的含量、结构和活性更多样化。本研究结果表明，发酵可以提高金针菇菇根多糖提取率，改善单糖含量组成，提高其抗氧化活性。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (2)

1.一种金针菇菇根多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、取金针菇菇根干燥后粉碎，干燥后水分在10～12%，按0.05～0.1%添加创博微生物发酵剂，其中创博微生物发酵剂生产批号为CB08190529，执行标准Q/SWHA-56，按3%比例加入糖蜜，加水调节水分至35～40%，在28℃～35℃的密闭环境中发酵10～12天，发酵结束后取出干燥，制得发酵金针菇菇根；
b、取步骤a中制得的发酵金针菇菇根，置于烘箱中，60℃下烘干后，粉碎过80目筛；
c、称取10g步骤b中制得的发酵金针菇菇根粉末放入烧杯中，向烧杯中加入350ml蒸馏水，混匀后置于超声波清洗器中浸提，设置超声波清洗器工作参数为超声功率180W，浸提温度80℃，浸提时间40min；
d、调节步骤c中发酵金针菇菇根浸提液的pH值为5，再将浸提液装入双层高压袋中，封口后放入超高压装置内，设定超高压压力360MPa，超高压时间5min，制得混合液；
e、将步骤d中制得的混合液离心取上清液，加入4倍体积的无水乙醇，4℃下过夜，离心收集沉淀，并用无水乙醇、丙酮和乙醚依次洗涤沉淀后50℃烘干，得粗多糖备用；
f、采用Sevage法脱蛋白、DEAE-纤维素-52色谱法初步纯化和用葡聚糖凝胶色谱法进行二次纯化。
2.根据权利要求1所述的一种金针菇菇根多糖的提取方法，其特征在于，所述步骤a发酵金针菇菇根制备过程中，菇根粉碎颗粒度标准为99%通过2.80mm编织筛，1.40mm编织筛筛上物不大于15%。
CN202010973534.8A 2020-09-16 2020-09-16 一种金针菇菇根多糖的提取方法 Active CN111978429B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010973534.8A CN111978429B (zh) 2020-09-16 2020-09-16 一种金针菇菇根多糖的提取方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010973534.8A CN111978429B (zh) 2020-09-16 2020-09-16 一种金针菇菇根多糖的提取方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111978429A CN111978429A (zh) 2020-11-24
CN111978429B true CN111978429B (zh) 2022-07-19

Family

ID=73450748

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010973534.8A Active CN111978429B (zh) 2020-09-16 2020-09-16 一种金针菇菇根多糖的提取方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111978429B (zh)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101323649B (zh) * 2008-08-04 2012-02-29 南方李锦记有限公司 一种利用超高压提取香菇多糖的方法
CN101357951A (zh) * 2008-09-19 2009-02-04 南方李锦记有限公司 利用超高压提取灵芝子实体多糖的方法
CN102174615B (zh) * 2011-03-16 2013-06-26 浙江省农业科学院 利用金针菇提取多糖后残渣生产真菌多糖的方法
CN103275235A (zh) * 2013-05-23 2013-09-04 南京泽朗农业发展有限公司 一种从木姜子根中提取多糖的方法
CN104277133A (zh) * 2014-08-18 2015-01-14 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 一种发酵黄芪多糖的提取纯化方法及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"发酵轮叶党参抗氧化活性研究";刘婷婷;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（硕士） 医药卫生科技辑》;20160815(第08期);E057-415 *
"番石榴叶多糖活性分析及分离鉴定与发酵提升";罗游;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（博士） 工程科技I辑》;20210215(第2期);B016-52 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111978429A (zh) 2020-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Cao et al. Comparative study on the monosaccharide compositions, antioxidant and hypoglycemic activities in vitro of intracellular and extracellular polysaccharides of liquid fermented Coprinus comatus
Tian et al. Ultrasonic-assisted extraction and antioxidant activity of polysaccharides recovered from white button mushroom (Agaricus bisporus)
Hu et al. Antioxidant activity of Inonotus obliquus polysaccharide and its amelioration for chronic pancreatitis in mice
CN108823261B (zh) 一种超低分子量铁皮石斛多糖及其制备与应用
Reshetnikov et al. Medicinal value of the genus Tremella Pers.(Heterobasidiomycetes)
Wang et al. Mycelial polysaccharides of Lentinus edodes (shiitake mushroom) in submerged culture exert immunoenhancing effect on macrophage cells via MAPK pathway
Li et al. Three kinds of Ganoderma lucidum polysaccharides attenuate DDC-induced chronic pancreatitis in mice
CN113024685A (zh) 一种低分子量竹荪菌托多糖及其制备方法与应用
CN107541533A (zh) 一种药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强剂的制备方法
CN113912750B (zh) 一种发酵预处理提取灵芝子实体多糖的方法
CN106692211A (zh) 一种牛樟芝菌丝体三萜类提取物的制备方法
CN107119096B (zh) 一种滑菇活性肽的制备方法及其应用
CN105368895A (zh) 一种制备具有抗氧化活性鼎湖鳞伞菌胞内、胞外多糖的方法
Fan et al. Mycelial biomass and intracellular polysaccharides production, characterization, and activities in Auricularia auricula-judae cultured with different carbon sources
CN111410699B (zh) 西藏灵芝多糖glp-3及其制备方法与应用
CN111978429B (zh) 一种金针菇菇根多糖的提取方法
Yang et al. Structural elucidation of a highly branched α-D-glucan from Huangjiu and its hepatoprotective activity via gut microbiome regulation and intestinal barrier repairment
Yu et al. Enzymatic-fingerprinting workflow of polysaccharides in Hericium erinaceus fruiting bodies: From HILIC-ESI−-MS screening to targeted MIM profiling
CN112062866B (zh) 一种猴头菌富硒多糖及其制备方法和用途
Jiang et al. Effects of extraction conditions on crude polysaccharides and antioxidant activities of the lion's mane medicinal mushroom, Hericium erinaceus (Agaricomycetes)
CN104817646B (zh) 薄树芝中的多糖及其提取方法和应用
KR20060117401A (ko) 상황버섯 및 가공인삼을 이용하여 다량의 Rg3와 Rg5를 함유하는 기능성 조성물의 제조방법 및 이를 이용한 기능성 다류의 제조방법
CN116925163A (zh) 一种低频超声获取玫瑰苷的方法
CN109232758B (zh) 一种榆黄蘑菌糠多糖及其提取工艺和应用
CN113999325B (zh) 一种米糠发酵多糖，制备及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant